MX2011000233A - Agentes de union del receptor notch1 y metodos para su uso. - Google Patents

Abstract

Se describen medios y métodos para diagnóstico, caracterización, pronóstico y tratamiento de cáncer, específicamente enfocadas en las células madre cancerígenas. Se proporciona un anticuerpo que específicamente se une a un dominio extracelular próximo de membrana, de unión no de ligando del receptor Notch humano e inhibe el crecimiento tumoral, y un método para tratar cáncer que comprende administrar el anticuerpo a un sujeto.

Description

AGENTES DE UNION DEL RECEPTOR NOTCH1 Y METODOS PARA SU USO Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones que comprenden un agente que se une a un receptor Notch humano y métodos para utilizar las composiciones para caracterización, diagnóstico y tratamiento de cáncer y otras enfermedades. En particular, la presente invención proporciona anticuerpos que específicamente se unen a una región próxima de la membrana de unión a ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhiben el crecimiento tumoral . La presente invención además proporciona métodos para tratar cáncer, los métodos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que específicamente se une a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de una proteína del receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral.

Antecedentes de la Invención El cáncer es una de las causas principales de muerte en el mundo desarrollado, dando como resultado aproximadamente 500,000 muertes por año en los Estados Unidos solamente. Aproximadamente se diagnostican con cáncer un millón de personas en Estados Unidos cada año, y en general se estima que más de 1 en 3 personas desarrollarán una forma Ref. 216747 ? de cáncer durante su vida. Aunque existen más de 200 tipos diferentes de cáncer, 4 de ellos, de pecho, de pulmón, colorectal y de próstata, representan más de la mitad de todos los nuevos casos (Jemal et al., 2003, Cáncer J. Clin 55:5-20) .

El cáncer surge de la desregulación de los mecanismos que controlan el desarrollo normal y el mantenimiento tisular, y las células madre en aumento se cree que juegan un papel central (Beachy et al., 2004, Nature 432 324) . Durante el desarrollo normal de los animales, las células de la mayoría o todos los tejidos se derivan de precursores normales, denominados células madre (Morrison et al., 1997, Cell 88:287-98; Morrison et al., 1997, Curr Opin. Immunol . 9-216-21; Morrison et al., 1995, Annu. Rev. Cell Dev. Biol 11:35-71) . Las células madre son células que: (1) tienen una extensa capacidad de capacidad proliferativa; (2) son capaces de la división celular asimétrica para generar una o más clases de progenie con potencial proliferativo y/o de desarrollo reducido; y (3) son capaces de la división celular simétrica para la auto-renovación o auto-mantenimiento. El ejemplo más conocido de la renovación de células en adultos a través de la diferenciación de células madre es el sistema hematopoyetico en donde los precursores en desarrollo inmaduros (células madre y progenitoras hematopoyéticas) responde a las señales moleculares para formar los tipos celulares sanguíneos y linfoides variables. Otras, células, incluyendo las células del intestino, las células de los conductos de pecho, y la piel, se recargan constantemente en una pequeña población de células madre en cada tejido, y los recientes estudios sugieren que la mayor parte de los otros tejidos en adultos también alojan células madre, incluyendo el cerebro.

Los tumores sólidos están compuestos de. poblaciones celulares heterogéneas. Por ejemplo, los cánceres de pecho son una mezcla de células cancerígenas y células normales, incluyendo células del mesenterio (del estroma) , células inflamatorias, y células endoteliales . Los modelos clásicos de cáncer soportan que todas las poblaciones celulares cancerígenas fenotípicamente diferentes tengan la capacidad de proliferar y dar origen a un nuevo tumor. En un modelo clásico, la heterogeneidad de las células tumorales resulta de factores ambientales así como mutaciones en curso dentro de las células cancerígenas dando como resultado una población diversa de células tumorigénicas . Este modelo se basa en la idea de que todas las poblaciones de células tumorales tendrían algún grado de potencial tumorigénico (Pandis et al., 1998, Genes, Chromosomes & Cáncer 12: 122-129; Kuukasjrvi et al., 1997, Cáncer Res 57:1597-1604; Bonsing et al., 1993, Cáncer 71:382-391; Bonsing et al., 2000, Genes Chromosomes & Cáncer 82: 173-183; Beerman H et al., 1991, Cytometry 12: 147-54; Aubele M & Werner M, 1999, Analyt. Cell. Path 19:53; Shen L et al., 2000, Cáncer Res. 60 :3884) .

Un modelo alternativo para la heterogeneidad celular de tumor sólido observada es que los tumores sólidos resultan de una "célula madre de tumor sólido" (o "célula madre cancerígena" de un tumor sólido) que posteriormente experimenta el desarrollo caótico a través de ambas rondas, simétrica y asimétrica de las divisiones celulares. En este modelo de célula madre, los tumores sólidos contienen un subgrupo diferente y limitado (posiblemente aún raro) de células que comparten las propiedades de las "células madre" normales, en que proliferan extensiva y eficientemente para dar origen a ambas células madre de tumor sólido adicionales (auto-renovación) y a la mayor parte de las células tumorales de un tumor sólido que carecen de potencial tumorigénico . Ciertamente, las mutaciones con una población de células madre que viven largo tiempo pueden iniciar la formación de células madre cancerígenas que se basan en el crecimiento y mantenimiento de tumores y cuya presencia contribuye a la falla de los métodos terapéuticos actuales.

La naturaleza de la célula madre de cáncer, primero se reveló en el cáncer de la sangre, leucemia mieloide aguda (AML) (Lapidot et al., 1994, Nature 367:645-8). Más recientemente se ha demostrado que los tumores de pecho humanos malignos similarmente alojan una pequeña población diferente de células madre cancerígenas enriquecidas por la habilidad de formar tumores en ratones inmunodeficientes . Una población de células ESA+ , CD44+, CD24-/bajo, Lin se encontró que está 50 veces más enriquecida para células tumorigénicas comparadas con células de tumor no fraccionadas (Al-Hajj et al., 2003, PNAS 100:3983-8). La habilidad para prospectivamente aislar las células cancerígenas tumorigénicas ha permitido la investigación de trayectorias biológicas críticas que basan la tumorigenicidad en estas células, y de esta forma promete el desarrollo de mejores ensayos de diagnóstico y terapéuticos para pacientes con cáncer. Es hacia este propósito que esta invención está dirigida.

Las células madre normales y las células madre cancerígenas comparten la habilidad de proliferar y auto-renovarse, de esta forma no es sorprendente que un número de genes que regulan el desarrollo de las células madre normales contribuyan a la tumorigénesis (revisado en Reya et al., 2001, Nature 414:105-111 y Taipale & Beachy, 2001, Nature 411:349-354). La presente invención identifica el receptor Notch, por ejemplo, Notchl, como un marcador de células madre cancerígenas, implicado en la trayectoria de señalización Notch en el mantenimiento de células madre cancerígenas y como un objetivo para tratar cáncer a través de la eliminación de estas células tumorigénicas .

La trayectoria de señalización Notch es uno de varios reguladores críticos de la formación del patrón embrionario, del mantenimiento del tejido post-embrionario y la bilogía de la célula madre. Más específicamente, la señalización de Notch está involucrada en el procedimiento de la inhibición lateral entre el destino de la célula adyacente y juega un papel importante en la determinación del destino de la célula durante las divisiones celulares asimétricas. La señalización Notch no regulada está asociada con numerosos cánceres en humanos y puede alterar el destino del desarrollo de las células tumorales para mantenerlas en un estado no diferenciado y proliferativo (Brennan and Brown, 2003, Breast Cáncer Res 5:69) . De esta forma la carcinogénesis puede avanzar usurpando los mecanismos homeostáticos que controlan el desarrollo normal y la reparación tisular a través de las poblaciones de células madre (Beachy et al, 2004, Nature 432 :324) .

El receptor Notch primero se identificó en mutantes de Drosophila con haploinsuficiencia dando como resultado muescas en el margen del ala, mientras la pérdida de la función produce un fenotipo "neurogénico" letal embrionario en donde las células de la epidermis cambian el destino hacia el tejido neural (Moohr, 1919, Genet . 4:252; Poulson, 1937, PNAS 23.133; Poulson, 1940, J Exp Zool 83:271). El receptor Notch es un receptor de transmembrana de un solo paso que contiene numerosas repeticiones de tipo factor de crecimiento epidérmico tándem (EGF) y tres repeticiones Not/LIN-12 ricas en cisteína (LNRs) dentro de un gran dominio extracelular (Wharton et al., 1985, Cell 43:567; Kidd et al., 1986, Mol Cell Biol 6:3094; revisado en Artavanis et al., 1999, Science 284 770) . Las LNR y una cola C-terminal adicional de aproximadamente 103 aminoácidos del dominio extracelular son referidas en la presente como la "región próxima de membrana" . Esta región también es conocida como, y referida como la región reguladora negativa Notch (NRR) .

Los receptores Notch de mamífero experimentan la división para ambas formas del receptor maduro y después de la unión del ligando a la señalización en corriente abajo activa. Una proteasa de tipo furina separa los precursores del receptor Notch durante la maduración para generar heterodímeros de yuxtamembrana que comprenden una subunidad extracelular no covalentemente asociada y una subunidad de transmembrana que se mantiene unida en un estado auto-inhibidor. La unión del ligando alivia esta inhibición e induce la separación del receptor Notch a través de una metaloproteasa de tipo ADAM y gama-secretasa, la anterior de las cuales libera el dominio intracelular (ICD) en el citoplasma, permitiéndole transferirse al núcleo para activar la transcripción del gen. La separación a través de ADAM ocurre dentro del dominio de separación de unión no de ligando dentro de la región reguladora negativa de yuxtamembrana (NRR) (ver Figura 1A) . En el receptor Notchl esta región abarca de aproximadamente el aminoácido 1427 a aproximadamente el aminoácido 1732.

Se han identificado cuatro proteínas Notch de mamífero (Notchl, Notch2 , Notch3 y Notch4) y las mutaciones en estos receptores invariablemente dan como resultado el desarrollo de anormalidades y patologías humanas que incluyen varios cánceres como se describen con detalle a continuación (Gradley, 1997, Mol Cell Neuroscí. 9: 103; Joutel & Tournier-Lasserve, 1998, Semin Cell Dev Biol 9:619-25) .

El receptor Notch se activa a través de los ligandos de transmembrana de un solo paso de la familia Delta, Dentada, Lag-2 (DSL) . Existen cinco ligandos Notch conocidos en mamíferos: de tipo Delta 1 (DLL1) , tipo Delta 3 (DLL3) , tipo Delta 4 (DLL4), Jaggedl y Jagged2, caracterizados por el dominio DSL y repeticiones de tipo EGF tándem dentro del dominio extracelular . El domino extracelular del receptor Notch interactúa con estos ligandos, típicamente en células adyacentes, dando como resultado dos separaciones proteolíticas de Notch; una separación extracelular mediada por una proteasa ADAM (una Desintegrina y Metalopeptidasa) y una separación dentro del dominio de transmembrana mediada por gama-secretasa . Esta separación anterior genera el dominio intracelular Notch (ICD) , que después entra en el núcleo en donde activa el CBF1, el Supresor sin Pelo [Su(H) ] , Lag-2 (CSL) de los factores de transcripción como los efectores en corriente abajo principales para aumentar la transcripción de los factores de transcripción de hélice-bucle-hélice básicos nucleares de la familia pilosa y potenciadora de la división [E(spl)] (Artavams et al., 1999, Science 284:770; Brennan and Brown, 2003, Breast Cáncer Res 5:69; Iso et al., 2003, Artenoscler. Thromb Vase Biol 23:543) . Las trayectorias intracelulares alternativas que involucran la proteína citoplásmica Deltex identificada en Drosophila también pueden existir en mamíferos (Martínez et al., 2002, Curr Opin. Genet Dev 12:524-33), y esta trayectoria dependiente de Deltex puede actuar para suprimir la expresión de los genes objetivo Wnt (Brennan et al., 1999, Curr Biol 9:707-710; Lawrence et al., 2001, Curr Biol 11-375-85).

Las células madre hematopoyéticas (HSC) son las células madre mejor entendidas en el cuerpo, y las señalización Notch está implicada en ambos, en su mantenimiento normal así como la transformación leucémica (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol Oncol Res 10 69-73) . Las HSC son una rara población de células que reside en el nicho del estroma dentro de la médula espinal en adultos. Estas células se caracterizan ambas por un único perfil de expresión genética así como una habilidad para continuamente dar origen a células progenitoras más diferenciadas para reconstituir el sistema hematopoyético completo. La activación constitutiva de la señalización Notchl en las HSC y células progenitoras establece líneas celulares inmortalizadas que generan tanto células linfoides como mieloides in vitro y en ensayos de reconstitución a largo plazo (Varnum-Finney et al., 2000, Nat Med 6:1278-81), y la presencia de Jaggedl aumenta el trasplante de poblaciones células de la médula espinal humana enriquecidas para las HSC (Karanu et al., 2000, J Exp Med 192: 1365-72). Más recientemente, la señalización Notch se ha demostrado en las HSC in vivo y mostró que está involucrada en la inhibición de la diferenciación de las HSC. Además, la señalización de Notch parece que es requerida para la auto-renovación de las HSC mediada por Wnt (Duncan et al, 2005, Nat Immunol 6:314).

La trayectoria de la señalización de Notch también juega un papel principal en el mantenimiento de las células madre neurales y está implicada tanto en su mantenimiento normal como en cánceres de cerebro (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol Oncol Res 10 69-73; Purow et al., 2005, Cáncer Res 65.2353-63; Hallahan et al., 2004, Cáncer Res 64 7794-800) . Las células madre neurales dan origen a todas células neuronales y gliales en el sistema nervioso de mamíferos durante el desarrollo, y más recientemente se han identificado en el cerebro de adultos (Gage, 2000, Science 287 1433-8). Loa ratones deficientes de Notchl; los genes objetivo Notch Hesl, 3, y 5; y un regulador de señalización Notch de presenilina 1 (PS1) mostraron números disminuidos de células madre neurales embrionarias. Además, las células madre neurales en adultos se reducen el cerebro de ratones heterocigotos PS1 (Nakamura et al., 2000, J Neurosci 20:283-93; Hitoshi et al., 2002, Genes Dev. 16:846-58). La reducción en las células madre neurales parece que resulta de su diferenciación prematura en neuronas (Hatakeyama et al, 2004, Dev 131:5539-50) sugiriendo que la señalización de Notch regula la diferenciación de las células madre neurales y la auto-renovación .

La señalización de Notch aberrante está implicada en un número de cánceres humanos. El gen Notchl en humanos primero se identificó en un subgrupo de leucemias linfoblásticas agudas de célula T como un sitio transferido que resulta en la activación de la trayectoria de Notch (Elhsen et al, 1991, Cell 66:649-61). La activación constitutiva de la señalización Notchl en células T en modelos de ratón similarmente genera linfomas de la célula T que sugieren un rol causativo (Robey et al, 1996, Cell 87:483-92; Pear et al, 1996, J Exp Med 183:2283-91; Yan et al., 2001, Blood 98-3793-9; Bellavia et al., 2000, E BO J 19:3337-48). Recientemente las mutaciones de punto, inserciones y eliminaciones de Notchl que producen la señalización de Notchl aberrante se ha encontrado que frecuentemente están presentes en leucemia/linforna linfoblástica aguda de célula T tanto en niños como en adultos (Pear & Aster, 2004, Curr Opin Hematol 11.416-33).

La frecuente inserción de virus de tumor mamario en ratones en ambos sitios Notchl y Notch4 en tumores mamarios y los fragmentos de proteína Notch activados resultantes primero implicaron la señalización Notch en cáncer de pecho (Gallahan & Callahan, 1987, J Virol 61.66-74; Brennan & Brown, 2003, Breast Cáncer Res 5 69, Politi et al , 2004, Semin Cáncer Biol 14:341-7). Los estudios adicionales en ratones transgénicos han confirmado un papel para Notch en la ramificación de conductos durante el desarrollo normal de las glándulas mamarias, y la forma constitutivamente activa de Notch4 en células epiteliales mamarias inhiben la diferenciación epitelial y da como resultado la tumorigénesis (Jhappan et al, 1992, Genes & Dev 6 345-5; Gallahan et al., 1996, Cáncer Res 56 1775-85, Smith et al, 1995, Cell Growth Differ 6:563-77, Soriano et al., 2000, Int J Cáncer 86:652-9, Uyttendaele et al, 1998, Dev Biol 196.204-17; Politi et al, 2004, Semin Cáncer Biol 14 341-7) . Actualmente, la evidencia para un papel para Notch en cáncer de pecho humano está limitado a la expresión de los receptores Notch en carcinomas de pecho y su correlación con el resultado clínico (Weijzen et al., 2002, Nat Med 8 979-86, Parr et al., 2004, Int J Mol. Med 14:779-86). Además, la sobre-expresión de la trayectoria de Notch ha sido observada en cánceres cérvicos (Zagouras et al, 1995, PNAS 92:6414-8), carcinomas de célula renal (Rae et al., 2000, Int. J. Cáncer 88:726-32), carcinomas de célula escamosa de cabeza y cuello (Lecthanakul et al, 2000, Oncogene 19:3220-4), cánceres del endometrio (Suzuki et al., 2000, Int. J. Oncol . 17:1131-9), y neuroblastomas (van Limpt et al., '2000, Med. Pediatr. Oncol 35:554-8) lo que sugiere un papel potencial para Notch en el desarrollo de un número de neoplasmas. De manera interesante, la señalización de Notch debería jugar un papel en el mantenimiento del estado no diferenciado de las células neoplásicas mutantes Apc del colon (van Es & Clevers, 2005, Trends in Mol. Med. 11:496-502).

La trayectoria de Notch también está involucrada en múltiples aspectos del desarrollo vascular que incluyen proliferación, migración, diferenciación del músculo liso, angiogénesis y diferenciación arterial -venosa (Iso et al, 2003, Arterioscler Thromb. Vasc . Biol. 23:543). Por ejemplo, las mutaciones nulas homocigotas en Notchl/4 y Jaggedl , así como la pérdida heterocigota de DLL4 da como resultado defectos de severos a variables en el desarrollo arterial y la vascularización del saco de la yema. Además, los embriones de ratones deficientes de DLL1 e hipomórficos de Notch2 muestran hemorragia que probablemente resulta de un pobre desarrollo de estructuras vasculares (Gale et al., 2004, PNAS, 101:15949-54; Krebs et al., 2000, Genes Dev. 14: 1343-52; Xue et al, 1999, Hum Mel Genet 8:723-30; Hrabe de Angelis et al., 1997, Nature 386:717-21; McCright et al., 2001, Dev. 128:491-502). En humanos, las mutaciones en Jaggedl están asociadas con el síndrome de Alagille, un trastorno del desarrollo que incluye defectos vasculares, y mutaciones en Notch3 que son responsables de una demencia vascular hereditaria (Cadasil) en donde la homeostasis de los vasos es defectuosa (Joutel et al., 1996, Nature 383 707-10).

La identificación de Notchl, Notch4, DLL1 y DLL4 como genes expresados en células madre cancerígenas comparada con el epitelio de pecho normal sugiere que la activación de la trayectoria de Notch puede ayudar a eliminar no solamente la mayor parte de las células cancerígenas no tumorigénicas , sino las células tumorigénicas responsables de la formación y la re-aparición de tumores sólidos. Además, debido al prominente papel de la angiogénesis en la formación del tumor y el mantenimiento, la activación de la trayectoria de Notch también puede efectivamente inhibir la angiogénesis, deja de alimentar un cáncer de nutrientes y contribuye a su eliminación.

Los anticuerpos anti-Notch y su posible uso como terapéuticos anti-cancerígenos han sido reportados. Ver, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente de E. U. A. Nos. 2008/0131434 y 2009/0081238, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. Ver también las Publicaciones Internacionales Nos. WO 2008/057144, WO 2008/076960, y WO 2008/50525.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona agentes que se unen a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl y composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden estos agentes. La invención además proporciona métodos para activar células madre cancerígenas con los agentes. En algunas modalidades, el método comprende reducir la frecuencia de células madre cancerígenas en un tumor, reduciendo el número de células madre cancerígenas en un tumor, reduciendo la tumorigenicidad de un tumor, y/o reduciendo la tumorigenicidad de un tumor mediante la reducción del número o frecuencia de células madre cancerígenas en el tumor. La invención también proporciona métodos para utilizar los agentes en el tratamiento de cáncer y/o en la inhibición del crecimiento tumoral .

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que específicamente se une a la región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl (por ejemplo, Notchl humano) . En algunas modalidades, la región próxima de la membrana de unión no de ligando de un receptor Notchl comprende aproximadamente del aminoácido 1424 a aproximadamente el aminoácido 1732 de un receptor Notchl humano. En algunas modalidades, la región próxima de la membrana de un receptor Notchl comprende SEC ID NO: 2. En ciertas modalidades, el anticuerpo específicamente se une a una región próxima de la membrana de unión no de ligando de un dominio extracelular de por lo menos un miembro de la familia del receptor Notch adicional.

En algunas modalidades el anticuerpo es un antagonista de Notchl. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe la señalización a través de o la activación del receptor Notchl. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe la actividad de Notchl. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe la separación dentro de la región próxima de la membrana. En ciertas modalidades, el anticuerpo inhibe la separación del receptor Notchl (por ejemplo, la separación en el sitio S2 a través de metaloproteasa) y/o inhibe la activación del receptor Notchl a través de la unión del ligando. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe la liberación o formación del dominio intracelular (ICD) de Notchl. En ciertas modalidades, el anticuerpo inhibe el crecimiento tumoral .

En ciertas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que se une a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un Notchl humano y comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende RGYWIE (SEC ID NO: 15), una CDR2 de cadena pesada que comprende QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID NO: 16), y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende FDGNYGYYAMDY (SEC ID NO: 17) ; y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID NO: 18) , una CDR2 de cadena ligera que comprende GTNNRAP (SEC ID NO: 19), y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID NO: 20) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende RGYWIE (SEC ID NO 15) , o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID NO: 16), o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; y/o (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende FDGNYGYYAMDY (SEC ID NO 17) , o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido. En otras ciertas modalidades, el anticuerpo comprende (o además comprende) una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID NO: 18), o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende GT RAP (SEC ID NO: 19), o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; y/o (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID NO: 20), o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácido son sustituciones de aminoácido conservadoras .

En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo, 52M51, producido a través de la línea celular de hibridoma depositado en la Colección de Cultivo de Tipo Americano (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA, bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 7 agosto del 2008, y con el número de asignación asignado PTA-9405. En algunas modalidades, la invención proporciona una versión humanizada del anticuerpo 52M51, 52M51H4L3, según codificado el ADN depositado con el ATCC, bajo las condiciones del Tratado de Budapest del 15 de octubre del 2008, y con el número de asignación asignado PTA-9549. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mimo epítopo que el epítopo al cual se une el anticuerpo 52 51.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une a la región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un Notchl humano y el anticuerpo comprende, consiste, o consiste esencialmente de un anticuerpo "52R43" según codificado por el ADN depositado con el ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest del 15 de octubre del 2008, y con el número de asignación asignado PTA-9548. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que compite con 52R43 para la unión específica a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un Notchl humano. También se proporcionan las composiciones farmacéuticas que comprenden 52R43 y los métodos para tratar cáncer que comprenden administrar cantidades terapéuticamente efectivas del anticuerpo 52R43.

En ciertas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos descritos en las modalidades anteriores y/o aspectos, así como otros aspectos/modalidades descritas en cualquier lugar en la presente, para la unión específica a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un Notchl humano (por ejemplo, en un ensayo de unión competitivo) . También se proporcionan las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos descritos en la presente y los métodos para tratar cáncer que comprenden administrar cantidades terapéuticamente efectivas de los anticuerpos.

En ciertas modalidades de cada uno de los aspectos o modalidades antes mencionadas, así como otros aspectos y/o modalidades descritas en cualquier lugar en la presente, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante . En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es monovalente, monoespecífico, bivalente, biespecífico o multiespecífico . En ciertas modalidades, el anticuerpo está conjugado a una fracción citotóxica. En ciertas modalidades, el anticuerpo está aislado. En aún modalidades adicionales, el anticuerpo es sustancialmente puro.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos descritos en la presente y los métodos para tratar cáncer que comprenden administrar cantidades terapéuticamente efectivas de los anticuerpos descritos en la presente también se proporcionan. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas además comprenden un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Notchl) , una cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo, y/o un fragmento de un anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido está aislado. En ciertas modalidades, el polipéptido es sustancialmente puro. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 28, o SEC ID NO: 32. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 24 y/o una secuencia de aminoácido de SEC ÍD NO: 8, SEC ID NO : 28, o SEC ID NO: 32. En algunas modalidades, el polipéptido comprende por lo menos una porción de la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 24, y/o al menos una porción de la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8, SEC ID NO : 28, o SEC ID NO: 32.

Además son provistas las composiciones farmacéuticas que comprenden tanto el polipéptido como un vehículo farmacéuticamente aceptable, como líneas celulares que producen el polipéptido.

