DE2928373C2

DE2928373C2 - Antibiotika KA-7038I bis KA-7038VII, deren Salze, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende antibiotische Mittel

Info

Publication number: DE2928373C2
Application number: DE2928373A
Authority: DE
Inventors: Takeo Deushi; Hisakatsu Kawagoe Itoh; Akio Iwasaki; Kazuhiro Mizoguchi Toshimi Kamiya; Toshihito Higashimurayama Mori; Masahito Higashimurayama Nakayama
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1978-07-13
Filing date: 1979-07-13
Publication date: 1983-01-05
Also published as: NL7905464A; FR2457893A1; ES482443A1; GB2028806A; US4329426A; FR2430951B1; IT7924358A0; FR2457893B1; DE2928373A1; GB2028806B; FR2430951A1; US4312858A; IT1122181B

Description

Die Erfinr*"ng betrifft eine neue antibiotische Substanz KA 7038. die aus mehreren Verbindungen, nämlich den als Antibiotika KA-70381 bis KA-7038VII bezeichneten Verbindungen besteht. Die Erfindung betrifft weiterhin diese Verbindungen enthaltende antibiotische Mittel und ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.

Es wurde ein Antibiotika erzeugender Stamm der Gattung Streptomyces aus der Erde von Sannan-cho. Hikami-gun, Hyogo Prefecture, Japan, isoliert. Aufgrund der morphologischen und physiologischen Eigenschaften sowie der Wachstumseigenschaften, wie hierin beschrieben, wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß es sich um pine neue As t der uattung Streptomyces. bezeichnet all Streptomytxs sp. KC-7038, handelt. Der Stamm KC-703« \*mdc am 31 Januar 1978 beim Fermentation Research Institute. Agenc\ of Industrial Science & Technolog), lap.in unter der Hinterlegungsnummet FERM-P Nr. 4388, bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC Ji 530 und bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter den Nummern DSM 1594 und DSM 1771 hinterlegt.

Es wurde bestätigt, daß die von dem Stamm KC-7038 erzeugten Antibiotika keine in der Literatur beschriebenen Substanzen sind und daß sie eine antibakteriell Wirkung gegen grampositive Bakterien und gramnega live Bakterien haben. Die antibiotische Substanz wurde als Substanz KA-7038 bezeichnet.

Weitere Untersuchungen haben ergeben, daß die Substanz KA-7038 in sieben Antibiotika, nämlich KA-70381. KA 703811. KA-7038III. KA-7038IV. KA-7038V. KA-7038Vi und KA-7038VII. aufgetrennt werden kann und daß diese leicht durch Behandlung mit Sauren in ihre Säureaddiiionssalze umgewandelt werden können.

Die als Antibiotika KA-70381 bis KA-7038VII bezeichneten Verbindungen haben folgende Strukturformeln und Eigenschafien:

Verbindung KA-70381;

Die Verbindung KA-70381 hat die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften:

Molekularformel: C_nH₃₅O₅N₅

spezifische Drehung: [a]% + 120,5° (c 1, H₂O)

Schmelzpunkt: 83 bis 90°C IR-Spektrum: Fig. 1

ίο Verbindung KA-7038II:

NH₂

OH

NH,

NHCH₃

Formel II

Die Verbindung KA-7038H hat die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften:

Molekularformel: Ci₃H₂₈O₄N₄ spezifische Drehung: \a]² _D ^s + 61° (c 1, H₂O) Schmelzpunkt: 85 bis 102°C IR-Spektrum: Fig. 2

Verbindung KA-7038III:

NH₂

CH₃

Die Verbindung KA-7038III hat die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften:

Molekularformel: C,_SH₃₂O₄N₄ spezifische Drehung: [*]£ + 78° (el, H₂O) Schmelzpunkt: 74 bis 83⁰C IR-Spektrum: Fig. 3

Verbindung KA-7038IV:

NH₂

OH

CH₃

OCH₃

COCH₂NH₂ Formel 1

NH₂

OCH₃

NHCH₃ Formel IV

Die Verbindung KA-7O.18IV hat die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften:

Molekularformel; CnH₃₀O₅N₁ spezifische Drehung: [a]£ + 115° (eO.l, H₂O) Schmelzpunkt: 78 bis 82°C
IR-Sp«ktrum:Fig. 4

Verbindung KA-7038V:
CH₂NH₂

NH,

OCH₃

NH₂

NHCH₃

Formel V

Die Verbindung KA-7038V hat die folgerten chemischen und physikalischen Eigenschaften:

Molekularformel: C₁₄H₃₀O₄N₄

spezifische Drehung: [a] ¹J + 98° (eOJ, H₁O)

iR-Spektrum: Fig. 5

Verbindung KA-7038V1:

CH₂NHCH₃ NH₂

OCH₃

Die neuen antibiotischen Substanzen gemäß der Erfindung werden hergestellt durch ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces sp KC-7038 FERM-P Nr. 4388 aerob in einem Nährmedium in einem pH-Bereich von etwa 4 bis 10 etwa 2 bis ecwa !ü Tage bei etwa 20 bis 35°C züchtet und die Antibiotika KA-70381 bis KA-7038V11 nach üblichen Verfahren aus der Kulturflüssigkeit abtrennt und gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz überführt.

Nachfolgend werden die morphologischen und physiologischen Eigenschaften sowie die Wachstumseigenschaften des Stammes Streptomyces sp. KC-7038 angegeben. Wenn nichts anderes angegeben ist, dann wurden die Eigenschaften auf verschiedenen Kulturme-

IJ dien nach üblichen Methoden nach 21tägiger Kultivierung bei 27° C beobachtet Die Farben sind für die reife Kultur gemäß der Klassifizierung vcn »Color Harmony Manual« (Container Corp. Amer. 1958) angegeben.

I. Morphologische Eigenschaften

Dieser Stamm erzeugt sowohl Substrathyphen als auch Lufthyphen. Das Luftmycelium ist in einfacher Weise verzweigt Die Kette der reifen Sporen bildet

kompakte Spiralen. Die Spiralen sind in zwei bis drei Umdrenungen ausgebildet Es wird keine Bildung von Sporenträgern beobachtet Die Sporen haben eine ovale bis zylindrische Gestalt mit den Abmessungen 03 bis 0,6 χ 0,8 bis 1.2 Mikron, wobei 20 oder mehr solcher

χ Sporen auf jeder Sporenkette gebildet sind. Die Oberfläche der Sporen ist leicht rauh, wird aber als glatt angesehen (weil kein klares skierotisches Körnchen gebildet ist).

NH₂

35

40

Die Verbindung KA-7O38VI hat die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften:

Molekularformel: C₁₃H₃₂O₄N_{4 45}

spezifische Drehung: [a]% + 5ΐ° (c 1, H₂O) IR-Spektrum: Fig. 6

Verbindung KA-7038VU: CH₂NH₂ O

50

3.

OCH₃

NH₂

NHCH₃

Formel VII

55

60

Die Verbindung KA-7038VII hat die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften: Molekularförtnei: CnH₃₀O₄N₄

spezifische Drehung [a] j? + 59° (c 1, H₂O)

IR-Spektrum: Fig. 7.

M. Kultureigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien

Saccharosenitratagar:
Wachstum: gering, farblos
Luftmycelium: mäBig, pulverförmig,

staubbraun (2 Ii).
lösliches Pigment: keines

Glucose-Asparagin-Agar:

Wachstum: mäßig, cremefarben (I '/2 ca) Luftmycelium: mäßig, pulverförmig,

weiß (a) bis staubbraun (2 Ii)
lösliches Pigment: keines

Glycerin-Asparagin-Agar:
Wachstum: gering, farblos
Luftmycelium: gering, pulverförmig, weiß (a) Ii⁵iliches Pigment: keines

anorganisches Salz-Stärke-Agar: Wachstum: gut, perlförmig (3 ba) Luftmycelium: gut. pulverförmig,

weiß (a) bis silbergrau (3 fe)
lösliches Pigmrnt: keines

Tyroiin-Agar:

Wachsium: gut, elfenbeinfarben (2 db) Luftmycelium: mäßig, pulverförmig, weiß (a) lösliches Pigment: keines

Nähr.-gar.

Wachstum: gut, lederfarben (2 fb) Luftmycelium: keines
lösliches Piement: keines

7 Hefeextrakl-Malzextrakt Agar:

Wachstum: gut, hell-weizenfarben (2 ea) Luftmycelium: gering, pulverförmig, weiß (a) lösliches Pigment: keines

8. Hafermehlagar:
Wachstum: mäßig, farblos
Luftmycelium: gut. pulverförmig.

staubbraun (2 Ii)
lösliches Pigment: keine«:

9. Pepton-Hefeextrakt-Eiscn-Agar: Wachstum: gut, cremefarben (I '/ι ca) Luftmycclium: keines

lösliches Pigment, schwach gelb

III. Physiologische Eigenschaften

1. Wachstumstemperaturbereich: 17 bis 37"C

2. Geiatineverfiussigung: positiv

3. .Stärkehydrolyse: positiv

4. Wirkung auf Milch: kein Wachstum

5. Bildung von Melanoidpigment: negativ

IV. Verwertung von Kohlenstoffquellen

Auf einem Pridham-Gottlieb-Agarmedium werden I.Arabinose.C-Xylose, D-Glucose, D-Fructose. Saccharose. Inosit, L-Rhamnose, Raffinose und D-Mannit nicht verwertet. Auf einem Medium, das durch Entfernen von Kupfersulfat von dem obigen Kulturmedium erhalten wird, werden D-Xylose und D-Glucose verwertet.

V. Zellwand

LL-Oianiinopimelinsnure wurde als Komponente der /ellwand gebildet.

Aufgrund der obi_r ^-on Eigenschaften wird davon ausgegangen, daß der .Siamni KC-7038 zu der Gattung Streptomycins gehört. Arten, die Spiralsporenketten. weiße bis ^raue l.uftmveel'.cn und Sporen mit einei glatten Oberfläche enthalten und die kein lösliches Pigment erzeugen und weder Inosit noch Saccharose verwerten, wurden aus bekannten Stämmen, beschrieben in Bergey's Manu.il of Determinative Bacteriology, 8. Auflage (1975), ISP-Stämmen von Shirline und Gottlieb und »The Aciinomycetes« von Waksman. durch Screening ermittelt. Als Ergebnis wurden Streptomycin argenteoltis (ISP 5226), Streptomyces griseolosiiffucus (IMET |A J708). Streptomyces griseofuscus (ISP 5191) und Streptomyces pyridomyceticus (ISP 5024) ermittelt.

Der Stamm KC-70W unterscheidet sich jedoch eindeutig von Streptomyces argenteolus. Streptomyces gnseolosuffucus und Streptomyces griseofuscus in der Verwertung von Kohlenstoffquellen mit Ausnahme von Inosit und Saccharose. Andererseits hat der Stamm KC-7038 mit Streplomyces pyridomyceticus die gemeinsame Eigenschaft, daß er auf dem Pridham-Gott lieb-Agarmedium nicht alle Kohlenstoffquellen verwertet. Die Stämme unterscheiden sich jedoch durch die folgenden Eigenschaften.

Das Wachstum von Streplomyces pyridomyceticus auf verschiedenen Medien von ISP ist geringer als dasjenige des Stammes KC-7038, und es werden kaum Luftmycelien beobachtet. Der Stamm KC-7038 wächst nicht in einem Magermilchmedium, und seine Gelatineverflüssigung ist positiv. Dagegen zeigt Streptornyccs pyridomyceticus bei der Gelatineverflüssigung ein negatives Ergebnis, und der Stamm wächst in einem Magermilchmedium. Die Stämme unterscheiden sich weiterhin hinsichtlich der Verwertung von Glucose und Saccharose in einem Pridham-Gottlieb-Medium, aus dem Kupfersulfat entfernt worden ist. Auch die resultierenden Metaboliien unterscheiden sich voneinander.

, Aus den obigen Versuchsergebnissen ist die Schlußfolgerung gezogen worden, daß der erfindungsgemäße Stamm in keine der bekannten Arten fällt und daß er eine neue Art ist. Er wurde von den Erfindern als Streptomyces sp. KC-7038 bezeichnet.

ίο Der erfindungsgemäß verwendete Stamm kann durch künstliche Mulierungsmaßnahmen mutiert werden, beispielsweise mit Ullraviolettlicht. Röntgenstrahlen, verschiedenen Chemikalien, wie Nitrosoguanidinen, Nitrosoharnstoff oder Mitomycin etc. Alle solchen Mutanten, die die Fähigkeit haben, die antibiotische Substanz KA-7038 zu erzeugen, können erfindungsgemäß verwendet werden.

Geeignete Kulturmedien zur Züchtung des die erfindungsgemäßen Verbindungen erzeugenden Stammes der Gattung Streptomyces sind z. B. Kohlenstoff- und Slickstoffquellcn und als fakultative Bestandteile anorganische Salze (Mineralien), sehr kleine Mengen von Schwermetallen etc.

Verschiedene Kohlenstuffquellen können verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Gl"cose. Stärke. Saccharose, Fructose, Dextrin, Molassen und Glycerin, die entweder allein oder als geeignete Gemische verwendet werden können. Kohlenwasserstoffe. Alkohole, organische Säuren und

ίο Pflanzenöle können gleichfalls verwendet werden, wenn der verwendete Stamm sie als Kohlenstoffquelle verwerten kann.

Beispiele fur geeignete Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl. Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Peptone.

J5 Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit, Casaminosäure, Distiller's lösliches Produkt, Ainmoniumchlorid, Ammoniiimsulfat. Ammoniumnitrat. Harnstoff und Natriumnitrat, die entweder für sich nder als geeignete Gemische verwendet werden können. Beispiele für anorganische Salze sind Natriumchlorid, Nitrate, Calciumcarbonat, Kaliumchlorid. Kobaltchlorid und Eisen(ll)-sulfat.

