KR101535219B1

KR101535219B1 - Ｎｏｔｃｈ３에 대한 인간 단일클론항체

Info

Publication number: KR101535219B1
Application number: KR1020110121216A
Authority: KR
Inventors: 정주연; 정봉현; 김혜란; 홍효정
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2015-07-09
Also published as: KR20130055462A

Abstract

본 발명은 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 암세포에서 특이적으로 과발현되는 Notch 3을 특이적으로 타겟팅할 수 있는 인간 단일클론항체에 관한 것이다.
본 발명에 따른, Notch 3 인간 단일클론항체는 암세포에서 특이적으로 과발현되는 Notch 3을 특이적으로 타겟팅할 수 있도록 파아지디스플레이를 통해 인간항체 라이브러리에서 스크리닝되어, 마우스에서 만들어진 단일항체에서 요구되는 인간화과정이 필요하지 않고 바로 인간에 적용할 수 있어, 암 진단 및 치료용 항체로 용이하게 활용할 수 있다.

Description

Ｎｏｔｃｈ３에 대한 인간 단일클론항체{Human Monoclonal Antibody against Notch 3}

본 발명은 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 암세포에서 특이적으로 과발현되는 Notch 3을 특이적으로 타겟팅할 수 있는 인간 단일클론항체에 관한 것이다.

단클론 항체(monoclonal antibody)를 만들어내는 기술이 개발된 이래로 이를 질병의 진단이나 치료에 이용하려는 시도가 지속적으로 이어져 왔다. 그에 따라 진단용 단클론 항체의 경우에는 이미 많은 제품이 개발되어 판매되고 있으나, 치료용 단클론 항체의 경우 여러 가지 제약 조건 때문에 제품화가 늦어지고 있는데, 그 중의 하나가 바로 인체의 면역반응이다.

항체 치료제의 개발은 면역원성을 줄이는 방향으로 진행되어 왔다. 가장 먼저 상업화에 성공한 Orthoclone-OKT3 은 신장이식의 거부반응을 억제하는 면역억제제로 마우스 서열을 가지고 있는 마우스 항체이다. 마우스 항체가 유발할 수 있는 HAMA (human anti-mouse antibody) 반응을 줄이기 위하여 항체의 variable domain의 서열을 제외한 나머지 서열은 인간서열을 포함하고 있는 chimeric antibody가 개발 되었고, CDR (complementarity determining region)을 제외한 나머지 서열이 모두 인간서열을 보유하고 있는 humanized antibody가 순차적으로 개발되었다.

이 기술이 개발된 이래 현재까지 약 10개의 인간화 항체 치료제가 FDA 승인을 받게 되었고 현재 암 및 자가면역질환의 치료제와 바이러스 감염 예방제로 사용되고 있으며, 특히 Her2 결합항체인 Herceptin과 VEGF 중화항체인 Avastin은 암치료제로서 blockbuster 항체 제품이다.

이와 같이 생쥐에서 유래한 항체를 조작하여 최대한 인간 항체와 유사하도록 바꾸어 주는 방법 외에도 아예 인간의 항체서열을 가진 인간 단클론 항체(fully human monoclonal antibody)를 제조하려는 노력도 이루어지고 있다.

완전인간항체를 개발하는 방법은 크게 phage display를 이용하는 방법과 transgenic mouse를 이용하는 방법이 있는데, 기존에 개발된 인간항체기술 중 Cambridge Antibody Technolgy (CAT)와 Dyax등이 보유하고 있는 Phage display 기술은 phage coat protein을 구성하는 pIII 단백질의 일부분에 CDR 서열을 포함하고 있는 항체 단편이 발현되도록 유전자 조작하여 특정 항원에 결합하는 항체 단편을 찾는 방법이며, 반면에 Medarex와 Abgenix등이 보유하고 있는 transgenic mouse 기술은 mouse 항체 발현 유전자를 인간 항체 발현 유전자로 치환시킨 형질전환 mouse를 이용하는 방법이다. VEGFR-2의 항체를 예로 볼 때, Tanibirumab은 phage display 기술을 이용하여 개발된 완전인간항체로 현재 개발되고 있는 다른 VEGFR-2 중화항체와 가장 큰 차이점은 mouse/rat VEGFR-2에 반응한다는 것이며, 현재 개발되고 있는 Imclone사의 Ramucirumab 이나, UCB pharma의 CDP-791의 경우는 모두 mouse의 VEGFR-2와 결합하지 못한다. 따라서, 이 두 개의 항체는 동물모델을 이용한 효과를 제대로 평가하기가 어려운 반면, Tanibirumab의 마우스 VEGFR-2에 대한 결합능력은 동물모델에서의 신생혈관억제 효과를 평가할 수 있다. 이러한 특징은 임상시험개발 과정에서 Tanibirumab에 가장 적절한 indication을 선정하는데 큰 도움이 될 것으로 기대하고 있다. 그 외에 파지 디스플레이 방법에 의하여 제조된 인간 단일클론항체는 TNF-α에 대한 항체(adalimumab, 상품명 Humira)로서 2002년 FDA의 승인을 받아 관절염 치료제로 사용되고 있는 강력한 항체 제품이다.

Notch 신호전달은 진화적으로 잘 보존된 신호전달 체계로 세포 결정, 분화, 증식 및 사멸을 조절하는 것으로 알려져 있으며, Notch 단백질은 단일 막관통 단백질로 세포표면 수용체와 핵 전사조절제의 역할을 한다. Notch 유전자는 초파리 표현형 연구시 초파리 날개끝에 홈(notches)이 있는 것을 발견하고 그와 관련된 유전자를 Notch로 명명하면서 처음 발견되었다. 포유동물은 네 개의 Notch를 가지고 있으며(Notch 1, 2, 3, 4), 각각의 Notch는 300-350 kDa 크기의 단백질로 합성되며 골지체에서 furin-like convertase에 의해 S1 자리가 잘리면서 세포표면에서 heterodimer를 형성한다.