En algunas modalidades, el polipéptido comprende: (a) un polipéptido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 24; y/o (b) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 28 o SEC ID NO: 32. En ciertas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que específicamente se une a la región próxima de membrana de unión no de ligando de un dominio extracelular de Notchl humano) . En ciertas modalidades, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98%, o aproximadamente 100% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 28 o SEC ID NO: 32. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera del anticuerpo 52 51. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de un anticuerpo 52M51 humanizado. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera del anticuerpo 52R43.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de polinucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos y/o polipéptidos de los aspectos antes mencionados, así como otros aspectos/modalidades como se describe en la presente. En algunas modalidades, un vector de expresión comprende la molécula de polinucleótido. En otras modalidades, una célula hospedera comprende el vector de expresión. En algunas modalidades, una célula hospedera comprende una molécula de polinucleótido. En algunas modalidades, la célula hospedera es una línea celular o una línea celular de hibridoma. En ciertas modalidades, la línea celular de hibridoma produce el anticuerpo 52M51 o el anticuerpo 52M51 humanizado.

En un aspecto más, la invención proporciona un método para inhibir la actividad de Notchl en una célula, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos o polipéptidos . descritos en los aspectos y modalidades antes mencionadas, así como otros aspectos/modalidades descritas en cualquier lugar en la presente. En ciertas modalidades, la célula es una célula tumoral .

En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos o polipéptidos descritos en los aspectos y modalidades antes mencionadas, así como otros aspectos/modalidades descritas en cualquier lugar en la presente. En algunas modalidades, el tumor comprende células madre cancerígenas. En algunas modalidades, los métodos comprenden activar las células madre cancerígenas, con los anticuerpos. En ciertas modalidades, los métodos comprenden reducir la frecuencia de células madre cancerígenas en un tumor, reduciendo el número de células madre cancerígenas en un tumor, reduciendo la tumorigenicidad de un tumor, y/o reduciendo la tumorigenicidad de un tumor a través de la reducción del número o la frecuencia de células madre cancerígenas en el tumor. En algunas modalidades, los métodos comprenden inhibir la actividad de un receptor Notchl y/o inhibir el crecimiento de un tumor. En algunas modalidades, el tumor se selecciona del grupo que consiste de tumor de pecho, tumor colorectal, tumor hepático, tumor renal, tumor de pulmón, tumor pancreático, tumor ovárico, tumor de próstata y tumor de cabeza y cuello.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar cáncer en un sujeto. En algunas modalidades, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos o polipéptidos descritos en los aspectos y/o modalidades, así como otros aspectos/modalidades descritos en cualquier lugar en la presente. En algunas modalidades, el cáncer a ser tratado es cáncer de pecho, cáncer colorectal, cáncer hepático, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer de vejiga, glioblastoma, y cáncer de cabeza y cuello. En ciertas modalidades de cada uno de los aspectos o modalidades antes mencionadas, así como otros aspectos y/o modalidades descritas en cualquier lugar en la presente, el método para tratar cáncer comprende inhibir el crecimiento tumoral .

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que específicamente se une a una región próxima de la membrana de unión no de ligando de un dominio extracelular de Notchl humano, en donde la unión inhibe la actividad de Notchl.

En un aspecto más, la invención proporciona un método para reducir la tumorigenicidad de un tumor que comprende células madre cancerígenas mediante la reducción de la secuencia o número de células madre cancerígenas en el tumor, el método comprende poner en contacto el tumor con una cantidad efectiva de un anticuerpo que inhibe la actividad de Notchl .

En ciertas modalidades de cada uno de los aspectos y/o modalidades antes mencionadas, así como otros aspectos modalidades descritos en la presente, los métodos además comprenden administrar a un sujeto por lo menos un agente anti -cancerígeno y/o terapéutico adicional. En ciertas modalidades de cada uno de los aspectos o modalidades antes mencionadas, así como otros aspectos y/o modalidades descritas en cualquier lugar en la presente, el anticuerpo o polipéptido se administra a un sujeto en combinación con un tratamiento adicional para cáncer. En ciertas modalidades, el tratamiento adicional para cáncer comprende terapia por radiación, quimioterapia y/o un terapéutico de anticuerpo adicional. En ciertas modalidades, la quimioterapia comprende taxol, irinotecan, gemcitabina y/o oxaliplatina . En ciertas modalidades, el terapéutico del anticuerpo adicional es un anticuerpo es un anticuerpo que específicamente se une a un segundo receptor Notch humano (por ejemplo, Notch2) o un ligando del receptor Notch humano (por ejemplo, DLL4 o JAG1) . En ciertas modalidades, el terapéutico del anticuerpo adicional es un anticuerpo que específicamente se une a VEGF. En ciertas modalidades, el sujeto tratado es un humano.

La invención además proporciona un método para tratar cáncer en un humano, en donde el cáncer comprende células madre cancerígenas que no se caracterizan por la sobre-expresión a través de la célula, madre cancerígena de uno o más receptores Notch, que comprende administrar al humano una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl y bloquea la activación del ligando de un receptor Notchl.

La invención además proporciona un método para tratar cáncer en un humano que comprende administrar al humano cantidades terapéuticamente efectivas de (a) un primer anticuerpo que se une al receptor Notchl e inhibe el crecimiento de las células madre cancerígenas que sobre-expresan los receptores Notch, y (b) un segundo anticuerpo que se une al receptor Notch y bloquea la activación del ligando de un receptor Notch.

La invención también proporciona otro método para tratar cáncer, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de pecho, colon pancreático, de próstata, de pulmón, rectal y colorectal, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que bloquea la activación del ligando de un receptor Notchl .

La invención adicionalmente proporciona: un anticuerpo humanizado que se une a Notchl y bloquea la activación del ligando de un receptor Notchl; una composición que comprende el anticuerpo humanizado y un portador farmacéuticamente aceptable; y un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo humanizado conjugado con un agente citotóxico.

Además, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo humanizado; un vector que comprende el ácido nucleico; una célula hospedera que comprende el ácido nucleico en el vector; así un procedimiento para la producción de un anticuerpo humanizado que comprende cultivar una célula hospedera que comprende el ácido nucleico de tal forma que el ácido nucleico se expresa y, opcionalmente , además comprende recuperar el anticuerpo humanizado del cultivo de la célula hospedera (por ejemplo, del medio de cultivo de la célula hospedera) .

La invención además pertenece a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a Notch conjugado con una o más moléculas de calciqueamicina , y el uso de tales conjugados para tratar cáncer que expresa Noten, por ejemplo, un cáncer el cual las células madre cancerígenas sobre-expresan Notch.

Los ejemplos de tumores sólidos que pueden tratarse utilizando una composición terapéutica de la presente invención, por ejemplo, un anticuerpo que se une a la región próxima de membrana del dominio extracelular del receptor Notchl incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma , sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma , linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma , rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de pecho, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de la glándula sudorípara, carcinoma de la glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma , seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de célula pequeña, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma .

Cuando los aspectos o modalidades de la invención se describen en términos del grupo Markush u otro agrupamiento de alternativas, la presente invención abarca no solamente el grupo completo enumerado como un todo, sino también cada miembro del grupo individualmente y todos los subgrupos posibles del grupo principal, y también el grupo principal en donde están ausentes uno o más de los miembros del grupo. La presente invención también visualiza la exclusión explícita de uno o más de cualquiera de los miembros del grupo en la invención reivindicada.

Breve Descripción de las Figuras Figuras 1A-1D: Identificación de Anticuerpos que Activan la Región Próxima de Membrana de Notch que Inhiben la Señalización de Notch.

Figura 1A: Esquemático del receptor Notch y la región del antígeno 52M. El antígeno 52M incluye el área del receptor Notchl sujeto a separación a través de furina durante la maduración del receptor y separación a través de las proteasas ADAM (una Desintegrina y Metaloproteasa) después de la unión del ligando. El procesamiento posterior a través de gama-secretasa causa la liberación del dominio intracelular (ICD) de Notch que activa la transcripción del gen en el núcleo. Figura IB: Niveles de luciferasa (eje y) derivados de Notchl-células Hela cultivadas en la presencia de un ligando Notch soluble (hDLL4-fc) y anticuerpos del receptor Notchl . Los resultados de las células no transfectadas (NT) con o sin hDLL4-Fc se muestran en el extremo izquierdo del eje x. Los anticuerpos del receptor Notchl 52M se muestran a lo largo del eje x y se comparan con DBZ, un inhibidor de gama-secretasa Notch (GSI) , y 21M18, un anticuerpo anti-DLL4. Los anticuerpos del receptor Notchl 52M51, 52M63, 52M74 y 52M80 todos inhiben significativamente la señalización Notch como se indica por una disminución en la actividad de luciferasa. Figura 1C: Los niveles de luciferasa (eje y) se derivan de Notchl-células Hela cultivadas en la presencia de un ligando Notch soluble (hDLL4-fc) y anticuerpos del receptor Notchl. Los resultados de las células no transfectadas (NT) con y sin hDLL4-Fc se muestran en el extremo izquierdo del eje x. El hibridoma de murino 52M51 derivado del anticuerpo y la variante humanizada 52M51-H4/L3 se muestran a lo largo del eje x en varias concentraciones como se indica. Ambos el anticuerpo de murino parental 52M51 y la variante humanizada significativamente inhibieron la señalización de Notch como se indica por una disminución en la actividad de luciferasa. Figura ID: Análisis Western blot de la formación ICD después de la estimulación mediada por el ligando de Notch que expresa células Hela. El ICD mínimo se produjo en la ausencia del ligando DLL4 (-DLL4), pero la formación se estimuló por la presencia de DLL4. Los anticuerpos 52M51, 52M63, 52M74, y 52 80 reducen la formación de ICD a niveles de fondo a pesar de la presencia de DLL4.

Figuras 2A-2D: El Anticuerpo del Receptor Notchl 52M51 Inhibe la Formación in vivo.

Figura 2A: Los ratones NOD/SCID se inyectaron con células de tumor de colon C8 y se trataron con anticuerpo de control (cuadro) o un anticuerpo 52 51 anti-Notchl (triángulos) , y volumen de tumor (eje y, mm3) se midieron con el tiempo (eje x, días) . El tratamiento con los anticuerpos 52M51 (p=0.0006) significativamente inhibió el crecimiento tumoral comparado con el control. Figura 2B: Mediciones del volumen tumoral individual para animales en (Figura 2A) medido en los días 48 y 55 para control (izquierda) contra ratones tratados con 52M51 (derecha) . Una línea demarca el promedio de cada grupo experimental. Figura 1C : Ratones NOD/SCID inyectados con células de tumor de pecho PE13 se trataron con anticuerpo de control (cuadros negros) o anticuerpos anti-Notchl que no inhibieron la señalización de Notch como se muestra en la Figura IB: 52M1 (triángulos negros) y 52M2 (círculos grises) . El volumen tumoral (eje y, mm3) se midió con el tiempo (eje x, días) . El tratamiento con 52M1 y 52M2 falló al efectuar el crecimiento de tumor cuando se compara con animales tratados de control. Figura 2D: Los ratones NOD/SCID se inyectaron con células de tumor de pecho PE13 que se trataron con anticuerpo de control (cuadro) o anticuerpo 52M8 anti-Notchl (triángulos) que no inhiben la señalización de Notch como se muestra en la Figura IB. El volumen tumoral (eje y, mm3) se midió con el tiempo (eje x, días) . Figura 2D El tratamiento con 52M8 falló para efectuar el crecimiento tumoral cuando se comparó con animales tratados con control .

Figuras 3A-3D: El anticuerpo receptor anti-Notchl 52R43 inhibe el crecimiento tumoral in vivo.

Figura 3A: Ratones NOD/SCID inyectados con células de tumor de melanoma M2 se trataron con anticuerpo de control (cuadros) o anticuerpo 52R43 anti-Notchl (círculos) , y volumen tumoral (eje y, mm3) se midieron con el tiempo (eje x, días). Figura 3B: ratones NOD/SCID inyectados con células de tumor de pulmón Lu24 se trataron con anticuerpo de control (cuadros) o anticuerpo anti-Notchl 52R43 (círculos) , y el volumen tumoral (eje y, mm3) se midió con el tiempo (eje x, días). Figura 3C: ratones NOD/SCID inyectados con células de tumor pancreático PN8 se trataron con anticuerpo de control (cuadros) o' anticuerpo 52R43 anti-Notchl (círculos) y el volumen tumoral (eje y, mm3) se midió con el tiempo (eje x, días) . Figura 3D : ratones NOD/SCID inyectados con células de tumor de pecho TI se trataron con anticuerpo de control (cuadros) , y anticuerpo 52R43 anti-Notchl (círculos cerrados) , taxol (triángulos) o 52R43 y taxol (círculos abiertos) y el volumen tumoral (eje y, mm3) se midió con el tiempo (eje x, días) .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona nuevos agentes, que incluyen, pero no se limitan a polipéptidos tales como anticuerpos, que se unen a uno o más receptores Notch humanos. Los agentes de unión a Notch incluyen antagonistas del receptor (s) Notch humano. Los polipéptidos y polinucleótidos relacionados, las composiciones que comprenden los agentes de unión a Notch, y los métodos para elaborar los agentes de unión a Notch también se proporcionan. Los métodos para utilizar los nuevos agentes de unión a Notch, tales como los métodos para inhibir el crecimiento tumoral y/o tratar cáncer, además se proporcionan .

La presente invención además identifica moléculas (por ejemplo, anticuerpos) que específicamente se unen a la región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular del receptor Notchl humano e inhiben el crecimiento del tumor in vivo. La región de unión del ligando de Notch, que es necesaria y suficiente para la unión del ligando, ha sido identificada como repeticiones EGF 11 y 12, lo que sugiere que esta región del receptor Notch es importante en la señalización de Notch y tumorigénesis (Rebay et al., 1991, Cell 67:687; Lei et al., 2003, Dev. 130-6411, Hambleton et al, 2004, Structure 12:2173). Inesperadamente, los anticuerpos que se unen fuera del dominio de unión del ligando del dominio extracelular. del receptor Notch humano se ha encontrado que inhiben el crecimiento de la célula tumoral in.. vivo (ver Publicación de Patente de E. U. A. No. 2008/0131434, incorporada aquí por referencia en la presente en su totalidad) . De esta forma, los anticuerpos que se unen fuera del dominio de unión del ligando del dominio extracelular de uno o más de los receptores Notch humanos, Notchl, Notch2, Notch3 , y Notch4 , tienen valor como terapéuticos cancerígenos potenciales.

Ahora se ha identificado los anticuerpos monoclonales que específicamente se unen a la región próxima de membrana del dominio extracelular de un Notchl, incluyendo el anticuerpo monoclonal 2M51, (Ejemplo 1) . También se han generado los anticuerpos 52M51 humanizados (Ejemplo 2). Varios de los anticuerpos, incluyendo 52M51, y una variante humanizada de 52M51, inhiben la señalización de Notchl inducida por el ligando (Ejemplo 3 y Figura IB y 1C) , a pesar de la unión de Notchl en una región exterior a la región de unión de ligando. La habilidad de varios de los anticuerpos para inhibir la formación del dominio intracelular Notch (ICD) también ha sido demostrada (Ejemplo3 y Figura ID) . Se ha encontrado que 52M51 inhibe el crecimiento de la célula tumoral in vivo en un modelo de xenotransplante (Ejemplo 5 y Figura 2A y 2B) . Además, otro anticuerpo 52R43 se ha encontrado que inhibe el crecimiento de la célula tumoral in vivo en múltiples modelos de xenotransplante (Ejemplo 7 y Figuras 3A-3D) .

Definiciones Un "antagonista" de un receptor Notch como se utiliza en la presente es un término que incluye cualquier molécula que parcialmente o completamente bloquea, inhibe o neutraliza una actividad biológica de la trayectoria de Notch. Las moléculas antagonistas adecuadas específicamente incluyen anticuerpos o antagonistas o fragmentos de anticuerpo. El término "antagonista" se utiliza en la presente para incluir cualquier molécula que parcial o completamente bloquea, inhibe, neutraliza la expresión de un receptor Notch.

El término "anticuerpo" se utiliza para significar una molécula de inmunoglobulina que reconoce y específicamente se une a un objetivo, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores, etc., a través de por lo menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se utiliza en la presente, el término abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpo (tales como, Fab, Fab ' , F(ab')2, y fragmentos Fv) , mutantes Fv (scFv) de cadena individual, anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecífieos generados de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos monovalentes o monoespecíficos , anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una porción de determinación de antígeno de un anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglob lina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno mientras los anticuerpos exhiban la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas : IgA, IgD, IgE, IgG, y Ig , o sus subclases (isotipos) (por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgAl y IgA2), con base en la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada referidos como alfa, delta, Épsilon, gama, y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen diferentes y bien conocidas estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados a otras moléculas tales como toxinas, radioisótopos, etc.

Como se utiliza en la presente, el término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena individual y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo .

Un "anticuerpo Fv" se refiere al fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un reconocimiento del antígeno completo ni el sitio de unión ya sea como dos cadenas, en donde un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera forman un dímero no covalente, o como una cadena individual (scFv) , en donde el dominio variable de la cadena pesada y la cadena ligera están covalentemente enlazadas a través de un enlazador de péptido flexible de tal forma que las dos cadenas se asocian en una estructura dimérica similar. En esta configuración las regiones determinantes de complementariedad (CDR) , de cada dominio variable interactúa para definir la especificidad de unión del antígeno del dímero Fv. Alternativamente, un dominio variable individual (o la mitad de un Fv) puede utilizarse para reconocer y unir el antígeno, aunque generalmente con una afinidad menor.

Un "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a una población de anticuerpos homogénea involucrada en un reconocimiento altamente específico y la unión de una determinante antigénica individual, o epítopo.

Esto es en contraste con los anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicas. El término "anticuerpo monoclonal" abarca ambos anticuerpos monoclonales intactos de longitud completa así como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, Fab ' , F(ab')2, Fv) , mutantes de cadena individual (scFv) , proteínas de fusión que comprenden una porción del anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno. Además, "anticuerpo monoclonal" se refiere a los anticuerpos elaborados en cualquiera de un número de formas que incluyen pero no se limitan a través de hibridoma, selección de fago, expresión recombinante y animales transgénicos .

Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a las formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) que son cadenas de inmunoglobulina específicas, inmunoglobulina quiméricas, o sus fragmentos que contienen secuencias no humanas mínimas. Típicamente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en donde los residuos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) está reemplazadas por residuos de una CDR de un especie no humana (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, etc.) que tienen la especificidad, afinidad y/o capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la región de estructura Fv (F ) de una inmunoglobulina humana se reemplazan como residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseada. El anticuerpo humanizado puede además modificarse a través de la sustitución de los residuos adicionales ya sea en la región de estructura Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos o tres, dominios variables que contienen todas, o sustancialmente todas, las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina humana mientras todas, o sustancialmente todas las regiones CDR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender por lo menos una porción de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Los ejemplos de métodos utilizados para generar anticuerpos humanizados se describen en la Patente de E . U. A. No. 5,225,539, incorporada aquí por referencia.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a una región variable de la cadena ligera del anticuerpo o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera cada una consiste de cuatro regiones de estructura (FR) conectadas a través de tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables . Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en cercana proximidad por las FR y, con las CDR de otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Existen por los menos dos técnicas para la determinación de las CDR: (1) un método basado en la variabilidad de secuencia especies cruzadas (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.); y (2) un método basado en estudios de cristalografía de complejos de antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948) . Además, las combinaciones de estos métodos algunas veces se utilizan en la técnica para determinar las CDR.

El término "anticuerpo humano" como se utiliza en la presente significa un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido correspondiente a un anticuerpo producido por un humano elaborado utilizando cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, sus fragmentos, y/o anticuerpos que comprenden por lo menos un polipéptido de cadena pesada y/o ligera humana, tal como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende polipéptidos de la cadena ligera de murino y la cadena pesada humana.

El término "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos en donde la secuencia de aminoácido de la molécula de inmunoglobulina se deriva de dos o más especies. Típicamente, la región variable de ambas cadenas ligera y pesada corresponde a la región variable de los anticuerpos derivados de una de las especies de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y/o capacidad deseada mientras las regiones constantes son homologas a las secuencias de los anticuerpos derivados de otras especies (usualmente humanas) para evitar provocar una respuesta inmunitaria en esas especies. El término anticuerpo quimérico incluye anticuerpos monovalentes, divalentes, y polivalentes.

El término "epítopo" o "determinante antigénica" se utilizan de manera intercambiable en la presente y se refieren a la porción de un antígeno capaz de ser reconocida y específicamente unirse a través de un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido, los epítopos pueden formarse tanto de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por un pliegue terciario de una proteína. Los epítopos formados de aminoácidos contiguos (también referidos como epítopos lineales) típicamente se retienen después de la desnaturalización de una proteína, mientras los epítopos formados por el pliegue terciario (también referido como epítopos de conformación) típicamente se pierden después de la desnaturalización de la proteína. Un epítopo típicamente incluye por lo menos 3, y más usualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una única conformación espacial.

Que un anticuerpo "selectivamente se una" o "específicamente se una" a un epítopo o receptor significa que el anticuerpo reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración, con mayor afinidad, o con alguna combinación del epítopo o receptor anterior que con sustancias alternativas, que incluyen proteínas no relacionadas. "Selectivamente se une" o "específicamente se une" significa, por ejemplo, que un anticuerpo se une a una proteína con un KD de aproximadamente 0.1 mM o menor, a veces aproximadamente 1 µ? o menor, algunas veces aproximadamente 0.1 µ? o menos y algunas veces 0.01 µ? o menos. Debido a la identidad de secuencia entre las proteínas homologas en diferentes especies, la unión específica puede incluir un anticuerpo que reconoce un receptor Notch en más de una especie. Se entiende que, en ciertas modalidades, un anticuerpo o una fracción de unión que específicamente se une a un primer objetivo pueden o no puede específicamente unirse a un segundo objetivo. Es decir, "unión específica" no necesariamente requiere (aunque puede incluir) la unión exclusiva, es decir, la unión a un solo objetivo. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a unión significa unión específica.

La competencia entre los anticuerpos se determina a través de un ensayo en donde la inmunoglobulina bajo el estudio inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común. Numerosos tipos de ensayos de unión competitivos son conocidos, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto de fase sólida (RIA) , inmunoensayo de enzima directo o indirecto de fase sólida (EIA) , ensayo de competencia de emparedado (ver Stahh et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (ver Kirkland et al., J Immunol 137:3614-3619 (1986)); ensayo marcado directo de fase sólida solida, ensayo de emparedado marcado directo de fase sólida (ver Harlow and Lañe, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA con marca directa de fase sólida utilizando la- etiqueta 125I (ver Morel et al., Molec. Immunol 25(1): 7-15 (1988)); EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); y RIA marcado directo (Moldenhauer et al., Scand. J Immunol 32:77-82 (1990)). Típicamente, tal ensayo involucra el uso de un antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que llevan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de ensayo no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide a través de la determinación de la cantidad de marcación unida a la superficie sólida o células en la presencia de la inmunoglobulina de prueba. Usualmente, la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Los anticuerpos identificados por ensayo de competencia (anticuerpos de competencia) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo como el anticuerpo de referencia y los anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que la barrera esférica ocurra. Usualmente, cuando un anticuerpo de competencia está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos 50 ó 75%.

Los términos "aislados" o "purificado" se refieren al material que es sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. Pureza y homogeneidad típicamente se determinan utilizando técnicas químicas analíticas tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto rendimiento. Una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) o ácido nucleico que es la especie predominante presente en una preparación es sustancialmente purificada. En particular, en algunas modalidades, un ácido nucleico aislado comprende un gen que se separa de los marcos de lectura abiertos que naturalmente flanquean el gen y codifican proteínas diferentes de la proteína codificada por el gen. Un anticuerpo aislado se separa de otras proteínas no inmunoglobulina y de otras proteínas de inmunoglobulina con diferentes especificidades de unión de antígeno. También pueden significar que el ácido nucleico y la proteína son al menos 85% puros, al menos 95% puros, y en algunas modalidades, al menos 99% puros.

Como se utiliza en la presente, los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos en donde una población de células se caracteriza por crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma , cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de la glándula salival, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cánceres de cabeza y cuello.

"Tumor" y "neoplasma" como se utiliza en la presente se refiere a cualquier masa de tejido que resulta de un crecimiento o proliferación celular excesiva, ya se benigno (no canceroso) o maligno (canceroso) que incluye lesiones pre-cancerígenas .

Los términos "trastorno proliferativo" y "enfermedad proliferativa" se refieren a trastornos asociados con la proliferación de célula anormal tal como el cáncer.

"Metástasis" como se utiliza en la presente se refiere al procedimiento a través del cual un cáncer se extiende o se transfiere desde el sitio de origen a otras regiones del cuerpo con el desarrollo de una lesión cancerígena similar en el nuevo lugar. Una célula "metastática" o "metastatizante" es una que pierde los contactos adhesivos con las células contiguas y migra hacia la corriente sanguínea o linfoides del sitio primario de la enfermedad para invadir las estructuras del cuerpo contiguas.

