ES2689508T3 - Micromir - Google Patents

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ES2689508T3
ES2689508T3 ES12191738.9T ES12191738T ES2689508T3 ES 2689508 T3 ES2689508 T3 ES 2689508T3 ES 12191738 T ES12191738 T ES 12191738T ES 2689508 T3 ES2689508 T3 ES 2689508T3
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Susanna Obad
Sakari Kauppinen
Joacim ELMÉN
Morten Lindow
Markus Heidenblad
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Abstract

Un oligómero de una secuencia de nucleobases contigua de 7-12 nucleobases de longitud, en el que todas las unidades de nucleobases del oligómero son unidades de LNA, y en el que al menos el 75 % de los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases de la secuencia de nucleobases contiguas son enlaces internucleosídicos de fosforotioato, y en el que el oligómero es capaz de reducir la cantidad eficaz de un microARN en una célula o in vivo.

Description

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DESCRIPCION
MICROMIR
Campo de la invención
La presente invención se refiere a oligonucleótidos muy cortos que se dirigen a e inhiben microARN in vivo, y a su uso en medicamentos y composiciones farmacéuticas.
Antecedentes de la invención
Los microARN (miARN) son una clase abundante de ARN endógenos cortos que actúan como reguladores postranscripcionales de la expresión génica por apareamiento de bases con sus ARNm diana. Se procesan a partir de precursores de tipo horquilla más largos (aprox. 70-80 nt) denominados pre-miARN por la enzima ARNasa III Dícer. Los microARN se ensamblan en complejos de ribonucleoproteínas denominados miRNP y reconocen sus sitios diana por complementariedad antisentido, mediando de este modo en la regulación negativa de sus genes diana. La complementariedad casi perfecta o perfecta entre el miARN y su sitio diana da como resultado la escisión del ARNm diana, mientras que la complementariedad limitada entre el microARN y el sitio diana da como resultado la inhibición de la traducción del gen diana.
Se proporciona un resumen del papel de los microARN en enfermedades humanas, y de la inhibición de microARN usando oligonucleótidos monocatenarios, en los documentos WO2007/112754 y WO2007/112753; el documento WO2008046911 proporciona secuencias de microARN que están asociadas con cáncer. Numerosos microARN se han asociado con fenotipos de enfermedad y, por lo tanto, es deseable proporcionar sustancias capaces de modular la disponibilidad de microARN in vivo. Los documentos WO2007/112754 y WO2007/112753 divulgan oligonucleótidos monocatenarios cortos que se considera que forman un dúplex fuerte con su miARN diana. Las SEQ ID NO: 1-45 son ejemplos de oligonucleótidos anti-microARN como se divulga en los documentos WO2007/112754 y WO2007/112753.
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad de cuatro solicitudes: el documento US 50/977497, presentado el 4 de octubre de 2007, el documento US 60/979217, presentado el 11 de octubre de 2007, el documento US 61/028062, presentado el 12 de febrero de 2008, y el documento EP08104780, presentado el 17 de julio de 2008. Además, se hace referencia a los documentos WO2007/112754 y WO2007/112753, que son solicitudes anteriores de los mismos solicitantes.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento de que el uso de oligonucleótidos muy cortos que están dirigidos a microARN y que tienen una alta proporción de nucleótidos análogos de nucleótidos, tales como nucleótidos LNA, es altamente eficaz para aliviar la represión de ARN, tales como un ARNm, por los microARN a los que están dirigidos in vivo.
La presente invención proporciona un oligómero de una secuencia de nucleobases contiguas de un total de 7-12 nucleobases, en el que todas las unidades de nucleobases del oligómero son unidades de LNA; y en el que al menos el 75 % de los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases de la secuencia de nucleobases contiguas son enlaces internucleosídicos de fosforotioato, y en el que el oligómero es capaz de reducir la cantidad eficaz de un microARN en una célula o in vivo.
La presente invención proporciona un oligómero de una secuencia de nucleobases contigua de 7-12 nucleobases de longitud, en el que todas las unidades de nucleobases del oligómero son unidades de LNA, y en el que al menos el 75 % de los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases de la secuencia de nucleobases contiguas son enlaces internucleosídicos de fosforotioato, y en el que el oligómero es capaz de reducir la cantidad eficaz de un microARN en una célula o in vivo; en el que el oligómero es para uso como medicamento.
El oligómero de la invención puede ser en algunos modos de realización de entre 7-10 nucleótidos de longitud, que comprende una secuencia de nucleótidos contigua de un total de entre 7-10 nucleótidos, tal como 7, 8, 9 o 10 unidades de nucleótidos, en el que la secuencia de nucleótidos es complementaria de una secuencia de nucleótidos correspondiente encontrada en microARN de mamífero o vírico.
La presente invención proporciona oligómeros de acuerdo con la invención como un medicamento.
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el oligómero de la invención y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona un conjugado que comprende un oligómero de acuerdo con la invención, conjugado con al menos una entidad no nucleotídica o polinucleotídica, tal como un esterol, tal como colesterol.
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La invención proporciona el uso de un oligómero o un conjugado de acuerdo con la invención, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión de un microARN, tal como uno o más de los microARN a los que se hace referencia en el presente documento.
La invención proporciona el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión del microARN, que comprende la etapa de administrar una composición (tal como la composición farmacéutica) que comprende un oligómero o conjugado de acuerdo con la invención a un paciente que padece o es probable que padezca dicha enfermedad o trastorno médico.
La invención proporciona un procedimiento in vitro para reducir la cantidad eficaz de una diana de microARN en una célula, que comprende administrar el oligómero de la invención, o una composición (tal como una composición farmacéutica) que comprende el oligómero o conjugado de acuerdo con la invención a.
La invención proporciona un procedimiento in vitro para reducir la cantidad eficaz de una diana de microARN en una célula, que comprende administrar el oligómero o conjugado o composición farmacéutica de acuerdo con la invención a la célula u organismo.
La invención proporciona un procedimiento in vitro para la desrepresión de un ARNm diana (o uno o más ARN) en una célula, que comprende administrar un oligómero o conjugado de acuerdo con la invención, o una composición que comprende dicho oligómero o conjugado, a dicha célula.
La invención proporciona el uso de un oligómero o un conjugado de acuerdo con la invención para inhibir el microARN en una célula que comprende dicho microARN, tal como una célula humana. El uso puede ser in vivo o in vitro.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Presentación esquemática de los LNA-antimiR octaméricos miR-21, miR-155 y miR-122, que indica las posiciones diana con el LNA-antimiR completamente modificado con LNA y fosforotiolado. También se indican las posiciones de hibridación preferentes para oligonucleótidos LNA heptaméricos, octaméricos, nonaméricos y decaméricos en el microARN maduro.
Figura 2. Valoración del antagonismo de miR-21 por LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3205 y SEQ ID NO: 3204 en células MCF-7 usando un ensayo de sensores de luciferasa. Las células MCF-7 se cotransfectaron con plásmidos de sensores de luciferasa que contenían un sitio diana de emparejamiento perfecto para miR-21 o un sitio diana de emparejamiento erróneos (.mm2) y LNA-antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran la media de las proporciones de renilla/luciérnaga para tres experimentos separados (barras = EEM), en los que todas se han normalizado frente a psiCHECK2 0 nM (= control).
Figura 3. Valoración del antagonismo de miR-21 por LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3205 y SEQ ID NO: 3204 en células HeLa usando un ensayo de sensores de luciferasa. Las células HeLa se cotransfectaron con plásmidos de sensores de luciferasa que contenían un sitio diana de emparejamiento perfecto para miR-21 (mir-21) o un sitio diana de emparejamiento erróneo (mm2) y LNA-antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran la media de las proporciones de renilla/luciérnaga para tres experimentos separados (barras = EEM), en los que todas se han normalizado frente a psiCHECK2 0 nM (= control).
Figura 4. Valoración del antagonismo de miR-155 por LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3206 y SEQ ID NO: 3207 en células RAW de ratón tratadas con LPS usando un ensayo de sensores de luciferasa. Las células RAW se cotransfectaron con miR-155 y los diferentes LNA-antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestra la media de renilla/luciérnaga, en la que todas se han normalizado frente a psiCHECK2 0 nM.
Figura 5. Valoración del antagonismo de miR-122 por LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3208 y SEQ ID NO: 4 en células HuH-7 usando un ensayo de sensores de luciferasa. Las células HuH-7 se cotransfectaron con un sensor de luciferasa de miR-122 que contenía un sitio diana de miR-122 de emparejamiento perfecto y los diferentes LNA-antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran la media de las proporciones de renilla/luciérnaga para tres experimentos separados (barras = EEM), en los que todas se han normalizado frente a psiCHECK2 0 nM (= control).
Figura 6. Presentación esquemática de los constructos indicadores de luciferasa de miR-21.
Figura 7. Valoración del antagonismo de miR-21 por un LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3205) frente a LNA- antimiR pentadecamérico (SEQ ID NO: 3204) en células PC3 utilizando un ensayo de indicador de luciferasa. Las células PC3 se cotransfectaron con plásmidos de indicadores de luciferasa que contenían un sitio diana de
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emparejamiento perfecto para miR-21 o un sitio diana de emparejamiento erróneo y LNA-antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = EEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM sin sitio diana (= control). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y posición de los LNA-antimiR. Los nucleótidos LNA están indicados por óvalos y los residuos de ADN están indicados por barras.
Figura 8. Valoración de la especificidad del antagonismo de miR-21 por un LNA-antimiR octamérico en células HeLa usando un ensayo de indicador de luciferasa. Las células HeLa se cotransfectaron con plásmidos de indicadores de luciferasa que contenían un emparejamiento perfecto o un sitio diana de emparejamiento erróneo para miR-21 y LNA- antimiR (SEQ ID NO: 3205) o un oligo LNA octamérico de control de emparejamiento erróneo (SEQ ID NO: 3218) a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = EEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM sin sitio diana (= control). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y posición de los LNA-antimiR. Los emparejamientos erróneos se indican con óvalos negros.
Figura 9. Valoración de la longitud más corta posible de un LNA-antimiR completamente modificado con LNA que media el antagonismo eficaz de miR-21. Las células HeLa se cotransfectaron con plásmidos de indicadores de luciferasa que contenían un emparejamiento perfecto o un sitio diana de emparejamiento erróneo para miR-21 y los LNA-antimiR a diferentes concentraciones (SEQ ID NO: 3209 = hexámero y SEQ ID NO: 3210 = heptámero). Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = EEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM sin sitio diana (= control). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y posición de los LNA-antimiR.
Figura 10. Valoración de la longitud de LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA que antagonizan miR-21. Las células HeLa se cotransfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contenían un emparejamiento perfecto o un sitio diana de emparejamiento erróneo para miR-21 y LNA-antimiR a diferentes concentraciones (SEQ ID NO: 3211 = nonámero, SEQ ID NO: 3212 = decámero, SEQ ID NO: 3213 = dodecámero y SEQ ID NO: 3214 = tetradecámero). Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = EEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM sin sitio diana (= control). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y posición de los LNA-antimiR.
Figura 11. Determinación de la posición más óptima para un LNA-antimiR octamérico dentro de la secuencia de reconocimiento de la diana miR. Las células HeLa se cotransfectaron con plásmidos de indicadores de luciferasa que contenían un emparejamiento perfecto o un sitio diana de emparejamiento erróneo para miR-21 y los LNA-antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = EEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM sin sitio diana (= control). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y posición de los LNA-antimiR.
Figura 12. Validación de la interacción de 3'-UTR de Pdcd4 y miR-21 por el LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3205 octamérico. Las células HeLa se cotransfectaron con un plásmido de indicador de luciferasa que contenía parte de la 3'UTR del gen Pdcd4 y LNA-antimiR a diferentes concentraciones (SEQ ID NO: 3205 = octámero, emparejamiento perfecto; SEQ ID NO: 3218 = octámero, emparejamiento incorrecto; SEQ ID NO: 3204 = pentadecámero, mezcla de LNA/ADN, SEQ ID NO: 3220 = pentadecámero, gapmero). Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran las proporciones de renilla/luciérnaga que se han normalizado frente a 0 nM. Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y posición de los LNA- antimiR.
Figura 13. Comparación de un LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3207) con un LNA-antimiR pentadecamérico (SEQ ID NO: 3206) en el antagonismo de miR-155 en células RAW de ratón. Se cotransfectaron células RAW de ratón con plásmidos de indicadores de luciferasa que contenían un emparejamiento perfecto para miR-155 y los diferentes LNA-antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = EEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM sin sitio diana de miR-155 (= control). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR-155 y el diseño y posición de los LNA-antimiR.
Figura 14. Valoración de c/EBPD Valoración de LNA-antimiR de c/EBPer (SEQ ID NO: 3207) con un LNA-antimiR pentadecamérico (SEQ ID NO: 3206) en el antagonismo de miR-155 en células RAW de ratón. Las células RAW de ratón se cotransfectaron con plásmidos de indicadores de luciferasa que contenían un emparejamiento perfecto para miR-155, y a las 20 horas las células se recogieron y se realizó un análisis de transferencia Western de extractos de
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proteína de células RAW. Se indican las diferentes isoformas de c/EBPp, y se muestran a continuación las proporciones calculadas de c/EBPp LIP y tubulina beta.
Figura 15. Antagonismo de miR-106b por un LNA-antimiR octamérico modificado completamente con LNA (SEQ ID NO: 3221) o por un antimiR de secuencia mixta pentadecamérico (SEQ ID NO: 3228). Las células HeLa se cotransfectaron con plásmidos de indicadores de luciferasa que contenían un emparejamiento perfecto para miR-106b y los diferentes LNA-antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios de cuatro duplicados en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM sin sitio diana de miARN (= control). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR-106b y el diseño y posición de los LNA-antimiR.
Figura 16. Antagonismo de miR-19b por un LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA (SEQ ID NO: 3222) y un antimiR de secuencia mixta pentadecamérico (SEQ ID NO: 3229). Las células HeLa se cotransfectaron con plásmidos de indicadores de luciferasa que contenían un emparejamiento perfecto para miR-19a y los dos LNA- antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios de cuatro experimentos duplicados, en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM sin un sitio diana de miR-19a (= control). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR-19a y el diseño y posición de los LNA-antimiR.
Figura 17. Presentación esquemática que muestra las secuencias de miR-221 y miR-222 humanas maduras. En el cuadrado se muestra la secuencia semilla (heptámero) que se conserva en ambas secuencias de miARN.
Figura 18. Dirigir una familia de microARN usando LNA-antimiR corto completamente sustituido con LNA. Las células PC3 se cotransfectaron con plásmidos de indicadores de luciferasa para miR-221 y miR-222 por separado o conjuntamente y con los diferentes LNA-antimiR a concentraciones variables. Cuando se cotransfectaron con los LNA- antimiR (pentadecámeros) de SEQ ID NO: 3223 (contra miR-221) y SEQ ID NO: 3224 (contra miR-222), la concentración total fue de 2 nM (1 nM cada uno), mientras que transfectando las células con la SEQ ID NO: 3225 (heptámero) las concentraciones fueron de 0, 1, 5, 10 o 25 nM. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = EEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM sin sitio diana de miARN (= control). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia miR-221/222 y el diseño y posición de los LNA-antimiR.
Figura 19. Valoración de los niveles de proteína p27 como lectura funcional para el antagonismo de la familia de miR- 221/222 por el LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3225 heptamérico. Las células PC3 se transfectaron con LNA-antimiR heptamérico de SEQ ID NO: 3225, dirigiéndose tanto a miR-221 como a miR-222 a concentraciones variables. Después de 24 horas, las células se recogieron y los niveles de proteína se midieron en una transferencia Western. Se muestran las proporciones de p27/tubulina.
Figura 20. Valoración del antagonismo de miR-21 por un LNA-antimR octamérico (SEQ ID NO: 3205) frente a un LNA- antimiR pentadecamérico (SEQ ID NO: 3204) y otro octámero con 2 emparejamientos erróneos (SEQ ID NO: 3218) en células HepG2 usando un ensayo de indicador de luciferasa.
Las células HepG2 se cotransfectaron con plásmido de indicador de luciferasa que contenía un sitio diana de emparejamiento perfecto para miR-21 y LNA-antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = EEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM sin sitio diana (= control). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR- 21 y el diseño y posición de los LNA-antimiR.
Figura 21. Validación de la interacción de la 3'UTR de Pdcd4 y miR-21 por el LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3205 frente al pentadecámero (SEQ ID NO: 3204) y un octámero con dos emparejamientos erróneos (SEQ ID NO: 3218) .
Se cotransfectaron células Huh-7 con un plásmido de indicador de luciferasa que contenía parte de la 3'UTR del gen Pdcd4, pre-miR-21 (10 nM) y LNA-antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = EEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM sin sitio diana (= control). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR- 21 y el diseño y posición de los LNA-antimiR.
Figura 22. El antagonismo de miR-21 por la SEQ ID NO: 3205 da lugar a niveles aumentados de niveles de proteína Pdcd4.
Las células HeLa se transfectaron con LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3205 5 nM (emparejamiento perfecto), o LNA de secuencia aleatoria de SEQ ID NO: 3219 (octamérico) o de SEQ ID NO: 3218 (octamérico de emparejamiento
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erróneo). Las células se recogieron después de 24 horas y se sometieron a transferencia Western con anticuerpo contra Pdcd4.
Figura 23. Niveles de ALT y AST en ratones tratados con SEQ ID NO: 3205 (emparejamiento perfecto) o SEQ ID NO: 3218 (control de emparejamiento erróneo). Los ratones se sacrificaron después de 14 días y después de haber recibido 25 mg/kg cada dos días.
Figura 24. Valoración de los niveles de proteína PU.1 como lectura funcional para el antagonismo de miR-155 por LNA-antimiR corto (SEQ ID NO: 3207).
Las células THP-1 se cotransfectaron con pre-miR-155 (5 nmol) y se añadieron diferentes oligonucleótidos de LNA (5 nM) y LPS 100 ng/ml. Después de 24 horas, se recogieron las células y se realizó un análisis de transferencia Western de extractos de proteínas de las células THP-1. Se indican PU.1 y tubulina.
Figura 25. Valoración de los niveles de proteína p27 como lectura funcional para el antagonismo de la familia de miR- 221/222 por el LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3225 heptamérico.
Las células PC3 se transfectaron con LNA-antimiR heptamérico de SEQ ID NO: 3225 dirigiéndose tanto a miR-221 como a miR-222 y un control de LNA de secuencia aleatoria a 5 y 25 nM. Después de 24 horas, las células se recogieron y los niveles de proteína se midieron en una transferencia Western. Se muestran las proporciones de p27/tubulina.
Figura 26. La desactivación génica de miR-221/222 por LNA-antimiR heptamérico de SEQ ID NO: 3225 (emparejamiento perfecto) reduce la formación de colonias en agar blando en células PC3.
Las células PC3 se transfectaron con 25 nM de LNA-antimiR heptamérico de SEQ ID NO: 3225 dirigiéndose tanto a miR-221 como a miR-222 o a un control de secuencia aleatoria heptamérico (SEQ ID NO: 3231). Después de 24 horas, las células se recogieron y se sembraron en agar blando. Después de 12 días, se contaron las colonias. Un experimento se ha realizado por triplicado.
Figura 27. Revisión de la familia let-7 humana, y de los antagonistas sometidos a prueba.
(Parte superior) Las secuencias representan el miARN maduro para cada miembro y el recuadro refleja los nucleótidos 2-16, las posiciones típicamente antagonizadas por LNA-antimiR. Las columnas a la derecha muestran el número de diferencias de nucleótidos en comparación con let-7a, dentro de la semilla (S: posición 2-8), semilla extendida (ES, posición 2-9) y la secuencia restante típicamente dirigida por LNA-antimiR (NE, posición 9-16), respectivamente. Los nucleótidos con colores invertidos están alterados en comparación con let-7a. (Parte inferior) Resumen de los antagonistas sometidos a prueba contra la familia let-7, incluyendo información sobre diseño, longitud y dianas perfectamente complementarias. Todos los compuestos están completamente fosforotiolados.
Figura 28. Valoración del antagonismo de let-7 por seis LNA-antimiR diferentes en células Huh-7 usando un ensayo de sensores de luciferasa.
Las células Huh-7 se cotransfectaron con plásmidos de sensores de luciferasa que contenían una 3'UTR de HMGA2 parcial (con cuatro sitios de unión a let-7), con o sin precursor de let-7a (barras grises y negras, respectivamente) y con 6 LNA-antimiR diferentes a concentraciones crecientes. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran la media de las proporciones renilla/luciérnaga para mediciones duplicadas y las desviaciones estandar para cada ensayo. Dentro de cada grupo de LNA-antimiR, todas las proporciones se han normalizado con respecto a la media de pocillos que no contienen precursor de let-7a (barras negras).
Figura 29. Resultados de luciferasa de células Huh-7 transfectadas con el plásmido de sensor de 3'UTR de HMGA2, LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3226 (izquierda) y SEQ ID NO: 3227 (derecha), y pre-miR para let-7a (A), let-7d (B), let- 7e (C) y let-7i (D). Las barras grises indican la desrepresión de la diana después de la inclusión de pre-miR, mientras que las barras negras de control representan el nivel equivalente sin la adición de pre-miR. Cada proporción se basa en mediciones cuadruplicadas y se han normalizado frente al promedio de pocillos que no contienen precursor (barras negras) dentro de cada grupo de tratamiento.
Figura 30. Resultados de luciferasa de células HeLa transfectadas con el plásmido del sensor de 3'UTR de HMGA2 o vector de control y el LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3227 a diversas concentraciones. Cada proporción se basa en mediciones cuadruplicadas normalizadas frente al vector de control vacío sin tratamiento (0 nM) (psi-CHECK-2; barras grises).
Figura 31. Valoración del antagonismo de miR-21 por el octámero (n.° 3205) en células HCT116 usando un ensayo de sensores de luciferasa. Las células HCT116 se cotransfectaron con plásmidos de sensores de luciferasa que contenían un sitio diana de emparejamiento perfecto para miR-21 (barras grises) y LNA-antimiR y oligonucleótidos de control a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la
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luciferasa. Se muestra un ejemplo típico de dos en el que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a un vector vacío de 0 nM (= barras negras).
Figura 32. El silenciamiento de miR-21 por LNA-antimiR de n.° 3205 octamérico reduce la formación de colonias en agar blando en células PC3. Las células PC3 se transfectaron con 25 nM de LNA-antimiR de n.° 3205 octamérico dirigiéndose a miR-21. Después de 24 horas, las células se recogieron y se sembraron en agar blando. Después de 12 días, se contaron las colonias. Se muestra la media de tres experimentos separados, cada uno realizado por triplicado, y normalizado frente a control de 0 nM (es decir, transfección pero sin LNA). p = 0,01898 para la n.° 3205.
Figura 33. La desactivación génica de miR-21 con LNA-antimiR de n.° 3205 octamérico reduce la formación de colonias en agar blando en células HepG2. Las células HepG2 se transfectaron con 25 nM de LNA-antimiR de n.° 3205 octamérico dirigiéndose a miR-21. Después de 24 horas, las células se recogieron y se sembraron en agar blando. Después de 17 días, se contaron las colonias. Se muestra la media de tres duplicados de un experimento (barras = EEM).
Figura 34. Cierre de herida en la línea de células de próstata humana invasivas PC3 después del tratamiento con la n.° 3205. (A) Las células PC3 se transfectaron el día 3 con LNA-antimiR y oligonucleótidos de control a 25 nM, n.° 3205 (octámero, emparejamiento perfecto) y n.° 3219 (octámero, emparejamiento erróneo) y al día siguiente se realizó un raspado. Se tomaron imágenes después de 24 horas para monitorizar la migración. (B) El área en cada punto temporal se ha medido con el programa de software Imagen J y se ha normalizado frente al respectivo punto temporal de 0 h.
Figura 35. Valoración de la longitud de LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA que antagonizan miR-155. Se cotransfectaron células RAW con plásmidos de indicadores de luciferasa que contenían un sitio diana de emparejamiento perfecto para miR-155 y con oligonucleótidos de LNA-antimiR a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = EEM) para tres experimentos independientes en los que las proporciones renilla/luciérnaga se han normalizado frente a vector vacío de 0 nM sin sitio diana (= simulado). Se muestra también una presentación esquemática de la secuencia de miR y el diseño y posición de los LNA-antimiR.
