DE3149608C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Mikroorganismen Pseudomonas Vv= DSM 2180 und Pseudomonas Vv-1=DSM 2181, ein Verfahren zur Herstellung der substituierten Tropolone der Formel I

in der X für eine Troponylmercapto- und Hydroxygruppe durch Züchtung der genannten Mikroorganismen in einem geeigneten Nährmedium und Isolierung der Tropolonverbindungen vom erhaltenen Zellmaterial steht, die Verbindung Bis-[3-hydroxy-2-oxo-cycloheptatrien-(3,5,7)-yl]-sulfid der Formel

und Arzneimittel, welche die mit Hilfe des Verfahrens gewonnenen Verbindungen der Formel I enthalten.

Nicht-substituierte Tropolone und isopropyl-substituierte Tropolone wurden bereits aus Nauturprodukten isoliert, und zwar wurde nicht-substituiertes Tropolon aus Pseudomonaskulturen (speziell Pseudomonas ATCC 31 099) isoliert und als antimikrobiell wirkend bezeichnet (G. D. Lindberg und J. M. Larkin, in J. Nat. Prod. 43 (1980), Seiten 592 bis 594). Aus Pflanzenpreßsaft (Zedern) isolierte alkylsubstituierte Tropolonderivate erwiesen sich in vitro als antibakteriell wirksam (T. J. Trust, Antimicrobial Agents und Chemotherapy (1975), Seiten 500 bis 506; T. J. Trust und R. W. Coombs, Can. J. Microbiol. 19 (1973), Seiten 1341 bis 1346).

Aus Pseudomonaskulturen wurden im übrigen antibiotisch wirksame cyclische Hydroxamsäureverbindungen isoliert (The Journal of Antibiotics 32 (1979), Seiten 1096 bis 1103). Ferner wurden Phenaziniumbetaine aus Pseudomonaskulturen isoliert, über deren Wirkungsspektrum jedoch keine Angaben gemacht werden (J. Chem. Soc. (C) 1969, Seiten 2517 bis 2520).

Von H. Ozawa u. a. (Chem. Abstr. 75 (1971), Seite 61 884m) wurden schließlich Isopropyl- bzw. Aminotropolone untersucht, die als analgetisch, antiinflammatorisch und hypothermisch wirksam beschrieben werden.

Weiterer Stand der Technik ist die Verbindung 7-Hydroxytropolon, hergestellt aus Pseudomonaskulturen (H. Korth und G. Pulverer, in Zeitschrift für Naturforschung 36c (1981), Seiten 728 und 729).

Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, neue Pseudomonasstämme zu schaffen, in bestimmter Weise substituierte Tropolone auf mikrobiologischem Wege herzustellen, sowie eine neue pharmakologisch vorteilhafte Tropolonverbindung zur Verfügung zu stellen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Gegenstände der Patentansprüche 1, 2 und 9. Vorteilhafte Ausführungsformen des Herstellungsverfahrens sind in den Unteransprüchen 3 bis 8 beschrieben.

Gemäß der Erfindung wurden nun ausgehend von Pseudomonaskulturen neue und bekannte antibakteriell wirksame Substanzen mit einem breiten Wirkungsspektrum isoliert.

Diese durch Biosynthese zugänglichen substituierten Tropolone entsprechend der Formel I

in der X für eine Hydroxy- oder Tropolonylmercaptogruppe steht.

Diese beiden Tropolone, und zwar die neue Verbindung Bis-[3-hydroxy-2-oxo-cycloheptatrien-(3,5,7)-yl]-sulfid der Formel

nachstehend kurz Ditropolonylsulfid genannt, und die bekannte Verbindung 7-Hydroxytropolon der Formel

sind biosynthetisch aus Pseudomonaskulturen zugänglich.

Zwar können Tropolone prinzipiell synthetisch erzeugt werden, jedoch erweist sich die biosynthetische Gewinnung als wirtschaftlich günstiger, und gemäß der Erfindung werden die substituierten Tropolone der vorstehenden Formeln dadurch erhalten, daß man eine zur Bildung der Tropolone befähigte Pseudomonasspezies, nämlich Pseudomonas cepacia, Hinterlegungs-Nr. ATCC 17 759 und Pseudomonas-Stämme Vv und Vv-1, hinterlegt bei DSM unter den Nummern DSM 2180 und DSM2181, auf einem geeigneten festen Nährboden oder in flüssigem Nährmedium züchtet und das gebildete Tropolon vom erhaltenen Zellmaterial isoliert.