Los términos "célula madre cancerígena" o "célula madre de tumor" o "célula madre de tumor sólido" se utilizan de manera intercambiable en la presente y se refiere a una población de células de un tumor sólido que: (1) tiene una extensa capacidad proliferativa; (2) son capaces de la división celular asimétrica para generar una o más clases de progenie diferenciada con un potencial proliferativo o de desarrollo reducido; y (3) son capaces de divisiones celulares simétricas para la auto-renovación o auto-mantenimiento. Estas propiedades de las "células madre cancerígenas" o "células madre de tumor" o "células madre de tumor sólidas" confieren a las células madre cancerígenas la habilidad de formar tumores palpables después del trasplante serial en un ratón inmuno-comprometido comparado con la mayor parte de las células de tumor que fallan para formar tumores. Las células madre cancerígenas experimentan auto- renovación contra diferenciación en una manera caótica para formar tumores con tipos celulares anormales que pueden cambiar con el tiempo cuando ocurren las mutaciones.

Los términos "célula cancerígena" o "célula tumoral" se refieren a la población total de células derivadas de un tumor que incluyen ambas células no tumorigénicas , que comprenden el volumen de la población celular tumoral, y células madre tumorigénicas (células madre cancerígenas) .

Como se utiliza en la presente "tumorigénico" se refiere a los aspectos funcionales de una célula madre de tumor sólido que incluyen las propiedades de auto-renovación (dando origen a células madre cancerígenas tumorigénicas adicionales) y la proliferación para generar todas las otras células tumorales (dando origen a células de tumor diferenciadas y de esta forma no tumorigénicas) que permiten que las células madre, de tumor sólido formen un tumor.

Como se utiliza en la presente, la "tumorigenicidad" de un tumor se refiere a la habilidad de una muestra aleatoria de células del tumor para formar tumores palpables después del trasplante serial en ratones inmuno-comprómetidos . Como se utiliza en la presente, los términos "marcador de cáncer de célula madre" o marcador de célula madre de cáncer" o "marcador de célula madre de tumor" o "marcador de célula madre de tumor sólido" se refiere a un gen o genes o a una proteína, polipéptido o péptido expresado por el gen o genes o el del nivel de expresión, solo o en combinación con otros genes, está correlacionado con la presencia de células cancerígenas tumorigénicas comparado con células no tumorigénicas. La correlación puede referirse ya sea a un aumento o disminución de la expresión del gen (por ejemplo, niveles aumentados o disminuidos del AR m en el péptido codificado por el gen) .

Los términos "identificación del gen de la célula madre cancerígena" o "identificación del gen de la célula madre de tumor" o "identificación de la célula madre de cáncer" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a las identificaciones genéticas que comprenden genes diferencialmente expresados en células madre cancerígenas comparadas con otras células o poblaciones de células, por ejemplo, tejido epitelial de pecho normal. En algunas modalidades las identificaciones del gen de la célula madre cancerígena comprende genes diferencialmente expresados en células madre cancerígenas contra epitelio de pecho normal a través de un cambio de pliegue, por ejemplo reducido dos veces y/o la expresión elevada, y además limitado por el uso de un análisis estadístico tal como, por ejemplo, por el valor P de una prueba T a través de múltiples muestras. En otra modalidad, los genes diferencialmente expresados en células madre cancerígenas se dividen en identificaciones del gen de la célula madre cancerígena con base en la correlación de su expresión con un gen seleccionado en combinación con su pliegue de porcentaje de cambio de expresión. Las identificaciones de la célula madre cancerígena son pronosticables tanto retrospectivamente de un aspecto de variabilidad clínica, incluyendo pero no limitándose, a metástasis y muerte.

El término "prueba genética" como se utiliza en la presente se refiere a procedimientos a través de los cuales la formación genética de un paciente o una muestra de tumor de paciente se analiza. El análisis puede incluir la detección de ADN, ARN, cromosomas, proteínas o metabolitos para detectar genotipos o cariotipos relacionados con enfermedad hereditable o somática para propósitos clínicos.

Como se utiliza en la presente, los términos "biopsia" o "tejido de biopsia" se refieren a una muestra de tejido o fluido que se remueve en un sujeto con el propósito de determinar si la muestra contiene tejido cancerígeno. En algunas modalidades, el tejido de la biopsia o el fluido se obtienen debido a que se sospecha que el sujeto tiene cáncer. El tejido o fluido de la biopsia después se examina para la presencia o ausencia de cáncer.

Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero) , que incluye, pero no se limita a humanos, primates no humanos, roedores y similares, que van a ser el receptor de un tratamiento particular. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan de manera intercambiable en la presente con referencia a un sujeto humano.

"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a aprobado o que se puede aprobar a través de la agencia reguladora del gobierno federal o estatal o está enlistado en la farmacopea de U. S. u otra farmacopea generalmente reconocida para utilizarse en animales, incluyendo humanos.

"Excipiente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable" o "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente, portador o adyuvante que puede administrarse a un sujeto, junto con por lo menos un anticuerpo de la presente descripción, y que no destruye la actividad farmacológica del mismo y no es tóxico cuando se administra en dosis suficientes para suministrar una cantidad terapéutica del anticuerpo. Además, un "portador farmacéuticamente aceptable" no activa una respuesta inmunitaria en un sujeto receptor. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar tales como solución salina regulada en pH con fosfato, agua, y varias emulsiones de aceite/agua. Algunos diluyentes para administración por aerosol o parenteral son salina regulada en pH con fosfato o salina normal (0.9%) .

"Vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o portador con el cual un anticuerpo de la presente descripción se administra.

El término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" o "efecto terapéutico" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido, polinucleótido, molécula orgánica pequeña, u otro fármaco efectivo para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco tiene un efecto terapéutico y como tal puede reducir el número de células cancerígenas; disminuir la tumorigenicidad, la frecuencia tumorigénica, o la capacidad tumorigénica ; reducir el número o frecuencia de células madre cancerígenas; reducir el tamaño del tumor; inhibir o detener la infiltración celular cancerígena en los órganos periféricos incluyendo, por ejemplo, la dispersión del cáncer en tejidos blandos y huesos; inhibir y detener la metástasis de tumor; inhibir y detener el crecimiento tumoral; aliviar en algún grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer; reducir la morbidez y la mortalidad; mejorar la calidad de vida; o una combinación de estos efectos. Al grado en que el agente, por ejemplo un anticuerpo, evite el crecimiento y/o aniquila las células cancerígenas existentes, puede ser referido como citostático y/o citotóxico.

Los términos tales como "tratando" o "tratamiento" o "para tratar" o "alinear" . o "para aliviar" se refiere a ambos 1) mediciones terapéuticas que curan, desaceleran, disminuyen síntomas de, y/o obstruyen el avance de una afección patológica diagnosticada o trastorno, y 2) medición profiláctica o preventiva que evita, o desacelera el desarrollo de una afección o trastorno patológico activado. De esta forma, los que están en la necesidad de tratamiento incluyen los que ya tienen un trastorno; los que están propensos a tener un trastorno; y aquellos en donde el trastorno ha sido prevenido. Un sujeto es exitosamente "tratado" de acuerdo con los métodos de la presente invención si el paciente muestra uno o más de los siguientes: Una reducción en el número de o en la ausencia completa de células cancerígenas; una reducción en el tamaño del tumor; la inhibición de, o la ausencia de infiltración de célula cancerígena en los órganos periféricos incluyendo la dispersión del cáncer en el tejido blando y los huesos; la inhibición de o la ausencia de metástasis de tumor; la inhibición o la ausencia de crecimiento de tumor; alivio de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; morbidez y mortalidad reducida; mejora en la calidad de vida; reducción en la tumorigenicidad; reducción en el número o frecuencia de células madre cancerígenas; o alguna combinación de estos efectos.

Como se utiliza en la presente, los términos "polinucleótido" o "ácido nucleico" se refiere a un polímero compuesto de una multiplicidad de unidades de nucleótido (ribonucleótido o desoxiribonucleótido o variantes estructurales relacionadas) enlazadas a través de enlaces de fosfodiéster , incluyendo pero no limitándose a, ADN o ARN. El término abarca secuencias que incluyen cualquiera de estos análogos base de ADN y ARN.

El término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que comprende secuencias de codificación necesarias para la producción de un polipéptido, precursor, o ARN (por ejemplo, ARNr, ARNt) . El polipéptido puede codificarse a través de una secuencia de codificación de longitud completa o a través de cualquier porción de la secuencia de codificación mientras las actividades deseadas o las propiedades funcionales (por ejemplo, la actividad enzimática, la unión de ligando, la transducción de señal, la inmunogenicidad, etc.) del polipéptido o fragmento de longitud completa se retengan. El término también abarca la región de codificación de un gen estructural y la secuencia localizada adyacente en la región de codificación en ambos extremos 5' y 3' para una distancia de aproximadamente 1 kb o más en cualquier extremo de tal forma que el gen corresponde a la longitud del ARNm de longitud completa. El término "gen" abarca ambas formas de ADNc y genómica de un gen.

El término "recombinante" cuando se utiliza con referencia a una célula, ácido nucleico, proteína o vector indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector ha sido modificada para la introducción de un ácido nucleico heterólogo o proteína, la alteración de un ácido nucleico nativo o proteína, o que la célula se deriva de una célula así modificada. De esta forma, por ejemplo, los genes que expresan la célula recombinante que se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que se sobre-expresan o por el contrario se expresan anormalmente, tales, por ejemplo, expresados como fragmentos de existencia no natural o varían de empalme. Por el término "ácido nucleico recombinante" en la presente significa ácido nucleico, originalmente formado in Vitro, en general, a través de la manipulación del ácido nucleico, por ejemplo, utilizando polimerasas y endonucleasas , en una forma no normalmente encontrada en la naturaleza. En esta forma, el enlace operable de diferentes secuencias se logra. De esta forma un ácido nucleico aislado, y en una forma lineal, o un vector de expresión formado in vi tro a través de moléculas de ADN de ligación que no se une normalmente, ambos se consideran recombinantes para los propósitos de esta invención. Se entiende que una vez que se elabora el ácido nucleico recombinante y se introduce en una célula hospedera u organismo, replicará no recombinantemente , es decir, utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula hospedera en lugar de las manipulaciones in vi tro; sin embargo, tales ácidos nucleicos, una vez producidos recombinantemente aunque se repliquen posteriormente no recombinantemente, aún se consideran recombinantes para los propósitos de la invención. Similarmente , una "proteína recombinante" es una proteína elaborada utilizando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se describe anteriormente.

Como se utiliza en la presente, el término "vector" se utiliza con referencia a moléculas de ácido nucleico que transfieren el segmento (s) de ADN de .una célula a otra. Los vectores por lo general se derivan de plásmidos, bacteriófagos, o virus de plantas o animales.

Como se utiliza en la presente, el término "expresión genética" se refiere al procedimiento de convertir la información genética codificada en un gen en ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, AR t , o ARNsn) a través de la "transcripción" del gen (por ejemplo, a través de la acción enzimática de una polimerasa de AR ) , y para genes que codifican la proteína, en proteína a través de la "transferencia" del ARNm. La expresión del gen puede regularse en muchas etapas en el proceso. "Regulación ascendente" o "activación" se refiere a la regulación que aumenta la producción de los productos de la expresión del gen (por ejemplo, ARN o proteína) , mientras la "regulación descendente" o "represión" se refiere a la regulación que disminuye la producción. Las moléculas (por ejemplo, los factores de transcripción) que están involucrados en la regulación ascendente o la regulación descendente por lo general se denominan "activadores" y "represores" , respectivamente .

Los términos "polipéptido" o "péptido" o "proteína" o "fragmento de proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácido en donde uno o más residuos de aminoácido es un mimético químico artificial de un aminoácido de existencia natural correspondiente, así como polímeros de aminoácidos de existencia natural y polímeros de aminoácido de existencia no natural .

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de existencia natural y sintéticos, así como a análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan similarmente a los aminoácidos de existencia natural. Los aminoácidos de existencia natural son los que se codifican a través del código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo hidroxiprolina , gama-carboxiglutamato y 0—fosforoserina . "Análogos de aminoácido" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica como el aminoácido de existencia natural, por ejemplo, un alfa-carbono que se une a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R (por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Tales análogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) estructuras de péptido modificadas, pero retienen la misma estructura básica química como el aminoácido de estructura existencia natural. "Miméticos de aminoácido" se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona similarmente a un aminoácido de existencia natural.

"Variantes conservadoramente modificadas" se aplica tanto a secuencias de aminoácido como de ácido nucleico. "Variantes de aminoácido" se refiere a secuencias de aminoácido. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácido idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácido, a las secuencias esencialmente idénticas o asociadas (por ejemplo, naturalmente contiguas) . Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican la mayor parte de las proteínas. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican la alanina de aminoácido. De esta forma, en cada posición en donde una alanina es especificada por un codón, el codón puede alterarse a otro de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosa" , que son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifica un polipéptido también describe variaciones silenciosas del ácido nucleico. Se reconoce que en ciertos contextos cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, cuando es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, cuando es ordinariamente el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, las variaciones silenciosas de un ácido nucleico que codifican un polipéptido están implícitas en una secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a las secuencias de sonda actual .

Como las secuencias de aminoácido, se reconocerá que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteína que altera, agrega o elimina un aminoácido individual o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservadoramente modificada" que incluye en donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de las sustituciones conservadores proporcionan aminoácidos con una funcionalidad similar que son bien conocidos en la técnica. (Ver, por ejemplo, Tabla 1) . Las instrucciones concernientes a que cambios de aminoácido probablemente son fenotípicamente silenciosos también puede encontrarse en Bowie et al., 1990, Science 247:1306 1310. Tales variantes conservadoramente modificadas son además de y no excluyen las variantes polimórficas , homólogos inter-especies, y alelos de la invención. Las sustituciones conservadoras típicamente incluyen: 1) Alanina (A) , Glicina (G) ; 2) Acido aspártico (D) , Acido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) , 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptófano (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) ; y 8) Cisteína (C) , Metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)) . Como se indica, los cambios son típicamente de una naturaleza menor, tales como sustituciones de aminoácido conservadoras que no afecten significativamente el pliegue o la actividad de la proteína.

Tabla 1. Sustituciones de Aminoácido Conservadoras Aminoácido Original Sustituciones Conservadoras y Ilustrativas Alanina Valina, Isoleucina, Leucina, Glicina, Serina Arginina Lisina, Histidina, Glutamina, Asparagina Asparagina Glutamina, Histidina, Lisina, Arginina Acido aspártico Acido glutámico, Asparagina Cisteína Serina, Alanina, Metionina Glutamina Asparagina Acido glutámico Acido Aspártico, Glutamina Glicina Prolina, Alanina Histidina Asparagina, Glutamina, Lisina, Arginina Isoleucina Leucina, Valina, Metionina, Alanina, Fenilalanina, Norleucina Leucina Norleucina, Isoleucina, Valina, Metionina, Alanina, Fenilalanina Lisina Arginina, Glutamina, Asparagina, Aminoácido Original Sustituciones Conservadoras y Ilustrativas Histidina Metionina Leucina, Fenilalanina, Isoleucina, Valina, Cisteína Fenilalanina Leucina, Valina, Isoleucina, Alanina, Tirosina Prolina Alanina, Glicina Serina Treonina Treonina Serina Triptófano Tirosina, Fenilalanina Tirosina Triptófano, Fenilalanina, Treonina, Serina Valina Isoleucina, Metionina, Leucina, Fenilalanina, Alanina, Norleucina Como se utiliza en la presente descripción y las reivindicaciones, las formas singulares "uno", "una", y "el, la" incluyen formas plurales a menos que el contexto claramente indique lo contrario.

Se entiende que siempre que describan las modalidades en la presente con el lenguaje "que comprende" por el contrario modalidades análogas como se describe en términos de "consiste de" y/o "consiste esencialmente de" también se proporcionan.

Ciertas Modalidades de la Presente Invención La presente invención proporciona composiciones y métodos para estudiar, diagnosticar, caracterizar y tratar cáncer. En particular, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona agentes, que incluyen antagonistas, que se unen a receptores Notch y métodos para utilizar los agentes o antagonistas para inhibir el crecimiento tumoral y tratar cáncer u otras enfermedades en pacientes humanos. En ciertas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos que específicamente se unen a la región de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notch humano.

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que específicamente se une a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a una región del Notchl humano que comprende aproximadamente el aminoácido 1427 a aproximadamente el aminoácido 1732. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a una región que comprende SEC ID NO : 2. En ciertas modalidades, el anticuerpo que específicamente se une a la región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de por lo menos un receptor Notch adicional .

En algunas modalidades, el anticuerpo es un antagonista de Notchl humano. En ciertas modalidades, el anticuerpo inhibe la señalización inducida por el ligando de una trayectoria de Notchl. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe la actividad de Notchl. En otras modalidades el anticuerpo inhibe la separación de un receptor receptor Notchl. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe la separación de Notchl en un sitio dentro de la región próxima de la membrana del dominio extracelular . En ciertas modalidades, el anticuerpo inhibe la liberación o formación del dominio intracelular (ICD) de Notchl. En otras modalidades, reduce la tumorigenicidad de un tumor que comprende células madre cancerígenas. En ciertas modalidades, el anticuerpo inhibe el crecimiento de un tumor que comprende células madre cancerígenas. En ciertas modalidades, el anticuerpo inhibe el crecimiento de un tumor.

En ciertas modalidades, el anticuerpo que específicamente se une a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral es un anticuerpo monoclonal . En ciertas modalidades, el anticuerpo que específicamente se une a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano es un anticuerpo quimérico, es un anticuerpo humanizado, es un anticuerpo humano, es un fragmento de anticuerpo, o es un anticuerpo biespecífico . En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un hibridoma que produce un anticuerpo que específicamente se une a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral .

En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que específicamente se unen a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de una proteína del receptor Notchl humano. En algunas modalidades, el tumor comprende células madre cancerígenas. En algunas modalidades, los métodos comprenden activar las células madre cancerígenas con los anticuerpos. En ciertas modalidades, el método de inhibir el crecimiento de un tumor comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal. En ciertas modalidades, el método de inhibir el crecimiento de un tumor comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo quimérico. En ciertas modalidades, el método de inhibir el crecimiento de un tumor comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo humanizado. En ciertas modalidades, el método de inhibir el crecimiento de un tumor comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo humano.

En ciertas modalidades, el método de inhibir el crecimiento de un tumor comprende reducir la frecuencia de células madre cancerígenas en el tumor, reducir el número de células madre cancerígenas en el tumor, reducir la tumorigenicidad del tumor, y/o reducir la tumorigenicidad del tumor reduciendo el número o frecuencia de células madre cancerígenas en el tumor. En algunas modalidades, el método de inhibir el crecimiento de un tumor comprende inhibir la actividad de un receptor Notchl. En ciertas modalidades, el tumor incluye, pero no se limita a, tumor de pecho, tumor colorectal, tumor hepático, tumor renal, tumor de pulmón, tumor pancreático, tumor ovárico, tumor de próstata y tumor de cabeza y cuello.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer en un sujeto en la necesidad del mismo que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que específicamente se une a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de una proteína del receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral en el sujeto. En ciertas modalidades, el método para tratar cáncer comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal. En ciertas modalidades, el método para tratar cáncer comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo quimérico. En ciertas modalidades, el método para tratar cáncer comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo humanizado. En ciertas modalidades, el método para tratar cáncer comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo humano.

En ciertas modalidades, el método para tratar cáncer comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo conjugado con una fracción citotóxica que específicamente se une a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral . En ciertas modalidades, el método para tratar cáncer comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de cualquiera de los aspectos y/o modalidades, así como otros aspectos y/o modalidades descritas en la presente, en combinación por terapia por radiación. En ciertas modalidades, el método para tratar cáncer comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de cualquiera de los aspectos y/o modalidades, así como otros aspectos y/o modalidades descritas en la presente, en combinación con quimioterapia. En ciertas modalidades, el método para tratar cáncer comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que específicamente se une a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral que son de tumores que incluyen, pero no se limitan a, tumor de pecho, tumor colorectal, tumor de pulmón, tumor pancreático, tumor de próstata, o tumor de cabeza y cuello.

En ciertas modalidades, el método para tratar cáncer comprende identificar pacientes en la necesidad de tratamiento utilizando una prueba genética que comprende un anticuerpo que específicamente se une a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano, y administrando una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo a los pacientes. En ciertas modalidades, el método para tratar cáncer comprende identificar pacientes en la necesidad de tratamiento con un anticuerpo que específicamente se une a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano utilizando una prueba genética que detecta una identificación de la célula madre cancerígena, y administrando una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo que específicamente se une a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral .

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar una molécula que se une a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral, el método comprende: i) incubar la molécula con una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano; ii) determinar si la molécula se une a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano; y iii) determinar si la molécula inhibe el crecimiento tumoral. En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para identificar una molécula que se unen a una región próxima de membrana de unión no de ligando de un dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral, el método comprende: i) incubar la molécula con una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano que comprende SEC ID NO: 2; ii) determinar si la molécula se une a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano que comprende SEC ID NO : 2 ; y iii) determinar si la molécula inhibe el crecimiento tumoral.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que específicamente se unen a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para elaborar un anticuerpo que específicamente se unen a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo que específicamente se unen a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral.

En ciertas modalidades, los antagonistas contra un receptor Notch, tal como Notchl, actúan extracelularmente para actuar sobre o inhibir la función del receptor Notch. En ciertas modalidades, un antagonista de un receptor Notch es proteico. En algunas modalidades, antagonistas proteicos de un receptor Notchl son anticuerpos que específicamente se unen a un epítopo extracelular de un receptor Notchl. La unión extracelular de un antagonista contra un receptor Notchl puede inhibir la señalización de un receptor Notch mediante la inhibición de la activación intrínseca (por ejemplo, actividad de cinasa) de un receptor Notchl y/o inhibiendo estéricamente la interacción, por ejemplo, de un receptor Notch con uno de sus ligandos. Además, la unión extracelular de un antagonista a un receptor Notch puede regular de manera descendente la expresión de la superficie celular de un receptor Notch tal como, por ejemplo, a través de la internalización de un receptor Notch y/o disminuyendo el tráfico de la superficie celular de un receptor Notch. La unión extracelular de un antagonista a un receptor Notch puede inhibir la separación del receptor Notch y reducir la liberación del ICD del Notch.

En algunas modalidades, los antagonistas contra un receptor Notch se unen a un receptor Notch y tienen uno o más de los siguientes efectos: inhibir la proliferación de las células tumorales, activar la muerte celular directamente en células de tumor, o prevenir la metástasis de las células de tumor. En ciertas modalidades, los antagonistas de un receptor Notch activan la muerte celular a través de una toxina conjugada, agente quimioterapéutico, radioisótopo u otro agente. Por ejemplo, un anticuerpo contra un receptor Notch se conjuga a una toxina que se activa en células tumorales que expresan el receptor Notch a través de la internalización de la proteína. En otras modalidades, los antagonistas de un receptor Notch median la muerte celular de una célula que expresa el receptor Notch a través de una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . ADCC involucra la lisis celular mediante las células efectoras que reconocen la porción Fe de un anticuerpo. Muchos linfocitos, monocitos, macrófagos tisulares, granulocitos y eosinófilos, por ejemplo, tienen receptores Fe y pueden mediar la citólisis (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol . 12:1497) . En algunas modalidades, un antagonista de un receptor Notch es un anticuerpo que activa la muerte celular de la célula que expresa un receptor Notch mediante la activación de la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . CDC involucra la unión del complemento sérico a la porción FC de un anticuerpo y la posterior activación de la cascada de proteína de complemento, dando como resultado un daño en la membrana celular y eventualmente la muerte celular. La actividad biológica de los anticuerpos se sabe que se determina, en un grado, a través de los dominios constantes o la región Fe de la molécula del anticuerpo (Uananue and Benacerraf, Textbook of Immunology, 2a Edición, Williams & Wilkins, p. 218 (1984)). Los anticuerpos de diferentes clases y subclases difieren en este respecto, como lo hacen los anticuerpos de la misma subclase pero de diferentes especies. De los anticuerpos humanos, IgM es la clase más eficiente de anticuerpos para unirse al complemento, seguido por IgGl, IgG3 , y IgG2 en donde IgG4 parece bastante deficiente en la activación de la cascada de complemento (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol . 12: 1497; Jefferis et al., 1998, Immunol . Rev. 163:59-76) . De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos de las clases que tienen la actividad biológica deseada se prepararon.

