DE2556043C3

DE2556043C3 - Antibiotikum Bu-2183, Verfahren zu seiner Herstellung und Arzneimittel

Info

Publication number: DE2556043C3
Application number: DE2556043A
Authority: DE
Inventors: Keiichi Kamifukuoka Saitama Fujisawa; Hiroshi Tokio Kawaguchi; Koji Kawasaki Kanagawa Tomita; Hiroshi Tokio Tsukiura
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1974-12-12
Filing date: 1975-12-12
Publication date: 1978-10-19
Also published as: JPS5343589B2; SE7514033L; DE2556043A1; NO146673C; SE431874B; NL7514507A; ES443463A1; US4012576A; GB1525977A; LU74002A1; CH619733A5; AU497760B2; NO146673B; NO144574C; HU174539B; GR58535B; DE2556043B2; DK142425B; IL48635A0; FI53838C

Description

CH₃CH₂CONH

HO

CHOH

^H0 |N\

OH j

CH₂NH₂
OH j CHOH
O—CH
CHNH₂
CHOH

CH₂OH

und dessen pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.

25

30

35

45

CH₂OH

und dessen pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.
5. Antibiotikum Bu-2183 B der Formel

OH

6. Antibiotikum Bu-2183 A₃der Formel

CH₃(CHJ₂CONH
HO

OH

O.

OH

CH₂NH₂
CHOH

O—CH

CHNH₂
CHOH

CH₂OH

und dessen pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.

7. Aminoglycosid Bu-2183 D der Formel

H₂N

OH

O.

HO

OH

CH₂NH₂

CHOH

O—CH

CHNH₂
CHOH

CH₂OH

und dessen Säureadditionssalze.

8. Arzneimittel, bestehend aus mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 und pharmazeutisch verträglichen Träger- und/oder üblichen Hilfsstoffen.

Die Erfindung betrifft einen neuen, als Bu-2183 bezeichneten Aminoglycosidantibiotikumkomplex, der hergestellt wird, indem man eine neue Species von Pseudomonas, die als Pseudomonas sp. Stamm D946-B83, ATCC Nr. 31 086, bezeichnet wird, in einem wäßrigen Nährmedium, welches assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis durch den Organismus im Kulturmedium eine wesentliche Menge an Bu-2183-KompIex gebildet ist, und den Bu-2183-Komplex aus dem Kulturmedium gewinnt. Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Gewinnung der Komponenten des Bu-2183-Koinplexes als Einzelsubstanzen, einschließlich insbesondere der antibiotischen Komponenten, die als Bu-2183 A, A₂ und B bezeichnet werden, und eines wertvollen, als Bu-2183 D bezeichneten Zwischenprodukts einfacherer Struktur, wobei das Verfahren die Herstellung des Bu-2183-Komplexes nach der zuvor beschriebenen Methode, das Abtrennen des antibiotischen Komplexes aus dem Mycel des Kulturmediums, das Adsorbieren des Bu-2183-Komple-

xes auf einem kationischen lonenaustauscherharz, das fraktionierte Eluieren der Bu-2183-Komponenten von dem Adsorbens und das Gewinnen der Fraktionen der gewünschten Komponenten, umfaßt.

Die Infrarot-Absorptionsspektren und die kernmagnetischen Resonanzspektren der vorstehend genannten Bu-2183-K.omponenten wurden unter folgenden Versuchsbedingungen aufgenommen:

Infrarot-Absorptionsspektren von der jeweiligen freien Base als Kaliumbromid-Preßling. Kernmagnetische Resonanzspektren von dem jeweiligen Hydrochlorid, gelöst in DjO unter Verwendung von 2,2 Dimethyl^-silapentan-S-suI-fonat als inneren Standard, bestimmt mit einem JEOL-60-MHz-Spektrometer(TypTNM-C-60HL).

Die Spektren sind in den F i g. 1 bis 8 wiedergegeben.

Spektrum

Bu-2I83-Komponente Λ Λ, Ε

IR, Fig.
KMR, Fig.

IO

>0

Obwohl zahlreiche Antibiotika einschließlich mehrerer Aminoglycosidantibiotika, wie Kanamycin, Gentamycin. Streptomycin, Neomycin, Tobramycin und Paromomycin, bekannt sind, besteht ein Bedürfnis für jo weitere neue Breitbandspektrumantibiotika, insbesondere für solche, die Aktivität gegen Aminoglycosidresistente Organismen, wie Pseudomonas, aufweisen.

Die neue Species von Pseudomonas, die als Pseudomonas sp. Stamm D946-B83 in der Bristo!-Ba- « nyu-Kultursammlung bezeichnet wird, ist ein psychrophiles Bodenbakterium, das aus einer indischen Bodenprobe isoliert wurde. Eine Kultur des Organismus ist in der American Type Culture Collection, Washington, D.C.. i.jnterlegt und wird in der permanenten Sammlung von Mikroorganismen als ATCC 31 086 geführt.

Der neue erfindungsgemäße Aminoglycosidkomplex umfaßt mindestens fünf Aminoglycosidkomponenten, von denen bei drei Komponenten, die als Bu-2183 A, A₂ 4» und B bezeichnet werden, festzustellen ist, daß sie bioaktiv sind, und bei zwei, als Bu-2183 C und D bezeichneten Komponenten, festgestellt wird, dcß sie bioinaktiv sind.

Der antibiotische Komplex Bu-2183 und jede der drei W bioaktiven antibiotischen Komponenten weisen ein breites Spektrum antibakteriell Aktivität auf und inhibieren das Wachstum der Aminoglycosid resistenten Miroorganismen, einschließlich der Pseudomonas-Species. Die Antibiotika Bu-2183. Bu 2183 A. Bu-2183 A₂ « und Bu-2183 B sind wertvoll als anitbakterielle Mittel, als Beifuttermittel bei Tierfutter und als therapeutische Mittel bei Geflügel und Tieren, einschließlich des Menschen. Sie sind wertvoll bei der Behandlung von infektiösen Erkrankungen, die durch gram-positive und f>o gram-negative Bakterien verursacht sind, insbesondere bei Erkrankungen, die durch Aminoglycosid resistente Mikroorganismen hervorgerufen sind,

Eine der neuen bioinaktiven Komponenten des durch Fermentation hergestellten Komplexes, und zwar Bu*21l33D, eignet sich als Zwischenprodukt zur halbsynthetischen Herstellung der bioaktiven Komponenten Bu-2183 A,A2und Bdurch N»Acylierung.

Der das Bu-2183-Antibiotikum produzierende Organismus, der als Pseudomonas Sp. Stamm ATCC 31 086 bezeichnet wird, ist ein streng aerobes, nichtsporulierendes und gram-negatives Bakterium. Die Zellen sind stabförmig und bilden unipolare Multiflagellen. Der Stamm ATCC 31 086 ist ein psychrophiler Organismus, der bei 4°C, nicht jedoch bei 41°C, wächst. Er bildet fluoreszierendes Pigment in Glutamatmedium und entrahmter Milchlösung, nicht jedoch in Kingschem B-Medium (H. Iizuka & K. Komagala: An Attempt At Grouping Of The Genus Pseudomonas. J. Gen. Appl. Microbiol. 9,73 - 82,1963). Cytochrornoxidasen werden nicht gebildet. Die morphologischen, kulturellen und physiologischen Charakteristika des Stamms ATCC 31 086 sind nachfolgend beschrieben:

Morphologie

Der Stamm ATCC 31 086 ist dadurch gekennzeichnet, daß er motile, nichtsporulierende und gram-negative Stäbchen aufweist. Die Zellen sind ;erade, bisweilen entlang der Längsachse gebogen ι\τ\ό produzieren unipolare Büschelflagellen. Poly-j?-hydroxybutyrat ist nicht als Zellreserve enthalten (R. Y. S tanier, N. J. Palleroni & M. Doudoroff: The Aerobic Pseudononads: A. Taxonomic Study. J. Gen. Microbiol. 43, 159-271, 1966). Es wird keine Hülle, Stengel oder Schleim produziert.