Geeignete Nährmedien für solche Pseudomonaskulturen sind flüssige Nährmedien (meist auf Glucose- oder Gluconatbasis) oder feste Agarnährböden, die jeweils Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Ammoniumsulfat und Kalilauge enthalten und einen nahezu neutralen pH-Wert haben. Bei der Züchtung auf festen Nährböden werden die gebildeten Kolonien durch Abkratzen geerntet und das gefriergetrocknete gesammelte Material wird mit einem mit rauchender Salzsäure versetzten Extraktionsmittel wie Methanol oder Chloroform etwa 1 Stunde lang zur Extraktion gerührt und der Extrakt säurefrei gewaschen und eingeengt.

Aus flüssigen Kulturen werden die Zellen abzentrifugiert und getrocknet (beispielsweise durch einstündiges Rühren in der 10fachen Acetonmenge und Abzentrifugieren des Materials), wonach das gebildete Tropolon durch Extraktion isoliert wird.

Proben, die weiße, schleimige Kolonien bilden, werden verworfen. Gezüchtet wird der pigmentierte schleimige, insbesondere braune Kolonietyp.

Cysteinzusätze zum Nährmedium (etwa 50 mg/l) und die Zugabe von L-Phenylalanin erweisen sich als günstig. 0,1% Hefezusatz fördert das Wachstum und die Ausbeute der Kultur ebenso wie der Zusatz von Phenylessigsäure zum Gluconatmedium.

Die Züchtungstemperatur liegt vorteilhaft im Bereich von etwa 30 bis 37°C, insbesondere bei 30°C, und die Bebrütungsdauer liegt vorteilhaft bei etwa 2 bis 4 Tagen, insbesondere bei 3 Tagen.

Obwohl die Pseudomonaskulturen Sauerstoff benötigen und bei Züchtung in flüssigen Medien Schichtdicken über 5 cm ungünstig sind, erweist sich ein direktes Durchleiten von Sauerstoff zumindest in späteren Entwicklungsstadien bei eisenhaltigen Kulturen als nachteilig.

In der beschriebenen Weise wurde ausgehend von dem Pseudomonas cepacia-Stamm mit der Hinterlegungs-Nr. ATCC 17 759 Ditropolonylsulfid der Formel I als leuchtend gelbe Substanz erhalten.

Ditropolonylsulfid kristallisiert monoklin (Raumgruppe P2₁) mit starker Neigung zur Zwillingsbildung. Die im Hochvakuum bei 140°C sublimierbare Substanz verfügt über einen Schmelzbereich von 209 bis 211°C. Sie ist in Dimethylsulfoxid sehr gut, in niederen Alkoholen, Chloroform, Tetrahydrofuran und Aceton gut, in Essigester und Äther weniger gut und in Wasser sowie aliphatischen und aromatischen Kohlenwasserstoffen praktisch nicht löslich.

Durch Umsetzung mit Natriumhydroxyid in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, beispielsweise in Tetrahydrofuran, läßt sich das Ditropolonylsulfid in ein gut wasserlösliches Natriumsalz überführen.

Die Elementaranalyse bestätigt die Summenformel C₁₄H₁₀O₄S. Durch Röntgenstrukturanalyse wurde festgestellt, daß das Ditropolonylsulfid monoklin kristallisiert mit 4 Formeleinheiten in der nicht zentrosymmetrischen Raumgruppe P2₁. Die Gitterkonstanten wurden mit dem Einkristalldiffraktometer an Hand von 25 genau vermessenen Reflexen durch eine Ausgleichsrechnung erhalten. Sie betragen:

• a= 7,612 ± 0,003 Å
• b=13,265 ± 0,002 Å
• c=11,812 ± 0,003 Å
• β = 90,280 ± 0,030 Grad
• Zellvolumen: V=1192,600 ų

Die monokline Elementarzelle enthält zwei symmetriunabhängige Molekülsorten, die sich nahezu wie Bild und Spiegelbild verhalten. Sie unterscheiden sich jedoch etwas in dem Winkel, um den die beiden Tropolonringe eines Moleküls gegeneinander verdreht sind, die 77,74° bzw. -73,57° betragen. Die Tropolonringe sind innerhalb der Fehlergrenzen eben.