Anorganische Substanzen und organische Substanzen (/. B. Aminosäuren), die das Wachstum des Stammes fördern und die Bildung der erfindungsgemäßen Verbindungen fördern, können gleichfalls, wie erforderlich, zu dem Kulturmedium zugesetzt werden.

Bei Verwendung einer Belüftungskultivierungsmethode kann auch ein Antischaummittel, z. B. ein Fettsäureöl, Siliconöle. Baumwollsamenöl oder Paraffin.

zu dem Kulturmedium zugesetzt werden.

Die Kultivierung kann in einem festen Medium durchgeführt werden. Vorzugsweise wird jedoch, wie bei dem allgemeinen Herstellungsverfahren von Antibiotika, ein flüssiges Kultivierungsverfahren, insbesondere ein Tauchkultivierungsverfahren. angewendet. Die Kultivierung erfolgt unter aeroben Bedingungen, wobei die Kultivierungsiemperatur etwa 20 bis 35"C, mehr bevorzugt etwa 24 bis etwa 27°C, beträgt Während der Kultivierung wird der pH-Wert des Kulturmediums bei etwa 4 bis etwa 10 gehalten. Die Kultivierungszeit beträgt im allgemeinen etwa 2 Tage bis etwa 10 Tage.

Als Ergebnis der Kultivierung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen erzeugt und diese sammeln sich in der Kuiturbrühe an. Wenn die Menge der in der Kulturbrühe erzeugten erfindungsgemäßen Verbindungen ein Maximum erreicht, dann wird die Kultivierung abgebrochen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können aus der Kulturbrühe gesammelt werden.

Da die erfindungsgemäßen Verbindungen basische Substanzen sind, die in Wasser löslich sind, jedoch in den üblichen organischen Lösungsmitteln nur schwer löslich sind, können sie aus der Krlturbrühe durch Methoden abgetrennt werden, die üblicherweise zur Isolierung und Reinigung von in Wasser löslichen basischen Antibiotika angewendet werden. So kann z. B. ein Adsorptions-Desc/^tions-Verfahren unter Verwendung eines lonenauslauscherharzes, von Aktivkohle etc, ein säulenchromatographisches Verfahren unter Verwendung von Cellulose, Silicagel, Aluminiumoxid ex., und ein Extraktionsverfahren unter Verwendung von Butanol, Amylalkohol etc, wobei eine höhere Fettsäure als Adjuvans verwendet wird, angewendet werden.

Wenn beispielsweise das Filtrat der Kulturbrühe auf eine Säule eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes aufgegeben wird, dann werden die erfindungsgemäßen Verbindungen darauf adsorbiert. Die erfindungs- adsorbieren läßt, sie mit entionisiertem Wasser eluiert. aktive Fraktionen sammelt und die gesammelten Fraktionen lyophilisiert. Die Verbindungen, die als freie Base erhalten werden, können in ihre Säureadditionssal ze durch Behandlung mit einer pharmazeutisch annehmbaren anorganischen oder organischen Säure umgewandelt werden. Beispiele für solche Säuren sind anorganische Säuren, wie Schwefelsäure, Salzsäure, Jodwassersloffsäure, Phosphorsäure, Kohlensäure, SaI- petersäure etc., und organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Mandelsäure und Bernsteinsäure.

Die Verbindung KA-7038III hat die Strukturformel der Verbindung KA-70381, bei der die Glycylgruppe -COCHjNHj abgespalten worden isL Die Verbindung KA-7038III kann daher dadurch erhalten werden, daß man die Verbindung KA-70381 mit Alkalien oder Säuren behandelt, um die Verbindung KA-70381 in die

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THIlUbIIl.

mit 0,1 bis 3,0 N-Alkali oder Säure isoliert. Das resultierende aktive Eluat kann lyophilisiert werden, wodurch ein rohes Pulver der erfindungsgemäßen Verbindungen erhalten wird.

Beispiele für schwach saure Kationenaustauscherharze, die zur Gewinnung der eifindungsgemäßen Verbindungen geeignet sind, sind Amberlite® IRC-50, IRC-84 und CG-50 und Diaion* WK-IO und WK-20. Beispiele für Alkalien, die zur Elution verwendet werden können, sind eine Ammoniumhydroxidlösung und eine wäßrige Natriumhydroxidlösung. Beispiele für geeignete Säuren sind Ameisensäure, Salzsäure und Schwefelsäure. Bei einem weiteren Beispiel für ein geeignetes Gewinnungsverfahren geht man so vor, daß man den pH-Wert des Filtrats der Kulturbrühe auf 7 bis 9 einstellt, das Filtrat mit Aktivkohle kontaktiert, um die erfindungsgemäßen Verbindungen an der Aktivkohle zu adsorbieren, und die erfindungsgemäßen Verbindungen mit saurem Wasser eluiert.

Das Gemisch der erfindungsgemäßen Verbindungen, das nach den oben beschriebenen Verfahren isoliert werden kann, kann in die Substanzen KA-70381, II, III, IV, V, Vl und VII aufgetrennt werden, indem man das Gemisch in Wasser auflöst, auf eine Säule eines Adsorbens, wie eines schwach sauren lonenaustauscherharzes des oben beschriebenen Typs oder eines schwach sauren Ionenaustauschers, wie CM-Sephadex® oder CM-Cellulose. aufgibt, damit die Substanz an dem Adsorbens adsorbiert wird, und sodann mit einer wäßrigen Alkalilösung, wie z. B. verdünnter Ammoniumhydroxidlösung oder einer wäßrigen Lösung von Ammoniumcarbonat oder Ammoniumformiat. durch ein Gradientenverfahren oder ein stufenweise durchgeführtes Verfahren eluiert. Bei diesem Trennverfahren werden die Verbindung KA-70381V, die Verbindung KA-7038VII.die Verbindung KA-70381, die Verbindung KA-7038II. die Verbindung KA-7038V!,die Verbindung KA-7038111 und die Verbindung KA-7038V als freie Basen nacheinander abgetrennt.

Die aufgetrennten resultierenden Verbindungen KA-70381. II, III, IV, V, VI und VII können durch Einengung des Eluats und Lyophilisierung des Kondensats in Pulverform übergeführt werden. Sie können durch Säulenchromatographie, beispielsweise auf Cellulose oder βίηςπι stark basischen Anionenaustauscherharz, gereinigt werden. So kann man z. B. in der Weise vorgehen, daß man das Pulver in Wasser löst, die Substanz auf einer Säule eines stark basischen Anionenaustauscherharzes. z. B. von Dowex® 1 χ 2.

lung kann in der Weise bewirkt werden, daß man die Verbindung KA-70381 mit einer 0,1 bis 4 N-wäßrigen Lösung eines alkalischen Reagenzes, z. B. von Natriumhydroxid oder Bariumhydroxid, oder mit einer 0,1 bis I N-wäßrigen Lösung eines sauren Reagenzes, wie

Salzsäure oder Schwefelsäure, behandelt.

