JP2007500248A - 細胞外アンタゴニストおよび細胞内アンタゴニストによる受容体チロシンキナーゼの抑制方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストの両方の組合せを利用することによる受容体チロシンキナーゼの抑制方法に関する。細胞外ＲＴＫアンタゴニストは、受容体の細胞外結合領域と相互作用することにより受容体チロシンキナーゼの活性化を抑制する生物学的分子または小分子である。細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、キナーゼドメインを保有する受容体の細胞内領域と相互作用することにより、または受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達経路に関与する細胞内タンパク質と相互作用することにより、受容体チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を抑制する生物学的分子または小分子である。本発明は、細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストの両方の組合せを投与することによるチロシンキナーゼ依存性疾患の治療方法、ならびにこのような方法において用いるためのその組成物も提供する。

Description

本発明は、細胞外ＲＴＫアンタゴニストおよび細胞内ＲＴＫアンタゴニストによる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の抑制方法に関する。特に本発明は、細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストの両方を投与することによる、哺乳類におけるチロシンキナーゼ依存性疾患および症状の治療方法に関する。

ＲＴＫは、いくつかの細胞過程、例えば細胞増殖および分化の制御および調節、細胞生存の促進、ならびに細胞代謝の調整と関連づけられてきた膜貫通型タンパク質である。ＲＴＫに関するリガンドは、可溶性または膜結合ペプチドまたはタンパク質ホルモンである。一般にＲＴＫとのリガンドの結合は、受容体チロシンキナーゼ活性を刺激し、これがその後、生化学的および生理学的変化のシグナル伝達カスケードを刺激し、最後にＤＮＡ合成および細胞分裂に終わる。このような受容体の例としては、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン受容体、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）および神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）が挙げられる。

一般にＲＴＫは、細胞外領域、膜貫通疎水性ドメイン、そしてキナーゼドメインを保有する細胞内領域を有する。リガンドがこのようなＲＴＫの細胞表面の細胞外結合領域と結合する場合、受容体における立体配座変化が生成され、これは細胞内チロシンキナーゼドメインのリン酸化部位を曝露する。受容体における立体配座変化は、関連ＲＴＫによるホモまたはヘテロ二量体化合物にも生成され得る。これらのドメインのリン酸化はチロシンキナーゼ活性を刺激して、シグナル伝達経路を開始し、これは次に、遺伝子活性化および細胞周期進行、そして最後に細胞増殖および分化を引き起こす。

さらに、リガンドの結合は、多数のＲＴＫを二量体化させて、そして各受容体モノマーのタンパク質キナーゼはその二量体相手の細胞内領域中の別個の組のチロシン残基をリン酸化する（自己リン酸化と呼ばれる過程）。自己リン酸化は一般に、２段階で起こる。先ず、触媒部位近くのリン酸化ｌｉｐ中のチロシン残基がリン酸化される。これは、ＡＴＰまたはタンパク質基質と受容体との結合を促す立体配座変化をもたらす。

次にリン酸化受容体は、ＲＴＫ媒介性シグナル伝達に関与する他のタンパク質のためのドッキング部位として役立つ。これらのタンパク質としては、活性化ＲＴＫ上の特定のホスホチロシンと結合しそしてＳｏｓと結合するアダプタータンパク質ＧＲＢ２、次に不活性Ｒａｓ−ＧＤＰ複合体（Ｒａｓは、結合ＧＴＰを伴う活性「オン」状態と結合ＧＤＰを伴う不活性「オフ」状態との間を交替するＧＴＰ−結合スイッチタンパク質である）と相互作用する別の細胞内タンパク質が挙げられる。次にＳｏｓのグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性は、活性Ｒａｓ−ＧＴＰ複合体の形成を促す。Ｒａｓは次に、ＭＡＰキナーゼの活性化に終わるキナーゼカスケードを誘導する。特に活性化Ｒａｓは、セリン−トレオニンキナーゼであるＲａｆのＮ末端ドメインと結合する。Ｒａｆは次に、チロシンおよびセリン残基の両方をリン酸化し、別のセリン−トレオニンキナーゼであるＭＡＰキナーゼを活性化する二重特異性タンパク質キナーゼであるＭＥＫと結合し、リン酸化する。ＭＡＰキナーゼは、細胞性応答を媒介する多数の異なるタンパク質、例えば核転写因子をリン酸化する。

ＲＴＫに関連したシグナル伝達経路における異常は、多数の病理学的結果、例えば癌、心臓血管性疾患、炎症性疾患およびその他の増殖性疾患に関与すると考えられる。例えばいくつかのＲＴＫは、増殖因子の非存在下でさえ、細胞に増殖シグナルを送る増殖因子受容体の突然変異体形態と関連付けられるヒト癌に関する試験で同定されている。ｎｅｕ遺伝子座でコードされるこのような一突然変異体受容体は、ある種のヒト乳癌の非制御増殖に関与すると考えられる。ＲＴＫの特定の成員も、種々のヒト癌と関連づけられてきた。

腫瘍形成に関与する一ＲＴＫはＥＧＦ受容体ファミリーであり、この例としては、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ−１／ＨＥＲ１としても既知である）、ＨＥＲ２（ｃ−ｎｅｕ／ｅｒｂＢ−２としても既知である）、ｅｒｂＢ−３／ＨＥＲ３およびｅｒｂＢ−４／ＨＥＲ４が挙げられる。例えばＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は、腫瘍細胞増殖および生存を調節する過程において重要な役割を演じると考えられる。特にＥＧＦＲは、生存およびアポトーシスからの防御、分化、転移（例えば細胞移動および侵襲）に関連づけられてきており、そしてＥＧＦＲは、新規血管を形成することによりそれら自身の血管系を作製する固形腫瘍の能力である新脈管形成にも関連づけられてきた。

多数のヒト腫瘍は受容体のＥＧＦファミリーの１つまたは複数の成員を発現するかまたは過剰発現する、ということが報告されている。特にＥＧＦＲ存在は、不十分な予後、腫瘍拡散の危険性増大、ならびにある種の腫瘍型の全体的生存短縮と相関すると思われる。後期疾患における標準化学療法および放射線照射に対する不十分な全体的応答は、このような標準アプローチにより殺されない腫瘍細胞における損傷を修復するＥＧＦＲの能力のためであり得る、ということも考えられる。さらにＨＥＲ２陽性転移性乳癌は特に攻撃的な疾患であり、ＨＥＲ２陰性乳癌と比較して、再発のより大きな可能性、不十分な予後ならびにほぼ半分の余命を生じる、ということを研究は示している。ＨＥＲ２タンパク質過剰発現は、原発性乳癌の２５〜３０％で観察されている。

ＶＥＧＦＲファミリーの成員も、腫瘍形成と関連づけられてきた。例えばこれらの受容体は、腫瘍形成、新脈管形成および腫瘍増殖において一役を演じる、と考えられる。ＶＥＧＦＲは、例えば胚形成および腫瘍形成中に内皮細胞上に選択的に発現され、そして腫瘍増殖を低減するために内皮細胞上で発現されるＶＥＧＦ受容体によりシグナル伝達を遮断するＶＥＧＦＲアンタゴニストが開発されてきた。ＶＥＧＦ受容体は、いくつかの非内皮細胞、例えばＶＥＧＦを産生する腫瘍細胞上にも見出されており、この場合、内皮細胞非依存性自己分泌ループが生成されて、腫瘍増殖を抑制する。