Die Berechnung der Bindungslängen lieferte folgende Werte:

für die S-C-Bindung
  1,780 Å (was auf eine kovalente Einfachbindung hinweist)
für die C-C-Bindung in 3-4, 5-6 und 1-7 Position:
  1,360 Å (welcher Wert zwischen dem Erwartungswert von 1,340 Å für eine C-C-Doppelbindung und von 1,40 Å für eine C-C- Bindung im aromatischen System liegt)
für die C-C-Bindung in 1-2 und 2-3 Position:
  1,460 Å
für die 2-C-O-Bindung:
  1,250 Å (C=O Erwartungswert von 1,230 Å)
für die 1-C-O-Bindung:
  1,340 Å

Die ¹H- und ¹³C-NMR-spektroskopischen Befunde stehen im Einklang mit den obigen, durch die Röntgenstrukturanalyse erhaltenen Ergebnissen.

¹H-NMR-Spektrum und IR-Spektrum der Substanz sind als Fig. 1 bzw. 2 ersichtlich.

Das oben genannte ¹³C-NMR-Spektrum geht aus Fig. 3 hervor.

Massenspektrometrisch wurde neben dem Molekülpeak bei 274 ein durch den Schwefel im Molekül bedingter relativ großer M + 2 Peak gefunden. Die Fragmentpeaks bei 246 (M-CO) und 218 (M-2CO) bestätigen die Tropolonstruktur.

Eine eingehende Diskussion der ermittelten Daten führt zu der Annahme der beiden Grenzstrukturen für den Tropolonylrest

von denen der Grenzform A sicherlich das höhere Gewicht zukommt.

Bei pharmakologischen Untersuchungen zeigte das Ditropolonylsulfid in vitro ausgeprägte antibakterielle Wirkungen gegenüber einer Vielzahl von Baktierienstämmen der Spezies Staph. aureus, Staph. epidermidis, β-hämat. Strept. (Gruppe A und B), Enterokokken (Strept. faecalis), E. coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter, Serratis marcescens, Indol-positiven und -negativen Proteusarten.

In vivo wurde bei der Maus eine starke Beeinflussung der Infektion mit Streptokokken und Pneumokokken festgestellt.

Die DL₅₀-Werte liegen bei intragastraler Applikation in der Größenordnung der Werte für Tropolon und Bromtropolon. Die Verbindungen wurden als Natriumsalze in wäßriger Lösung bei der Maus getestet. Folgender Werte wurden erhalten:

Ditropolonyl-(3′,3′)sulfid
283 mg/kg
Bromtropolon	255 mg/kg
Tropolon	385 mg/kg

Ferner wurden bei Mäusen beiderlei Geschlechts und 13 bis 17 g Körpergewicht bzw. 17 bis 19 g Körpergewicht die DL₅₀- Werte des in 1% Methylcellulose suspendierten Ditropolonylsulfids subkutan, peroral und intraperitoneal bestimmt. Folgende Werte wurden erhalten:

subkutan
190,5 mg/kg
peroral	167,0 mg/kg
intraperitoneal	90,0 mg/kg

Zum Nachweis der antibakteriellen Wirksamkeit wurden Blättchentests durchgeführt, deren Ergebnis in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt sind. Bei einer Beschickung der Testblättchen mit je 20 µg Ditropolonylsulfid konnte (abgesehen von Pseudomonas aeruginosa) ein überraschend breites Wirkungsspektrum festgestellt werden. Bei allen als "empfindlich" bezeichneten Bakterienstämmen war um die Testblättchen ein deutlicher Hemmhof zu beobachten.

