DE2462485A1

DE2462485A1 - Neue pseudotrisaccharide und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2462485A1
Application number: DE19742462485
Authority: DE
Inventors: Peter J L Daniels; Alan K Mallams; Tattanahalli L Nagabhushan; Raymond Testa; Gerald H Wagman; Marvin J Weinstein; John J Wright
Original assignee: Scherico Ltd
Current assignee: Scherico Ltd
Priority date: 1973-08-06
Filing date: 1974-08-01
Publication date: 1977-04-21
Also published as: SE424994B; DK146298C; NL171587C; FI62100C; DE2437160C3; NO139483C; SE7409946L; NO139483B; IL45385A; AU7194274A; IE40437L; BE818431A; CH606076A5; FR2240015B1; LU70661A1; FR2240015A1; NO742787L; BG25804A3; DD119037A5; DE2437160B2

Description

Dr.-lng. Sdi9nvwi!d-0r.-Ing.lti./ieyfrof.-!ng.ti5iiMiu 2 0E9X-6i // Dr. Fues · Dipl.-Chem. Ale!: von Kre:sler Co/rh Γ

Dipl.-Chem. Carola Keller · Dipl.-lng. Setting 5 Köln 1, Deichmannhaus

NEUES PSEUDOTRISACCHARID, DESSEN THERAPEUTISCHE VERWENDUNG UND VERFAHREN ZU SEINER HERSTELLUNG

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Pseudotrisaccharid mit antibakterieller Wirkung, auf Verfahren zu seiner Herstellung und auf seine Verwendung als Bestandteil in pharmazeutischen Zubereitungen.

Es sind Mittel mit breitem antibakteriellem Spektrum bekannt, die chemisch als 4_s6-Di-(aminoglycosyl)-l,3-diaminocyclitole klassifiziert werden. Wertvolle antibakterielle Mittel in dieser Gruppe sind jene, worin das Aminocyclitol 2-Deoxystreptamin mit Aminogruppen in den Stellungen 1 und 3 ist. Besonders wertvolle antibakterielle Mittel aus der 4,6-Di-(aminoglycosyl)-2-deoxystreptamin-Reihe sind jene, worin die Aminoglycosylgruppe in Stellung 6 Garosaminyl darstellt. In der Gruppe der U-Aminoglycosyl-6-garosaminyl-2-deoxystreptamine befinden sich Antibiotika wie Gentamicin B, B-j^, C^, C-^_a, C2 s G2_a, C2_b und X2; Sisomicin, Verdamicin, Antibiotikum G-418, Antibiotikum G-52, Antibiotikum JI-20A und Antibiotikum JI-20B. Sisomicin ist in der DAS 1932309 beschrieben.

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Diese Erfindung bezieht sich nun auf eine Verbindung, worin die Arninogruppe in Stellung 1 in dem 4,6-Di-(aminoglycosyl)-l ,3-diaminocyclitol Sisomicin selektiv durch Aethyl substituiert ist. Diese Verbindung weist ein breites antibakterielles Spektrum auf.

Die Verbindung der Erfindung, 1-N-Aethylsisomicin, hat die folgende Strukturformel:

CH₂NH₂ NH₂

NHCHoCHo

(In der Strukturformel bedeuten die nicht weiter gekennzeichneten Linien Bindungen mit Wasserstoffatomen).

Von der Erfindung umfasst werden ebenso die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze von 1-NN-Aethylsisomicin. Die Salze können nach bekannten Methoden hergestellt werden, beispielsweise durch Neutralisieren der freien Base mit der entsprechenden Säure bis zu einem pH von etwa 5.
Geeignete Säuren sind beispielsweise Chlorwasserstoff-, Schwefel-,

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Phosphor-, Salpeter-, Bromwasserstoff-, Essig-, Propion-, Malein-, Ascorbin-, Zitronensäure u.s.w. Die Säureadditionssalze der Erfindung sind weisse Feststoffe, die in Wasser löslich, in den meisten polaren organischen Lösungsmitteln schwach löslich und in nicht polaren organischen Lösungsmitteln unlöslich sind.

Die Verbindung der Erfindung und die nicht toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze weisen ein breites antibakterielles Spektrum auf, insbesondere im Vergleich mit den in Stellung 1 nicht substituierten Antibiotika ähnlicher Struktur. Dies zeigt sich in der erhöhten Aktivität der Verbindungen gegen Organismen, die gegen die unsubstituierten Antibiotika resistent sind. Ein Verfahren zur Herstellung von 1-N-Aethylsisomicin und von dessen pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzen ist dadurch gekennzeichnet, dass man Sisomicin, welches Aminoschutzgruppen in allen Stellungen ausser Stellung 1 enthalten kann, mit Acetaldehyd in Gegenwart eines Wasserstoff-Donor-Reduktionsmittels umsetzt, vorhandene Schutzgruppen entfernt und das Derivat als solches oder als pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz isoliert.

Dieses Verfahren, bei dem die 1-Aminogruppe in Sisomicin selektiv mit einem Aldehyd kondensiert und gleichzeitig in situ reduziert wird, wird gewöhnlich bei Raumtemperatur in Gegenwart von Luft durchgeführt, obwohl es günstiger sein kann, die Reaktion unter Inertgas (Argon, Stickstoff) durchzuführen. Die Reaktion ist ge-

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wohnlich sehr rasch, oft unter 3 0 Minuten, vollendet, was durch dünnschichtchromatographische Bestimmungen festgestellt werden kann.

Wasserstoff-Donor-Reduktionsmittel, die in diesem Verfahren Verwendung finden, umfassen Dialkylaminoborane (z.B. Dimethylaminoboran, Diäthylaminoboran und vorzugsweise Morpholinoboran), Tetraalkylammonium cyanoborohydride (z.B. Tetrabutylammonium cyanoborohydrid), Alkalimetallborohydride (z.B. Natriumborohydrid) und vorzugsweise Alkalimetallcyanoborohydride (z.B. Lithiumcyanoborohydrid und Natriumcyanoborohydrid).

Das Verfahren wird üblicherweise in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt. Das Lösungsmittel kann ein organisches oder anorganisches sein, in dem Sisomicin und die anderen Reagentien löslich sind und das unter den Reaktionsbedingungen nach Möglichkeit Nebenreaktionen herabsetzt oder verhindert. Obwohl wasserfreie aprotische Lösungsmittel mit Vorteil eingesetzt werden können (z.B. Tetrahydrofuran wenn das Reduktionsmittel Morpholinoboran ist), wird gewöhnlich doch ein protisches Lösungsmittel verwendet. Als solches eignet sich z.B. ein niederes Alkanol oder vorzugsweise Wasser oder ein wässeriges niedriges Alkanol (z.B. wässeriges Methanol oder Aethanol) oder andere mit Wasser mischbare Lösungsmittelsysteme, wie z.B. wässeriges Dimethylformamid, wässeriges Hexamethylphosphoramid, wässeriges Tetrahydrofuran oder wässeriger

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Aethyleng'lycoldinethyläther.