Figura 36. Unión de LNA-antimiR-21 marcado con 5-FAM (n.° 3205) con proteína de plasma de ratón.
(A) % de compuesto de LNA-antimiR-21 libre en función de la concentración de oligonucleótido en plasma de ratón.
(B) Concentración de compuesto de LNA-antimiR-21 libre de n.° 3205 en función de la concentración de n.° 3205 en plasma de ratón.
Figura 37. Cuantificación de los niveles de proteína Ras mediante análisis de transferencia Western.
A. Imagen de gel que muestra las proteínas Ras y tubulina (patrón interno) en muestras de pulmón y riñón tratadas (anti-let-7; octámero) frente a no tratadas (solución salina). B. Cuantificaciones de los niveles de proteína Ras en el pulmón y el riñón, respectivamente, de ratones tratados con LNA-antimiR (barras negras), normalizadas frente a controles de solución salina equivalentes (barras grises), usando tubulina como control de igual carga.
B. El silenciamiento de miR-21 por la n.° 3205 da lugar a niveles aumentados de niveles de proteína Pdcd4 in vivo.
C. Se inyectó a los ratones solución salina o 25 mg/kg de LNA-antimiR (n.° 3205) durante 14 días cada dos días, con un total de 5 dosis. Se sacrificaron los ratones, se aisló de riñón la proteína y se sometió a análisis de transferencia Western con anticuerpo contra Pdcd4. A. Imagen de gel que muestra las proteínas Pdcd4 y Gapdh (patrón interno) en muestras de riñón tratadas (antimiR-21; octámero) frente a no tratadas (solución salina) (M1, ratón 1; M2, ratón 2). B. Cuantificación de los niveles de proteína Pdcd4 en riñones de ratones tratados con LNA-antimiR (barras de color gris oscuro), normalizados frente al promedio de controles de solución salina equivalente (barras de color gris claro), usando Gapdh como control de carga.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los oligonucleótidos cortos que incorporan LNA son conocidos en el área de los reactivos in vitro (véanse, por ejemplo, los documentos WO2005/098029 y WO 2006/069584). Sin embargo, las moléculas diseñadas para uso diagnóstico o como reactivo son muy diferentes en diseño que aquellas para uso in vivo o farmacéutico. Por ejemplo, los nucleótidos terminales de los oligos reactivos típicamente no son LNA, sino ADN, y los enlaces internucleosídicos son típicamente distintos de fosforotioato, el enlace preferente para uso en los oligonucleótidos de la presente invención. Por lo tanto, la invención proporciona una clase novedosa de oligonucleótidos (a los que se hace referencia en el presente documento como oligómeros) en sí misma.
Los siguientes modos de realización hacen referencia a ciertos modos de realización del oligómero de la invención, que se pueden usar en una composición farmacéutica. Los aspectos que hacen referencia al oligómero también pueden hacer referencia a la secuencia de nucleótidos contigua, y viceversa.
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El oligómero
El oligómero de la invención es un oligonucleótido monocatenario en el que el LNA forma la secuencia de nucleótidos contigua completa del oligonucleótido. La secuencia de nucleótidos del oligómero consiste en una secuencia de nucleótidos contigua.
El término "oligonucleótido" (o simplemente "oligo"), que se usa indistintamente con el término "oligómero" hace referencia, en el contexto de la presente invención, a una molécula formada por enlace covalente de dos o más nucleótidos. Cuando se usa en el contexto del oligonucleótido de la invención (al que también se hace referencia como oligonucleótido monocatenario), el término "oligonucleótido" puede tener, en un modo de realización, por ejemplo, entre 7-10 nucleótidos, tal como en modos de realización individuales, 7, 8, 9 o 10.
El término "nucleótido" hace referencia a nucleótidos, tales como ADN y ARN, y análogos de nucleótidos. Debe reconocerse que, en algunos aspectos, el término nucleobase también se puede usar para hacer referencia a un nucleótido que puede ser de origen natural o no natural; a este respecto, el término nucleobase y nucleótido se pueden usar indistintamente en el presente documento.
En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos contiguos consiste en 7 unidades de LNA de nucleótidos. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos contiguos consiste en 8 unidades de LNA de nucleótidos. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos contiguos consiste en 9 unidades de LNA de nucleótidos.
Como se describe a continuación, la secuencia de nucleótidos contigua consiste únicamente en unidades de LNA (incluyendo grupos de enlace, tales como enlaces de fosforotioato).
El oligómero puede consistir en la secuencia de nucleótidos contigua.
En un modo de realización especialmente preferente, todos los análogos de nucleótidos son LNA. Además, todos los nucleótidos del oligómero son LNA. En un modo de realización preferente adicional, todos los nucleótidos del oligómero son LNA y todos los grupos de enlace internucleosídico son fosfotioato.
En el presente documento, el término "base nitrogenada" pretende cubrir purinas y pirimidinas, tales como las nucleobases de ADN A, C, T y G, las nucleobases de ARN A, C, U y G, así como las nucleobases que no son ADN/ARN, tales como 5-metilcitosina (MeC), isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 5- propinil-6-fluoroluracilo, 5-metiltiazoluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, 2,6-diaminopurina, 7-propino-7- desazadenina, 7-propino-7-desazaguanina y 2-cloro-6-aminopurina, en particular MeC. Se entenderá que la selección real de la nucleobase que no es ADN/ARN dependerá del nucleótido correspondiente (o emparejado) presente en la cadena de microARN a la que el oligonucleótido se pretende dirigir. Por ejemplo, en caso de que el nucleótido correspondiente sea G, normalmente será necesario seleccionar una nucleobase que no sea de ADN/ARN que sea capaz de establecer enlaces de hidrógeno con G. En este caso específico, en el que el nucleótido correspondiente es G, un ejemplo típico de una nucleobase preferente que no sea de ADN/ARN es MeC.
Debe reconocerse que el término en "un modo de realización" no necesariamente debe limitarse a hacer referencia a un modo de realización específico, sino que puede hacer referencia a un rasgo que puede estar presente en "algunos modos de realización", o incluso como un rasgo genérico de la invención. Asimismo, el uso del término "algunos modos de realización" se puede utilizar para describir un rasgo de un modo de realización específico, o una colección de modos de realización, o incluso como un rasgo genérico de la invención.
Los términos "correspondiente a" y "corresponde a" hacen referencia a la comparación entre la secuencia de nucleótidos del oligómero o secuencia de nucleótidos contigua (una primera secuencia) y la secuencia de nucleótidos contigua equivalente de una secuencia adicional seleccionada de i) una subsecuencia del complemento inverso de la diana de ácido nucleico de microARN (tal como una diana de microARN seleccionada de las SEQ ID NO: 40-SEQ ID NO: 976, y/o ii) la secuencia de nucleótidos proporcionada en el presente documento, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 977-1913, o las SEQ ID NO 1914-2850, o las SEQ ID NO 2851-3787. Los análogos de nucleótidos se comparan directamente con sus nucleótidos equivalentes o correspondientes. Una primera secuencia que corresponde a una secuencia adicional en i) o ii) típicamente es idéntica a esa secuencia a lo largo de la longitud de la primera secuencia (tal como la secuencia de nucleótidos contigua).
Cuando se hace referencia a la longitud de una molécula de nucleótidos tal como se hace referencia en el presente documento, la longitud corresponde al número de unidades monoméricas, es decir, nucleótidos, independientemente de si esas unidades monoméricas son nucleótidos o análogos de nucleótidos. Con respecto a nucleótidos o nucleobases, los términos monómero y unidad se usan indistintamente en el presente documento.
Debe entenderse que, cuando el término "aproximadamente" se usa en el contexto de valores específicos o intervalos de valores, la divulgación debe leerse para incluir el valor o intervalo específico al que se hace referencia.
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Como se usa en el presente documento, “hibridación” significa enlaces de hidrógeno, que pueden ser Watson-Crick, Hoogsteen, enlaces de hidrógeno de Hoogsteen invertidos, etc. entre bases nucleosídicas o nucleotídicas complementarias. Las cuatro nucleobases comúnmente encontradas en el ADN son G, A, T y C, de las cuales G se aparea con C, y A se aparea con T. En el ARN, T se reemplaza por uracilo (U), que se aparea entonces con A. Los grupos químicos de las nucleobases que participan en la formación de dúplex estándar constituyen la cara Watson- Crick. Un par de años más tarde, Hoogsteen demostró que las nucleobases de purina (G y A), además de su cara Watson-Crick, tienen una cara Hoogsteen que se puede reconocer desde fuera de un dúplex y se puede usar para unir oligonucleótidos de pirimidina por medio de enlaces de hidrógeno, formando de este modo una estructura de triple hélice.
En el contexto de la presente invención, “complementario” hace referencia a la capacidad de apareamiento preciso de dos secuencias nucleotídicas entre sí. Por ejemplo, si un nucleótido en una determinada posición de un oligonucleótido se puede unir mediante enlaces de hidrógeno a un nucleótido en la posición correspondiente de una molécula de ADN o ARN, entonces se considera que el oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí en esa posición. Las cadenas de ADN o ARN se consideran complementarias entre sí cuando un número suficiente de nucleótidos del oligonucleótido pueden formar enlaces de hidrógeno con los nucleótidos correspondientes del ADN o ARN diana para posibilitar la formación de un complejo estable. Para ser estable in vitro o in vivo, la secuencia de un oligonucleótido no necesita ser 100 % complementaria de su microARN diana. Por lo tanto, los términos “complementario” e “hibridable específicamente” implican que el oligonucleótido se une lo suficientemente fuerte y específicamente a la molécula diana para proporcionar la interferencia deseada con la función normal de la diana, mientras se mantiene invariable la función de los ARN no diana. Sin embargo, en un modo de realización preferente, el término complementario significará 100 % complementario o completamente complementario.
En un ejemplo preferente, el oligonucleótido de la invención es 100 % complementario de una secuencia de miARN, tal como una secuencia de microARN humano, o una de las secuencias de microARN a las que se hace referencia en el presente documento.
En un ejemplo preferente, el oligonucleótido de la invención comprende una secuencia contigua, que es 100 % complementaria de la región semilla de la secuencia de microARN humano.
Preferentemente, el término "microARN" o "miARN", en el contexto de la presente invención, significa un oligonucleótido de ARN que consiste en entre 18 y 25 nucleótidos de longitud. En términos funcionales, los miARN son típicamente moléculas de ARN endógenas reguladoras.
Los términos "microARN diana" o "miARN diana" hacen referencia a un microARN con un papel biológico en la enfermedad humana, por ejemplo un miARN oncogénico regulado positivamente o un miARN supresor tumoral en cáncer, siendo de este modo una diana para la intervención terapéutica de la enfermedad en cuestión.
Los términos "gen diana" o "ARNm diana" hacen referencia a dianas de ARNm reguladoras de microARN, en los que dicho "gen diana" o "ARNm diana" está regulado postranscripcionalmente por el microARN basándose en la complementariedad casi perfecta o perfecta entre el miARN y su sitio diana, que da como resultado la escisión del ARNm diana; o la complementariedad limitada, a menudo conferida a la complementariedad entre la llamada secuencia semilla (nucleótidos 2-7 del miARN) y el sitio diana, que da como resultado la inhibición de la traducción del ARNm diana.
En el contexto de la presente invención, el oligonucleótido es monocatenario, esto hace referencia a la situación en la que el oligonucleótido está en ausencia de un oligonucleótido complementario, es decir, no es un complejo de oligonucleótido bicatenario, tal como un ARNip. En un modo de realización, la composición de acuerdo con la invención no comprende un oligonucleótido adicional que tiene una región de complementariedad con el oligómero de 5 o más, tal como 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos consecutivos, tales como ocho o más.
Longitud
Sorprendentemente, se ha encontrado que dichos "antimiR"' cortos proporcionan una inhibición específica mejorada de los microARN in vivo, al tiempo que conservan una notable especificidad por la diana de microARN. Se ha encontrado que es un beneficio adicional la capacidad de inhibir varios microARN simultáneamente debido a la conservación de secuencias cortas homólogas entre especies de microARN, tales como las regiones semilla como se describen en el presente documento. De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que es particularmente ventajoso tener oligonucleótidos cortos de 7, 8, 9 o 10 nucleótidos, tales como 7, 8 o 9 nucleótidos.
Secuencias
La secuencia de nucleótidos contigua es complementaria (tal como un 100 % complementaria, es decir, perfectamente complementaria) de una región correspondiente de una secuencia de microARN de mamífero, humana o vírica (miARN), preferentemente una secuencia de miARN humana o vírica.
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La secuencia de microARN puede ser adecuadamente un microARN maduro. En algunos modos de realización, el microARN puede ser un precursor de microARN.
La secuencia de microARN humana puede seleccionarse de las SEQ ID NO: 1-558 como se divulga en el documento WO2008/046911. Como se describe en el documento WO2008/046911, estos microARN están asociados con cáncer.
La secuencia de microARN vírica se puede seleccionar, en algunos modos de realización, del grupo que consiste en herpesvirus simple 1, herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi, virus de Epstein Barr y citomegalovirus humano.
En un modo de realización, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria (tal como un 100 % complementaria) de una región correspondiente de una secuencia de miARN seleccionada del grupo de miARN enumerados en la tabla 1. La tabla 1 proporciona oligómeros heptaméricos, octaméricos y nonaméricos que se dirigen a microRNAs humanos y víricos publicados en miRBase (edición 12.0 -
https://microrna.sanger.ac.uk/sequences/).
En algunos modos de realización, los oligómeros de acuerdo con la invención pueden consistir en o comprender una secuencia de nucleótidos contigua que es complementaria de una secuencia de microARN correspondiente seleccionada del grupo que consiste en miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR- 34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR- 222 y miR-375.
Por lo tanto, en un modo de realización, el miARN (es decir, miARN diana) se selecciona del grupo que consiste en miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR- 122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR-222 y miR-375.
En un modo de realización, la diana de miARN es un miembro de la agrupación de miR 17-92, tal como miR 17, miR 106a, miR 106b, miR 18, miR 19a, miR 19b/1, miR 19b/2, miR20/93, miR92/1, miR92/2 y miR25.
En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria de una región correspondiente de una secuencia de microARN (miARN) seleccionada del grupo que consiste en miR-21, miR-155, miR-221, mir-222 y mir-122.
En algunos modos de realización, dicho miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-1, miR-10, miR-29, miR- 125b, miR-126, miR-133, miR-141, miR-143, miR-200b, miR-206, miR-208, miR-302, miR-372, miR-373, miR-375 y miR-520c/e.
En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria de una región correspondiente de una secuencia de microARN (miARN) presente en el agrupamiento de miR 17-92, tal como un microARN seleccionado del grupo que consiste en miR-17-5p, miR-20a/b , miR-93, miR-106a/b, miR-18a/b, miR- 19a/b, miR-25, miR-92a y miR-363.
En un modo de realización, el miARN (es decir, miARN diana) es miR-21, tal como hsa-miR-21. En un modo de realización, el miARN (es decir, miARN diana) es miR-122, tal como hsa-miR-122. En un modo de realización, el miARN (es decir, miARN diana) es miR-19b, tal como hsa-miR-19b. En un modo de realización, el miARN (es decir, miARN diana) es miR-155, tal como hsa-miR-155. En un modo de realización, el miARN (es decir, miARN diana) es miR-375, tal como hsa-miR-375. En un modo de realización, el miARN (es decir, miARN diana) es miR-375, tal como hsa-miR-106b.
Adecuadamente, la secuencia de nucleótidos contigua puede ser complementaria de una región correspondiente del microARN, tal como un hsa-miR seleccionado del grupo que consiste en 19b, 21, 122, 155 y 375.
La región semilla y las secuencias semilla
Los inventores han encontrado que oligonucleótidos monocatenarios cortos cuidadosamente diseñados que comprenden o consisten en análogos de nucleótidos, tales como análogos de nucleótidos de alta afinidad tales como unidades de ácido nucleico bloqueado (LNA), muestran un silenciamiento significativo de microARN, que da como resultado niveles reducidos de microARN. Se ha encontrado que la unión estrecha de dichos oligonucleótidos a la llamada secuencia semilla, típicamente los nucleótidos 2 a 8 o 2 a 7, contando desde el extremo 5', de los microARN diana era importante. El nucleótido 1 de los microARN diana es una base sin apareamiento y muy probablemente esté oculta en un bolsillo de unión en la proteína Ago 2. Aunque sin desear estar ligados a una teoría específica, los presentes inventores consideran que seleccionando las secuencias de la región semilla, particularmente con oligonucleótidos que comprenden LNA, en la región que es complementaria de la región semilla, el dúplex entre miARN y oligonucleótido es particularmente eficaz en dirigirse a miARN, evitando efectos fuera de la diana, y posiblemente proporcionando un rasgo adicional que impide la función de miARN dirigida por RISC.
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Los inventores han encontrado que el silenciamiento de microARN se potencia aún más cuando los oligonucleótidos monocatenarios modificados con LNA no contienen un nucleótido en el extremo 3' correspondiente a este nucleótido 1 no apareado. Se ha encontrado además que al menos dos unidades de LNA en el extremo 3' de los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención hacían dichos oligonucleótidos altamente resistentes a las nucleasas.
En un modo de realización, el primer o segundo nucleótido en 3' del oligómero corresponde al segundo nucleótido en 5' de la secuencia de microARN.
En un modo de realización, las unidades de nucleótidos 1 a 6 (inclusive) del oligómero medidas desde el extremo 3' de la región del oligómero son complementarias de la secuencia de la región semilla de microARN.
En un modo de realización, las unidades de nucleótidos 1 a 7 (inclusive) del oligómero medidas desde el extremo 3' de la región del oligómero son complementarias de la secuencia de la región semilla de microARN.
En un modo realización, las unidades de nucleótidos 2 a 7 (inclusive) del oligómero medidas desde el extremo 3' de la región del oligómero son complementarias de la secuencia de la región semilla de microARN.
En un modo de realización, el oligómero comprende al menos una unidad de LNA, en una posición que está dentro de la región complementaria de la región semilla de miARN. El oligómero puede comprender, en un modo de realización, entre 1 y 6 o entre 1 y 7 unidades de análogos de nucleótidos, tales como entre 1 y 6 y 1 y 7 unidades de LNA, en una posición que está dentro de la región complementaria de la región semilla de miARN.
En un modo de realización, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria (tal como un 100 % complementaria) de la secuencia semilla de dicho microARN.
En un modo de realización, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de las secuencias semilla enumeradas en la tabla 1.
En un modo de realización, el nucleótido en 3' de la secuencia semilla forma el nucleótido más en 3' de la secuencia de nucleótidos contigua, en el que la secuencia de nucleótidos contigua puede, opcionalmente, comprender uno o dos nucleótidos adicionales en 5' a la secuencia semilla.
En un modo de realización, el oligómero no comprende un nucleótido que corresponda al primer nucleótido presente en la secuencia de microARN contada desde el extremo 5'.
En un modo de realización, el oligonucleótido de acuerdo con la invención no comprende un nucleótido en el extremo 3' que corresponda al primer nucleótido en el extremo 5' del microARN diana.
Análogos de nucleótidos
De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que es particularmente ventajoso tener oligonucleótidos cortos de 7, 8, 9 o 10 nucleótidos, tales como 7, 8 o 9 nucleótidos, en los que el 100 % de las unidades de nucleótidos del oligómero son unidades de nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA).
En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención tiene una lontidud de 7, 8 o 9 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es complementaria de una región semilla de un microARN humano o vírico, y en la que el 100 % de los nucleótidos son unidades de nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA).
En dichos oligómeros, al menos un 75 % de los grupos de enlace internucleosídico son enlaces fosforotioato.
Todas las unidades de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos contigua son unidades de nucleótidos LNA.
En un modo de realización, la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 7, 8, 9 o 10 unidades de nucleótidos LNA contiguas.
En un modo de realización preferente adicional, el oligonucleótido de la invención tiene una longitud de 7, 8 o 9 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es complementaria de una región semilla de un microARN humano o vírico, y en la que todos los nucleótidos son LNA, y en la que al menos un 80 %, tal como un 85 %, tal como un 90 %, tal como un 95 %, tal como un 100 %, de los enlaces internucleotídicos son enlaces fosforotioato. Se reconocerá que la secuencia de nucleótidos contigua del oligómero (una secuencia semilla) puede extenderse más allá de la región semilla.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención tiene una longitud de 7 nucleótidos, que son todos LNA.
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Los análogos de nucleótidos de alta afinidad son análogos de nucleótidos que dan como resultado oligonucleótidos que tienen una mayor estabilidad térmica del dúplex con un nucleótido de ARN complementario que la afinidad de unión de un nucleótido de ADN equivalente. Esto puede determinarse midiendo la Tm.
En un modo de realización, el oligómero tiene al menos 7 unidades de LNA, tal como al menos 8 unidades de LNA, tal como al menos 9 unidades de LNA, tal como 10 LNA.
En un modo de realización en el que al menos una de las unidades de LNA es citosina o guanina, tal como entre 1-10 de las unidades de LNA, es citosina o guanina, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de las unidades de LNA, son citosina o guanina.
En un modo de realización, al menos dos de las unidades de LNA son citosina o guanina. En un modo de realización, al menos tres de las unidades de LNA son citosina o guanina. En un modo de realización, al menos cuatro de las unidades de LNA son citosina o guanina. En un modo de realización, al menos cinco de las unidades de LNA son citosina o guanina. En un modo de realización, al menos seis de las unidades de LNA son citosina o guanina. En un modo de realización, al menos siete de las unidades de LNA son citosina o guanina. En un modo de realización, al menos ocho de las unidades de LNA son citosina o guanina.
En un modo de realización preferente, las unidades de LNA tienen una mayor estabilidad térmica del dúplex para un nucleótido de ARN complementario que la afinidad de unión de un nucleótido de ADN equivalente a dicho nucleótido de ARN complementario.
En un modo de realización, las unidades de LNA confieren una mayor estabilidad sérica al oligonucleótido monocatenario.
Aunque las SEQ ID específicas en el listado de secuencias y la tabla 1 hacen referencia a oligómeros de monómeros de LNA con cadena principal de fosforotioato (PS), se reconocerá que la invención también abarca el uso de otros enlaces, siempre que un 75 % de los enlaces sean fosforotioato. Como tal, la secuencia de nucleótidos (bases) mostrada en los listados de secuencias puede ser de LNA tal como LNA/PS, LNA o puede ser oligómeros que contienen una química de enlace alternativa, al tiempo que retienen la misma secuencia de bases (A, T, C o G), a condición de que un 75 % de enlaces sean fosforotioato.
LNA
Cuando se usan en el presente contexto, los términos "unidad de LNA", "monómero de LNA", "residuo de LNA", "unidad de ácido nucleico bloqueado", "monómero de ácido nucleico bloqueado" o "residuo de ácido nucleico bloqueado" hacen referencia a un análogo de nucleósido bicíclico. Las unidades de LNA se describen, entre otros, en los documentos WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 y WO 03/095467. La unidad de LNA también se puede definir con respecto a su fórmula química. Por tanto, una "unidad de LNA", como se usa en el presente documento, tiene la estructura química mostrada en el Esquema 1 a continuación:
imagen1
en el que
X se selecciona del grupo que consiste en O, S y NRH, en el que RH es H o alquilo C1-4 e Y es (-CH2)r, en el que r es un número entero de 1-4; y B es una base nitrogenada.
En un modo de realización preferente de la invención, r es 1 o 2, en particular 1, es decir, una unidad de LNA preferente tiene la estructura química mostrada en el Esquema 2 a continuación:
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en el que X y B son como se definen anteriormente.
En un modo de realización interesante, las unidades de LNA incorporadas en los oligonucleótidos de la invención se seleccionan independientemente del grupo que consiste en unidades de tio-LNA, unidades de amino-LNA y unidades de oxi-LNA.
Por tanto, la unidad de tio-LNA puede tener la estructura química mostrada en el Esquema 3 a continuación:
imagen3
en el que B es como se define anteriormente.
Preferentemente, la unidad de tio-LNA está en su forma beta-D, es decir, que tiene la estructura mostrada en 3A anteriormente; asimismo, la unidad de amino-LNA puede tener la estructura química mostrada en el Esquema 4 a continuación:
imagen4
en el que B y RH son como se definen anteriormente.