Tabelle

Antibakterielles Wirkungsspektrum von Bis-[3-hydroxy-2-oxo-cycloheptatrien-(3,5,7)-yl]- sulfid

Die im Plattentest erarbeitete MHK (Minimale Hemmkonzentration) des Tropolonderivats lag bei je 10 Staphylococcus aureus-Stämmen, koagulase-negativen Staphylokokken und Mikrokokken zwischen 12,5 und 50,0 µg/ml. Bei je zwei getesteten Stämmen von E. coli, Enterobacter, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens waren ähnliche MHK-Werte festzustellen. Die beiden Pseudomonas aeruginosa-Stämme zeigten dagegen MHK-Werte von 100,0 bzw. <100,0 µg/ml.

Als weiteres Tropolonderivat mit besonders intensiver antimikrobieller Wirksamkeit, insbesondere gegen Staph. aureus- und Pseudomonas aeruginosa-Stämme wurde das 7-Hydroxytropolon der Formel II aus einem Pseudomonas- Stamm isoliert, und zwar wurde aus Rheinwasser der Pseudomonas-Stamm Vv (hinterlegt bei DSM unter der Nr. DSM 2180) angezüchtet.

Eine Mutante dieses Stammes produziert ebenfalls 7-Hydroxytropolon. Diese Mutante wurde bei DSM hinterlegt unter der Nr. DSM 2181.

Diese Stämme fallen durch eine starke Hemmwirkung gegenüber anderen Bakterien auf. Es handelt sich bei diesen Stämmen um streng aerobe, gram-negative, lophotrisch begeißelte Stäbchen, welche Glucose und Gluconat als einzige C-Quellen, Ammoniumsalz und Nitrat als einzige N-Quellen verwerten können. Arabinose (d- und l-), Xylose, Mannit, Inosit, Saccharose, Stärke, Maltose und Cellobiose werden nicht fermentiert. Alle weiteren Untersuchungsergebnisse sprechen für die Zugehörigkeit dieser Stämme zur Pseudomonas-Gruppe, eine sichere Spezies-Zuordnung war dagegen nicht möglich.

Die Züchtung erfolgte auf eisenfreien Glukonatmedien oder mit Fe⁺⁺⁺-Zusatz in Anwesenheit von L-Phenalalanin, Phenylessigsäure oder Phenyläthylalkohol. Die Substanz wird mit Äther, Chloroform oder Dichlormethan extrahiert.

Im Falle der Vewendung der oben genannten Mutante Nr. DSM 2181 kann die Kultivierung vorteilhaft bei Raumtemperatur erfolgen.

Die erhaltene Verbindung, das 7-Hydroxytropolon der Elementarzusammensetzung C₇H₆O₃ ist außerordentlich flüchtig und bildet weiße Kristalle, die sich durch geringste Eisenspuren braunrot färben. Sie zeigt das Verhalten einer aromatischen Hydroxysäure und ist in Bicarbonatlösung leicht löslich.

Das Massenspektrum dieser Verbindung zeigte von M⁺ (m/z 138) ausgehend nur Fragmentierungssequenzen durch sukzessiven Verlust von CO, CHO und H₂O in unterschiedlicher Reihenfolge, das ¹H-NMR-Spektrum ein AA′BB′-Muster (4H), Zentrum bei 7,38 ppm sowie ein breites Singulett bei 8,37 ppm (2H, das bei Zusatz von D₂O verschwindet). Im IR- Spektrum finden sich CO- (1610 cm^-1) und OH- (3230 cm^-1) Banden in dem für Tropolone typischen Bereich.

Ein Vergleich der physikalischen Eigenschaften mit Literaturdaten (Fp, IR-, UV- und ¹H-NMR-Spektren) ergibt eindeutig, daß es sich bei der isolierten Verbindung 7-Hydroxytropolon auch um eine neue Verbindung handelt.

Das 7-Hydroxytropolon hat einen Schmelzpunkt von 134 bis 135°C. Massenspektrometrisch wurden folgende Daten ermittelt: (Finnigan 3200, 70 eV, direkt) 138 (M⁺) 49%, 110 (M-CO) 100%, 92 (M-CO-H₂O) 15%, 82 (M-2 CO) 14%, 81 (M-CO-CHO) 21%, 64 (M-2 CO-H₂O) 46%, 63 (M-CO-CHO-H₂O) 37%, 53 (M-2 CH-CHO) 38%, 52 17%, 51 30%, 50 28%. IR (Film auf NaCL) 3230, 1610, 1530, 1520, 1435, 1405, 1290, 1270, 1250, 1230, 1180, 1000, 910, 855, 730 cm^-1. UV (CH₃OH) 245 (4,56), 324, (3,78), 355 (Schulter), 365 (3,85), 375 (3,88) nm, (log). NMR (90 MHz, CDCl₃, TMS): AA′BB′-System zentriert bei 7,38 ppm (4 H); breites Singulett 8,37 ppm (2 H, verschwindet bei D₂O-Zusatz).