したがって、ＲＴＫの適切な阻害薬、調節物質またはモジュレーターを開発することにより、ＲＴＫのシグナル伝達経路が調整されて、これらの病理学的結果を治療または予防し得る。腫瘍形成におけるＥＧＦＲおよびＶＥＧＦＲの関与のため、これらのＲＴＫは抗癌薬療法に関して特異的に標的にされてきた。この療法は、リガンドと受容体の細胞外ドメインとの結合を遮断するモノクローナル抗体、あるいはＲＴＫの細胞内領域に直接作用してシグナル伝達を妨げる合成チロシンキナーゼ阻害薬を主に包含する。

一般的に臨床試験において種々のモノクローナル抗体阻害薬が存在する。このような一例は、ＥＧＦＲとのリガンド結合を遮断し、受容体活性化を防止し、そして培養中の細胞の増殖を抑制するキメラ（ヒト／マウス）モノクローナル抗体であるセツキシマブである。別の例はＡＢＸ−ＥＧＦであり、これはＥＧＦおよびＴＦＧ−αの結合を遮断すると報告されているＥＧＦＲに特異的な完全ヒトモノクローナル抗体である。ヘルセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２陽性転移性乳癌の治療のために認可されたヒト化抗体であり、これはＨＥＲ２タンパク質過剰発現の機能を標的にし、そして遮断するよう意図される。

さらに臨床試験は一般的に、種々の小分子阻害薬に関して実行されている。チロシンキナーゼ阻害薬の一例は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を抑制すると報告されている小分子上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬であり、機能性ＥＧＦＲを発現する一連のヒト癌細胞に対して細胞分裂抑制的であり、ｐ２７の上向き調節を介して腫瘍細胞増殖を抑制し得るイレッサ^TMである。

ＲＴＫを標的にする一般的小分子療法は、投薬が継続する間、感受性腫瘍の増殖を抑制することが見出されたが、しかしそれらは時々、重症副作用と関連する。一旦小分子を用いた投与が終結されると、腫瘍再増殖が起こり、これは、治療前よりなおいっそう大きい比率で起こり得る、ということが報告されている。さらに小分子チロシンキナーゼ阻害薬の連続投与は、その他の副作用、例えば発疹、下痢、粘膜炎および好中球減少症を生じることが示されている。

本発明は、細胞外ＲＴＫアンタゴニストおよび細胞内ＲＴＫアンタゴニストを用いることによる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の抑制方法を提供する。特に本発明は、細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストの両方を投与することによる、哺乳類におけるチロシンキナーゼ依存性疾患および症状、例えば腫瘍増殖の治療方法を提供する。このような治療は、単独での細胞外ＲＴＫアンタゴニストまたは単独での細胞内ＲＴＫアンタゴニストの投与と比較して、腫瘍増殖抑制に及ぼす増強されたまたは相乗的な作用を生じる。本発明は、細胞外ＲＴＫアンタゴニストおよび細胞内ＲＴＫアンタゴニストを含む製剤組成物も提供する。

発明の詳細な説明
本発明は、細胞外ＲＴＫアンタゴニストおよび細胞内ＲＴＫアンタゴニストを用いたＲＴＫの抑制方法を提供する。ＲＴＫは、細胞外領域、膜貫通疎水性ドメイン、ならびにキナーゼドメインを保有する細胞内領域を有する膜貫通型細胞表面受容体である。リガンド結合、あるいは別のＲＴＫとのホモまたはヘテロ二量体形成により起こり得る細胞外領域の活性化後、細胞内キナーゼドメインが活性化される。ＲＴＫシグナル伝達経路は、細胞内ドメインが活性化され、チロシンキナーゼ活性が刺激されると開始され、それにより種々の遺伝子を活性化し、細胞周期進行を開始し、そして最後に細胞増殖および分化を開始する。

好ましくはＲＴＫは、ＥＧＦＲファミリーの一成員、例えばＥＧＦＲまたはｅｒｂＢ−１、ｅｒｂＢ−２、ｅｒｂＢ−３またはｅｒｂＢ−４である。さらに好ましくはＲＴＫはＥＧＦＲであり、これは、例えばＥＧＦ、ＴＮＦ−α、アムフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、エピレグリンおよびＮＲＧ２−αと結合する170 kDa膜貫通型糖タンパク質である。さらにまた好ましくはＲＴＫは、185 kDaの膜貫通受容体タンパク質をコードする癌原遺伝子ＨＥＲ２である。ＲＴＫは、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリーの一成員でもあり、この例としてはＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ニューロピリン−１およびニューロピリン−２が挙げられる。ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２と結合するリガンドとしては、ＶＥＧＦのアイソフォーム（ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₄₅、ＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ₁₈₉およびＶＥＧＦ₂₀₆）が挙げられる。

本発明のアンタゴニストが結合し得る他のＲＴＫの例としては、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）ファミリーの成員、例えばＰＤＧＦＲ−α（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢと結合する）およびＰＤＧＦＲ−β（ＰＤＧＦ−ＢＢと結合）；ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）ファミリーの成員、例えばＦＧＲＦ−１およびＦＧＦＲ−２；ＨＧＦ受容体（ＨＧＦＲ）ファミリーの成員；ＮＧＲ受容体（ＮＧＦＲ）ファミリーの成員、例えばＣＤ２７およびＣＤ４０；ならびにインスリン受容体ファミリーの成員、例えばインスリン受容体（ＩＲ）、１型インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）およびインスリン受容体関連受容体（ＩＲＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞外ＲＴＫアンタゴニストは、本発明との関係では、チロシンキナーゼ活性が抑制されるよう、ＲＴＫアンタゴニストと受容体の細胞外結合領域との間の十分な物理的または化学的相互作用によりＲＴＫの細胞外結合領域と相互作用する。会合または結合を包含するこのような化学的相互作用の例は当該技術分野で既知であり、例としてはＲＴＫアンタゴニストおよび細胞外結合領域間の共有結合、イオン結合、水素結合等が挙げられる、と当業者は理解する。

細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、本発明との関係では、受容体リン酸化および／または種々のＲＴＫシグナル伝達経路に関与するその他のタンパク質のリン酸化を防止することにより、ＲＴＫのチロシンキナーゼ活性を抑制する。細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、キナーゼドメインを保有する細胞内領域と結合するかまたはその活性化を抑制することにより、あるいはＲＴＫのシグナル伝達経路に関与する任意の細胞内タンパク質と結合するかまたはその活性化を抑制することにより、ＲＴＫのチロシンキナーゼ活性を抑制し得る。