Preferentemente, la unidad de amino-LNA está en su forma beta-D, es decir, tiene la estructura mostrada en 4A anteriormente.
La unidad de oxi-LNA puede tener la estructura química que se muestra en el Esquema 5 a continuación:
imagen5
en el que B es como se define anteriormente.
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Preferentemente, la unidad de oxi-LNA está en su forma beta-D, es decir, que tiene la estructura mostrada en 5A anteriormente. Como se indicó anteriormente, B es una base nitrogenada que puede ser de origen natural o no natural. Los ejemplos específicos de bases nitrogenadas incluyen adenina (A), citosina (C), 5-metilcitosina (MeC), isocitosina, pseudoisocitosina, guanina (G), timina (T), uracilo (U), 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo , 5-propinil-6,5- metiltiazoluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, 2,6-diaminopurina, 7-propino-7-desazadenina, 7-propino-7- desazaguanina y 2-cloro-6-aminopurina.
El término "unidad de tio-LNA" hace referencia a una unidad de LNA en la que X en el Esquema 1 es S. Una unidad de tio-LNA puede estar tanto en la forma beta-D como en la forma alfa-L. En general, se prefiere la forma beta-D de la unidad de tio-LNA. La forma beta-D y la forma alfa-L de una unidad de tio-LNA se muestran en el Esquema 3 como compuestos 3A y 3B, respectivamente.
El término "unidad de amino-LNA" hace referencia a una unidad de LNA en la que X en el Esquema 1 es NH o NRH, en el que RH es hidrógeno o alquilo C1-4. Una unidad de amino-LNA puede estar tanto en la forma beta-D como en la forma alfa-L. En general, se prefiere la forma beta-D de la unidad de amino-LNA. La forma beta-D y la forma alfa-L de una unidad de amino-LNA se muestran en el Esquema 4 como los compuestos 4A y 4B, respectivamente.
El término "unidad de oxi-LNA" hace referencia a una unidad de LNA en la que X en el Esquema 1 es O. Una unidad de oxi-LNA puede estar tanto en la forma beta-D como en la forma alfa-L. En general, se prefiere la forma beta-D de la unidad de oxi-LNA. La forma beta-D y la forma alfa-L de una unidad de oxi-LNA se muestran en el Esquema 5 como compuestos 5A y 5B, respectivamente.
En el presente contexto, se pretende que el término “alquilo C1-6” signifique una cadena de hidrocarburos saturados lineal o ramificada en la que las cadenas más largas tienen de uno a seis átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, ferc-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo y hexilo. Se pretende que una cadena de hidrocarburos ramificada signifique un alquilo C1-6 sustituido en cualquier carbono con una cadena de hicrocarburos.
En el presente contexto, se pretende que el término “alquilo C1-4” signifique una cadena de hidrocarburos saturados lineal o ramificada en la que las cadenas más largas tienen de uno a cuatro átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y ferc-butilo. Se pretende que una cadena de hidrocarburos ramificada signifique un alquilo C1-4 sustituido en cualquier carbono con una cadena de hicrocarburos.
Cuando se usa en el presente documento, el término “alcoxi C1-6” significa alquiloxi C1-6, tal como metoxi, etoxi, n- propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, ferc-butoxi, pentoxi, isopentoxi, neopentoxi y hexoxi.
En el presente contexto, se pretende que el término “alquenilo C2-6” signifique un grupo de hidrocarburos lineal o ramificado que tiene de dos a seis átomos de carbono y que contiene uno o más dobles enlaces. Los ejemplos ilustrativos de grupos alquenilo C2-6 incluyen alilo, homoalilo, vinilo, crotilo, butenilo, butadienilo, pentenilo, pentadienilo, hexenilo y hexadienilo. La posición de la insaturación (el doble enlace) puede estar en cualquier posición a lo largo de la cadena carbonada.
En el presente contexto, se pretende que el término “alquinilo C2-6” signifique grupos de hidrocarburos lineales o ramificados que contienen de dos a seis átomos de carbono y que contienen uno o más triples enlaces. Los ejemplos ilustrativos de grupos alqunilo C2-6 incluyen acetileno, propinilo, butinilo, pentinilo y hexinilo. La posición de insaturación (el triple enlace) puede estar en cualquier posición a lo largo de la cadena carbonada. Más de un enlace puede estar insaturado de modo que el “alquinilo C2-6” sea un diino o enediino como es conocido por el experto en la técnica.
Cuando se hace referencia a sustición de una unidad de ADN por su correspondiente unidad de LNA en el contexto de la presente invención, se pretende que el término “unidad de LNA correspondiente” signifique que la unidad de ADN ha sido reemplazada por una unidad de LNA que contiene la misma base nitrogenada que la unidad de ADN que ha reemplazado, por ejemplo, la unidad de LNA correspondiente de una unidad de ADN que contiene la base nitrogenada A también contiene la base nitrogenada A. La excepción es que, cuando una unidad de ADN contiene la base C, la unidad de LNA correspondiente puede contener la base C o la base MeC, preferentemente MeC.
En el presente documento, el término “unidad que no sea de LNA” hace referencia a un nucleósido diferente de una unidad de LNA, es decir, el término “unidad que no sea de LNA” incluye una unidad de ADN así como una unidad de ARN. Una unidad que no sea de LNA preferente es una unidad de ADN.
Los términos “unidad”, “residuo” y “monómero” se usan indistintamente en el presente documento.
El término “al menos uno” abarca un número entero mayor o igual que 1, tales como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 y así sucesivamente.
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Se pretende que los términos “un” y “una” como se usan sobre un nucleótido, un agente, una unidad de LNA, etc. signifiquen uno o más. En particular, se pretende que la expresión “un componente (tal como un nucleótido, un agente, una unidad de LNA, o similar) seleccionado del grupo que consiste en ...” signifique que se pueden seleccionar uno o más de los componentes citados. Por tanto, se pretende que expresiones como “un componente seleccionado del grupo que consiste en A, B y C” incluyan todas las combinaciones de A, B y C, es decir, A, B, C, A+B, A+C, B+C y A+B+C.
Enlaces internucleosídicos
Se pretende que el término “grupo de enlaces internucleosídicos” signifique un grupo capaz de unir covalentemente dos nucleótidos, tales como entre unidades de ADN, entre unidades de ADN y análogos de nucleótidos, entre dos unidades que no sean de LNA, entre una unidad que no sea de LNA y una unidad de LNA y entre dos unidades de LNA, etc. Los ejemplos incluyen fosfato, grupos fosfodiéster y grupos de fosforotioato.
En algunos modos de realización, al menos uno de los enlaces internucleosídicos en el oligómero es fosfodiéster. Sin embargo, para uso in vivo, pueden preferirse los enlaces fosforotioato.
Los grupos de enlaces internucleosídicos típicos en oligonucleótidos son grupos fosfato, pero estos pueden reemplazarse por grupos de enlaces internucleosídicos que difieren de fosfato. En un modo de realización interesante adicional de la invención, el oligonucleótido de la invención se modifica en su estructura de grupo de enlaces internucleosídicos, es decir, el oligonucleótido modificado comprende un grupo de enlaces internucleosídicos que difiere de fosfato. En consecuencia, en un modo de realización preferente, el oligonucleótido de acuerdo con la presente invención comprende al menos un grupo de enlaces internucleosídicos que difiere de fosfato.
Los ejemplos específicos de grupos de enlaces internucleosídicos que difieren del fosfato
(-O-P(O)2-O-) incluyen -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S- , -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRh)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O- PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRh-, -NRh-P(O)2-O-, -NRh-CO-O-, -NRh-CO-NRh-, -O-CO-O-, -O-CO-NRh-, -NRh-CO-CH2-, - O-CH2-CO-NRh-, -O-CH2-CH2-NRh-, -CO-NRh-CH2-, -CH2-NRh-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S- , -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRh-, -O-CH2-CH2-NRh-CO-CH2-NCH3-O-CH2-, en los que RH es hidrógeno o alquilo C1-4.
Cuando se modifica un grupo de enlaces internucleosídicos, el grupo de enlaces internucleosídicos es preferentemente un grupo fosforotioato (-OP(O,S)-O-). En un modo de realización preferente, todos los grupos de enlaces internucleosídicos de los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención son fosforotioato.
El enlace internucleosídico puede seleccionarse del grupo que consiste en: -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O- PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO- O-, -NRH-CO-NRH-, y/o el enlace internucleosídico puede seleccionarse del grupo que consiste en: -O-CO-O-, -O-CO- NRH -, -NRH -CO-CH2 -, -O-CH2-CO-NR H-, -O-CH2-CH2-NRh-, -CO-NRh- CH2-, -CH2 -NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S- CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2 -CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-0-CH2-, en los que RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4. Adecuadamente, en algunos modos de realización, se pueden preferir enlaces internucleosídicos que contienen azufre (S) como se proporciona anteriormente. Los enlaces internucleosídicos se pueden seleccionar independientemente, o ser todos iguales, tales como enlaces fosforotioato.
En un modo de realización, un 80 u 85 % o 90 % o 95 % o la totalidad de los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos contigua son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
Oligonucleótidos de micromir que se dirigen a más de un microARN
En un modo de realización, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria de la secuencia correspondiente de al menos dos secuencias de miARN tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de miARN. El uso de una única base universal puede permitir que un único oligómero de la invención se dirija a dos microARN independientes que o bien uno o ambos tienen un emparejamiento erróneo único en la región que corresponde al oligómero en la posición en la que se coloca el nucleótido universal.
En un modo de realización, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria de la secuencia de al menos dos secuencias de la región semilla de miARN tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de la región semilla de miARN.
En un modo de realización, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria de la región correspondiente tanto de miR-221 como de miR-222.
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En un modo de realización, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria de la región correspondiente de más de un miembro del agrupamiento de miR-17-92, tal como dos o más o la totalidad de miR-17-5p, miR-20a/b, miR- 93, miR-106a/b; o dos o más o la totalidad de miR-25, miR-92a y miR-363.
En un modo de realización, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria de 5'GCTACAT3'.
Composición farmacéutica y aplicación médica
La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el oligómero de acuerdo con la invención, y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además el uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención, tal como aquellos que pueden formar parte de la composición farmacéutica, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión (regulación positiva) del microARN.
La invención proporciona además un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión del microARN, que comprende la etapa de administrar una composición (tal como la composición farmacéutica) de acuerdo con la invención a una persona que necesite tratamiento
La invención proporciona además un procedimiento para reducir la cantidad eficaz de un miARN en una célula o un organismo, que comprende administrar una composición (tal como la composición farmacéutica) de acuerdo con la invención o un oligómero de acuerdo la invención a la célula o al organismo. Reducir la cantidad eficaz en este contexto hace referencia a la reducción de miARN funcional presente en la célula u organismo. Se reconoce que los oligonucleótidos preferentes de acuerdo con la invención pueden no reducir siempre significativamente la cantidad real de miARN en la célula u organismo, ya que típicamente forman dúplexes muy estables con sus dianas de miARN. La reducción de la cantidad eficaz del miARN en una célula puede medirse, en un modo de realización, detectando el nivel de desrepresión de la diana de miARN en la célula.
La invención proporciona además un procedimiento para la desrepresión de un ARNm diana de un miARN en una célula o un organismo, que comprende administrar una composición (tal como la composición farmacéutica) o un oligómero de acuerdo con la invención a la célula o al organismo.
La invención proporciona además el uso de un oligómero de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión del microARN.
En un modo de realización, la afección médica (o enfermedad) es hepatitis C (VHC) y el miARN es miR-122.
En un modo de realización, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención es para uso en el tratamiento de un trastorno médico o enfermedad seleccionado del grupo que consiste en: infección por el virus de la hepatitis C e hipercolesterolemia y trastornos relacionados, y cánceres.
En un modo de realización, el trastorno médico o enfermedad es una enfermedad del SNC, tal como una enfermedad del SNC en la que se sabe que están indicados uno o más microARN.
En el contexto de la hipercolesterolemia, trastornos relacionados hacen referencia a enfermedades tales como aterosclerosis o hiperlipidemia. Otros ejemplos de enfermedades relacionadas también incluyen diferentes tipos de desequilibrio de colesterol HDL/LDL; dislipidemias, por ejemplo, hiperlipidemia combinada familiar (FCHL), hiperlipidemia adquirida, hipercolesterolemia resistente a las estatinas; enfermedad arterial coronaria (CAD), cardiopatía coronaria (CHD) y aterosclerosis.
En un modo de realización, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende además un segundo principio activo independiente que es un inhibidor de la ruta de ensamblaje del VLDL, tal como un inhibidor de ApoB o un inhibidor de MTP (tales como los divulgados en el documento US 60/977.497, incorporado en el presente documento por referencia).
La divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión del microARN, que comprende la etapa de administrar una composición (tal como la composición farmacéutica) que comprende un oligómero de la invención a una persona que necesite tratamiento.
La divulgación proporciona un procedimiento para reducir la cantidad eficaz de una diana de miARN (es decir, el miARN “disponible") en una célula o un organismo, que comprende administrar una composición (tal como la composición farmacéutica) que comprende un oligómero de la invención a la célula o al organismo.
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Debe reconocerse que “reducir la cantidad eficaz” de uno o más microARN en una célula u organismo hace referencia a la inhibición de la función de microARN en la célula u organismo. La célula es preferentemente una célula de mamífero o una célula humana que expresa el microARN o los microARN.
La divulgación proporciona un procedimiento para la desrepresión de un ARNm diana de un miARN en una célula o un organismo, que comprende un oligómero de la invención (o una composición que comprende dicho oligonucleótido) para la célula o el organismo.
Como se mencionó anteriormente, los microARN están relacionados con diversas enfermedades. Por ello, un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de un oligonucleótido como se define en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de microARN seleccionada del grupo que consiste en atrofia muscular espinal, síndrome de Tourette, hepatitis C, retraso mental por cromosoma X frágil, síndrome de DiGeorge y cáncer, tal como en un ejemplo no limitante, leucemia linfocítica crónica, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de colon, en particular cáncer.
Procedimientos de síntesis
La divulgación proporciona un procedimiento para la síntesis de un oligómero de la invención dirigido contra un microARN humano, tal como un oligómero descrito en el presente documento, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
a. Seleccionar opcionalmente un primer nucleótido, contando desde el extremo 3', que es un nucleótido LNA.
b. Seleccionar opcionalmente un segundo nucleótido, contando desde el extremo 3', que es un nucleótido LNA.
c. Seleccionar una región del oligómero que corresponde a la región semilla del miARN, en la que dicha región es como se define en el presente documento.
d. Seleccionar un séptimo y opcionalmente un octavo nucleótidos como se define en el presente documento.
e. Seleccionar opcionalmente uno o dos extremos 5' adicionales del oligómero como se define en el presente documento;
en el que la síntesis se realiza por síntesis secuencial de las regiones definidas en las etapas a-e, en el que dicha síntesis puede realizarse en la dirección 3'-5' (a a f) o 5'-3' (e a a), y en el que dicho oligómero es complementario de una secuencia de la diana de miARN.
La invención proporciona además un procedimiento para la preparación de un oligómero (tal como un oligómero de acuerdo con la invención), comprendiendo dicho procedimiento las etapas de a) comparar las secuencias de dos o más secuencias de miARN para identificar dos o más secuencias de miARN que comprendan una secuencia de nucleótidos contigua común de al menos 7 nucleótidos de longitud, tal como 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud (es decir, una secuencia encontrada en ambos miRNA no idénticos), b) preparar una secuencia de oligómero que consista en o comprenda una secuencia de nucleótidos contigua que es complementaria de dicha secuencia de nucleótidos contigua común, en la que dicho oligómero es como de acuerdo con el oligómero de la invención. En un ejemplo preferente, la secuencia de nucleótidos contigua común consiste en o comprende la región semilla de cada una de dichas dos o más secuencias de miARN (que comprenden una secuencia de nucleótidos contigua común de al menos 6 nucleótidos de longitud). En un modo de realización, las regiones semilla de los dos o más miARN son idénticas. Adecuadamente, el oligómero consiste en o comprende una secuencia semilla de 7 u 8 nucleótidos de longitud que comprende una secuencia que es complementaria de dichos dos o más miARN. Este procedimiento se puede usar junto con la etapa c del procedimiento anterior.
El procedimiento para la síntesis del oligómero de acuerdo con la invención se puede realizar usando la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida estándar.
En un modo de realización, el procedimiento para la síntesis de un oligómero dirigido hacia un microARN humano se realiza en la dirección 3' a 5' a-e.
Un aspecto adicional de la invención es un procedimiento para reducir los niveles de microARN diana poniendo en contacto el microARN diana con un oligonucleótido como se define en el presente documento, en el que el oligonucleótido (i) es complementario de la secuencia de microARN diana y (ii) no contiene un nucleótido en el extremo 3' que corresponda al primer nucleótido del extremo 5' del microARN diana.
Estabilidad y Tm del dúplex
En un modo de realización, el oligómero de la invención es capaz de formar un dúplex con una molécula de ácido nucleico de ARN monocatenario complementario (típicamente de aproximadamente la misma longitud que dicho
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oligonucleótido monocatenario) con enlaces internucleosídicos de fosfodiéster, en el que el dúplex tiene una Tm de entre 30 °C y 70 °C u 80 °C, tal como entre 30 °C y 60 °C o 70 °C, o entre 30 °C y 50 °C o 60 °C. En un modo de realización, la Tm es de al menos 40 °C. La Tm puede determinarse determinando la Tm del oligómero y una diana de ARN complementario en las siguientes condiciones de tampón: NaCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, fosfato de Na 10 mM, pH 7.0 (véanse los ejemplos para un protocolo detallado). Un análogo de alta afinidad se puede definir como un análogo que, cuando se usa en el oligómero de la invención, da como resultado un aumento en la Tm del oligómero en comparación con un oligómero idéntico que solo contiene bases de ADN.
Conjugados
En un modo de realización, dicho oligómero se conjuga con uno o más compuestos no nucleotídicos (o polinucleotídicos).
En el contexto, se pretende que el término “conjugado” indique una molécula heterogénea formada por unión covalente (“conjugación”) del oligómero como se describe en el presente documento con uno o más restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos. Los ejemplos de restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos incluyen agentes macromoleculares tales como proteínas, cadenas de ácidos grasos, restos de azúcar, glicoproteínas, polímeros o combinaciones de los mismos. Típicamente, las proteínas pueden ser anticuerpos contra una proteína diana. Los polímeros típicos pueden ser polietilenglicol.
Por lo tanto, en diversos modos de realización, el oligómero de la invención puede comprender tanto una región polinucleotídica que típicamente consiste en una secuencia contigua de nucleótidos como una región no nucleotídica adicional. Cuando se hace referencia al oligómero de la invención que consiste en una secuencia de nucleótidos contigua, el compuesto puede comprender componentes no nucleotídicos, tales como un componente conjugado.
En diversos modos de realización de la invención, el compuesto oligomérico se une a ligandos/conjugados, que se pueden usar, por ejemplo, para aumentar la captación celular de compuestos oligoméricos. El documento WO2007/031091 proporciona ligandos y conjugados adecuados.
La invención también proporciona un conjugado que comprende el compuesto de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento, y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico unido covalentemente a dicho compuesto. Por lo tanto, en diversos modos de realización en los que el compuesto de la invención consiste en una secuencia especificada de ácidos nucleicos o nucleótidos, el compuesto también puede comprender al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico (por ejemplo, que no comprenda uno o más nucleótidos o análogos de nucleótidos) unido covalentemente a dicho compuesto.
La conjugación (con un resto conjugado) puede potenciar la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligómero de la invención. Dichos restos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, polipéptidos, restos lipídicos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-s-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, dodecandiol o restos de undecilo, fosfolípidos, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-o-hexadecil- rac-glicero-3-h-fosfonato de trietilamonio, una cadena de poliamina o polietilenglicol, un ácido adamantanoacético, un resto de palmitilo, un resto de octadecilamina o hexilaminocarboniloxicolesterol.
Los oligonucleótidos de la invención también se pueden conjugar con sustancias farmacéuticas activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, una sulfamida, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.
En ciertos modos de realización, el resto conjugado es un esterol, tal como colesterol.
En diversos modos de realización, el resto conjugado comprende o consiste en un polímero cargado positivamente, tal como péptidos cargados positivamente de, por ejemplo, entre 1-50, tal como 2-20 tal como 3-10 residuos de aminoácidos de longitud, y/o poli(óxido de alquileno) tal como polietilglicol (PEG) o polipropilenglicol; véase el documento WO 2008/034123. Adecuadamente, el polímero cargado positivamente, tal como un poli(óxido de alquileno), se puede unir con el oligómero de la invención mediante un conector tal como el conector liberable descrito en el documento WO 2008/034123.
A modo de ejemplo, los siguientes restos conjugados se pueden usar en los conjugados de la invención:
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Oligómeros activados
El término “oligómero activado”, como se usa en el presente documento, hace referencia a un oligómero de la invención que está unido covalentemente (es decir, funcionalizado) a al menos un resto funcional que permite el enlace covalente del oligómero con uno o más restos conjugados, es decir, restos que no son en sí mismos ácidos nucleicos o monómeros, para formar los conjugados descritos en el presente documento. Típicamente, un resto funcional comprenderá un grupo químico que es capaz de unirse covalentemente al oligómero mediante, por ejemplo, un grupo 3'-hidroxilo o el grupo NH2 exocíclico de la base de adenina, un espaciador que es preferentemente hidrófilo y un grupo terminal que es capaz de unirse a un resto conjugado (por ejemplo, un grupo amino, sulfhidrilo o hidroxilo). En algunos modos de realización, este grupo terminal no está protegido, por ejemplo, es un grupo NH2. En otros modos de realización, el grupo terminal está protegido, por ejemplo, por cualquier grupo protector adecuado tal como los descritos en “Protective Groups in Organic Synthesis” por Theodora W Greene y Peter GM Wuts, 3.a edición (John Wiley & Sons, 1999). Los ejemplos de grupos protectores de hidroxilo adecuados incluyen ésteres tales como éster de acetato, grupos aralquilo tales como bencilo, difenilmetilo o trifenilmetilo y tetrahidropiranilo. Los ejemplos de grupos protectores de amino adecuados incluyen grupos bencilo, alfa-metilbencilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, benciloxicarbonilo, ferc-butoxicarbonilo y acilo tales como tricloroacetilo o trifluoroacetilo. En algunos modos de realización, el resto funcional es autoescindible. En otros modos de realización, el resto funcional es biodegradable. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.087.229.
En algunos modos de realización, los oligómeros de la invención se funcionalizan en el extremo 5' para permitir la unión covalente del resto conjugado al extremo 5' del oligómero. En otros modos de realización, los oligómeros de la invención se pueden funcionalizar en el extremo 3'. En otros modos de realización más, los oligómeros de la invención se pueden funcionalizar a lo largo de la cadena principal o en el resto de la base heterocíclica. En aún otros modos de realización, los oligómeros de la invención se pueden funcionalizar en más de una posición seleccionada independientemente del extremo 5', el extremo 3', la cadena principal y la base.
En algunos modos de realización, los oligómeros activados de la invención se sintetizan incorporando durante la síntesis uno o más monómeros que están unidos covalentemente a un resto funcional. En otros modos de realización, los oligómeros activados de la invención se sintetizan con monómeros que no se han funcionalizado y el oligómero se funcionaliza una vez completada la síntesis. En algunos modos de realización, los oligómeros se funcionalizan con un éster impedido que contiene un conector aminoalquilo, en el que la porción alquilo tiene la fórmula (CH2)W, en la que w es un número entero que varía de 1 a 10, preferentemente aproximadamente 6, en la que la porción alquilo del grupo alquilamino puede ser de cadena lineal o de cadena ramificada, y en la que el grupo funcional está unido al oligómero a través de un grupo éster (-OC(O)-CH2)wNH).
En otros modos de realización, los oligómeros se funcionalizan con un éster impedido que contiene un conector (CH2)w- sulfhidrilo (SH), en el que w es un número entero que varía de 1 a 10, preferentemente aproximadamente 6, en el que la porción alquilo del grupo alquilamino puede ser de cadena lineal o de cadena ramificada, y en el que el grupo funcional está unido al oligómero a través de un grupo éster (-OC(O)-(CH2)wSH).