Wachstumscharakteristika

Kolonie auf Nähragar und Hefeextraktagar: Reichliches Wachstum. 0.5 bis 1,5 mm Durchmesser nach 1 Tag. Diffus, kreisförmig und etwas erhoben. Glatt und weich. Opak, weißliche Creme, später hellederfarbenorange. Leicht viskos. Kein diffusionsfähiges Pigment.

Nährbrühe und Hefeextraktbrühe: Reiches Wachstum. Trüb, später mit Sediment und gelegentlich Häutchen.

Hefeextrakt-Agar-Stich: Wachstum n-ir ar der Oberfläche. Kein Wachstum unter irgendeiner anaeroben Bedingung.

Chemisch definiertes Medium aus anorganischen Salzen: Mäßiges Wachstum, wenn mit Glucose oder Lactat als einzige Kohlenstoffquelle versetzt.

Erfordernis für Wachstumsfaktor: Keines.

Wachstumstemperatur: Gehemmtes Wachstum bei 4C. Mäßiges bis reiches Wachstum bei 10 bis 32°C. Spärliches Wachstum bei 37X. Kein Wachstum bei 41°C.

Einfluß des pH der Medien: Kein Wachstum bei pH 4.0. Gehemmtes Wachstum bei pH 4,5 und pH 10,5 bis 11,0 Mäßiges bis gutes Wachstum bei pH 5,5 bis 9,5.

NaCI-Effekt: Kein Wachstum bei 12% NaCI. Gehemm'es Wachstum bei 6 bis 9%. Mäßiges Wachstum bei 5% oder weniger.

Die oben beschriebenen morphologischen und kulturellen Charakteristika sind denen der Familie Pseudomonadaceae gleich.

Physio'ogische Charakteristika

Der Stamm ATCC 31 086 produziert diffundierbares fluoreszierendes Pigment in bestimmten Medien, nicht jedoch in anderen, während eine bekannte· Species von Pseudomonas, Pseudomonas fluorescerts, eine reiche Fluoreszenzbildung zeigt (Tabelle I).

Die physiologischem und biochemischen Charakteristika des Stamms ATCC 31 086 sind in Tabelle Il gezeigt. Die Nutzung von Kohlenhydrat und anderen Kohlenstoffquellen durch den Organismus ist in Tabelle

III im Vergleich mit der von zwei bekannten Pseudomonas-Species, Ps. fluorescens und Ps. aeruginosa. gezeigt.

Taxonomie

Aufgrund der oben beschriebenen morphologischen, kulturellen und physiologischen Charakteristika scheint der Stamm ATCC 31 086 zur Gruppe der Pseudomonaden zu gehören. Nachdem von Stanier et al. (R. Y. Stanier, N. J. Palleroni und M. Doudoroff: The Aerobic Pseudomonads: A Taxonomie Study. |. Gen. Microbio]. 43: 159-271. 1966) für die aeroben Pseudomonaden vorgeschlagenen taxonomischen System ist der Stamm ATCC 31 086 mit Pseudomonas fluorescens ziemlich nahe verwandt, ausgenommen seine negative Eigelbreaktion, die negative Nutzung von Inosit und die negative Oxidaseproduktion. Unter den i3 Typ-5pecies von aeroben Pseudomonaden. die von Stanier untersucht wurden, wird nur von Pseudomonas maltophilia berichtet, daß es eine negative Oxidasereaktion zeigt. Dieser Organismus ist jedoch vom Stamm ATCC 31 086 hinsichtlich des Fehlens von fluoreszierendem Pigment, dem positiven Methioninbedarf. dem nichtvorhandenen Wachstum bei 4° C, der negativen Arginidihydrolase und der unterschiedlichen Substratverwendung, sehr verschieden. Somit wird der Stamm ATCC 31 086 als einer neuen Species der Art Pseudomonas zugehörig angesehen.

Herstellung der Antibiotika

Der antibiotische Komplex Bu-2183 wird durch Kultivieren der neuen Pseudomonas Species, die als Pseudomonas sp. Stamm ATCC 31 086 bezeichnet wird, unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium hergestellt. Man läßt den Organismus in einem Nährmedium wachsen, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, beispielsweise ein assimilierbares Kohlenhydrat, enthält. Zu Beispielen für bevorzugte Kohlenstoffquellen gehören Glucose, Fructose. Mannose, Glycerin und dergleichen. Das Nährmedium sollte auch eine assimilierbare Stickstoffquelle enthalten, wie beispielsweise Fischmehl, Sojabohnenmehl. Peptone und dergleichen. Es können auch anorganische Nährsalze in das Kulturmedium eingebracht werden, und derartige Salze können irgendwelche der üblichen Salze umfassen, weiche in der Lage sind. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Kalzium-, Phosphat-, Salufat-, Chlorid-, Bromid-, Nitrat-, Carbonat- oder ähnliche Ionen zu liefern.

Die Herstellui.g des Bu-2183-Komplexes kann bei irgendeiner Temperatur durchgeführt werden, die einem befriedigenden Wachstum des Organismus förderlich ist, beispielsweise bei 10bis32°C,und sie wird besonders bevorzugt bei einer Temperatur um 28 bis 30° C durchgeführt Üblicherweise erhält man eine optimale Produktion in 3 bis 5 Tagen. Man stellt fest, daß der optimale pH-Bereich des Mediums ungefähr pH 5,5 bis 9,5 beträgt und besonders bevorzugt wird das Medium auf einen pH von ungefähr 7 eingestellt. Wenn man eine Tankfermentation durchführt, ist es wünschenswert, ein vegetatives Inoculum in einer Nährbrühe zu produzieren, indem man die Brühenkultur mit einer Schräg- oder Bodenkultur oder eine Iyophilisierten Kultur des Organismus inoculiert Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inoculum erhalten hat, wird es aseptisch in das Fermentationstankmedium überführt.

Eine bevorzugte Arbeitsweise zur Herstellung des Bu-2183-Antibiotikumkomplexes ist wie folgt:

Saatmedium

Bestandteile in %

Fermentationsmedium

Glucose 3 -

Fischmehl 2 2

Sojabohnenmehl 0,5

,o Pepton 0,2

CaCO, 0,6 0,5 [0,6*)]

Glycerin - 2

Leinsamenmehl - 2

Erdnußmehl**) - 1

,5 (NH₄)₂SO₄ - 0,3

*) Gemäß Beispiel.

**) Gemäß Beispiel an dessen Stelle proteinreiches
embryonischer Baumwollsaat.

Man verwendet eine gut gewachsene Agar-Schrägkultur von Pseudomonas Stamm ATCC 31 086, um das Saatmedium zu inoculieren, wobei vor der Sterilisation der pH auf 7,0 eingestellt wird. Man inkubiert die Saatkultur bei 28°C währnd 48 Std. auf einer Rotationsschüttelvorrichtung (250 UpM) und überführt 2 ml des Wachstums auf 100 ml des Fermentationsmediums in vinem 500 ml Erlenmeyer-Kolben. Die Produktion an Antibiotikum erreicht nach 3- bis 5tägigem Schütteln bei 28°C ein Maximum. Die antibiotische Aktivität in der Fermentationsbrühe wird durch einen Papierscheiben-Agardiffusionstest unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testorganismus bestimmt. Der Stamm ATCC 31 086 produziert 1500 bis 2000 y/ml antibiotischen Komplex durch die Schüttelkolbenfermentationsmethode.