Das rein dargestellte 7-Hydroxytropolon wurde auf seine antibiotische Aktivität überprüft. Die folgenden 183 frisch aus Klinikmaterial angezüchteten Bakterienstämme wurden getestet:

1. Gram-positive Erreger
Staphylococcus aureus
10 Stämme
Koagulase-negative Staphylokokken	10 Stämme
Mikrokokken	9 Stämme
Streptococcus faecalis (Enterokokken)	10 Stämme
Streptococcus pyogenes (Gruppe A)	8 Stämme
Streptococcus agalactiae (Gruppe B)	10 Stämme
Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken)	1 Stamm

2. Gram-negative Erreger
Escherichia coli
20 Stämme
Citrobacter intermedius	2 Stämme
Citrobacter freundii	6 Stämme
Klebsiella pneumoniae	13 Stämme
Klebsiella oxytoca	9 Stämme
Enterobacter cloacae	11 Stämme
Enterobacter aerogenes	3 Stämme
Serratia marcescens	13 Stämme
Proteus mirabilis	15 Stämme
Proteus morganii	4 Stämme
Proteus vulgaris	5 Stämme
Proteus rettgeri	1 Stamm
Pseudomonas aeruginosa	20 Stämme
Pseudomonas-Gruppe	1 Stamm
Acinetobacter calcoaceticus	2 Stämme

Die Differenzierung der Stämme erfolgte nach dem Bergey's Manual (8. Ausgabe). Als Kontrolle wurden folgende Stämme mitgetestet:

Staph. aureus SG 511-Jena
Staph. aureus ATCC 25 923
E. coli ATCC 25 922
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27 853

Zur Empfindlichkeitstestung wurde der Blättchentest auf Müller-Hinton-Agar (Oxoid Nr. 4) herangezogen. Die Vorkultur der Stämme erfolgte in Müller-Hinton-Bouillon (Oxoid). Bei den Streptokokken und Pneumokokken wurde dem Agarmedium 5% defibriniertes Hammelblut zugegeben. Die Oberfläche der Agarplatten wurde mit je 1 ml der Übernachtkulturen (Keimkonzentrationen rd. 10⁵ bis 10⁶/ml) beimpft, nach Trocknen wurden die Testblättchen aufgelegt, welche mit 100 γ 7-Hydroxytropolon beschickt worden waren. Die Ergebnisse wurden nach 18stündiger Bebrütung bei 37°C abgelesen. Alle 183 Bakterienstämme zeigten um die Testblättchen sehr deutliche Hemmhöfe mit einem Radius vom Blättchenrand aus von 10 bis 30 mm (im Durchschnitt lag der Radius bei 20 mm).

Die antimikrobielle Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Tropolonderivate und ihrer pharmakologisch verträglichen Salze bietet eine willkommene Bereicherung der modernen Therapie, und die Erfindung umfaßt mithin pharmazeutische Zubereitungen, die die Verbindung des Anspruchs 9 oder ein pharmakologisch verträgliches Salz derselben, vorzugsweise ein Alkalisalz, zusammen mit üblichen Hilfs- und/oder Trägermitteln enthalten.

Diese Zubereitungen können digestiv verabreicht, injiziert oder lokal angewendet werden. Sie werden dafür z. B. als Tabletten, Dragees, Kapseln, Zäpfchen, Lösungen oder Pasten dargeboten. Die Applikation erfolgt z. B. intraperitoneal, intravenös oder subkutan, vorzugsweise aber per os oder lokal. Die Tagesdosis richtet sich nach der Schwere der Erkrankung, der Art der Applikation und dem Allgemeinbefinden des Patienten.