En algunos modos de realización, los oligonucleótidos activados con sulfhidrilo se conjugan con restos poliméricos tales como polietilenglicol o péptidos (mediante la formación de un enlace disulfuro).
Los oligómeros activados que contienen ésteres impedidos como se describió anteriormente se pueden sintetizar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, y en particular mediante procedimientos divulgados en la publicación PCT N.° WO 2008/034122 y los ejemplos en la misma.
En otros modos de realización más, los oligómeros de la invención se funcionalizan introduciendo grupos sulfhidrilo, amino o hidroxilo en el oligómero por medio de un reactivo de funcionalización sustancialmente como se describe en las patentes de EE. UU. n.° 4.962.029 y 4.914.210, es decir, un reactivo sustancialmente lineal que tiene una fosforamidita en un extremo enlazada a través de una cadena espaciadora hidrófila al extremo opuesto que comprende un grupo sulfhidrilo, amino o hidroxilo protegido o no protegido. Dichos reactivos reaccionan principalmente con grupos hidroxilo del oligómero. En algunos modos de realización, dichos oligómeros activados tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo 5'-hidroxilo del oligómero. En otros modos de realización, los oligómeros activados tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo 3'-hidroxilo. En otros modos de realización más, los oligómeros activados de la invención tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo hidroxilo en la cadena principal del oligómero. En aún otros modos de realización, el oligómero de la invención se funcionaliza con más de uno de los reactivos de funcionalización como se describen en las patentes de EE. UU. n.° 4.962.029 y 4.914.210. Los procedimientos para sintetizar dichos reactivos de funcionalización e incorporarlos a monómeros u oligómeros se divulgan en las patentes de EE. UU. n.° 4.962.029 y 4.914.210.
En algunos modos de realización, el extremo 5' de un oligómero unido en fase sólida se funcionaliza con un derivado de dienilfosforamidita, seguido de la conjugación del oligómero desprotegido con, por ejemplo, un aminoácido o péptido mediante una reacción de cicloadición de Diels-Alder.
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En diversos modos de realización, la incorporación de monómeros que contienen modificaciones de azúcar en 2', tales como azúcar sustituido con 2'-carbamato o un azúcar 2'-(0-pentil-A/-ftalimido)desoxirribosa en el oligómero, facilita la unión covalente de restos conjugados con los azúcares del oligómero. En otros modos de realización, se prepara un oligómero con un conector que contiene amino en la posición 2' de uno o más monómeros usando un reactivo tal como, por ejemplo, 5'-dimetoxitritil-2'-0-(e-ftalimidilaminopentil)-2'-desoxiadenosin-3'-W,W-
diisopropilcianoetoxifosforamidita. Véase, por ejemplo, Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991,34, 7171.
En otros modos de realización más, los oligómeros de la invención pueden tener restos funcionales que contengan amina en el nucleótido, incluyendo en los grupos N6 amino purina, en el N2 exocíclico de guanina, o en las posiciones N4 o 5 de citosina. En diversos modos de realización, dicha funcionalización se puede lograr usando un reactivo comercial que ya está funcionalizado en la síntesis de oligómeros.
Algunos restos funcionales están disponibles comercialmente, por ejemplo, están disponibles restos de unión heterobifuncionales y homobifuncionales en Pierce Co. (Rockford, III). Otros grupos de unión disponibles comercialmente son los reactivos 5'-Amino-Modifier C6 y 3'-Amino-Modifier, ambos disponibles en Glen Research Corporation (Sterling, VA). El 5'-Amino-Modifier C6 también está disponible en ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) como Aminolink-2, y 3'-Amino-Modifier también está disponible en Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.)
Tratamiento y composiciones farmacéuticas - formulación y administración
Como se explicó inicialmente, los oligonucleótidos de la invención constituirán fármacos adecuados con propiedades mejoradas. El diseño de un fármaco potente y seguro requiere el ajuste de varios parámetros, tales como afinidad/especificidad, estabilidad en fluidos biológicos, captación celular, modo de acción, propiedades farmacocinéticas y toxicidad.
En consecuencia, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de acuerdo con la invención y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, dicho vehículo es solución salina o solución salina tamponada.
En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un oligonucleótido de acuerdo con la presente invención para uso como medicamento.
Como se entenderá, la dosificación depende de la gravedad y el grado de respuesta de la enfermedad que se va a tratar, y del curso de tratamiento, que dura desde varios días a varios meses, o hasta que se consiga una curación o una atenuación de la enfermedad. Las pautas de dosificación óptimas se pueden calcular a partir de las mediciones de la acumulación de fármaco en el organismo del paciente. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales. En general, se puede estimar basándose en las CE50 que se han encontrado eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificación es desde 0,01 gg a 1 g por kg de peso corporal, y se puede administrar una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 10 años o por infusión continua durante horas hasta varios meses. Las tasas de repetición para la dosificación se pueden estimar basándose en los tiempos de permanencia y las concentraciones medidos del fármaco en tejidos o fluidos corporales. Después de un tratamiento con éxito, puede ser deseable que el paciente se someta a un tratamiento de mantenimiento para prevenir la recidiva de la enfermedad.
Como se indica anteriormente, la invención también se refiere a una composición farmacéutica, que comprende al menos un oligonucleótido de la invención como principio activo. Se debe entender que la composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende opcionalmente un vehículo farmacéutico y que la composición farmacéutica comprende opcionalmente compuestos adicionales, tales como compuestos quimioterápicos, compuestos antiinflamatorios, compuestos antivíricos y/o compuestos inmunomoduladores.
Los oligonucleótidos de la invención se pueden usar “tal cual” o en forma de una variedad de sales farmacéuticamente aceptables. Como se usa en el presente documento, el término “sales farmacéuticamente aceptables” hace referencia a sales que conservan la actividad biológica deseada de los compuestos identificados en el presente documento y presentan efectos toxicológicos no deseados mínimos. Se pueden formar ejemplos no limitantes de dichas sales con sales de adición de bases y aminoácidos orgánicos formadas con cationes de metal, tales como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio y similares o con un catión formado a partir de amoníaco, W,W-dibenciletilendiamina, D-glucosamina, tetraetilamonio o etilendiamina.
En un modo de realización de la invención, el oligonucleótido puede estar en forma de un profármaco. Los oligonucleótidos son, en consecuencia, iones cargados negativamente. Debido a la naturaleza lipófila de las membranas celulares, la captación celular de oligonucleótidos se reduce en comparación con los equivalentes neutros o lipófilos. Este “impedimento” de polaridad se puede evitar usando el enfoque del profármaco (véase, por ejemplo, Crooke, R. M. (1998) en Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlín, Alemania, vol. 131, pág. 103-140).
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Los agentes aglutinantes y adyuvantes farmacéuticamente aceptables pueden comprender parte del fármaco formulado.
Los ejemplos de procedimientos de administración para el la administración de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento, así como detalles de formulaciones farmacéuticas, sales, pueden estar bien descritos en otra parte, por ejemplo, en las solicitudes provisionales de los EE. UU. 60/838.710 y 60/788.995 y la solicitud danesa, PA 2006 00615.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una diversidad de componentes que incluyen, pero no están limitados a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. La administración del fármaco al tejido tumoral se puede potenciar mediante la administración mediada por vehículos, incluyendo, pero no limitado a, liposomas catiónicos, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadena ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas y microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1): 3-27). Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificación unitaria, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con el(los) vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan mezclando uniforme y estrechamente los principios activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y, entonces, si fuera necesario, conformando el producto. Las composiciones de la presente invención se pueden formular en cualquiera de las muchas formas de dosificación posibles, tales como, pero no limitadas a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos y supositorios. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes. Los compuestos de la invención también se pueden conjugar con sustancias farmacéuticas activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, una sulfamida, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.
En otro modo de realización, las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos oligonucleotídicos, dirigidos a un primer microARN y uno o más compuestos oligonucleotídicos adicionales dirigidos a una segunda diana de microARN. Dos o más compuestos combinados se pueden usar conjunta o secuencialmente.
Los compuestos divulgados en el presente documento son útiles para varias aplicaciones terapéuticas, como se indica anteriormente. En general, los procedimientos terapéuticos de la invención incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido a un mamífero, particularmente un ser humano. En cierto modo de realización, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos de la invención, y (b) uno o más agentes quimioterápicos. Cuando se usan con los compuestos de la invención, dichos agentes quimioterápicos se pueden usar individualmente, secuencialmente o en combinación con uno o más de otros de dichos agentes quimioterápicos o en combinación con radioterapia. Todos los agentes quimioterápicos conocidos por un experto en la técnica se incorporan en el presente documento como tratamientos de combinación con el compuesto de acuerdo con la invención. Otros agentes activos, tales como fármacos antiinflamatorios, incluyendo, pero no limitados a, fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, fármacos antivíricos y fármacos inmunomoduladores, también se pueden combinar en las composiciones de la invención. Dos o más compuestos combinados se pueden usar conjunta o secuencialmente.
Ejemplos de indicaciones terapéuticas que pueden tratarse mediante las composiciones farmacéuticas de la invención:
microARN
Posibles indicaciones médicas
miR-1
Arritmia cardíaca
miR-21
Glioblastoma, cáncer de mama, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal, sensibilización de gliomas a fármacos citotóxicos, hipertrofia cardíaca
miR-21, miR-200b y miR-141
Respuesta a la quimioterapia y regulación del crecimiento de colangiocarcinomas
miR-122
Hipercolesterolemia, infección por hepatitis C, hemocromatosis
miR-19b
linfoma y otros tipos de tumores
miR-26a
diferenciación en osteoblastos de células madres humanas
miR-155
linfoma, desarrollo de tumor pancreático, cáncer de mama y pulmón
miR-203
psoriasis
miR-375
diabetes, trastornos metabólicos, secreción de insulina inducida por glucosa a partir de células endocrinas pancreáticas
miR-181
diferenciación de mioblastos, trastornos autoinmunitarios
miR-10b
invasión de células de cáncer de mama y metástasis
miR-125b-1
cáncer de mama, pulmón, ovario y cuello uterino
miR-221 y 222
carcinoma de próstata, carcinoma papilar tiroideo humano, carcinoma hepatocelular humano
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miARN-372 y 373
tumores de células germinales testiculares.
miR-142
leucemia de linfocitos B
Agrupamiento miR-17- 19b
linfomas de linfocitos B, cáncer de pulmón, carcinoma hepatocelular
El ARNm del gen supresor tumoral de tropomiosina 1 (TPM1) se ha indicado como diana de miR-21. El ARNm de miotrofina (mtpn) se ha indicado como diana de miR 375.
En un aspecto adicional más, la presente invención se refiere al uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: aterosclerosis, hipercolesterolemia e hiperlipidemia; cáncer, glioblastoma, cáncer de mama, linfoma, cáncer de pulmón; diabetes, trastornos metabólicos; diferenciación de mioblastos y trastornos inmunitarios.
La invención se refiere además a oligonucleótidos de acuerdo con la invención para el uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: aterosclerosis, hipercolesterolemia e hiperlipidemia; cáncer, glioblastoma, cáncer de mama, linfoma, cáncer de pulmón; diabetes, trastornos metabólicos; diferenciación de mioblastos y trastornos inmunitarios.
La divulgación proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en: aterosclerosis, hipercolesterolemia e hiperlipidemia; cáncer, glioblastoma, cáncer de mama, linfoma, cáncer de pulmón; diabetes, trastornos metabólicos; diferenciación de mioblastos y trastornos inmunitarios, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar un oligonucleótido o composición farmacéutica de la invención al sujeto que lo necesita.
La invención proporciona además un kit que comprende una composición farmacéutica de acuerdo con la invención y un segundo principio activo independiente que es un inhibidor de la ruta de ensamblado del VLDL, tal como un inhibidor de ApoB, o un inhibidor de MTP.
Cáncer
En un aspecto adicional más, la presente invención se refiere al uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento la profilaxis contra, el cáncer, comprendiendo dicho procedimiento administrar un oligonucleótido de la invención o una composición farmacéutica de la invención a un paciente que lo necesita.
Dichos cánceres pueden incluir neoplasia linforreticular, leucemia linfoblástica, tumores cerebrales, tumores gástricos, plasmocitomas, mieloma múltiple, leucemia, tumores del tejido conjuntivo, linfomas y tumores sólidos.
En el uso de un compuesto de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, dicho cáncer puede estar adecuadamente en forma de un tumor sólido. De forma análoga, en el procedimiento para tratar el cáncer divulgado en el presente documento, dicho cáncer puede estar adecuadamente en forma de un tumor sólido.
Además, dicho cáncer también es adecuadamente un carcinoma. El carcinoma típicamente se selecciona del grupo que consiste en melanoma maligno, carcinoma de células basales, carcinoma de ovario, carcinoma de mama, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma de células renales, carcinoma de vejiga, cáncer superficial de vejiga recurrente, carcinoma de estómago, carcinoma de próstata, carcinoma de páncreas, carcinoma de pulmón, carcinoma de cuello uterino, displasia de cuello uterino, papilomatosis laríngea, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal y tumores carcinoides. Más típicamente, dicho carcinoma se selecciona del grupo que consiste en melanoma maligno, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma de mama, carcinoma de colon y carcinoma de células renales. El melanoma maligno se selecciona típicamente del grupo que consiste en melanoma de extensión superficial, melanoma nodular, melanoma lentiginoso maligno, melanoma acro, melanoma amelanótico y melanoma desmoplásico.
De forma alternativa, el cáncer puede ser adecuadamente un sarcoma. El sarcoma típicamente está en la forma seleccionada del grupo que consiste en osteosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, fibrosarcoma y sarcoma de Kaposi.
De forma alternativa, el cáncer puede ser adecuadamente un glioma.
Un modo de realización adicional se dirige al uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en el que dicho medicamento comprende además un agente quimioterápico seleccionado del grupo que consiste en adrenocorticosteroides, tales como prednisona, dexametasona o decadrona; altretamina (Hexalen, hexametilmelamina (HMM)); amifostina (Ethyol); aminoglutetimida (Cytadren); amsacrina (M-AMSA); anastrozol (Arimidex); andrógenos tales como testosterona; asparaginasa (Elspar); bacilo de Calmette-Guérin; bicalutamida (Casodex); bleomicina (Blenoxane); busulfano (Myleran); carboplatino (Paraplatin); carmustina (BCNU, BiCNU); clorambucilo (Leukeran); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, Leustatin); cisplatino
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De manera similar, la invención se dirige además al uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en el que dicho tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterápico adicional seleccionado del grupo que consiste en adrenocorticosteroides, tales como prednisona, dexametasona o decadrona; altretamina (Hexalen, hexametilmelamina (HMM)); amifostina (Ethyol); aminoglutetimida (Cytadren); amsacrina (M-AMSA); anastrozol (Arimidex); andrógenos tales como testosterona; asparaginasa (Elspar); bacilo de Calmette-Guérin; bicalutamida (Casodex); bleomicina (Blenoxane); busulfano (Myleran); carboplatino (Paraplatin); carmustina (BCNU, BiCNU); clorambucilo (Leukeran); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, Leustatin); cisplatino (Platinol); arabinósido de citosina (citarabina); dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, Cosmegen); daunorubicina (Cerubidina); docetaxel (Taxotere); doxorubicina (Adriamycin); epirubicina; estramustina (Emcyt); estrógenos tales como dietilestilbestrol (DES); etopósido (VP-16, VePesid, Etopophos); fludarabina (Fludara); flutamida (Eulexin); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (Gemzar); goserelina (Zodalex); herceptina (Trastuzumab); hidroxiurea (Hydrea); idarubicina (Idamycin); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina); interferón alfa (Intron A, Roferon A); irinotecán (Camptosar); leuprorelina (Lupron); levamisol (Ergamisole); lomustina (CCNU); clormetina (Mustargen, mostaza nitrogenada); melfalán (Alkeran); mercaptopurina (Purinethol, 6-MP); metotrexato (Mexate); mitomicina-C (Mutamucin); mitoxantrona (Novantrone); octreotida (Sandostatin); pentostatina (2-desoxicoformicina, Nipent); plicamicina (mitramicina, Mithracin); prorocarbazina (Matulane); estreptozocina; tamoxifeno (Nolvadex); taxol (Paclitaxel); tenipósido (Vumon VM-26); tiotepa; topotecán (Hycamtin); tretinoína (Vesanoid, ácido todo-frans-retinoico); vinblastina (Valban); vincristina (Oncovin) y vinorelbina (Navelbine). Adecuadamente, dicho tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterápico adicional seleccionado de taxanos, tales como Taxol, Paclitaxel o Docetaxel.
Dicho de otra forma, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar el cáncer, comprendiendo dicho procedimiento administrar un oligonucleótido de la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención a un paciente que lo necesite, y comprende además la administración de un agente quimioterápico adicional. Dicha administración adicional puede ser tal que el agente quimioterápico adicional se conjugue con el compuesto de la invención, esté presente en la composición farmacéutica, o se administre en una formulación separada.
Enfermedades infecciosas
Se contempla que los compuestos de la invención puedan ser ampliamente aplicables a una amplia variedad de enfermedades infecciosas, tales como difteria, tétanos, tosferina, polio, hepatitis B, hepatitis C, gripe por Hemopilus, sarampión, paperas y rubéola.
El Hsa-miR122 está indicado en la infección por hepatitis C y, como tales, pueden usarse oligonucleótidos de acuerdo con la invención que se dirigen a miR-122 para tratar la infección por hepatitis C.
Por consiguiente, en otro aspecto más, la presente invención se refiere al uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, así como a un procedimiento para tratar una enfermedad infecciosa, comprendiendo dicho procedimiento administrar una oligonucleótido de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención a un paciente que lo necesite.
En un modo de realización preferente, la invención proporciona un tratamiento de combinación que proporciona un oligómero anti-miR-122 en combinación con un inhibidor del ensamblado del VLDL, tal como un inhibidor de apoB o de MTP.
Enfermedades inflamatorias
La respuesta inflamatoria es un mecanismo esencial de defensa del organismo contra el ataque de agentes infecciosos y también está implicada en la patogenia de muchas enfermedades agudas y crónicas, incluidos los trastornos autoinmunitarios. A pesar de ser necesarios para combatir los patógenos, los efectos de una exacerbación inflamatoria pueden ser devastadores. Por lo tanto, a menudo es necesario restringir la sintomatología de la inflamación con el uso
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de fármacos antiinflamatorios. La inflamación es un proceso complejo normalmente desencadenado por una lesión tisular que incluye la activación de un gran conjunto de enzimas, el aumento de la permeabilidad vascular y la extravasación de fluidos sanguíneos, la migración celular y la liberación de mediadores químicos, todos destinados tanto a destruir como a reparar el tejido lesionado.
En aún otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, así como a un procedimiento para tratar una enfermedad inflamatoria, comprendiendo dicho procedimiento administrar un oligonucleótido de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención a un paciente que lo necesita.
En un modo de realización preferente de la invención, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad reumática y/o enfermedades del tejido conjuntivo, tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES) o lupus, esclerodermia, polimiositis, enfermedad inflamatoria intestinal, dermatomiositis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, vasculitis, artritis psoriásica, dermatitis psoriásica exfoliativa, pénfigo vulgar y síndrome de Sjorgren, en particular enfermedad inflamatoria intestinal y enfermedad de Crohn.
De forma alternativa, la enfermedad inflamatoria puede ser una inflamación no reumática, como bursitis, sinovitis, capsulitis, tendinitis y/u otras lesiones inflamatorias de origen traumático y/o deportivo.
Enfermedades metabólicas
Una enfermedad metabólica es un trastorno causado por la acumulación de sustancias químicas producidas naturalmente en el cuerpo. Estas enfermedades suelen ser graves, algunas incluso potencialmente mortales. Otras pueden retrasar el desarrollo físico o causar retraso mental. La mayoría de los bebés con estos trastornos, al principio, no muestran signos evidentes de la enfermedad. Un cribado adecuado al nacer a menudo puede descubrir estos problemas. Con el diagnóstico y tratamiento precoces, las enfermedades metabólicas a menudo se pueden tratar de manera eficaz.
En aún otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención o un conjugado del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad metabólica, así como a un procedimiento para tratar una enfermedad metabólica, comprendiendo dicho procedimiento administrar un oligonucleótido de acuerdo con la invención o un conjugado del mismo, o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención a un paciente que lo necesite.
En un modo de realización preferente de la invención, la enfermedad metabólica se selecciona del grupo que consiste en amiloidosis, biotinidasa, OMIM (Herencia mendeliana en línea en el hombre), síndrome de Crigler Najjar, diabetes, Grupo de apoyo e información de Fabry, trastornos de la oxidación de ácidos grasos, galactosemia, deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), aciduria glutárica, Organización Internacional de Acidemia Glutárica, acidemia glutárica de tipo I, acidemia glutárica de tipo II, acidemia glutárica de tipo I, acidemia glutárica de tipo II, F- HYPDRR - hipofosfatemia familiar, raquitismo resistente a vitamina D, enfermedad de Krabbe, deficiencia de 3- hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena larga (LCHAD), Grupo de Manosidosis, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce, trastornos mitocondriales, síndromes de mucopolisacaridosis: enfermedad de Niemann Pick, acidemias orgánicas, PKU, enfermedad de Pompe, porfiria, síndrome metabólico, hiperlipidemia y trastornos lipídicos hereditarios, trimetilaminuria: el síndrome del mal olor a pescado y trastornos del ciclo de la urea.
Trastornos hepáticos
En aún otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención o un conjugado del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno hepático, así como a un procedimiento para tratar un trastorno hepático, comprendiendo dicho procedimiento administrar un oligonucleótido de acuerdo con la invención o un conjugado del mismo, o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención a un paciente que lo necesite.
En un modo de realización preferente de la invención, el trastorno hepático se selecciona del grupo que consiste en atresia biliar, síndrome de Alagille, enfermedad de alfa-1 antitripsina, tirosinemia, hepatitis neonatal y enfermedad de Wilson.
Otros usos
Los oligonucleótidos de la presente invención se pueden utilizar como reactivos de investigación para el diagnóstico, el tratamiento y la profilaxis. En investigación, el oligonucleótido se puede usar para inhibir específicamente la síntesis de los genes diana en células y animales de laboratorio, facilitando de este modo el análisis funcional de la diana o una valoración de su utilidad como diana para intervención terapéutica. En el diagnóstico, los oligonucleótidos se pueden usar para detectar y cuantificar la expresión de la diana en células y tejidos mediante inmunoelectrotransferencia, hibridación in situ o técnicas similares. Para el tratamiento, un animal o un ser humano que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno que se puede tratar modulando la expresión de la diana se
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somete a tratamiento administrando compuestos oligonucleotídicos de acuerdo con la presente invención. Se proporcionan además procedimientos de tratamiento de un animal, en particular ratón y rata, y de tratamiento de un ser humano que se sospecha que tienen o son propensos a tener una enfermedad o afección asociada a la expresión de la diana administrando una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los compuestos oligonucleotídicos o composiciones de la invención.
Uso terapéutico de oligonucleótidos dirigidos a miR-122a
Se ha demostrado que un LNA-antimiR que se dirija a miR-122a reduce los niveles de colesterol en plasma. Por lo tanto, otro aspecto de la invención es el uso de los oligonucleótidos descritos anteriormente que se dirigen a miR-122a como medicamento.
Otro aspecto más de la invención es el uso de los oligonucleótidos descritos anteriormente que se dirigen a miR-122a para la preparación de un medicamento para el tratamiento de niveles aumentados de colesterol en plasma (o hipercolesterolemia y trastornos relacionados). El experto apreciará que los niveles aumentados de colesterol en plasma son indeseables ya que aumentan el riesgo de diversas afecciones, por ejemplo, aterosclerosis.
Otro aspecto más de la invención es el uso de los oligonucleótidos descritos anteriormente que se dirigen a miR-122a para regular positivamente los niveles de ARNm de Nrdg3, Aldo A, Bckdk o CD320.
MODOS DE REALIZACIÓN
Los siguientes modos de realización de la presente invención se pueden usar en combinación con las otros modos de realización descritos en el presente documento.