활성화된 Notch 신호전달은 여러 암 모델에서 종양형성을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Wang Z. et al., Anticancer Res., 28:3621, 2008; Santagata S. et al., Cancer Res., 1;64:6854, 2004). 종양형성 과정과 배아 기관 발달은 유사한 방법으로 일어날 것이라는 가설이 있으며, 활성 Notch인 NICD를 쥐의 조혈세포에 발현시켰더니 T-cell leukemia/lymphomas를 일으키고, T-cell acute lymphoblastic leukemia(T-ALL)에선 활성화 된 Notch 1이 50% 정도 발견되었다(Weng AP. et al., Science, 306:269, 2004). 또한 유방암 쥐 모델에서도 Notch의 발암효과가 보고 되어있다.

최근 많은 연구들이 Notch의 암 유발작용에 관해 보고하고 있다. Notch 수용체와 리간드 그리고 Notch 타겟이 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암 등의 경우에 활성화 되어 있었다고 보고 되었으며(Miele L. et al., Oncogene, Sep 1;27:5124, 2008), Notch 1과 Jagged-1은 유방암 환자에 있어서는 안 좋은 예후(Reedijk M. et al., Cancer Res., 15;65:8530, 2005)와, 전립선암에서는 암 전이와 관련이 있다고 알려져 있다 (Santagata S. et al., Cancer Res., 64:6854, 2004).

Notch 신호전달이 암 연구에서 주목을 받는 이유는 새로운 항암치료의 주요 타겟이 될 수 있기 때문이다. 첫째, Notch/리간드 결합으로 시작되는 Notch 신호전달 체계는 kinase 같은 효소적 신호 증폭이 없어 비교적 정확하게 신호강도를 조절할 수 있는데, 그 결과 Notch 타겟 유전자들을 농도 의존적으로 제한할 수 있다. 둘째, 활성 Notch 반감기가 짧다. 이것은 지속적인 신호전달 억제가 필요하지 않을 수 있고 적절한 중간 강도의 억제만으로도 Notch 신호전달 체계를 제한할 수 있음을 의미한다. 셋째, Notch 신호전달이 다분히 조직과 기관에 따라 다른 양상을 보인다는 것이다. 따라서 Notch 신호가 세포 특성에 따라 다른 목적으로 사용될 수 있다.

Notch 신호전달은 Notch/리간드 결합을 방해하는 단일클론 항체를 이용해 Notch 신호전달 초기단계에서 억제할 수 있으며, Notch 리간드인 Dll4를 타켓으로 하는 단일클론 항체가 개발되어 내피세포에서의 Notch 신호전달을 억제해 혈관 생성을 제한한다는 보고가 있고(Ridgway J. et al., Nature, 444:1083, 2006), 현재 Notch 신호전이를 방해할 수 있는 많은 단일클론 항체들이 개발중이다 (Yan M. et al., Nature, 464:1052, 2010).

이에, 본 발명자들은 새로운 항암치료의 주요 타겟이 될 수 있는 Notch의 단일클론 인간 항체를 제공하기 위하여 예의 노력한 결과, Notch 3의 인간단일클론 항체 N37가 여러 종류의 암세포에서 과발현되는 Notch 3과 특이적으로 결합하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 암세포에서 특이적으로 과발현되는 Notch 3을 특이적으로 타겟팅할 수 있는 인간 단일클론항체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 Notch 3에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 Notch 3에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른, Notch 3 인간 단일클론항체는 암세포에서 특이적으로 과발현되는 Notch 3을 특이적으로 타겟팅할 수 있도록 파아지디스플레이를 통해 인간항체 라이브러리에서 스크리닝되어, 마우스에서 만들어진 단일항체에서 요구되는 인간화과정이 필요하지 않고 바로 인간에 적용할 수 있어, 암 진단 및 치료용 항체로 용이하게 활용할 수 있다.

도 1은 Fab형태의 N37을 whole Ig 형태로 전환한 후 N37의 순수도를 측정한 결과이다.
도 2은 N37 항체의 Notch 3 도메인 20-22와의 반응을 분석한 결과이다.
도 3는 인간 단일클론 항체 N37과 L1CAM을 발현하는 세포의 특이적 결합여부를 FACS로 분석한 결과이다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것이다.

본 발명에서 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체는 (a) Notch 3 항원 단백질의 제조단계; (b) Notch 3에 결합하는 인간항체의 선별단계; (c) Notch 3에 결합하는 인간항체, N37의 염기서열 및 아미노산 서열 분석단계; (d) N37의 whole IgG로 전환 및 생산단계; (e) N37 항체의 암세포 표면에 발현하는 Notch 3에 대한 결합능 분석단계를 통해 Notch 3의 인간 단일클론항체 N37을 제조하고 Notch 3에 대한 결합능을 확인하는 단계를 통하여 제조하였다.

본 발명의 일 양태에서는, Notch 3의 도메인 20-22(아미노산 서열 771-885)의 서열을 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)로 증폭하여, 리더서열(leader sequence)와 Fc를 연결하여 Notch 3 항원을 제조하였다.

본 발명에서 "항체(antibody)"는 항원(antigen)과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거하는 면역단백질을 의미한다. 항체에는 immunoglobulin(Ig)M, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 5종류가 있으며, 각각 중쇄 불변영역 유전자 μ, δ, γ, α, ε로부터 만들어진 중쇄를 포함한다. 항체기술에서는 주로 IgG가 사용되는데 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 4종류의 isotype이 있으며, 각각의 구조 및 기능적 특성은 다르다.