もちろん、細胞外アンタゴニストおよび細胞内アンタゴニストはともに同一ＲＴＫ経路を抑制するよう機能すべきであるが、しかしこれらの経路は別個のシグナル伝達経路であり得る、と理解されるべきである。したがって経路は互いに完全に独立して機能し得るし、細胞外経路は、細胞内経路が存在しない場合に活性化され、そしてその逆も同じである。さらに各経路の作用メカニズムは異なり得る；したがって異なる活性化およびシグナル伝達を生じ得る。

理論に結び付けて考えたくはないが、細胞外ＲＴＫアンタゴニストは、ＲＴＫ活性化後のＲＴＫの細胞外領域における立体配座変化により開始される全てのシグナル伝達カスケードを抑制する。この抑制は、表面ＲＴＫ、ならびに細胞内にインターナライズされたＲＴＫを包含する。例えば活性化ＲＴＫは、依然としてそれらのシグナル伝達活性を保持しながら、クラテリン被覆ピットによりエンドソーム中にインターナライズされ得る、と考えられる。インターナライゼーション後、このような受容体は、細胞表面にリサイクルされ戻されるか、あるいはエンドソームまたはリソソーム中で分解される。リガンドと受容体との結合は受容体の再利用を促し得るが、一方、別の受容体（即ちホモまたはヘテロ二量体）とあるいはアンタゴニストと受容体との結合はＲＴＫの分解を促進し得る。

細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、本発明との関係では、受容体の細胞外結合領域との相互作用によりＲＴＫの活性化を抑制（即ち、細胞外アンタゴニスト）するか、あるいはその経路に関与する細胞内チロシンキナーゼドメインまたは任意のその他の細胞内タンパク質との相互作用によりリン酸化を抑制（即ち、細胞内アンタゴニスト）して、それにより最終的に遺伝子活性化または細胞増殖を抑制する生物学的分子、小分子または任意のその他の物質であり得る。一般にＲＴＫアンタゴニストはＲＴＫの活性化を低減するが、ＲＴＫの活性化を必ずしも完全に防止または停止しない。

生物学的分子は、本発明との関係では、一般に650 Dより大きい分子量を有する全てのアミノ酸、ヌクレオチド、脂質および単糖類のポリマーを包含する。したがって生物学的分子としては、例えばオリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにオリゴ糖および多糖が挙げられる。生物学的分子はさらに、上記の分子のいずれかの誘導体を包含する。例えば生物学的分子の誘導体としては、脂質およびグリコシル化誘導体またはオリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質が挙げられる。生物学的分子の誘導体はさらに、オリゴ糖および多糖の脂質誘導体、例えばリポ多糖を包含する。最も典型的には生物学的分子は、抗体またはその機能的誘導体である。

本発明のこのような抗体は、抗原と特異的に結合する例えば天然抗体、二価断片、例えば（Ｆａｂ‘）₂、一価断片、例えばＦａｂ、一本鎖抗体、例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、多価一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体等（これらは一または二特異的である）であり得る。本発明の抗体は、効率的結合を提供する単一抗体可変ドメインを効率的に結合しそして包含する単一ドメイン抗体でもあり得る。重鎖のホモ二量体でありそして軽鎖および第一定常ドメインを欠く抗体も用いられ得る。

概して本発明の抗体は、ヒトＶ_HおよびＶ_Lフレームワーク領域（ＦＷ）ならびにヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。好ましくは全Ｖ_HおよびＶ_L可変ドメインは、ヒト配列であるかまたはヒト配列に由来する。さらにまた本発明の抗体の可変ドメインは完全抗体重鎖または軽鎖可変ドメインであり得るし、あるいはそれは天然ドメインの機能的等価物または突然変異体または誘導体、あるいは当業者に既知の技法を用いて構築された合成ドメインであり得る。例えば少なくとも１つのアミノ酸を失っている抗体可変ドメインに対応するドメインを一緒に連結することが可能である。重要な特性を成す特徴は、相補的ドメインと会合して抗原結合部位を形成する各ドメインの能力である。

選定供給源からのＶ_LおよびＶ_Hドメインは、機能性ヒト定常ドメインを有するキメラ抗体中に組み入れられ得る。本発明の抗体は「ヒト化」もされ、そしてヒトフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされた非ヒト起源の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。あるいはヒト結合ドメインまたは抗体は、非整列ヒトＩｇ遺伝子セグメントが導入され、そして内因性マウスＩｇ遺伝子が不活性化されたトランスジェニック動物から得られる（Bruggemann and Taussig (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 455-458で再検討されている）。このようなマウスから産生されるモノクローナル抗体は、ヒトである。

抗体の機能的等価物も本発明により意図され、そして全長抗体の可変または超可変部のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。「実質的に同一の」アミノ酸配列は、本明細書中では、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-8 (1988)に従ってＦＡＳＴＡ検査方法により確定した場合、別のアミノ酸配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくとも約90％の相同性を有する配列と定義される。本発明の抗体は、結合特質（例えば親和性および特異性）が直接的突然変異、親和性成熟の方法、ファージ表示または鎖シャッフリングにより改良されたものも包含する。

抗体または抗体の混合物は、好ましくは細胞外ＲＴＫアンタゴニストとして用いられる。抗体は細胞外ドメインと結合し、そして好ましくは、例えば受容体二量体化および／またはリガンド結合を遮断することにより、ＲＴＫ活性化を中和する。さらに好ましくは細胞外ＲＴＫアンタゴニストは、ＥＧＦＲ抗体である。

このようなＥＧＦＲ抗体の一例は、セツキシマブ（ＩＭＣ−Ｃ225）であり、これはキメラ（ヒト／マウス）ＩｇＧモノクローナル抗体である（例えば米国特許第4,943,533号（Mendelsohn等）；米国特許第6,217,866号（Schlessinger等）；米国特許出願08/973,065号（Goldstein等）および09/635,974（Teufel）；WO 99/60023（Waksal等）およびWO 00/69459参照）。セツキシマブはＥＧＦＲと特異的に結合し、そしてリガンド、例えばＥＧＦの結合を遮断する。この遮断は、ＥＧＦＲ活性化の作用を妨げ、そして腫瘍増殖、腫瘍侵襲、転移、細胞修復および新脈管形成の抑制を生じる。さらにまたは代替的に、セツキシマブは受容体−抗体複合体のインターナライゼーションを促して、そのリガンドによる、または任意のその他のメカニズムによる受容体のさらなる刺激を防止し得る。

ＥＧＦＲ抗体の別の例はＡＢＸ−ＥＧＦであり、これは、ＥＧＦＲに特異的な完全ヒトＩｇＧ₂モノクローナル抗体である。ＡＢＸ−ＥＧＦは高特異性でＥＧＦＲを結合し、そのリガンド、ＥＧＦおよびＴＧＦ−αの何れもとのＥＧＦＲの結合を遮断する（例えばFiglin et al., Abstract 1102（37^th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001に提示）参照）。以前はクローンＥ７．６．３として既知であったＡＢＸ−ＥＧＦの配列および特性化は、米国特許第6,235,883号（Abgenix, Inc.）のカラム28の62行〜カラム29の36行に、そして図29〜34に開示されている（参照Yang et al., Critical Rev. Oncol./Hematol., 38 (1): 17-23, 2001）。

ヘルセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）は、細胞ベースの検定において高親和性（5 nMのKd）で、ヒトＥＧＦＲ２タンパク質ＨＥＲ２の細胞外ドメインと選択的に結合する組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体である。抗体は、ＨＥＲ２と結合するネズミ抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域とともにヒトフレームワーク領域を含有するＩｇＧ₁κである（例えば国際特許公告WO 01/89566（Mass）参照）。

本発明の細胞外ＲＴＫとして用いられ得るその他のＥＧＦＲ抗体としては、ＥＭＤ72000（MerckＫＧａＡ）（これは、ネズミ抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体ＥＭＤ55900のヒト化バージョンである）；ｈ−Ｒ３（TheraＣＩＭ）（これは、ヒト化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である）；Ｙ10（これは、ネズミモノクローナル抗体であり、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異のネズミ相同体に対して産生された）；ならびにＭＤＸ−447（Medarex）が挙げられる（米国特許第5,558,864号（Bendig等）、第5,884,093号（Kettleborough等）、第5,891,996号（Mateo de Acosta del Rio等）参照）。

本発明の細胞外ＲＴＫアンタゴニストは、ＶＥＧＦＲ抗体でもあり得る。ＶＥＧＦＲ抗体を産生する細胞株としては、ラット抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体を産生するＤＣ101ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ ＨＢ11534）；マウス抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体ＭＡｂ25を産生するＭ25.18Ａ１ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ ＨＢ12152）；マウス抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体ＭＡｂ73を産生するＭ73.24ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ ＨＢ12153）；ならびに可溶性および細胞表面発現ＶＥＧＦＲ−１と結合するＭＡｂ6.12を産生する細胞株（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−3344）が挙げられる。抗ＶＥＧＦＲ−１抗体を産生するその他のハイブリドーマとしては、WO 98/22616、WO 99/59636、オーストラリア国受理出願AU1998 50666 B2、およびカナダ国出願CA 2328893に開示されたハイブリドーマＫＭ1730（ＦＥＲＭ ＢＰ−5697として寄託）；ＫＭ1731（ＦＥＲＭ ＢＰ−5718として寄託）；ＫＭ1732（ＦＥＲＭ ＢＰ−5698として寄託）；ＫＭ1748（ＦＥＲＭ ＢＰ−5699として寄託）；およびＫＭ1750（ＦＥＲＭ ＢＰ−5700として寄託）が挙げられるが、これらに限定されない。ＶＥＧＦＲ−２特異的抗体のさらなる例としては、ＩＭＣ−１Ｃ１１（WO 00/44777（Zhu等）；WO 01/90192（Zhu）参照）およびＩＭＣ−２Ｃ６（Lu et al., 2002；PCT/US02/20332（Zhu）参照）が挙げられる。

その他のＶＥＧＦＲアンタゴニストが当該技術分野で既知である。ＶＥＧＦＲアンタゴニストのいくつかの例は、米国特許出願第07/813,593号；第07/906,397号；第07/906,507号；第07/977,451号；第08/055,269号；第08/252,517号；第08/601,891号；第09/021,324号；第09/208,786号および第09/919,408号（全てLemischka等）；米国特許第5,840,301号（Rockwell等）；米国特許出願第08/706,804号；第08/866,969号；第08/967,113号；第09/047,807号；第09/401,163号および第09/798,689号（すべてRockwell等）；米国特許出願第09/540,770号（Witte等）；ならびにPCT/US01/06966（Liao等）に記載されている。米国特許第5,861,301号（Terman等）、Terman et al. Oncogene 6: 1677-1683 (September 1991)、WO 94/10202（Ferrara等）、およびWO 95/21865（Ludwig）は、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、特に抗ＶＥＧＦＲ−２抗体を開示する。さらにPCT/US 95/01678（Kyowa Hakko）は、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体を記載する。抗ＶＥＧＦＲ抗体は、米国特許出願第09/976,787号（Zhu等）にも記載されている。米国特許第6,177,401号（Ullrich等）、第5,712,395号（App等）および第5,981,569号（App等）は、有機分子であるＶＥＧＦＲアンタゴニストを記載する。さらにＫＤＲおよびＶＥＧＦＲ−１に向けられる2つの異なる抗原結合特異性または部位を有する抗体である二重特異性抗体（ＢｓＡｂｓ）が既知である（例えば米国特許出願第09/865,198（Zhu）号；第60/301,299（Zhu）号参照）。

特異的ＶＥＧＦアンタゴニストの1つが、ＶＥＧＦに対する組換えヒト化モノクローナル抗体（ｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦ）であるアバスチン^TM（ベバシズマブ、Genentech）である。ＶＥＧＦと結合し、それを抑制するよう意図されるアバスチンは、全体的生存改善の一次終点を示す転移性結腸直腸癌患者におけるＩＩＩ相臨床試験に関与する。

細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、好ましくは小分子である。小分子のいくつかの例としては、有機化合物、有機金属化合物、有機化合物および有機金属化合物の塩、ならびに無機化合物が挙げられる。小分子中の原子は、共有およびイオン結合を介して一緒に連結される；前者は小有機化合物、例えば小分子チロシンキナーゼ阻害薬に関して典型的であり、そして後者は、小無機化合物に特徴的である。小有機分子中の原子の配置は、鎖、例えば炭素−炭素鎖または炭素−異種原子鎖を表し得るし、あるいは炭素原子を含有する環、例えばベンゼンまたは多環式系、あるいは炭素および異種原子の組合せ、即ち複素環、例えばピリミジンまたはキナゾリンを表し得る。小分子は任意の分子量を有し得るが、しかしそれらは一般に、それらの分子量が650 D以下である場合を除いて、そうでなければ生物学的分子である分子を包含する。小分子は、天然に見出される化合物、例えばホルモン、神経伝達物質、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂質およびそれらの誘導体、ならびに伝統的有機合成、生体媒介性合成またはそれらの組合せにより、合成的に製造される化合物の両方を包含する（例えばGanesan, Drug Discov. Today 7(1): 47-55(Jan. 2002); Lou, Drug Discov. Today, 6(24): 1288-1294 (Dec. 2001)参照）。

さらに好ましくは、本発明の細胞内ＲＴＫアンタゴニストとして用いられるべき小分子は、キナーゼドメインを有するＥＧＦＲの細胞内結合領域と、あるいはＥＧＦＲ活性化のシグナル伝達経路に関与するタンパク質と結合するためのＡＴＰと競合する細胞内ＥＧＦＲアンタゴニストである。このようなシグナル伝達経路の例としては、ｒａｓ−分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、ホスファチジルイノシタール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−Ａｋｔ経路、ストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＳＡＰＫ）経路、ならびに転写のシグナル伝達物質および活性化物質（ＳＴＡＴ）経路が挙げられる。このような経路に関与する（そして本発明の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストが結合する）タンパク質の例としては、ＧＲＢ−２、ＳＯＳ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。

小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの一例は、ＩＲＥＳＳＡ^TM（ＺＤ1939）であり、これは、ＡＴＰ模倣物として作用してＥＧＦＲを抑制するキノザリン誘導体である（米国特許第5,616,582号（Zeneca Limited）；WO96/33980（Zeneca Limited）P.4参照；Rowinsky et al., Abstract 5 presented at the 37^th Annual Meetnig of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001；Anidio et al., Abstract 1712 presented at the 37^th Annual Meetnig of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001も参照）。

