ES2541726T3

ES2541726T3 - Anticuerpos anti-Notch2 y métodos de uso

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Publication number: ES2541726T3
Application number: ES09793181.0T
Authority: ES
Inventors: Christian W. Siebel; Yan Wu
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2008-10-01
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2015-07-23
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: AR073717A1; RU2011117237A; CA2736429A1; US20170204175A9; JP2015145379A; US20100080808A1; JP2012504634A; CL2011000711A1; ZA201101651B; US20180057589A1; JP5710487B2; MX2011002928A; RU2580029C2; CN102170909A; IL211623A0; CN102170909B; WO2010039832A1; EP2334331B1; US8404239B2; EP2334331A1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une al dominio de Repetición de Lin12/Notch (LNR)-A y al dominio de heterodimerización (HD)-C de la región reguladora negativa (NRR) de Notch2 e inhibe la actividad de Notch2, en el que el anticuerpo se une a NRR de Notch2 de ser humano y ratón con una Kd de < 10 nM y en el que el anticuerpo comprende una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado entre las SEC ID Nº: 1-2; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4; una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5; una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº: 6-9; una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº: 11-13; y una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº: 15-18.

Description

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PRIMATIZED® en los que la región de unión a antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido mediante, por ejemplo, inmunización de macacos con el antígeno de interés.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una mínima parte de la secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. En una realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en el que los restos de una HVR del receptor se sustituyen por restos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como de ratón, ratas, conejo o un primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por restos correspondientes no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones pueden efectuarse para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de la región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véase también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998). Harris, Biochem. Soc. Transaction 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994) y las Patentes de los Estados Unidos Nos 6.982.321 y 7.087.409.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde con aquella de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha producido usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos tal como se divulgan en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente a un anticuerpo humanizado que comprende restos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden preparar usando varias técnicas conocidas en la materia, incluyendo bibliotecas de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los métodos descritos en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Véase también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos humanos pueden prepararse administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a exposición antigénica, pero cuyos locus endógenos se han deshabilitado, por ejemplo, "xenoratones" inmunizados (véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nº 6.075.181 y 6.150.584 referentes a la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) referente a anticuerpos humanos generados mediante una tecnología de hibridoma de células

B.

La expresión "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando se usa en el presente documento se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis HVR, tres en la VH (H1, H2, H3), y tres en la VL (L1, L2, L3). En los anticuerpos nativos, H3 y L3 muestran la mayor diversidad de las seis HVR, y se cree que H3 en particular juega un papel único, confiriendo una especificidad fina a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De hecho, los anticuerpos de camélido de origen natural que consisten solo en una cadena pesada son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

Se usan y están abarcadas en el presente documento una serie de delineaciones de HVR. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las que se usan más comúnmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia, por su parte, se refiere a la localización de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las HVR de AbM representan un compromiso entre las HVR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan por el programa informático de modelado de anticuerpos Oxford Molecular's AbM. Las HVR de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los restos de cada una de estas HVR se indican a continuación.

Bucle Kabat AbM Chothia Contacto 5

L1: L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2: L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3: L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1: H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B

(Numeración de Kabat)

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(Numeración de Chothia)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

Las HVR pueden comprender "HVR extendidas" del modo siguiente: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en la VH. Los restos del dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., anteriormente citado, para cada una de estas definiciones.

Los restos "marco conservados" o "FR" son aquellos restos del dominio variable distintos de los restos de la HVR, tal como se definen en el presente documento.

Las expresiones "numeración de restos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posición de aminoácidos como en Kabat" y variantes de las mismas se refieren al sistema de numeración usado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la complicación de anticuerpos en Kabat et al., anteriormente citado. Usando este sistema de numeración, la secuencia lineal de aminoácidos real puede contener menos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de, o a una inserción en, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una sola inserción de aminoácido (resto 52a de acuerdo con Kabat) después del resto 52 de H2 y restos insertados (por ejemplo, los restos 82a, 82b, y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del resto 82 de la FR de cadena pesada. La numeración de restos de Kabat puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "patrón".

El sistema de numeración de Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un resto en el dominio variable (aproximadamente los restos 1-107 de la cadena ligera y los restos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). El "sistema de numeración EU" o "índice EU" se usa generalmente cuando se hace referencia a un resto en una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU comunicado en Kabat et al., anteriormente citado). El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de restos del anticuerpo EU de IgG1. A menos que se afirme lo contrario en el presente documento, las referencias a los números de resto en el dominio variable de los anticuerpos significan la numeración de restos mediante el sistema de numeración de Kabat. A menos que se afirme lo contrario en el presente documento, las referencias a los números de resto en el dominio constante de los anticuerpos significan la numeración de restos mediante el sistema de numeración EU (por ejemplo, véase la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº US 2008/0181888 A1, Figures for EU numbering).