IgG는 중쇄(heavy chain, 50 kDa) 단백질 2개와 경쇄(light chain, 25 kDa) 단백질 2개로 만들어진 Y자 모양의 매우 안정된 구조(분자량, 150 kDa)를 형성하고 있다. 항체의 경쇄와 중쇄는 아미노산 서열이 항체들마다 서로 다른 가변영역(variable region)과 아미노산 서열이 같은 불변영역(constant region)으로 나뉘어져 있으며, 중쇄 불변영역에는 CH1, H(hinge), CH2, CH3 도메인이 존재한다. 각 도메인은 두 개의 β-sheet로 구성되어 있고 이들사이에 intramolecular disulfide bond가 연결되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역 두 개가 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)가 형성되며, 이 부위는 Y자 모양의 양 팔에 각각 한 개씩 존재하는데 이러한 항원과 결합할 수 있는 부분을 Fab(antibody binding fragment)이라 하고, 항원과 결합하지 못하는 부분을 Fc(crystalizable fragment)라고 한다. Fab과 Fc은 유연한 hinge region으로 연결되어 있다.

항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 안에는 항체마다 아미노산 서열이 특히 다른 부분이 있는데 이를 hypervariable region이라고 부르며, 항원과 결합하는 부위를 구성하고 있기 때문에 상보성 결정영역 (complementarity determining regions, CDRs)이라고도 부른다. 항체의 입체 구조를 살펴보면, 이들 CDRs은 항체의 표면에서 고리(loop) 모양을 하고 있고 고리 아래에는 이를 구조적으로 지지해주는 FR(framework region)이 존재한다. 중쇄와 경쇄에는 각각 세 개씩의 고리구조가 존재하며, 이들 여섯 개의 고리 지역 구조는 서로 합쳐져서 항원과 직접적으로 접촉하고 있다.

파지 디스플레이는 1985년 G. Smith에 의해 처음 도입된 개념으로, 1990년 영국 MRC에 의해 처음으로 항체의 제조에 응용되었다. 박테리오파지(bacteriophage)란 대장균(Escherichia coli)에 기생하는 바이러스의 일종으로 이 기술에서는 주로 실사형 박테리오파지(filamentous bacteriophage)인 M13이 사용되고 있다.

항체의 phage display는 인체 내에 수많이 존재하는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 각각 PCR로 증폭시켜 phagemid vector 안에 들어있는 파지 표면 단백질(pIII)에 융합시킨 형태로 클로닝하여 대장균에서 발현시킨 후 helper 파지를 감염시키면, 파지의 표면에 display된 다양한 조합의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 항체 라이브러리(library)를 제작할 수 있는 기술을 말한다. 이때 사용하는 항체의 형태는 scFv나 Fab이다. 이 라이브러리로부터 패닝(panning) 방법에 의하여 특정 항원에 결합하는 인간 단일클론 항체를 분리ㅇ제작할 수 있다. 패닝은 특정 항원(target antigen)에 파지를 결합시키고 결합하지 않은 파지를 제거한 후, 결합된 파지를 회수하여 대장균에 감염시킴으로써 파지 수를 증폭하고, 이 과정을 2-4회 반복하는 과정이다. 이 기술을 이용하면 단 몇 주 만 에 인간 단일클론 항체를 분리할 수 있다. 위와 같이 인체에 이미 존재하는 항체 유전자로부터 항체의 다양성을 창조한 것을 naive antibody library라 하고, 항체의 CDRs에 무작위 합성 서열을 넣어 다양성을 창조한 것을 synthetic antibody library라고 한다. Naㅿve library는 분리한 항체의 친화력이 그리 높지 않지만 제작비용이 많이 들지 않고, synthetic library는 분리한 항체의 친화력이 높은 반면 제작비용이 많이 든다. 분리된 항체클론들의 친화력이 높지 않을 경우, 항체의 CDRs 및 FRs의 잔기들을 변이시킨 후 파지 디스플레이 방법을 사용하여 친화력이 보다 높은 항체 클론들을 다시 선별하는 친화력 성숙 과정(in vitro affinity maturation)을 거친다.

본 발명의 다른 양태에서는 Notch 3의 항원을 인간항체 라이브러리를 디스플레이하고 있는 파지와 1시간 동안 반응시켰고, 1차 패닝의 경우 10회, 2차 패닝의 경우 20회, 3차 패닝의 경우 30회 세척하였다. 세척 후 항원에 결합하고 있던 파지-항체들을 분리시킨 다음 TG1 대장균에 감염시키고 하룻밤 배양하였다. 이 때 각 패닝 초기에 사용한 파지의 수를 인풋 (input)으로, 세척과정을 마친 이후 글라이신 용액에 의하여 분리된 후 TG1 대장균을 통하여 만들어진 콜로니의 수를 아웃풋 (output) 파지의 수로 계산하여, 항원결합능이 있는 항체의 증폭 정도의 지표로 삼았고, 1차 패닝 결과 얻어진 콜로니들을 모아 배양한 후 같은 방법으로 보조 파지를 넣고 배양하여 항체가 디스플레이드된 파지를 만들었고, 동일한 양의 항원에 대하여 2차, 3차 패닝을 진행하였다. 패닝 횟수가 증가됨에 따라 항원결합능이 높은 항체들이 증폭되고 있는지 확인하기 위하여, 라이브러리와 1차, 2차, 3차 패닝 후에 정제한 항체들의 항원결합능을 간접 ELISA 방법으로 측정하였고, 그 결과 3차 패닝 후 Notch 3 도메인 20-22에 대한 결합능이 있는 클론들이 증폭되는 것을 확인하였으며, 이들의 플라스미드 DNA를 분리한 후 염기서열을 분석하였다.

본 발명의 Notch 3 항체의 염기서열을 인간 점라인(germline) 염기서열과 비교 분석한 결과, 경쇄 가변영역은 인간 항체 점라인 카파 (Kappa) 그룹의 IGKV1-5*03 (93.55% 동일) 으로부터 유래된 것으로 분석되었고(서열번호 1), N37 항체의 중쇄 가변영역은 인간 항체 점라인 (germline)의 중쇄그룹 IGHV1-46*01 (94.10% 동일)으로부터 유래된 것으로 분석되었으며(서열번호 2), N37의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열은 IMGT 데이터 베이스 (IMGT data base)에 있는 어느 중쇄 및 경쇄 서열과 100% 동일하지는 않아, N37이 점라인 항체가 아니고 인체 내에서 성숙과정을 거친 새로운 항체임을 확인하였다.