1. Una composición farmacéutica que comprende un oligómero de 7-12 nucleótidos de longitud, en la que dicho oligómero comprende un total de 7-12 nucleótidos, tal como 7, 8, 9, 10, 11 o 12 unidades de nucleótidos, en la que todas las unidades de nucleótidos son unidades de LNA, y en la que al menos un 75 % de los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases de la secuencia de nucleobases contigua son enlaces internucleosídicos de fosforotioato, en la que el oligómero es capaz de reducir la cantidad eficaz de un microARN en una célula o in vivo; y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
2. La composición farmacéutica de acuerdo con el modo de realización 1, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria de una región correspondiente de una secuencia de microARN de mamífero, humana o vírica (miARN).
3. La composición farmacéutica de acuerdo con el modo de realización 2, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria de una región correspondiente de una secuencia de miARN seleccionada del grupo de miARN enumerados en una cualquiera de las tablas 3, 4 o 5.
4. La composición farmacéutica de acuerdo con el modo de realización 2 o 3, en la que la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria de la secuencia semilla de dicho microARN.
5. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de los modos de realización 2-4, en la que la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de las secuencias enumeradas en la tabla 3 o 4.
6. La composición farmacéutica de acuerdo con el modo de realización 4 o 5, en la que la nucleobase en 3' de la secuencia semilla forma la nucleobase más en 3' de la secuencia de nucleótidos contigua, en la que la secuencia de nucleótidos contigua puede comprender, opcionalmente, una o dos nucleobases en 5' adicionales.
7. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1-6, en la que dicha secuencia de nucleótidos contigua no comprende un nucleótido que corresponda al primer nucleótido presente en la secuencia de micro ARN contado desde el extremo 5'.
8. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1-7, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria de una secuencia de nucleótidos correspondiente presente en un miARN seleccionado de los mostrados en la tabla 3 o 4 o 5.
9. La composición farmacéutica de acuerdo con el modo de realización 8, en la que dicho miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR-222 y miR- 375.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1-13, en la que la secuencia de nucleótidos contigua consiste en 7, 8, 9 o 10 unidades contiguas de nucleobases de LNA.
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11. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1-14, en la que el oligómero consiste en 7, 8, 9 o 10 LNA contiguos.
12. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1-9, en la que un 80 % u 85 % o 90 % o 95 % o la totalidad de los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases de la secuencia de nucleótidos contigua son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
13. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1-18, en la que dicho oligómero está conjugado con uno o más compuestos que no son nucleobases.
14. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1-19, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria de la secuencia correspondiente de al menos dos secuencias de miARN tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de miARN.
15. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1-20, en la que la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria de la secuencia de al menos dos secuencias de la región semilla de miARN tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de la región semilla de miARN.
16. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 20 o 21, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria de la región correspondiente tanto de miR-221 como de miR- 222.
17. La composición farmacéutica de acuerdo con el modo de realización 22, en la que la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria de 5'GCUACAU3'.
18. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1-23, en la que el oligómero está constituido como un profármaco.
19. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1-24, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria de una región correspondiente de has-miR-122.
20. La composición farmacéutica de acuerdo con el modo de realización 25, para uso en el tratamiento de un trastorno médico o enfermedad seleccionado del grupo que consiste en: infección por el virus de la hepatitis C e hipercolesterolemia y trastornos relacionados.
21. La composición farmacéutica de acuerdo con el modo de realización 25 o 26, en la que la composición comprende además un segundo principio activo independiente que es un inhibidor de la ruta de ensamblado del VLDL, tal como un inhibidor de ApoB o un inhibidor de MTP.
22. Un kit que comprende una composición farmacéutica de acuerdo con el modo de realización 25 o 26, y un segundo principio activo independiente que es un inhibidor de la ruta de ensamblado del VLDL, tal como un inhibidor de ApoB, o un inhibidor de MTP.
23. La composición farmacéutica de la invención para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión de un microARN.
24. Un oligómero, como se define de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1-25.
25. Un conjugado que comprende el oligómero de acuerdo con el modo de realización 30, y al menos un compuesto que no es una nucleobase.
26. El uso de un oligómero o un conjugado como se define en uno cualquiera de los modos de realización 30-31, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión del microARN.
27. Un procedimiento in vitro para reducir la cantidad, o cantidad eficaz, de un miARN en una célula, que comprende administrar un oligómero, un conjugado o una composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización anteriores a la célula que expresa dicho miARN para reducir la cantidad, o la cantidad eficaz, de miARN en la célula.
28. Un procedimiento in vitro para la desrepresión de un ARNm cuya expresión es reprimida por un miARN en una célula, que comprende administrar un oligómero, un conjugado o una composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización anteriores a la célula que expresa tanto dicho ARNm como dicho miARN, para desreprimir la expresión del ARNm.
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Referencias: Los detalles de la referencia se proporcionan en los documentos de prioridad.
EJEMPLOS
La síntesis de monómeros y oligonucleótidos de LNA se realizó usando la metodología a la que se hace referencia en los ejemplos 1 y 2 del documento WO2007/112754. La estabilidad de los oligonucleótidos de LNA en plasma humano o de rata se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 4 del documento WO2007/112754. El tratamiento de células in vitro con oligonucleótido anti-miR antisentido de LNA (que se dirige a miR-122) se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 6 del documento WO2007/112754. El análisis de la inhibición por oligonucleótidos de la expresión de miR mediante PCR cuantitativa específica de microARN en un modelo tanto in vitro como in vivo se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 7 del documento WO2007/112754. La valoración de la especificidad de la desactivación génica de LNA antimir usando el perfil de expresión de micromatrices de miARN se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 8 del documento WO2007/112754. La detección de microARN mediante hibridación in situ se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 9 del documento WO2007/112754. El aislamiento y análisis de la expresión de ARNm (aislamiento de ARN total y síntesis de ADNc para el análisis de ARNm) en un modelo tanto in vitro como in vivo se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 10 del documento WO2007/112754. Los experimentos in vivo que usan oligómeros de la invención que se dirigen a microARN-122 y el análisis posterior se realizan usando los procedimientos divulgados en los ejemplos 11-27 del documento WO2007/112754.
Ejemplo 1: Diseño de los oligonucleótidos LNA-antimiR y temperaturas de fusión
Tabla 2 - Oligómeros usados en los ejemplos y figuras. El N.° de SEQ es un identificador usado a lo largo de los ejemplos y figuras; también se proporciona la sEq ID NO que se usa en el listado de secuencias.
N.° de SEQ del ejemplo/figura
SEQ ID NO Secuencia del compuesto Comentario
#3204
1 TcAGtCTGaTaAqCT
#3205
2 GATAAGCT
#3206
3 T cAcAAT.aG C AtT A
#3207
4 TAGCATTA
#4
5 CcAítGTcaCaCtCC
#3208
6 CACACTCC
#3209
7 TAAGCT
#3210
8 ATAAGCT
#3211
9 TGATAAGCT
#3212
10 CTGATAAGCT
#3213
11 GTCTG ATAAGCT
#3214
12 CAGTCTGATAAGCT
#3215
13 TCTGATAA
#3216
14 ATCAGTCT
#3217
15 TCAACATC
#3218/#3230
16 GGTAAACT Subrayado = emparejamiento erróneo
#3219
17 CGTAATGA Subrayado = emparejamiento erróneo
#3220
18 TCAgtctgaiaaGCTa Marcador fluorescente en 5' (FAM)
#3221
19 AGCACTTT
#3222
20 ATTTGCAC
#3223
21 AgCagACaaTgTaGC Marcador fluorescente en 5' (FAM)
#3224
22 GtAgcCAgaTgTaGC Marcador fluorescente en 5' (FAM)
#3225
23 ATGTAGC
#3226
24 ACaAcCTacTaCcTC
#3227
25 ACTACCTC
#3228
26 CaCtqTCaqCaCtI I
#3229
27 TcCatAGatTtGcAC
5
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15
20
25
30
35
40
#3231
28 GTAGACT
#3232
29 TACCTC
#3233
30 CTACCTC
#3234
31 TNCTACCTC N = base universal.
#3235
32 TNCTACCTC N = base universal.
#3236
33 GCaAcCTacTaCcTC
#3237
34 ACaAcCTccTaCcTC
#3238
35 ACaAaCTacTaCcTC
#3239
36 CTACCTC
#3240
37 CTAACTC
#3241
38 TTAGCATTA
#3242
39 C6ATTAGCATTA
#3243
977 CACGATTAGCATTA
#3244
978 GCATTA
#3245
979 AGCATTA
#3246
980 ATTAGCATTA
Las letras mayúsculas y minúsculas denotan LNA y DNA, respectivamente. Las citosinas de LNA son preferentemente metilcitosina/5'-metilcitosina* Todos los enlaces internucleosídicos son preferentemente fosforotioato* Todos los LNA pueden ser, por ejemplo, LNA beta-D-oxi* *Usados en los ejemplos específicos.
Ejemplo 2: Modelo in vitro: Cultivo celular
El efecto de los oligonucleótidos de LNA sobre la expresión (cantidad) del ácido nucleico diana se pueden someter a prueba en cualquiera de una diversidad de tipos de células siempre que el ácido nucleico diana esté presente en niveles medibles. La diana se puede expresar endógenamente o mediante transfección transitoria o estable de un ácido nucleico que codifica dicho ácido nucleico.
El nivel de expresión del ácido nucleico diana se puede determinar rutinariamente usando, por ejemplo, análisis de inmunoelectrotransferencia (incluyendo inmunoelectrotransferencia de microARN), PCR cuantitativa (incluyendo qPCR de microRNA) y ensayos de protección con ribonucleasa. Los siguientes tipos de células se proporcionan con propósitos ilustrativos, pero se pueden usar de manera rutinaria otros tipos de células, siempre que la diana se exprese en el tipo de células elegido.
Las células se cultivaron en el medio apropiado como se describe a continuación y se mantuvieron a 37 °C con un 9598 % de humedad y un 5 % de CO2. Las células se sometieron a pases de manera rutinaria 2-3 veces por semana.
15PC3: La línea celular de cáncer de próstata humana 15PC3 fue donada amablemente por el Dr. F. Baas, Laboratorio de Neurociencia, AMC, (Países Bajos) y se cultivó en DMEM (Sigma) + suero bovino fetal (FBS) al 10 % + Glutamax I + gentamicina.
PC3: La línea celular de cáncer de próstata humano PC3 se adquirió de ATCC y se cultivó en F12 de Coon con glutamina (Gibco) + FBS al 10 % + gentamicina.
518A2: La línea celular de cáncer de melanoma humano 518A2 fue amablemente donada por el Dr. B. Jansen, Sección de Oncología experimental, Farmacología Molecular, Departamento de Farmacología Clínica, Universidad de Viena, y se cultivó en DMEM (Sigma) + suero bovino fetal (FBS) al 10 %. + Glutamax I + gentamicina.
HeLa: La línea celular de carcinoma de cuello uterino HeLa se cultivó en MEM (Sigma) que contiene suero bovino fetal al 10 % y gentamicina a 37 °C, 95 % de humedad y 5 % de CO2.
MPC-11: La línea celular de mieloma múltiple murino MPC-11 se adquirió de ATCC y se mantuvo en DMEM con Glutamax 4 mM + suero de caballo al 10 %.
DU-145: La línea celular de cáncer de próstata humano DU-145 se adquirió de ATCC y se mantuvo en RPMI con Glutamax + FBS al 10 %.
RCC-4 +/- VHL: La línea celular de cáncer renal humano RCC4 transfectada establemente con plásmido que expresa VHL o plásmido vacío se adquirió de ECACC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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786-0: La línea celular de carcinoma de células renales humanas 786-0 se adquirió de ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
HUVEC: La línea de células endoteliales de vena umbilical humana HUVEC se adquirió de Camcrex y se mantuvo en medio EGM-2.
K562: La línea celular de leucemia mielógena crónica humana K562 se adquirió de ECACC y se mantuvo en RPMI con Glutamax + FBS al 10 %. U87MG: La línea celular de glioblastoma humano U87MG se adquirió de ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
B16: La línea celular de melanoma murino B16 se adquirió de ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
LNCap: La línea celular de cáncer de próstata humano LNCap se adquirió de ATCC y se mantuvo en RPMI con Glutamax + FBS 10 %.
Huh-7: De tipo epitelial de hígado humano, cultivada en MEM de Eagle con SFB al 10 %, Glutamax I 2 mM, 1 x aminoácidos no esenciales, 25 gg/ml de gentamicina.
L428: (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM, Braunschwieg, Alemania)): Linfoma de linfocitos B humanos mantenido en RPMI 1640 suplementado con PCS al 10 %, L-glutamina y antibióticos.
L1236: (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM, Braunschwieg, Alemania)): Linfoma de linfocitos B humanos mantenido en RPMI 1640 suplementado con FCS al 10 %, L-glutamina y antibióticos.
Ejemplo 3: Diseño de una colección de LNA-antimiR para todas las secuencias de microARN humanas en la base de datos de microARN miRBase.
La versión de miRBase usada fue la versión 12, como se indica en Griffiths-Jones, S., Grocock, RJ, van Dongen, S., Bateman, A., Enright, AJ. 2006. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acid Res. 34: D140-4, y disponible a través de
https://microma.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml.
La Tabla 1 muestra secuencias de nucleótidos heptaméricas, octaméricas y nonaméricas que comprenden la secuencia semilla de microARN de acuerdo con la base de datos de microARN miRBase. La secuencia semilla comprende el complemento inverso de la región semilla de microARN. En algunos modos de realización, el oligómero de la invención tiene una secuencia de nucleótidos contigua seleccionada de las secuencias heptaméricas, octaméricas o nonaméricas. Con respecto a las secuencias heptaméricas, octaméricas y nonaméricas, en algunos modos de realización todos los enlaces internucleosídicos son fosforotioato. Las secuencias de nucleótidos heptaméricas, octaméricas y nonaméricas pueden consistir en una secuencia de análogos de nucleótidos como se describe en el presente documento, tales como análogos de nucleótidos LNA. Las citosinas de LNA pueden ser metilcitosina (5'-metilcitosina). En algunos modos de realización, el LNA es beta-D-oxi-LNA.
La Tabla 3 proporciona una lista de microARN agrupados en aquellos que pueden ser dirigidos por los mismos oligómeros de secuencia semilla tales como los heptámeros, octámeros o nonámeros proporcionados en el presente documento (véase la tabla 1).
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imagen8
Se ha construido un LNA-antimiR octamérico contra miR-21, miR-155 y miR-122 (designado en el presente documento 5 como micromiR) que está completamente modificado con LNA y fosforotiolado (véanse la figura 1 y la Tabla 6). Los resultados de experimentos repetidos en células MCF-7, HeLa, Raw y Huh-7 usando un plásmido de sensores de luciferasa para miR-21, miR-155 y miR-122 demuestran que los LNA-antimiR cortos completamente modificados con LNA son altamente potentes para antagonizar microARN.
Tabla 4. Secuencias de LNA-antimiR y MicromiR y Tm teóricas
SEQ ID NO
microARN secuencia Tm(°C)
3204
miR-21 TcAGtCT GaTaAgCT 73
3205
GATAAGCT 33
3206
miR-155 TcAcAATtaG CAtTA 63
3207
TAG CATTA 45
4
miR-122 CcAttGTca CaCtCC 73
3208
CACACTCC 62
Las letras mayúsculas son unidades de LNA, tales como beta-D-oxi-LNA. Las letras minúsculas son unidades de ADN. Los enlaces internucleosídicos son preferentemente fosforotioato. Las citosinas de
LNA son todas preferentemente citosina metilada/5-metilcitosina.
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Las temperaturas de fusión se pueden valorar hacia la secuencia de microARN madura, usando un oligonucleótido de microARN sintético (que consiste típicamente en nucleótidos de ARN con una cadena principal de fosfodiéster). Las Tm medidas son típicamente más altas que las Tm teóricas cuando se usan oligómeros de LNA contra la diana de ARN.
Ejemplo 4: Valoración del antagonismo de miR-21 por LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3205 en células MCF-7 usando un ensayo de sensores de luciferasa.
Para valorar la eficacia de un oligonucleótido LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA (SEQ ID NO: 3205) para dirigirse a y antagonizar miR-21, se construyeron constructos de sensores de luciferasa que contenían un sitio diana de emparejamiento perfecto para el miR-21 maduro y, como control, un sitio diana con dos mutaciones en la semilla (Fig. 6). Para monitorizar la inhibición de microARN-21, se transfectó la línea celular de carcinoma de mama MCF-7 con los diferentes constructos de luciferasa junto con el antagonista de miR-21 de SEQ ID NO: 3205 a concentraciones variables en comparación con un LNA-antimiR pentadecamérico de SEQ ID NO: 3204 contra miR- 21 . Después de 24 horas, se midió la actividad de la luciferasa.
Resultados: Como se ve en la Figura 2, el nuevo LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA (SEQ ID NO: 3205) muestra una potencia dos veces mayor en comparación con la SEQ ID NO: 3204, como se muestra mediante la desrepresión de la actividad de la luciferasa. Por el contrario, el constructo del sensor de miR-21 de control con dos emparejamientos incorrectos en la semilla de miR-21 no mostró ninguna desrepresión de la actividad de la luciferasa de luciérnaga, demostrando de este modo la especificidad del sensor de miR-21 de emparejamiento perfecto en la monitorización de la actividad de miR-21 en células. La desrepresión de la actividad de la luciferasa por el LNA- antimiR octamérico es claramente dependiente de la dosis, lo que no se ve con la SEQ ID NO: 3204. Además, el nuevo octámero también es mucho más potente en dosis más bajas que la SEQ ID NO: 3204.
Para concluir, el LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3205) muestra una potencia significativamente mejorada en la inhibición de miR-21 in vitro en comparación con el LNA-antimiR pentadecamérico de SEQ ID NO: 3204 que se dirige a miR-21.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de mama MCF-7 se adquirió de ATCC (n.° HTB-22™). Las células MCF- 7 se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 400 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células MCF-7 se transfectaron con 0,8 ug de miR-21 de emparejamiento perfecto /psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío (SDS Promega) junto con 1 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se recogieron con un raspador de células, después de lo cual las células se centrifugaron durante 5 min a 10 000 rpm. El sobrenadante se desechó y se añadieron 50 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) al sedimento celular, después de lo cual las células se pusieron en hielo durante 30 min. Las células lisadas se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se transfirieron 20 gl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 5: Valoración del antagonismo de miR-21 por LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3205 en células HeLa usando un ensayo de sensores de luciferasa.
Para evaluar además la eficacia del LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3205 totalmente modificado con LNA en dirigirse a miR-21, se transfectó también la línea celular de carcinoma de cuello uterino HeLa con los constructos de sensores de la luciferasa de miR-21 previamente descritos junto con la SEQ ID NO: 3205 a concentraciones variables como se describe en la sección anterior (Figura 3).
Resultados: La SEQ ID NO: 3205 muestra una desrepresión completa del constructo del sensor de la luciferasa de miR-21 en células HeLa ya a 5 nM en comparación con la SEQ ID NO: 3204, que no mostró una desrepresión completa hasta la dosis más alta (50 nM). Además, el antagonismo de miR-21 por el LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3205 es dependiente de la dosis. Para demostrar la especificidad del ensayo de sensores de la luciferasa de miR-21, se transfectó también un sitio diana de miR-21 de emparejamiento erróneo (2 emparejamientos erróneos en la semilla) en células HeLa, pero no mostró ninguna desrepresión de la actividad de la luciferasa de luciérnaga.
Para concluir, la SEQ ID NO: 3205 completamente modificada con LNA muestra una potencia significativamente mejorada en la inhibición de miR-21 in vitro, tanto en células MCF-7 como en células HeLa en comparación con el LNA-antimiR pentadecamérico de SEQ ID NO: 3204.
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Materiales y procedimientos:
Linea celular: La línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa se adquirió en ECACC (n.° 93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 60 000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 gg de miR-21 de emparejamiento perfecto/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o el vector vacío psiCHECK2 junto con 0,7 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 100 gl de 1 x tampón pasivo de lisis (Promega) a cada pocillo, después de lo cual las placas de 24 pocillos se colocaron en un agitador orbital durante 30 min. Las células se recogieron y se transfirieron a un tubo Eppendorf y se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se transfirieron 10 gl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 6: Valoración del antagonismo de miR-155 por LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3207 en células RAW de ratón usando un ensayo de sensores de luciferasa.
Para averiguar si un LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA puede antagonizar eficazmente miR-155, se clonó un sitio diana de emparejamiento perfecto para miR-155 en el mismo vector de luciferasa (psiCHECK2) y se transfectó a la línea celular RAW de ratón leucémica de monocitos y macrófagos. Debido a que los niveles endógenos de miR-155 son bajos en la línea celular RAW, las células se trataron con 100 ng/ml de LPS durante 24 horas para inducir la acumulación de miR-155.
Resultados: Las mediciones de la luciferasa mostraron que el LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3207 completamente modificado con LNA que se dirige a miR-155 tenía una eficacia similar para antagonizar miR-155 en comparación con el LNA-antimiR pentadecamérico de SEQ ID NO: 3206 (Figura 4). Ambos LNA-antimiR mostraron una desrepresión >50 % del sensor de la luciferasa de miR-155 a una concentración de 0,25 nM e inhibieron miR-155 de una manera dependiente de la dosis.
Conclusión: Estos datos apoyan además los resultados de antagonizar miR-21, como se muestra en los ejemplos 1 y 2, lo que demuestra que un LNA-antimiR octamérico completamente tiolado es altamente potente en dirigirse a microARN.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La RAW 264.7 leucémica de monocitos y macrófagos de ratón se adquirió de ATCC (TIB-71). Las células RAW se cultivaron en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 4 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 500 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50 % al día siguiente. El día de la transfección, las células MCF-7 se transfectaron con 0,3 gg de miR-155 o vector psiCHECK2 vacío junto con 10 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para inducir la acumulación de miR-155, se añadió LPS (100 ng/ml) a las células RAW después de incubación durante 4 horas con los complejos de transfección. Después de otras 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se recogieron con un raspador de células, después de lo cual las células se centrifugaron durante 5 min a 2500 rpm. El sobrenadante se desechó y se añadieron 50 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) al sedimento celular, después de lo cual las células se pusieron en hielo durante 30 min. Las células lisadas se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se transfirieron 20 gl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 7: Valoración del antagonismo de miR-122 mediante LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3208 en células HuH- 7 usando un ensayo de sensores de luciferasa.
Se evaluó la potencia del LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3208 completamente modificado contra miR-122 en la línea celular HuH-7 de hepatoma humano. Las células HuH-7 se transfectaron con el constructo del sensor de luciferasa que contenía un sitio diana de miR-122 de emparejamiento perfecto. Después de 24 horas, se realizaron mediciones de la luciferasa (Figura 5).
Resultados: El LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3208 completamente modificado con LNA es más potente que el LNA-antimiR pentadecamérico de SEQ ID NO: 4 a baja concentración, como se muestra mediante la
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desrepresión del sensor de luciferasa de miR-122. Ambos LNA-antimiR inhiben miR-122 de una manera dependiente de la dosis (Figura 5).
Conclusión: El LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA de SEQ ID NO: 3208 que se dirige a miR-122 muestra una potencia mejorada en la inhibición de miR-122 in vitro .
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de hepatoma humano HuH-7 fue un amable regalo de R. Bartenschlager, Heidelberg. Se cultivaron células Huh-7 en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 8.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células HuH-7 se transfectaron con 57 ng de miR-122 o un vector psiCHECK2 vacío junto con 1 pl de Lipofectamine2000 (Invitrogen). Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Se añadieron 50 pl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo, después de lo cual la placa de 96 pocillos se puso en un agitador orbital durante 30 min. A cada pocillo se le añadió el sistema de Dual- Luciferase Reporter Assay System (Promega) y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 8. Valoración del antagonismo de miR-21 mediante la comparación de un LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3205) frente a otro pentadecamérico (SEQ ID NO: 3204) en células de carcinoma de próstata humano (PC3).