Nachfolgend wird die Herstellung der erfindungsgemäßen Tropolonderivate an Hand von Beispielen beschrieben:

Beispiel 1 Gewinnung von Ditropolonylsulfid ausgehend von Agar-Plattenkulturen a) Kulturmedium

4 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat (7 H₂O), 5 g Ammoniumsulfat, 18 g Bacto-Agar und 15 g Natriumgluconat wurden in 1 l Wasser gelöst und im Dampftopf sterilisiert. Dazu wurden 10 ml einer gesondert im Dampftopf sterilisierten 0,5%igen Eisencitratlösung hinzugefügt. Die Mischung wurde mit 30%iger KOH auf pH 7,2 eingestellt und in Platten gegossen.

b) Kulturstamm

Als Kulturstamm diente der Pseudomonas cepacia-Stamm mit der Hinterlegungs-Nr. ATCC 17 759, mit dem die Kulturplatten geimpft wurden.

c) Bebrütung

Die Bebrütung erfolgte bei 30°C. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei der Bruttemperatur gehalten.

Bei Zugabe von 10% DST-Oxoid-Fertignährböden während der Herstellung der Kulturplatten wachsen die Kolonien größer (DST-Oxoid-Fertignährboden allein liefert gelbliche Kolonien im Gegensatz zu den dunkelbraunen Kolonien auf dem vorstehend genannten Nährsubstrat).

d) Aufarbeitung

Das Bakterienmaterial wurde von den festen Nährböden abgekratzt und gefriergetrocknet. 600 g gefriergetrocknetes Zellmaterial wurde mit 6 l Chloroform, dem zuvor 0,4 l rauchende Salzsäure zugesetzt worden waren, ohne äußere Wärmezuführ 2 Stunden lang extrahiert. Danach wurde die Flüssigkeit filtriert und der Rückstand noch 2mal wie beschrieben behandelt. Die vereinigten Filtrate wurden säurefrei gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, klarfiltriert und bei 40°C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Der dabei verbleibende Rückstand wird 3mal mit je 0,5 l 10%iger Natriumcarbonatlösung unter Erwärmen ausgezogen. Die vereinigten, filtrierten Extrakte werden anschließend mit Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt, wobei die Substanz als hellgelber mikrokristalliner Niederschlag ausfällt. Das Produkt wird abgenutscht, säurefrei gewaschen und bei 40°C 20 Stunden im Vakuumtrockenschrank getrocknet.

Zur weiteren Reinigung wird die Substanz bei 140°C und 10^-5 bar langsam sublimiert. Es resultieren intensiv gelb gefärbte säulenförmige Kristalle.

C₁₄H₁₀O₄S (274,29):
berechnet:
C 61,32%; H 3,67%; O 23,33%; S 11,69%
gefunden:
C 61,22%; H 3,65%; O 23,28%; S 11,68%

Beispiel 2 Gewinnung von Ditropolonylsulfid ausgehend von Flüssigkulturen a) Kulturmedium

Für die Flüssigkulturen wurde das gleiche Nährsubstrat ohne Agar (allerdings wiederum mit DST-Oxoid-Fertignährboden in gleicher Weise wie in Beispiel 1) verwendet. Das Kulturmedium wurde in 1-l-Rundkolben (je 250 ml) gegeben.

b) Kulturstamm

Pseudomonas cepacia ATCC 17 759 wie in Beispiel 1.

c) Bebrütung

Die Bebrütung erfolgte bei 30°C. Bei Bebrütung ohne zusätzliche Belüftung und Schüttelung wurden die Kulturen frühestens nach 3 Tagen aufgearbeitet. Ein Zusatz von Cystein (50 mg/l) oder von 0,1% Hefeextrakt erwies sich als zweckmäßig in bezug auf Wachstum und Ausbeute.