Das Verfahren wird gewöhnlich in einem pH-Bereich·von Ibis 11 und vorzugsweise 2 bis 5 durchgeführt, wobei der Bereich von 2,5 bis 3,5 am günstigsten sein kann. Das bevorzugt saure Medium wird durch Zusatz einer organischen oder anorganischen Säure zu Sisomicin erhalten. Hierbei bildet sich das Säureadditionssalz aus. Beispiele von Säuren sind Essig-, Trifluoressig-, p-Toluolsulfon-, Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor- oder Salpetersäure. Schwefelsäure wird bevorzugt verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Säureadditionssalz in situ durch Zugabe der gewünschten Säure (z.B. Schwefelsäure) zu der Lösung oder Suspension von Sisomicin in einem protischen Lösungsmittel (z.B. Wasser) bis zur Einstellung des gewünschten pH-Wertes gebildet. ■

Es besteht auch die Möglichkeit, ein Acetal oder Halbacetal des Aldehydes zu verwenden, wenn die Reaktion in einem sauren Medium, welches Anlass zur in situ-Bildung des freien Aldehydes gibt, durchgeführt wird.

Bevorzugt wird das Verfahren ausgeführt, indem man eine Lösung von Sisomicin in einem protischen Lösungsmittel (vorzugsweise Wasser) herstellt, den pH der Lösung in einen Bereich von 2 bis 5 bringt (z.B. mit verdünnter Schwefelsäure) und so das Säureadditions-

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. _fm 2A62485

salz der Ausgangsverbindung herstellt. Bei einem pH von etwa 5 enthält das Säureadditionssalz ungefähr ein Äquivalent Säure pro Aminogruppe, also pro Mol Sisomicin 2,5 Mol Schwefelsäure. Zur Lösung des Säureadditionssalzes wird zumindest ein Äquivalent und vorzugsweise ein grosser Ueberschuss des Acetaldehydes und kurz danach (ca. 5 Minuten) ungefähr ein molares Äquivalent des Reduktionsmittels, vorzugsweise ein Alkalimetallcyanoborohydrid, wie Natriumcyanoborohydrid, zugegeben. Die Reaktion ist gewöhnlich in etwa 30 Minuten beendet, was durch dünnschichtchromatographische Bestimmung festgestellt wird. Die Isolierung und Reinigung des so erhaltenen 1-N- Aethylsisomicins erfolgt nach Standardmethoden (vorzugsweise chromatographisch).

Es besteht auch die Möglichkeit, teilweise N-geschütztes Sisomicin als Ausgangsverbindung zu verwenden. Sisomicin kann in Stellung 6¹

ι
oder in den Stellungen 2¹ und 6' oder in den Positionen 2¹, 3 und geschützt sein. Andere Aminoschutzgruppen können sich in Positionen 3", 4·" befinden (z.B. Carbonyl). Beispielsweise kann als 1-N-unsubstituierte Ausgangsverbindung eine solche verwendet werden, worin die 6'-Aminogruppe geschützt ist (z.B. 6 '-N-t^-Butoxycarbonylsisomicin), und man erhält das entsprechende teilweise N-geschützte 1-N-substituierte Derivat, nämlich l-N-Aethyl-6'-N-t-butoxycarbonylsisomicin, das nach Entfernung der Schutzgruppe nach bekannten Methoden die Verbindung der Erfindung ergibt.

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Sisomicin mit Aminoschutzgruppen kann nach Verfahren, die gleich oder ähnlich denen aus Beispiel 1 sind, hergestellt werden. Der Ausdruck "Schutzgruppe" bezieht sich auf Gruppen, die die Aminogruppen gegen chemische Reaktionen abschirmen und die nach vollendeter Reaktion wieder leicht entfernt werden können. Beispiele von Aminoschutzgruppen sind Benzyl, 4-Nitrobenzyl, Tripheny!methyl, 2,4-Dinitrophenyl; Acylgruppen wie Acetyl, Propionyl und Benzoyl; Alkoxycarbonylgruppen wie Methoxycarbonyl, Aethoxycarbonyl, 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl, ^-Butoxycarbonyl und 2-Jodäthoxycarbonyl; und Arylalkoxycarbonylgruppen wie Carbobenzyloxy und 4-Methoxybenzyloxycarbonylgruppen.

Beim Einführen der Aminoschutzgruppen werden diese gewöhnlich in der Form des Säureimidazolderivates, des Säureazides, oder des aktiven Esters wie Aethylthioltrifluoracetat, N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid oder p_-Nitrophenyltrichloräthylcarbonat eingesetzt. Die Schutzgruppe stammt daher von einer Verbindung der Formel BgLg, worin Bg die Schutzgruppe wird, wie beispielsweise der Säureteil eines aktiven Esters, .und Lg eine Gruppe, die bei der Reaktion leicht abgespalten wird (z.B. Imidazolin), darstellt.

Ein andec.es Verfahren zur Herstellung von 1-N-Aethylsisomicin und von dessen Säureadditionssalzen ist dadurch gekennzeichnet, dass man 1-N-Acetylsisomicin mit einem Wasserstoff enthaltenden Amid-

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Reduktionsmittel reagieren lässt und das Derivat als solches oder als pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz isoliert.

Das Verfahren wird gewöhnlich in einem inerten organischen Lösungsmittel durchgeführt', worin die Ausgangsverbindung und das Reduktionsmittel löslich sind und das Nebenreaktionen nach Möglichkeit unterdrückt. Besonders geeignete Lösungsmittel sind Aether, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Diäthylenglycoldimethyläther usw.

Bevorzugte Reduktionsmittel sind Aluminiumhydride und Borhydride, wie Lithiumaluminiumhydrid, Lithiumtrimethoxyaluminiumhydrid, Aluminiumhydrid, Diboran, Di-isoamylboran und 9-Borabicyclo [3.3.l] nonan.

Im allgemeinen verwendet man bevorzugt Lithiumaluminiumhydrid.

Ein anderes Verfahren gemäss der Erfindung zur Herstellung von 1-N-Aethylsisomicin und von den pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzen dieser Verbindung ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mutante der Art Micromonospora inyoensis, und zwar Micromonospora inyoensis Stamm 1550F-1G,oder einen Stamm derselben Art, der in seiner Eigenschaft als Produzent der oben genannten Verbindung dem Stamm 1550F-IG entspricht, in einem Nährmedium, das l-N-Aethyl-2-deoxy-D-streptamin enthält, so lange fermentiert, bis

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das Medium antibiotische Aktivität aufweist und die so erhaltene Verbindung als solche oder als pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz isoliert.