小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの別の例はＴＡＲＣＥＶＡ^TM（ＯＳＩ−774）であり、これは、４−（置換フェニルアミノ）キノザリン誘導体［６，７−ビス（２−メトキシ−エトキシ）−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニル−フェニル）アミン塩酸塩］ＥＧＦＲ阻害薬である（WO 96/30347（Pfizer Inc.）の例えば2ページ12行〜4ページ34行および19ページ14-17行参照。Moyer et al., Cancer Res., 57: 4838-48 (1997)；Pollack et al., J. Pharmacol., 291: 739-48 (1999)も参照）。ＴＡＲＣＥＶＡ^TMは、ＥＧＦＲおよびその下流ＰＩ３／Ａｋｔのリン酸化ならびにＭＡＰ（分裂促進因子活性化タンパク質）キナーゼシグナル伝達経路を抑制して、ｐ２７媒介性細胞周期休止を生じることにより、機能し得る（Hidalgo et al., Abstract 281 presented at the 37^th Annual Meetnig of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001参照）。

その他の小分子もＥＧＦＲを抑制することが報告されており、その多くが、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインと結合すると考えられる。これらの例としては、三環式化合物、例えば米国特許第5,679,683号に記載されている化合物；キナゾリン誘導体、例えば米国特許第5,616,582号に記載されている誘導体；およびインドール化合物、例えば米国特許第5,196,446号に記載されている化合物が挙げられる。このような小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの例は、WO 91/116051、WO 96/30347、WO 96/33980、WO 97/27199（Zeneca Limited）、WO 97/30034（Zeneca Limited）、WO 97/42187（Zeneca Limited）、WO 97/49688（Pfizer Inc.）、WO 98/33798（Warner Lambert Company）、WO 00/18761（American Cyanamid Company）およびWO 00/31048（Warner Lambert Company）に記載されている。天然由来ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬としては、ゲニステイン、ヘルビマイシンＡ、クエルセチンおよびエルブスタチンが挙げられる。

特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの例としては、Ｃ１−1033（Pfizer）（これはチロシンキナーゼ、特にＥＧＦＲのキノザリン（Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロ−フェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イル−プロポキシ）−キナゾリン−６−イル］−アクリルアミド）阻害薬であり、そしてWO 00/31048の8ページ22-6行に記載されている）；ＰＫＩ166（Novartis）（これはＥＧＦＲのピロロピリミジン阻害薬であり、そしてWO 97/27199の10-12ページに記載されている）；ＧＷ2016（GlaxoSmithKline）（これはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の阻害薬である）；ＥＫＢ569（Wyeth）（これはin vitroおよびin vivoでＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を抑制すると報告されている）；ＡＧ−1478（Tryphostin）（これはＥＧＦＲおよびｅｒｂＢ−２の両方からのシグナル伝達を抑制するキナゾリン小分子である）；ＡＧ−1478（Sugen, Pharmacia and Repligen）（これはプロテインキナーゼＣＫ２も抑制するに置換阻害薬である）；ＰＤ153035（Parke-Davis）（これはＥＧＦＲキナーゼ活性および腫瘍増殖を抑制し、培養中の細胞においてアポトーシスを誘導し、そして化学療法薬の細胞傷害性を増強することが報告されている）；ＳＰＭ−924（Schwarz Pharma）（これは前立腺癌の治療のために標的化されるチロシンキナーゼ阻害薬である）；ＣＰ−546,989（OSI Pharmaceuticals）（これは固形腫瘍の治療のための新脈管形成の阻害薬と報告されている）；ＡＤＬ−681（これは、癌の治療のために標的化されるＥＧＦＲキナーゼ阻害薬である）；ＰＤ158780（これはマウスにおけるＡ4431異種移植片の腫瘍増殖率を抑制すると報告されているピリドピリミジンである）；ＣＰ−358,774（これはマウスにおけるＨＮ５異種移植片における自己リン酸化を抑制すると報告されているキンゾリンである）；ＺＤ1839（これは外陰部、ＮＳＣＬＣ、前立腺、卵巣および結腸直腸癌を含めたマウス異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を有すると報告されているキンゾリンである）；ＣＧＰ59326Ａ（これはマウスにおけるＥＧＦＲ陽性異種移植片の増殖を抑制すると報告されているピロロピリミジンである）；ＰＤ165557（Pfizer）；ジアニルノフタルイミドであるＣＧＰ54211およびＣＧＰ53353（Novartis）が挙げられる。

細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、ＥＧＦＲのシグナル伝達経路に関与するタンパク質であるｒａｓタンパク質の阻害薬でもあり得る。このような阻害薬は、ｒａｓタンパク質を活性化する酵素であるファルネシルトランスフェラーゼを標的化し得る。このような阻害薬としては、例えばＲ115777ザメストラ（Ortho-Biotech）（これはｒａｓ依存性腫瘍の治療のためにゲムシタビンと組合せて用いられる）；ＳＣＨ66336（Schering Plough）（これは種々の固形腫瘍、例えば転移性膀胱癌、進行性膵臓癌、ならびに頭部および頚部扁平上皮癌の治療に関して報告されている）；ＢＭＳ−214662 Ｐｔアーゼ（Bristol-Myers Squibb）（これは急性白血病、脊髄形成異常性症候群および慢性骨髄性白血病の治療に関して報告されている）；Ｌ−778,123（Merck）（これは再発性または難治性固形腫瘍の治療に関して報告されているペプチド模倣性ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ（ＦＰＴアーゼ）阻害薬である）；ＣＰ−609−754（OSI PharmaceuticalsおよびPfizer）（これは固形腫瘍癌の治療に関して報告されたｒａｓファルネシル化の阻害薬である）；ならびにＡＺＤ−3409（AstraZeneca）（これは固形腫瘍の治療のために標的化されるファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬である）が挙げられる。

細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、ｒａｓ−ｒａｆモジュレーター、例えば43-9006（Onyx Pharmaceuticals/Bayer）（これは、結腸、肺、膵臓およびその他の癌、ならびにその他の増殖性疾患の治療のために、ｒａｆキナーゼを抑制し、そしてｒａｓシグナル伝達経路を遮断するためにｒａｓ遺伝子における突然変異を有する細胞を標的にする小分子である）；ｒａｓアンタゴニストＦＴＳ（Thyreos）（これは黒色腫、膵臓癌、結腸癌、肺癌、乳癌およびその他の癌の治療のために突然変異体ｒａｓタンパク質を不活性化すると報告されている）でもあり得る。