Bei Verwendung des alkalischen Reagenzes kann ein stark basisches Anionenaustauscherharz [z. B. Amberlite® IRA 400 (OH--Form) oder Dowex· 1x2 (OH--Form)] zugesetzt werden, und die Reaktion kann im suspendierten Zustand durchgeführt werden. Gleichermaßen kann bei Verwendung eines sauren Reagenzes ein stark saures Kationenaustauscherharz, wie Aberlite* IR 120 (H⁺-Form) oder Dowex® 50x8 (H+ -Form), zugesetzt werden, und die Reaktion kann im suspendier ten Zustand durchgeführt werden. Die Reaktion kann gewöhnlich bei etwa 30 bis IC0°C etwa 0,5 bis 3 Stunden lang durchgeführt werden.

Nachstehend werden die physikalischen und chemischen Eigenschaften der neuen antibiotischen Verbin- düngen KA-70381 bis VII im Detail beschrieben.

Verbindung KA-70381 (freie Base) (1) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: C₁₇H₃₅O₅N₅

(3) Elementaranalyse:

berechnet (%): C 52,42 H 9,06 N 17,98 gefunden (%): C 51,98 H 8,71 N 17,64

(4) Molekulargewicht: 389 (Massenspektrum)

(5) Schmelzpunkt: 83 bis 90°C

(6) Spezifische Drehung: [a]³ _D ^s+120,5° (c 1, H₂O)

(7) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Bei 220 bis 360 mn zeigt sich keine charakteristische Absorption. Es liegt nur eine terminaJe Absorption vor.

(8) Infrarotabsorptionsspektrum:

«J Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in

einer Kaliumbromidtablette ist als Fig. 1 angegeben.

(9) Löslichkeit:

Sehr leicht löslich in Wasser. Leicht löslich in Me

thanol, wenig löslich in Äthanol, geringfügig löslich in Aceton- Unlöslich in Chloroform, Äthylacetat, Diäthyläther, Hexan und Petroläther.

(10) Farbreaktion:

Ninhydrinreaktion und Rydon-Smith-Reaktion: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Eisen(III)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ.

(11) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis S,0.

(12) Kernmasneüsches Resonanzspektrum (i_Dj₀,ppm):

2,75 (3 H, s, 6'-N-CH₃)

3,12 (3H, s, 4-N-CH₃) _l0

3,45 (3 H, s, OCH₃)

4,06 (2 H, s, COCH₂N)

5,32 (1 H, d, J = 3,5 Hz, anomerischer H)

(13) Massenspektrum (m/e):

390 (M* + 1), 360, 276, 258, 230, 143

(14) Papierchromatographie:

Rf-Wert: 0,86

Filterpapier: Whatman Nr. 1 Lösungsmittel: untere Schicht von Chloroform/ Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

(15) Dünnschichtchromatographie :

Es wurde eine DC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 F₂₅₄ 0,2 mm) (Merck) verwendet ²⁵

Rf-Wert Lösungsmittel

15

(10) Farbreaktion:

Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smitb-Reaktion: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Eisen(III)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ.

(11) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 9,0.

(12) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (Α>₂ο>ΡΡπι)·'

2.83 (3 H, s, N-CH₃)

5.84 (1 H, d, J - 3,5 Hz, anomerischer H)

(13) Massenspektrum (m/e):

305 (M⁺+ 1), 214, 205, 177, 129

(14) Papierchromatographie:

Rf-Wert: 0,18

Filterpapier: Whatman Nr. 1 Lösungsmittel: Uüicfc Schicht von Chloroform/ Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

(15) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine DC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 F₂₅₄ 0,2 mm) (Merck) verwendet.

Rf-Wert Lösungsmittel

30

35

Butanol/Äthanol/ChIoroform/17% Ammoniumhydroxid (4:5:2:5)

Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (1:8 3)

0,16 untere Schicht von Chloroform/Methanol/

17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

0,87 obere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

Verbindung KA-7O38II (freie Base)

(1) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: Ci₃H₂₈O₄N₄

(3) Elementaranalyse:

berechnet (%): C 51,30 H 9,27 N 18,41 gefunden (%): C 51,12 H 8,87 N 18,10

(4) Molekulargewicht: 304 (Massenspektrura)

(5) Schmelzpunkt: 8,5 bis 102⁰C

(6) Spezifische Drehung: [<^J + 61° (c 1, H₂O)

(7) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Bei 220 bis 360 nm zeigt sich keine charakteristi- ⁵⁵ sehe Absorption. Es liegt lediglich eine terminale Absorption vor.

(8) Jnfrarotabsorptionsspektrum:

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in so einer Kaliumbromidtablette ist als Fig. 2 dargestellt.

(9) Löslichkeit:

Sehr leicht löslich in Wasser. Leicht löslich r? Me- 65 thanol, wenig löslich in Äthanol, geringfüg' t, löslich in Aceton. Unlöslich in Chloroform, Athylacetat, Diäthyläther, Hexan und Petroläther.

0,43 Butanol/Äthanol/Chloroform/17% Ammoniumhydroxid (4:5:2:5)

0,44 Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (1:8:3)

0,06 untere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

0,73 obere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

45

50

Verbindung KA-7038IU (freie Base)

(1) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: C₁₅H₃₂O₄N₄

(3) Elementaranalyse:

berechnet (%): C 54,19 H 9,70 N 16,85 gefunden (%): C 53,84 H 9,38 N 16,50

(4) Molekulargewicht: 332 (Massenspektrum)

(5) Schmelzpunkt: 74 bis 83°C

(6) Spezifische Drehung: [a]%+ 78° (c OA H₂O)

(7) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Bei 220 bis 360 nm wird keine charakteristische Absorption gezeigt Es liegt lediglich eine terminale Absorption vor.

(8) Infrarotabsorptionsspektrum:

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist als Fig. 3 dargestellt

(S) Löslichkeit:

Sehr leicht löslich in Wasser. Leicht löslich in Methanol, wenig löslich in Äthanol, geringfügig löslich in.Aceton. Unlöslich in Chloroform, Aihylacetat, Diäthyläthcr, Hexan und Petroläther.

IO

(10) Farbreaktion:

Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smith-ReakUon: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Eisen(IiI)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ.

(11) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 9,0.

(12) Kernmagnetisches Resonanzspektnim (<5ο_2θ,ppm): als HCl-SaIz

2,73 (3 H, s, 6'-N-CH₃)

2,83 (3 H, s, 4-N-CH₃)

3,46 (3 H, s, OCH₃)

5,43 (1H, d, J = 3,5 Hz, anomerischer H)

03) Massepjpektrum (m/e):

333 (M⁺ + 1), 332, 283, 230, 219, 191, 143

(14) Papierchromatographie:

Rf-Wert: 0.92

Filterrapier: Whatman Nr. 1

Lösungsmittel: untere Schicht von Chloroform/ Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

(15) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine DC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 F₂S₄ 0,2 mm) (Merck) verwendet

Rf-Wert Lösungsmittel

25

(10) Farbreaktion:

Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smith-Reaktion: positiv; Sakagu .iii-Roaktion, Eisen(III)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ.

(11) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert ν,,,η 2,0 bis 8,0.