Der Mikroorganismus Micromonospora inyoensis Stamm 155OF-IG ist im U.S. Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois unter der Zahl NRRL 5742 hinterlegt, und seine Eigenschaften sind im folgenden beschrieben.

Taxonomische, biochemische und morphologische Eigenschaften von Micromonospora inyoensis Stamm 1550F-1G:

Der ursprünglicheMikroorganismus, Micromonospora inyoensis ist im Journal of Antibiotics (Japan) Band XXIII, Nr. 11, S. 551-558 (1970) von M.J. Weinstein und Mitarbeitern ausführlich beschrieben worden, und ein Muster davon wurde bei U.S. Department of Agriculture, Norther Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois unter der Registriernummer NRRL 3292 hinterlegt.

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tficror.onospora inyoensis Stamm 155OF-1G zeigt Wachstumscr.arakteristika,die denen des ursprünglichen Mikroorganismus sehr ähnlich sind. Ein Muster davon wurde bei der.oben genannten Hinterlegungsstelle unter der Registriernummer NRRL 5742 deponiert. Die folgenden Tabellen zeigen einige taxonomische, biochemische und morphologische Eigenschaften des Organismus. Tabelle I .zeigt Beobachtungen des Mikroorganismus auf verschiedenen Nährböden. Tabelle II enthält Beobachtungen bezüglich der Stickstoffverwertung, und Tabelle III bezüglich der Kohlehydrat verwertung.

Für die Beschreibung der beobachteten Farben wird folgendes System und werden folgende Kennzeichen verwendet: Die Farbbezeichungen bestehen aus zwei Teilen. Der erste ist ein Farbnarae, entnommen dem Buch "Descriptive Color Name Dictionary" von Taylor, Knoche und Granville, (1950), herausgegeben durch Container Corporation of America, USA, mit einer dem Farbnarnen entsprechenden Farbkennziffer, wobei die Kennziffer dem "Color Harmony Manual", vierte Auflage, (I958), herausgegeben durch Container Corporation of America, entnommen worden ist. Der zweite Teil der Farbbezeiehnungen besteht aus einem Farbnamen und einer Zahl, die sich auf ein Synonym oder annäherndes Synonym bezieht, entsprechend der Veröffentlichung "National Bureau of Standard (USA), Circular 553, vom 1. November 1955".

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Auf einem Agar-Nahrboden, der 3^ NZ Amin Typ A enthält (ein Pepton, das durch enzymatisch^ Behandlung von Kasein enthalten wird und hier als Stickstoffquelle funktioniert), zeigt der Mikroorganismus ein so geringes Wachstunr, dass eine Charakteri sierung unmöglich ist.

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BAD ORIGINAL

•^.

Beobachtungen das Mikroorganismus auf vorschiadsneu Nährböden

Medien hzv/.Bedingungen Beob2chtungen

Temperatur Wachstum: Gut bei 28° und 37°C
Kein Wachstum bei 50 C

Aerobisch oder Anaerobisch Aerobisch

Reduktion von iJitrat Unters chiedlich

Czapeks Medium (Glucose) Wachstum: Mittelmässig bis schwach, membr a nf or mig,

kein diffundierbaras Pigment

Färbet g3ic heller Bernstein (light amber) - dunkles orangegelb 72
(dark orange yellow)

Asparagin-Glucose Medium Wachstum: Mittelmässig bis schwach, flach -membranförmig,

kein difrundierbares Pigment

Farbe: g3ic heller Bernstein (light

amber)

-dunkles orangegelb 72 (dark orange

yellow)

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* Jy

. TABuELLB I (./-)

Kslzium Monohydroxysuccinat Wachstum: Schwach, flach, kein Agar diffundierbares Pigment

Farbe: g3ic heller Bernstein (light amber) -dunkles Orangegelb (darlc orange yellow)

Gewöhnliches Agar Wachstum: Schwach, ungenügend für Beobachtungen

Nähr Agar Wachstum: Mittelmässig bis schwach, flach bis leicht runzlig Farbe: g4ne Lederbraun-starkes Braun (luggage tan-strong brown) bis g4pn Schokoladebraun-dunkles Braun 59 (chocolate brown- dark brown)

Löffler's Serum Medium (Difco*) Wachstum: Mittelmässig, Substrat teilweise verflüssigt Farbe: g5pe Terrakotta (teracotta) starkes Braun 55 (strong brown)

Kartoffel Kein Wachstum

Pepton Glucose Agar Wachstum: Mittelmässig bis schwad flach bis laicht gerillt, kein difj undierbares Pigment

Farbe: g4ne Lederbraun (luggage tai starkes Braun 55 (strong brown) "

Ei Agar

(Dorset Egg Medium-Difco*) Wachstum: Schwach, ungenügend für Beobachtung

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TABELLE

•Λ.

G e 1 a t i na Ked ium

Wachstum: Mittolii-ässig bis schwach, flach bis leicht gefurcht, lesin diffundierbares Pigment; Farba; g41e Torfbraun (turftan)-helles Braun 57 (light brown)

Stärke Agar Wachstum: Mittelmässig, flach, kein diffundierbares Pigment; Stärke schwach hydrolysiert aber nur direkt unter der Kolonie. Farbe: g31e Ahorngelb (yellow maple) starkes Gelbbraun 74 bis schwarz (strong yellov/isäx brown to black)

Tyrosin Medium Wachstum: Mittalraässig bis schwach flach, leichte Dunkelfärbung' des Mediums

Farbe: g41e Torfbraun (turf tan) heiles Braun 57 (light brown)

Lackmus-Milch
(Difco*)

Peptonisierung, saure Reaktion

Zellulose Medium Schwache Zersetzung der Zelluloser (schwache Hydrolyse der Zellulose)

Bennett's Agar Wachstum: Gut, membranförmig faltig, kein diffundierbares Pigmen Farbe: Schwarz

Eminerson's Agar Wachstum: Gut, membranförmig, kein diffundierbares Pigment Farbe: g3n ; Nelkenbraun (clove brov/n -dunkles Gelbbraun 78 (dark yellov/'ish brown)

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TABELLE ΐ (./.)

Tc-2ten mark-Hafermshl Agar

Wachstum: MjLttsi.tua.GSxg, erhöht, gefurcht, kein äiffur.dierbares

Pigment Farbe: g4ne Rotbraun (sunset orange) starkes Orange 50 (strong orange.)