Se ha demostrado previamente (solicitud de patente 1051) que un LNA-antimiR octamérico que está completamente modificado con LNA y fosforotiolado es capaz de desreprimir por completo los niveles de indicador de luciferasa de miR-21 en la línea celular de carcinoma de cuello uterino HeLa y desreprimir en parte los niveles de indicador de luciferasa de miR-21 en la línea celular de carcinoma de mama humano MCF-7. A continuación, se amplió este enfoque de cribado a la línea celular de cáncer de próstata humano PC3. Para valorar la eficacia de los diferentes oligonucleótidos LNA-antimiR contra miR-21, se generaron constructos de indicadores de luciferasa en los que se clonaron un sitio diana de emparejamiento perfecto para el miR-21 maduro y un sitio diana con dos emparejamientos errónes en la semilla en la 3' UTR del gen de luciferasa de renilla (Figura 7). Para monitorizar la inhibición de miR-21, se transfectaron células PC3 con los diferentes constructos de luciferasa junto con el antagonista de miR-21 de SEQ ID NO: 3205 (octámero) y para comparación con el LNA-antimiR pentadecamérico de emparejamiento perfecto de SEQ ID NO: 3204 a concentraciones variables. Después de 24 horas, se midió la actividad de la luciferasa.
Resultados: Los experimentos del indicador de luciferasa mostraron una desrepresión dependiente de la dosis de la actividad del indicador de luciferasa de miR-21 con el LNA-antimiR pentadecamérico contra miR-21 (SEQ ID NO: 3204). Sin embargo, no se obtuvo una desrepresión completa de indicador de luciferasa siquiera a las concentraciones más altas (Figura 7). Por el contrario, las células que se transfectaron con LNA-antimiR octamérico completamente sustituido con LNA mostraron una desrepresión completa ya a 1 nM, lo que indica una potencia significativamente mejorada en comparación con el LNA-antimiR pentadecamérico. El indicador de control de luciferasa que alberga un sitio diana de emparejamiento erróneo para miR-21 no se vio afectado por ninguno de los LNA-antimiR, lo que demuestra una alta especificidad de ambos LNA-antimiR.
Conclusión: El micrómero es mucho más potente que el LNA-antimiR pentadecamérico en dirgirse a miR-21 y hasta ahora ha demostrado ser más potente en células de carcinoma de próstata.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular PC3 de carcinoma de próstata humano se adquirió de ECACC (n.° 90112714). Las células PC3 se cultivaron en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 100 000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50 % al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con 0,3 ug de miR-21 o vector psiCHECK2 vacío junto con 1,2 pl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 250 pl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a los pocillos. Las placas se colocaron en un agitador durante 30 min, después de lo cual los lisados celulares se transfirieron a tubos Eppendorf. El lisado celular se centrifugó durante 10 min a 2500 rpm, después de lo cual se
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transfirieron 20 |jl a una placa de 96 pocilios y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 9. Valoración de la especificidad del antagonismo de miR-21 por un LNA-antimiR octamérico.
Para investigar la especificidad del LNA-antimiR corto que se dirige a miR-21, se diseñó un LNA-antimiR octamérico de control de emparejamiento erróneo (SEQ ID NO: 3218) que contenía 2 emparejamientos erróneos en la secuencia de reconocimiento de semilla (véase la Figura 8). Se transfectaron los constructos de indicadores de luciferasa descritos en el ejemplo 1 a la línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa junto con el oligo de control de emparejamiento erróneo de LNA de SEQ ID NO: 3218 y se comparó su eficacia con el LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3205) que se dirige a miR -21. Después de 24 horas, se midió la actividad de la luciferasa.
Resultados: Como se muestra en la Figura 8, la transfección del LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA en células HeLa dio como resultado una desrepresión completa del indicador de luciferasa de miR-21 ya a 5 nM. Por el contrario, cuando las células se transfectaron con el oligo de control de emparejamiento erróneo de LNA octamérico, combinado con los resultados obtenidos con indicador de luciferasa de miR-21 de control que tenía dos emparejamientos erróneos en la semilla de miR-21, estos datos demuestran una alta especificidad del LNA-antimiR octamérico completamente sustituido al dirigirse a miR-21 en células Hela.
El análisis de la base de datos de secuencias de microARN miRBase mostró que la secuencia de reconocimiento de miR-21 del LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3205 es única para microRNA-21. Sin embargo, al disminuir la longitud del micrómero a 7 nt, no es específico solo para miR-21, ya que ath-miR-844, mmu-miR-590-3p y has-miR-590-3p también son dianas.
Conclusión: El intercambio de dos posiciones de nucleótidos dentro del LNA-antimiR octamérico por dos nucleótidos de emparejamiento erróneo anulaba por completo la actividad antagonizante del LNA-antimiR para miR-21.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa se adquirió en ECACC (n.° 93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 60 000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 jg de miR-21 de emparejamiento perfecto/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o un vector psiCHECK2 vacío junto con 0,7 jl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 100 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo, después de lo cual las placas de 24 pocillos se pusieron en un agitador orbital durante 30 min. Las células se recogieron y se transfirieron a un tubo Eppendorf y se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se transfirieron 10 jl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 10. Valoración de la longitud más corta posible de un LNA-antimiR completamente modificado con LNA que media el antagonismo eficaz de miR-21.
Para investigar más a fondo los requisitos de longitud del LNA-antimiR, se diseñó un LNA-antimiR heptamérico y hexamérico que se dirigía a miR-21, ambos oligonucleótidos completamente modificados con LNA y fosforotiolados. Se transfectaron los constructos de indicadores de luciferasa de miR-21 en células HeLa junto con los LNA-antimiR a concentraciones variables. Las mediciones de la luciferasa se realizaron después de 24 horas.
Resultados: Como se ve en la Figura 9, el LNA-antimiR heptamérico media la desrepresión del plásmido de indicador de luciferasa de miR-21, pero a una potencia menor en comparación con el LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3205). No obstante, aún se puede observar una tendencia dependiente de la dosis. Por el contrario, el LNA-antimiR hexamérico no mostraba ninguna actividad inhibidora.
Conclusión: Para concluir, la longitud más corta posible de un LNA-antimiR que es capaz de mediar la inhibición de miR-21 es de 7 nucleótidos. Sin embargo, el LNA-antimiR heptamérico es menos potente en comparación con LNA- antimiR octamérico para miR-21.
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Linea celular: La línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa se adquirió en ECACC (n.° 93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 60 000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 gg de miR-21 de emparejamiento perfecto/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o el vector vacío psiCHECK2 junto con 0,7 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 100 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo, después de lo cual las placas de 24 pocillos se pusieron en un agitador orbital durante 30 min. Las células se recogieron y se transfirieron a un tubo Eppendorf y se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se transfirieron 10 gl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 11. Valoración de la longitud de LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA que antagonizan miR-21
A continuación, se investigó el efecto de aumentar la longitud de un LNA-antimiR nonamérico a tetradecamérico completamente sustituido con LNA en el antagonismo de miR-21 en células HeLa. Los LNA-antimiR resultantes se transfectaron en células HeLa junto con los constructos de indicadores de luciferasa de miR-21 (Figura 10). Las mediciones de la luciferasa se realizaron después de 24 horas.
Resultados: El LNA-antimiR nomamérico de SEQ ID NO: 3211 (nonámero) mostró una desrepresión dependiente de la dosis del indicador de luciferasa de miR-21 que no alcanzó la desrepresión completa, como se demostró para el LNA-antimiR heptamérico (SEQ ID NO: 3210). El aumento de la longitud desde decámeros a tetradecámeros (SEQ ID NO: 3212, sEq ID. NO 3213 y SEQ ID nO: 3214) disminuyó la potencia como se muestra por una desrepresión menos eficaz del indicador de miR-21.
Conclusión: Como se muestra en la Figura 10, el LNA-antimiR completamente modificado con LNA y fosforotiolado más largo que todavía es capaz de mediar la inhibición de miR-21 es un LNA-antimiR nonamérico de SEQ ID NO: 3211. Sin embargo, es claramente menos eficaz que los LNA-antimiR heptamérico y octamérico.
Materiales y procedimientos: Línea celular: La línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa se adquirió en ECACC (n.° 93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 60 000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección para alcanzar una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 ug de miR-21 de emparejamiento perfecto/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o vector de control psiCHECK2 vacío sin sitio diana junto con 0,7 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 100 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo, después de lo cual las placas de 24 pocillos se pusieron en un agitador orbital durante 30 min. Las células se recogieron y se transfirieron a un tubo Eppendorf y se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se transfirieron 10 gl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 12. Determinación de la posición más óptima para un LNA-antimiR octamérico dentro de la secuencia de reconocimiento de la diana de miR.
Los experimentos han demostrado que el LNA-antimiR fosforotiolado completamente modificado con LNA más potente tiene 8 nucleótidos de longitud. Para valorar la posición más óptima para un LNA-antimiR octamérico dentro de la secuencia de reconocimiento de la diana de miR, se diseñaron cuatro LNA-antimiR octaméricos completamente modificados con LNA diferentes dispuestos a lo largo de la secuencia de miR-21 madura como se muestra en la Figura 11. Los diferentes LNA-antimiR se cotransfectaron junto con los constructos de indicadores de luciferasa de miR-21 en células HeLa. Las mediciones de la luciferasa se realizaron después de 24 horas. Resultados: El único LNA-antimiR que medió un silenciamiento eficaz de miR-21 medido por el indicador de luciferasa fue el de SEQ ID NO: 3205, que se dirige a la región semilla de miR-21. Ni la SEQ ID NO: 3215 que se diseñó para cubrir el extremo 3' de la semilla (que se dirigía a la semilla en un 50 %) mostró ningún efecto, ni tampoco los otros dos LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3216 o SEQ ID NO: 3217, que se colocaron para dirigirse a la región central y al extremo 3' del miR-21
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maduro, respectivamente. Conclusión: El único silenciamiento potente de mi-21 por LNA-antimiR octamérico es el que se dirige a la semilla del miR-21.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa se adquirió en ECACC (n.° 93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 60 000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección para alcanzar una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 pg de miR21 de emparejamiento perfecto /psiCHECK2, miR-21 .mm2/psiCHECK2 o vector psiCHECK2 vacío junto con 0,7 pl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 100 pl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo, después de lo cual las placas de 24 pocillos se pusieron en un agitador orbital durante 30 min. Las células se recogieron y se transfirieron a un tubo Eppendorf y se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se transfirieron 10 pl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 13. Validación de la interacción del sitio diana de miR-21 en la 3'-UTR de Pdcd4 y miR-21 usando el LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3205.
La proteína supresora de tumores Pdcd4 inhibe la transformación neoplásica inducida por TPA, la promoción y la progresión tumorales. También se ha mostrado que Pdcd4 se regula positivamente en la apoptosis en respuesta a diferentes inductores. Además, la regulación negativa de Pdcd4 en el cáncer de pulmón y colorrectal también se ha asociado con un mal pronóstico del paciente. Recientemente, Asangani et al y Frankel et al mostraron que la 3'-UTR de Pdcd4 contiene un sitio diana conservado para miR-21, y la transfección de células con un antimiR-21 dio como resultado un aumento de la proteína Pdcd4. Por lo tanto, se construyó un plásmido de indicador de luciferasa que alberga 313 nt de la región 3'UTR de Pdcd4 que abarca el sitio diana de miR-21 anteriormente mencionado, que se cotransfectó junto con diferentes LNA-antimiR en células HeLa. Los diferentes LNA-antimiR fueron: SEQ ID NO: 3205 (octámero, emparejamiento perfecto) o SEQ ID NO: 3218 (octámero, emparejamiento erróneo). Las mediciones de la luciferasa se realizaron después de 24 horas.
Resultados: Como se muestra en la Figura 12, en células transfectadas con el indicador de luciferasa de la 3'UTR de Pdcd4 y la SEQ ID NO: 3205, se observó un aumento en la actividad de la luciferasa, que indicaba interacción entre la 3'UTR de Pdcd4 y miR-21. Sin embargo, transfectando las células con el compuesto de emparejamiento erróneo, la SEQ ID NO: 3218, no se observó cambio en la actividad de la luciferasa, lo que era de esperar ya que el compuesto no antagoniza miR-21. Al comparar el LNA-antimiR octamérico frente a dos LNA-antimiR diseñados más largos, el LNA-antimiR corto modificado completamente con LNA y fosforotiolado era significativamente más potente, lo que confirma los datos anteriores de ensayo de luciferasa.
Conclusión: Estos datos concluyen que la SEQ ID NO: 3205, que antagoniza miR-21, puede regular la interacción entre la 3'UTR de Pdcd4 y miR-21.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa se adquirió en ECACC (n.° 93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 60 000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección para alcanzar una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 pg de 3'-UTR de Pdcd4/psiCHECK2 o vector psiCHECK2 vacío junto con 0,7 pl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. También se transfectaron concentraciones variables de los oligonucleótidos LNA-antimiR. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 100 pl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo, después de lo cual las placas de 24 pocillos se pusieron en un agitador orbital durante 30 min. Las células se recogieron y se transfirieron a un tubo Eppendorf y se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se transfirieron 10 pl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
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Ejemplo 14. Comparación de un LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3207) con un LNA-antimiR pentadecamérico (SEQ ID NO: 3206) en el antagonismo de miR-155 en células RAW de ratón.
Para averiguar si el enfoque de usar LNA-antimiR cortos podría adaptarse a otros miARN, se diseñó un LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA contra microARN-155. Se clonó un sitio diana de emparejamiento perfecto para miR-155 en la 3'UTR del gen de la luciferasa en el plásmido de indicador psiCHECK2 y se transfectó en la línea celular RAW de macrófagos de ratón junto con un LNA-antimiR octamérico o pentadecamérico. Debido a que los niveles endógenos de miR-155 son bajos en la línea celular RAW, las células se trataron con 100 ng/ml de LPS durante 24 horas para inducir la acumulación de miR-155. Después de 24 horas, se realizó el análisis de la luciferasa.
Resultados: Las mediciones de la luciferasa mostraron que el LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3207 completamente modificado con LNA que se dirige a miR-155 tenía una eficacia similar para antagonizar miR-155 en comparación con el LNA-antimiR pentadecamérico de SEQ ID NO: 3206 (Figura 13). Ambos LNA-antimiR mostraron una desrepresión >50 % del sensor de luciferasa de miR-155 a una concentración de 0,25 nM e inhibieron miR-155 de una manera dependiente de la dosis.
El análisis de la base de datos de secuencias de microARN miRBase mostró que la secuencia de reconocimiento de miR-155 del LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3207 es única para microRNA-155. Sin embargo, cuando se reduce la longitud del LNA-antimiR a 7 nt, no es específico solo para miR-155, también está dirigido a mdv1-miR-M4 y kshv- miR-K12-11.
Conclusión: Un LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA y fosforotiolado es igual de potente en comparación con un LNA-antimiR pentadecamérico de un diseño mixto de LNA/ADN en el antagonismo de miR-155. Por tanto, el enfoque de usar LNA-antimiR cortos se puede adaptar fácilmente para dirigirse a otros miARN.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de macrófagos de ratón RAW 264.7 se adquirió de ATCC (TIB-71). Las células RAW se cultivaron en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 4 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 500 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50 % al día siguiente. El día de la transfección, las células RAW 264.7 se transfectaron con 0,3 gg de miR-155 de emparejamiento perfecto con /psiCHECK2 o vector psiCHECK2 vacío junto con 10 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR. Para inducir la acumulación de miR-155, se añadió LPS (100 ng/ml) a las células RAW después de incubación durante 4 horas con los complejos de transfección. Después de otras 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se recogieron con un raspador celular, después de lo cual las células se centrifugaron durante 5 min a 2500 rpm. El sobrenadante se desechó y se añadieron 50 gl de 1 * tampón de lisis pasiva (Promega) al sedimento celular, después de lo cual las células se pusieron en hielo durante 30 min. Las células lisadas se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se transfirieron 20 gl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 15. Valoración de los niveles de proteína c/EBPp como lectura funcional para el antagonismo de miR- 155 por LNA-antimiR corto (SEQ ID NO: 3207).
Como lectura funcional para el antagonismo de miR-155 por LNA-antimiR corto (SEQ ID NO: 3207) se determinaron los niveles de proteína de una nueva diana de miR-155, c/EBPp. La línea celular RAW de macrófagos de ratón se transfectó junto con un LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3207) o pentadecamérico (SEQ ID NO: 3206) en ausencia o presencia de pre-miR-155. Como controles de emparejamiento erróneo para el pentadecámero, se usó la SEQ ID NO: 4 que se dirige a miR-122, y para el octámero, se usó la SEQ ID NO: ID 3205, que se dirige a miR-21. Estos dos miARN de control no regulan los niveles de expresión de c/EBPp. Se usó LPS para inducir la acumulación de miR-155 y las células se recogieron después de 16 horas con LPS. La c/EBPp tiene tres isoformas; LIP, LAP y LAP*, que se detectaron mediante análisis de transferencia Western, y las mismas membranas se volvieron a sondar con tubulina beta como control de carga.
Resultados: Se calcularon las proporciones para c/EBPp LIP y tubulina beta como se indica en la Figura 14.
Las células RAW que se transfectaron con el LNA-antimiR pentadecamérico y ningún pre-miR-155 mostraron todas iguales proporciones de c/EBPp LIP/tubulina beta, debido a que la inhibición de miR-155 aumenta los niveles de c/EBPp LIP (Figura 14, panel izquierdo). En comparación, la transfección de pre-miR-155 en células RAW dio como resultado una disminución de los niveles de c/EBPp LIP, como se esperaba, si c/EBPp era una diana de miR-155, como se muestra en carriles con extractos de proteína de células RAW tratadas sin LNA o un emparejamiento incorrecto. Sin embargo, los extractos proteicos de las células RAW transfectadas con LNA-antimiR contra miR-155
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mostraron un aumento de los niveles de c/EBPP LIP. Los mismos experimentos también se llevaron a cabo con el LNA-antimiR-155 octamérico (SEQ ID NO: 3207) y, como se muestra en la Figura 14 (panel derecho), se obtuvieron resultados similares a los del LNA-antimiR pentadecamérico de SEQ ID NO: 3206.
Conclusión: El antagonismo de miR-155 utilizando un LNA-antimiR octamérico o pentadecamérico da lugar a la desrepresión de la diana directa c/EBPp.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de macrófagos de ratón RAW 264.7 se adquirió de ATCC (TIB-71). Las células RAW se cultivaron en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 4 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 500 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección para alcanzar una confluencia de un 50 % al día siguiente. El día de la transfección, las células RAW 264.7 se transfectaron con 5 nmol de pre-miR-155 (Ambion) y/o LNA-antimiR 5 nM junto con 10 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR. Para inducir la acumulación de miR-155, se añadió LPS (100 ng/ml) a las células RAW después de incubación durante 4 horas con los complejos de transfección. Después de 16 horas, las células se recogieron para la extracción de proteínas y el análisis de transferencia Western.
Transferencia Western: Las células se lavaron con PBS, se tripsinizaron, se transfirieron a tubos Eppendorf y se añadieron 250 gl de tampón de lisis (1 x RIPA). El lisado celular se colocó en hielo durante 20 min y se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 minutos. La concentración de proteína se midió con Coomassie Plus de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se cargaron 80 ug en un gel de BIS-TRIS al 4-12 %. La membrana se incubó durante la noche a 4 °C con el anticuerpo monoclonal primario de ratón C/EBP B (Santa Cruz) con una concentración de 1:100. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron con ECL Plus (Amersham).
Ejemplo 16. Antagonismo de miR-106b por un LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA (SEQ ID NO: 3221).
Para confirmar que el enfoque de usar LNA-antimiR cortos podría adaptarse a dirigirse a otros miARN, se diseñó un LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA contra microARN-106b. Se clonó un sitio diana de emparejamiento perfecto para miR-106b en la 3'UTR del gen de la luciferasa en el vector (psiCHECK2) y se transfectó en la línea de células HeLa de carcinoma de cuello uterino humano junto con un LNA-antimiR corto (SEQ ID NO 3221)
0 con un LNA-antimiR pentadecamérico (SEQ ID NO: 3228) a concentraciones variables. Las mediciones de la luciferasa se realizaron después de 24 horas.
Resultados: La transfección del LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3221 contra miR-106b dio como resultado la inhibición dependiente de la dosis de miR-106b, como se muestra por la desrepresión del indicador de luciferasa, que se desreprimió por completo a una concentración de 1 nM de LNA-antimiR (Figura 15).
Se obtuvieron resultados similares usando el LNA-antimiR pentadecamérico de SEQ ID NO: 3228, demostrando que un LNA-antimiR octamérico tiene una potencia similar a un pentadecámero.
Conclusión: Dirigirse a miR-106b en células HeLa muestra que un LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA y fosforotiolado es igual de potente en comparación con un LNA-antimiR de secuencia mixta de LNA/ADN pentadecamérico.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa se adquirió en ECACC (n.° 93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM,
1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 5200 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección para alcanzar una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 57 ng de miR-21 de emparejamiento perfecto/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o vector psiCHECK2 vacío junto con 0,14 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 30 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo, después de lo cual las placas de 24 pocillos se pusieron en un agitador orbital durante 30 min. Las células se recogieron y se transfirieron a tubos Eppendorf y se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
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Ejemplo 17. Antagonismo de miR-19a por un LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA (SEQ ID NO: 3222).
Para confirmar además que el enfoque del uso de LNA-antimiR cortos se puede adaptar fácilmente para dirigirse a otros miARN, se diseñó un LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA contra microARN-19a. Se clonó un sitio diana de emparejamiento perfecto para miR-19a en la 3'UTR del gen de la luciferasa en el vector psiCHECK2. El plásmido de indicador se transfectó en la línea celular HeLa de carcinoma de cuello uterino humano junto con un LNA-antimiR corto (SEQ ID NO: 3222) o con un LNA-antimiR pentadecamérico (SEQ ID NO: 3229) que se dirigía a miR-19a a concentraciones variables. Las mediciones de la luciferasa se realizaron después de 24 horas.
Resultados: Como se muestra en la Figura 16, la transfección del LNA-antimiR pentadecamérico de SEQ ID NO: 3229 en HeLa antagoniza eficazmente miR-19a, como se demuestra por desrepresión completa a una concentración de 1 nM de LNA-antimiR. En comparación, la transfección del LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3222 dio como resultado un antagonismo de miR-19a eficaz ya a una concentración de 0,5 nM, lo que indica que este LNA-antimiR octamérico es al menos igual de potente en comparación con un LNA-antimiR pentadecamérico en células HeLa.
Conclusión: Dirigirse a miR-19a en células HeLa muestra que un LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA y fosforotiolado es al menos igual de potente en comparación con un LNA-antimiR de secuencia mixta de LNA/ADN pentadecamérico.
Materiales y procedimientos: Línea celular: La línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa se adquirió en ECACC (n.° 93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 5200 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección para alcanzar una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 57 ng de miR-21 de emparejamiento perfecto/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o vector psiCHECK2 vacío junto con 0,14 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 30 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo, después de lo cual las placas de 24 pocillos se pusieron en un agitador orbital durante 30 min. Las células se recogieron y se transfirieron a tubos Eppendorf y se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 18. Dirigir una familia de microARN usando LNA-antimiR corto completamente sustituido con LNA.
A continuación, se investigó si es posible dirigir una familia de microARN utilizando un único LNA-antimiR corto heptamérico complementario de la secuencia semilla que es común para todos los miembros de la familia (véase la Figura 17). Este experimento se centró en miR-221 y miR-222, que se sobreexpresan en tumores sólidos de colon, páncreas, próstata y estómago. También se ha mostrado que miR-221 y miR-222 son los microARN regulados positivamente más significativos en el glioblastoma multiforme. Además, la sobreexpresión de miR-221 y miR-222 puede contribuir al crecimiento y progresión del carcinoma de próstata, al menos en parte bloqueando la proteína supresora tumoral p27. Se clonó un sitio diana de emparejamiento perfecto tanto para miR-221 como miR-222, respectivamente, en la 3'UTR del gen de la luciferasa, dando como resultado dos constructos de indicadores. Estos constructos se transfectaron por separado o combinados en la línea celular de carcinoma de próstata, PC3. Además del heptámero, dirigido tanto a miR-221 como a miR-222, también se cotransfectó un LNA-antimiR pentadecamérico (pentadecámero) que se dirigía a miR-221 (SEQ ID NO: 3223) o miR-222 (SEQ ID NO: 3224), cada uno transfectado por separado o juntos (véase la Figura 18 a la izquierda).