d) Aufarbeitung

Die bebrüteten Flüssigkulturen wurden vereinigt und die Zellen nun eine Stunde in etwa der 10fachen Menge Aceton gerührt, abzentrifugiert und derselben Behandlung ein zweites Mal unterworfen. Sie wurden nach Abzentrifugieren (oder Abfiltrieren) gut mit Methanol gewaschen und darauf in der 10fachen Menge Methanol suspendiert. Dieser Suspension wurde unter Rühren etwa 5 bis 10% rauchende Salzsäure hinzugefügt. Es wurde eine Stunde lang weitergerührt. Nun wurde das gleiche Volumen Chloroform hinzugefügt und darauf etwa das doppelte Volumen Wasser. Die Flüssigkeit trennte sich in zwei Schichten. Die Chloroformschicht wurde abgelassen und zur Beseitigung der entstandenen Emulsion zentrifugiert. Die braune Chloroformlösung wurde in leichtem Vakuum eingedampft und hinterließ einen braunschwarzen Rückstand. Dieser wurde mit 10%iger Natriumbicarbonatlösung behandelt. Das Produkt ging nun mit gelber Farbe in Lösung. Es wurde mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Dabei fiel schon der größte Teil des schon fast reinen Antibiotikums aus. Es wurde in Chloroform aufgenommen und wieder im leichten Vakuum zur Trockne gebracht. Zur weiteren Reinigung wurde das gelbe Pulver mit rauchender Salzsäure 24 Stunden stehen gelassen, wieder in Chloroform aufgenommen, gut mit Wasser gewaschen und zur Trockene verdampft. Es wurde zur Analyse aus Aceton umkristallisiert.

Das Produkt zeigte die gleichen Eigenschaften wie in Beispiel 1.

Die dünnschichtchromatographische Untersuchung (Cellulose- Fertigplatten der Fa. Merck, Darmstadt, Fließmittel n-Propanol/Wasser/Essigsäure/Dioxan=5/15/10/10, Entwicklung unter Kammersättigung) ergab eine einheitliche Substanz.

Beispiel 3 Gewinnung von Ditropolonylsulfid aus mannit- oder xylosehaltigem Nährmedium a) Kulturmedium

Das Kulturmedium enthielt 4 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 7 H₂O, 5 g (NH₄)₂SO₄, 15 g Mannit oder Xylose auf 1 l Wasser. Nach dem Sterilisieren wurde der pH- Wert auf 7,4 eingestellt.

b) Kulturstamm

Pseudomonas cepacia ATCC 17 759.

c) Bebrütung

Die Flüssigkulturen wurden unter starker Belüftung durch Rühren bei 30°C bebrütet. Wenn eine kleine Probe bei Zusatz von Fe⁺⁺⁺ eine starke Rotfärbung zeigte, wurde die Kultur aufgearbeitet (nach 3 Tagen).

d) Aufarbeitung

Die Kultur wurde nach Ansäuern (mit HCl) auf pH 3,0 bis 4,0 mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde zur Trockene gebracht, und der Rückstand wurde mit Methanol (zur Entfernung der stark störenden Polyhydroxybuttersäure) extrahiert. Das Methanol, das die Substanz enthielt, wurde abgedampft, und der Rückstand wurde mit Bicarbonat extrahiert. Nach Ansäuern der Lösung fiel die gesuchte Substanz aus.

Beispiel 4 Gewinnung von 7-Hydroxytropolon a) Kulturmedium

Als Kulturmedium diente ein Gluconatmedium mit 4 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 7 H₂O, 5 g (NH₄)₂SO₄, 10 g Glucose ad 1000 ml aqua dest., pH 7,5.

b) Kulturstamm

Pseudomonas-Stamm Vv (DSM Nr. DSM 2180).

c) Bebrütung

Die Flüssigkulturen wurden 3 bis 4 Tage lang bei 30°C ohne zusätzliche Belüftung durch Schütteln oder Rühren bebrütet.

d) Aufarbeitung

Die gesuchte Substanz wurde aus der Flüssigkultur nach Ansäuern mit HCl auf pH 3,0 mit Dichlormethan (2 × 250 ml auf 500 ml Kulturflüssigkeit) extrahiert. Die mit Natriumsulfat getrocknete Dichlormethanlösung hinterließ nach dem Abdampfen einen gelblich-bräunlichen Rückstand, von dem, auch schon ohne daß ein Vakuum angelegt wurde, der größte Teil sublimierte und sich am oberen Kolbenrand in Form weißter Kristalle abschied. Diese Kristalle färbten sich schon beim Berühren mit Eisenspateln oder durch geringste Eisenspuren braunrot. Das Ergebnis der Analyse dieser Substanz ergab, daß es sich um das 7-Hydroxytropolon handelt. Fp (im abgeschmolzenen Röhrchen) 134 bis 135°C.