Glucose-Hefe-Extrskt Agar Wachstum: Gut, merobranförmig, kein diffundierbares Pigment Farbe: Schwarz

Karboffelscheibe Mit CaCO₃ gutes Wachstum, ohna CaCO- kein Wachstum Farbe: Schwarz

Tyrosin Agar-Hefe Extrakt Wachstum: Gut, membranförmig, Kristalle gelöst
Hellbraunes, diffundierbares Pigment gebildet

Tyrosin-Fleisch-Extrakt

(Beobachtungen nach 2,7 und 14 Tagen nach Gordon und Smith, J.Bact.69: 147 (1955) Wachstums Mittelmässig bis schwach. Kristalle schwach gelöst, braunes Pigment nur bei "cross-hatched" Methodegebildet

Pepton Eisen Agar (Beobachtungen nach 2, und 14 Tagen) Kein Wachstum, keine Reaktion

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TABELLE II

S t i ck stoffverwertung

Stickstoffqualla +1% Glucose

Beoba chtungen

0.5% Hefe Extrakt (Difco*) Wa chs turn ; Gu t, membr a nf örmig, kein diffundierbares Pigment Fa rb e: Schvarζ

1.0% HZ Arain Typ A

Wachstum: Gut, membr anf örmig, Farbe: g4nc Rotbraun (sunset orange) starkes Orange 5O (strong orange) bis Schwarz

1% Asparagin Schwaches Wachstum, ungenügend für Charakterisierung

1% Glutaminsäure

1% Natriumnitrat Schwaches Wachstum, ungenügend für Charakterisierung

Schwaches Wachstum, ungenügend für Charakterisierung

1% Ammoniumnitrat Schwaches Wachstum, ungenügend für Charakterisierung

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TABELLE III Kohlehyär a tverwertu ng

Medium	Wachstum
Kontrolle	- Schv/ach
D-Ärabinose	- Schwach
L-Arabinose	- Schwach
Dulcitol	- Schwach
D-Galactose	-; Mittelmässig
D-Glucose	++ Gut
Glycerol	- Schwach
I-Inositol	~ Schwach
B-Lactose	+ - Schwach
D-Levulose	- Mittelmässig
D-Mannitol	- Schwach
Mannose	++4- Gut
i'ielibiose	τ- Schwach
Melizitose	- Schwach

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Raffinose	- Schwach
L-Rhsinnose	- Schwach
D-Ribose	4- Mittelmässig
Salizin	- Schwach
Sucrose	+ Mittelmässig
D-Xylose	++ Gut

l-N-Aethyl-2-deoxy-D-streptamin kann aus bekannten Aminocyclitolen (z.B. (lS^)-l-Acetamido-3-amino-l,3-dideoxy-myo-inositol) oder aus bekannten Pseudodisacchariden (z.B. Garamin) nach Standardmethoden, wie in den Beispielen beschrieben, hergestellt werden.

Die Fermentation wird auf die folgende Art durchgeführt. Eine lyophilisierte Kultur oder Zellen einer Schrägkultur von Micromonospora inyoensis Stamm 155OF-1G NElRL 57^2 werden auT ein steriles Medium übertragen. Dieses ist ein wässeriges Medium, das assimilierbaren Stickstoff und Kohlenstoff und die üHichen Zusätze enthält. Dieses inokulierte Medium wird unter aeroben Bedingungen bei ca. 24 bis 4-9 C, vorzugsweise 35 C, ca. 2 bis 5> vorzugsweise 3 Tage,inkubiert. Der pH-Wert wird zwischen 6,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,8 und Ί,\ gehalten.

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Das Inokulum wird aseptisch auf ein Fermentationsmedium übertragen, da; gleich oder verschieden ist von obigem Medium. Das Aminocyclitol kann vor oder nach der Sterilisation des Fermentationsmediums, zur Zeit der Inokulation oder bis zu 48 Stunden danach zugesetzt werden. .Das Aminocyclitol wird gewöhnlich in Wasser gelöst, steril filtriert und dem Medium zugesetzt» Allgemein beträgt die Konzentration dieser Verbindung 100 bis 1500 mcg/ml Fermentationsbrühe. Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen und ca. in denselben pH- und Temperaturbereichen wie das Inokulum. durchgeführt. Antibiotikaproduktion wird nach demselben Bestimmungsverfahren wie bei Sisomicin [J. Antibiotics (Japan) Vol. XXIIl] verfolgt. Die Verbindung der Erfindung wird von dem Fermentationsmedium und von Nebenprodukten mit antibakterieller Aktivität nach Standardmethoden isoliert.

Ein anderes Verfahren zur Herstellung der gewünschten Verbindung und von den pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzen dieser Verbindung umfasst die Reaktion von Sisomicin, das Aminoschutz^ gruppen in allen Positionen ausser Position 1 hat und worin die 1-Aminogruppe aktiviert sein kann, mit einem Alkylierungsmittel, das die Aethylgruppe und eine leicht abspaltbare Gruppe enthält, Entfernen der·Schutzgruppen und etwaiger aktivierender Gruppen und Isolierung des Derivates als solches oder als pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz. Beispiele von bevorzugten Alky-

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lierungsmitteln sind Aethyljodid, Aethylbromid, Diäthylsulfat, Aethylfluorsulphonat und Aethyl-p-Toluolsulfonat. Triäthylaniliniumhydroxid, Triäthyloxoniumflucrborat, Triäthylsulfoniumfluorborat, oder Triäthylsulfoxoniumfluorborat sind weitere Beispiele. Alle diese Alkylierungsmittel enthalten eine leicht abspaltbare Gruppe, wie Br , I , OSO₂F , Di-äthylanilin oder Diäthylather.

Die Aminogruppe in Stellung 1 von Sisomicin kann frei oder aktiviert sein. Ein Beispiel einer Aktivierungsgruppe ist Trifluormethylsulfonyl. Diese Gruppe kann in das Molekül durch Reaktion von Sisomicin, das Aminoschutzgruppen in allen Stellungen ausser Stellung 1 hat, z.B. 3"-N-i+"-0-Carbonyl-2 ' ,3 ,6 ^rtri-N-t-butoxycarbonylsisomicin, mit einer Verbindung, die die aktivierende Gruppe enthält, beispielsweise Trifluoromethylsulfonylchlorid, eingeführt werden.

Die Alkylierung der 1-Aminogruppe kann auch über das entsprechende Di-C2-cyanoäthyl)-Derivat erfolgen, welches durch Reaktion von Acrylnitril mit Sisomicin mit Aminoschutzgruppen in allen Positionen ausser Stellung 1 erhalten werden kann. Das l-N-Di-(2-cyanoäthyl)-Derivat wird mit einem der oben genannten Mittel alkyliert, wonach die Cyanoäthylgruppen entfernt werden.

Dieses Alkylierungsverfahren wird nach Methoden, die für die direkte Alkylierung von Aminen bekannt sind, durchgeführt.