Nachdem man die optimale Brühenwirksamkeit erreicht hat (beispielsweise durch die zuvor erwähnte Testmethode festgestellt), wird die Brühe auf einen pH von ungefähr 2 eingestellt, wodurch der basische, wasserlösliche antibiotische Komplex vom Mycel getrennt und im wäßrigen Fermentationsmedium gelöst wird. Dann wird die Brühe filtriert, vorzugsweise mit Filterhilfe, und das Filtrat, welches das Antibiotikum enthält, auf einen pH von ungefähr 7 neutralisiert. Man gibt das neutralisierte Filtrat durch ein kationisches Ionenaustauscherharz in der Ammoniumform. Dann wird das Harz mit Wasser und verdünntem (n/50) NHjOH gewaschen und der antibiotische Komplex aus dem Harz mit einem geeigneten Eluiermittel,-beispielsweise n/2 NH4OH. eluiert. Man vereinigt die aüäven Eluiermittel, konzentriert im Vakuum und dampft ein öder lyophilisiert, wobei man den rohen Bu-2183-Anti-

-' biotikumkomplex erhält.

Durch Dünnschichtchromatographie wird gezeigt, daß der so erhaltene rohe Feststoff mindestens drei aktive Komponenten enthält, die hier als Bu-2183 A, A2 und B bezeichnet werden, sowie mindestens zwei inaktive Komponenten, die hier als Bu-2183 C und D bezeichnet werden. Der Bu-2183-Komplex kann in seine Komponenten Bu-2183 A, A₂, B, C und D durch Verwendung eines kationischen Ionenaustauscherharzes, vorzugsweise in der Ammoniumform, aufgetrennt werden. Nachdem man den Komplex in Wasser gelöst hat, wird er auf das Harz aufgebracht, mit Wasser und verdünntem (n/40) Ammoniumhydroxid gewaschen und mit einem geeigneten Eluiermittel eluiert. Es wurde festgestellt, daß Ammoniumhydroxid (n/20) die Auftrennung der Komponenten Bu-2183 A und B erlaubt

Weiteres Eluieren der Säule mit einer konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung, beispielsweise (n/10) ergibt Bu-2l83 C und D.die ninhydrinpositiv, jedoch bioinaktiv sind. Um gereinigte Komponente Bu-2!83A2 zu erhalten, ist es üblicherweise erforderlich, eine zusätzliche Säulenchromatographie der BU'2183-A'Fraktion durch7>.fuhren, um die Komponenten Bu-2183Ä2 und BU-2I83A aufzutrennen. Die vollständige Trennung und Reinigung jeder Komponente wird erzielt, indem man die oben beschriebene chromatograpHische Trennung wiederholt. Wie in Tabelle IV gezeigt, wurde festgestellt, daß zwei DC-Systemc, die hier als S-117 und S-122 bezeichnet werden, geeignet sind, um die vier Komponenten Bu-2183 A, B, C und D zu differenzieren. Während der chromatographischen Reinigung der Komponente Bu-2183 A, wie sie in den nachfolgenden Beispielen detailliert beschrieben ist, wird eine weitere bioaktive Aminoglycosidkomponente gefunden, die hier als Bu-2183 A2 bezeichnet wird. Die Komponente Bu-2183 A2 kann von der Komponente Bu-2183 A durch die DC-Systeme S-117 und S-122 differenziert werden, wie dies in der Tabelle V nachstehend gezeigt ist.

Charakterisierungsdaten für
die Bu-2183-Antibiotika-Komponenten

Bu-2183 A

Die antibiotische Substanz Bu-2183 A ist eine weiße, «morphe Base, die in Wasser löslich, in Methanol und Äthanol etwas löslich und in n-Butanol, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln praktisch unlöslich ist.

Das Antibiotikum Bu-2183 A kann Salze mit Säuren bilden, und pharmazeutisch verträgliche Säureaddilionssalze des Antibiotikums sind in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Zu Beispielen für geeignete pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze gehören die nichttoxischen Salze mit organischen und anorganischen Säuren, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure. Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Stearinsäure, Propionsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Benzoesäure, Bernsteinsäure. Entsprechendes gilt für die Komponenten B und A2.

Die Komponente Bu-2183 A ergibt mit Ninhydrin- und Anthronreagentien positive, mit Tollens-, Fehling- und Sakaguchi-Reagentien jedoch negative Reaktionen.

Die spezifische Drehung von Bu-2183-A-Base beträgt [oc] ? + 78,5° (C= 1,0; Wasser).

Eine Probe der Komponente Bu-2183 A wird nach dem Ausfällen aus Äthanol zu

· C₂H₅OH · H₂O analysiert.

Die Komponente Bu-2183A weist nur eine Endabsorption von ultraviolettem Licht auf. In Kaliumbromid pelletisiert besitzt es ein Infrarotspektrum, das im wesentlichen wie in F i g. 1 dargestellt ist, mit charakteristischen Absorptionsbanden bei den nachfolgenden Wellenzahlen in cm-¹: 1635 und 1570 (Amid) und 1080 und 1020 (Hydroxylgruppen). Gelöst in Deuteriumoxid bei einer Konzentration von ungefähr 8% ist das NMR-Spektrum des Bu-2183-A-Hydrochlorids im wesentlichen wie in F i g. 2 dargestellt. Das Spektrum zeigt ein anomeres Proton bei <55,17 ppm (lH,d, J = 3 Hz) und eine Propionylgruppe bei (51,12 (3H, t, J = 7,5Hz) und 2,29 (2H,q, J = 7,5 Hz) ppm.

Es wurde festgestellt, daß die Struktur von Bu-2183 A wie folgt ist:

CH₃CH₂CONH

Analyse:

- Ben: C44,24, H 8,52, N 8,11%;
gef.: C 44,25, H 8,08, N 9,11%.

Das Di-N-acetat von Bu-2183 A wird in Form farbloser Nadeln mit Schmelzpunkt 149 bis 150⁰C erhalten. Es weist ein durch Osmometrie bestimmtes Molekulargewicht von 481 auf und wird zu C19H35N3O11 · H₂O analysiert

Analyse:

Ber.: C 45,68, H 7,42, N 8,41%;
gef.: C 45,73, H 7,49, N 8,19%.

Bu-2183 A ist schwach basisch und weist titrierbare Gruppen mit pK/-Werten von 630 und 9,40 in Wasser auf. Das aus den Titrationsdaten berechnete angenäherte Molekulargewicht des Antibiotikums beträgt 398.

HO

OH

CH₇NH,

CHOH

O—CH

CHNH₂
CHOH

CH₂OH

Bu-2183 A₂

Die antibiotische Komponente Bu-2183 A₂ ist wie das obige Bu-2183 A eine weiße, amorphe Base, die in Wasser löslich, in Methanol und Äthanol etwas löslich und in n-Butanol, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln praktisch unlöslich ist. Sie kann mit Säuren Salze bilden, und pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze der Bu-2183-Base fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Die Komponente Bu-2183 A₂ ergibt positive Ninhydrin- und Änthronreaktionen und negative Tollens-, Fehling- und Sakaguchireaktionen.

Die spezifische Drehung von Bu-2183-A₂-Base so beträgtf«] i> +79,1° (c=0,43; H₂O).

Eine Probe von Bu-2183 A₂, die als Carbonatsalz isoliert wird, wird zu C16H33N3O9 ■ V2H2CO3 analysiert .Analyse:

Ber.: C 44,79, H 7,75, N 9,50%;

gef.: C 4435, H 7,83, N 9,21%.