항체절편은 항체 분자에서 effector function을 나타내는 Fc region을 제외한 항원결합 도메인들을 말하며, 주로 Fab, single-chain antibody fragment(scFv) 및 3세대 항체절편(예, single domain, minibody 등)이 포함된다.

항체절편은 whole IgG에 비하여 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 박테리아에서 생산할 수 있으므로 생산 비용이 적게 드는 장점이 있으며, Fc가 없기 때문에 effector function을 원하지 않는 경우에 사용한다. 항체절편은 인체 내에서의 반감기가 짧아 생체 진단용으로 적합하지만, 항체를 이루고 있는 아미노산 중 일부 염기성, 산성 혹은 중성 아미노산을 상호 교체할 경우 그 항체만의 고유한 등전점(isoelectric point)이 바뀔 수 있는데, 이러한 항체의 등전점 변화가 항체의 생체 내 독성 부작용을 경감한다거나 수용성을 증가시키는 등의 변화를 유도할 수 있으므로 치료용 항체의 경우 친화도나 구조적 형태를 고려하여 whole Ig를 사용하게 된다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 Fab 형태의 N37을 whole Ig 형태로 전환하기 위하여 N37 로부터 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭시켰고, HEK293T 세포에 형진전환하여 N37항체를 정제하였으며, 항체의 중쇄 및 경쇄의 분자량으로 알려진 55 KDa, 25 KDa의 분자량을 갖는 단백질 밴드를 관찰하였다 (도 1). Notch 3 도메인 20-22Fc 단백질과 N37항체의 결합을 확인하였다 (도 2).

본 발명의 다른 양태에서는 Notch 3에 대한 인간항체인 N37 항체가 Notch 3을 발현하는 세포 표면에 존재하는 Norch3를 인식할 수 있는지 시험하기 위하여, 유세포 분석기 (FACS caliber)를 사용하여 인간 자궁암 세포주 OVCAR3, SKOV3 MDH2774, 인간 유방암 세포주 MDAMB231, T47D에 대한 결합능을 분석한 결과, N37은 Notch 3을 발현하는 인간 암세포주(OVCAR3, T47D)에 결합하였고, Notch 3을 거의 발현하지 않은 세포(2774)나 Notch 3을 발현하지 않는 MDAMB231, SKOV3세포에는 거의 결합하지 않음을 확인하였다 (도 3).

본 발명은 다른 관점에서 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 Notch 3의 발현을 검출하여 진단 가능한 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암 등을 포함한다.

본 발명의 진단용 조성물은 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체를 포함함을 특징으로 하는, Notch 3 또는 그 발현의 억제제, 촉진제 및/또는 억제제를 처리한 환자를 모니터링하는데 사용할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체의 투여는 다양한 표준 과정으로 이루어진다. 이러한 기술의 보다 상세한 설명을 위하여, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, ed. E. Harlow and D. Lane(1988)을 참조한다. 항체를 사용하면, 제약학적으로 수용가능한 보조제, 예를 들면 완전 또는 비완전 프로인드 보조액 (Freund's adjuvant), RIBI (muramyl dipeptides) 및 ISCOM (immunostimulating complexs)을 투여하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 조성물은 보조제로 유중수(water-in-oil)형 에멀젼 또는 수산화알루미늄을 포함할 수 있다.

이 항체 조성물은 처리 계열로 한 번 또는 그 이상을 환자 또는 처리 동물에게 투여한다. 투여시의 가장 유효한 모드 및 투여량 양생법 (regimen)은 면역학적의 수준, 처리시에 사용되는 특정한 제제 및/또는 보조제, 예상된 감염의 정도와 과정, 이전의 치료법, 환자 또는 동물의 건강 상태와 면역처치에 대한 반응 등에 따라 의존한다. 예를 들면, 면역성분 환자, 가장 고도의 면역학적 폴리펩타이드, 보다 소량의 투여량 및 필요한 면역조치수에 의존한다. 유사하게, 투여량과 처리시간은 항체가 보조제로 투여되면 낮아질 것이다.

본 발명의 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체가 바이러스, 세균 및 기생충에 의해 발생된 각종 질병을 방지하거나 이 감염의 정도를 경감시키는 능력을 스크린하기 위해서, 당업자들이 다수의 동물 모델들을 사용할 것이라는 것이 인지될 것이다. 세균에 감염되기 쉬운 어떠한 동물을 사용할 것이다. Balb/c 쥐는 활성화 면역보호 스크린에 적합한 동물 모델이며, 면역결핍 생쥐도 수동적 스크린에 바람직한 동물 모델이다. 따라서, 이 동물 모델에 대한 특정 폴리펩타이드 또는 항체를 투여함으로써, 당업자는 폴리펩타이드 또는 항체가 본 명세서에서 기술된 방법 및 조성에 유용한 것인지의 여부를 과도하게 부담스러운 실험없이도 결정할 수 있다.

변할 수 있음은 이해될 것이다. 본 발명에 따른 치료용 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명에 따른 치료용 조성물의 주사는 근육조직내의 근육세포 또는 다른 세포에 주사할 수 있으며 복강 내의 내장세포에 주사할 수 있다.

바람직한 양태로서, 치료용 조성물은 고체상의 부형제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있으며 정제 또는 당의정 형태로 제조하기 위해 과립형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소비톨과 같은 슈가 형태 또는 옥수수, 밀가루, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 전분, 메틸 셀룰로스, 하이드로시프로필메틸-셀룰로스 또는 나트륨 카복시메틸세룰로스와 같은 세룰로스, 아라빅 검, 타가칸쓰 검을 포함하는 검류와 같은 카보하이드레이트 또는 젤라틴, 콜라겐과 같은 단백질 필러를 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 나트륨 알긴산과 같은 각각의 염 형태의 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.