{12) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (<5_Dj_Ol ppm): (als freie Base)

2,47 (3 H, s, N-CH₃)
3,43(3H₁S₁O-CH₃)
5,08 (1H, d, anomerischer H)

(als HCl-SaIz)

2,72(3H,s,N-CH₃)
3,37(3H₁S₁O-CH₃)
5,44 (1H, d, anomerischer H)

(13) Massenspektrum (m/e):

j« nit χ ρ 235 207 !89 !29

(14) Papierchromatographie:

Rf-Wert: 0,63

Filterpapier: Whatman Nr. 1

(15) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine DC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 F₂₅₄ 0,2 mm) (Merck) verwendet

45

Butanol/Äthanol/Chloroform/17% Ammoniumhydroxid (4:5:2:5) Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (1:8:3)

0,35 untere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

0,84 obere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

Verbindung KA-7O38IV (freie Base)

(1) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: Ci₄H₃₀O₅N₄

(3) Elementaranalyse:

berechnet (%): C 50,28 H 9,04 N 16,75 gefunden (%): C 49,89 H 8,91 N 16,45

(4) Molekulargewicht: 334 (Massenspektrum)

(5) Schmelzpunkt: 7ef bis 82°C

(6) Spezifische Drehung: [a]'_B ^s+115° (c O₁I₁ H₂O)

(7) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Bei 220 bis 360 nm wird keine charakteristische Absorption gezeigt Es liegt lediglich eine tenninale Absorption vor.

(8) Infrarotabsorptionsspektrum:

Das Infraroiabsorptionsspektrum einer Probe in iiner KaliumbromidiÄblefis ist ais Fig.4 dargestellt

(9) Löslichkeit:

Sehr leicht löslich in Wasser. Leicht löslich in Me- es thanoL, wenig ie-slicb \n Äthanol, geringfügig löslich in Aceton. Unlöslich ta Chloroform, Äthyl acetat, Ditihyra.-hsr, Hexan und Petroläthtr.

jo

Rf-Wert Lösungsmittel

0,56 Butanol/Äthanol/Chloroform/17% Ammoniumhydroxid (4:5:2:5)

0,62 Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (1;8.3)

0,13 untere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

0,85 obere Schicht von Chloroform/Mrthanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

Verbindung KA-7038V (freie Base)

(1) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: C₁₄H₃₀O₄N₄

(3) Elementaranalyse:

berechnet (%): C 52,81 H 9,50 N 17,60 gefunden (%): C 52,70 H 9,33 N 17,41

(4) Molekulargewicht: 318 (Massenspektrum)

(5) Spezifische Drehung: [atf + 98° (c0,5, H₂O)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Bei 220 bis 360 mn wift* keine charakteristische Absorption gezeigt Es liegt lediglich eine terminale Absorption vor.

(7) InfraJotHbsorptionsspeiftrum:

Das !"firaroiabsoipii^sssp^truii· eine; Probe in «!■au K-'iHumbviiraidtablette ist als Fig. 5 dar- :: -stel.7.

(8) Löslichkeit:

Sehr leicht löslich in Wasser. Leicht löslich in Methanol, wenig löslich in ÄthanoL geringfügig löslich in Aceton. Unlöslich in Chloroform, Äthylacetat, Diäthyläther, Hexan und Petroläther.

(9) Farbreaktion:

Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smith-Reaktion: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Eisen(ili)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ.

(10) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 9,0.

(11) Kernmagnetisches Resonanzspektrum ((5D₂O₁PPm): (als freie Base)

2.35 (3H,s, N-CH₃)

3.36 (3 H, s, 0-CH₃)

5,12 (1H, d, anomerischer H)

(als HCl-SaIz)

2,78(3H₁S₁N-CH₃) 3,43(3H₁S₁O-CH₃) 5,76 (1H, d, anomerischer H)

(12) Massenspektrum (m/e):

319 (M⁺ + I), 219, 191, 173, 129

(13) Papierchromatographie:

Rf-Wert: 0,82

(14) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine DC-AluminiumpIatte (Silicagel 60 F₂₅₄ 0,2 mm) (Merck) verwendet.

(J) Infrarotabsorptionsspektrum.·

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe ii einer Kaliumbromidtablette ist als Fig. 6 dar gestellt.

(8) Löslichkeit:

Sehr leicht löslich in Wasser, Leicht löslich in Me thanol, wenig löslich in Äthanol, geringfügig lös lieh in Aceton. Unlöslich in Chloroform, Äthyl acetat, Diäthyläther, Hexan und Petroläther.

(9) Farbreaktion:

Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smith-Reaktion: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Eisen(Iir)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ.

(10) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 8,0.

(11) Kernmagnetisches Resonanzspektrum ((Jd₂O, ppm): 2,87(3H, s, 6'-N-CK₃)

2^3(3H, s, 4-N-CH₃)

3,87 (3 H, S₁O-CH₃)

5,57 (1H, d, anomerischer H)

(12) Massenspektrum (m/e):

333 (M⁺ +1), 332, 283, 230,219,191, 143

(13) Papierchnmatographie:

Rf-Wert: 0,91

(14) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine DC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 F]₅₄ 0,2 mm) (Merck) verwendet.

Rf-Wert Lösungsmittel

0,57 Butamol/Äthanol/Chloroform/17% Ammoniumhydroxid (4:5:2:5)

0,55 Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (1:8:3)

0,25 untere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

0,81 obere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

Rf-Wert Lösungsmittel

0,63 Butanol/Äthanol/Chlorofonn/17% Ammoniumhydroxid (4:5:2:5)

0,60 Chloroform/Methanol/17% Ammonium-.. hydroxid (1:8:3)

0,29 untere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

0,62 obere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

Verbindung KA-7038VI (freie Base)

fl) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: Ci₅H₃₂O₄N₄

(3) Elementaranalyse:

berechnet (Vy. C 54,19 H 9,70 N 16,85 gefunden (%): C 53,83 H 9,87 N 16,59

(4) Molekulargewicht: 332 (Massenspektrum)

(5) Spezifische Drehung: [a]£ + 58° (c 1, H₃O)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrurn:

Bei 220 bis 360 nm wird keine charakteristische Absorption gezeigt. Es liegt lediglich eine terminate Absorption vor.

Verbindung KA-7038V1I (freie Base)

(1) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: C₁₄Hj₀O₄N₄

(3) Elementaranalyse:

berechnet (%): C 52,81 H 9,50 N 17,60 gefunden (%): C 52,50 H 9,78 N 17,41

(4) Molekulargewicht: 318 (Massenspektrum)

(5) Spezifische Drehung: [e)J^J + 59° (c 1, H₂O)

(6) Ultravioletubsorptjonsspektnim:

Bei 220 bis 360 nm wird keine charakterijtiiche Absorption gezeigt Es liegt lediglich eine terminate Absorption vor.

230 281/500

18

(7) Infrarotabsorptionsspektrum:

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist als F i g. 7 gezeigt

(8) Löslichkeit:

Sehr leicht löslich in Wasser. Leicht löslich in Methanol, wenig löslich in Äthanol, geringfügig löslich in Aceton. Unlöslich in Chloroform, Äthylacetat, Diethylether, Hexan und Petrotäther.

(9) Farbreaktion:

Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smith-Reaktion: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Bisen(IH>chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negatir:

(10) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 9,0.