Die Komponente Bu-2183 A₂ weist nur eine Endabsorption von ultraviolettem Licht auf. In KBr pelletisiert besitzt sie ein Infrarotspektrum, das im wesentlichen wie in Fig.3 gezeigt ist. Gelöst in D₂O bei einer Konzentration von ~6% ist das NMR-Spektrum von Bu-2183-A₂-Hydrochloridsalz im wesentlichen wie in Fig.4 dargestellt Die Komponente Bu-2183 A₂ kann von Bu-2183 A und Bu-2183 B durch die Anwesenheit einer n-Butyrylgruppe im NMR-Spektrum bei »50,92 (3H, t), 1,63 (2H, Sextett) und 2,30 (2H, t) ppm anstelle der Propionyl- oder Acetylgruppen in den Komponenten A und B, unterschieden werden.

Es wurde festgestellt, daß die Struktur der Komponente Bu-2183 A2 wie folgt ist:

CH₃(CH₂)jCÖNH-

-O

Fig. 6 dargestellt. Das NMR-Spcktruin zeigt, daß Bu-2183 B von Bu-2I8J Λ und A₂ durch die Anwesenheil einer Acetylgruppe bei (52,02 ppm (311, s) anstelle der Propionyl- oder n-Butyrylgfüppe, wie in Λ bzw. Aj, unterschieden werden kann.

Die Komponente Bu-2183 B besitzt die folgende Struktur:

Νλ CH₂NH₂ OH J CHOH	Bu-2183 B	IO	CHjCONH—«^	OH	CH₂NH₂ CHOH L
0—CH CHNH₂ CHOH I	15	HO^-	J-O Ί\ OH r\	CHNH₂
CH₂OH	20			CHOH I

Das Antibiotikum Bu-2183 B ist in Aussehen und Löslichkeit den Komponenten Bu-2183 A und A₂ sehr ähnlich; es ist eine weiße, amorphe Base, die in Wasser löslich, in Methanol und Äthanol etwas löslich und in n-Butanol, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln praktisch unlöslich ist.

Das Antibiotikum Bu-2183 B kann Salze mit Säuren jo bilden, und pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze des Antibiotikums fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Die Komponente Bu-2183 B gibt mit Ninhydrin- und Anthron-Reagentien positive Reaktionen, jedoch ergibt sie mit Tollens-, Fehling- und Sakaguchi-Reagentien negative Reaktionen.

Die spezifische Drehung von Bu-2183-B-Base beträgt [α] ·.'+ 85" (c= 1,0; Wasser).

Eine Probe der aus Äthanol ausgefällten Komponen-Ie Bu-2183 B wird zu ChH₂₉N₃O₉-C₂H₅OH-H₂O analysiert.

Analyse:

Ber.: C 42,95. H 8,34, N 936%;
gef.: C 42,69, H 7,78, N 8,86%.

Das Di-N-acetat von Bu-2183 B wird in Form farbloser Prismen mit Schmelzpunkt 159 bis 162°C erhalten. Es besitzt ein durch Osmometrie bestimmtes Molekulargewicht von 484 und wird zu • H2O analysiert.

CH₂OH

Analyse:

Ber.: C 44,53, H 7,27, N 8,66%;
gef.: C 44,96, H 7,44, N 8,52%.

Bu-2183 B ist schwach basisch und besitzt titrierbare Gruppen mit pK/-Werten von 7,15 und 9,35 in Wasser. Das aus den Titrationsdaten berechnete angenäherte Molekulargewicht des Antibiotikums beträgt 409.

Die Komponente Bu-2183 B weist nur eine Endabsorption von ultraviolettem Licht auf. In Kaliumbromid pelletisiert besitzt sie ein Infrarotspektruni, das im wesentlichen wie in F i g. 5 gezeigt ist, mit charakteristischen Absorptionsbanden bei den nachfolgenden V/ellenzahien in cm-^!: 1635 und 1570 (Amid) und 1080 und 1020 (Hydroxylgruppen). Gelöst in Deuteriumoxid in einer Konzentration von 10% ist das NMR-Spektrum von Bu^liÖ-B-Hydrochloridsalzim wesentlichen wie in Charakterisierungsdaten für
das Zwischenprodukt Bu-2183 D i

Die bioinaktive Komponente Bu-2183 D ist eine weiße, amorphe Base, die in Wasser löslich, in Methanol und Äthanol etwas löslich und in n-Bulanol, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln praktisch unlöslich ist.

Die Verbindung Bu-2183 D kann mit Säuren Salze bilden. Diese Säureadditionssalze liegen im Rahmen der Erfindung; Beispiele dafür sind die vorstehenden für die Komponenten A, A₂ und B genannten nicht toxischen Salze mit organischen und anorganischen Säuren.

Die Komponente Bu-2183 D ergibt positive Reaktionen mit Ninhydrin- und Anthronreagentien, jedoch negative Reaktionen mit Tollens-, Fehling- und Sakaguchi-Reagentien.

Die spezifische Drehung von Bu-2183-D-Base beträgt [α] ? +72,5° (C= 1,0; Wasser).

Eine Probe der Komponente Bu-2183 D, die als das Carbonatsalz isoliert wurde, wird zu Ci₂H₂₇N₃O₈ ■ H₂CO₃ analysiert.

Analyse:

Ber.: C 38,70, H 7,25, N 10,42%;
gef.: C38.86, H 6.93, N 10,14%.

..; i, Bu-2183 D ist schwach basisch und weist drei 'titrierbare Gruppe mit pK_a'-Werten von 6,95 (2

Äquivalente) und 9,68 in Wasser auf.

Man erhält das Tri-N-acetat von Bu-2183 D in Form farbloser Prismen mit Schmelzpunkt 159 bis 162°C. Bei diesem Salz wird festgestellt, daß es mit dem Di-N-acetat von Bu-2183 B identisch ist.

Die Komponente Bu-2183 D weist nur eine Endabsorption von ultraviolettem Licht auf. In Kaliumbromid pelletisiert besitzt sie ein Infrarotspektrum, das im wesentlichen wie in Fig.7 gezeigt ist. Das Spektrum zeigt das Fehlen der Amidcarbonylbanden an, die in den bioaktiven Komponenten Bu-2183 A, A₂ und B vorliegen. Gelöst in Deuteriumoxid bei einer Konzentration von 10% ist das NMR-Spektrum von Bu-2183-D-Hydrochloridsalz im wesentlichen wie in F i e. 8 dargestellt.

Es wurde festgestellt, daß die Struktur von Bu-2183 D wie folgt ist:

OH

Analyse:

Ber.: C 45,95, H 7,28, N 5,95%;
gef.: C 45,93, H 7,43, N 5,88%.

Das fvlassenspektfum dieses N-Acetylderivats zeigt einen Peak bei m/e 204 (M-31), der dem Verlust einer glycosidischen Methoxylgruppe aus dem Molekül zuzuschreiben ist. Somit sollte der freie Aminozucker der Formel C₆Hi₃NOs entsprechen.

Die κ- und j9-Formen des Methylglycosids wurden durch die (R- und NMR-Spektren ihrer Tetra-N,O-acetylderivate als MethyI-4-amino-4-desoxy-<x- bzw. -0-glücopyranosid, identifiziert. Die IR-Spektren authentischer Proben dieser aus 4-Trehalosarriin isolierten Zucker (]. Antibiotics, 27, 145, 1974) stehen in Übereinstimmung mit den IR-Spektren der experimentellen Proben.

Saure Hydrolyse von Bu-2183 D in 6 n-HCI (Rückfluß,

4 J ^lU Λί

Strukturl*sstimmungder Bu-2183-Komponenten

Milde saure Hydrolyse von Bu-2183 A und B (1 n-HCI/Methanol, 8O⁰C, 3 Std.) ergibt dieselbe Desacylverbindung Ci₂H₂ZNjOs, die mit der Komponente Bu-2183 D, die durch chrotnatographische Auftrennung des rohen Bu-2183-Komplexes erhalten wurde, identisch ist. Die vollständige N-Acetylierung von Bu-2183 D ergibt das Tri-N-acetat, Ci₈H₃JN₃On, das als das Di-N-acetat der Komponente Bu-2183 B identifiziert wird.