바람직한 양태로서, 비경구적 투여의 경우 본 발명의 치료용 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 (injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액 (oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.

치료용 조성물중의 단클론 항체는 바이알 등의 유리용기와 주사통 등에 흡착하고 또한 불안정하며, 여러 가지 물리화학적 인자, 예컨대 열, pH 및 습도 등에 의해 쉽게 실활한다. 따라서, 안정한 형으로 제제화하기 위해 안정화제, pH조정제, 완충제, 가용화제, 계면활성제 등을 첨가한다. 안정화제로서는 글리신, 알라닌 등의 아미노산류, 덱스트란 40 및 만노우스등의 당류, 솔비톨, 만니톨, 크실톨 등의 당알콜등이 열거되고, 또한 이들의 2종이상을 병용해도 좋다. 이들 안정화제의 첨가량은 항체의 중량에 대하여 0.01 내지 100배, 특히 0.1 내지 10배 첨가하는 것이 좋다. 이들 안정화제를 가함에 의해 액상제제 또는 동결건조제제의 보존안정성을 향상할 수 있다. 완충제로서는 예컨대 인산버퍼, 구연산버퍼등이 열거된다. 완충제는 액상제제 또는 동결건조제제의 재용해 후 수용액의 pH를 조정하고, 항체의 안정성, 용해성에 기여한다. 완충제의 첨가량으로서는 예컨대 액상제제 혹은 동결건조제제를 재용해 한 후의 수량에 대해 1 내지 10mM로 하는 것이 좋다. 계면활성제로서는 폴리솔베이트 20, 프르로닉(pulluronic) F-68, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있으며 특히 바람직하게는 폴리솔베이트 80이 열거되고, 또 이들의 2종 이상을 병용해도 좋다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: Notch 3 항원의 제조

Notch 3의 도메인 20-22 (771-885)의 서열을 포함하고 있는 pCMV-tag4-N3FL로부터 도메인 아미노 말단 프라이머인 서열번호 3과 도메인 22 카복시 말단 프라이머 서열번호 4를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. PCR은 먼저 50 ng의 DNA 주형, 12.5 pmol 씩의 센스프라이머와 안티센스 프라이머, 10 mM dNTP와 DNA 중합효소 pfu (Solgent, 한국)를 DNA 중합효소 완충용액 (Solgent, 한국)에 섞어 95℃에서 5분간 전처리반응을 시켰다. 다음, 95℃에서 45초간 DNA를 변성시키고, 58℃에서 45초간 프라이머를 결합시킨다. 72℃에서 2분간 DNA를 합성시키는 과정을 30회 반복하였고, 마지막 단계에서는 72℃에서 10분간 반응시켜 효소가 충분히 활성을 발휘하도록 하였다. 여기에서 얻어진 DNA 단편을 리더 서열을 포함하고 있는 pJK-dhfr2-L1-monomer (대한민국 특허출원 제10-2006-0079969호)로부터 도메인 아미노 말단 프라이머인 서열번호 5과 서열번호 6를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 동일한 방법으로 실시하여 얻어진 DNA 단편과 연결하는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. 아미노 말단 프라이머인 서열번호 5과 카복시 말단 프라이머 서열번호 4를 사용하였다. EcoRI과 XhoI으로 처리한 후 pJK-dhfr2-Fc의 EcoRI과 XhoI 위치 사이에 클로닝하였으며, 제조된 플라스미드를 pJK-dhfr2-Notch 3 (20-22)Fc라 명명하였다.

Notch 3의 도메인 20-22 (771-885)의 서열을 암호화하는 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드 pJK-dhfr2-Notch 3 (21-22)F 를 우태아혈청을 10% 함유하고 있는 DMEM (Hyclone, 미국) 배지에서 키운 HEK293T 세포에 리포펙타민 (lipofectamine) 2000 (Invitrogene, 미국) 을 이용하여 형질전환 (transfection)하고 37℃, 5% CO2 항온기에서 4-6 시간 배양한 후 혈청을 함유하고 있지 않은 CD293(Gibco, 미국) 배지로 갈아주었다. 계속해서 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하면서 3일에 한번씩 새로운 배지로 갈아주고 3회 상층액을 모은 후 배양 상청액을 Protein G column (Upstate 사, 미국)을 사용하여 친화성크로마토그래피를 수행하여 단백질을 정제하였다.

서열번호 3 : 5'-GACGAATTGCTACTCCTCTCCCCC-3'

서열번호 4 : 5'-AGTCTAGACTCGAGGGCGCATCGTGGGCC-3'

서열번호 5 : 5' -GAGACCCAAAGCTTATC- 3'

서열번호 6 : 5' -TAGCAATTCGTCTGG- 3'

실시예 2. Notch 3 에 결합하는 인간항체의 선별

인간 항체 라이브러리는 2단계 클로닝법에 의하여 만들어졌다. 첫 단계로는 pKRIBB-Fab 파지미드 벡터를 제한효소 BstXI (Roche, 스위스)으로 절단한 후 경쇄 유전자들을 그 자리에 클로닝하여 경쇄 라이브러리를 제조하였고, 두 번째 단계로는 경쇄 라이브러리를 제한효소 SfiI (Roche, 스위스)으로 절단하여 그 자리에 중쇄 유전자들을 클로닝하였다.

첫 단계로 경쇄 라이브러리를 구축하기 위하여 pKRIBB-Fab 파지미드 벡터를 제한 효소 BstXI로 절단하고, 0.6% 아가로스 젤(Agarose gel (Cambrex))을 이용하여 분리 정제하였고, 자가-결합 (self-ligation) 시험을 하였다.이때 1 x 10⁵/1 ㎍ DNA 이하인 경우에만 벡터로 사용하였다.