La habilidad de cualquier anticuerpo particular contra un receptor Notch para mediar la lisis de la célula objetivo a través de la activación de complemento y/o ADCC puede ensayarse. Las células de interés se cultivan y marcan in vitro; el anticuerpo se agrega al cultivo celular en combinación con ya sea complementos séricos o células inmunitarias que pueden activarse a través de los complejos de anticuerpo a antígeno. La citólisis de las células objetivo se detecta, por ejemplo, a través de la liberación de la etiqueta de las células lisadas. De hecho, los anticuerpos pueden clasificarse utilizando el propio usuario del paciente como una fuente de células de complemento y/o inmunitaria. El anticuerpo que es capaz de activar el complemento o mediar ADCC en el ensayo in vitro después puede utilizarse terapéuticamente en ese paciente particular.

En ciertas modalidades, el agente de unión Notch o antagonista es un anticuerpo que no tiene una o más funciones efectoras . Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo tiene una actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) , y/o ninguna actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . En ciertas modalidades, el anticuerpo no se une al receptor Fe y/o los factores de complemento. En ciertas modalidades, el anticuerpo no tiene función efectora.

En otras modalidades, los antagonistas de un receptor Notch pueden activar la muerte celular indirectamente inhibiendo la angiogénesis . La angiogénesis es el procedimiento a través del cual se forman los nuevos vasos sanguíneos de vasos preexistentes y un procedimiento fundamental requerido para el crecimiento normal, por ejemplo, durante el desarrollo embrionario, sanación de heridas y en respuesta a ovulación. El crecimiento de tumor sólido mayor de 1-2 mm2 también requiere angiogénesis para suministrar nutrientes y oxígeno sin el cual las células tumorales mueren. De esta forma, en ciertas modalidades, un antagonista-receptor Notch activa las células vasculares que expresan el receptor Notch incluyendo, por ejemplo, células endoteliales , células de músculo liso o componentes de la matriz extracelular requeridos para el ensamble vascular. En otras modalidades, un antagonista de un receptor Notch inhibe la señalización del factor de crecimiento requerida para el reclutamiento de la célula vascular, el ensamble, mantenimiento o supervivencia.

La presente invención proporciona una variedad de polipéptidos , que incluyen pero no se limitan a anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. En ciertas modalidades, el polipéptido se aisla. En ciertas modalidades alternativas, el polipéptido es sustancialmente puro.

En ciertas modalidades, el polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recpmbinante , polipéptidos naturales, o polipéptidos sintéticos que comprenden las secuencias de SEC ID NO : 8, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 24, SEC ID NO : 28, o SEC ID NO: 32 (con o sin las secuencias de señal indicadas) .

La invención proporciona un polipéptido que comprende la cadena pesada y/o la cadena ligera provistas en SEC ID NO: 10 y/o SEC ID NO: 4, respectivamente (con o sin las secuencias de señal putativas indicadas) . En ciertas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidades, el polipéptido específicamente se une a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano.

La invención además proporciona un polipéptido que comprende SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 28 o SEC ID NO: 32, y/o SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 24. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de cadena ligera variable que comprende SEC ID NO: 8 y una secuencia de cadena pesada variable que comprende SEC ID NO: 14. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de cadena ligera variable que comprende SEC ID NO: 28 y una secuencia de cadena pesada variable que comprende SEC ID NO: 24. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de cadena ligera variable que comprende SEC ID NO: 32 y una secuencia de cadena pesada variable que comprende SEC ID NO: 24. En ciertas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidades, el polipéptido específicamente se une a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano.

Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácido de la invención pueden variar sin ningún efecto significativo sobre la estructura o función de la proteína. Sin tales diferencias en las secuencias se contemplan, se deberá recordar que habrá áreas críticas sobre las proteínas que determinan la actividad. De esta forma, la invención además incluye variaciones de los polipéptidos que muestran actividad sustancial. Tales imitantes incluyen eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones, y tipo de sustituciones. Las instrucciones concernientes a los cambios de aminoácido son probablemente fenotípicamente silenciosas que pueden encontrarse en Bowie, J.U., et al, "Deciphering the Message in Protein Sequences : Tolerance to Sustitutions of amino acids" , Science 7990, 247- 1306-1310.

De esta forma, los fragmentos, derivados o análogos de los polipéptidos de la invención pueden ser: (i) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácido están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (por lo general residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no puede codificarse por el código genético; o (ii) uno en el cual uno o más residuos de aminoácidos incluyen grupo sustituyente ; o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol ) , o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales se fusionan al polipéptido maduro, tal como la secuencia líder o secretora o una secuencia que se utiliza para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de pro-proteína. Tales fragmentos, derivados y análogos se considera que están dentro del alcance de las enseñanzas de la presente.

De particular interés son las sustituciones de aminoácidos cargados con otro aminoácido cargado y con aminoácidos neutrales o negativamente cargados. Lo anterior da como resultado proteínas con una carga positiva reducida. La prevención de la agregación es altamente deseada. La agregación de las proteínas no solamente da como resultado una pérdida de la actividad sino también puede ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas, porque pueden ser inmunogénicas (Pinckard et al., Clin. Ex . Immunol . 1967, 2:331-340, Robbins et al., Diabetes 1987, 36.838-845; Cleland et al. Crit . Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 1993, 10:307-377).

Por supuesto, el número de sustituciones de aminoácido puede depender de muchos factores, que incluyen los descritos en la presente. En ciertas modalidades, el número de sustituciones para cualquier polipéptido dado no será mayor de 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 ó 3.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen los polipéptidos de SEC ID NO: 14 así como los polipéptidos que tienen por lo menos 90% de similitud (en ciertos momentos al menos 90% de identidad de secuencia) con los polipéptidos de SEC ID NO: 14 y por lo menos 95% de similitud (en ciertos momentos por lo menos 95% de identidad de secuencia) con los polipéptidos de SEC ID NO: 14, y aún otras modalidades, el polipéptido que tiene al menos 96%, 97%, 98%, o 99% de similitud (en ciertos momentos 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia) con los polipéptidos de SEC ID NO: 14. Los polipéptidos de la presente invención incluyen los polipéptidos de SEC ID NO: 8 así como los polipéptidos que tienen por lo menos 90% de similitud (en ciertos momentos al menos 90% de identidad de secuencia) con los polipéptidos de SEC ID NO: 8 y por lo menos 95% de similitud (en ciertos momentos al menos 95% de identidad de secuencia) con los polipéptido de SEC ID NOs : 8, y aún en otras modalidades, polipéptidos que tienen al menos 96%, 97%, 98%, o 99% de similitud (en ciertos momentos 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia) con los polipéptidos de SEC ID NO : 8. Como se conoce en la técnica "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácido y sus sustitutos de aminoácido conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido.

Los fragmentos o porciones de polipéptidos de la presente invención pueden utilizarse para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente a través de síntesis peptídica; por consiguiente, los fragmentos pueden emplearse como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden utilizarse para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención.

En ciertas modalidades, un fragmento de las proteínas de esta invención es una porción o toda la proteína que es capaz de unirse a la proteína del receptor Notchl . El fragmento tiene una alta afinidad para un receptor Notchl. Ciertos fragmentos de proteína que comprenden por lo menos parte del dominio de unión Notch del agente del polipéptido o antagonista fusionado a por lo menos parte de una región constante de una inmunoglobulina. La afinidad está típicamente en el intervalo de 10"11 a 10"12 M, aunque la afinidad puede variar considerablemente con fragmentos de diferentes tamaños, en el intervalo de 10"7 a 10"13 M. En algunas modalidades, el fragmento es de aproximadamente 10-110 aminoácidos en longitud y comprende el dominio de unión Notch del agente o antagonista polipéptido enlazado a por lo menos parte de una región constante de una inmunoglobulina.

Los polipéptidos de análogos además pueden modificarse para contener fracciones químicas adicionales no normalmente parte de la proteína. Las fracciones derivatizadas pueden mejorar la solubilidad, la vida media biológica y/o la absorción de la proteína. Las fracciones también pueden reducir o eliminar cualquier efecto secundario indeseable de la proteína y similar. Una visión general de las fracciones químicas puede encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a ed. , Mack Publishing Co., Easton, PA (2000) .

Los polipéptidos aislados descritos en la presente pueden producirse a través de cualquier método adecuado conocido en la técnica. Tales métodos están en el intervalo de métodos sintéticos de proteína directos para constituir una secuencia de ADN que codifica secuencias de polipéptido aisladas y expresan esas secuencias en un hospedero transformado adecuado.

En algunas modalidades de un método recombinante , una secuencia de ADN se construye aislando o sintetizando la secuencia de ADN que codifica una proteína de tipo silvestre de interés. Opcionalmente , la secuencia puede mutagenizarse mediante mutagénesis específica del sitio para proporcionar sus análogos funcionales. Ver, por ejemplo, Zoeller et al., Proc. Nat Acad Sci USA 1984, 81:5662-5066 y Patente de E. U. A. No. 4,588,585. Otro método para construir una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés podría ser a través de síntesis química utilizando un sintetizador de oligonucleótido. Tales oligonucleótidos pueden designarse con base en la secuencia de aminoácido del polipéptido deseado y seleccionar los codones que son favorecidos en la célula hospedera en donde el polipéptido recombinante de interés será producido.

Los métodos estándar pueden aplicarse para sintetizar una secuencia de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, una secuencia de aminoácido completa puede utilizarse para construir un gen retro-transferido . Además, un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido aislado de interés puede sintetizarse. Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado pueden sintetizarse y después ligarse. Los oligonucleótidos individuales típicamente contienen salientes 5' o 3' para el ensamble complementario .

Una vez ensamblado (a través de síntesis, mutagénesis dirigida al sitio, u otro método) , las secuencias de ADN imitantes que codifican un polipéptido aislado particular de interés se insertarán en un vector de expresión y se enlazarán operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada para la expresión de la proteína en un hospedero deseado. El pobre ensamble puede confirmarse a través de la secuenciación del nucleótido, mapeo de restricción y la expresión de un polipéptido biológicamente activo en un hospedero adecuado. Como es bien conocido en la técnica, con el fin de obtener altos niveles de expresión de un gen transíectado en un hospedero, el gen está operativamente enlazado a las secuencias de control de expresión de transcripción y transferencia que son funcionales en el hospedero de expresión seleccionado.

La presente invención proporciona anticuerpos aislados contra una región próxima de la membrana de unión no de ligando de dominio extracelular de un receptor Notchl . El anticuerpo, o el fragmento de anticuerpo, puede ser cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal que específicamente reconoce una región próxima de membrana del domino extracelular de Notchl. En algunas modalidades, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales , o sus fragmentos que específicamente se unen a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un Notchl humano como se describe en la presente. En algunas modalidades, los anticuerpos monoclonales, o sus fragmentos, son anticuerpos quiméricos o humanizados que específicamente se unen a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano como se describe en la presente. En otras modalidades, los anticuerpos monoclonales, o sus fragmentos, son anticuerpos humanos que se unen específicamente a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano como se describe en la presente.

Los anticuerpos contra una región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl encuentran uso en métodos experimentales, de diagnóstico y terapéuticos descritos en la presente. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención se utilizan para detectar la expresión de un receptor Notchl en muestras biológicas tales como, por ejemplo, una biopsia tisular del paciente, efusión pleural, o muestras sanguíneas. Las biopsias de tejido pueden seccionarse y la proteína detectarse utilizando, por ejemplo, inmunofluorescencia o inmunohistoquímica . Alternativamente, las células individuales de una muestra se aislan, y la expresión de la proteína se detecta sobre células fijas o vivas a través de análisis FACS . Además, los anticuerpos pueden utilizarse sobre arreglos de proteína para detectar la expresión de un receptor Notchl, por ejemplo, sobre células de tumor, en lisatos celulares, o en otras muestras de proteína. En otras modalidades, los anticuerpos de la presente invención se utilizan para inhibir el crecimiento de células tumorales a través del contacto de los anticuerpos con las células tumorales ya sea en ensayos basados en células in vi tro o modelos de animal in vivo. En aún otras modalidades, los anticuerpos se utilizan para tratar cáncer en un paciente humano mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo contra una una región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl .

Los anticuerpos policlonales pueden prepararse a través de cualquier método conocido. Los anticuerpos policlonales se elevan mediante la inmunización de un animal (por ejemplo, un conejo, rata, ratón, cabra, burro, etc.) a través de múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del antígeno relevante (un fragmento de péptido purificado, proteína recombinante de longitud completa, proteína de fusión, etc.) ópticamente conjugada con hemocianina de lapa (KLH) , albúmina de suero, etc., diluido en salina estéril y combinado con un adyuvante (por ejemplo, Adyuvante de Freund Completo o Incompleto) para formar una emulsión estable. El anticuerpo policlonal después se recupera de la sangre, ascitos y similares, de un animal así inmunizado. La sangre colectada se coagula, y el suero se decanta, se clarifica a través de centrifugación y se ensaya para concentración de anticuerpo. Los anticuerpos policlonales pueden purificarse de suero o ascitos de acuerdo con métodos estándar en la técnica incluyendo cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio de ión, electroforesis en gel, diálisis, etc.

Los anticuerpos monoclonales pueden preparase utilizando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497. Utilizando el método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal hospedero apropiado, se inmuniza como se describe anteriormente para provocar la producción de anticuerpos a través de linfocitos que específicamente se unirán a un antígeno inmunizador. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aislan y fusionan como una línea celular de mieloma adecuada utilizando, por ejemplo, polietilenglicol , para formar células de hibridoma que después pueden seleccionarse a parte de los linfocitos no fusionados y células de mieloma. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra un antígeno seleccionado como se determinan por inmunoprecipitación, inmunotinción, o a través de un ensayo de unión in vitro tal como radioinmunoensayos (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) después pueden propagarse ya sea en cultivo in vitro utilizando métodos estándar (Goding, onoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, 1986) o in vivo como tumores de ascitos en un animal. Los anticuerpos monoclonales después pueden purificarse del medio de cultivo o el fluido de ascitos como se describe para anticuerpos policlonales anteriormente.

En algunas modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo que específicamente se unen a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 14; y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 8. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 14, y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 8. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo.

En ciertas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que se une a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un Notchl humano y comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende RGY IE (SEC ID NO: 15), una CDR2 de cadena pesada que comprende QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID NO : 16), y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende FDGNYGYYAMDY (SEC ID NO: 17) . En algunas modalidades, el anticuerpo además comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID NO: 18) , una CDR2 de cadena ligera que comprende GTNNRAP (SEC ID NO: 19), y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende ALWYSNH VFGGGTKL (SEC ID NO: 20) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una CDRl de cadena pesada que comprende RGYWIE (SEC ID NO: 15) , una CDR2 de cadena pesada que comprende QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID NO: 16), y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende FDGNYGYYAMDY (SEC ID NO: 17) ; y una CDRl de cadena ligera que comprende RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID NO: 18) , una CDR2 de cadena ligera que comprende GTNNRAP (SEC ID NO: 19), y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID NO : 20) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende RGYWIE (SEC ID NO: 15), o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID NO: 16), o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; y/o (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende FDGNYGYYAMDY (SEC ID NO: 17) , o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido. En otras modalidades, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende (a) una CDRl de cadena ligera que comprende RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID NO: 18), o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido, (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende GTNNRAP (SEC ID NO: 19), o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; y/o (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID NO: 20), o una de sus variantes que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácido son sustituciones de aminoácido conservadoras .

En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo, 52 51, producido a través de la línea celular de hibridoma depositada con el ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 7 de agosto del 2008 y con el número asignado PTA-9405. En algunas modalidades, el anticuerpo es una versión humanizada de 52M51. En algunas modalidades, el anticuerpo es una versión humanizada de 52M51, "52M51 H4L3", según codificado por el ADN depositada con el ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 15 de octubre del 2008 y con el número asignado PTA-9549. En algunas modalidades, el anticuerpo es una versión humanizada de 52M51, "52M51 H4L4" . En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mimo epítopo que el epítopo al cual se une el anticuerpo 52M51. En otras modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos descritos en las modalidades anteriores y/o aspectos, así como otros aspectos/modalidades descritas en cualquier lugar en la presente, para la unión específica a una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y los métodos para tratar cáncer que comprende administrar cantidades terapéuticamente efectivas de los anticuerpos también se proporcionan.

En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo, 52R43, según codificado por el ADN depositada con el ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 15 de octubre del 2008 y con el número asignado PTA-9548. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mimo epítopo que el epítopo al cual se une el anticuerpo 52R43. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis de las CDR de 52R43. En otras modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que compite con 52R43. Las composiciones farmacéuticas que comprende los anticuerpos y los métodos para tratar cáncer que comprende administrar cantidades terapéuticamente efectivas de los anticuerpos también se proporcionan.

Alternativamente los anticuerpos monoclonales también elaborarse utilizando métodos de ADN recombinantes como se describe en la Patente de E. U. A. No. 4,816,567. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aislan de células B maduras o células de hibridoma, tales como a través de RT-PCR utilizando iniciadores de oligonucleótido que específicamente amplifican los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, y sus secuencias se determinan utilizando procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican las cadenas pesada y ligera después se clonan en vectores de expresión adecuados y después se transfectan en células hospederas tales como células E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células de mieloma que por el contrario no producen la proteína inmunoglobulina. Las células hospederas se clasifican para la producción del anticuerpo monoclonal y los anticuerpos con la especificidad deseada se seleccionan. También, los anticuerpos monoclonales recombinantes o sus fragmentos de las especies deseadas pueden aislarse de colecciones de despliegue de fago como se describe (McCafferty et al., 1990, Nature, 348.552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628, and Marks et al., 1991, J. Mol Biol, 222:581-597).

El polinucleótido (s) que codifica un anticuerpo monoclonal puede además modificarse en un números de diferentes maneras utilizando tecnología de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunas modalidades, los dominios constantes de la cadena ligera y pesada de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón puede sustituirse, 1) por esas regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico o 2) para polipéptidos no de inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En otras modalidades, las regiones constantes se truncan o se eliminan para generar el fragmento de anticuerpo deseado del anticuerpo monoclonal . Además, la mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable puede utilizarse para optimizar la especificidad, afinidad, etc., de un anticuerpo monoclonal.

Más generalmente, los anticuerpos modificados útiles en la presente invención pueden obtenerse o derivarse de cualquier anticuerpo. Además, el anticuerpo progenitor o precursor, o uno de sus fragmentos, utilizada para generar los anticuerpos modificados descritos pueden ser de murino, humanos, quiméricos, humanizados, de primate no humano o privatizado. En otras modalidades los anticuerpos modificados de la presente invención pueden comprender constructos de anticuerpo de cadena individual (tales como los descritos en la Patente de E. U. A. No. 5,892,019, que se incorpora aquí por referencia) que tienen dominios constantes alterados como se describe en la presente. En consecuencia, cualquiera de estos tipos de anticuerpos modificados de acuerdo con las enseñanzas de la presente son compatibles con esta invención.

De acuerdo con la presente invención, las técnicas pueden adaptarse para la producción de anticuerpos de cadena individual específicos para un polipéptido de la invención (ver, Patente de E. U. A. No. 4,946,778) . Además, los métodos pueden adaptarse para la construcción de colecciones de expresión Fab (Huse, et al., 1989, Science, 246: 1275-1281) para permitir la rápida y efectiva identificación de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para Notch o derivados, fragmentos, análogos o sus homólogos. Los fragmentos de anticuerpo que contienen los idiotipos para un polipéptido de la invención pueden producirse a través de técnicas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a: (a) un fragmento F(ab')2 producido por la digestión de pepsina de una molécula de anticuerpo; (b) un fragmento Fab generado por la reducción de fuentes de disulfuro de un fragmento F(ab')2; (c) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula del anticuerpo con papaína y un agente reductor; y (d) fragmentos Fv.

Los anticuerpos biespecífieos también están dentro del alcance de la invención. Los anticuerpos biespecífieos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes.

Los métodos para elaborar anticuerpos biespecífieos se conocen en la técnica. Por ejemplo, en el caso presente, una de las especificidades de unión es para un polipéptido antigénico de la invención (Notchl o uno de sus fragmentos) , mientras el segundo objetivo de unión es cualquier otro antígeno, y ventajosamente es una proteína de superficie celular, o receptor o subunidad del receptor. La producción recombinante de anticuerpos biespecífieos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesa/cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein and Cuello, Nature 1983, 305:537-539). Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta usualmente se logra a través de cromatografía por afinidad.

Los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas pueden fusionarse a secuencias del dominio de inmunoglobulina. La fusión es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la conexión, las regiones CH2 y CH3. La primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera puede estar presente en por lo menos uno de las fusiones. El ADN que codifica las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina, y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo severo adecuado. Los detalles adicionales para generar anticuerpos biespecífieos pueden encontrarse en Suresh et al., Methods in Enzymology 1986, 121:210.

Los anticuerpos biespecífieos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo. Las técnicas para generar anticuerpos biespecífieos y los fragmentos de anticuerpo han sido descritas en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecífieos pueden prepararse utilizando el enlace químico. Además, Brennan et al., Science 1985, 229:81 describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se separan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2.

Adicionalmente, los fragmentos Fab ' pueden directamente recuperarse de E. coli y químicamente acoplarse para formar anticuerpos biespecífieos (Shalaby et al, J. Exp . Med. 1992, 175:217-225). Estos métodos pueden utilizarse en la producción de una molécula de anticuerpo F(ab' )2 biespecífica completamente humanizada.

Los anticuerpos con más de dos valencias también se contemplan. Por ejemplo, los anticuerpos triespecíficos pueden prepararse (Tutt et al., 1991, J. Immunol . 147:60) .

Esta invención también abarca anticuerpos biespecífieos que específicamente reconocen la región próxima de membrana de un dominio extracelular de receptor Notchl. Los anticuerpos biespecífieos son anticuerpos que son capaces de específicamente reconocer y unirse a por los menos dos epítopos diferentes. Los diferentes epítopos pueden ser cualquiera que esté dentro de la misma molécula (por ejemplo, el mismo Notchl) , o moléculas diferentes tales como ambas, por ejemplo, los anticuerpos pueden específicamente reconocer y unirse al receptor Notchl, así como, por ejemplo, 1) una molécula efectora en un leucocito tal como el receptor de la célula T (por ejemplo, CD3) o un receptor Fe (por ejemplo, CD64, CD32, o CD 16) o 2) un agente citotóxico como se describe con detalle a continuación. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpo. Las técnicas para elaborar anticuerpos biespecíficos son comunes en la técnica (Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539; Brennan et al, 1985, Science, 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol, 121 : 120; Traunecker et al., 1991, EMBO J, 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. , 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 148.1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol . , 152:5368; y Patente de E. U. A. No. 5,731,168).

Los anticuerpos biespecíficos ilustrativos pueden unirse a dos diferentes epítopos, por lo menos uno de los cuales se origina en un polipéptido de la invención. Alternativamente, un brazo anti -antigénico de una molécula de inmunoglobulina puede combinarse con un brazo que se une a una molécula activada en un leucocito tal como la molécula receptora de la célula T (por ejemplo, CD2 , CD3 , CD28, o B7) , o receptores Fe para IgG para así enfocar los mecanismo de defensa celular para la expresión de la célula del antígeno particular. Los anticuerpos biespecíf icos también pueden utilizarse para dirigir a los agentes citotóxicos hacia las células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a antígeno y un brazo que se une a un agente citotóxico o un quelatador de radionúclidos, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA.

Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heterocon ugados están compuestos de dos anticuerpos covalentemente unidos. Tales anticuerpos, por ejemplo, han sido propuestos para activar células inmunitarias en células indeseadas (Patente de E. U. A. No. 4,676,980). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en la química proteica sintética, incluyendo los que involucran agentes de entrelazamiento. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o a través de la formación de un enlace de tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4 -mercaptobutirimidato .

Para los propósitos de la presente invención, se deberá apreciar que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de región variable que proporciona la asociación del anticuerpo con una región próxima de la membrana del dominio extracelular del receptor Notchl. A este respecto, la región variable puede comprender o puede derivarse de cualquier tipo de mamífero que puede inducir la cantidad de una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas contra el antígeno asociado con el tumor deseado. Es decir, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de humano, murino, primate no humano (por ejemplo, monos cynomolgus, macacos, etc.) o de origen lupino. En algunas modalidades ambas regiones variable y constante de las inmunoglobulinas modificadas con humanas. En otras modalidades las regiones variables de los anticuerpos compatibles (usualmente derivados de una fuente no humana) pueden modificarse o especialmente elaborarse para mejorar las propiedades de unión o reducir la inmunogenicidad de la molécula. A este respecto, las regiones variables útiles en la presente invención pueden humanizarse o por el contrario alterarse a través de la inclusión de secuencias de aminoácido importadas.

En algunas modalidades, de la presente invención el anticuerpo monoclonal contra una región próxima del dominio extracelular del receptor Notchl es un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos que contienen secuencias mínimas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) dentro de las regiones variables. Tales anticuerpos se usan terapéuticamente para reducir la antigenicidad y las respuestas HAMA (anticuerpo anti-ratón humano) cuando se administra a un sujeto humano. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos con un mínimo, a secuencias no humanas. Un anticuerpo humano es un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido correspondiente a un anticuerpos producido por un humano.