Saure Hydrolyse von Bu-2183 B in methanolischem Chlorwasserstoff (gesättigt, Riickflußtemperatur, 24 Std.) liefert ein Aglykon und einen Aminozucker zusammen mit der Komponente Bu-2183 D. Das Aglykon wird als kristallines Sulfat mit Schmelzpunkt 263 bis 264°C isoliert und zu C₆Hi₆N₂O₄ · H₂SO₄ analysiert.

Analyse:

Ben: C 25,90, H 6,52, N 10,07, S 11,52%;
gef.: C 26,10, H 6,47, N 9,93, S 11,29%.

Das 220-MHz-NMR-Spektrum seines N.O-Hexaacetats zusammen mit massenspektrometrischen Daten, die mit den N-Acetyl-O-TMS-, N-Acetyl-diisopropyliden- und Hexa-N,O-acetyI-Derivaten des Aglykone erhalten wurden, legten eine l,4-Diamino-2,3,5,6-tetra-ol-Struktur für den Aglykonteil nahe.

Das Di-N-acetat des Aglykons wird in Form farbloser Nadeln mit Schmelzpunkt 114 bis 115°C erhalten und zu CioH₂oN₂0₆ analysiert.

Analyse:

Ben: 045,45, H 7,63, N 10,60%;
gef.: C 4537, H 7°7, N 10,57%.

Da angenommen wurde, daß die D-Glucosetyp-Konfiguration für das Agiykon am wahrscheinlichsten ist, wurde die Herstellung des l,4-Diamino-l,4-didesoxy-D-sorbits aus 4-Amino-4-desoxy-D-gIucose durchgeführt, und es wurde durch DC- und NMR-Analyse gezeigt, daß das so erhaltene Produkt das Aglykon ist.

Der nach der obigen sauren Methanolyse der Komponente B erhaltene Aminozuckertei! wird durch Chromatographie an schwach saurem Kationenaustauscher gereinigt und in die α- und ^-Formen des Methylglycosids aufgetrennt, wobei die Ä-Form das Hauptprodukt ist Die N-Acetylierung des a-Methylglycosids liefert farblose Prismen mit Schmelzpunkt 185 bis 186°C, die zu C₉Hi₇NO₆ analysiert werden.

.JV „-„ti,*
J IU.y UIgIUt

y g gj

zucker wie aus dem Hydrolysat von Bu-2183 B isoliert.

Das durch chromatographische Auftrennung des rohen Bu-2183-Komplexes erhaltene Bu-2183 C wird in Methanol, welches 1 n-HCl enthält, während 3 Std. dpi Rückflußtemperatur hydrolysiert. Der Aglykonteil ist mit dem der anderen Komponenten von Bu-2183 identisch, und der Zuckerteil wird durch DC-, NMR- und Gas-Chromatographie als Methyl-D-glucosid identifiziert. Demgemäß besitzt die Summenformel von Bu-2183 C den Wert Ci₂H₂₆N₂O,.

Auf der Grundlage der obigen Daten wurde festgestellt, daß die Bu-2183-Komponenten folgende Strukturen aufweisen:

HO

CH₂NH₂

40	OH	CHOH I	R
	0—CH I
	CHNH₁ CHOH I	CH₃CH₂CON H- GH₁CONH- CH₃CH₂CH₂CONH- HO- H₂N-
45	CH₂OH

50 Bu-2183-Komponente
A B 55 A₂ C D

Antimikrobielle Aktivität

In vitro-Tests zeigen, daß der Komplex Bu-2183 und die einzelnen antibiotischen Komponenten Bu-2183 A, A₂ und B ein breites Spektrum antibakterieller Aktivität aufweisen. Der antibiotische Komplex und die aktiven Komponenten sind besonders brauchbar zur Inhibierung des Wachstums der meisten Aminoglycosid-resistenten Mikroorganismen. Man stellt fest, daß die

Komponente Bu-2183 A; aktiver als Bu 2183 B, jedoch weniger aktiv als Bu-2183 A ist.

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) von Bu-2183 A und B wurden bei einer großen Vielzahl von Bakterien durch du zweifache Agarverdünnungsmethode auf Nähragarplatien bestimmt. Man verwendete die Inokular-Repliziervorrichtung von Steers et al. Die Inokulumgröße wird auf eine 10⁴-Verdünnung der Übernachtkultur der Testorganismen in Heart-lnfusionsbriihe (Difco) eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammen mit denen für Kanamycin gezeigt, das als Vergleichsantibioiikum untersucht wurde.

Die Eigenaktivitäten von Bu-2183 A und B sind hinsichtlich ihrer MHK-Werte mäßig oder ziemlich schwach, wobei die Komponente A ungefähr zwei- bis viermal akt'ver als B ist. Jedoch weisen sie ein breites Spel·' im antibakterieller Aktivität gegen gram-positve und gram-negative Bakterien, einschließlich vieler der Aminoglycosid-resistenten Mikroorganismen und PseudomonasStämme auf.

Die nacnstehende Tabelle VII zeigt die minimalen Hemmkonzentrationen der Komponenten Bu-2'83A und A: gegen verschiedene pathogene Mikroorganismen

Man stellt fest.daß eine Probe von Bu-2183-KompIex mit einer Reinheit von angenähert 30 bis 40% E. coil A20365 bei einer Konzentration von 12.5 y/ml. K. pr iumoniae D-Il bei einer Konzentration von 12,5 y/ml und Ps. aeruginosa A 9930 bei einer Konzentration von 25 jv ml. inhibiert.

Einfluß des pH der Medien auf die MHK

Der Einfluß des pH der Medien auf die MHK von Bu-2183 A wurde durch die zweifache Agarverdünnungsmethode unter Verwendung von Nähragarmedium bei pH 6.0. 7.0. 8.0 und 9,0 untersucht Die in der Tabelle VIII dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität von Bu-2183 A bei alkalischem pH steigt und bei saurem pH abnimmt.

Einfluß der Medien

der Medien auf die Aktivität von Testorganismen

Der Einfluß

Bu-2183 A und B wurde bei acht
bestimmt. Bei den untersuchten Medien handelte es sich um Nähragar. Heart-Infusionsagar und Mueller-Hinton-Agar. Der pH der Medien wurde auf 8 eingestellt. Wie in Tabelle IX dargestellt, zeigt sich die größte In vitro-Aktivität. wenn man Nähragar als Testmedium verwendet.

In vivo-Aklivität und Toxizität

Bu-2183 A und B wurden in vivo bei experimentellen Infektionen von Mäusen beurteilt Bei den verwendeten palhogenen Bakterien handelte es sich um S. aureus Smith. E. coil NIH| und Ps. aeruginosa Λ9930. Die Mäuse wurden mit einer 100 l.Dw-Dosis der pathogenen Mikroorganismen in einer 5°/nigen Suspension in Mucin aus Schweinemägen insultiert. Unmittelbar nach dem Bakterieninsult (0 Std.) wurde eine einzelne subkutane Behandlung mit dem Antibiotikum vorgenommen, und nach einem Doppeldosiszeitplan wurde das Antibiotikum 0 und 3 Std. na°h dem Insult verabreicht. Für jede Dosierung wurden Gruppen von 5

ίο Mäusen verwendet, und die Tiere wurden 5 Tage beobachtet, um die mittlere Schutzdosis (PD_W) zu bestimmen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle X dargestellt. Bu-2183 A und B liefern gegen alle drei der untersuchten Infektionen eine In-vivo-Aktivität.