정제된 벡터와 정제된 경쇄 유전자들을 몰/2몰 비율로 사용하여 20㎕의 10 x 리가아제 (ligase) 완충용액, 10㎕의 T4 DNA 리가아제 (ligase)와 살균 증류수를 넣어 200 ㎕가 되도록 한 후, 16℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날 라이게이션 (ligation) 산물을 글리코겐을 가하고 에탄올 침전법으로 농축한 후 대장균의 형질전환에 사용하였다.

대장균의 형질전환 (transformation)은 전기천공 (electoporation)을 이용하였다. 전기천공 수용성 대장균(Electrocompetent E.coli) (TG1)에 상기에서 만들어진 라이게이션 산물을 2.5 kV, 200 Ω, 25 ㎌D 조건으로 엘렉트로포레이션 (BioRad Gene Pulser Xcell 이용) 하였다. 이렇게 형질전환된 대장균은 23.5 cm x 23.5 cm x20.0 cm 의 암피실린 (ampicilin)과 글루코오스(glucose), 마그네슘(magnesium)을 함유하고 있는 SOB 고형 배지 플레이트에 도말하여 밤새 37℃에서 키운 후 암피실린과 글루코즈, 마그네슘을 함유하고 있는 2YT 액체 배지를 이용하여 회수하였고 글리세롤을 최종 농도 20%로 가하여 -80℃에 보관하였다. 이 때 만들어진 라이브러리의 크기는 전기천공 후 얻어진 대장균을 다단계로 희석하여 암피실린을 함유한 2YT 플레이트에 도말한 다음 37℃에서 밤새 키운 후 얻어진 cfu (colony forming unit)의 개수를 측정함으로써 결정하였다. Vκ의 경우 2.3 x 10⁸cfu의 라이브러리가, Vλ 의 경우 2.8 x 10⁸cfu의 라이브러리를 얻을 수 있었다.

두번째 단계로 중쇄 라이브러리를 구축하기 위하여 경쇄 라이브러리를 제한 효소 BstXI 으로 절단하고, 0.6% Agarose gel 을 이용하여 분리 정제하였고, 자가-결합 시험을 하였다. 이때 1 x 10⁵/1 ㎍ DNA 이하인 경우에만 벡터로 사용하였다.

라이게이션과 대장균의 형질전환은 경쇄 라이브러리 제조 방법과 동일하게 하였고 위와 같은 실험을 60회 이상 반복하여 5 x 10¹⁰ cfu의 서로 다른 항체가 존재하는 대형 인간 항체 라이브러리를 구축하였다.

인간 Fab 항체 라이브러리에서 경쇄부분의 카파 (kappa) 라이브러리와 람다 (lambda) 라이브러리를 6:4로 섞어 그 중 1.7 x 10¹¹ 클론을 암피실린(ampicilline, 100 ㎍/㎖)을 함유하고 있는 2YT 배지(Bactotryptone 16 g, 효모 추출물 (Yeast extract) 10 g, NaCl 5 g in 1 liter H2O, pH 7.0) 2.1 리터에 넣고 37℃에서 OD 600 = 0.7-0.8 까지 (약 2 시간 정도) 흔들면서 키운 후 보조 파지 VCSM13을 20배 가하고 카나마이신(kanamycin) (70 ㎍/㎖) 을 첨가하여 30ㅀC에서 밤새 키웠다. 다음날, 한일 supra22K 원심분리기 (No.11 rotor 이용)를 이용하여 5,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 NaCl과 PEG8000을 각각 최종 농도 500 mM, 5 mM 되도록 가하여 얼음 속에 2 시간 동안 방치하였다. 다음, 10,000 rpm 에서 1 시간 동안 동일한 원심분리기(No.9 rotor 이용)를 이용하여 원심분리하여 파지를 침전시킨 후 5 ㎖ 의 PBS에 용해하였다. Legend Micro17 (Sorvall, 미국) 초원심분리기를 이용하여 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액만 취한 후 0.2㎛ 일회용 필터(Sartorius stedim biotech, 스위스) 로 여과하였다. 이 때 만들어진 항체를 디스플레이한 파지의 수는 7.2 x 10¹³이었다.

Notch 3 (20-22)-Fc 100 ㎍을 코팅 완충용액 (15 mM Na₂CO₃, 34.84 mM NaHCO₃, pH 9.6) 1 ㎖에 섞어 면역튜브 (Maxisorp Immunotube, Nunc 사) 에 넣고 4℃에서 밤새 코팅한 다음, 0.05% Tween 20이첨가된 PBS 용액(PBST)으로 2번 세척하고 4% 탈지분유로 1시간 동안 실온에서 블로킹 하였다. 다시 2번 세척한 후, 실시예 1에서 제조된 항원과 인간 항체 라이브러리를 디스플레이하고 있는 파지 (1.6 x 10¹³)를 최종 농도 2% 탈지분유에 섞어 1 ㎖ 면역튜브에 넣고 37℃ 에서 1시간 동안 항원과 반응시켰다. 다음 0.5% Tween20이 첨가된 PBS로 1차 패닝의 경우 10회, 2차 패닝의 경우 20회, 3차 패닝의 경우 30회 세척하였다, 1회 세척은 1 ㎖ 의 세척용액을 넣은 후 1 ㎖용 피펫만 (pipetman) 을 사용하여 용액을 파이펫팅 (up and down) 10번 한 후 4 ㎖의 세척 용액을 더 넣고 5분간 정치하여 두는 것을 의미한다. 세척 후 항원에 결합하고 있던 파지-항체들을 0.1 M 글라이신 (pH 2.5) 1 ㎖을 사용하여 분리시킨 다음 60 ㎕의 2 M Tris HCl pH 9.0를 가하여 중화한 후 즉시 OD 600>0.8로 키운 TG1 대장균에 감염시키고 암피실린 (100 ㎍/㎖)을 함유하고 있는 2YT(2YTA) 고체배지에 도말한 후 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 때 각 패닝 초기에 사용한 파지의 수를 인풋 (input)으로, 세척과정을 마친 이후 글라이신 용액에 의하여 분리된 후 TG1 대장균을 통하여 만들어진 콜로니의 수를 아웃풋 (output) 파지의 수로 계산하여, 항원결합능이 있는 항체의 증폭 정도의 지표로 삼았다. 1차 패닝 결과 얻어진 콜로니들을 모아 배양한 후 같은 방법으로 보조 파지를 넣고 배양하여 항체가 디스플레이드된 파지를 만들었고, 동일한 양의 항원에 대하여 2차, 3차 패닝을 진행하였다. 패닝 횟수가 증가됨에 따라 항원결합능이 높은 항체들이 증폭되고 있는지 확인하기 위하여, 라이브러리와 1차, 2차, 3차 패닝 후에 선택된 콜로니들을 모아 OD 600>0.8 로 37℃에서 키운 후 IPTG 를 최종농도 1 mM 로 가하여 30℃에서 밤새 발현시킨 다음 상층액에 존재하는 항체들의 항원결합능을 간접 ELISA 방법으로 측정하였다.