(11) Kernmagnetisches Resonanzspelrtrum ((Jo₂O₁PPm):

2^2 (3 H, s, N-CH₃) 3,93 (3 H, s, 0-CH₃) 5,63 (1H, d, anomerischer H)

(12) Massenspektrum (m/e):

319 (M⁺ +1), 219, 191, 173, 129

(13) Papierchromatographie:

Rf-Wert: 0,65

(14) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine DC-Aluminiumplattc (Silicagel 60 F₁S* 0,2 mm) (Merck) verwendet

Rf-Wert Lösungsmittel

0,62 Butanol/Äthanol/Chloroform/l^ Ammoniumhydroxid (4:5:2:5)

0,61 Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (1:8:3)

0,28 untere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

0,63 obere Schicht von Chloroform/Methanoi/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

Die RF-Werte bei der Papierchromatographie der neuen antibiotischen Verbindungen K.A-70381 bis VII sind in Tabelle I im Vergleich zu den entsprechenden Werten von bekannten Antibiotika zusammengestellt. Ähnliche Werte, erhallen durch Dünnschichtchromatographie, sind in Tabelle Il zusammengestellt.

Es hai sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen sich hinsichtlich ihrer physikochemischen Eigenschaften stark von den Kanamycinen A, B und C, von Tobramycin. Paromomycin, Neomycinen A, B und C. von den Butirosinen A und B, von den Lividomycinen A und B. von Ribostamycin, Xylostatin, Apramycin, den Gentamicinen A und B und von Sorbistin und von der antibiotischen Substanz Nr. 460, welche bekannte rechtsdrehende wasserlösliche basische antibiotische Substanzen sind.unterscheiden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen unterscheiden sich weiterhin von den in den Tabellen I und Il angegebenen bekannten Antibiotika hinsichtlich der Rf-Werte bei der Papierchromaiographie und der Dünnschiclitchromatographie.

Tabelle I

Rf-Werte der erfindungsgemäßen Verbindungen und von bekannten Antibiotika

Lösungsmittelsystem: untere Schicht von Chloroform/ Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

Filterpapien'Whatman Nr. 1 Antibiotikum

Rf-Wert

KA-7038I

ΚΑ-7038Π

ΚΑ-7038ΠΙ

KA-7038IV

KA-7038V

KA-7038VI

KA-7O38VÜ

KA-6606I

ΚΑ-6606Π

ΚΑ-6606ΙΠ

KA-6606IV

KA-66O6V

KA-6606VI

Gentamicin C_t Gentamicin C₂ Gentamicin C₁₁

Sagamicin

Sisomicin

Verdamicin

G-52

Fortimicin A Fortimicin B

Andere (·1)

0,86 Ό.18 0,92 0,63 0,82 0,91 0,65 0,53 0,86 0,27 0,55 0,91 0,94 0,59 0,35 0,12 0,49 0,12 0,35 0,49 0,32 0,89 0,0-0,05

j-. (*1): Andere bedeutet Kanamycin A, B und C, Paromomycin, Neomycin A, B und C, die Butiroeine A und B, Lividomycin A und B, Ribostamycin, Xylostatin, Gentamicin A und B, Tobramycin, Apramycin, Sorbistin, die antibiotische Substanz 460, Hygrorrycin bzw. Desto-

,„ mycin.

Tabelle II

Rf-Werte der erfindungsgemäßen Verbindungen und von bekannten Antibiotika

Lösungsmittelsystem

Lösungsmittel a: BuUnol/Äthanol/Chloroform/17% Ammoniumhydroxid (4:5:2:5) Lösungsmittel b: Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (1:8:3)

Platte

DC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 F_7iA 0,2 mm) (Merck)

Antibiotikum

ΚΑ-70381 ΚΑ-7038ΙΙ ΚΑ-7Ο38ΙΙΙ KA-7038IV KA-7O38V KA-7038VI KA-7038VII ΚΑ-66Ο6Ι ΚΑ-6606ΙΙ ΚΑ-6606ΙΠ KA-6606IV

Rf-Wert

Lösungsmittel a

Lösungsmittel b

0,61	0,60
0,43	0,44
0,65	0,61
0,56	0,62
0,57	0,55
0,63	0,60
0,62	0,61
0,56	0,60
0,57	0,52
0.55	0,64
0,56	0,66

Antibiotikum

20

Rf-Wert

KA-66O6V KA-6606VI Gentamicin C₁ Gentamicin C₂ Gentamicin C₁, Sagamicin Fortimicin A Fortimicin B

Die antimikrobiellen Spektren der neuen ertlndungsgemäßen Verbindungen sind in Tabelle ΠΙ zusammengestellt

Losungs	Lösungs
mittel a	mittel b
0,64	0,61
0,69	0.73
0,52	0,40
0,51	0,44
0.43	0,34
0,45	0,32
0,53	046
0,60	0,70

Tabelle III

	I	1,5	II	III	IV	V	VI	VII
Staphylococcus aureus 209 P	0.4	50	25	25	50	25	50
Staphylococcus aureus Smith	0,2	25	6	12	25	6	25
Bacillus subtilis ATCC 6633	3	6	12	3	3	12	6
Bacillus cercus	0,4	100	100	50	50	100	50
Bacillus anthracis	>100	3	6	1.5	1.5	6	3
Streptococcus faecalis	6	>100	>100	>100	>100	>100	>100
Escherichia coli NIHJ	12	100	100	50	50	100	100
Escherichia coli ML1410	50	>100	>100	>100	>100	>100	>100
Escherichia coli ML1410R-81		>100	>100	>100	>100	>too	>100
(gegenüber Kanamycin, Streptomycin
und Lividomycin resistent)	25
Escherichia coli ML1410R-82		>100	>100	>100	>100	>100	>100
(gegenüber Kanamycin, Streptomycin
und Butirosin resistent)	12
Escherichia coli ML1410R-101		>100	>100	>100	>100	>100	>100
(gegenüber Gentamycin, Tobramycin
und Kanamycin resistent)	6
Proteus vulgaris OX19	6	100	100	50	50	100	100
Klebsiella pneumoniae PCI 602	6	100	>100	100	>I00	100	100
Pseudomonas aeruginosa Shibata	12	100	>100	100	>100	100	>100
Proteus inconstans	6	>100	>!00	>100	>100	>100	>100
Serratia sp.	3	>100	50	>100	>100	>100	>100
Mycobacterium smegmatis ATCC 607	>100	>100	>100	>100	>100	>100

Die akuten.Toxizitäten der erftndungsgemäBen Verbindungen KA-7038I bis VII, bestimmt bei der Maus, sind wie folgt:

LD₅₀ (mg/kg)	1	Il	III	IV	V	VI	VII
i. V. SC.	>100 >400	>300 >600	>300 >600	>300 >600	>3O0 >600	>300 >600	>300 >600

Durch die Erfindung wird weiterhin ein antibiotisches Mittel, bestehend aus mindestens einer der als Antibiotika KA-70381 bis KA-7038VII bezeichneten Verbindungen und pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln oder Trägern, zur Verfügung gestellL Das erfindungsgemäße amibioiische Mitte! karm auch Gemische dieser Verbindungen enthalten.