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más HVR del mismo que dan como resultado una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee dichas alteraciones. En una realización, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad pueden producirse usando determinados procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante reordenamiento de los dominios VH y VL. La mutagénesis al azar de restos de HVR y/o marco conservados se describe por, por ejemplo, Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995). Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Un anticuerpo "bloqueante" o "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Algunos anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas inhiben de forma sustancial o completa la actividad del antígeno.

Un "anticuerpo agonista", tal como se usa en el presente documento, es un anticuerpo que imita parcial o totalmente al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

Los anticuerpos "inhibidores del crecimiento" son aquellos que evitan o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al que se une el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede prevenir o reducir la proliferación de células cancerosas in vitro y/o in vivo.

Los anticuerpos que "inducen la apoptosis" son aquellos que inducen la muerte celular programada según se determina mediante ensayos de apoptosis convencionales, tales como unión de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación del retículo endoplasmático, fragmentación celular, y/o formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptóticos).

Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de secuencia de aminoácidos variante) de un anticuerpo, y varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: Unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); unión a receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de

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anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y activación de células B. La expresión "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, se ha definido que la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde un resto de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo terminal de la misma. La lisina C-terminal (resto 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o diseñando por ingeniería genética el ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los restos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos sin restos K447 eliminados, y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el resto K447.

Una "región Fc funcional" posee una "función efectora" de una región Fc de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen unión a C1q; CDC; unión a receptor Fc; ADCC; fagocitosis; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras necesitan generalmente que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo., un dominio variable de anticuerpo) y puede evaluarse usando diversos ensayos tal como se divulgan, por ejemplo, en las definiciones del presente documento.

Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia nativa (alotipos no-A y A); región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa así como variantes de origen natural de las mismas.

Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de una región Fc de secuencia nativa a causa de la modificación de al menos un aminoácido, preferentemente una o más sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido parental, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido parental. La región Fc variante del presente documento poseerá preferentemente al menos aproximadamente un 80 % de homología con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido parental, y más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de homología con esta, más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % con esta.

Un "receptor de Fc" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un FcR es un FcR humano nativo. En algunas realizaciones, un FcR es uno que se une a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRN, yFcγRIN, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativo de aquellos receptores. Los receptores FcγRN incluyen FcγRNA (un "receptor activante") y FcγRNB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activante FcγRNA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcγRNB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Véase, por ejemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo aquellos que se identifiquen en el futuro, están abarcados por el término "FcR" del presente documento.

La expresión "receptor de Fc" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG de la madre al feto (Guyer et al, J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y de la regulación de la homeostasis de las inmunoglobulinas. Se conocen métodos para medir la unión a FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); documento WO 2004/92219 (Hinton et al.).

Pueden ensayarse la unión a FcRn humano in vivo y la semivida en suero de polipéptidos de unión de alta afinidad a FcRn humano, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se administran los polipéptidos con una región Fc variante. El documento WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a los FcR. Véase también, por ejemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y llevan a cabo funciones efectoras. En determinadas realizaciones, las células expresan al menos FcγRIII y llevan a cabo funciones efectoras de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC),

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linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos, y neutrófilos. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de la sangre. "La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que una Ig unida a receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, células NK, neutrófilos, y macrófagos) permiten a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana que porta un antígeno y posteriormente eliminar a la célula diana con citotoxinas. Las células principales para mediar la ADCC, las células NK, solo expresan FcγRIN, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRN, y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, puede efectuarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.500.362 o 5.821.337 o en la Patente de Estados Unidos Nº 6.737.056 (Presta). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen PBMC y células NK. Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia de complemento. La activación de la ruta clásica de complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase adecuada), que están unidos a su antígeno afín. Para determinar la activación de complemento, puede efectuarse un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Las variantes de polipéptido con secuencias de aminoácidos de región Fc alteradas (polipéptidos con una región Fc variante) y capacidad de unión a C1q aumentada

o disminuida se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.194.551 y en el documento WO 1999/51642. Véase también, por ejemplo, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

La expresión "anticuerpo que comprende región Fc" se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fc. La lisina C-terminal (resto 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la purificación del anticuerpo o mediante ingeniería genética recombinante del ácido nucleico que codifica al anticuerpo. Por consiguiente, una composición que comprende un anticuerpo que tiene una región Fc de acuerdo con la presente invención puede comprender un anticuerpo con K447, con todos los K447 eliminados, o una mezcla de anticuerpos con y sin el resto K447.