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Beispiel 1

Selektiv blockiertes Sisomicin

A. 2 ' ,3,6 ^?-Tri-N-Butoxycarbonyl-3"-N-4"-0-carbonylsisomicin

1. Penta-N-carbobenzoxysisomicin

Man löst 25 g Sisomicin und 13 g Natriumkarbonat in 625 ml destilliertem Wasser." Man fügt bei 2 5°C 100 ml Carbobenzoxychlorid der gerührten Lösung zu und rührt die Mischung während 16 Stunden. Man filtriert den Niederschlag, wäscht ihn gründlich mit Wasser, trocknet im Vakuum, und wäscht ihn anschliessend mit Hexan. Man erhält Penta-N-carbobenzoxysisomicin (62 g)

26 als farblosen amorphen Stoff, m.p. = 165-173°CO3 _D + 96.2° (CH₃OH) IR: Y max (CHCl₃) 3400, 1720, 1515, 1215, 1050, 695, cm"¹ NMR: ^ (CDCl₃) 1.03 (3H, breites Singulett, 4"-C-CH₂); 3.02 (3H, breites Singulett, 3"-NCH₃); 5.02 (1OH, breites Singulett, CH₂CgH₅); 3.28,3.30 ppm (25H, breites Singulett, -CH₂C₆H₅).

2. Tetra-N-carbobenzoxy-3"-N-4'^f-0-carbonylsisomicin Man löst 5 g Penta-N-carbobenzoxysisomicin in 50 ml Dimethyl-

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formamid, fügt 250 mg Natriumhydrid in die gerührte Lösung und rührr dis Reaktionsmischung bsi Raumtemperatur unter Argon währerti zwei Stunden. Man filtriert und fügt eiskalte Essigsäure (2 ml) ins Filtrat, das dann im Vakuum konzentriert wird» Man extrahiert den Rückstand mit Chloroform(konditioniert mit basischer Tonerde) wäscht den Extrakt mit Wasser und trocknet über Natriumsulfat. Die Lösung wird eingedampft und man erhält Tetra-N-carbobenzoxy-3"-N-4"-0-carbonylsisomicin als ein amorphes Pulver (3,5g) m.p. = 210-213°C [a]^⁶ + 68.8 (C=O.22) IR: Vmax (Nujol) 3550, l84O, 176Ο, I58O cm"¹ NMR: S (CDCl ) 1.34 (3H, Singulett, 4"-CIL); 2.68 (3H, Singulett, 3"-N-Me); 5.04 (8H, breites Singulett, -

3. 3" -N-V-0-Carbony !sisomicin

Man fügt in eine Lösung von 1,3,2',6'-Tetra-N -benzyloxycarbonyl-3"-N-4"-^-carbonylsisomicin (10.1 g) in Tetrahydrofuran (200 ml) 1 Liter flüssigen Ammoniak (über Natrium destilliert) und unter Rühren fügt man in kleinen Stücken 6 g Natrium bei. Nach 3-stündigem Rühren vernichtet man den Natriumüberschusa durch Zugabe von Ammoniuraehlorid und lässt die Lösung unter einem Stickstoffstrom verdampfen. Der Rückstand wird in Wasser aufgelöst und auf Amberlit IRC-50 Harz (H⁺Form) aufgegeben. Das Harz wird mit Wasser gewaschen und man eluiert das Produkt mit 2N Ammoniumhydroxidlösung. Man verdampft dasEluat im Vakuum und erhält das Titelprodukt (3"-N-V-O-

_ ²²_

7 0 9 8 1~6 /Ί 0 8 1

Carbonylsisomicin). Ausbeute cso 4 s

IR: V .T:ax (NuJoI) 1745 cm~ . Das Produkt kann, .in den folgenden Stufen ohne weitere Reinigung angewendet werden. Durch Chromatographie des Produktes auf Silikagel kann jedoch eine sehr reine Probe erhalten werden, wenn man die untere Phase von einem Chloroform:Methanol:konz·Ammoniumhydroxid (1:1:1) Lösungsmittelsystem als Eluierungsmittel anwendet.

4. 2¹,3,6' -Tri-N-t-butoxycarbonyl-3"-N-4"-a-carbonylsisomicin

Man löst 3"-N-4"-0-Carbonylsisomicin (1.4 g, 3 mMol) in 10 ml *50$ig33 wässerigem Methanol, auf, das Triäthylamin (3,5 mMol) enthält. Unter Rühren fügt man tropfenweise t-Butoxycarbonylazid (3,5 mMol) bei. Man rührt die Mischung währen 2 Tagen bei Raumtemperatur. Man fügt 5 ml Amberlite IRA-401S (0H~)-Ionenaustauscherharz mit 5 ml Methanol bei und rührt viährenä einer halben Stunde. · Man entfernt das Harz durch Filtration und wäscht mit Methanol. Man konzentriert das FiItrat und chromatographiert den Rückstand auf einer Silikagelsäule (60-100 Siebweite, 20,0 g), indem man Chloroform:Methanol:Araraoniurahydroxid (30:10:0.4)/als LösungsraittelsysterB benützt. Man vereingt jene Fraktionen, die das erwünschte Produkt enthalten und entfernt das Lösungsmittel im Vakuum. Man löst den Rückstand in Methanol* fällt das Produkt mit überschüssigem Aether aus, isoliert den Niederschlag durch Filtration und trocknet.

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ι*

• u.

3. 6'-N-Trifluoroacetylsisomicin

Man löst 20 g Sisomicin in 1,2 Liter wasserfreiem Methanol auf und fügt tropfenweise eine Lösung von 6 ml Aethylthioltrifluoro azetat in 60 ml Methanol über einen Zeitraum von 3 Stunden unter Rührer, zu. Man lässt die Reaktion 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen, entfernt das Lösungsmittel im Vakuum und erhält einen Rückstand von 23,8 g eines ungefähr 95 % reinen Produktes, das die folgenden Eigenschaften aufweist: Massenspektrum m/e 543 M , andere definitive Peaks bei m/e 413, 395, 385, 362, 223 und 126.

NMR (60MHz, D₂O) S 5,37 (Dublett, J=2Hz, H-I¹); 5,12 (Dublett, J=HHz, H-I"); 4,96 (breites Singulett, H-4'); 2,57 (Singulett, N-CH₃); 1,26 (Singulett, C-CH₃).

Beispiel 2

l-N-Aethyl-2-deoxy-D-streptamin

A. (IS)-l-Amino-3-(äthylamino)-1,3-dideoxy-myo-inositol

Zu einer Lösung von 10 g (lS_)-l-Acetamido-3-amino-l,3-dideoxymy_o-inosit öl in 100 ml Aethanol werden 6 g Acetaldehyd zugegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 16 Stunden belassen, danach wird das Reaktionsgemisch, das das (lS)-l-Acetamido-3-N-

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äthyliden Derivat enthält, vorsichtig .-it ρ g Natriumborhydrid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird v;sitere "ZK Stunden belassen und danach im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt. Man setzt ON Chlorwasserstoffsäure zu und erhitzt 6Stunden auf Rückfluss, um die 1-Acetamidogruppe abzuspalten. Man kühlt, verdampft im Vakuum zur Trockene, löst den Rückstand in V/asser, neutralisiert die wässerige Lösung mit 1 N Ammoniumhydroxid und gibt sie sodann auf eine Säule, die Amberlite IRC-50 Harz (NH^ ® Zyklus) enthält, auf. Die Säule wird zwecks Entfernung der anorganischen Salze mit Wasser gewaschen und mit 2 N Ammoniumhydroxid eluiert» Das Eluat wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand auf Silikagel (350 g) eluiert, wobei ein Gemisch aus Chloroform:Methanol:7$ Ammoniumhydroxid (1:2:1) als Eluent dient. Die sich bei der dünnschichtehromatographischen Analyse als gleichwertig ergebenden Fraktionen werden vereint und auf einen Rückstand, der (IS^)-l-Amino-3-{äthylamin<^-l,3-dideoxy-myo_-inositol enthält, verdampft..