Los anticuerpos humanizados pueden producirse utilizando varias técnicas conocidas en la técnica. Un anticuerpo puede ser humanizado sustituyendo la COR de un anticuerpo humano con la de un anticuerpo no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, etc.) que tienen la especificidad, afinidad y/o capacidad deseada (Jones et al., 1986, Nature, 321 :522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536). El anticuerpo humanizado además puede modificarse a través de la sustitución del residuo adicional ya sea en la región de estructura Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad, afinidad, y/o capacidad del anticuerpo.

En algunas modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado que específicamente se une a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 24; y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 28 o SEC ID NO: 32. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 24, y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 28 o SEC ID NO: 32.

En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada de SEC ID NO 24, y una región variable de cadena ligera de SEC ID NO: 28. En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada de SEC ID NO: 24, y una región variable de cadena ligera de SEC ID NO: 32.

Los anticuerpos humanos pueden directamente prepararse utilizando varias técnicas conocidas en la técnica. Los linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislado de un individuo humanizado que produce un anticuerpos dirigido contra un antígeno objetivo pueden generarse (ver, por ejemplo, Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ; Boemer et al., 1991, J. Immunol . , 147 (1) 86-95; y Patente de E. U. A. No. 5,750,373). También, el anticuerpo humano puede seleccionarse de una colección de fago, en donde la colección de fago expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al.,' 1996, Nature Biotechnology, 14.309-314; Sheets et al, 1998, PNAS, 95.6157-6162; Hoogenboom and inter, 1991, J. Mol. Biol . , 227:381; Marks et al . , 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Los anticuerpos humanizados también elaborarse a través de ratones transgénicos que contienen un sitio de inmunoglobulina humano que es capaz, después de la inmunización, de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación de los homocigotos del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de la línea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción de anticuerpo endógeno. La transparencia del arreglo del gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos después del. refuerzo del antígeno (ver, por ejemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 90:2551; Jakobovits et al., 1993, Nature, 362 255-258; Bruggemann et al., 1993, Year in Immuno 7:33; Patentes de E. U. A. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425, y 5,661, 016.

Alternativamente, la tecnología de despliegue de fago puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, de reportorios genéticos del dominio variable de inmunoglobulina (V) para donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en el marco, en cualquiera de un gen proteico de cubierta principal o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y desplegado como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de estructura de cadena individual del genoma del fago, las selecciones se basan en l¾s propiedades funcionales del anticuerpo que también resultan en la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. De esta forma, el fago imita alguna de las propiedades de la célula B. El despliegue de fago puede llevarse a cabo en una variedad de formatos. Se pueden utilizar varias fuentes de segmentos del gen V para el despliegue de fago. Un arreglo diverso de anticuerpos anti-oxazolona ha sido aislado de una colección de combinación aleatoria pequeña de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados puede construirse y los anticuerpos para un arreglo diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) pueden aislarse.

Como se explicó anteriormente, los anticuerpos humanos también generarse a través de células B activadas in vitro (ver, Patentes de E. U. A. Nos. 5,567,610 y 5,229,275).

Se apreciará que el injerto de dominios variables no humanos en regiones constantes humanas producirá anticuerpos quiméricos "clásicos" . En contexto de la presente solicitud el término "anticuerpos quiméricos" se mantendrá para significar cualquier anticuerpo en donde la región inmuno-reactiva o sitio se obtiene o se deriva de una primera especie y la región constante (que puede ser intacta, parcial o modificada de acuerdo con esta invención) se obtiene de una segunda especie. En algunas modalidades, la región de unión del antígeno o el sitio se formará de una fuente no humana (por ejemplo, ratón) y la región constante es humana. Aunque la especificidad inmunogénica de la región variable no se afecta generalmente por su fuente, una región constante humana es menos probable provoca una respuesta inmunitaria de un sujeto humano que sería la región constante de una fuente no humana .

Los dominios variables en ambas cadenas pesada y ligera se alteran a través del reemplazo al menos parcial de una o más CDR, y si es necesario, por el reemplazo de la región de estructura parcial y el cambio de secuencia. Aunque las CDR pueden derivarse de un anticuerpo de la misma clase o aún subclase como el anticuerpo del cual las regiones de estructura se derivan, se visualiza que las CDR se derivarán de un anticuerpo de diferente clase preferiblemente de un anticuerpo de una especie diferente. Se debe enfatizar que puede no ser necesario reemplazar todas las CDR con las CDR completas de la región variable del donador para transferir la capacidad de unión al antígeno de un dominio variable a otro. Más bien, puede ser solamente necesario transferir esos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión a antígeno. Dada las explicaciones establecidas en las Patentes de E. U. A. Nos. 5,585,089, 5,693,761 y 5,693,762, estará bien dentro de la técnica, ya sea llevando a cabo experimentación de rutina, o pruebas de ensayo de error obteniendo un anticuerpo funcional con inmunogenicidad reducida.

A pesar de las alteraciones en la región variable, se apreciará que los anticuerpos modificados de esta invención comprenderán anticuerpos, o sus fragmentos inmuno-reactivos, en donde por lo menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante ha sido eliminada o por el contrario alterada para así proporcionar las características bioquímicas deseadas tales como una localización de tumor incrementada o una vida media en suero reducida cuando se compara con un anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una región constante nativa o no alterada. En algunas modalidades, la región constante de los anticuerpos modificados comprenderá una región constante humana. Las modificaciones de la región constante compatibles con la invención comprenden adiciones, eliminaciones y sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Es decir, los anticuerpos modificados descritos en la presente pueden comprender alteraciones o modificaciones a uno o más de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o el dominio constante de cadena ligera (CL) . En algunas modalidades de la invención, las regiones constantes modificadas en donde uno o más dominios están parcial o completamente eliminados se contemplan. En otras modalidades, los anticuerpos modificados comprenderán los constructos eliminados del dominio o las variantes en donde el dominio CH2 completo ha sido eliminado (constructos ACH2) . En aún otras modalidades el dominio de la región constante omitido será reemplazado por un separador de aminoácido corto (por ejemplo, 10 residuos) que proporciona algo de la flexibilidad molecular típicamente impartida por la región constante ausente .

Aparte de su configuración, se conoce en la técnica que la región constante media varias funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente Cl del complemento a los anticuerpos activa el sistema de complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y la lisis de los patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede involucrarse en la hipersensibilidad auto- inmunitaria .

Además, los anticuerpos que se unen a las células a través de la región Fe, con un sitio del receptor Fe en la región Fe del anticuerpo que se une al receptor Fe (FcR) en una célula. Existe un número de receptores Fe que son específicos para diferentes clases de anticuerpo, incluyendo IgG (receptores gama) , IgE (receptores épsilon) , IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu) . La unión del anticuerpo a los receptores Fe en la superficie celular activan un número de importantes y diversas respuestas biológicas que incluyen el hundimiento, y la destrucción de las partículas que recubren el anticuerpo, la depuración de los complejos inmunitarios , la lisis de las células objetivo recubiertas con anticuerpo a través de células aniquiladoras (denominada citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo, o ADCC) , liberación de los mediadores inflamatorios, transferencia de placenta y control de producción de inmunoglobulina . Aunque varios receptores Fe y sitios del receptor han sido estudiados a un cierto grado, aún existe mucho que es desconocido acerca de su ubicación, estructura y funcionamiento.

Aunque no se limita el alcance de la presente invención, se cree que los anticuerpos que comprenden regiones constantes modificadas como se describe en la presente proporcionan funciones efectoras alteradas las cuales, a su vez, afectan el perfil biológico del anticuerpo administrado. Por ejemplo, la eliminación o inactivación (a través de mutaciones de punto u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión del receptor Fe del anticuerpo modificado en circulación por lo tanto aumentando la localización del tumor. En otros casos puede ser que las modificaciones de la región constante, consistentes con esta invención, modulan la unión del complemento de esta forma reducen la vida media en suero y la asociación no específica de una citotoxina conjugada. Aún otras modificaciones de la región constante pueden utilizarse para eliminar enlaces de disulfuro o fracciones de oligosacárido que permiten la localización mejorada debido a una especificidad de antígeno incrementada o flexibilidad del anticuerpo. Similarmente , las modificaciones de la región constante de acuerdo con esta invención pueden fácilmente hacerse utilizando técnicas bioquímicas o de ingeniería molecular conocidas.

Se observará que los anticuerpos modificados pueden modificarse para fusionar el dominio CH3 directamente con la región de conexión de los anticuerpos modificados respectivos. En otros constructos puede ser deseable proporcionar un separador de péptido entre la región de conexión y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, los constructos compatibles podrían expresarse en donde el domino CH2 ha sido eliminado y el domino CH3 restante (modificado o no modificado) se une a la región de conexión con un separador de 5-20 aminoácidos. Tal separador puede agregarse, por ejemplo, para asegurar que los elementos reguladores del dominio constante permanezcan libres y accesibles o que la región de conexión permanezca flexible. Sin embargo, se debe observar que los separadores de aminoácido pueden, en algunos casos, probar ser inmunogénicos y provocar una respuesta inmunitaria indeseada contra el constructor. Por consiguiente, cualquier separador agregado al constructor puede ser relativamente no inmunogénico o, aún omitirse todo si las calidades bioquímicas deseadas de los anticuerpos modificados deben mantenerse.

Aparte de la eliminación de los dominios de región constante completos, se apreciará que los anticuerpos de la presente invención pueden ser provistos a través de eliminación o sustitución parcial de unos cuantos o aún un aminoácido individual. Por ejemplo, la mutación de un aminoácido individual en las áreas seleccionadas del domino CH2 puede ser lo suficiente para sustancialmente reducir la unión de Fe y por lo tanto aumentar la localización del tumor. Similarmente , puede ser deseable simplemente eliminar esa parte de uno o más de los dominios de región constante que controlan la función efectora (por ejemplo, unión CLQ de complemento) a ser modulada. Tales eliminaciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (vida media en suero) mientras dejan otras funciones deseables asociadas con el dominio de la región constante del sujeto intacta. Además, como se sugiere anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden modificarse a través de la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que mejoran el perfil del constructo resultante. A este respecto puede ser posible alterar la actividad provista por el sitio de unión conservado (por ejemplo, unión Fe) mientras se mantiene sustancialmente la configuración del perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Aún otras modalidades pueden comprender la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables tales como la función efectora o proporcionar mayor unión de citotoxina o carbohidrato. En estas modalidades puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas derivadas de dominios de región constante seleccionados.

En ciertas modalidades de la invención, puede ser deseable utilizar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto, para aumentar la penetración tumoral, por ejemplo. Varias técnicas son conocidas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente , estos fragmentos se derivan a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 y Brennan et al., 1985, Science, 229:81). Sin embargo, estos fragmentos ahora se producen típicamente directamente a través de células hospederas recombinantes como se describe anteriormente. De esta forma, los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, y scFv todos pueden expresarse en, y secretarse de, E. coli u otras células hospederas, de esta forma permitiendo la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Alternativamente, tales .fragmentos de anticuerpo puede aislarse de colecciones de fago de anticuerpo explicadas en la presente. El fragmento del anticuerpo también pueden ser anticuerpos lineales como se describe en la Patente de E . U. A. No. 5,641,870, por ejemplo, y pueden ser monoespecífieos o biespecífieos . Otras técnicas para la producción de los fragmentos de anticuerpo serán evidentes para un experto en la técnica.

Además puede ser deseable, especialmente en el caso de fragmentos de anticuerpo, modificar un anticuerpo con el fin de aumentar su vida media en suero. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión del receptor salvaje en el fragmento de anticuerpo a través de mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo a través de la incorporación del epítopo en una etiqueta de péptido que después se fusiona al fragmento del anticuerpo en cualquier extremo o en la parte media (por ejemplo, ADN o síntesis de péptido) .

La presente invención además abarca variantes y equivalentes que son sustancialmente homologas a los anticuerpos quimérico, humanizado y humano, o sus fragmentos de anticuerpo, establecidas en la presente. Estas pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservadoras, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares. Por ejemplo, la sustitución conservadora se refiere a la sustitución de aminoácido con otro dentro de la misma clase general tal como, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido. Un aminoácido básico con otro aminoácido básico, o un aminoácido neutral con otro aminoácido neutral. Lo que se pretende a través de la sustitución del aminoácido conservador se conocen bien en la técnica.

La invención también pertenece a los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico. Los agentes citotóxicos incluyen agentes quimioterapéuticos , agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, de planta o animal, o sus fragmentos) , isótopos radioactivos (es decir, radioconjugados) , etc. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados incluyen, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, doxorubicina , melfalano, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes de intercalación. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden utilizarse incluyen la cadena de difteria A, fragmentos activos no de unión de la toxina de difteria, la cadena de exotoxina A, la cadena de ricina A, la cadena de abrina A, la cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas del árbol de aceite, proteínas de diantina, proteínas de pitolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricótesenos . En algunas modalidades, los anticuerpos pueden conjugarse con radioisótopos, tales como 90Y, 1251 , 131I, 123I, li:LIn, 105Rh, Sm, Cu, Ga, Ho, Lu, Re y Re utilizando cualquiera de un número de quelatadores bien conocidos o marcación directa. En otras modalidades, las composiciones descritas pueden comprender anticuerpos acoplados a fármacos, profármacos, o linfocinas tales como interferón. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se elaboran utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridiiditiol) propionato (SPDP) , iminotiolan (IT), ,derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como HCL de dimetil adipimidato) , ásteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tal como glutareldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoilo) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilenodiamina) , diisocianatos (tal como 2 , 6 -diisocianato de tolieno) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenceno) . Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicina, maitansinoides , un tricoteno, y CC1065, y los derivados de esas toxinas que tienen actividad de toxina, también pueden utilizarse. En algunas modalidades, los anticuerpos modificados pueden formarse en complejo con otros ligandos inmunológicamente activos (por ejemplo, anticuerpos o sus fragmentos) en donde la molécula resultante se une a ambas la célula neoplásica y una célula efectora tal como la célula T.

Independientemente de cómo se obtienen las cantidades útiles, los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse en cualquiera de un número de formas conjugadas (es decir, inmunoconjugados) o sin conjugar. Alternativamente, los anticuerpos de esta invención pueden utilizarse en una forma no conjugada o "desnuda" para aprovechar los mecanismos de existencia natural del sujeto incluyendo la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y la toxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) para eliminar las células malignas. La selección de cual conjugado o anticuerpo modificado sin conjugar utilizar dependerá del tipo y la etapa del cáncer, el uso del tratamiento adjunto (por ejemplo, quimioterapia o radiación externa) y la condición del paciente. Se apreciará que se pueden hacer fácilmente tal selección en vista de las enseñanzas de la presente .

Los ensayos de competencia pueden utilizarse para determinar si dos anticuerpos se unen al mismo epítopo a través del reconocimiento de los epítopos de traslape idénticos o estéricos. Cualquier método conocido por el experto en la técnica para determinar la unión competitiva (tal como, por ejemplo, los inmunoensayos descritos en cualquier lugar en la presente) pueden utilizarse.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ensayarse para la unión inmunoespecífica a través de cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos utilizando técnicas tales el análisis de Biacore, el análisis FACS, inmunofluorescencia , inmunocitoquímica, análisis Western blot, radioinmunoesayo, ELISA, inmunoensayo "emparedado", ensayo de inmunoprecipitación, reacción de precipitina, reacción de precipitina de difusión con gel, ensayo de inmunodifusión, ensayo de aglutinación, ensayo de fijación de complemento, ensayo inmunoradiométrico, inmunoensayo fluorescente, e inmunoensayo de proteína A. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol . 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) .

En algunas modalidades, de la presente invención la inmunoespecificidad de un anticuerpo contra una región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano se determina utilizando ELISA. Un ensayo ELISA comprende preparar el antígeno, recubrir las cavidades de una placa de microtitulación de 96 cavidades con el antígeno, agregar al anticuerpo contra un marcador de la célula madre cancerígena conjugado con un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) a una cavidad, incubar durante un periodo de tiempo y detectar la presencia del antígeno. Alternativamente el antígeno contra la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano no se conjuga a un compuesto detectable, sino más bien un segundo anticuerpo conjugado que reconoce el anticuerpo contra la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano se agrega a la cavidad. Además, en lugar de recubrir la cavidad con el antígeno, el anticuerpos contra una región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano puede cubrirse la cavidad y un segundo anticuerpo conjugado a un compuesto detectado puede agregarse después de la adición del antígeno a la cavidad recubierta.

Se conoce por el experto en la técnica que parámetros pueden modificarse para aumentar la señal detectada así como otras variaciones de ELISA conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol . 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1).

La afinidad de unión de-~un anticuerpo a una región próxima de la membrana del dominio extracelular del receptor Notchl y la unión fuera de la tasa puede determinarse de los datos a través del análisis de un anticuerpo-antígeno de interacción puede determinarse a través de un ensayo de unión competitivo. Un ejemplo de un ensayo de unión competitivo es un radioinmunoensayo que comprende la incubación del antígeno marcado (por ejemplo, 3H o 125I) , o un fragmento o variante del mismo, o uno de sus fragmentos o variantes, con el anticuerpo de interés en la presencia de cantidades en aumento de antígeno no marcado seguido por la detección del anticuerpo que se une al antígeno marcado. La afinidad del anticuerpo contra la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano y las tasas de unión fuera del intervalo pueden determinarse de los datos del análisis Scatchard plot . En algunas modalidades, el análisis cinético Biacore se utiliza para determinar la unión en tazas dentro y fuera del anticuerpo contra la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano. El análisis cinético Biacore comprende analizar la unión y la disociación de los anticuerpos de chips con antígeno inmovilizado, por ejemplo, receptores Notchl, en su superficie.

En ciertas modalidades, la invención abarca polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido que comprende un anticuerpo o uno de sus fragmentos, contra la región próxima de la membrana de unión no ligando del dominio extracelular Notchl humano. El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye solamente secuencias de codificación para el polipéptido así como el polinucleótido que incluye secuencias de codificación y/o no de codificación adicionales. Los polinucleótidos de la invención pueden estar en la forma de ARN o en la forma de ADN. El ADN incluye ADNc, ADN genómico, y ADN sintético, y puede ser de estructura de cadena doble o de estructura de cadena individual, y si es de estructura de cadena individual puede ser la estructura de cadena de codificación o la estructura de cadena no de codificación (antisentido) . Los polinucleótidos de la invención pueden estar en la forma de ARN o en la forma de ADN, cuyo ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de estructura de cadena doble o de estructura de cadena individual, y si es de estructura de cadena individual puede ser una estructura de cadena de codificación o una estructura de cadena no codificación (antisentido) .

La presente invención además se refiere a variantes de los polinucleótidos descritos aquí anteriormente que codifican fragmentos, análogos y derivados. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica de existencia natural del polinucleótido o una variante de existencia no natural del polinucleótido.

Como se indica aquí anteriormente, el polinucleótido puede tener una secuencia de codificación que es una variante alélicas de existencia natural de la secuencia de codificación del polipéptidos descritos. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alterna de una secuencia de polinucleótido que tiene una sustitución, eliminación o adición de uno o más nucleótidos, que no alteran sustancialmente la función del polipéptido codificado .

La presente invención también incluye polinucleótidos, en donde la secuencia de codificación para el polipéptido maduro puede fusionarse en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que ayuda en la expresión y la secreción de un polipéptido de una célula hospedera, por ejemplo una secuencia líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una pre-proteína y puede tener la secuencia líder separada a través de la célula hospedera para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una pro-proteína que es la proteína madura más los residuos de aminoácido 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una pro-secuencia es una pro-proteína y una forma nativa de la proteína. Una vez que la pro- secuencia se separa permanece una proteína madura activa. De esta forma, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede codificar una proteína madura, o para una proteína que tiene una prosecuencia o para una proteína que tiene tanto una prosecuencia como una pre-secuencia (secuencia líder) .

Los polinucleótidos de la presente invención también pueden tener la secuencia de codificación fusionada en marco a la secuencia marcadora que permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una etiqueta hexa-histidina suministrada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un hospedero bacteriano, o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) cuando un hospedero mamífero (por ejemplo, células COS-7, se utilizan. La etiqueta HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37 : 767) .

En modalidades adicionales de la invención se incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido por lo menos 90% idéntica, 95% idéntica, y en algunas modalidades al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a las secuencias descritas. En algunas modalidades,, los polinucleótidos tienen secuencias de nucleótido al menos 90% idénticas a SEC ID NOs : 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 25 ó 29 (con o sin secuencia de señal). En algunas modalidades, los polinucleótidos tienen secuencias de nucleótido al menos 90% idéntica a SEC ID NOs: 7 ó 13. En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido que híbrida a un polinucleótido que codifica a los polipéptidos de SEC ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 30, 31, o 32. En algunas modalidades, los polinucleótidos hibridan a los polinucleótidos de SEC ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 25 ó 29. En algunas modalidades, los polinucleótidos hibridan bajo condiciones de hibridación estrictas .

Como se utiliza en la presente, las frases "híbrida" o "selectivamente híbrida" o "específicamente híbrida" se 'refiere a la unión o duplexión de una molécula solamente a una secuencia de nucleótido particular bajo condiciones de hibridación estrictas cuando la secuencia está presente en una mezcla completa (por ejemplo, colección de ADN o ARN) , ver, por ejemplo Andersen (1998) Nucleic Acid Hybridization Spnnger-Verlag; Ross (ed. 1997) Nucleic Acid Hybridization iley.

Como se utiliza en la presente, la frase "condiciones de hibridación estrictas" se refiere a condiciones bajo las cuales la sonda hibridará a su secuencia objetivo, típicamente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero a las otras secuencias. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones estrictas se seleccionan de aproximadamente 5-10°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una resistencia iónica definida. La Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica definida, pH, y concentración nucleica) a la cual 50% de la sondas complementarias al objetivo hibridan la secuencia objetivo en equilibrio (como las secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en el equilibrio) . Las condiciones estrictas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor de aproximadamente 1.0 M del ion de sodio, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ión sódico (u otras sales) a pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es menor de aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (es decir, mayores de 50 nucleótidos) . Las condiciones estrictas también pueden lograrse con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. Para hibridación altamente estricta, una señal positiva es al menos dos veces el fondo, o 10 veces la hibridación de fondo. Las condiciones de hibridación altamente estrictas o estrictas ilustrativas incluyen: 50% de formamida, 5x SSC, y 1% de SDS incubado a 42 °C o 5x SSC y 1% de SDS incubado a 65°C, con un lavado en 0.2x SSC y 0.1% de SDS a 65°C. Para PCR, una temperatura de aproximadamente 36 °C es típica para amplificación estrictamente baja, aunque las temperaturas de templado pueden variar de aproximadamente 32 °C a aproximadamente 48 °C dependiendo de la longitud del iniciador. Para amplificación PCR de alta restricción, una temperatura de aproximadamente 62 °C es típica, aunque las temperaturas de templado con alto rigor pueden estar en el intervalo de 50 °C a aproximadamente 65 °C, dependiendo de la longitud del iniciador y la especificidad. Las condiciones de ciclo típicas para ambas amplificaciones de alto y bajo rigor incluyen una fase de desnaturalización de 90 °C a 95 °C durante 30-120 segundos, una fase de templado que dura 30-120 segundos, y una fase de extensión de aproximadamente 72 °C por 1-2 minutos.

A través de un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótido de referencia pretende que la secuencia de nucleótido del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótido puede incluir hasta 5 mutaciones de punto por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótido de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótido de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden eliminarse o sustituirse con otro nucleótido, o un números de nucleótidos hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones del término amino o carboxi de la secuencia del nucleótido de referencia o en cualquier lugar entre las posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como un aspecto práctico, si cualquier molécula de ácido nucleico particular es al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de referencia puede determinarse convencionalmente utilizando programas de computadora conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, I 53711) . Bestfit utiliza un algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre las dos secuencias. Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a la secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros establecen, por supuesto, de tal forma que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótido de referencia y que los huecos en la homología de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia son permitidos.

Las variantes de polinucleótido pueden contener alteraciones en las regiones de codificación, en las regiones no de codificación, o en ambas. En algunas modalidades, las variantes de polinucleótido contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o eliminaciones silenciosas, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunas modalidades, las variantes de nucleótido se producen a través de sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. Las variantes de polinucleótido pueden producirse de una variedad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión del codón para un hospedero particular (por ejemplo, cambio de codones en el ARN humano a los preferidos por un hospedero bacteriano tal como E. coli) .

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes , polipéptidos naturales, o polipéptidos sintéticos que comprenden un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, contra una región próxima de membrana de unión de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano. Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácido de la invención pueden variarse sin afectar significativamente la estructura o la función de la proteína. De esta forma, la invención además incluye variaciones de los polipéptidos que muestran una actividad sustancial o que incluyen regiones de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, contra una región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano. Tales mutantes incluyen eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones, y tipo de sustituciones.

Los polipéptidos y los polinucleótidos de la presente invención son provistos en forma aislada, y algunas veces se purifican para homogeneidad.