La "afinidad de unión" se refiere generalmente a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en el presente documento, la "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de una pareja de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su ligando Y se puede representar en general por su constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo aquellos descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen lentamente al antígeno y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen generalmente al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos más tiempo. Se conocen en la técnica una diversidad de métodos para medir la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente invención. Las realizaciones específicas ilustrativas y ejemplares para medir la afinidad de unión se describen a continuación.

En una realización, la "Kd" o el "valor de Kd" se mide mediante un ensayo de unión con antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno tal como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión en solución de los Fab por su antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con 125I en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, y a continuación capturar el antígeno unido con una placa revestida de anticuerpo contra Fab (véase, por ejemplo, Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones del ensayo, se recubren durante toda una noche placas multipocillo MICROTITER® (Thermo Scientific) con 5 mg/ml de un anticuerpo de captura anti-Fab (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9,6), y posteriormente se bloqueó con albúmina de suero bovino al 2 % (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc Nº 269620), se mezclan 100 pM o 26 pM de [125I]-antígeno con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, coherente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés se incuba entonces durante toda una noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurarse de que se alcanza el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación se elimina la solución y la placa se lava ocho veces con TWEEN-20™ al 0,1 % en PBS. Cuando se secan las placas, se añaden 150 μl/pocillo de centelleante (MICROSCINT-20™; Packard), y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan una unión menor o igual al 20 % de la máxima se seleccionan para su uso en ensayos de unión competitiva.

De acuerdo con otra realización, se mide la Kd o el valor de Kd usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIACORE®-2000 o BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con antígeno inmovilizado en microplacas CM5 a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan microplacas de

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solo se mantienen las propiedades deseadas. Pueden llevarse a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/eliminación de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcγR (careciendo análogamente de actividad ADCC), pero que mantiene la capacidad de unión a FcRn. Las células principales para mediar la ADCC, las células NK, solo expresan FcγRNI, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRN y FcγRNI. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC en una molécula de interés se han descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I., et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985);

5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Como alternativa, pueden emplearse métodos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a C1q y por tanto carece de actividad CDC. Para determinar la activación de complemento, puede efectuarse un ensayo de citotoxicidad (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Las determinaciones de la unión a FcRn y del aclaramiento/semivida in vivo también se pueden llevar a cabo usando métodos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

Se proporcionan otras variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. En la Tabla 1 se muestran sustituciones conservativas bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Los cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" se proporcionan en la Tabla 1, o tal como se describe adicionalmente a continuación en referencia a clases de aminoácidos. Pueden introducirse sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y explorarse los productos, por ejemplo, para una actividad deseada, tal como unión a antígeno mejorada, inmunogenicidad disminuida, ADCC o CDC mejoradas, etc.

TABLA 1

Resto original: Sustituciones ejemplares Sustituciones preferidas

Ala (A): Val; Leu; Ile Val

Arg (R): Lys; Gln; Asn Lys

Asn (N): Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln

Asp (D): Glu; Asn Glu

Cys (C): Ser; Ala Ser

Gln (Q): Asn; Glu Asn

Glu (E): Asp; Gln Asp

Gly (G): Ala Ala

His (H): Asn; Gln; Lys; Arg Arg

Ile (I): Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu

Leu (L): Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile

Lys (K): Arg; Gln; Asn Arg

Met (M): Leu; Phe; Ile Leu

Phe (F): Trp; Leu; Val; He; Ala; Tyr Tyr

Pro (P): Ala Ala

Ser (S): Thr Thr

Thr (T): Val; Ser Ser

Trp (W): Tyr; Phe Tyr

Tyr (Y): Trp; Phe; Thr; Ser Phe

Val (V): Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

Las modificaciones en las propiedades biológicas de un anticuerpo pueden lograrse seleccionando sustituciones que afectan a (a) la estructura del armazón polipeptídico en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación

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Claims

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15. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el anticuerpo es humano, humanizado, o quimérico.
16.

Un método para inhibir la actividad de Notch2 in vitro, comprendiendo el método exponer a una célula que expresa 5 Notch2 a un anticuerpo como en cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
17. Un anticuerpo como en cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para su uso como medicamento.
18.

Un anticuerpo como en cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para su uso en el tratamiento de una neoplasia de 10 células B.
19. Un anticuerpo como en cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para su uso en el tratamiento del melanoma.

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