Die Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen beträgt beispielsweise etwa 0,01 bis etwa 99,5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Mittels.

Da* erftfidungsgemäße antibiotische Mittel kann in jeder beliebigen, üblicherweise verwendeten Dosierungsform angewendet werden, wobei jedoch injizierbare Zubereitungen und Kapseln besonders bevorzugt werden.

Vorzugsweise wird, ähnlich bei bekannten wasserlöslichen basischen Antibiotika, eine injizierbare Zubereitung in der Weise hergestellt, daß man ein lyophilisiertes Pulver des Antibiotikums in ein Gläschen, vorzugsweise zusammen mit einem Stabilisator, einfüllt und daß man beim Gebrauch den Inhalt des Gläschens in einer Auflösungsflüssigkeit für die Verabreichung cuflöst.

Geeignete Verdünnungsmittel oder Träger sind z. B. flüssige Verdünnungsmittel, wie destilliertes Wasser zur Injektion und eine physiologische isotonische Lösung, oder feste Träger, wie Lactose, Stärke, weißer Zucker, Glucose, kristalline Cellulose, Calciumcarbonat, Kaolin, D-Mannit, Magnesiummetasilicataluminat, Calciumsulfat, Calciumphosphat und Bentonit Die Zugabe von Stabilisatoren, wie z. B. von Natriurnhydrogenbisulfit, wird gleichfalls bevorzugt.

Die Dosierung der erfindungsgemäßen antibiotischer. Substanz kann in geeigneter Weise ausgewählt werden und beispielsweise etwa 0,01 bis etwa 100 mg/kg und Tag betragen.

Somit können erfindungsgemäß antibiotische Mittel für Tiere, wie Geflügel, Haustiere und gezüchtete Fische und für den Menschen zur Verfügung gestellt werden. Diese Mittel sind als antibakterielle Mittel mit breitem antibakterHIem Spektrum geeignet

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Der Stamm Streptomyces KC-7038 wurde in ein sterilisiertes Kulturmedium eingeimpft, das aus 4% Stärke, 0,5% Sojabohnenmehl. 4% Maisquellflüssigkeit. 0,05% Magnesiumsulfatheptahydrat,OJ% Natriumchlorid und 0,1% Calciumcarbonat bestand. (Der pH-Wert war vor der Sterilisierung auf 7,0 eingestellt worden.) Der Stamm wurde :twa 48 Stunden bei 27°C vorkultiviert, um einen ersten Impfstamm zu bilden.

Bin 20C I-Tank wurde mit 1001 eines Kulturmediums beschickt, das in der Weise erhalten worden war, daß 1% Baumwollsamenöl zu dem gleichen Kulturmedium, w<e bei der Herstellung der Impfkultur verwendet, zugesetzt worden war. Sodann wurden 500 ml des ersten Impfmaterials eingeimpft, und es wurde 4 Tage bei 27°C unter Belüften und Rühren (220 Upm, Fließgeschwindigkeit von Luft 50 l/min) kultiviert.

Nach der Fermentation wurde zu der Fermentationsbrühe verdünnte Schwefelsäure zugesetzt, um ihren pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Dicalite® wurde als Filterhilfsmittel zugesetzt, und die Mycelien wurden durch Filtration entfernt. Eine verdünnte wäßrige Natriumhydroxid'ösung wurde zu dem Filtrat zugegeben, um den pH-Wert auf 6,2 einzustellen. Das Filtrat wurde durch eine Γ-öule von Amberlite® IRC-50 -Form), eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes, geleitet. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte Material mit 1 N-Ammoniaklösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert. wodurch 9,7 g eines rohen Pulvers der erfindungsgemä-San Verbindungen erhalten wurden.

9,7 g des rohen Pulvers wurden in 1 I destillierten Wassers aufgelöst, und die Lösung wurde mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt.

Die Lösung wurde sodann durch eine Säule (3 χ 150 cm) eines Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex* C-25 (NH<⁺-Form) hindurchgeleitet, und sodann wurde mit Wassser gewaschen. Das adsorbierte Material wurde mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/h eluiert, wobei eine Konzentrationsgradientenmethode zwischen 51 einer 0,05 N-Ammoniaklösung und 5 1 einer 0,5 N-Ammoniaklösung angewendet wurde. Die Eluate wurden zu Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 30 ml fraktioniert. Die Aktivität jeder Fraktion wurde durch eine Papierscheibenmethode unter Verwendung einer Agarplatte von Bacillus subtilis genasen.

Aktive Fraktionen Nr. 96 bis 112 wurden lyophilisiert, wodurch-0.65 g eines rohen Pulvers, das die Substanz KA-7038IV enthielt, erhalten wurden. Die Lyophilisierung der aktiven Fraktionen Nr. 113 bis 134 lieferte 0,4 g eines .ohen Pulvers der Verbindung KA-7038I und der Verbindung KA-7038VI1. Die Lyophilisierung der Fraktionen Nr. 135 bis 149 lieferte 0,36 g eines rohen Pulvers eines Gemisches aus der Verbindung KA-70381.

der Verbindung KA-7038II und der Verbindung KA-7038VI. Weiterhin wurden 0.9 g der freien Base der Verbindung KA-7038III aus den Fraktionen Nr. 150 bis 172 erhalten.

Sodann wurden 0.12 g eines rohen Pulvers der Verbindung KA-7038V aus den aktiven Fraktionen Nr. 173 bis 212 erhalten.

Eine Probe der Verbindung KA-7038IV (0,65 g) wurde als gleichförmige Schicht auf eine Säule aufgefüllt, die mit 300 ml Cellulosepulver gepackt war.

Es wurde mit einer unteren Schicht einer Chloroform/ Methanol/17% Ammoniaklösung-Mischung (2:1:1) als Eluierungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/h eluiert. Das Eluat wurde zu Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 10 ml fraktioniart, und die Aktivität jeder Fraktion wurde in ähnJ'cher Wä?ise, wie oben beschrieben, gemessen. Aktive Fraktionen wurden zur Trockene konzentriert und als gleichförmige Schicht auf eine Säule aufgebracht, die mit 160 ml Silicagei gepackt war. Uner Verwendung der unteren Schicht eines Gemisches aus Chloroform/Methanol/l 7% Ammoniaklösung (2 : 1 :1) als Eluierungsmittel wurde mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/h eluiert. Das Eluat wurde zu Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 3 ml fraktioniert, und die Aktivität jeder Fraktion wurde in gleicher Weise, wie oben beschrieben, gemessen. Fraktionen, die die Verbindung KA-70381V enthielten, wurden nach der Elution von ein oder zwei geringfügigeren Komponenten gesammelt, und das Lösungsmit"il wurde bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 20 ml Wasser aufgelösi und durch eine Säule geleitet, die mit 5 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex® C-25 (NH₄ ⁺ ) gepackt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte Material mit 0,5 N-Ammo.Uklösiing eluiert. und die aKtiv-en Fraktionen wurden gesammelt. Die Lyophilisierung der aktiven Fraktionen lieferte 0,01 g der freien Base der Verbindung KA-7O38IV als farbloses amorphes Culver