必ずしもＥＧＦＲのみに特異的な小分子および／またはアンタゴニストというわけではない細胞内ＲＴＫアンタゴニストのその他の例は、スチリル置換ヘテロアリール化合物、例えば米国特許第5,656,655号に記載された化合物；ビスモノ−ならびに二環式アリールおよびヘテロアリール化合物、例えば米国特許第5,646,153号に記載された化合物；ＰＤ153035（Fry et al., 265 Science 1093-1095(August 1994)に記載）；チルフォスチン、例えばOsherov et al., J. Biol. Chem., Vol. 268, No. 15 pp.11134-11142 (1993)に記載されたもの；ＰＤ166285（６−アリール−ピリオド［２，３−ｄ］ピリミジン）（Panek et al., J. Pharm and Exp. Therapeutics, Vo. 283, No. 3, pp. 1433-1444 (1997)に記載）である。

細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、小分子ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、例えばＡＸＤ−6474（AstraZeneca）（これは新脈管形成阻害薬であると報告されている）；ＣＥＰ−5214（これはシグナル伝達モジュレーターである）；またはＺＤ−6474（これは進行性固形腫瘍の治療のために新脈管形成におけるシグナル伝達経路を中断すると報告されているＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害薬である）でもあり得る。

上記の細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストは例示であるに過ぎず、チロシンキナーゼ活性を抑制するその他の細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストが当業者に周知であり、および／または容易に同定可能であり、したがって本発明の範囲内である。このようなその他のアンタゴニストを同定するために、当業者に周知の種々のチロシンキナーゼ抑制検定が実施され得る。

例えば本発明のアンタゴニストは一般にリン酸化事象の抑制または調節に関与するため、本発明との関係で有用なアンタゴニストを確定するに際しては、リン酸化検定が有用であり得る。このような検定は、組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベルおよび／または天然または合成基質のリン酸化を検出し得る。リン酸化は、例えばＥＬＩＳＡ検定またはウエスタンブロットにおいてホスホチロシンに特異的な抗体を用いることにより、検出され得る。チロシンキナーゼ活性を確定するためのこのようなリン酸化検定は、Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera., 283: 1433-44 (1997)およびBatley et al., Life Sci., 62: 143-50 (1998)に記載されている。慣用的検定、例えばリン酸化に用いられるものおよびＥＬＩＳＡ検定の詳細な説明は、多数の出版物から、例えばSambrook, J. et al.(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressから得られる。

さらに、測定されているタンパク質がチロシンキナーゼ活性により調節されるタンパク質発現の検出方法が利用され得る。これらの方法としては、タンパク質発現の検出のための免疫組織化学（ＩＨＣ）、遺伝子増幅の検出のための蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、競合放射性リガンド結合検定、固体マトリックスブロッティング技法、例えばノーザンおよびサザンブロット、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＥＬＩＳＡが挙げられる（例えばGrandis et al., Cancer, 78: 1284-92. (1996); Shimizu et al., Japan J. Cancer Res., 85: 567-71 (1994); Sauter et al., Am. J. Path., 148: 1047-53 (1996); Collins, Glia, 15: 289-96 (1995); Radinsky et al., Clin. Cancer Res., 1: 19-31 (1995); Petrides et al., Cancer Res., 50: 3934-39 (1990); Hoffmann et al., Anticancer Res., 17: 4419-26 (1997); Wikstrand et al., Cancer Res., 55: 3140-48 (1995)参照）。

チロシンキナーゼ抑制を検出するために、in vivo検定も利用され得る。例えば受容体チロシンキナーゼ抑制は、阻害薬の存在下および非存在下で受容体リガンドを用いて刺激された細胞株を用いた分裂促進検定により観察され得る。別の方法は、例えばマウスに注入されたヒト腫瘍細胞を用いて、ＥＧＦＲ−またはＶＥＧＦ発現腫瘍細胞の増殖の抑制に関して試験することを包含する（米国特許第6,365,157号（Rockwell等）参照）。

別の態様では、本発明は、治療的有効量の細胞外ＲＴＫアンタゴニストおよび細胞内ＲＴＫアンタゴニストを投与することにより、哺乳類におけるチロシンキナーゼ依存性疾患および症状を治療する方法を提供する。このような症状および障害の治療は、チロシンキナーゼ依存性疾患の作用を低減し、それを防止し、その増殖を抑制し、またはその症候を軽減することを包含する。当業者は、既知の慣用的試験を用いて、このような症状および障害を容易に診断し得る。

細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストの投与は、求められる結果を達成し得る任意の方法により哺乳類にＲＴＫアンタゴニストを送達することを包含する。ＲＴＫアンタゴニストは、例えば経口的に、非経口的（静脈内または筋肉内）に、局所的に、経皮的にまたは吸入により投与され得る。細胞外ＲＴＫアンタゴニストおよび細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、共存的にまたは逐次的に投与され得る。哺乳類という用語は、本明細書中で用いる場合、ヒト、実験室動物、家庭用ペットおよび農場動物を含む（しかしこれらに限定されない）よう意図される。治療的有効量の投与とは、哺乳類に投与される場合、所望の治療効果、例えばキナーゼ活性の抑制を生じるのに有効である本発明の化合物の量を意味する。

任意の特定のメカニズムと結びつけるつもりはないが、本発明の方法により治療されるかまたは予防され得る疾患および症状としては、細胞増殖に関連した疾患および症状、例えば腫瘍、心臓血管性疾患、炎症性疾患およびその他の増殖性疾患が挙げられる。治療され得る腫瘍としては、原発性腫瘍および転移性腫瘍、ならびに難治性腫瘍が挙げられる。難治性腫瘍としては、化学療法薬単独、抗体単独、放射線照射単独またはそれらの組合せに応答できないかまたは耐性である腫瘍が挙げられる。難治性腫瘍は、このような作用物質を用いた治療により抑制されると思われるが、しかし治療が中断されて5年までに、時としては10年までまたはそれより長い間までに再発する腫瘍も包含する。

さらに本発明の細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストで治療され得る腫瘍としては、正常レベルでＲＴＫを発現し、そして正常レベルのＲＴＫ活性により特性化されるものが挙げられる。当該アンタゴニストは、例えば正常レベルの少なくとも10、100または1000倍であるレベルでＲＴＫを過剰発現する腫瘍を治療するためにも有用である。このような過剰発現は、例えば受容体遺伝子増幅、転写増大またはタンパク質代謝回転の低減（受容体安定性増大）のためであり得る。

さらに本発明のアンタゴニストは、例えば非調節化受容体活性を生じる突然変異からの受容体シグナル伝達の欠損のためにＲＴＫ活性増大を示す腫瘍を治療するために有用である。このような突然変異体受容体は、刺激のためのリガンド結合に依存し得ない（例えばPedersen et al., Ann. Oncol., 12(6): 745-60 (2001)参照）（ＩＩＩ型ＥＧＦＲ突然変異（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｄｅ２−７ＥＧＦＲまたはＡＥＧＦＲと様々に呼ばれる）は、エキソン２−７によりコードされる細胞外リガンド結合ドメインの一部分を欠く）（Wikstrand et al., Cancer Res., 55: 3140-8 (1995)）も参照）。

例えば、活性増強およびＥＧＦＲの過剰発現はしばしば腫瘍進行と関連し、そして腫瘍細胞膜上のＥＧＦ受容体の増幅および／または過剰発現は、化学療法に対する低応答率および放射線抵抗性に関連づけられてきた。別の例では、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現は、原発性乳癌の25％〜30％において観察された。これはＩＨＣ検定（例えばHercep Test^TM）を用いて確定され、そして遺伝子増幅は、固定腫瘍ブロックのＦＩＳＨ検定（例えばPathVysion^TM）を用いて確定され得る。