간접 ELISA는, 실시예 1에서 제조한 Notch 3 도메인 20-22 (100 ng/well) 을 96 웰 플레이트(MaxiSorp, Nunc)에 코팅한 후 상기 배양 상층액 100 ㎕를 각 웰에 넣고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 이어서 PBST로 3번 세척한 다음, 경쇄에 연결된 preS1 tag에 특이적으로 결합하는 마우스 항체인 AP2 (1/2000) 100㎕를 가한 후 PBST로 4 번 세척하였고, 항-mouse IgG(Fc-specific)-HRP 결합체(Pierce, 1/2000) 100 ㎕를 가하여 실온에서 1 시간 동안 반응 시켰다. 다시 PBST로 5 번 세척한 후, TMB (BD) 와 과산화수소수를 1:1의 비율로 섞어 100 ㎕ 씩 웰에 넣고 5 분간 반응시킨 다음 2M H2SO4를 50 ㎕ 가하여 반응을 정지시켰다. 흡광 분석기(VERSA max 사의 microplate reader)를 이용하여 450 nm 파장에서의 흡광도를 읽어 항체의 발현을 측정하였다.

그 결과, 3차 패닝 후 Notch 3 도메인 20-22에 대한 결합능이 있는 클론들이 증폭되었다. 3차 패닝 후 용출된 파지들을 희석하여 TG1 대장균에 감염시킨 후 2YTA 고체배지에 도말하여 37℃ 항온기에 넣고 배양하였다. 100개의 콜로니를 무작위로 선택하여 각각 2YTA 액체 배지 3 ㎖에 접종하고 37℃ 항온기에서 진탕배양하면서 각 클론의 흡광도가 600 nm에서 0.7 과 0.8 사이가 될 때 까지 배양하였다. 다음, IPTG를 최종 농도 1 mM로 가하고 30℃ 항온기에서 밤새 진탕배양한 후, 배양 상층액을 회수하여 Notch 3 도메인 20-22를 인식하는 항체를 검출하기 위한 간접 ELISA를 수행하였다.

Notch 3 도메인 20-22에 결합하는 클론을 선택하여 N37로 명명하고, 그 결과 경쇄가변영역 서열을 서열번호 1, 중쇄가변영역 서열을 서열번호 2로 나타내었으며, 플라스미드 DNA를 분리한 후 염기서열을 분석하였다.

실시예 3. N37 항체의 염기서열 및 아미노산 서열 분석

실시예 3의 염기서열을 IMGT 소프트웨어(https://imgt.cines.fr/ IMGT_vquest /share/textes/)를 이용하여 인간 점라인 (germline) 염기서열과 비교 분석한 결과, 경쇄 가변영역은 인간 항체 점라인 카파 (Kappa) 그룹의 IGKV1-5*03 (93.55% 동일) 으로부터 유래된 것으로 분석되었고, N37 항체의 중쇄 가변영역은 인간 항체 점라인 (germline)의 중쇄그룹 IGHV1-46*01 (94.10% 동일)으로부터 유래된 것으로 분석되었다. N37의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열은 IMGT 데이터 베이스 (IMGT data base)에 있는 어느 중쇄 및 경쇄 서열과 100% 동일하지는 않았다. 이는 N37이 점라인 항체가 아니고 인체 내에서 성숙과정을 거친 새로운 항체임을 증명하는 것이다.

실시예 4. N37의 whole IgG로 전환 및 생산

Fab 형태의 N37을 whole Ig 형태로 전환하기 위하여 N37 로부터 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭시켰고 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex) 을 통하여 분리한 다음 Zymo 겔 추출 키트(Zymoresearch, 미국)을 이용하여 정제하였다. 이 때 사용한 프라이머는 경쇄 가변영역의 경우 서열번호 7와 서열번호 8이었고, 중쇄 가변영역의 경우 서열번호 7와 서열번호 9이었다.

서열번호 7 :

5'-ACTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3'

서열번호 8 :

5'-GCAGCCGCCGTACGTTTGATCTCCACTTTGGTCCCTTGGCC-3'

서열번호 9 : 5'-CCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCGCTGGCCGAGGA-3'

다음 항체를 동물세포에서 발현 생산할 수 있도록 pdCMV-dhfrC (대한민국 특허 등록번호 제10-0476363호)로부터 중쇄와 경쇄의 리더 시퀀스를 PCR에 의하여 합성하고 분리하고 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex) 과 Zymo 겔 추출 키트 (Zymoresearch)을 통하여 분리 정제하였다. 이 때 사용한 프라이머는 중쇄 리더 시퀀스의 경우 서열번호 10과 서열번호 11이었고, 경쇄 리더 시퀀스의 경우 서열번호 12과 서열번호 13이었다. 다음 중쇄 리더 시퀀스와 중쇄 가변영역을, 경쇄 리더 시퀀스와 경쇄 가변영역을 각각 재조합 (recombination) PCR을 이용하여 연결시켰고, 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex) 과 Zymo 겔 추출 키트를 통하여 분리 정제하였다. 중쇄 가변영역과 중쇄의 리더 펩타이드를 연결시키는데 사용한 프라이머는 서열번호 10과 서열번호 9이었고, 경쇄 가변영역과 경쇄의 리더 시퀀스를 연결시키는데 사용한 프라이머는 서열번호 13과 서열번호 14이었다.