Los polipéptidos aislados descritos en la presente pueden producirse a través de cualquier método adecuado conocido en la técnica. Tales métodos están en el intervalo de métodos de síntesis proteica directa para construir una secuencia de ADN que codifica secuencias de polipéptido aisladas y que expresa esas secuencias en un hospedero transformado adecuado. Por ejemplo, un ADNc puede obtenerse clasificando una colección de ADNc humana con un fragmento de ADN marcado que codifica un polipéptido (por ejemplo, el nucleótido SEC ID NO: 1) e identificando los clones a través de auto-radiografía. Las rondas adicionales de la purificación de plantas y la hibridación se llevan a cabo utilizando métodos convencionales.

En algunas modalidades de método recombinante , una secuencia de ADN se construyó aislando o sintetizando una secuencia de ADN que codifica una proteína de tipo silvestre de interés. Opcionalmente , la secuencia puede mutagenizarse a través de mutagénesis específica del sitio para proporcionar sus análogos funcionales. (Ver, por ejemplo, Zoeller et al., 1984, Proc. Nat Acad. Sci. USA, 81:5662-5066 y Patente de E. U. A. No. 4,588,585) . Otro método para construir una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés sería a través de síntesis química utilizando un sintetizador de oligonucleótido. Tales oligonucleótidos pueden diseñarse con base en la secuencia de aminoácido del polipéptido deseado y seleccionando los codones que están favorecidos en la célula hospedera en donde el polipéptido recombinantes de interés se producirá.

Los métodos estándar pueden aplicarse para sintetizar una secuencia de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, una secuencia aminoácido completa puede utilizar para construir un gen retro-transferido. Además, un oligómero de ADN que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido deseado puede sintetizarse. Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado pueden sintetizarse y después ligarse. Los oligonucleótido individuales típicamente contienen salientes 5' o 3' para el ensamble de complementariedad .

Una vez ensamblado (por síntesis, mutagénesis dirigida al sitio o a otro método) , las secuencias de ADN mutantes que codifican un polipéptido aislado particular de interés se insertarán en un vector de expresión y se enlazarán operativamente en la secuencia de control de expresión apropiada para la expresión de la proteína en un hospedero deseado. En ensamble apropiado puede confirmarse a través de secuenciación de nucleótido, mapeo por restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un hospedero adecuado. Como es bien conocido en la técnica, con el fin de obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un hospedero, el gen está operativamente enlazado a secuencias de control de expresión de transcripción y transferencia que son funcionales en el hospedero de expresión seleccionado.

Los vectores de expresión recombinantes se utilizan para amplificar y expresar ADN que codifica fusiones de polipéptido de marcador de la célula madre. Los vectores de expresión recombinantes son constructos de ADN replicables que tienen fragmentos sintéticos, o de ADN derivados de ADNc que codifican la función del polipéptido marcador de la célula madre cancerígena o un análogo bioequivalente operativamente enlazado a los elementos reguladores de transcripción y transferencia adecuados derivados de genes de mamífero, microbianos, virales o de insecto. Una unidad transcripcional generalmente comprende un ensamble de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión del gen, por ejemplo, promotores o potenciadores de transcripción, (2) una secuencia estructural o de codificación que se transcribe en ARNm y se transfiere dentro de la proteína, y (3) secuencias de iniciación y terminación de transcripción y transferencias apropiadas, como se describe con detalle más adelante. Tales elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripción. La habilidad para replicar en hospedero, usualmente conferida a través del origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes puede adicionalmente incorporarse. Las regiones de ADN están operablemente enlazadas cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, para un péptido de señal (líder secretor) está operablemente enlazado a ADN para un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está operablemente enlazado a la secuencia de codificación si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operablemente enlazado a una secuencia de codificación si se coloca para así permitir la transferencia. Generalmente, operativamente enlazado significa contiguo y, en el caso de líderes secretores, significa contiguo y en marco de lectura. Los elementos estructurales previstos para utilizarse en sistemas de expresión de levadura, incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína transferida a través de una célula hospedera. Alternativamente, cuando la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Este residuo puede opcionalmente posteriormente separarse de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final .

La selección de la secuencia de control de expresión y el vector de expresión dependerán de la elección del hospedero. Una amplia variedad de combinaciones de hospedero/vector de expresión pueden utilizarse. Los vectores de expresión útiles para hospederos eucarióticos , incluye, por ejemplo, vectores que comprenden secuencia de control de expresión de SV40, virus de papiloma de bovino, adenovirus y citomegalovirus . Los vectores de expresión útiles para hospederos bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de Escherichia coli, incluyendo pCRl, pBR322, pMB9 y sus derivados, y plásmidos en un intervalo de hospederos más amplios tal -como M13 y fagos de ADN de estructura de cadena individual filamentosas.

Las células hospederas adecuadas para la expresión de una proteína marcadora de una célula madre cancerígena incluyen células procariotas, de levadura, de insecto o eucarióticas superiores. Los procariotas incluyen organismos gram negativo o gram positivo, por ejemplo, E. Coli o bacilo. Las células eucarióticas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero como se describe a continuación. Los sistemas de transferencia libres de células también podrían utilizarse. Los vectores de clonación y expresión adecuados para utilizarse con hospederos celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y mamífero se describen en Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y. , 1985) , la descripción relevante de la cual se incorpora aquí por referencia.

Varios sistemas de cultivo de mamíferos o de células de insecto también se utilizan venta osamente para expresar la proteína recombinante . La expresión de las proteínas recombinantes en células de mamíferos pueden llevarse a cabo debido a que tales proteínas generalmente están correctamente plegadas apropiadamente modificadas y completamente funcionales. Los ejemplos de líneas celulares hospederas de mamífero adecuado incluyen las líneas COS-7 de células de riñon de mono, descritas por Gluzman (1981, Cell, 23:175), y otras líneas celulares .-capaces de expresar un vector apropiado que incluyen, por ejemplo, células L, C127, 3T3, líneas celulares de ovario de hámster Chino (CHO) , HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender elementos no transcritos tales como el origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador enlazado al gen a ser expresado, y otras secuencias no transcritas de flanqueo 5' o 3', secuencias no transcritas 5' o 3', tales como los sitios de unión de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donador y aceptor de empalme, y secuencias de terminación de transferencia. Los sistemas de baculovirus para la producción proteínas heterólogas en células de insecto fue estudiado por Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47.

Las proteínas producidas a través de un hospedero transformado pueden purificarse de acuerdo con cualquier método adecuado. Tales métodos estándar incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio de ión, de afinidad y de dimensionamiento de columna) , centrifugación, solubilidad diferencial, o a través de cualquier otra técnica estándar para purificación de proteína. Las etiquetas de afinidad tales como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, la secuencia de recubrimiento de influenza y glutationa-s-transferasa pueden unirse a la proteína para permitir la fácil purificación a través del paso sobre una columna de afinidad apropiada. Las proteínas aisladas también pueden típicamente caracterizarse utilizando técnicas tales proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos x.

Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas que secretan proteína recombinante en medios de cultivo primero pueden concentrare utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después del paso de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada. Alternativamente, puede utilizarse una resina de intercambio de anión, por ejemplo una matriz o un sustrato que tienen grupos dietilaminoetilo pendientes (DEAE) . Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrina, celulosa u otros tipos comúnmente utilizados en purificación de proteína. Alternativamente, se puede utilizar un paso de intercambio de catión. Los intercambiadores de catión adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden los grupos sulfopropilo o carboxiraetilo . Finalmente, uno o más pasos de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) utilizando el medio RP-HPLC hidrófobo, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos pendientes, pueden utilizarse para purificar adicionalmente una proteína recombinante o una composición de proteína-Fc de la célula madre cancerígena. Algunos o todos los pasos de purificación anteriores, en varias combinaciones, también pueden utilizarse para proporcionar una proteína recombinante homogénea .

La proteína recombinante producida en un cultivo bacteriano usualmente se aisla a través de la extracción inicial de los granulos de la célula, seguido por una o más concentraciones, desalado, pasos de cromatografía de intercambio de ión acuoso o exclusión de tamaño. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) puede utilizarse para los pasos de purificación finales. Las células microbianas utilizadas en la expresión de una proteína recombinante pueden alterarse a través de cualquier método conveniente, incluyendo ciclacíón de congelamiento-descongelamiento, sonicación, alteración mecánica o el uso de agentes de lisación.

La presente invención también proporciona métodos para inhibir el crecimiento de células tumorigénicas que expresan un marcador de la célula madre cancerígena utilizando los antagonistas de un marcador de célula madre cancerígena descritas en la presente. En algunas modalidades, el método para inhibir el crecimiento de células tumorigénicas que expresan un marcador de la célula madre cancerígena, por ejemplo el receptor Notchl, comprenden poner en contacto las células con un antagonista contra un marcador de la célula madre cancerígena in vi tro. Por ejemplo, una línea celular inmortalizada o una línea celular cancerígena que expresa un marcador de la célula madre cancerígena se cultiva en medio al cual se agrega un antagonista del marcador de la célula madre cancerígena expresada para inhibir el crecimiento celular. En algunas modalidades, las células tumorales que comprenden células madre de tumor se aislan de una muestra de un paciente tal como, por ejemplo, una biopsia tisular, efusión pleural, una muestra sanguínea y se cultivan en media al cual se agrega un antagonista de un marcador de la célula madre cancerígena para inhibir el crecimiento celular. En algunas modalidades, el antagonista es un anticuerpo que específicamente reconoce un epítopo de una proteína marcadora de la célula madre cancerígena. Por ejemplo, los anticuerpos contra la proteína marcadora de la célula madre cancerígena puede agregarse al medio de cultivo de células madre cancerígenas aisladas para inhibir el crecimiento celular.

En algunas modalidades, el método para inhibir el crecimiento de células tumorigénicas que expresan un marcador de la célula madre cancerígena comprende poner en contacto la célula con una antagonista contra un marcador de la célula madre cancerígena in vivo. En algunas modalidades, el método para inhibir el crecimiento de las células tumorigénicas que expresan Notchl comprenden poner en contacto las células con un anticuerpo que específicamente se une a una región próxima de la membrana de unión no de ligando de un receptor Notchl humano. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorigénicas e inhibiendo la actividad de Notchl. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe el crecimiento de las células tumorigénicas inhibiendo la señalización de Notchl inducida por el ligando. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe el crecimiento de las células tumorigénicas inhibiendo la separación de Notchl. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe el crecimiento de las células tumorigénicas reduciendo la frecuencia o el número de células madre cancerígenas en el tumor.

En ciertas modalidades, poner en contacto una célula tumorigénica con un antagonista para un marcador de célula madre cancerígena se lleva a cabo en un modelo de animal. Por ejemplo, los xenotrasplantes que expresan un marcador de la célula madre cancerígena se cultivan en ratones inmunocomprometidos (por ejemplo, ratones NOD/SCID) a los cuales se administra un antagonista para un marcador de célula madre cancerígena para inhibir el crecimiento del tumor. En algunas modalidades, las células madre cancerígenas que expresan un marcador de la célula madre cancerígena se aislan de una muestra de un paciente tal como, por ejemplo, biopsia tisular, efusión pleural, o una muestra sanguínea y se inyecta en los ratones inmunocomprometidos a los cuales después se administra un antagonista contra el marcador de la célula madre cancerígena para inhibir el crecimiento de la célula tumoral . En algunas modalidades, el antagonista de un marcador de la célula madre cancerígena se administra al mismo tiempo o en breve después de la introducción de células tumorigénicas en el animal para evitar el crecimiento del tumor. En otras modalidades, el anticuerpo contra el marcador de la célula madre cancerígena se administra con un agente terapéutico después de que las células tumorigénicas han crecido a un tamaño especificado.

La presente invención además proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos, polipéptidos u otros agentes que activan un marcador de la célula madre cancerígena. Estas composiciones farmacéuticas encuentran uso en la inhibición del crecimiento del tumor, crecimiento de una célula de tumor, y tratar cáncer en pacientes humanos.

Las formulaciones se preparan para almacenamiento y uso a través de la combinación de un antagonista purificado (por ejemplo, anticuerpo) de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, portador, excipiente, etc.) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Edición Mack Publishing, 2000) . Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, reguladores de pH no tóxicos tales como fosfato. Citrato y otros ácidos orgánicos; sales tales como cloruro de sodio; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio ; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol fenílico, butílico o bencílico; alquil parabenes, tales como metil o propil parabeno; catecol ; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácido) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; carbohidratos tales como monosacáridos , disacáridos, glucosa, mañosa o dextriñas ; agentes quelatadores tales como EDT; azúcares tales sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos tales como los complejos de Zn-proteína; y/o agentes tensioactivos no iónicos tales como TWEEN o polietileno glicol (PEG) .

La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse en cualquier número de formas ya sea en un tratamiento local o sistémico. La administración puede ser tópica (tal como a las membranas mucosas incluyendo distribución vaginal y rectal) tales como parches transdérmicos , ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aspersiones, líquidos y polvos; la administración pulmonar tal como a través de inhalación o insuflación de polvos o aerosoles (incluyendo a través de nebulizador) , intera-traqueal , intranasal , epidérmica y transdérmica ; oral; parenteral incluyendo inyección intravenosa, intra-arterial , intratumoral , subcutánea, intraperitoneal o intramuscular o infusión; o intracraneal tal como asintratecal o intraventricular .

La formulación terapéutica puede ser en forma de dosificación unitaria. Tales formulaciones incluyen tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones en agua o un medio no acuoso, o supositorios para administración oral, parenteral o rectal o para administración a través de inhalación. En las composiciones sólidas tales como tabletas el ingrediente activo principal se mezcla con el portador farmacéutico. Los ingredientes formadores de tabletas convencionales incluyen almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbito, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato dicálcico o gomas, y otros diluyente (por ejemplo, agua) para formar una composición de pre-formulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables no tóxicas. La composición de pre-formulación sólida después se subdivide en formas de dosis unitarias del tipo descrito en la presente. Las tabletas, pildoras, etc., de la nueva composición pueden recubrirse o por el contrario formarse en compuestos para proporcionar una forma de dosificación que obtiene las ventajas de la acción prolongada. Por ejemplo, la tableta o la pildora pueden comprender una composición interna cubierta por un componente externo. Además, los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración y permitir que el componente interno pase intacto a través del estómago o se retrase en liberación. Puede utilizarse una variedad de materiales tales como capas entéricas o recubrimientos, tales materiales incluyen un número de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales como goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa .

Las formulaciones farmacéuticas incluyen anticuerpos de la presente invención en complejo con liposomas (Epstein, et al., 1985, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 82:3688; Hwang, et al., 1980, Proc Nati. Acad. Sci. USA, 77 4030, y Patentes de E. U. A. 4,485,045 y 4,544,545). Los liposomas con un tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de E. U. A. No. 5,013,556. Algunos liposomas pueden generarse a través de evaporación de fase inversa con una composición lípida que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG. Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño adecuado de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado .

Los anticuerpos también pueden insuflarse en microcápsulas . Tales microcápsulas se preparan, por ejemplo, a través de técnicas de coacervación o a través polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetracrilato) , respectivamente, en sistemas de distribución de fármacos coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas) o en una microemulsión como se describe en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing (2000) .

Además pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi -permeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos moldeados (por ejemplo, películas o microcápsulas) . Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles tales como poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico) , polilactidas (Patente de E. U. A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y 7-etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT TM (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , isobutirato de acetato de sacarosa, y ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico . En algunas modalidades, los anticuerpos pueden utilizarse para tratar varias afecciones caracterizadas por la expresión y/o sensibilidad aumentada de las células al marcador de la célula madre cancerígena. Particularmente, se visualiza que los anticuerpos contra el marcador de la célula madre cancerígena, por ejemplo, Notchl, se utilizarán para tratar trastornos proliferativos que incluyen pero no se limita a tumores benignos y malignos del riñon, hígado, vejiga, pecho, estómago, ovario, colón, recto, próstata, pulmón, vulva, tiroides, cabeza y cuello, cerebro (glioblastoma , astrocitoma, meduloblastoma, etc.), sangre y linfoide (leucemias y linfomas) .

En algunas modalidades, el tratamiento involucra la administración combinada de un anticuerpo u otro agente de la presente invención y un agente quimioterapéutico o coctel de múltiples agentes quimioterapéuticos diferentes. El tratamiento con anticuerpo puede ocurrir antes de, concurrentemente con, o posteriormente en la administración de quimioterapia. Las quimioterapias contempladas por la invención incluyen sustancias químicas o fármacos conocidos en la técnica que están comercialmente disponibles, tales como doxorubicina, 5-fluorouracilo, citocina arabinosida ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfano, citosina, taxol, metrotrexato, cisplatina, melfalano, vinblastina y carboplatina . La administración combinada puede incluir la co-administración, ya sea en una sola formulación farmacéutica o utilizando formulaciones separadas, o administración consecutiva en cualquier orden pero generalmente dentro de un periodo de tiempo de tal forma que todos los agentes activos pueden ejercer sus actividades biológicas simultáneamente. La preparación y los programas de dosificación para los agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente . La preparación y los programas de dosificación para la quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed. , M. C Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, d. (1992) .

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la presente invención también incluyen, pero no se limitan a, agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclosfamida (Citoxan) ; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquone, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina , trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamima, mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida , estramustina , ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina , melfalano, novembicina, fenesterina, prednimustina , trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustima, clorozotocina , fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina ; antibióticos tales como aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caloqueamicina , carabicina, carminomicina, carzinofilina , cromomicinas , dactinomicina, daunorubicina, detorubicina , 6-diazo- 5 -oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina , mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina , estreptonigrina , estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato ; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol , mepitiostano, testolactona ; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedores de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato, defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina ; acetato de eliptinio; etoglucida; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona ; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina ; ácido podofinílico ; 2-etilhidrazida; procarbazina ; PSK. ; razoxana; sizofurano; espirogermano; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2', 2"-triclorotrietilamina ; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa; toxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.) y doxetaxel (Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina ; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina, platino; etoposida (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposida; daunomicina; aminopterina ; xeloda; ibandronato; CPT11; inhibidores de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; ácido retinoico; esperamicinas ; capecitabina ; y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables. Los agentes quimioterapéuticos también incluyen agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de la hormona en tumores tales como anti -estrógenos que incluyen por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, inhibidores de aromatasa 4 (5) -imidazoles, 4 -hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston) ; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida , leuprolida, y goserelina; y sales, ácidos, o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables.

En ciertas modalidades, el agente quimioterapéutico es un inhibidor de topoisomerasa. Los inhibidores de topoisomerasa son agentes de quimioterapia que interfieren con la acción de una topoisomerasa enzima (por ejemplo, topoisomerasa I o II) . Los inhibidores de topoisomerasa incluyen, pero no se limitan a HCL de doxorubicina, citrato de daunorubicina, HCL de mitoxantrona, actinomicina D, etoposida, HCL de topotecan, teniposida (VM-26) , e irinotecan.

En ciertas modalidades, el agente quimioterapéutico es un anti -metabolito . Un anti -metabolito es un químico con una estructura que es similar al metabolito requerido para las reacciones bioquímicas normales, pero lo suficientemente diferente para interferir con una o más de las funciones de las células normales tales como la división celular. Los anti-metabolitos incluyen, pero no se limitan a, gemcitabina, fluorouracilo, capecitabina, metotrexato sódico, ralitrexed, Pemetrexed, tegafur, citosina arabinosida, Tioguanina (GlaxoSmithKline) , 5-azacitidina, 6 -mercaptopurina , azatioprina, 6-tioguanina, pentostatina , fosfato de fludarabina, y cladribina, así como sales, ácidos o derivados de cualquiera de éstos farmacéuticamente aceptables.

En otras modalidades, el tratamiento involucra la administración combinada de un anticuerpo u otro agente de la presente invención y terapia por radiación. El tratamiento con un anticuerpo puede ocurrir antes de, concurrentemente con o posteriormente en la administración de la terapia por radiación. Cualquier programa de dosificación para la terapia de radiación puede utilizarse según determinado por el médico con experiencia.

En otras modalidades, el tratamiento puede involucrar la administración combinada de anticuerpos de la presente invención con otros anticuerpos contra tumores adicionales asociados con los antígenos que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos que se unen al receptor EGF (EGFR) (Erbitux®) , el receptor erbB2 (HER2) (Herceptin®) , y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Avastin®) . Además, el tratamiento puede incluir la administración de una o más citocinas; puede estar acompañado por la remoción quirúrgica de células cancerígenas; y/o cualquier otra terapia que se estima necesaria a través del médico tratante.

Para el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo u otro agente de la presente invención depende del tipo de enfermedad a ser tratada, la severidad y el curso de la enfermedad, la sensibilidad y la enfermedad, si el anticuerpo se administra para propósitos terapéuticos o preventivos, terapia previa, historial clínico del paciente, etc., todo es a discreción del médico tratante. El anticuerpo o agente puede administrarse una vez o sobre una serie de tratamientos que duran de varios días a varios meses, o hasta que se efectúe la cura o la disminución del estado de la enfermedad se logre (por ejemplo, reducción en el tamaño del tumor) . Los programas de dosificación óptimos pueden calcularse de mediciones y acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente y variarán dependiendo de la potencia relativa de un antagonista individual. El médico que administra puede fácilmente determinar dosis óptimas, metodologías de dosificación y grados de repetición. En general, la dosificación es de 0.01 ]ig a 100 mg por kilogramo de peso corporal y puede darse una o más veces diariamente, semanalmente , mensualmente o anualmente. El médico tratante puede -estimar los grados 'de repetición para la dosificación con base en los tiempos de residencia medidos y concentraciones del anticuerpo o agente en los fluidos corporales o tejidos.

La presente invención proporciona kits que comprende los anticuerpos descritos en la presente y que pueden utilizarse para llevar a cabo los métodos descritos en la presente. En algunas modalidades, un kit comprende por lo menos un anticuerpo purificado contra un marcador de célula madre cancerígena, en uno o más contenedores. En algunas modalidades, un kit comprende por lo menos un anticuerpo purificado contra la región próxima de de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano, en uno o más contenedores. En algunas modalidades, un kit comprende el anticuerpo 52M51 o una variante humanizada de 52M51. En algunas modalidades, un kit comprende el anticuerpo 52R43. En algunas modalidades, los kits contienen todos los componentes necesarios y/o suficientes para llevar a cabo en ensayo de detección, incluyendo todos los controles, direcciones para llevar a cabo los ensayos, y cualquier software necesario para el análisis de la presentación de los resultados. Un experto en la técnica fácilmente reconocerá que los anticuerpos descritos en la presente invención pueden fácilmente incorporarse en uno de los formatos de kit establecidos que son bien conocidos en la técnica.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para identificar una molécula que se unen a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral, el método comprende: i) incubar la molécula con región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano; ii) determinar si la molécula se une a la región próxima de la membrana del dominio extracelular del receptor Notch humano; y iii) determinar si la molécula inhibe el crecimiento tumoral. Las moléculas que específicamente se unen a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos y anticuerpos.

La clasificación puede llevarse a cabo utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. En ciertas modalidades, la clasificación se lleva a cabo in vitro. En algunas modalidades, las células que expresan una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano se incuban con una molécula marcada y la unión específica de la molécula marcada a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano se determina por análisis FACS . En algunas modalidades, se identificó una región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano se expresó por despliegue de fago, y las moléculas que específicamente se unen a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano. Otros métodos adecuados para identificar moléculas que específicamente se unen a un región próxima de la membrana de unión no de ligando de un receptor Notchl humano incluyen, pero no se limita a, ELISA; Western (o inmuno) blotting; y levadura-dos-híbridos .

Las moléculas que específicamente se unen a un región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano después se ensayan para la inhibición del crecimiento de la célula tumoral . Las pruebas pueden realizarse utilizando cualquier método conocido en la técnica. En ciertas modalidades, las moléculas que específicamente se unen a región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano se ensayan para la habilidad para inhibir el crecimiento tumoral in vi tro. En algunas modalidades, las moléculas que específicamente se unen a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano se incuban con células de tumor en cultivo y la proliferación de las células de tumor en la presencia de la molécula que específicamente se une a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano se determina y compara las células de tumor incubadas con una molécula de control no de unión. En ciertas modalidades, las moléculas que específicamente se unen a región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano se ensayan para la habilidad para inhibir el crecimiento tumoral in vivo. En ciertas modalidades, las moléculas que específicamente se unen la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano se inyectaron en un modelo de xenotransplante de animal y el crecimiento de los tumores en los animales se trató con moléculas que específicamente se unen a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un receptor Notchl humano se determinó y comparó con animales tratados con una molécula de control no de unión.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Los anticuerpos se generaron contra una región de unión no de ligando de Notchl, específicamente la región próxima de membrana de unión no se ligando del dominio extracelular. En ciertas modalidades, los fragmentos de polipéptido recombinante del dominio extracelular Notchl humano se generaron como antígenos para la producción del anticuerpo. Se utilizó tecnología de ADN recombinante para aislar polinucleótidos que codifican los aminoácidos 1427-1732 (SEC ID NO.l) de la región próxima de la membrana del dominio extracelular de Notchl humano. Estos polinucleótidos se ligaron de forma separada en N-terminal en-marco a un Fe humano y se marcaron con la etiqueta de histidina y clonaron en un vector de plásmido de transferencia para la expresión mediada por baculovirus en células de insecto. Se utilizaron protocolos de estándar de transfección, infección y cultivo celular para producir células de insecto recombinantes que expresan el polipéptido de Notchl correspondiente a la región próxima de la membrana que comprende los aminoácidos 1427-1732 (SEC ID NO: 2) (O'Reilly et al., 1994, Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press) .