B. l-N-Aethyl-2-deoxy-D-streptarain

Zu 1 g sorgfältig getrocknetem und fein zerpulvertem ^ Amino-3-(äthylaraino)-l,3-dideoxy-my_o-inositol werden 10 ml Acetylbromid und 10 ml Essigsäureanhydrid gegeben. Das Gemisch. wird in einem Glasdruckgefäss verschlossen und 6 Stunden auf

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IpO C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Gemisch in 100 ml Aetr.anol gegeben, zur Trockene verdampft, der Rückstand in 10 ml Sssigsäureanhydrid und 20 ml Pyridin aufgenommen und bei Raumtemperatur über Nacht belassen. Das Reaktionsgemisch wird zur Trockene verdampft und der Rückstand auf Silikagel mit Chloroform, das 1,5$ Methanol enthält, als Eluent chromatographiert· Die gemäss Dünnschichtchromatographie die wesentlichen Bestandteile enthaltenden Fraktionen werden vereint und zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird in 100 ml wässerigem Aethanol (50$) gelöst, es wird Raney-Nickel T-²I- und Amberlite ^ IR-401S Harz (0H~*Form) zugegeben und bei 3,5 Atmosphären 2 Tage hydriert-Die Lösung wird filtriert, eingedampft und der Rückstand in 6 S Chlorwasserstoffsäure aufgenommen. Man erhitzt 6stunden unter Rückfluss, kühlt, dampft die Lösung im Vakuum ein, löst wiederum in VJasser auf, neutralisiert die wässerige Lösung mit Ammoniurahydroxid und gibt sie einem Ueberschuss von Amber lit ^r IRC-50 Harz (NH₂, ^ Form) zu. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und das Produkt mit 2 N Ammoniumhydroxid eluiert. Die sich durch Dünnschichtchromatographie als gleichwertig erweisenden Fraktionen, werden vereint und im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand enthält l-lJ-Aethyl-2-deoxy-D-streptamin und wird chromatographisch auf Silikagel gereinigt, wobei das System Chloroform: Methanol:ifo■ Ammoniumhydroxid (1:2:1) als Eluent dient. Es v/erden wieder gleiche Fraktionen (TLC) vereint und auf einen Rückstand eingedampft. Man erhält l-N-Aethyl-2-deoxy-rD-streptamin als amorphen, weissen Feststoff [a]~ -k-0 (Wasser),Massenspektrum

m/e 191 (M+l)⁺.

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Beispiel 3
Λ." l-N"-Äthylsisomicin:

Zu ein er-Lösung von 5 g Sisomicin in 250 ml Wasser wird so lange 1 N Schwefelsäure zugegeben, bis sich der pH-Vert der Lösung auf etwa 5 eingestellt hat. Zur Lösung des dabei gebildeten Schwefelsäureädditionssalzes von Sisomicin, werden 2 ml Acetaldehyd zugegeben, 10 min lang gerührt, und dann 0,85 g Natriuracyanohorhydrid zugesetzt. Das Rühren wird bei Raumtemperatur 15 nio lang fortgesetzt, und dann die Lösung im Vakuum auf ein Volumen von etwa 100 ml eingedampft, die Lösung mit einem basischen Ionenaustauscherharz, (z.B. Araberlite IRA 401S (OH"")), behandelt, und dann lyophi— lisiert, wobei ein Rückstand erhalten wird, der 1 ü"-Äthyl~ sisomicin enthält. .

Es wird durch Chromatographie auf 100 g Silicagel gereinigt, wobei mit der unteren Phase eines Chloroform/Methanol/^ wässeriges Ammoniumhydroxid (2:1: l) systems eluiert wird·. Durch Dünnschichtchromatographie als gleich bestimmte Eluate werden vereinigt und die vereinigten Eluate der Hauptkomponente im Vakuum zum Erhalt eines Rückstands, der i N-Äthylsisomicin in einer Ausbeute von 1,25 g enthält, eingedampft. Die weitere Reinigung erfolgt wiederum durch Chro~ inatographie auf 100 g Silicagel, wobei mit einem Chloroform/ Methanol/3»5$ Ammoniumhydroxid (l r 2 : l) system eluiert wird. Die durch Dünnschichtchromatographie als gleich be-, —stimmten Eluate werden vereinigt uad durch eine mit einem

basischen Ionenaustauscherharz beschickte Säule geschickt- und das Eluat lyophilisiert, wobei 1-N-Aethylsisomicin in einer Ausbeute von 0,54 g erhalten wird. Es wurden die folgenden Kenndaten bestimmt:

ρ^δ + 164° (0,3 %, H₂O); pmr (ppm) (D₃O): δ 1,05 (3H, t, J=7 Hz, -CH₀CH-); 1,19 (3H, s, -C-CH-); 2,5 (3H, s, N-CH-); 4,85 (IH, m, =CH-); 4,95 (IH, d, J=4 Hz, H₁"); 5,33 (IH, d, J=2,5 Hz, H₁').

Massenspektrum: (M + 1) m/e 476

weiterhin m/e 127, 154, 160, 173, 191, 201, 219, 256, 299, 317, 332, 345, 350, 360, 378, 390, 400.

B. 1-N-Aethylsisomicin über ein 6'-N-substituiertes Zwischenprodukt:

6' -N-t-Butoxycarbonylsisomicin wird in wässerigem Methanol mit Schwefelsäure und anschliessend mit Acetaldehyd und Natrxumcyanoborhydrid behandelt. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur 30 Min. lang abstehen gelassen und dann im Vakuum zum Erhalt von l-N-Aethyl-6'-N~t~ butoxycarbonylsisomicin eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in Trifluoressigsäure aufgelöst und die Lösung 10 Min. lang abstehen gelassen. Dann wird die Lösung in überschüssiges wasserfreies Methanol gegossen, der erhaltene Niederschlag des trifluoressigsauren Salzes von

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l-N-Aethylsisomicin abgefiltert und über Silicagel chromatographiert, wobei die untere Phase eines Chlorof ο rm/Methanol/Anunoniumhydroxia-Lösung smittel systems verwendet wurde und man l-N-Aethylsisomicin erhält.