Die Elementaranalyse für C₇H₆O₃ (M=138; massenspektrometrisch bestimmt) ergab folgende Werte:

berechnet:
C 60,85%; H 4,38%; O 34,77%;
gefunden:
C 61,01%; H 4,55%; O 34,55%.

Die Lösung gab mit Staph. aureus und verschiedenen Pseudomonas aeruginosa-Stämmen starke antibiotische Effekte.

Das überdestillierte Dichlormethan enthielt noch geringe Anteile der außerordentlich flüchtigen Substanz, die mit Bicarbonat wieder ausgeschüttelt wurden.

Beispiel 5 Gewinnung von 7-Hydroxytropolon, Kulturstamm: Pseudomonas-Stamm Vv (DSM Nr. DSM 2180)

Die Anreicherung dieses Produktes wurde in folgendem Medium durchgeführt:
KH₂PO₄ 4 g, MgSO₄ (7 H₂O) 0,5 g, (NH₄)₂SO₄, 5 g, Glucose 10 g, pH 7,4 mit KOH. 1 l dieses Mediums wurde mit dem Pseudomonas Vv beimpft, die Bebrütung erfolgte bei Zimmertemperatur unter starker Belüftung mittels Magnetrührer. Nach einem 3tägigen Wachstum wurde die Kultur auf pH 3,0 angesäuert und dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand unter normalem Luftdruck bei 100°C sublimiert. Dabei konnte als weiße kristalline Substanz das 7-Hydroxytropolon gewonnen werden.

Beispiel 6 Gewinnung von 7-Hydroxytropolon a) Kulturmedium

Als Kulturmedium diente ein Gluconatmedium mit 2 mg Eisensulfat, 4 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄ · 7 H₂O, 5 g (NH₄)₂SO₄, 10 g Glucose ad 1000 ml aqua dest., pH 7,5.

b) Kulturstamm

Pseudomonas-Stamm Vv (DSM 2180).

c) Bebrütung/Aufarbeitung

Bebrütung und Aufarbeitung wie in Beispiel 4 beschrieben, wobei allerdings die Bebrütungstemperatur bei Raumtemperatur lag.

Claims (10)

1. Pseudomonas Vv=DSM 2180 und Pseudomononas Vv-1=2181.

2. Verfahren zur Herstellung der substituierten Tropolone der Formel I in der X für eine Troponylmercapto- und Hydroxygruppe steht, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung der Verbindung der Formel I, in der X für die Troponylmercaptogruppe steht, den Pseudomonas-Stamm cepacia - ATCC 17 759 - und zur Herstellung der Verbindung der Formel I, in der X für die Hydroxygruppe steht, die Pseudomonas-Stämme Vv DSM 2180 oder Vv-1 DSM 2181 auf einem geeigneten festen Nährboden oder in flüssigem Nährmedium züchtet und das gebildete Tropolon vom erhaltenen Zellmaterial isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Glucose- oder Gluconatnährmedium einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium mit Cystein-, Hefe-, L-Phenylalanin- oder Phenyl­ essigsäurezusatz einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein eisenhaltiges Nährmedium einsetzt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein flüssiges Nährmedium in einer Schichtdicke bis 5 cm einsetzt und in den ersten 24 Stunden zusätzlich belüftet und die Kultur bei 30°C für 3 Tage bebrütet.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur in eisenfreiem xylosehaltigen flüssigen Medium unter starker Belüftung züchtet, bis mit Fe⁺⁺⁺ eine intensive Rotfärbung erhalten wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3, 4, 5 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man im Falle des Einsatzes von Pseudomonas Vv-1 DSM 2181 die Kultivierung bei Raumtemperatur durchführt.

9. Bis-[3-hydroxy-2-oxo-cycloheptatrien-(3,5,7)-yl]-sulfid der Formel

10. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Verbindung des Anspruchs 9 oder deren pharmakologisch verträglichem Salz zusammen mit üblichen pharmazeutischen Träger- und/oder Hilfsstoffen.