Die akute Toxizität von Bu-2183 A und B wurde bei Mäusen subkutan und intravenös bestimmt. Die Mäuse wurden 15 Tage beobachtet, und die intravenösen (i. v.) und subkutanen (s. c.) LDw-Werte der Komponente Bu-2183 A wurden zu 2500 mg/kg bzw. 1000 mg/kg ermittelt. Die Komponente Bu-2183 B ist wesentlich weniger toxisch als Bu-2183 Λ und bei Dosen bis zu 2000 mg/kg entweder i. v. oder s. c. trat während der Bobachtungsperiode von 15 Tagen kein Todesfall auf.

Brauchbarkeit der Komponente Bu-2183 D

Obgleich die Komponente Bu-2183 D bioinaktiv ist. .lellt sie ein wertvolles Zwischenprodukt für die halbsynthetische Herstellung der bioaktiven Komponenten Bu-2183 A. A; und B dar. So kann die entsprechende freie Aminogruppe von Bu-2183 D (nach geeignetem Schützen der anderen reaktiven funktionellen Gruppen) nach an sich bekannten Methoden N-acyliert werden, wobei man (nach dem Entfernen irgendwelcher Schutzgruppen) das N-Butyrylderival Bu-2183 A. das NAcetyldenvat Bu-2183 B oder das N-Propionylderivat Bu-2183 A?erhalten würde

Tabelle I

Bildung von fluoreszierendem Pigment

Medium	Bu-2183	Ρ* lluores-
	Produzent	cens
	AITC 31086	NlIlJ B254
Hefeextraktagar	-	+
Kingsches B-Medium		+ +
20% entrahmte Milch	+ +	+ +
lösung
Glutamalbrühe	+ +	+ +

Tablle II

Physiologische und biologische Charakteristika von Stamm ATCC 31086

Test	Ansprechen
Afgindihydföiase	positiv
Katalase	positiv
Oxidase (Cytochrorrioxidase)	negativ
Extrazelluläre Hydrolasen
Gelatinehydrolase	positiv

Methode und verwendetes Medium

Modifizierte Methode vöri Stariief et al.¹)

Wasserstoffperoxid auf der Kolonie

Nach drei verschiedenen Methoden untersucht'),

Methode von Stan ic r et al.¹)

15

Fortsetzung

Ansprechen Methode und verwendetes Medium

Stärkehydrolase
Voges-Proscauer-Reaktion
Indolbildung

HjO-Bildung aus Cystein und
Thiosulfat

Gelatineverflüssigung

Reaktionen in entrahmter
Milchlösung

negativ negativ negativ negativ

positiv

(schnell verflüssigt)

grünlichgelb fluorreszierendes Pigment gebildet pH alkalisch gemacht positiv

positiv

negativ positiv positiv negativ negativ positiv positiv

negativ

negativ ortho-Spaltung

negativ

Nutzung von Nitrat-N
Nitritbildung aus Nitrat

Nutzung von Ammonium-N

Ammoniakbildung aus Pepton

Denitrifizierung

Gas aus Kohlenhydrat
Nutzung von Harnstoff
Nutzung von Citrat

Nutz;.ng von Oxalat

Eigelbreaktion
Spaltungsmechanismus der
aromatischen Verbindung

Bildung von Phenazinpigmenten,
einschließlich Pyocyanin,
Chloraphin und Phenazin-σ-carbonsäure

')R. Y Stanier. N. J. Palleroni & M.Doudoroff: The Aerobic Pscudomonads A Taxonomic Study. J. Gen. Microbiol.

I><)-27I. 1966.

^J) M F Rhodes The Characterization Of Pseudomonas FIuorescens. J. Gen Appl. Microbiol. 21. 221-263, 1959 ³JfI. Ii/uka & K. Komagata: An Attempt At Grouping Of The Genus Pseudomonas. J Gen. Appl. Microbiol.

9. 73-82. l%3
⁴) H 11/u ka & K. Komagata: Taxonomy Of Genus Pseudomonas With Special Reference ίο Their Mode» Of Metabolism

Of Carbon Compounds. J Gen Appl. Microbiol. 9. 83-95, 1963.
^ς) V BI) Skc rman : Abstracts Of Microbiological Methods. Wiley-Inlersctence. New York. Seite 364. 1969.

Methode von Stanier et al.¹) Peptonbrühe plus 1 % Glucose Peptonbrühe (Kovacs Reagens) Ammonium-anorganische Salze plus Cystein und Thiosulfat

Bleiacetatpapier zum Auffinden von H,S Peptonbrühe plus 25% Gelatine⁵)

20% entrahmte Milchlösung durch mildes Behandeln im Autoklav sterilisiert (0,5 kg/cm³ während 5 Min.)

Rhodes anorganische Salze-Glycerin-Nitrat-Mediunr)

Rhodes anorganische Salze-Glycerin-Nitrat-Medium²)

Peptonbrühe plus 0,1% KNO₃ Kosers Citratmedium Peptonbrühe (Nesslers Reagens) Methode von Stanier et al.¹) Nährbrühe plus 1 % Glucose Christensens HarnstofFmedium Simmons Citratmedium und Kosers Citratmedium

Oxalat von Citrat in Simmons und Kosers Medien

von Stanier et al.') angewendete Methode Modifizierte Methode von Stanier et al.¹)

Kings A-Medium

Tabelle III	Kohlenstoffquellen	Ps. fluores-	Ps aeru-	Substrat	Stamm	Pv fluores-	Ps. aeru
		cens	ginosa		Λ FCC	cc η s	ginosa
Nutzung von		NIHJ B254	vrcc 19 660		31086	NIHJ	ATCC
	Stamm					B2M	19 660
	ATCC	+	+	_		— _ —
Substr.ii	31 (186	+	-	D-Mannose M) D-Fucf)sc			-
		+	-	Trehalose	+	+	-
	+	-	-	Cellobiose	-	-	-
	+	+	+	Maltose	-	-	-
Glycerin	+	+	-	Saccharose	-	-	-
L'Arabinosc	-	+		65 Lactose		-	-
D-Xylose	+			Raffinose	-	-	-
L-Rhamnose	+		Inosit	-	+	-
D-Fructose	+		D-Manni!	-t-	+
D-Galactose
D^GIucose

17

Fortsetzung

D-Sorbit

-

Ps. fluores- Ps. aeru-

DC voa Bu-2183-Komponenten

LÖiiungsrnittelsystem

043

18

..

P^ fll 1^rf»c_ Pc tif»n i_

ginosa

Lösungsmittelsystem

*) Auffindung: Ninhydrinreagens.

MHK(y/ml)

Bu-2183 "B

30

C D

25 56

Dulcit

Inulin -

cens ginosa

System Platte

Äthanol -

cens

ATCC

Tabelle VI

Bu-2183 A

50

27

0,21 0,23

Substrat Stamm

Geraniol -

Salicin -

NIHJ ATCC 5

CHC1₃-CH₃OH-28%NH₄OH

Suhstrat Stn mm

n-Propanol -

NIHJ

19660

12,5

25

0,15 0,03

ATCC

Stärke

Acetat +

d2M 19 660

S-117 Silikagel

t~J UU-Il-I ti I- (J(-ll|}|(| I
ATCC

Phenol

B254

Antibakterielle Spektren von Bu-2183 A und B

25

>1OO

31086

Cellulose

Propionat +

S-122 Silikagel

31086

Kresol -

-f-

Testorganismus

25

>100

jS-OH-Butyrat +

+ -

Monoäthanolamin -

100

Rf*)

2-Ketogluconat +

- -

Tabelle V

Äthylamin -

-

S. aureus Smith

25

A

Succinat +

- + ίο

Diäthylamin -

-

CHC1₃-CH₃OH-28%NH₄OH (1:3:2)

S. aureus D193

0,49

A₂

Maieat

- -

Triäthylamin -

-

—

CHCl₃-CH₃OH-2n-NH₄OH-CH₃COOH

S, aureus D133

0,39

0,57

Glycolat -

- -

Testosteron -

-

—

(20:65:40:5)

S. aureus D137

0,48

DL-Lactat +

- -

Acetamid -

-

S. aureus A20239

Pelargonat +

- -

Arginin +

-

Adipat -

- - 15

Valin +

-

p-OH-B enzoat +

+ +

Norleucin -

-

m-OH-Benzoat

+ +

D-Tryptophan -

-

+

Methanol -

+ +

δ-Aminovalerat +

-f

+

Kanamycin A

Tabelle IV

+ +

Betain +

+

-

0,2

+ + 20

Putrescin -t-

-

0,4

-

0,8

- -

Basalmedium enthält pro Liter:

-

+

1,6

+ +

40 ml 1 m-Phosphatpuffer (pH

+

25

+ +

lg(NH₄)₂SO₄;

+

+ 25

+ +

— —

6,8);

+

20 ml Hutners vitaminfreie Mineralsalzlösung.