したがってＥＧＦＲを発現し、そして本発明の細胞外および細胞内アンタゴニストを用いて処理され得るＥＧＦＲのリガンドにより刺激される腫瘍としては、癌腫、神経膠腫、肉腫、腺癌、腺肉腫および腺腫が挙げられる。このような腫瘍は、身体の事実上全ての部分、例えば乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部および頚部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸部または肝臓において生じ得る。本発明に従って処理され得るＥＧＦＲを過剰発現することが観察された腫瘍としては、結腸直腸ならびに頭部および頚部腫瘍、特に頭部および頚部の扁平上皮細胞癌、脳腫瘍、例えば神経膠芽細胞腫、ならびに肺、乳房、膵臓、食道、膀胱、腎臓、卵巣、子宮頸部および前立腺の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。構成的に活性な（即ち非調節性）受容体チロシンキナーゼ活性を有することが観察された腫瘍の非限定例としては、神経膠腫、非小細胞肺癌、卵巣癌および前立腺癌が挙げられる。

本発明の細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、ＶＥＧＦ受容体、特にＫＤＲを発現する腫瘍を治療するためにも有用である。このような腫瘍は、それらの環境中に存在するＶＥＧＦに対して特長的に感受性であり、そして自己分泌刺激ループ中のＶＥＧＦによりさらに産生され、刺激され得る。したがって本方法は、血管新生されないかまたは未だ実質的に血管新生されない固形または非固形腫瘍を治療するために有効である。それなりに治療され得る固形腫瘍の例としては、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、神経膠腫およびリンパ腫が挙げられる。非固形腫瘍の例としては、白血病、多発性骨髄腫およびリンパ腫が挙げられる。白血病のいくつかの例としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、赤芽球性白血病または単球性白血病が挙げられる。リンパ腫のいくつかの例としては、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫が挙げられる。

本発明の細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、新脈管形成を抑制するためにも用いられ得る。血管内皮のＶＥＧＦＲ刺激は、新脈管形成性疾患および腫瘍の血管新生化に関連する。典型的には血管内皮は、他の供給源（例えば腫瘍細胞）からのＶＥＧＦによりパラ分泌様式で刺激される。したがって本発明の方法は、血管新生化腫瘍または新生物または新脈管形成性疾患を有する被験者を治療するために有効であり得る。このような腫瘍および新生物としては、例えば悪性腫瘍および新生物、例えば芽細胞腫、癌腫または肉腫、ならびに高血管性腫瘍および新生物が挙げられる。本発明の方法により治療され得る癌としては、例えば脳、尿生殖路、リンパ系、胃、腎臓、結腸、喉頭および肺ならびに骨の癌が挙げられる。非限定例としてはさらに、類表皮腫瘍、扁平上皮腫瘍、例えば頭部および頚部腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、例えば肺腺癌ならびに小細胞および非小細胞肺腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍および肝臓腫瘍が挙げられる。

本発明の方法は、悪性ケラチノサイト、例えばヒト悪性ケラチノサイトの増殖を抑制することにより治療され得る血管新生化皮膚癌、例えば扁平上皮細胞癌、基底細胞癌および皮膚癌の治療のためにも用いられ得る。治療され得るその他の癌としては、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物（神経芽細胞腫、毛細血管性血管芽細胞腫、髄膜腫および大脳転移）、黒色腫、消化管および腎臓癌および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽細胞腫、例えば多形神経膠芽細胞腫、および平滑筋肉腫が挙げられる。

本発明は、過度の新脈管形成により特性化される病理学的症状、例えば血管新生化および／または炎症、例えばアテローム硬化症、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、新生血管性緑内障、増殖性網膜症、例えば増殖性糖尿病性網膜症、黄斑変性、血管腫、血管繊維腫および乾癬を治療するかまたは予防するための細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストの使用も意図する。非新生物性血管新生性疾患のその他の非限定例は、未熟児網膜症（水晶体後方繊維増殖性）、角膜移植片拒絶、インスリン依存性真正糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、クローン病、自己免疫腎炎、原発性胆汁性肝硬変、急性膵炎、同種異系移植片拒絶、アレルギー性炎症、接触性皮膚炎および遅延型過敏反応、炎症性腸疾患、敗血症性ショック、骨粗鬆症、変形性関節炎、ニューロン性炎症により誘導される認知障害、オスラー・ウェーバー症候群、再狭窄、ならびに真菌、寄生生物およびウイルス感染、例えばサイトメガロウイルス感染である。前記の疾患および症状は例証に過ぎず、本発明の方法は例示された疾患および症状を飲み治療することに限定されず、むしろキナーゼの調節により治療され得る任意の疾患または症状を治療する。

さらに本発明の範囲内に含まれるのは、当該技術分野で周知である研究または診断のためのin vivoおよびin vitroでの本発明の化合物の使用である。

本発明の別の態様は、本発明のアンタゴニストあるいはその製薬上許容可能な塩、水和物またはプロドラッグを、製薬上許容可能な担体と組合せて含有する製剤組成物に関する。このような組成物は、細胞外ＲＴＫアンタゴニストおよび細胞内ＲＴＫアンタゴニストの別個の組成物、あるいは細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストの両方を含有する単一組成物であり得る。

本発明の組成物は、固体または液体形態、溶液中または懸濁液中であり得る。投与経路としては、例えば経口的、非経口的（静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内）、局所的、経皮的経路および吸入による経路が挙げられる。

経口投与のためには、ＲＴＫアンタゴニストは、例えば不活性希釈剤または同化可能担体を伴う液体形態で投与され得るし、あるいは固体剤形中に組入れられ得る。経口液体および固体剤形の例としては、例えば溶液、懸濁液、シロップ、乳濁液、錠剤、ロゼンジ、カプセル（例えば軟質ゼラチンカプセル）等が挙げられる。経口剤形は、例えば活性化合物の崩壊を遅延するかまたは拡散を制御するためのコーティングを用いて持放性製品として処方され得る。必要な場合、組成物は可溶化剤も含み得る。

注射用剤形の例としては、滅菌注射液、例えば溶液、乳濁液および懸濁液が挙げられる。注射用剤形としてはさらに、注射前に液体中に再構成され、溶解され、または懸濁される固体、例えば滅菌粉末が挙げられる。滅菌注射溶液は、上記で列挙されたいくつかのその他の成分とともに適切な溶媒中に必要量でＲＴＫアンタゴニストを混入し、必要な場合には、その後、濾過滅菌することにより、調製される。担体としては、典型的には、例えば滅菌水、生理食塩水、注射用有機エステル、落花生油、植物油等が挙げられる。緩衝剤、防腐剤等が、投与可能形態中に含まれ得る。滅菌処方物は、加熱、放射線照射、精密濾過により、および／または種々の抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の付加により調製され得る。