Resultados: Como se muestra en la Figura 18, la transfección de células PC3 con el LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3223 contra miR-221 dio como resultado una inhibición eficaz de miR-221 a una concentración de LNA-antimiR de 1 nM. También se observó un efecto inhibidor cuando se usaba el plásmido de indicador de la luciferasa para miR- 222, así como cuando se cotransfectaban ambos indicadores de luciferasa para miR-221 y miR-222 simultáneamente en células PC3. Este efecto inhibidor es más probable debido a la secuencia semilla compartida entre miR-221 y miR- 222. De forma similar, la transfección de células PC3 con el LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3224 contra miR-222 dio como resultado una inhibición eficaz de miR-222 a una concentración de LNA-antimiR de 1 nM como se muestra mediante la desrepresión completa del indicador de luciferasa para miR-222. También se observó un efecto inhibidor cuando se usaba el plásmido de indicador de la luciferasa para miR-222, así como cuando se cotransfectaban ambos indicadores de luciferasa para miR-221 y miR-222 simultáneamente en células PC3. La cotransfección de ambos compuestos LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3223 y SEQ ID NO: 3224 contra miR-221 y miR-222, respectivamente (véase la Figura 18 a la izquierda), dio como resultado la inhibición eficaz de ambos miARN como se muestra mediante la desrepresión completa de los plásmidos de indicadores de luciferasa tanto cuando se transfectan por separado como cuando se cotransfectan en células PC3. Curiosamente, la transfección de un único LNA-antimiR heptamérico
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completamente modificado con LNA (SEQ ID NO: 3225) que se dirige a la secuencia semilla de miR-221 y miR-222 en células PC3 dio como resultado un antagonismo eficaz y dependiente de la dosis de miR-221 y miR-222 simultáneamente, como se muestra mediante la desrepresión completa de los plásmidos de indicadores de luciferasa tanto cuando se transfectan por separado como cuando se cotransfectan en células PC3. Esto demuestra que un único LNA-antimiR corto sustituido con LNA puede dirigirse eficazmente a las secuencias semilla, antagonizando de este modo familias de microARN completas simultáneamente. El análisis de la base de datos de secuencias de microARN miRBase mostró que la secuencia de reconocimiento de semilla de miR-221/222, del LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3225, es única para ambos miARN.
Conclusión: Los resultados demuestran que el LNA permite el diseño y la síntesis de oligonucleótidos LNA-antimiR cortos completamente sustituidos con LNA que pueden dirigirse eficazmente a las secuencias semilla de microARN, antagonizando de este modo familias de microARN completas simultáneamente.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular PC3 de carcinoma de próstata humano se adquirió en ECACC (n.° 90112714). Se cultivaron células PC3 en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 100 000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50 % al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con 0,3 gg de plásmido de indicador de luciferasa para miR-221 o para miR-222 o con el vector psiCHECK2 vacío sin sitio diana de miARN como control junto con 1,2 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 250 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a los pocillos. Las placas se colocaron en un agitador durante 30 min, después de lo cual los lisados celulares se transfirieron a tubos Eppendorf. El lisado celular se centrifugó durante 10 min a 2500 rpm, después de lo cual se transfirieron 20 gl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 19. Valoración de los niveles de proteína p27 como lectura funcional para el antagonismo de la familia de miR-221/222 por el LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3225 heptamérico.
El trabajo previo ha mostrado (le Sage et al. 2007, Galardi et al., 2007) que miR-221 y miR-222 regulan postranscripcionalmente la expresión del gen supresor tumoral p27, que está implicado en la regulación del ciclo celular. En estos estudios, se observó que la regulación negativa de miR-221 y miR-222 aumentaba los niveles de expresión de p27. Por tanto, como lectura funcional para el antagonismo de la familia de miR-221/222 por el LNA- antimiR heptamérico de SEQ ID NO: 3225, se determinaron los niveles de proteína p27 después de la transfección del LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3225 en células PC3 en comparación con un control de emparejamiento incorrecto de LNA octamérico. Después de 24 horas, las células se recogieron para análisis de transferencia Western (Figura 19).
Resultados: Como se muestra en la Figura 19, la transfección del LNA-antimiR heptamérico de SEQ ID NO: 3225 que se dirigía a la secuencia semilla de miR-221 y miR-222 dio como resultado un aumento dependiente de la dosis de los niveles de proteína p27 en comparación con células PC3 no transfectadas o transfectadas con control de emparejamiento erróneo de LNA. Estos resultados demuestran claramente que el LNA-antimiR heptamérico es capaz de antagonizar eficazmente la familia de miR-221/222, lo que da lugar a la desrepresión de la diana directa p27 al nivel de proteína.
Conclusión: Un LNA-antimiR heptamérico completamente modificado con LNA que se dirige a la secuencia semilla de la familia de miR-221/222 antagonizó eficazmente ambos miARNA, dando lugar a la desrepresión de la diana directa p27 al nivel de proteína.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular PC3 de carcinoma de próstata humano se adquirió en ECACC (n.° 90112714). Se cultivaron células PC3 en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 250 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50 al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con LNA- antimiR a concentraciones variables con Lipofectamine2000. Las células se recogieron después de 24 horas para la extracción de proteínas y el análisis de transferencia Western.
Transferencia Western: Las células se lavaron con PBS, se tripsinizaron, se transfirieron a tubos Eppendorf y se añadieron 250 gl de tampón de lisis (1 x RIPA). El lisado celular se colocó en hielo durante 20 min y se centrifugó
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entonces a 10 000 rpm durante 10 minutos. La concentración de proteína se midió con Coomassie Plus de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se cargaron 100 ug en un gel de BIS-TRIS al 4-12 %. La membrana se incubó durante la noche a 4 °C con el anticuerpo monoclonal primario de ratón p27 (BO Biosciences) a una dilución de 1:1000. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron con ECL Plus (Amersham).
Ejemplo 20. Temperaturas de fusión del dúplex (Tm) de los LNA-antimiR.
Como se muestra en la tabla 5, los valores de Tm aumentan al aumentar la longitud de LNA-antimiR cortos completamente modificados con LnA (véanse los valores de Tm para la SEQ ID NO: 3205 y SEQ ID NO: 3209-3214 en la tabla 7). El efecto inhibidor más óptimo se logró con el LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3205 contra miR- 21, mientras que la Tm muy baja del hexámero de SEQ ID NO: 3209 probablemente no sea suficiente para mediar el antagonismo de la diana de miR-21. Por otro lado, aumentar la longitud más allá de un decámero (SEQ ID NO: 3212) aumenta significativamente la Tm, mientras que simultáneamente disminuye la actividad inhibidora medida usando el indicador de luficerasa de miR-21, lo que muy probablemente se deba a la alta tendencia de los LNA-antimiR dodecaméricos y tetradecaméricos completamente modificados a formar homodímeros. Los experimentos que usan una ventana deslizante de LNA-antimir octaméricos completamente modificados con LNA a lo largo de la secuencia de reconocimiento de miR-21 demuestran claramente que, además de un valor de Tm adecuado del LNA-antimiR, la región semilla es lo más crítico para la función de miARN y, por tanto, la región más óptima para que se diriga a ella un LNA-antimiR.
Tabla 5: Valores de Tm para LNA-antimiR de miR-21, medidos frente a un oligonucleótido de ARN complementario
SEQ ID NO
microARN Longitud (pb) secuencia Tm medida (ARN) °C
3205
miR-21 8 5’- G ATAAGCT -3’ 64,0
3209
miR-21 6 5'- TAAGCT '3' 32,0
3210
miR-21 7 5'- ATAAGCT -3’ 45,0
3211
miR-21 9 5’- TGATAAGCT -3’ 65,0
3212
miR-21 10 5’- CTGATAAGCT -3‘ 63,0
3213
miR-21 12 5’- GTCTGATAAGCT -3' 86,8
3214
miR-21 14 5’- CAGTCTGATAAGCT -3’ 89,9
3215
miR-21 8 5'- TCTGATAA - 3' 56,0
3216
miR-21 8 5 - ATCAGTCT- 3 72,0
3217
miR-21 8 5'- TCAACATC — 3 48,0
Conclusión: Los valores de Tm, junto con los datos experimentales obtenidos con los indicadores de luciferasa, muestran que un potente antagonismo por LNA-antimiR no solo depende de la Tm, sino que también depende de la colocación del LNA-antimiR dentro de la secuencia de reconocimiento de microARN.
Materiales y procedimientos:
Mediciones de la Tm: Se diluyeron dúplex de oligonucleótido:ARN de miR-21 a 3 pM en 500 pl de H2O libre de ARNasa y se mezclaron con 500 pl de 2 * tampón de Tm (NaCl 200 mM, EDTA 0,2 mM, fosfato de Na 20 mM, pH 7,0). La solución se calentó a 95 °C durante 3 min y luego se dejó reasociar a TA durante 30 min. Las temperaturas de fusión del dúplex (Tm) se midieron en un espectrofotómetro Lambda 40 UV/VIS equipado con un programador de temperatura Peltier PTP6 usando el software PE Templab (Perkin Elmer). La temperatura se elevó de 20 °C a 95 °C y luego bajó a 25 °C, registrándose la absorción a 260 nm. Se usaron la primera derivada y los máximos locales tanto de la fusión como de la reasociación para evaluar las temperaturas de fusión del dúplex.
Ejemplo 21. Valoración del antagonismo de miR-21 mediante la comparación de un LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3205) frente a uno pentadecamérico (SEQ ID NO: 3204) en la línea celular hepatocítica humana HepG2.
Se ha demostrado previamente en esta solicitud que un LNA-antimiR octamérico que está completamente modificado con LNA y fosforotiolado antagoniza eficazmente miR-21 en la línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa, la línea celular de carcinoma de mama humano MCF-7 y la línea celular de cáncer de próstata humano PC3. Se amplió este enfoque de cribado a la línea celular de cáncer hepatocelular humano HepG2. Para valorar la eficacia del oligonucleótido LNA-antimiR octamérico contra miR-21, se generaron constructos de indicadores de luciferasa en los que se clonó un sitio diana de emparejamiento perfecto para el miR-21 maduro en la 3'UTR del gen de la luciferasa de renilla. Para monitorizar la inhibición de miR-21, se transfectaron células HepG2 con los constructos de luciferasa junto con el antagonista de miR-21 de SEQ ID NO: 3205 (octámero) y para la comparación de la especificidad con el LNA-antimiR octamérico de emparejamiento erróneo (SEQ ID NO: 3218) y para la comparación de la potencia junto
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con el pentadecámero (SEQ ID NO: 3204) a concentraciones variables. Después de 24 horas, se midió la actividad de la luciferasa.
Resultados: Los experimentos del indicador de luciferasa mostraron una desrepresión dependiente de la dosis de la actividad del indicador de luciferasa de miR-21 con el LNA-antimiR pentadecamérico contra miR-21 (SEQ ID NO: 3204). Sin embargo, no se obtuvo una desrepresión completa de indicador de luciferasa siquiera a las concentraciones más altas (Figura 20). Por el contrario, las células que se transfectaron con LNA-antimiR octamérico completamente modificado con LNA (SEQ ID NO: 3205) mostraron una desrepresión completa ya a 5 nM, lo que indica una potencia significativamente mejorada en comparación con el LNA-antimiR pentadecamérico. Comparando la especificidad del octámero de emparejamiento perfecto y el octámero de emparejamiento erróneo, el LNA-antimiR de emparejamiento erróneo (SEQ ID NO: 3218) no mostró ninguna desrepresión, demostrando una alta especificidad del compuesto de LNA-antimiR contra miR- 21.
Conclusión: El LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3205) es más potente que el pentadecamérico al dirigirse a miR-21, y el antagonismo de miR-21 por la SEQ ID NO: 3205 es específico.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular HepG2 hepatocítica humana se adquirió de ECACC (n.° 85011430). Las células HepG2 se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 650 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se realizó transfección inversa. Las células HepG2 se transfectaron con 0,6 gg de miR-21, o vector psiCHECK2 vacío junto con 2,55 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 300 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a los pocillos. Las placas se colocaron en un agitador durante 30 min, después de lo cual los lisados celulares se transfirieron a tubos Eppendorf. El lisado celular se centrifugó durante 10 min a 2500 rpm, después de lo cual se transfirieron 50 gl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 22. Validación de la interacción del sitio diana de miR-21 en la 3'-UTR de Pdcd4 y miR-21 usando el LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3205 en la línea celular hepatocelular humana Huh-7.
La proteína supresora tumoral Pdcd4 inhibe la promoción y progresión tumorales. Además, la regulación negativa de Pdcd4 en el cáncer de pulmón y colorrectal también se ha asociado con un mal pronóstico del paciente. Recientemente, Asangani et al (Oncogene 2007) y Frankel et al (J Biol Chem 2008) mostraron que la 3'-UTR de Pdcd4 contiene un sitio diana conservado para miR-21, y la transfección de células con un antimiR-21 dio como resultado un aumento de la proteína Pdcd4. Por lo tanto, se construyó un plásmido de indicador de luciferasa que alberga 313 nt de la región 3'UTR de Pdcd4 que abarca el sitio diana de miR-21 anteriormente mencionado, que se cotransfectó junto con diferentes LNA-antimiR y pre-miR21 (10 nM) en células Huh-7. Los diferentes LNA-antimiR fueron: SEQ ID NO 3205 (octámero, emparejamiento perfecto), SEQ ID NO: 3218 (octámero, emparejamiento erróneo) y SEQ ID NO: 3204 (pentadecámero, secuencia mixta de ADN/LNA). Las mediciones de la luciferasa se realizaron después de 24 horas.
Resultados: Como se muestra en la Figura 21, en células transfectadas con el indicador de luciferasa de la 3'UTR de Pdcd4 y la SEQ ID NO: 3205, se observó un aumento en la actividad de la luciferasa, que indicaba interacción entre la 3'UTR de Pdcd4 y miR-21. Sin embargo, transfectando las células con el compuesto de emparejamiento erróneo, la SEQ ID NO: 3218, no se observó cambio en la actividad de la luciferasa, lo que era de esperar ya que el compuesto no antagoniza miR-21. Al comparar el LNA-antimiR octamérico frente al LNA-antimiR pentadecamérico (SEQ ID NO: 3204), el LNA-antimiR corto modificado completamente con LNA y fosforotiolado era significativamente más potente, lo que confirma los datos anteriores.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea de células de hepatoma humano Huh-7 fue un amable regalo de R. Bartinschlager (Dept. Virología Mol., Universidad de Heidelberg). Se cultivaron células Huh-7 en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 11 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección para alcanzar una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células Huh-7 se transfectaron con 20 ng de 3'UTR de Pdcd4/psiCHECK2 o vector psiCHECK2 vacío junto con pre-miR-21 10 nM (Ambion) y 0,14 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. También se transfectaron
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concentraciones variables de los oligonucleótidos LNA-antimiR. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron y se añadieron 30 pl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo, después de lo cual las placas de 96 pocillos se pusieron en un agitador orbital. Después de 30 min, se añadieron 50 pl de sustrato de luciferasa disuelto en tampón de ensayo de luciferasa II (Dual-Luciferase Reporter Assay System de Promega, n.° de cat. E1910) a los pocillos con células lisadas y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 23. Valoración de los niveles de proteína Pdcd4 como lectura funcional para el antagonismo de miR- 21 por el LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3205).
Además, también se transfectaron células HeLa con SEQ ID NO: 3205 (emparejamiento perfecto), SEQ ID NO: 3218 (emparejamiento erróneo), SEQ ID NO: 3219 (secuencia aleatoria) y se analizaron los niveles de proteína Pdcd4 después de 24 horas con transferencia Western (Figura 22). Como se muestra, en los extractos proteicos de las células en las que se había añadido la SEQ ID NO: 3205, los niveles de proteína Pdcd4 aumentan, debido al antagonismo de mir-21 por la SEQ ID NO: 3205, en contraste con los dos oligonucleótidos de LNA de control.
Conclusión: El antagonismo de miR-21 usando un octámero (SEQ ID NO: 3205) da lugar a la desrepresión del antagonismo de miR-21por la diana directa Pdcd4.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa se adquirió en ECACC (n.° 93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM,
1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 200 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con oligonucleótidos de LNA 5 nM y Lipofectamine2000 2,5 pl/ml (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, las células se recogieron para análisis de transferencia Western.
Transferencia Western: Las células se lavaron con PBS, se tripsinizaron, se transfirieron a tubos Eppendorf y se añadieron 50 pl de tampón de lisis (1 x RIPA). El lisado celular se colocó en hielo durante 20 min y se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 minutos. Se cargaron cantidades iguales (15 pl de lisado celular) en un gel de BIS-TRIS al 412 %. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando iBlot (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La membrana se incubó durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario sérico de conejo purificado por afinidad Pdcd4 (Rockland) con una concentración de 1:2000. Como control, se usaron anticuerpos anti-tubulina beta (Thermo Scientific) a una dilución de 1:5000. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron con ECL Plus (Amersham).
Ejemplo 24. Valoración de la hepatotoxicidad potencial del LNA-antimiR octamérico de emparejamiento perfecto de SEQ ID NO: 3205 y la SEQ ID NO: 3218 de control de emparejamiento erróneo de LNA.
Cada compuesto se inyectó en ratones hembra NMRI, a dosis de 25 mg/kg, 5 mg/kg y 1 mg/kg, cada dos días durante
2 semanas. Los animales se sacrificaron y se recogió el suero de sangre completa para análisis de ALT y AST. Como se ve en la Figura 23, los niveles de ALT y AST no se elevaron para la SEQ ID NO: 3205 en comparación con la solución salina o la SEQ ID NO: 3218 (control de emparejamiento erróneo). Sin embargo, un ratón mostró niveles aumentados (marcados en rojo), ya que las muestras de suero estaban contaminadas con glóbulos rojos, que contienen niveles 6-8 veces más altos de ALT y AST en comparación con el plasma. En los ratones que recibieron 5 mg/kg y 1 mg/kg también se analizaron los niveles de ALT y AST, y no mostraron cambios en comparación con los animales de control tratados con solución salina (datos no mostrados).
Materiales y procedimientos:
Diseño experimental:
N.° de gr.
N.° de ID de animal N.° de ratones Nivel de dosis de compuesto al día Conc. a un vol. de dosis de 10 ml/kg Vía de administración Dosificación
1
1-10 10 NaCl 0,9 % - i.v. 0, 2, 4, 7, 9.
2
11-15 5 SEQ ID NO: 3205 25 mg/kg 2,5 mg/ml i.v. 0, 2, 4, 7, 9.
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3
16-20 5 SEQ ID NO: 3205 5 mg/kg 0,5 mg/ml i.v. 0, 2, 4, 7, 9.
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21-25 5 SEQ ID NO: 3205 1 mg/kg 0,1 mg/ml i.v. 0, 2, 4, 7, 9.
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26-30 5 SEQ ID NO: 3230 25 mg/kg 2,5 mg/ml i.v. 0, 2, 4, 7, 9.
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31-35 5 SEQ ID NO: 3230 5 mg/kg 0,5 mg/ml i.v. 0, 2, 4, 7, 9.
Sacrificio: Los animales fueron sacrificados por luxación cervical.
Muestreo de suero para ALT/AST: Los animales fueron anestesiados con un 70 % de CO2-30 % de O2 antes de la recogida de sangre del seno retroorbitario. La sangre se recogió en viales S-monovette Serum-Gel. Las muestras de suero se recogieron y almacenaron de cada ratón individual. Las muestras de sangre se almacenaron a temperatura ambiente durante dos horas y después de ello se centrifugaron 10 min, 3000 rpm, a temperatura ambiente. Las fracciones de suero se recogieron en tubos Eppendorf sobre hielo húmedo.
Mediciones de ALT y AST: Las mediciones de ALT y AST se realizaron en placas de 96 pocillos usando reactivos de ALT y AST de ABX Pentra (A11A01627 - ALT, A11A01629 - AST) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las muestras de suero se diluyeron 2,5 veces con H2O y cada muestra se sometió a prueba por duplicado. Después de la adición de 50 pl de muestra diluida o patrón (Multical de ABX Pentra A11A01652) a cada pocillo, se añadieron 200 pl de mezcla de reactivo para AST o ALT a 37 °C a cada pocillo. Las mediciones cinéticas se realizaron durante 5 min con un intervalo de 30 s a 340 nm y 37 °C.
Ejemplo 25. Valoración de los niveles de proteína PU.1 como lectura funcional para el antagonismo de miR- 155 por LNA-antimiR corto (SEQ ID NO: 3207).
Se ha demostrado previamente que el octámero (SEQ ID NO: 3207) que antagoniza miR-155 da lugar a la desrepresión de la diana de miR-155 c/EBPbeta en las células RAW de macrófagos de ratón. Para verificar además la potencia de la SEQ ID NO: 3207, se determinaron los niveles de proteína de otra diana de miR-155, PU.1. Como lectura funcional para el antagonismo de miR-155 por LNA-antimiR corto (SEQ ID NO: 3207), se realizó una transferencia Western. El antagonismo se verificó en la línea celular THP-1 monocítica humana, que se transfectó junto con un octámero de emparejamiento perfecto (SEQ ID NO: 3207) o un LNA octamérico de control en ausencia
0 presencia de pre-miR-155. Se usó LPS para inducir la acumulación de miR-155 y las células se recogieron después de 24 horas.
Resultados: Las células THP-1 que se transfectaron con pre-miR-155 muestran una disminución de los niveles de PU.1 (Figura 24). La transfección de las células con la SEQ ID NO: 3207 completamente modificada con LNA y fosforotiolada antagoniza eficazmente miR-155, dando lugar a niveles inalterados de proteína PU.1. En comparación, transfectando las células con un control de LNA octamérico, los niveles de PU.1 disminuyeron, lo que indica que el antagonismo de miR-155 por el LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3207 es específico.
Conclusión: El antagonismo de miR-155 usando un octámero da lugar a la desrepresión de la diana directa PU.1 en células THP-1 humanas.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea de células THP-1 monocítica humana se adquirió de ECACC (n.° 88081201). Las células THP-
1 se cultivaron en RPMI con L-glutamina, complementada con suero bovino fetal al 10 %.
Transfección: Se sembraron 200 000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos el día anterior. El día de la transfección, las células THP-1 se transfectaron con 5 nmol de pre-miR-155 (Ambion) y/o LNA-antimiR 5 nM junto con Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió LPS (100 ng/ml) a las células después de incubación durante 4 horas con los complejos de transfección. Después de 24 horas, las células se recogieron para la extracción de proteínas y el análisis de transferencia Western.
Transferencia Western: Las células se lavaron con PBS, se tripsinizaron, se transfirieron a tubos Eppendorf y se añadieron 50 pl de tampón de lisis (1 x RIPA). El lisado celular se colocó en hielo durante 20 min y se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 minutos. Se cargaron cantidades iguales (15 pl de lisado celular) en un gel de BIS-TRIS al 412 %. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando iBlot (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La membrana se incubó durante la noche a 4 °C con el anticuerpo monoclonal contra PU.1 de conejo (Cell Signaling) a una concentración de 1:2000. Como carga igual, se usó tubulina (Thermo Scientific) a una dilución de 1:5000. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron con ECL Plus (Amersham).
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Ejemplo 26. Valoración de los niveles de proteína p27 como lectura funcional para el antagonismo de la familia de miR-221/222 por el LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3225 heptamérico.
El trabajo previo ha mostrado (le Sage et al. 2007, Galardi et al., 2007) que miR-221 y miR-222 regulan postranscripcionalmente la expresión del gen supresor tumoral p27, que está implicado en la regulación del ciclo celular. En estos estudios, se observó que la regulación negativa de miR-221 y miR-222 aumentaba los niveles de expresión de p27. Por tanto, como lectura funcional para el antagonismo de la familia de miR-221/222 por el LNA- antimiR heptamérico de SEQ ID NO: 3225, se determinaron los niveles de proteína p27 después de la transfección del LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3225 en células PC3.
Resultados: Como se muestra en la Figura 25, la transfección del LNA-antimiR heptamérico de SEQ ID NO: 3225 que se dirigía a la secuencia semilla de miR-221 y miR-222 dio como resultado un aumento dependiente de la dosis de los niveles de proteína p27 en comparación con células PC3 no transfectadas o transfectadas con control de secuencia aleatoria de LNA. Estos resultados demuestran claramente que el LNA-antimiR heptamérico es capaz de antagonizar eficazmente la familia de miR-221/222, lo que da lugar a la desrepresión de la diana directa p27 al nivel de proteína a concentraciones de tan solo 5 nM.