Ein rohes Pulver (0,4 g) eines Gemisches der Verbindung KA-70381 und der Verbindung KA-7038VII wurde als gleichförmige Schicht auf eine Säule aufgebracht, die mit 200 ml Cellulose gepackt war, und es wurde Chromatographien, wobei die untere Schicht einer Chloroform/Methanol/17% Ammoniaklösung-(2:1: t)-Mischung als Eluierungsmiitel verwendet wurde. Dann wurde die Verbindung KA-70381 und hierauf die Verbindung KA-7O38VII eluiert. Die Fraktion, die die Verbindung KA-7038VII enthielt, wurde zur Trockene konzentriert und erneut in Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde auf einer Säule mit 15 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex® C-25 (NH₄*-Form) adsorbieren gelassen. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte Material nach der Konzentrationsgradientenmethode zwischen 300 ml von 0,04 N-Ammoniaklösung und i"-»n Γ\ A KJ . Λ

jrtnial/ jnciino «tjniort praLtir>n*>n

die die Verbindung KA-7038VII enthielten, wurden gesammeil und lyophilisieri, wodurch 0.01 g der freien Base als farbloses Pulver erhalten wurden.

Als andererseits Fraktionen, die die Verbindung KA-70381 enthielten, zur Trockene konzentriert wurden, wurden 0,31 g eines rohen Pulvers der Verbindung KA-70381 erhalten. Das rohe Pulver wurde in destilliertem Wasser aufgelöst und auf einer Säule adsorbieren gelassen, die mit 1000 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex® C-25 (NH₄ ⁴ -Form) gepackt war. Danach wurde mit Wasser gewaschen. Das adsorbierte Material wurde durch eine Konzentrationsgradientenmeihode zwischen 2.25 1 Wasser und 2,25 1 0,5 N-Ammoniaklösung eluiert. Die Aktivität joder Fraktion wurde gemessen. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert. wodurch 0.21 g der freien Base der Verbindung KA-70381 :ils farbloses amorphes Pulver erhalten wurden.

Ein Gemisch (0.2b g) der Verbindung KA-70381, Verbindung KA-7O38II und der Verbindung KA-7038VI wurde als gleichförmige Schicht auf eine Säule aufgebracht, die mit 300 ml Cellulosepulver gepackt war. Es wurde unter Verwendung der unteren Schicht eines Gemisches aus Chloroform/Methanol/17% Ammoniaklösung (2:1 : 1) mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/h eluiert. Das Eluat wurde zu Fraktionen mit jeweils einem Volumen von 10 ml fraktioniert. Die Aktivität jeder Fraktion wurde nach der gleichen Methode wie oben gemessen. Als Ergebnis wurde die Verbindung KA-7038VI als erste eluiert, worauf die Verbindung KA-7C38I und die Verbindung KA-7038II nacheinander eluiert wurden.

Die aktiven Fraktionen der Verbindung KA-7038II wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde erneut in 20 ml Wasser aufgelöst und durch eine Säule geleitet, die mit 5 ml schwach saurem Kationenaustauscherharz CM-Sephadex® C-25 (NH₄*-Form) gepackt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte , Material mit 0,5 N-Ammoniaklösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 0,05 g der freien Base der Verbindung KA-7038II als farbloses amorphes Pulver erhalten wurden.

Fraktionen, die die Verbindung KA-7038VI enthielten, wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde erneut in 100 ml Wasser aufgelöst und durch eine Säule geleitet, die mit 40 ml schwach saurem Kationenaustauscherharz CM-Sephadex® C-25 (NH₄ ⁺ -Forrn) gepackt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte Material durch ein Konzentrationsgradienlenverfahren zwischen 500 ml 0.1 N-Ammoniaklösung und 500 ml einer 0,5 N-Ammoniaklösung eluiert.

Frsküoncn die die Verbinden" K^A-7^noo\" --^>L:~'·

wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 0,07 g der freien Base der Verbindung KA-7038VI erhalten wurden.

Das rohe Pulver (0.12 g) der Verbindung KA-7038V wurde in destilliertem Wasser aufgelöst und auf einer Säule adsorbieren gelassen, die mit 1000 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex'* C-25 (NH₄*-Form) bepackt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte Material durch ein Konzentrationsgradientenverfahren zwischen 2.25 1 Wasser und 2.25 I 0.5 N-Ammoniaklösung eluiert.

Die Aktivität der einzelnen resultierenden Fraktionen wurde wie oben gemessen. Die aktiven Fraktionen wurden gesammeil und lyophilisiert. wodurch 0,02 g einer freien Base der Verbindung KA-7028V als farbloses amorphes Pulver erhalten wurden.

" Beispiel 2

Das lyophilisierte Pulver der Verbindung KA-70381. erhalten im Beispiel I (100-g-Einheiten). wurde in 500 ml Wasser aufgelöst, und mit verdünnter Schwefelsäure versetzt, um den pH-Wert auf 5.0 bis 7.0 einzustellen. Die Lyophilisierung der Lösung ergab 160 g eines Pulvers der Verbindung KA-70381, Sulfat.

Beispiel 3

Das lyophilisierte Pulver der Verbindung KA-70381, Sulfat (20-g-Einheiten) und 200 mg Natriumhydrogensulfit wurden gleichförmig miteinander vermischt, und das Gemisch wurde in 100 Gläschen gegossen. Die

so einzelnen Gläschen enthielten 200 mg (Einheiten; der Verbindung KA-70381, Sulfat. Vor dem Gebrauch wurde die Lösung in einem Gläschen in 2 bis 5 ml destillierten Wassers zur Injektion aufgelöst. Die Lösung kann intramuskulär oder intravenös verabreicht werden oder sie kann intravenös als Gemisch mit einer Nährinfusion infundiert werden.

Claims

im. u.: Veröflentlichungstag: S. 1.83 Patentansprüche:

1. Als Antibiotika KA-7O38I bis KA-7O38VÜ bezeichnete Verbindungen der Formeln (I) bis (VH), deren Gemische und Säureadditionssalze

CH₂NHCH₁
J O

NH₂

CH,

OCH₃
COCH₂NH,

OH

OH " NHCH,
NH₂

CH₂NHCH,

NH₂

OCHj

OCH,

Formel I

Formel U

Formel III

Formel IV

Formel V

Formel VI

Formel VlI

NHCH,

CH₂NHCH₃ — O

NH₃

NH₂

2. Antibiotische Mittel, bestehend aus mindestens einer der Verbindungen gemäß Anspruch 1 und pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln oder Trägern.

3. Verfahren zur Herstellung der als Antibiotika KA-70381 bis KA-7038VII bezeichneten Verbindungen gemäß Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, da3 man Streptomyces sp. KC-7038 FERM-P Nr. 4388 aerob in einem Nährmedium in einem pH-Bereich von etwa 4 bis 10 etwa 2 bis etwa 10 Tage bei etwa 20 bis 35° C züchtet und die Antibiotika KA-70381 bis KA-7038VII nach üblichen Verfahren aus der Kulturflüssigkeit abtrennt und gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz überführt.