Beispiel 4
l-N-Aethylsisomicin:

(l) i g l-N-Acetylsisomicin wird in 100 ml Tetrahydrofuran suspendiert. Es wird 1 g Lithiumaluminiumhydrid zugegeben, und dann die erhaltene Suspension bei Rückflußtemperatur 2k h lang unter Stickstoff erhitzt. Es wird abgekühlt und das überschüssige Hydrid durch vorsichtige Zugabe von Äthylacetat zersetzt. Die Reaktionsmischung wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit ¥asser verdünnt. Die unlöslichen Feststoffe -werden abgefiltert und gut mit Essigsäure gewaschen. Das FiItrat und die Vasehlösungen-werden, vereinigt und der erhaltene Niederschlag wird in Wasser gelöst. Der pH-Wert der wässerigen Lösung wird durch Zusatz von Ammoniuaihydroxid auf etwa 7 eingestellt. Die Lösung wird durch eine IRC-50 Harzsäule in der Ammoniumstufe durchgeschickt, und die Säule gut mit Wasser gewaschen. Dann wird mit 0,5 N—Ammoniumhydroxid eluiert, das Eluat eingedampft und der erhaltene Rückstand über 20 g Silicagel chromatographiert, wobei mit der unteren Phase eines- ChloroformZMethanol/konzentriertes Ammoniumhydroxid (2 : 1 : i) Lösungsmittelsystems eluiert wird. Durch Dünnschichtchro—

• au

• matographie als gleich bestimmte Fraktionen werden vereinigt und unter Erhalt von 1-N-Aethylsisomicin eingedampft.

Beispiel 5

A. Herstellung eines Inoculums aus Micromonospora inyoensis, Stamm 155OF-IG:

•Keimstufe 1: Eine lyophilisierte Kultur (oder aus einer Schrägkultur erhaltene Zellen) von Micromonospora inyoensis, Stamm 155OF-1G werden unter aseptischen Bedingungen in eine 300 ml Schuttelflasche überführt, die 100 ml des folgenden sterilen Mediums enthält:

Rindfleischextrakt	5 g
Tryptose	5 g
Hefeextrakt	5 g
Dextrose	Ig
Stärke	24 g
CaIciumcarbonat	2 g
Leitungswasser	iOO ml

Die Flasche und ihr Inhalt werden auf einen Drehschüttler (280 Umdr/min, 5 cni-Hub) 2-5 Tage lang bei 35°C incubieren gelassen.

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•Μ.

Keirastufe 2: 25 ml des Fermentationsmediums von Keimstufe i werden unter aseptischen Bedingungen in eine
2 1 Schüttelflasche überführt, die 500 ml des oben erwähnten sterilen Keiiiimediums enthält. Die Flasche und ihr Inhalt werden 3 Tage lang bei 28⁰C auf einem Drehschüttler (280 Umdr/min, 5 cm-Hub) incubieren gelassen.

Fermentationsstufe: 500 nil des aus der Keimstufe 2 erhaltenen Inoculums werden in einem 14 1 Fermentationstank überführt, der 9,5 1 des folgenden sterilen Mediums enthält:

Dextrin	50 g
Dextrose	5 g
Sojabohnenmehl	35 g
Calciumcarbonat	7 g
Cobaltchlorid	iO~⁶ molar
Lei-tungswasser	1000 ml.
Antischaummittel

(GE 60) 10 ml.

B. Vor der Sterilisierung des oben beschriebenen Mediums wird der pH-Wert auf 8 eingestellt und eine wässerige

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Lösuag zugesetzt, die 8,1 g l-K-Aethyl-2-deoxy-D-streptamin enthält. Der Inhalt wird unter aeroben Bedingungen h8 bis 2Ί0 h lang fermentiert, wobei bei 250 Umdr/rain gerührt und h,5 1 Luft/min bei 2,5 atü eingeblasen werden»

Während der Produktion des Antibiotikums ändert sich der pH-Wert des Fenaentationsraediuins etwas, und liegt im Bereich von etwa 6,8 bis etwa 7,3.

Die Antibiotikumproduktion wird unter Verwendung der

Bestimnrangsmethode nach J. Antibiotics (Japan) Vol. XXIII, überwacht und das entstehende Produkt gewonnen, wenn die Spitzenprodukten erreicht ist.(Die Fermentation ist üblicherweise in etwa 7 Tagen abgeschlossen).

C. Isolierung von l-N-Aethylsisoraicin:

Der erhaltenen Brühe aus Stufe B werden unter Rühren

7,0 g Oxalsäure zugesetzt. Dann wird unter Verwendung von 6-N—Schwefelsäure die Brühe auf einen pH-Wert von 2 angesäuert"« Die Mischung wird etwa 15 min lang gerührt und unter Verwendung einer geeigneten Filterhilfe abgefiltert. Das Filtrat wird mit 6-N-Aramoniumhydroxid auf einen pH—Wert von 7,0 neutralisiert. Das Filtrat wird durch eine 1 1 Kationenaustau— scherharzsäule in der Ammoniumform geschickt.(beispielsweise durch Amberlite IRC-50). Die verbrauchte Brühe wird verworfen und die Säule mit 2-N-Aromoniumhydroxid eluiert, wobei jeweils Fraktionen von etwa iOO ml abgenommen werden. Die Säuleneluate

10 9 8 1 β ki 0-8 1

werden so überwacht, daß jede Fraktion gegen Staphylococcus aureus ATCG 655-SP einem Scheibentest unterworfen wird. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum auf etwa 100 ml eingeengt, sowie zum Erhalt eines festen Produkxes lyophilisiert. Das Produkt wird mehrere Male mit warnem Äthanol angerieben, abgefiltert und das Filtrat zu einem Rückstand eingedampft. Das erhaltene Produkt wird auf 25 g Silicagel, chromatographiert, wobei die untere Phase eines Chloroforn/Methanol/konzentriertes Ammoniumhydroxid (i : 1 ; l) systems als Eluierungsmittel verwendet wird. Die antibiotische Wirksamkeit aufweisenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, wobei 1-N-Aethylsisomicin erhalten wird.

Beispiel 6
Säureadditionssalze:

A. Sulfatsalze (Schwefelsäureadditionssalze): 5,Og l-N-Aethylsisomicin werden in 25 ml Wasser gelöst und der pH-^Wert der Lösung auf 4,5 unter Verwendung von "1-ST-Schwefelsäure eingestellt. Dann wird unter starkem Rühren in etwa 300 ml Methanol gegossen, das Rühren etwa 10 bis 20 Min. lang fortgesetzt und abgefiltert. Der Niederschlag wird mit Methanol gewaschen und bei etwa 6O°C im Vakuum getrocknet, wobei 1-N-Aethylsisomicinsulfat erhalten wird.