서열번호 10 : 5'-GACGAATTCACTCTAACCATGGAA-3'

　 서열번호 11 : 5'-GGAGTGGACACCTGTAG-3'

서열번호 12 :　5'-TCCTTCAACACCAGACAAC-3'

서열번호 13 : 5'-TGCAAAGCTTCGGCACGAGCA-3'

서열번호 14 : 5'-TGCAGCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGT-3'

이것을 중쇄는 제한효소 EcoRI (Roche, 스위스)과 ApaI (Roche, 스위스)으로, 경쇄는 HindⅢ (Roche, 스위스)와 BsiWI (Roche, 스위스)로 잘라 동일한 제한효소로 절단하고 정제한 pdCMV-dhfrC 벡터의 중쇄와 경쇄 불변영역 위쪽에 각각 클로닝하고 pdCMV-dhfrC-N37라 명명하였다.

상기 pdCMV-dhfrC-N37 DNA를 HEK293T 세포에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 미국)을 사용하여 형질전환하였다. 4-6시간 동안 37℃ 5% CO2 항온 배양기에서 배양한 후 혈청을 함유하고 있지 않은 배지 CD293 (Gibco,미국)로 바꾸어 3일간 동일한 항온 배양기에서 배양하여 N37 생산하는 상청액을 모으기 시작했다. 상기에서 얻어진 상청액 으로부터 protein G 아가로즈 컬럼(Upstate, 미국)을 통하여 N37 항체를 정제하였다. 그 결과, 이 항체를 환원시켰을 때에 항체의 중쇄 및 경쇄의 분자량으로 알려진 55 KDa, 25 KDa의 분자량을 갖는 단백질 밴드를 관찰하였다 (도 1).

상기의 발현된 Notch 3 도메인 20-22Fc 단백질을 8% SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)시킨후, PVDF 막 (Millipore, 한국) 으로 옮겨 웨스턴 블럿을 하였다. 이 때 N37 항체를 1차 항체로, anti hIgG F(ab')₂-HRP (Pierce, 1/5000)를 2차 항체로 사용하였으며 ECL 시약 (Amersham Biosciences) 으로 검출시켰다. 그 결과 N37항체는 Notch 3 도메인 20-22 Fc에 결합하였다 (도 2).

실시예 5. N37 항체의 암세포 표면에 발현하는 Notch 3에 대한 결합능 분석

N37 항체가 Notch 3을 발현하는 세포 표면에 존재하는 Norch3를 인식할 수 있는지 시험하기 위하여, 유세포 분석기 (FACS caliber)를 사용하여 인간 자궁암 세포주 OVCAR3, SKOV3 MDH2774, 인간 유방암 세포주 MDAMB231, T47D에 대한 결합능을 분석하였다. 구체적으로 세포를 세포 분리 완충용액 (Gibco) 4 ㎖을 가하고 37℃, 5 분간 처리한 후, 원심분리기를 이용하여 분리 완충용액을 제거하고 BSA를 1% 함유하고 있는 PBS (1% BSA-PBS) 1 ㎖에 세포를 부유시켰다. 그 중 100 ㎕ 를 96 웰 플레이트에 넣고 분리 정제한 N37을 2 ㎍/웰 씩 넣고 4℃에서 1시간 동안 반응 시킨다. 1000 rpm 에서 3 분간 원심분리하여 반응액을 제거하고 1% BSA-PBS로 3번 세척한다. 1% BSA-PBS 100 ㎕를 가하여 세포를 부유시킨 다음, 검출 항체인 항 인간 Fc-FITC (Sigma) 0.5 ㎍/웰 되도록 1% BSA-PBS에 용해하여 100 ㎕씩 넣고 4℃에서 1시간 반응시켰다. 1% BSA-PBS 로 3번 세척한 후 세포를 500 ㎕ 1% BSA-PBS에 부유하여 FACS용 튜브로 옮겼다. PI (propidium iodide, Sigma, 미국)를 1/10000 으로 희석하여 넣고 5분 동안 실온에서 반응 시킨 후 FACS를 수행하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, N37은 Notch 3을 발현하는 인간 암세포주(OVCAR3, T47D)에 결합하였고, Notch 3을 거의 발현하지 않은 세포(2774)나 Notch 3을 발현하지 않는 MDAMB231, SKOV3세포에는 거의 결합하지 않았다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Human Monoclonal Antibody against Notch 3 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Asn Gly Gly Asp Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Ala Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Leu Val Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gacgaattgc tactcctctc cccc 24 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agtctagact cgagggcgca tcgtgggcc 29 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gagacccaaa gcttatc 17 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tagcaattcg tctgg 15 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antiboy of Notch3 <400> 7 actacaggtg tccactccca ggtgcagctg gtggagtct 39 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcagccgccg tacgtttgat ctccactttg gtcccttggc c 41 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccgatgggcc cttggtggag gcgctggccg agga 34 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gacgaattca ctctaaccat ggaa 24 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggagtggaca cctgtag 17 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tccttcaaca ccagacaac 19 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tgcaaagctt cggcacgagc a 21 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tgcagccacc gtacgtttga tctccagctt ggt 33

Claims

서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체.
제1항의 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암 및 전립선암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
제 1항의 Notch 3에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 치료용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암 및 전립선암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.