El polipéptido de la región próxima de la membrana Notchl (aminoácidos Notchl 1472-1732) se purificó de lisatos de células de insecto utilizando la proteína A y cromatografía por afinidad en Ni++-quelato como se conoce por el experto en la técnica. El polipéptido de la región próxima de la membrana Notchl purificado se dializó contra PBS (pH=7) , concentró a aproximadamente 1 mg/ml, y filtró de forma estéril en la preparación para la inmunización.

Los ratones (n=3) se inmunizaron con la proteína antígeno Notchl purificada (Antibody Solutions; Mountain View, CA) utilizando técnicas estándar. La sangre de los ratones individuales se filtró aproximadamente 70 días después de la inmunización inicial para reconocimiento de antígeno utilizando ELISA y análisis FACS (como se describe en la presente) . Los dos animales con concentraciones de anticuerpo más altas se seleccionaron para el refuerzo de antígeno final después de lo cual las células del bazo se aislaron de la producción de hibridoma. Las células de hibridoma se colocaron en placas a 1 célula por cavidad en placas de 96 cavidades, y el sobrenadante de cada cavidad de se filtró por ELISA y análisis FACS contra polipéptido de la región próxima de membrana Notchl. Se seleccionaron varios hibridomas con alta concentración de anticuerpo y se mejoraron en un cultivo en matraz estático. Los anticuerpos se purificaron del sobrenadante de hibridoma utilizando cromatografía en agarosa de proteína A o proteína G. Los anticuerpos monoclonales purificados se ensayaron de nuevo por FACS como se describe en la presente. Se aislaron varios anticuerpos que reconocieron la región próxima de la membrana del dominio extracelular de Notchl humano. Una línea celular de hibridoma que expresa el anticuerpo 52M51 se deposito con ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 7 de Agosto del 2008, y la Designación de Depósito de Patente ATCC PTA-9405. Se determinaron las secuencias de nucleótido y la proteína pronosticada de ambas, la cadena pesada (SEC ID NO: 9 y 10) y cadena ligera (SEC ID NO: 3 y 4) del anticuerpo 52M51.

Anticuerpos Humanos En modalidades alternativas, los anticuerpos humanos que específicamente reconocen la región próxima de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl se aislaron utilizando tecnología de despliegue de fago. En ciertas modalidades, una colección de anticuerpos sintéticos que contiene dominios variables de anticuerpo humano se clasificó para reconocimiento específico y de alta afinidad de un Antígeno del receptor Notch descrito en la presente. En ciertas modalidades, una colección de despliegue de fago Fab humano se clasificó utilizando una serie de proteínas recombinantes que comprenden la unión no de ligando de la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un Receptor Notchl. En resumen, se incubaron 2 x 1013 partículas de fago de despliegue Fab con proteína recombinante (pasivamente inmovilizada) en la ronda uno, el fago no específico se lavó, y después el fago específico se eluyó con ya sea pH bajo (células) o DTT (proteína recombinante) . El producto eluido se utilizó para infectar bacteria TG1 F+, rescatada con el fago auxiliar, y después el despliegue de Fab se indujo con IPTG (0.25 mM) . Este procedimiento se repitió por dos rondas más y después la tercera ronda se clasificó en ELISA contra el antígeno pasivamente inmovilizado (5 g/ml) .

Los casetes de la CDR en la colección se intercambiaron específicamente a través de sitios de restricción de flaqueo únicos para optimización del anticuerpo. Las regiones variables humanas optimizadas después se clonaron en un vector de expresión Ig humano conteniendo la cadena pesada IgGl humana y la cadena ligera kappa para la expresión de los anticuerpos humanos en células CHO.

Mapeo del epítopo Para identificar anticuerpos que reconocen los dominios extracelulares de una región próxima de la membrana de unión no de ligando específica del receptor Notchl, se llevó a cabo el mapeo del epítopo. En ciertas modalidades, los vectores del plásmido de expresión de mamífero que comprenden una corriente arriba del promotor CMV de polinucleót idos que codifican fragmentos del dominio Notchl extracelular como proteínas de fusión Fe se generaron utilizando tecnología de ADN recombinante estándar. En ciertas modalidades, el mapeo del epítopo de las series 52M de los anticuerpos de la región de unión no de ligando se hizo utilizando una serie de proteínas de fusión y las eliminaciones de la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un Notchl humano de aproximadamente el aminoácido 1427 a aproximadamente el aminoácido 1732. Estas proteínas de fusión recombinantes se expresaron en células HEK 293 temporalmente transfectadas de la cuales se recolectó el medio acondicionado veinticuatro a cuarenta y ocho horas después de la transfección por ELISA.

En ciertas modalidades, los fragmentos de la proteína de fusión Notchl se separaron en geles SDS-PAGE y se sondearon con ambos anticuerpos anti-Fc para detectar la presencia de todas las proteínas de fusión contra los anticuerpos anti-Notchl para detectar los dominios reconocidos por cada anticuerpo anti-Notch.

Para identificar los epítopos específicos dentro de los dominios extracelulares reconocidos por un anticuerpo contra Notchl se utilizó el sistema SPOTs (Sigma Genosys, The oodlands, TX) . Una serie de 10 péptidos lineales de residuo se traslaparon a través de un aminoácido y que cubrieron el dominio extracelular Notchl completo se sintetizaron y unieron covalentemente a una membrana de celulosa mediante la técnica de síntesis SPOT. La membrana se pre- incubó por 8 horas a temperatura ambiente con regulador de pH de bloqueo y se híbrido con el anticuerpo durante la noche a 4°C. La membrana después se lavó, incubó con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) , se volvió a lavar, y visualizó con solución para desarrollo de señal conteniendo 3-amino-9-etilcarbazol . De esta forma se determinaron los epítopos específicos reconocidos por un anticuerpo.

Anticuerpos quiméricos Después de que se identificaron los anticuerpos monoclonales específicamente que reconocieron un dominio próximo de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl, estos anticuerpos se modificaron para superar la respuesta inmunitaria del anticuerpo anti -ratón humano (HAMA) cuando los anticuerpos de roedor se utilizaron como agentes terapéuticos. Las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo monoclonal seleccionado se aislaron por RT-PCR de células de hibridoma y y ligaron en marco a las regiones constantes de cadena pesada de IgGl humano y cadena ligera kappa, respectivamente, en vectores de expresión de mamífero. Alternativamente, un vector de expresión Ig humano tal como TCAE 5.3 se utilizó el cual contiene los genes de la región constante de la cadena pesada IgGl humana y la cadena ligera kappa en el mismo plásmido (Preston et al., 1998, Infection & Immunity 66 4137-42) . Los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera quiméricas después se co-transfectaron en células de ovario de hámster Chino (CHO) para la producción del anticuerpo quimérico. La inmunoreactividad y afinidad de los anticuerpos quiméricos se comparó con los anticuerpos de murino progenitores por ELISA y FACS.

Anticuerpos humanizados Como terapéuticos de anticuerpo quimérico aún son frecuentemente antigénicos, la producción de una respuesta inmunitaria de un anticuerpo anti-quimérico humano (HACA) , los anticuerpos quiméricos contra un dominio próximo de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl puede requerir humanización adicional. Para generar anticuerpos humanizados las tres secuencias hipervariables cortas o regiones de determinación de complementariedad (CDR) , de los dominios variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo quimérico se modificaron utilizando tecnología de ADN recombinante en la estructura del dominio variable de una secuencia de cadena pesada y ligera, respectivamente, y después se clonaron en un vector de expresión de mamífero para la expresión en células CHO. La inmunoreactividad y afinidad de los anticuerpos humanizados se comparó con los anticuerpos quiméricos progenitores a través de ELISA y FACS . Adicionalmente , la mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable puede utilizarse para optimizar la especificidad, afinidad, etc. del anticuerpo humanizado.

Ejemplo 2 Se generaron anticuerpos humanizados contra la región próxima de la membrana del dominio extracelular de un Notchl humano. Los dominios variables del anticuerpo monoclonal de murino 52M51 se aislaron y secuenciaron de la línea de hibridoma utilizando PCR degenerada esencialmente como se describe en Larrick, J. . , et al., 1989, Biochem Bwphys Res Comm 160: 1250 y Jones, S.T. & Bendig, M.M. , 1991, Bio/Technology 9:88. Las regiones de estructura variables de cadena pesada y ligera humanas que probablemente serán estructuralmente similares a la secuencias de aminoácido 52M51 progenitoras después se consideran como regiones de estructura humanas de referencia para ayudar a guiar el diseño de las nuevas estructuras sintéticas. Para identificar las regiones de estructura humanas que llevan similitud con las estructuras de murino 52M51, las secuencias de proteína pronosticadas codificadas por los dominios variables VH y VL de murino se comparan con las secuencias de anticuerpo humano codificadas por ADNc humano expresado utilizando las búsquedas BLAST de secuencias humanas depositadas en Genbank. Utilizando este método, se seleccionaron las secuencias de ADNc humanas (por ejemplo genbank DA975021, DB242412) y los dominios Vh de la línea germinal (por ejemplo IGHV1-24) para análisis adicional en el diseño de estructuras de cadena pesada. Similarmente , las secuencias de ADNc humano (por ejemplo, genbank CD709370, CD707373) y la línea germinal VI (por ejemplo IGLV7-46, IGLV8-61) se consideraron en el diseño de las estructuras de cadena ligera.

Las diferencias de aminoácido entre las cadenas pesadas de estructura humanizadas candidato y el dominio variable de cadena pesada y los dominios variables de cadena ligera del anticuerpo 52M51 del anticuerpo monoclonal de murino se evaluaron por importancia probable, y se hizo un juicio de si cada diferencia en la posición contribuye al pliegue y función apropiada del dominio variable. Este análisis fue guiado por el examen de las estructuras de cristal resueltas de otros fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, la estructura de Fab 2E8 como se describe en Trakhanov et al, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1999, 55: 122-28, así como otras estructuras de cristal de proteína (por ejemplo, estructuras del banco de datos de proteína 1ADQ y 1GIG) ) . Las estructuras se modelaron utilizando software de computadora incluyendo Jmol, quick PDB, y Pymol . Se da consideración al impacto potencial de un aminoácido en una posición dada en el empaque de la estructura de lamia ß, la interacción entre los dominios variables de cadena pesada y ligera, el grado de exposición de solvente de la cadena lateral de aminoácido, y la probabilidad de que un aminoácido impactaría la colocación de los bucles de CDR. A partir de este análisis, se concibieron y sintetizaron químicamente nueve cadenas VH candidato fusionadas en-marco a la región constante IgG2 humana y ocho cadenas VI candidato fusionadas en-marco con la región constante IgLCl humana. Las cadenas pesadas candidato comprenden: i) una estructura sintética designada para asemejarse a las estructuras humanas naturales y ii) las CDR del anticuerpo de murino 52M51 progenitor.

La funcionalidad de cada cadena pesada y ligera humanizada variante candidato se ensayó por co-transfección en células de mamífero. Cada uno de las nueve cadenas pesadas 52M51 humanizadas candidato descrita anteriormente se co-transfectó en células HEK 293 con el ADNc de cadena ligera 52M51 de murino, y el medio de acondicionamiento de ensayó por ELISA para la actividad de unión de Notchl . La variante de la cadena pesada 52M51 que exhibió la unión más robusta se seleccionó. Esta variante "52M51-H4" (SEC ID NO: 22) contiene, además de las CDR de murino, la variación en las 3 posiciones de estructura dentro de la estructura Vh, las posiciones de Kabat 20, 48, y 71 en comparación con una estructura humana de ejemplo (por ejemplo IGHV1 -24) . La cadena pesada humanizada 52M51-H4 después se co-transfectó en células HEK.293 con cada una de las ocho cadenas ligeras humanizadas candidato, y el medio de acondicionamiento de nuevo se ensayó para unión de antígeno por ELISA. Se encontró que dos variantes de cadena ligera "2M51 L3 " (SEC ID NO: 26) y "52M51 L4 " (SEC ID NO: 30) exhiben mejor unión que los otros candidatos y se seleccionaron para un estudio adicional . La variante 52 51-L3 contiene, además de las CDR de murino, variación en 1 posición de la estructura en la posición 49 de Kabat en comparación con una estructura humana de ejemplo (por ejemplo, IGLV7-46) . Se desarrollaron dos anticuerpos variantes humanizados, 52 51H4L3 y 52M51H4L4. 52M51H4L3, como se codifica por ADN se depositó con el ATCC, bajo las condiciones del Tratado de Budapest del 15 de Octubre del 2008, y número de designación asignado PTA-9549.

Las afinidades de Notchl humano y de ratón se determinaron utilizando un instrumento Biacore 2000. En resumen, las proteínas de Notchl de humano y ratón recombinantes se inmovilizaron en un chip CM5 utilizando química con base en amina estándar (NHS/EDC) . Se inyectaron diferentes concentraciones del anticuerpo sobre las superficies de la proteína y los datos cinéticos se recolectaron con el tiempo. Los datos se adaptaron utilizando la ecuación de adaptación global simultánea para producir las constantes de disociación (KD, nM) para cada Notchl (Tabla 2) .

Tabla 2 Constantes de disociación IgG (KD) Anticuerpo Notchl humano (nM) Notchl de ratón (nM) 52M51 2.86 NB 52M51H4L3 4.33 NB 52M51H4L4 7.35 NB Ejemplo 3 Señalización del Receptor Notch En ciertas modalidades, se determinó la habilidad de los anticuerpos del receptor Notchl para bloquear la señalización de Notch mediada por ligando. En ciertas modalidades, las células HeLa modificadas para sobre-expresar Notchl (Notchl-HeLa) cultivadas en DMEM complementadas con antibióticos y 10% de FCS se co-transfectaron con 1) luciferasa de luciérnaga pGL4 8X CBS conteniendo un promotor sensible Notch en corriente arriba de un gen reportero de luciferasa de luciérnaga para medir los niveles de señalización Notch en respuesta al ligando DLL4 ; y 2) un reportero de luciferasa Renilla (Promega; Madison, I) como un control interno para la eficiencia de la transfección . Las células transfectadas se agregaron a placas de cultivo recubiertas durante la noche con 200 ng/cavidad de proteína hDLL4-fc, y los anticuerpos a Notchl después se agregaron al medio del cultivo celular. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se midieron los niveles de luciferasa utilizando un kit de ensayo de luciferasa doble (Promega; Madison, WI) con actividad de luciferasa de luciérnaga normalizada para la actividad de luciferasa Renilla. La habilidad de los anticuerpos para inhibir la activación de la trayectoria de Notchl de esta forma se determinó. Los anticuerpos 52M51, 52M63, 52M74, y 52M80, generados contra una región próxima de la membrana del dominio extracelular de un Notchl humano (Fig. 1A) redujeron significativamente la actividad de luciferasa lo que indica que la señalización de Notchl se redujo cuando se compara con los otros anticuerpos Notchl (Fig. IB) . Además, la variante humanizada del anticuerpo 52M51, la variante 52M51 H4/L3 desplegó una potencia similar en la reducción de la actividad de luciferasa (Fig. 1C) .

Activación del Receptor Notch y Formación de IDC La separación de los receptores Notch mediante furina, ADAM, y gamma-secretasa da como resultado la formación del dominio intracelular Notch (ICD) que después activa la señalización de Notch corriente abajo en el núcleo. En ciertas modalidades, la habilidad de los anticuerpos del receptor Notchl para bloquear la activación del receptor mediada por ligando se determinó mediante el análisis Western blot análisis. Las células Notchl-HeLa se cultivaron en cultivo en suspensión en medio 293-SMII media (Gibco) . Las células cultivadas se transfirieron a placas de 96 cavidades en donde las cavidades seleccionadas se habían pre-cubierto con proteína de fusión DLL4-fc humana (2 µg/ml) en DMEM más 2% de FBS y 1 µ? de MG 132 (Calbiochem) . Los anticuerpos a ser generados contra la región próxima de la membrana del dominio extracelular de Notchl humano se agregaron al medio del cultivo celular, y las células se incubaron a 37°C por cinco horas . Las cavidades después se aspiraron y las células de volvieron a suspender en regulador de pH corriente SDS 2X. Las muestras se sonicaron a temperatura ambiente, y después se sometieron a SDS-PAGE y análisis western blot utilizando un anticuerpo específico para el ICD de Notchl separado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Cell Signaling Technology). 52M51 junto con 52M63, 52M74, y 52M80 todos inhibieron significativamente la generación del ICD después de la estimulación del ligando (Fig. ID) .

Ejemplo 4 Prevención del crecimiento de tumor in vivo utilizando anticuerpos del receptor anti-Notch de la región de unión del ligando Las células tumorales de una muestra del paciente que habían cambiado de cultivo como un xenotransplante en ratones se prepararon para inyección en animales experimentales. Los tumores se establecieron en OncoMed Pharmaceuticals adhiriéndose a los procedimientos descritos previamente (Ver, Al-Hajj et al., 2003; Dalerba et al., 2007) e incluyen: UM-PE13 y T3 (células de carcinoma de pecho) , 0MP-C9, OMP-C8, OMP-C6, y Colo-205 (células de tumor de colon) ; y 0MP-PN4 (células de carcinoma pancreático) . El tejido tumoral se removió bajo condiciones estériles, se cortó en pequeñas piezas, se desmenuzó completamente utilizando navajas estériles, y las suspensiones de célula individual se obtuvieron por digestión enzimática y alteración mecánica. Las piezas de tumor resultantes se mezclaron con colagenasa III ultra-pura en medio de cultivo (200-250 unidades de colagenasa por mi) y se incubaron a 37°C por 3-4 horas con mediciones en pipeta hacia arriba y hacia abajo a través de una pipeta de 10 mi cada 15-20 mm. Las células digeridas se filtraron a través de una malla de nailon de 45 ul, se lavaron con RPMI/20% FBS, y lavaron dos veces con HBSS . Las células de tumor disociadas después se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID a las 6-8 semanas para provocar el crecimiento del tumor. Para las células de tumor UM-PE13 y T3 , se inyectaron 50,000 células en 100 ul en la almohadilla de grasa mamaria derecha (n=20) junto con el implante de un gránulo de estrógeno. Para las células de tumor de colon OMP-C9, se inyectaron 50,000 células en 100 ul en la región del costado derecho (n=20) . Para las células de tumor de colon OMP-C8, se inyectaron 10,000 células en 100 en el área del costado derecho (n=10) . Para las células de tumor de colon OMP-C6, se inyectaron 10,000 células en 100 ul en el costado derecho (n=10) . Todas las células tumorales se inyectaron en una mezcla de PBS (sin magnesio o calcio) y BD Matrigel (BD Biosciences) a una relación de 1:1.

Tres días después de la inyección de la célula tumoral, se inició el tratamiento del anticuerpo. Cada animal inyectado recibió 10 mg/kg de anticuerpos anti-Notchl o PBS como un control intraperitoneal (i.p.) dos veces por semana para un total de 6 a 8 semanas. Los animales inyectados con células PE13 recibieron inyecciones en la almohadilla de grasa mamaria superior derecha además de inyecciones de gránulos de estrógeno. Los animales que se inyectaron con células C9, C8, o C6 recibieron inyecciones en el cuadrante inferior derecho del abdomen. El tamaño del tumor se evaluó dos veces a la semana.

En ciertas modalidades, los anticuerpos contra la la región próxima de la membrana del dominio extracelular de Notchl humano se ensayaron para un efecto en la formación de tumores de pecho. Las células de tumor de pecho PE13 (50,000 células por inyección) se implantaron subcutáneamente en las almohadillas de grasa mamarias. Dos días después del implante de la célula, los animales se trataron con ya sea anticuerpo de control o anticuerpos 52M, 52M1, 52M2, y 52 8 (que no tenían la capacidad de la señalización de anti-Notch, ver Fig. IB) a 10 mg/kg dosificado i.p. dos veces por semana. El tratamiento con anticuerpos del inhibidor no de Notchl no tuvieron efecto sobre el crecimiento del tumor comparado con los animales tratados con control (Figs. 2C y 2D) . En ciertas modalidades, los animales inyectados con células de tumor de pecho PE13 se trataron con ya sea anticuerpo de control o 52M51 a 10 mg/kg dosificados i.p. dos veces por semana. El volumen del tumor se midió dos veces semanalmente , y el efecto de 52M51 en el crecimiento del tumor de pecho se determinó .

En modalidades alternativas, las células de tumor disociadas primero se clasificaron en células tumorigénicas y no tumorigénicas con base en los marcadores de superficie celular antes de la inyección en animales experimentales. Específicamente, las células de tumor disociadas como se describe anteriormente se lavaron dos veces con solución de salina regulada en pH de Hepes (HBSS) conteniendo 2% de suero de becerro inactivado con calor (HICS) y se volvieron a suspender a 106 células por 100 ul . Los anticuerpos se agregaron y las células se incubaron por 20 min en hielo seguido por dos lavados con HBSS/2% de HICS. Los anticuerpos incluyen anti-ESA (Biomeda, Foster City, CA) , anti-CD44, anti-CD24, y marcadores de linaje anti-CD2, -CD3, -CD10, CD16, -CD18, -CD31, -CD64, y -CD140b (colectivamente referidos como en Lin; PharMingen, San José, CA) . Los anticuerpos se conjugaron directamente con fluorocromos para positiva o negativamente seleccionar las células que expresan estos marcadores. Las células .de ratón se eliminaron mediante la selección contra células H2Kd+, y las células muertas se eliminaron utilizando el tinte de viabilidad 7AAD . Se llevó a cabo la citometría de flujo en un FACSVantage (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Los perfiles de la difusión lateral y la difusión progresiva se utilizaron para eliminar las aglomeraciones de células. Las células tumorigéncias Lin, ESA+, CD44+, CD24-/baja aisladas, después se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID para provocar el crecimiento del tumor.

Ejemplo 5 Tratamiento in vivo de tumores utilizando anticuerpos del receptor anti-Notchl Las células de tumor de una muestra del paciente (biopsia de tumor sólido o efusión pleural) que habían cambiado de cultivo como un xenotransplante en ratones se prepararon para volver a cambiar de cultivo en animales experimentales. El tejido tumoral se removió, se cortó en pequeñas piezas, se desmenuzó completamente utilizando navajas estériles, y las suspensiones de célula individual se obtuvieron por digestión enzimática y alteración mecánica. Las células de tumor disociadas después se inyectaron subcutáneamente en las almohadillas de grasa mamarias, para tumores de pecho, en el costado, para tumores no de pecho, de ratones NOD/SCID para provocar el crecimiento del tumor. En ciertas modalidades, las células de tumor ESA+, CD44+, CD24-/baja, Lin se aislaron como se describe con detalle anteriormente y se inyectaron.

En ciertas modalidades, las células de tumor de colon C8 recién aisladas (225 células per animal) se implantaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID. Después del a inyección de la célula tumoral, los animales se monitorearon para el crecimiento del tumor. Los tumores se dejaron crecer por 48 días hasta que alcanzaron un tamaño promedio de aproximadamente 210 mm3 y se distribuyeron de forma aleatoria en dos grupos (n=10 por grupo) . Los animales se trataron ya sea con anticuerpo de control o anticuerpo que se une a la región próxima de la membrana del dominio extracelular de Notchl humano, 52M51, (10 mg/kg) dosificado i-P dos veces por semana. El tamaño del tumor se evaluó en los días 55, 57, y 62. Los animales tratados con 52M51 mostraron una inhibición estadísticamente significativa (p=0.0006) del crecimiento del tumor comparada con los animales tratados con control (Fig. 2A y 2B) .

En el punto final de tratamiento con anticuerpo, los tumores se cosecharon para análisis adicional. En algunas modalidades, se analizó una porción del tumor por inmunofluorescencia para evaluar la penetración del anticuerpo en el tumor y la respuesta del tumor. Una porción de cada tumor cosechado de los ratones tratados con el receptor anti -Notchl tratado y tratados con el anticuerpo de control se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido, embebió en O.C.T., y se cortó en un criostato como secciones de 10 um en portaobjetos de vidrio. Alternativamente una porción de cada tumor se fijo en formalina, embebió en parafina, y cortó con un bisturí en secciones de 10 um sobre portaobjetos de vidrio. Las secciones de post-fijaron e incubaron con anticuerpos marcados con cromóforo que específicamente reconocen anticuerpos inyectados para detectar los anticuerpos del receptor anti-Notchl y de control presentes en la biopsia del tumor. Además, los anticuerpos que detectan diferentes tumores y tumores que reclutan tipos de células tales como, por ejemplo, cadherina anti-VE (CD144) o anticuerpos anti-PECAM-1 (CD31) para detectar células endoteliales vasculares, anticuerpos alfa-actina anti -músculo liso que detectan células de músculo liso vasculares, anticuerpos anti-Ki67 para detectar células proliferantes, ensayos TUNEL para detectar células que están muriendo, y anticuerpos del fragmento Notch del dominio anti-intracelular ICD) para detectar la señalización de Notch pueden utilizarse para evaluar los efectos del tratamiento con anticuerpo en angiogénesis , crecimiento de tumor y morfología del tumor.