Rf*)

A B

1(1:3:2) 0,39 0,

CHCl₃-CH₃OH-2n-NH₄OH-CH₃COOH 0,38 0,

(20:65:40:5)

DC von Bu-2183-Komponenten A und A₂

System Platte

S-117 Silikagel

S-122 Silikagel

	Fortsetzung	25 56	043	20	Bu-2183 B	/ml)	Kanamycin A
19	Testorganisnius				50	A	0,8
				50		0,4
E. coli NIHJ	MHK (j'/ml)		50		100
E. coli PO 1495	BU-2I83A		100		25
E. coli ML 1630	12,5		12,5		12,5
E. coli NR 79/W677	25		50		25
E. coli JR 35/C600	12,5		25		25
E. coli A20107	25		100		6,3
E. coli JR 66/W677	6,3		50		0,8
E. coli R 5	12,5		25		12,5
E. coli A70895	6,3		50		100
E. coli A20732	25		100		50
Ent. cloacae A20364	12,5		50		0,2
Ent. cloacae A21006	12,5		50		0,8
Pr. vulgaris A9436	25		25		0,4
Pr. morganii A20031	25		>100		0,8
Pr. mirabilis A9554	12,5		12,5		0,2
Prov. stuartii A20894	25		100		100
K.. pneumoniae DH	12,5		>100	0.8
K. pneumoniae Typ 22-3038	>100		>100	>100
Ser. marcescens A20019	3,1		25	6,3
Ser. marcescens A 21247	25		100	>100
Ps. aeruginosa A 9930	>100		100	25
Ps. aeruginosa A 20653	100		50	12,5
Ps. aeruginosa #130	12,5		100	>100
Ps. aeruginosa A 20601	25		50	100
Ps. aeruginosi A 20896	25		>100	12,5
Ps. aeruginosa GN 315	25
Pseudomonas sp. A 20621	25
Tabelle VIl	25
Antibakterielle Spektren von	> 100		Bu-2183 A₂
Testorganismus			25
	BU-1283A und A₂		50
S. aureus Smith		MHK (	100
S. aureus D 193		Bu-2183	100
S. aureus D 133		25	100
S. aureus D 137		25	100
S. aureus A 20239		50	>100
E. coli NIHJ		50	.50
E, coli PO 1495		50	25
i E. coli ML1630		25	6,3
' E, coii NR79/W677		25	50
E, coli JR35/C60Ö		25	25
E. coli A 20107		12,5	25
E. coli JR66/W677		6,3
E. coli R5		25
	25
	6.3

Fortsetzung

22

Teslorganismus

MlIKf /ml)
BU-2I83A

Bu-2183A₂

E. coli A 20895 25

E. coli A 20732 12,5

Ent. cloacae A 20364 25

Ent. cloacae A 21006 25

Pr. vulgaris A 9436 25

Pr. morganii A 20031 25

Pr. mirabilis A 9554 25

Prov. stuartii A20894 >l00

K. pneumoniae DIl 6,3

K. pneumoniae Typ 22-3028 25

Ser. marcescens A 20019 >100

Ser. marcescens A 21247 > ί 00

Ps. aeruginosa A 9930 12,5

Ps. aeruginosa A 20653 50

Ps. aeruginosa # 130 25

Ps. aeruginosa A 20601 50

Ps. aeruginosa A 20896 50

Ps. aeruginosa GN315 25

Pseudomonas sp. A 20621 > ί 00

Tabelle VIII

Einfluß des pH der Medien auf die MHK von Bu-2183A

50 25

100 100

100 50 50

> loo

12,5 iöö

>100 >100

>ioo

100 >100 >i00

100

>ioo

pH 6

pH 7

pH

E. coli NIHJ
K. pneumoniae D 11
Ps. aeruginosa D 15
S. aureus Smith
B subtiiis PCI 219

>50	50	25	12,5
12,5	12,5	12,5	3,1
>50	50	25	12,5
>50	50	50	50
50	6,3	6,3	6,3

Tabelle IX

Einfluß der Medien auf die Aktivität von Bu-2183A und B

Stamm	BU-2183A	HIA	MHA	BU-2183B	HIA	MHA
	NA-)	50	100	NA	>100	>100
E. coli NTHJ	124	124	25	50	50	50
K. pneumoniae D 11	3.1	50	100	12,5	>100	>100
Ent cloacae A20364	25	50	100	50	>100	>100
Ps. vulgaris A9436	124	50	50	50	>100	100
Ps. mirabilis A9554	12,5	25	50	25	100	>100
Ps. aeruginosa A9930	124	50	50	25	100	>100
S. aureus Smith	124	iOO	>100	50	>100	>100
S. aureus A20239	25		100

*) NA : Nälirargar

HIA : Heart-Infnsioiisaigar.
MHA: Mueller-Hintonargar.

Tabelle X

In-vivo^Aktivität von Bu-2183 A und B

Infizierende Mikroorganismen

PD50 in mg/kg
(Einzeldosis)

Bu-2183Ä

BÜ-2I83B

S. aureus Smith 42

E. coli NIlIJ 92

frs. aeruginosa Λ9930 230

100
135
540

Infizierende Mikroorganismen

PD50 in mg/kg
(Doppeldosis)

BU-2I83A

S. aureus Smith 36-2

fe. coli NIIIJ 45·2

Ps. aeruginosa A9930 80-2

Das nachfolgende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung. Als Ionenaustauscher wurden durchwegs tchwachsaure kationische Austauscherharze mit Carboxylgruppen (Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolymerisal, pK etwa 6,1) verwendet.

Beispiel
1. Fermentation im Tank

Man verwendet eine Agar-Schrägkultur von Pseudomonas sp. Stamm ATCC 31 086, um 100 ml des Saalmediums in 500 ml Erlenmeyer-Kolben zu inokulieren. Die Kolben werden 3 Tage auf einer Rotations-Schüttelvorrichtung (250 UpM) bei 28°C inkubiert, und man verwendet I Ltr. Saatkultur, um 300 ml des Fermentationsmediums zu inokulieren. Der Tank wird bei 30⁰C unter Rühren bei 140 UpM und einer Belüftungsrate von 200 l/min betrieben. Die Brühenwirksamkeit wird durch die Papierscheiben-Agarplattenmethode unter Verwendung von B. subtilis PCI 219 als Testorganismus und Bu-2183 A als Teststandard bestimmt. Man erhält die nachfolgenden Ergebnisse:

Zeit (Std.)