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3. Hydrochloridsalze:

5,0 g 1-N-Aethylsisomicin werden in 25 ml Wasser gelöst» Dann wird mit 2-N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 5 angesäuert. Durch Lyophilisieren erhält man 1-N-Aethylsisomicin~ hydrochlorid.

Beispiel 7
1-N-Acetylsisomicin:

(a) 1,25 g Sisomicinsulfat werden in 200 ml Methanol/Wasser (Volumverhältnis 2 : 3) gelöst und die Lösung abgekühlt. Dann werden 1,5 nil Essigsäureanhydrid zugesetzt und nach etwa 10 min 0,125 ml Triethylamin in 10 ml Methanol innerhalb von 15 min zugegeben. Die Reaktionsmischung wird innerhalb

von 2 h auf Raumtemperatur anwärmen gelassen, und dann das Lösungsmittel im Vakuum entfernt*- Der Rückstand wird in Wasser gelöst und das Produkt durch Durchschicken seiner wässerigen Lösung durch Amberlite IRA-^OlS Harz in der Hydroxylionform in die freie Base umgewandelt. Das Säulen«* eluat wird lyophilisiert und der Rückstand auf 50 g Silicagel chromatographiert, wobei die untere Phase eines Chloroform/. Methanol/7^ Ammoniumhydroxid (2 : i : l) Lösungsmittelsystems als Eluierungsmittel verwendet wird. Die Fraktionen werden mittels Dünnschichtchromatographie überwacht und gleiche. Fraktionen vereinigt, wobei man das l-N-Acetylsisoaicin erhält.

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Ausbeute -0,185 g, F.p. 128°-13O°C,
[a]^⁶ = 159° (0,3 % H₂O),

NiMR : (D₂O) 5 1,22 (3H, s, -C-CH₃); 2,02 (3H, s, NH-CO-CH₃); 2,53 (3H, s, N-CH₃); 4,88 (IH, m, =CH-); 5,08 (IH, d, J=4 Hz, H₁"); 5,35 (IH, d, J=2 Hz, H₁').
Massenspektrum: (M + I)⁺ m/e 490, M+ m/e 489.

Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zubereitungen enthaltend 1-N-Aethylsisomicin oder dessen pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze.

Die Verbindung der Erfindung kann alleine oder in Kombination mit anderen Antibiotika verwendet werden, um das Wachstum von Bakterien zu verhindern oder deren Zahl zu vermindern. Die Verbindung kann beispielsweise zum Desinfizieren von Laboratoriumsgeräten, von zahnärztlichen oder medizinischen Ausrüstung sgegenständen, die durch Staphylococcus aureus oder andere empfängliche Bakterien kontaminiert sind, verwendet werden. Die Aktivität>der Verbindung der Erfindung gegen gramnegative Bakterien lässt sie besonders nützlich erscheinen in der Bekämpfung von Infektionen, die durch gram-negative Organismen, z.B. Proteus und Pseudomonas Arten, verursacht werden.

1-N-Aethylsisomicin kann auch veterinärmedizinisch eingesetzt werden, besonders in der Behandlung von Mastitis in Rindvieh

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und von durch Salmonellen verursachte Diarrhöe in Haustieren, wie Hund und Katze.

Im allgemeinen hängt die zu verabreichende Dosis der Verbindung der Erfindung vorn Alter und Gewicht des Lebewesens, von der Verabreichungsart, vom Typ und von der Schwere der bakteriellen Infektion ab.

Die Verbindung der Erfindung kann oral verabreicht werden. Sie kann auch topisch verabreicht v/erden in der Form von Salben, Cremen oder Lotionen. Pharmazeutische Trägerstoffe für diese Formulierungen umfassen Wasser, OeIe, Fette, Polyester und Polyole.

Zur oralen Verabreichung der Verbindung dieser Erfindung können Tabletten, Kapseln oder Elixire Anwendung finden, die Verbindung kann aber auch dem Tierfutter zugemischt v/erden. Die orale Verabreichung ist besonders günstig im Falle von Infektionen im Gastrointestinaltrakt, die Diarrhöe verursachen.

Im allgemeinen enthalten topische Preparationen ca. 0,1 bis ca. 3,0g der Verbindung der Erfindung pro 100 g Salbe, Creme oder Lotion. Die topische Verabreichung erfolgt ca. 2 bis 5 Mal am Tag.

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33.

Die antibakteriellen Mittel der Erfindung können in flüssiger Form als Lösungen oder Suspensionen zur Anwendung an Ohren, und Augen oder zur parenteralen Verabreichung in Form intramuskulärer Injektionen vorliegen. Inaetionslösungen oder -suspensionen werden gewöhnlich so verabreicht, dass ca. 1 bis 15 mg Wirkstoff pro Kilogramm Körpergewicht in 2 bis 4 Dosen pro Tag in den infizierten Organismus gelangen. Die genaue Dosis hängt von Zustand der Infektionen^ der Empfänglichkeit des infizierenden Organismus und von den'individuellenCharakteristika des zu Behandelnden ab.

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Claims

PATESITANSPRUECHE

1. Die neue Verbindung 1-N-Aethylsisomicin und deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze.

2. l-N-Aethylsisomicinsulfat.

3. Verfahren zur Herstellung von 1-N-Aethylsisomicin und

von dessen pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzen, dadurch gekennzeichnet, dass man in an sich bekannter Weise

A. Sisomicin, das Aminoschutzgruppen in jeder Stellung ausser Stellung 1 haben kann, mit Acetaldehyd in Gegenwart eines Wasserstoff-Donor-Reduktionsmittels umsetzt und vorhandene Schutzgruppen entfernt;

B. 1-N-Acetylsisomicin mit einem Wasserstoff-Donor-Reduktionsmittel umsetzt;

C. eine Mutante der Art.Micromonospora inyoensis und zwar Micromonospora inyoensis Stamm 155OP - IG oder einen Stamm derselben Art, der in seiner Eigenschaft als Produzent der.oben genannten Verbindung dem Stamm 155OF - IG entspricht, in einem Nährmedium, das l-N-Aethyl-2-deoxy-D-streptamin enthält, so lange fermentiert, bis das Medium antibiotische Aktivität aufweist;

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D. Sisomicin, das Aminoschutzgruppen in allen Positionen ausser Position 1 hat und worin die 1-Aminogruppe aktiviert sein kann, mit einem Alkylierungsmittel, das die Aethylgruppe und eine leicht abspaltbare Gruppe enthält, umsetzt, und die Schutzgruppe und etwaige aktivierende Gruppen entfernt;

und dass man nach erfolgter Reaktion gemäss einer der Stufen A) bis D) 1-N-rAethylsisomicin als solches oder als pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz isoliert.

4. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine Verbindung gemäss den Ansprüchen 1 und 2.

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