局所投与のためには、本発明のＲＴＫアンタゴニストは、例えばゲル、クリームまたは軟膏、あるいは顔料の形態で投与され得る。このような適用のための典型的担体としては、疎水性または親水性基剤、油性またはアルコール性液体、および乾燥粉末が挙げられる。ＲＴＫアンタゴニストは、パッチでの適用のためにゲルまたはマトリックス基剤中にも混入され、任意に経皮バリアを介して化合物の制御放出を提供する。ＲＴＫアンタゴニストは、直腸投与のための既知の方法によっても処方され得る。

吸入による投与のためには、本発明のＲＴＫアンタゴニストは、ネブライザー、エーロゾルまたは乾燥粉末吸入器中で用いるために、適切な担体中に溶解または懸濁され得るし、あるいは担体上に吸着され得る。

適切な投薬量は、医者または有資格医療専門家により確定され、そして治療されている疾病の性質、投与経路、治療持続期間、および患者の状態によっている。本発明のＲＴＫアンタゴニストは、所望の治療効果を得るために必要な頻度で投与され得る。投与頻度は、例えば用いられる剤形のおよび治療されている疾患の性質によっている。一般的細胞外ＥＧＦＲアンタゴニストの一例示的投薬量は、400 mg/m²負荷および250 mg/m²毎週注入（セツキシマブ）；1.5 mg/kg毎週注入（ＡＢＸ−ＥＧＦ）；ならびに90分注入として投与される4 mg/kg負荷用量、および30分注入として2 mg/kgの維持用量（トラスツズマブ）である。一般的細胞内ＥＧＦＲアンタゴニストの一例示的投薬量は、250 mg/日経口投与（イレッサ）；150 mg/日経口投与（タルセバ）；および560 mg/週経口投与（ＣＩ−1033）である。

本発明は2つの異なる独立したメカニズムにより機能し得る治療を提供するため、このような治療は、細胞外アンタゴニストまたは細胞内アンタゴニストの単独での投与と比較して、腫瘍抑制に及ぼす増強されたまたは相乗的作用を提供する。さらに本発明は細胞外ＲＴＫアンタゴニストおよび細胞内ＲＴＫアンタゴニストを用いた治療を提供するため、治療的有効用量は、細胞外ＲＴＫアゴニスト単独または細胞内ＲＴＫアゴニスト単独の治療的有効用量より低い可能性がある。

腫瘍増殖を抑制するために連続投与を必要とする一般的治療とは違って、本発明の組合せ療法は、腫瘍増殖を抑制するための細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストの断続的投与を可能にする。例えば2つの治療は、同時に施され得る。あるいは2つの治療は、逐次的に施され得る。さらに2つの治療は、周期的に施され得る。したがって2つのアンタゴニストは、ある期間、共在的に投与され、次に一方または他方が単独で投与され得る。もちろん、投与の任意の組合せまたは順序が用いられ得る。

本発明の別の態様では、本発明の細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、他の治療的活性化合物と一緒に用いるために処方され、あるいは治療的技法の適用と関連して投与される。当該技術分野で既知の任意の慣用的療法が、本発明の方法と組合せて用いられ得る。

例えば細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、１つまたは複数のその他の抗新生物性作因と組合せて投与され得る（例えば米国特許第6,217,866号（Schlessinger等）（抗ＥＧＦＲ抗体を抗新生物薬と組合せて）；米国特許出願第09/312,286号（Waksal等）（抗ＥＧＦＲ抗体を放射線と組合せて）参照）。任意の適切な抗新生物性作因、例えば化学療法薬または放射線が用いられ得る。化学療法薬の例としては、シスプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、イリノテカン（ＣＰＴ−11）、トポテカンおよびオキサリプラチン、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。抗新生物性作因が放射線である場合、放射線源は、治療されている患者に対して外部（外部ビーム照射療法−ＥＢＲＴ）または内部（近接照射療法−ＢＴ）であり得る。投与される抗新生物性作因の用量は、多数の因子、例えば作因の種類、治療されている腫瘍の種類および重症度、ならびに作因の投与経路によっている。しかしながら本発明はいかなる特定の用量にも限定されない、ということが強調されるべきである。

さらに細胞外および細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、１つまたは複数の適切なアジュバント、例えばサイトカイン（例えばＩＬ−１０およびＩＬ−１３）またはその他の免疫刺激剤と組合せて投与され得る（例えばLarrivee et al., Int’l J. Mol. Med., 5: 447-56 (2000)参照）。

上記の説明は本発明を単に例証するために記述してきたが、本発明を限定するものではない。本発明の精神および物質を組入れている開示実施形態の修正は当業者にとって起こり得ることであり、そしてこのような修正は本発明の範囲内である。さらに本明細書中に引用された参考文献は全て、参照により本明細書中で援用される。

Claims (21)

1. 哺乳類における受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の抑制方法であって、細胞外ＲＴＫアンタゴニストおよび細胞内ＲＴＫアンタゴニストを哺乳類に投与することを包含する方法。
2. 哺乳類における腫瘍増殖または新脈管形成を治療するために用いられる請求項１記載の方法。
3. ＲＴＫが上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）である請求項１または２記載の方法。
4. 細胞外ＲＴＫアンタゴニストがセツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ72000、ｈ−Ｒ３またはＹ10である請求項３記載の方法。
5. 細胞内ＲＴＫアンタゴニストがＺＤ1939またはＯＳＩ−774である請求項３記載の方法。
6. ＲＴＫがＨＥＲ２受容体である請求項１または２記載の方法。
7. 細胞外ＲＴＫアンタゴニストがトラスツズマブである請求項６記載の方法。
8. ＲＴＫが血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）である請求項１または２記載の方法。
9. 細胞外ＲＴＫアンタゴニストがベバシズマブである請求項８記載の方法。
10. 細胞内ＲＴＫアンタゴニストがｒａｓタンパク質またはｒａｓ−ｒａｆモジュレーターを抑制する請求項１または２記載の方法。
11. 抗新生物薬を投与することをさらに包含する請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 細胞外ＲＴＫアンタゴニストおよび細胞内ＲＴＫアンタゴニストを含む製剤組成物。
13. ＲＴＫが上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）である請求項１２記載の製剤組成物。
14. 細胞外ＲＴＫアンタゴニストがセツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ72000、ｈ−Ｒ３またはＹ10である請求項１３記載の製剤組成物。
15. 細胞内ＲＴＫアンタゴニストがＺＤ1939またはＯＳＩ−774である請求項１３または１４記載の製剤組成物。
16. ＲＴＫがＨＥＲ２受容体である請求項１２記載の製剤組成物。
17. 細胞外ＲＴＫアンタゴニストがトラスツズマブである請求項１６記載の製剤組成物。
18. ＲＴＫが血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）である請求項１２記載の製剤組成物。
19. 細胞外ＲＴＫアンタゴニストがベバシズマブである請求項１８記載の製剤組成物。
20. 細胞内ＲＴＫアンタゴニストがｒａｓタンパク質またはｒａｓ−ｒａｆモジュレーターを抑制する請求項１２記載の製剤組成物。
21. 抗新生物薬をさらに含む請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の製剤組成物。