El efecto del anticuerpo del receptor anti-Notchl en la expresión genética de la célula tumoral también se evaluó. El A N total se extrajo de una porción de cada tumor cosechado de ratones tratados con anticuerpo y control y se utilizó para RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión de Notchl, los componentes de la trayectoria de señalización de Notch incluyendo, también la adición de marcadores de célula madre previamente identificados incluyendo, por ejemplo CD44, se analizó con relación al GAPDH del gen de mantenimiento como un control interno. Los cambios en la expresión genérica de la célula tumoral después de la expresión del tratamiento con el anticuerpo del receptor Notchl de esta forma se determinaron .

Además, se evaluó el efecto del tratamiento con el anticuerpo del receptor anti -Notchl en la presencia de células madre cancerígenas en un tumor. Las muestras de ratones tratados con tumor Notchl contra las de tratados con anticuerpo de control se cortaron en pequeñas piezas, se desmenuzaron completamente utilizando navajas estériles, y las suspensiones de célula individual se obtuvieron por digestión enzimática alteración mecánica. Las células de tumor disociadas después se analizaron por Análisis FACS para la presencia de células madre cancerígenas tumorigénicas con base la expresión del marcador de célula de superficie ESA+, CD44+, CD24-/bajo, Lin como se describe con detalle anteriormente .

La tumorigenicidad de las células aisladas con base en la expresión de ESA+, CD44+, CD24-/bajo, Lin después del tratamiento con anticuerpo anti -Notchl después puede evaluarse. Se volvieron a inyectar subcutáneamente 5,000, 1,000, 500, y 100 células madre cancerígenas aisladas ESA+, CD44+, CD24-/bajo, Lin de ratones tratados con anticuerpo Notchl contra las de ratones tratados con anticuerpo de control en las almohadillas de grasa mamarias de ratones NOD/SCID. De esta forma se determinó la tumorigencidad de las células madre cancerígenas con base en el número de células inyectadas requerido para la formación de tumor consistente.

En contraste a la eficacia in vivo de 52M51, un anticuerpo que inhibe la señalización de Notchl, en un modelo de xenotransplante de colon descrito anteriormente, ciertos otros anticuerpos que reconocen la región próxima de la membrana de Notchl, pero no inhiben la señalización de Notchl, se encontró que no inhiben apreciablemente la señalización de Notch (Ejemplo 3 y Figura IB) , se inyectaron en ratones NOD/SCID que habían sido previamente inyectados con células de tumor de pecho PE13. Cada uno de los anticuerpos 52M1, 52M2, y 52M8 fallaron al efectuar el crecimiento del tumor en el modelo de xenotransplante cuando se comparó con los animales tratados con control (Figura 2C (52M1, 52M2) y Figura 2D (52M8) ) .

Ejemplo 6 Tratamiento de cáncer humano utilizando anticuerpos del receptor anti-Notch Este ejemplo describe métodos para tratar cáncer utilizando anticuerpos contra un receptor Notch para activar tumores que comprenden células madre cancerígenas y/o células de tumor en donde se ha detectado la expresión del receptor Notch.

La presencia de la expresión del marcador de la célula madre cancerígena primero puede determinarse de una biopsia de tumor. Las células de tumor de la biopsia de un paciente diagnosticado con cáncer se removieron bajo condiciones estériles. En algunas modalidades, la biopsia de tumor se congeló fresca en nitrógeno líquido, embebió en O.C.T., y cortó en un criostato como secciones de 10 um sobre portaobjetos de vidrio. Alternativamente la biopsia tisular se fijo con formalina, embebió en parafina, y corto en un micrótomo como secciones de 10 um sobre portaobjetos de vidrio. Las secciones se incubaron con anticuerpos contra un receptor Notch para detectar la expresión de la proteína. Adicionalmente , la presencia de células madre cancerígenas puede determinarse. Las muestras de la biopsia tisular se cortaron en pequeñas piezas, desmenuzaron completamente utilizando navajas estériles, y las células se sometieron a digestión enzimática y alternación mecánica para obtener una suspensión de célula individual. Las células de tumor disociadas después se incubaron con los anticuerpos anti-ESA, -CD44, -CD24, -Lin, y - Notchl para detectar células madre cancerígenas, y la presencia de las células madre de tumor ESA+, CD44+, CD24-/bajo, Lin-, Notch+ se determinó por citometría de flujo como se describe con detalle anteriormente.

Los pacientes con cáncer cuyos tumores se diagnosticaron como expresando un receptor Notch se trataron con anticuerpos del receptor anti-Notch. Los anticuerpos del receptor anti-Notch monoclonales humanizados o humanos generados como se describe anteriormente se purificaron y formularon con un portador farmacéuticamente aceptable en PBS para inyección. Los pacientes se trataron con los anticuerpos Notch una vez por semana durante al menos 10 semanas, pero en ciertos casos una vez por semana durante al menos 14 semanas. Cada administración del anticuerpo deberá ser una dosis farmacéuticamente efectiva de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 mg/ml y en ciertos casos entre aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/ml. El anticuerpo puede administrarse antes de, concurrentemente con, o después de la regímenes de radioterapia estándar o regímenes de quimioterapia utilizando uno o más agentes quimioterapéut icos , tales como oxal iplat ina , f luorouracilo , leucovorin, o estreptozocina . Los pacientes se monitorearon para determinar si tal tratamiento ha dado como resultado una respuesta anti-tumoral, por ejemplo, con base en la regresión del tumor, reducción en las incidencias de nuevos tumores, disminución de la expresión del antígeno, números disminuidos de células madre cancerígenas, u otros medios para evaluar el pronóstico de la enfermedad.

Ejemplo 7 Estudios adicionales de tratamiento de tumores in vivo utilizando anticuerpos del receptor anti-Notchl En una modalidad, se inyectaron células de melanoma M2 (10,000) subcutáneamente en ratones NOD-SCID. Los tumores se dejaron crecer por 35 días hasta que alcanzaron un volumen de aproximadamente 110 mm3. Los ratones con tumores se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos (n=10) y se trataron ya sea con anticuerpo de control o anticuerpo anti-Notchl 52R43. Los anticuerpos de dosificaron dos veces semanalmente a 10 mg/kg. Los volúmenes del tumor se midieron en los días indicados. Como se muestra en la Figura 3A, el tratamiento anti-Notchl con 52R43 redujo el crecimiento del tumor con relación al grupo de control (p=0.02) .

En una modalidad, Las células de tumor de pulmón Lu24 (30,000) se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD-SCID. Los tumores se dejaron crecer por 35 días hasta que alcanzaron un volumen de aproximadamente 205 mm3. Los ratones con tumores se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos (n=8) y se trataron ya sea con anticuerpo de control o anticuerpo anti-Notchl 52R43. Los anticuerpos de dosificaron dos veces semanalmente a 10 mg/kg. Los volúmenes del tumor se midieron en los días indicados. Como se muestra en la Figura 3B, el tratamiento anti-Notchl con 52R43 redujo el crecimiento del tumor con relación al grupo de control (p=0 04) .

En una modalidad, las células de tumor pancreáticas PN8 (50,000) se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD-SCID. Los tumores se dejaron crecer por 27 días hasta que alcanzaron un volumen de aproximadamente 115 mm3. Los ratones con tumor se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos (n=8) y se trataron ya sea con anticuerpo de control o anticuerpo anti-Notchl 52R43. Los anticuerpos de dosificaron dos veces semanalmente a 10 mg/kg. Los volúmenes del tumor se midieron en los días indicados. Como se muestra en la Figura 3C, el tratamiento anti-Notchl con 52R43 redujo el crecimiento del tumor con relación al grupo de control (p=0.005).

En una modalidad, las células de tumor de pecho TI (300,000) se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD-SCID. Los tumores se dejaron crecer por 27 días hasta que alcanzaron un volumen de aproximadamente 130 mm3. Los ratones con tumores se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos (n=10) y se trataron ya sea con anticuerpo de control, anti-Notchl 52R43, taxol , o una combinación de 52R43 y taxol . Los anticuerpos de dosificaron una vez semanalmente a 15 mg/kg y el taxol se dosificó una vez a la semana a 12 mg/kg. Los volúmenes del tumor se midieron en los días indicados . Como se muestra en la Figura 3D, el tratamiento anti-Notchl con 52R43 -redujo el crecimiento del tumor con relación al grupo de control (p<0 0001) , y el grupo de combinación se redujo con relación a taxol sólo (p=0.001) Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior se incorporan en la presente por referencia. Varias modificaciones y variaciones del método y sistema descritos de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención ha sido descrita en conexión con modalidades específicas, debe entenderse que la invención como se reivindica no deberá limitarse indebidamente a tales modalidades específicas. Ciertamente, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para los expertos en los campos relevantes pretenden estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

SECUENCIAS SEC ID NO: 1 Notchl Polinucleótido que codifica los aminoácidos 1427-1732.

CACATCCTGGACTACAGCTTCGGGGGTGGGGCCGGGCGCGACATCCCCCCGCCGCTGATC GAGGAGGCGTGCGAGCTGCCCGAGTGCCAGGAGGACGCGGGCAACAAGGTCTGCAGCCTG CAGTGCAACAACCACGCGTGCGGCTGGGACGGCGGTGACTGCTCCCTCAACTTCAATGAC CCCTGGAAGAACTGCACGCAGTCTCTGCAGTGCTGGAAGTACTTCAGTGACGGCCACTGT GACAGCCAGTGCAACTCAGCCGGCTGCCTCTTCGACGGCTTTGACTGCCAGCGTGCGGAA GGCCAGTGCAACCCCCTGTACGACCAGTACTGCAAGGACCACTTCAGCGACGGGCACTGC GACCAGGGCTGCAACAGCGCGGAGTGCGAGTGGGACGGGCTGGACTGTGCGGAGCATGTA CCCGAGAGGCTGGCGGCCGGCACGCTGGTGGTGGTGGTGCTGATGCCGCCGGAGCAGCTG CGCAACAGCTCCTTCCACTTCCTGCGGGAGCTCAGCCGCGTGCTGCACACCAACGTGGTC TTCAAGCGTGACGCACACGGCCAGCAGATGATCTTCCCCTACTACGGCCGCGAGGAGGAG CTGCGCAAGCACCCCATCAAGCGTGCCGCCGAGGGCTGGGCCGCACCTGACGCCCTGCTG GGCCAGGTGAAGGCCTCGCTGCTCCCTGGTGGCAGCGAGGGTGGGCGGCGGCGGAGGGAG CTGGACCCCATGGACGTCCGCGGCTCCATCGTCTACCTGGAGATTGACAACCGGCAGTGT GTGCAGGCCTCCTCGCAGTGCTTCCAGAGTGCCACCGACGTGGCCGCATTCCTGGGAGCG CTCGCCTCGCTGGGCAGCCTCAACATCCCCTACAAGATCGAGGCCGTGCAGAGTGAGACC GTGGAGCCGCCCCCGCCG SEC ID NO: 2 Aminoácidos Notchl 1427-1732 HILDYSFGGGAGRDIPPPLIEEACELPECQEDAGNKVCSLQCNNHACGWDGGDCSLNFND PWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQRAEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHC DQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLWWLMPPEQLR SSFHFLRELSRVLHTNW FKRDAHGQQMIFPYYGREEELRKHPIKRAAEGWAAPDALLGQVKASLLPGGSEGGRRRRE LDPMDVRGSIVYLEIDNRQCVQASSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVQSET VEPPPP Secuencias del anticuerpo 52M51 de ratón; SEC ID NO: 3 52 51 Secuencia de polinucleótido de cadena ligera (La secuencia de señal putativa está subrayada) ATGGCCTGGATTTCACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAG GCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACT TGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAAAAA CCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCT GCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAG ACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGT GGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGCCAGCCCAAGTCTTCGCCATCAGTCACCCTGTTT CCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGACTAACAAGGCCACACTGGTGTGTACGATCACTGAT TTCTACCCAGGTGTGGTGACAGTGGACTGGAAGGTAGATGGTACCCCTGTCACTCAGGGT ATGGAGACAACCCAGCCTTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACATGGCTAGCAGCTACCTG ACCCTGACAGCAAGAGCATGGGAAAGGCATAGCAGTTACAGCTGCCAGGTCACTCATGAA GGTCACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGACTGTTCCTAG SEC ID NO: 4 52M51 Secuencia de aminoácido de cadena ligera (La secuencia de señal putativa está subrayada) MAWISLILSLLALSSGAISQAWTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEK PDHLFTGLIGGTN RAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFG GGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPG TVDWKVDGTPVTQG METTQPSKQS NKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS SEC ID NO: 5 52M51 Secuencia de polinucleótido de la región variable de cadena ligera (La secuencia de señal putativa está subrayada) ATGGCCTGGATTTCACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAG GCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACT TGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAAAAA CCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCT GCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAG ACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGT GGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGC SEQID NO: 6 52M51 Secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera (La secuencia de señal putativa está subrayada) MAWISLILSLLALSSGAISQAWTQE5ALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEK PDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFG GGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGWTVDW VDGTPVTQG SEC ID NO: 7 52M51 Secuencia de polinucleótido de la región variable de cadena ligera sin secuencia de señal putativa CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTC ACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAA AAACCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTT CCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCA CAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTC GGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGC SEC ID NO: 8 52M51 Secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera sin secuencia de señal putativa QAWTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYAN QEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGV PARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 9 52 51 Secuencia de polinucleótido de cadena pesada (La secuencia de señal putativa está subrayada) ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAG GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCC TGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGGCCT 5 GGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTACAAT GAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCAACATG CAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGATGGT AACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCCTCA GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAAC o TCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACC TGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGAC CTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTC ACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGG GATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTC 5 CCCCCAAAGCCCAAGGATGTCCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTG GTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAG GTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTC AGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTC AACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATATCCAAAACCAAAGGCAGACCG O AAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTC AGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATAACAGTGGAGTGGCAGTGG AATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCT TACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTC ACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCAC 5 TCTCCTGGTAAATGA SEC ID NO: 10 52M51 Secuencia de aminoácido de cadena pesada (La secuencia de señal putativa está subrayada) ME TWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGYWIEWIKQRP GHGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGKATFTADTSSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCARFDG NYGYYAMDY GQGSSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVT WNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASST VDKKIVPR DCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVL ITLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVE VHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRP KAPQVYTI PPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGS YFVYSKLNVQKSN EAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK SEC ID NO: 11 52M51 Secuencia de polinucleótido de la región variable de cadena pesada (La secuencia de señal putativa está subrayada) ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAG GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCC TGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGGCCT GGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTACAAT GAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCAACATG CAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGATGGT AACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCCTCA SEC ID NO: 12 52M51 Secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada (La secuencia de señal putativa está subrayada) MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGYWIEWIKQRP GHGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGKATFTADTSSNTA MQLSSLTSEDSAVYYCARFDG NYGYYAMDY GQGSSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVT SEC ID NO: 13 52M51 Secuencia de polinucleótido de la región variable de cadena pesada sin secuencia de señal putativa CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATA TCCTGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGG CCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTAC AATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCAAC ATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGAT GGTAACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCC TCA SEC ID NO: 14 52 51 Secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada sin secuencia de señal putativa QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGY IE IKQRPGHGLEWIGQILPGTGRTNY NEKFKGKATFTADTSSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCARFDGNYGYYA DYWGQGSSVTVS SA SEC ID NO: 15 52M51 CDR1 de cadena pesada RGY IE SEC ID NO: 16 52M51 CDR2de cadena pesada QILPGTGRTNYNEKFKG SEC ID NO: 17 52M51 CDR3de cadena pesada FDGNYGYYAMDY SEC ID NO: 18 52M51 CDR1 de cadena ligera RSSTGAVTTSNYAN SEC ID NO: 19 52M51 CDR2 de cadena ligera GTNNRAP SEC ID NO: 20 52M51 CDR3 de cadena ligera ALWYSNHWVFGGGTKL Secuencias 52 51 humanizadas: SEC ID NO: 21 52M51-H4 Secuencia de polinucleótido de cadena pesada (la secuencia de señal putativa está subrayada) ATGGATTGGACATGGAGGGTGTTCTGCCTCCTCGCTGTGGCTCCTGGAGTCCTGAGCCAG GTCCAGCTCGTCCAGAGCGGGGCTGAAGTCAAGAAGCCTGGCGCTAGCGTCAAAATCAGC TGTAAGGTCAGCGGATACACACTGAGGGGATACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCA GGAAAGGGCCTGGAATGGATCGGCCAGATCCTGCCTGGAACCGGAAGGACAAATTACAAT GAGAAGTTTAAGGGAAGGGTCACAATGACAGCAGACACAAGCACAGACACAGCTTATATG GAACTCAGCTCCCTCAGATCCGAGGACACCGCTGTCTACTATTGTGCCAGGTTCGATGGA AATTACGGATACTATGCCATGGATTACTGGGGACAGGGGACAACGGTCACCGTGAGCTCA GCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAG AGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACC TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGC AAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGG CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEC ID NO: 22 52M51 H4 Secuencia de aminoácido de cadena pesada (Secuencia de señal putativa subrayada) MDWTWRVFCLLAVAPGVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTLRGYWIEWVRQAP GKGLE IGQILPGTGRTNY EKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDG NYGYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC VDHKPSNTKYDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPE NYKTTPPMLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQG VFSCSV HEALHNHYTQKSLSLSPGK SEC ID NO: 23 52M51-H4 Secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada (secuencia dé señal putativa subrayada) MD TWRVFCLLAVAPGVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTLRGYWIEWVRQAP GKGLEWIGQILPGTGRTNY EKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDG NYGYYAMDYWGQGTTVTVSSA SEC ID NO: 24 52M51-H4 Secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada sin secuencia de señal putativa QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTLRGYWIEWVRQAPGKGLEWIGQILPGTGRTNY NEKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGTTVTVS SA SEC ID NO: 25 52M51-L3 Secuencia de polinucleótido de cadena ligera (La secuencia de señal putativa está subrayada) ATGAGCGTCCCTACAATGGCTTGGATGATGCTCCTGCTGGGACTCCTGGCTTATGGAAGC GGAGTGGATAGCCAGGCCGTCGTCACACAGGAACCTAGCCTCACCGTTAGCCCTGGAGGA ACAGTCACACTGACCTGTAGGAGCTCCACAGGAGCTGTGACAACAAGCAATTACGCTAAC TGGTTCCAGCAGAAGCCCGGTCAAGCCCCTAGAACCCTCATCGGCGGCACCAATAACAGA GCTCCCGGAGTCCCCGCCAGGTTCTCCGGCTCCCTCCTGGGTGGCAAGGCTGCTCTGACA CTCAGCGGTGCCCAGCCAGAGGATGAAGCGGAGTACTACTGTGCACTGTGGTACAGCAAC CATTGGGTTTTCGGAGGCGGAACAAAGTTAACCGTCCTCGGGCAGCCTAAGGCTGCTCCT AGCGTCACACTGTTCCCCCCATCTAGCGAGGAGCTGCAGGCTAACAAGGCAACCCTCGTC TGCCTGGTTAGCGACTTCTACCCTGGCGCTGTCACAGTGGCCTGGAAAGCTGACGGCTCC CCTGTGAAAGTTGGCGTCGAAACCACAAAGCCTTCTAAGCAGAGCAATAATAAATATGCC GCAAGCTCCTACCTCTCCCTGACTCCTGAGCAGTGGAAAAGCCATAGGAGCTACTCCTGC CGGGTCACACACGAAGGAAGCACAGTGGAAAAGACAGTCGCCCCTGCTGAGTGTAGCTGA SEC ID NO: 26 52M51-L3 Secuencia de aminoácido de cadena ligera (La secuencia de señal putativa está subrayada) SVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYAN WFQQKPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAE YYCAL YSN HWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQA KATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGS PVKVGVETTKPSKQS KYAASSYLSLTPEQ KSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS SEC ID NO: 27 52M51-L3 Secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera (La secuencia de señal putativa está subrayada) MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYAN WFQQKPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSN HWVFGGGTKL VLG SEC ID NO: 28 52M51-L3 Secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera SGVDSQAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQQKPGQAPRTLIGGTNN RAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG SEC ID NO: 29 52M51-L4 Secuencia de polinucleótido de cadena ligera (La secuencia de señal putativa está subrayada) ATGAGCGTCCCTACAATGGCTTGGATGATGCTCCTGCTGGGACTCCTGGCTTATGGAAGC GGAGTGGATAGCCAGACCGTCGTCACACAGGAACCTAGCTTTTCCGTTAGCCCTGGAGGA ACAGTCACACTGACCTGTAGGAGCTCCACAGGAGCTGTGACAACAAGCAATTACGCTAAC TGGTATCAGCAGACTCCCGGTCAAGCCCCTAGAACCCTCATCGGCGGCACCAATAACAGA GCTCCCGGAGTCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCATCCTGGGAAATAAAGCTGCTCTGACA ATCACAGGTGCCCAGGCTGACGATGAAAGCGACTACTACTGTGCACTGTGGTACAGCAAC CATTGGGTTTTCGGAGGCGGAACAAAGTTAACCGTCCTCGGGCAGCCTAAGGCTGCTCCT AGCGTCACACTGTTCCCCCCATCTAGCGAGGAGCTGCAGGCTAACAAGGCAACCCTCGTC TGCCTGGTTAGCGACTTCTACCCTGGCGCTGTCACAGTGGCCTGGAAAGCTGACGGCTCC CCTGTGAAAGTTGGCGTCGAAACCACAAAGCCTTCTAAGCAGAGCAATAATAAATATGCC GCAAGCTCCTACCTCTCCCTGACTCCTGAGCAGTGGAAAAGCCATAGGAGCTACTCCTGC CGGGTCACACACGAAGGAAGCACAGTGGAAAAGACAGTCGCCCCTGCTGAGTGTAGCTGA SEC ID NO: 30 52M51-L4 Secuencia de aminoácido de cadena ligera (La secuencia de señal putativa está subrayada) MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQTWTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA WYQQTPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPDRFSGS ILGNKAAL I GAQADDESDYYCALWYSN HWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGS PVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ KSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS SEQ ID NO: 31 52M51-L4 Secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera (La secuencia de señal putativa está subrayada) MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQTWTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYAN YQQTPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSN HWVFGGGTKLTVLG SEC ID NO: 32 52M51-L4 Secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera sin secuencia de señal putativa SGVDSQT TQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNY A WYQQTPGQAPRTLIGGTNN RAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCAL YSNHWVFGGGTKLTVLG Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo aislado que específicamente se une a la región próxima de membrana de unión no de ligando de un dominio extracelular de Notchl humano, caracterizado porque comprende : (a) una CDRl de cadena pesada que comprende RGYWIE (SEC ID NO: 15) ; una CDR2 de cadena pesada que comprende QILPGTGRTNYHEKFKG (SEC ID NO: 16); y una CDR3 de cadena pesada que comprende FDGNYGYYAMDY (SEC ID NO: 17) ; y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RSSTGAVTTNSYAN (SEC ID NO: 18) ; una CDR2 de cadena ligera que comprende GTNNRAP (SEC ID NO: 19) ; y una CDR3 de cadena ligera que comprende ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID NO: 20) .

2. Un anticuerpo aislado que específicamente se une a la región próxima de membrana de unión no de ligando de un dominio extracelular de Notchl humano, caracterizado porque comprende : (a) una región variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 24; y/o (b) una región variable de cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 28 o SEC ID NO: 32.

3. Un anticuerpo aislado que específicamente se une a la región próxima de membrana de unión no de ligando de un dominio extracelular de Notchl humano, caracterizado porque comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende SEC ID NO: 24, y (b) una región variable de cadena ligera que comprende SEC ID NO: 28.

4. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es un anticuerpo recombinante , un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespeclfico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, o un fragmento de anticuerpo.

5. Un anticuerpo monoclonal aislado caracterizado porque comprende las mismas regiones variables de cadena pesada y ligera como las codificadas por el plásmido en el depósito como Designación de Depósito de Patente ATCC PTA-9549.

6. Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque se produce por la línea celular de hibridoma en la Designación de Depósito de Patente ATCC PTA-9405.

7. Un anticuerpo caracterizado porque compite por la unión específica a una región próxima de membrana de unión no de ligando del dominio extracelular del Notchl humano con un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una molécula de polinucleótido caracterizadA porque comprende el anticuerpo que codifica el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Una célula caracterizada porque comprende la molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9 o para producir el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. El uso del anticuerpo conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.