pH der Brühe

0
20
-30
40
50
60
64

6,7
7,5
7,8
7,9
7,9
8,1
8,1

200
400
1600
1650
1700
1800

2. Aufarbeitung

Die geerntete Brühe wird mit Filterhilfe bei pH 2 filtriert. Das Filtrat (19 I), das ungefähr 30 g Wirksamkeit an Bu-2183 A enthält, wird auf pH 7 eingestellt und mit 3 i ionenaustauscher (NH+4-Form) gerührt Man trennt das Harz ab, wäscht nacheinander mit 101 Wasser Und 5! n/50 NH4OH und rührt dann mit zwei 4-I-Portionen n/2 NH₄OH, um die Bioaktivität zu

eluieren. Man vereinigt die aktiven Eluate, konzentriert im Vakuum und lyophilisicrt dann, wobei man 18,6 g weißen Feststoff (ungefähr 700y/mg) erhält. Diesen Feststoff löst man in Wasser und gibt auf eine Säule mit Ionenaustauscher (NH+4-Form, 400ml) auf. Die Säule wird nacheinander iriil 2,2 I Wasser Und 3 I n/40 NH₄OH gewaschen und dann mit n/20 NH₄OH entwickelt. Die Eluate werden fraktioniert gesammelt und durch Biounlersuchung auf einer B.-subtilis-Platte und auch durch DC (System S-117, Ninhydrin) untersucht. Geeignete Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und lyophiüsierl, wobei man die folgenden Feststoffe erhält:

n/20 NH₄OIi

FeststolT,
Gewicht

Bu-2183-Komportcnten (roh)

0-1,31
-2,51
-4,41
-5,21

2.7 g

7.8 g
3,3 g

keine Aktivität

A + B (weniger)

3. Gewinnung von Bu-2183 A

Die in der Aufarbeitungsstufc erhaltene rohe Probe von Bu-2183 A (2,7 g) wird in Wasser gelöst und auf eine Säule mit Ionenaustauscher (NH+₄-Form, 80 ml) aufgegeben. Die Säule eluiert man mit n/20 NH₄OH und sammelt jeweils 15-ml-Portionen des Eluats in einem Fraktionssammler. Die Fraktionen werden durch DC/Ninhydrin und ebenso durch Biountersuchung getestet, und geeignete Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man die nachfolgenden Feststoffe erhält:

Fraktion Nr.

Feststoff,
Gewicht

DC

Wirksamkeit (K/ml)

28-53 801mg A+Verunreinigung

54-72 1597 mg A

73-95 189 mg A + B (weniger)

Das reine Präparat von Bu-2183 A wird zu C15H31N3O9 · '/2 H₂CO₃analysiert.

Analyse:

Ber.: C 43,45, H 7,53, N 9,81%;
gef.: C 43,22, H 7,52, N 9,49%.

Seine IR- und NMR-Spektren sind in Fig. 1 bzw.2 - gezeigt. Eine Zusammenfassung der, NMR-Daten ist nachfolgend angegeben:

Chemische Verschiebung Kopplungskonstante Relative
C<5, ppm) (J, Hz) Intensität

1,12 (t)

2,29 (q)

3,1-3,35 (m)

3,5-4,3 (m)

5,17 (d)

7,5
7,5

1 η

3H
2 H
2H
12H
IH

Cs) = Singulett; (d) = Dubiett; (i) = Triplett; (q) = Quartett; (m) = Multiplen.

4. Gewinnung von Bu-2183 B

Die in der Aufarbeitungsstufe erhaltene rohe Probe von Bu-2183 B (3,3 g) wird in Wasser gelöst und auf eine Säule mit Ionenaustauscher (NH*4-Formj 130 ml) aufgegeben. Man eluicrt die Säule mit n/20 NI-UOH und sammelt jeweils '5 ml-Poriiötiendes Eklats durch einen Frakliönssamm!tir. Die Fraktionell werden durch DC/Ninhydrin und ebenso durch Biounterstichung getestet, und geeignete Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man die nachfolgenden Feststoffe erhält:

Fraktion Nr.

Feststoff",
Gewicht

DC

1 - 5°· 86 mg

60-151 2792 mg

152-160 356 mg

B + Verunreinigung
B

B+ Verunreinigung
(weniger)

Das reine Präparat von Bu-2183 B wird zu ι/ι H₂CO, analysiert.

Analyse:

Ber.: C 42,02, H 7,30, N 10,14%;
gef.: C 41,92, H 7,43, N 9,93%.

Seine IR- und NMR-Spektren sind in Fig. 5 bzw. 6 gezeigt. Eine Zusammenfassung der NMR-Daten ist nachstehend angegeben:

Chemische Verschiebung
(<?, Ppm)

Kopplungskonstante Relative
(J, Hz) Intensität

	2,02 (s)	3,0
3,1	-3,2(m)	= Duplett; (m)
3,6	- 4,3 (m)
	5,17 (d)
(S)	= Singulett; (d)

3 H

2 H

12 H

IH

Multiplett.

5. Gewinnung von Bu-2183 C und Bu-2183 D

Die in der Aufarbeitungsstufe verwendete Säule wird weiter mit 1,4 I n/20 NH₄OH entwickelt, mit dem kein weiteres bioaktives Material eluiert wird. Dann entwickelt ^Λman."die"Säule mit n/10 NH₄OH und

untersucht die liluate durch DC₄ wobei mit Ninhydrinfcägens besprüht wird. Geeignete Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man die folgende Feststoffe erhält:

n/10 NM₄OM Feststoff, Identirizierung

FestslofT,
Gewicht

0- 300 ml

301 -1200 ml

1201 -1900 ml

1901 -2400 ml

1638 mg
526 mg

Bu-2183 C
Bu-2183 D

6. Gewinnung von Bu-2183 Λ2

Während des bei der Gewinnung von Bu-2183 Λ beschriebenen Reinigungsverfahrens wird eine neue aktive Komponente aus den Vorfraktionen isolierl und als Komponente Bu-2183 A2 bezeichnet. Sie wird durch die DC-.Systemc S-117 und S-122 von der Komponente A differenziert, wie nachstehend gezeigt:

Bu-2183 Λ

Bu-2183 Λ,

S-117
S-122

Rr = 0,49
Rf = 0,39

RT =0,48

Die IR- und NMR-Spektrcn der Komponente J5 Bu-2183 A 2 sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Eine Zusammenfassung der NMR-Datcn ist nachstehend angegeben:

Chemische Verschiebung	Kopplungskonstante	Relative
(J, ppm)	U,Hz)	Intensität
0,92 (t)	7,5	311
1,63 (Sextett)	7,5	211
2,30 (t)	7,5	211
3,1 -3,5(m)		211
3,6-4,4 (m)		1211
5,27 (d)	3,0	IH

(d) = Dublett: (0 _r= Triplett; (m) s. Multiplen.

Hierzu 8 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikumkomplexes Bu-2183, dadurch gekennzeichnet, daß man Pseudomonas sp. Stamm ATCC 31 086 in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen bei einem pH von 4,5 bis 11,0 und einer Temperatur von 4 bis 37° C kultiviert, bis durch den Organismus im Kulturmedium eine wesentliche Menge an Bu-2183-Komplex gebildet ist und man in einer weiteren Stufe den Bu-2183-KompIex aus dem Kulturmedium gewinnt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kultivieren bei einem pH von 5,5 bis 9,5 und einer Temperatur von 10 bis 32"C durchführt

3. Verfahren zur Gewinnung der Komponenten Bu-2183 A, SU-2183B, Bu-2183 A₂ und Bu-2183 D, dadurch gekennzeichnet, daß man den gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 erhaltenen Bu-2183-Komplex durch

(a) Adsorbieren des Komplexes an einem kationischen Ionenaustauscherharz,

(b) fraktioniertes Eluieren der Bu-2183-Komponenten von dem Adsorbens und

(c) Gewinnen der Fraktionen der gewünschten Komponenten Bu-2183 A, B, A2 und D

auftrennt.

4. Antibiotil: im Bu-2183 A der Formel