Conclusión: Un LNA-antimiR heptamérico completamente modificado con LNA que se dirige a la secuencia semilla en la familia de miR-221/222 a 5 nM puede antagonizar eficazmente ambos miARNA, dando lugar a la desrepresión de la diana directa p27 al nivel de proteína.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular PC3 de carcinoma de próstata humano se adquirió de ECACC (n.° 90112714). Las células PC3 se cultivaron en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 250 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50 al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con oligonucleótidos de LNA a concentraciones variables (véase la Figura 25) con Lipofectamine2000. Las células se recogieron después de 24 horas para la extracción de proteínas y el análisis de transferencia Western.
Transferencia Western: Las células se lavaron con PBS, se tripsinizaron, se transfirieron a tubos Eppendorf y se añadieron 50 pl de tampón de lisis (1 * RIPA). El lisado celular se colocó en hielo durante 20 min y se centrifugó entonces a 10 000 rpm durante 10 minutos. Se cargaron cantidades iguales (15 pl de lisado celular) en un gel de BIS- TRIS al 4-12 %. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando iBlot (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La membrana se incubó durante la noche a 4 °C con el anticuerpo monoclonal primario de ratón p27 (BD Biosciences) a una dilución de 1:1000. Como control de carga, se usó tubulina (Thermo Scientific) a una dilución de 1:5000. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron con ECL Plus (Amersham).
Ejemplo 27. La desactivación génica de miR-221/222 por LNA-antimiR heptamérico de SEQ ID NO: 3225 reduce la formación de colonias de células PC3.
Un signo distintivo de la transformación celular es la capacidad de las células tumorales de crecer de una manera independiente del anclaje en un medio semisólido. Por lo tanto, se ha realizado un ensayo en agar blando que es un ensayo fenotípico que es pertinente para el cáncer, dado que mide la disminución de las células tumorales. Se transfectaron la SEQ ID NO: 3225 (emparejamiento perfecto) y la SEQ ID NO: 3231 (secuencia aleatoria) en células PC3 y, después de 24 horas, se sembraron células en agar blando. Las colonias se contaron después de 12 días. Se muestra en la Figura 26 que la inhibición de miR-221 y miR-222 por la SEQ ID NO: 3225 puede reducir la cantidad de colonias que crecen en agar blando en comparación con LNA-antimiR de control de secuencia aleatoria, lo que indica una disminución de las células tumorales.
Conclusión: El heptámero (SEQ ID NO: 3225) que se dirige a la familia de miR-221/222 reduce el número de colonias en agar blando, lo que indica la detención de la proliferación de las células PC3.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular PC3 de carcinoma de próstata humano se adquirió de ECACC (n.° 90112714). Las células PC3 se cultivaron en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 250 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50 al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con 25 nM de diferentes oligonucleótidos de LNA con Lipofectamine2000.
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Crecimiento clonogénico en agarblando: Se sembraron 2,5 x 103 células PC3 en agar al 0,35 % sobre la parte superior de una capa base que contenía agar al 0,5 %. Las células se sembraron 24 horas después de la transfección. Las placas se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 en una incubadora humidificada durante 12 días y se tiñeron con 0,005 % de violeta cristal durante 1 h, después de lo cual se contaron las células. El ensayo se realizó por triplicado.
Ejemplo 28: Valoración del antagonismo de let-7 por LNA-antimiR hexaméricos a nonaméricos en células Huh- 7 transfectadas con miARN precursor de let-7a, y un ensayo de sensor de luciferasa.
Para valorar la eficacia de los oligonucleótidos hexaméricos a nonaméricos completamente modificados con LNA para dirigirse a y antagonizar la familia let-7 de miARN-7, se construyó un constructo de sensor de luciferasa, que contenía aproximadamente 800 pb de la 3'UTR de HMGA2. La secuencia clonada en el vector contiene cuatro de siete sitios de unión a let-7 funcionales (sitios 2-5), como se demostró anteriormente por Mayr et al. (Science, 2007) y Lee y Dutta (Genes Dev, 2007). Para monitorizar la inhibición de let-7, la línea celular de carcinoma hepatocelular Huh-7 (con niveles bajos a inexistentes de let-7 endógeno) se transfectó con el constructo de sensor de luciferasa, con el miARN precursor de let-7a, y con los antagonistas hexaméricos a nonaméricos de let-7 de SEQ ID NO: 3232, 3233, 3227, 3234, 3235; véase la Figura 27) a concentraciones crecientes. Los LNA-antimiR hexaméricos a nonaméricos se compararon con la SEQ ID NO: 3226, un pentadecámero contra let-7a, como control positivo. Después de 24 horas, se midió la actividad de la luciferasa.
Resultados: Como se ve en la Figura 28, los LNA-antimiR octaméricos y nonaméricos completamente modificados con LNA (SEQ ID NO: 3227, SEQ ID NO: 3234 y SEQ ID NO: 3235) muestran potencias similares en la desrepresión de las dianas de let-7 en el ensayo de sensor de luciferasa, como el control positivo pentadecamérico de SEQ ID NO: 3226. La desrepresión total de la diana para estos compuestos altamente potentes se alcanza ya a 1-5 nM, mientras que el heptámero de SEQ ID NO: 3233 necesita estar presente en concentraciones ligeramente mayores (10 nM) para generar el mismo efecto. Sin embargo, el hexámero de SEQ ID NO: 3232 no muestra ningún efecto siquiera a concentraciones de hasta 50 nM. La desrepresión de la actividad de la luciferasa por los LNA-antimiR heptaméricos a nonaméricos y pentadecaméricos es dependiente de la dosis, lo que es particularmente claro en el caso de la SEQ ID NO: 3233 ligeramente menos potente.
Conclusión: Para concluir, los LNA-antimiR octaméricos a nonaméricos (SEQ ID NO: 3227, SEQ ID NO: 3234 y SEQ ID NO: 3235) muestran potencias antagonistas iguales en la inhibición de let-7a in vitro en comparación con el LNA- antimiR pentadecamérico de SEQ ID NO: 3226 que se dirige a let-7a. También se observa un efecto potente, aunque a concentraciones ligeramente más altas, para el heptámero SEQ ID NO: 3233, mientras que un hexámero no tiene efecto a las concentraciones sometidas a prueba.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma hepatocelular Huh-7 fue un amable regalo de R. Bartinschlager (Dept. Virología Mol., Universidad de Heidelberg). Se cultivaron células Huh-7 en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 8000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 60-80 % al día siguiente. El día de la transfección, se transfectaron células Huh-7 en cada pocillo con 20 ng de plásmido de la 3'UTR de HMGA2/psiCHECK2, miARN precursor de let-7a (Dharmacon, concentración final 10 nM), LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3232, 3233, 3227, 3234, 3235, 3226; concentraciones finales de 0-50 nM) junto con 0,17 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Se desechó el medio de crecimiento y se añadieron 30 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo. Después de 15-30 minutos de incubación en un agitador orbital, se realizaron mediciones de la luciferasa de renilla y luciérnaga de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 29: Valoración del antagonismo de la familia completa de let-7 por LNA-antimiR octaméricos y pentadecaméricos en células Huh-7 transfectadas con un ensayo de sensor de luciferasa.
Para valorar la eficacia de un oligonucleótido octamérico completamente modificado con LNA para antagonizar la familia completa de miARN de let-7, se usó el mismo constructo de sensor de luciferasa que se describió en el ejemplo anterior. De nuevo, las células Huh-7 (con niveles bajos a inexistentes de let-7 endógeno) se transfectaron con el constructo de sensor, con uno de los representantes de la familia de precursores let-7a, let-7d, let-7e o let-7i y con el antagonista de SEQ ID NO: 3227 a concentraciones crecientes. El LNA-antimiR octamérico se comparó con la SEQ ID NO: 3226, un pentadecámero contra let-78, como control positivo y potente. Después de 24 horas, se midió la actividad de la luciferasa.
Resultados: Como se ve en la Figura 29, los LNA-antimiR octaméricos completamente modificados con LNA (SEQ ID NO: 3227) muestran potencias similares para desreprimir las diversas dianas de let-7 en el ensayo de sensor de luciferasa, como el pentadecámero de SEQ ID NO: 3226 de control positivo. La desrepresión casi total de la diana
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para el octámero se alcanza ya a 0,5-1 nM, excepto en el caso del premiR de let-7e (Figura 29C), en el que solo hibridan 7 de 8 nucleótidos de SEQ ID NO: 3227 con la diana. Sin embargo, a pesar del emparejamiento erróneo terminal en este caso, la SEQ ID NO: 3227 genera una desrepresión total de la diana a 5 nM. El pentadecámero de control positivo muestra un potente antagonismo de todos los precursores y proporciona una desrepresión casi total a 0,5 nM. La desrepresión de la actividad de la luciferasa por los LNA-antimiR tanto octaméricos como pentadecaméricos es claramente dependiente de la dosis, como se ve en los cuatro paneles (Fig. 29A-D).
Conclusión: Para concluir, el LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3227) es un potente antagonista contra cuatro miembros de la familia de let-7 representativos in vitro y, por tanto, probablemente contra toda la familia. Comparado con un antagonista de control positivo pentadecamérico, SEQ ID NO: 3226, el octámero es igual de potente para tres de las cuatro dianas, y ligeramente menos potente para la cuarta diana, let-7e, lo que se explica por un emparejamiento erróneo terminal en este caso.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma hepatocelular Huh-7 fue un amable regalo de R. Bartinschlager (Dept. Virología Mol., Universidad de Heidelberg). Se cultivaron células Huh-7 en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 8000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 60-80 % al día siguiente. El día de la transfección, se transfectaron células Huh-7 en cada pocillo con 20 ng de plásmido de la 3'UTR de HMGA2/psiCHECK2, con miARN precursor de let-7a, 7d, 7e o 7i (Dharmacon; concentración final 10 nM) y con LNA-antimiR de SEQ ID NO: 3227 y SEQ ID NO: 3226; concentraciones finales de 0-50 nM) junto con 0,17 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Se desechó el medio de crecimiento y se añadieron 30 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo. Después de 15-30 minutos de incubación en un agitador orbital, se realizaron mediciones de la luciferasa de renilla y luciérnaga de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 30. Valoración del antagonismo de let-7 endógeno por la SEQ ID NO: 3227, un LNA-antimir octamérico, en células HeLa transfectadas con un ensayo de sensor de luciferasa.
Para determinar la eficacia de un oligonucleótido octamérico completamente modificado con LNA para dirigirse a y antagonizar let-7 endógeno, se cotransfectó el mismo constructo de sensor de luciferasa que se describió en los dos ejemplos anteriores con la SEQ ID NO: 3227 en la línea celular de cáncer de cuello uterino HeLa (que expresa niveles moderados a altos de let-7 según lo determinado por Q-PCR, datos no mostrados). El vector psiCHECK-2 vacío se incluyó como control negativo.
Resultados: Como se ve en la Figura 30, el LNA-antimiR octamérico de SEQ ID NO: 3227 completamente modificado con LNA muestra un potente antagonismo de let-7 endógeno, y proporciona una desrepresión total de la diana a concentraciones de 5-10 nM. La desrepresión de la actividad luciferasa es dependiente de la dosis, comenzando alrededor de 1 nM y alcanzando una meseta a aproximadamente 10 nM.
Conclusión: Para concluir, el LNA-antimiR octamérico (SEQ ID NO: 3227), es un potente antagonista también contra let-7 endógeno in vitro y, por tanto, proporciona pruebas definitivas de que familias enteras de miARN pueden dirigirse con éxito por antagonistas cortos y completamente modificados con LNA.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de cáncer de cuello uterino HeLa se adquirió de ATCC (n.° CCL-2™). Las células HeLa se cultivaron en medio MEM de Eagle, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM, 1 x NEAA y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 8000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50-70 % al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa en cada pocillo se cotransfectaron con 20 ng de plásmido de la 3'UTR de HMGA2/psiCHECK2 o psiCHECK-2 (vector vacío), y con LNA- antimiR de SEQ ID NO: 3227 (0-50 nM, concentraciones finales) junto con 0,17 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Se desechó el medio de crecimiento y se añadieron 30 gl de 1 x tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo. Después de 15-30 minutos de incubación en un agitador orbital, se realizaron mediciones de la luciferasa de renilla y luciérnaga de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
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Ejemplo 31. Valoración del antagonismo de miR-21 por un LNA-antimiR-21 octamérico (n.° 3205) frente a un LNA de control octamérico de secuencia aleatoria (n.° 3219) en la línea celular de carcinoma de colon humano HCT116.
Se ha demostrado previamente en esta solicitud que un LNA-antimiR octamérico que está completamente modificado con LNA y fosforotiolado antagoniza eficazmente miR-21 en la línea celular de carcinoma de cuello uterino humano HeLa, la línea celular de carcinoma de mama humano MCF-7, la línea celular de cáncer de próstata humano PC3 y línea celular HepG2 de carcinoma hepatocelular humano. Se amplió este enfoque de cribado a la línea celular de carcinoma de colon humano HCT116. Para valorar la eficacia del oligonucleótido LNA-antimiR octamérico contra miR- 21 , se generaron constructos de indicadores de luciferasa en los que se clonó un sitio diana de emparejamiento perfecto para el miR-21 maduro en la 3'UTR del gen de la luciferasa de renilla. Para monitorizar la inhibición de miR- 21, se transfectaron células HCT116 con los constructos de luciferasa junto con el antagonista de miR-21 n.° 3205 (octámero) y para la comparación de la especificidad con el control de secuencia aleatoria de LNA octamérico (n.° 3219). Después de 24 horas, se midió la actividad de la luciferasa.
Resultados: Los experimentos del indicador de luciferasa mostraron una desrepresión dependiente de la dosis de la actividad del indicador de luciferasa de miR-21 con el LNA-antimiR octamérico contra miR-21 (n.° 3205) y se obtuvo la desrepresión completa a 5 nM (Figura 31). Al comparar la especificidad del octámero de emparejamiento perfecto y el octámero de control de sequencia aleatoria, el LNA-antimiR de control de secuencia aleatoria (n.° 3219) no mostró ninguna desrepresión en absoluto, demostrando una alta especificidad del compuesto de LNA-antimiR contra miR-21.
Conclusión: El octámero (n.° 3205) es potente al dirigirse a miR-21 y el antagonismo de miR-21 por la n.° 3205 es específico.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de colon humano HCT116 se adquirió de ATCC (CCL-247). Las células HCT116 se cultivaron en medio RPMI, complementado con suero bovino fetal al 10 %, y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 110 000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos y se realizó la transfección. Las células HCT116 se transfectaron con 0,3 pg de plásmido de sensor de luciferasa de miR-21 o vector PSICHECK2 vacío junto con 1,2 pl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR y oligonucleótidos de control. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se añadieron 250 pl de 1 * tampón de lisis pasiva (Promega) a los pocillos. Las placas se colocaron en un agitador durante 30 min, después de lo cual los lisados celulares se transfirieron a tubos Eppendorf. El lisado celular se centrifugó durante 10 min a 2500 rpm, después de lo cual se transfirieron 50 pl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 32. La desactivación génica de miR-21 por LNA-antimiR octamérico n.° 3205 reduce la formación de colonias de células PC3.
Un signo distintivo de la transformación celular es la capacidad de las células tumorales de crecer de una manera independiente del anclaje en un medio semisólido. Por lo tanto, se realizó un ensayo en agar blando que es un ensayo fenotípico que es pertinente para el cáncer, dado que mide la disminución de las células tumorales. Se transfectaron la n.° 3205 (LNA-antimiR-21 de emparejamiento perfecto) y la n.° 3219 (control de secuencia aleatoria de LNA) en células PC3, y después de 24 horas se sembraron células en agar blando. Las colonias se contaron después de 12 días. Se muestra en la Figura 32 que la inhibición de miR-21 por la n.° 3205 puede reducir la cantidad de colonias que crecen en agar blando en comparación con el LNA de control de secuencia aleatoria tratado o no tratado (transfectado, pero sin LNA), lo que demuestra la disminución de las células tumorales.
Conclusión: El octámero (n.° 3205) que se dirige a la familia de miR-21 reduce el número de colonias en agar blando, lo que demuestra la detención de la proliferación de las células PC3.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular PC3 de carcinoma de próstata humano se adquirió de ECACC (n.° 90112714). Las células PC3 se cultivaron en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 250 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50 al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con 25 nM de diferentes oligonucleótidos de LNA con Lipofectamine2000.
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Crecimiento clonogénico en agarblando: Se sembraron 2,5 x 103 células PC3 en agar al 0,35 % sobre la parte superior de una capa base que contenía agar al 0,5 %. Las células se sembraron 24 horas después de la transfección. Las placas se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 en una incubadora humidificada durante 12 días y se tiñeron con 0,005 % de violeta cristal durante 1 h, después de lo cual se contaron las células. El ensayo se realizó por triplicado.
Ejemplo 33. El silenciamiento de miR-21 por el LNA-antimiR octamérico de n.° 3205 reduce la formación de colonias de células HepG2. El miR-21 está sobreexpresado en la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 y se ha demostrado previamente que es posible regular la actividad de la luciferasa de un plásmido de sensor de miR-21 con la n.° 3205 en estas células. Las células HepG2 se transfectaron con la n,° 3205 y la n.° 3219 (octámero de sequencia aleatoria), y después de 24 horas se sembraron en agar blando. Las colonias se contaron después de 17 días con un microscopio.
Resultados: Se muestra en la Figura 33 que la inhibición de miR-21 por la n.° 3205 puede reducir la cantidad de colonias que crecen en agar blando, lo que muestra que se ha producido una detención de la proliferación. Además, el control octamérico de secuencia aleatoria, n.° 3219, no tenía un efecto significativo sobre el número de colonias. Conclusión: El octámero (n.° 3205) que se dirige a miR-21 reduce el número de colonias en agar blando, lo que indica la detención de la proliferación de las células HepG2.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular HepG2 hepatocítica humana se adquirió de ECACC (n.° 85011430). Las células HepG2 se cultivaron en medio EMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 650 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se realizó transfección inversa. Las células HepG2 se transfectaron con 0,6 gg de plásmido de sensor de luciferasa de miR-21 o vector PSICHECK2 vacío junto con 2,55 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también LNA-antimiR y oligonucleótidos de control a concentraciones variables. Después de 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Crecimiento clonogénico en agar blando: Se sembraron 2,0 x 103 células HepG2 en agar al 0,35 % sobre la parte superior de una capa base que contenía agar al 0,5 %. Las células se sembraron 24 horas después de la transfección. Las placas se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 en una incubadora humidificada durante 12 días y se tiñeron con 0,005 % de violeta cristal durante 1 h, después de lo cual se contaron las células. El ensayo se realizó por triplicado.
Ejemplo 34. El silenciamiento de miR-21 por LNA-antimiR octamérico n.° 3205 inhibe la migración celular en células PC3.
La migración celular se puede monitorizar realizando un ensayo de cicatrización de heridas (= ensayo de raspado) en el que se realiza un “raspado” en una monocapa de células, y se capturan imágenes al principio y a intervalos regulares durante la migración celular. Al comparar las imágenes, se puede determinar la cuantificación de la tasa de migración de las células. Esto se hizo en la línea celular de cáncer de próstata humano PC3. Las células se sembraron y, el día 3, las células se transfectaron, y al día siguiente, cuando se alcanzó una confluencia de un 100 %, se realizó un raspado (= herida). Cuando se hizo el raspado, se tomaron fotografías para documentar la herida inicial. Posteriormente, el área del cierre de la herida se mide en diferentes puntos temporales con el programa de software libre Imagen J. Como se muestra en la Figura 34A, las células PC3 se trataron con n.° 3205 25 nM (emparejamiento perfecto, miR-21), el control n.° 3219 o se dejaron sin transfectar. Las imágenes se tomaron después de 24 horas, y se calculó el área para el cierre de la herida en el punto temporal respectivo. El cierre de la herida para las células no transfectadas y para el control, n.° 3219, fue más rápido en comparación con el LNA-antimiR contra miR-21, n.° 3205, lo que indica que la n.° 3205 inhibe el miR-21 y evita que las células migren (Figura 34B) .
Conclusión: El octámero (n.° 3205) que se dirige a miR-21 inhibe la migración celular de las células PC3 en comparación con las células no transfectadas y transfectadas de control.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular PC3 de carcinoma de próstata humano se adquirió de ECACC (n.° 90112714). Las células PC3 se cultivaron en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 2 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Ensayo de raspado: Se sembraron 150 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos tres días antes de la transfección para recibir una confluencia de un 100 % al día siguiente. A las 24 horas después de la transfección, se realizó un raspado en la monocapa celular con una punta de 200 gl. Se tomaron imágenes a las 0 h y después de las 24 horas mediante el uso de una cámara digital acoplada a un microscopio. Se usó el programa de software Image J para determinar el cierre de la herida.
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Ejemplo 35. Valoración de la longitud de LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA que antagonizan miR-155.
Se ha mostrado previamente una valoración de la longitud de miR-21 con respecto a LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA, y se ha mostrado que los LNA-antimiR más potentes tienen una longitud de 7, 8 o 9 nt. El mismo experimento se repitió con miR-155. Se clonó un sitio diana de emparejamiento perfecto para miR-155 en la 3'UTR del gen de la luciferasa en el plásmido de indicador psiCHECK2 y se transfectó en la línea celular RAW de macrófagos de ratón junto con LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA de diferentes longitudes. Debido a que los niveles endógenos de miR-155 son bajos en la línea celular RAW, las células se trataron con 100 ng/ml de LPS durante 24 horas para inducir la acumulación de miR-155. Después de 24 horas, se realizó el análisis de la luciferasa.
Resultados: Como se muestra en la Figura 35, los LNA-antimiR más potentes son la n.° 3207 (8 nt) y la n.° 3241 (9 nt), alcanzando casi un 80 % de desrepresión a solo 0,25 nM de concentración de LNA. El hexámero (n.° 3244) no muestra una desrepresión significativa. El aumento de la longitud desde dodecámero a tetradecámero (n.° 3242 y n.° 3243) disminuyó la potencia como se muestra por una desrepresión menos eficaz del indicador de miR-155.
Conclusión: Los LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA más potentes que se dirigen a miR-155 eran un octámero y un nonámero (n.° 3207 y n.° 3241).
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de macrófagos de ratón RAW 264.7 se adquirió de ATCC (TIB-71). Las células RAW se cultivaron en medio DMEM, complementado con suero bovino fetal al 10 %, Glutamax 4 mM y 25 ug/ml de gentamicina.
Transfección: Se sembraron 500 000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección para recibir una confluencia de un 50 % al día siguiente. El día de la transfección, las células RAW 264.7 se transfectaron con 0,3 gg de miR-155 de emparejamiento perfecto con /psiCHECK2 o vector psiCHECK2 vacío junto con 10 gl de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron también concentraciones variables de LNA-antimiR. Para inducir la acumulación de miR-155, se añadió LPS (100 ng/ml) a las células RAW después de incubación durante 4 horas con los complejos de transfección. Después de otras 24 horas, las células se recogieron para mediciones de la luciferasa.
Ensayo de luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se recogieron con un raspador celular, después de lo cual las células se centrifugaron durante 5 min a 2500 rpm. El sobrenadante se desechó y se añadieron 50 gl de 1 * tampón de lisis pasiva (Promega) al sedimento celular, después de lo cual las células se pusieron en hielo durante 30 min. Las células lisadas se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30 min, después de lo cual se transfirieron 20 gl a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 36. Unión a proteínas plasmáticas para el octámero completamente sustituido con LNA de n.° 3205 que se dirige a miR-21 (LNA-antimiR-21).
Las proteínas del plasma no están saturadas con n.° 3205 a las concentraciones plasmáticas en el experimento que se muestra en la Figura 36A. En un amplio intervalo de concentraciones de n.° 3205 en el plasma, la unión a proteínas es de alrededor deun 95 % del LNA-antimiR-21 de n.° 3205 en la Figura 36B. A concentraciones de n.° 3205 de 50,1 gM (174 pg/ml), la capacidad de unión de las proteínas plasmáticas a n.° 3205 marcado con FAM no se ha saturado.
Materiales y procedimientos: Se añadieron a plasma de ratón (100 gl) concentraciones de n.° 3205 marcado con FAM de 0,167, 1,67, 5,01, 10,02, 16,7, 25,05 y 50,1 gM. Las soluciones se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Las soluciones se transfirieron a un filtro Microcon Ultracel YM-30 (celulosa regenerada de 30 000 MWCO). Los filtros se centrifugaron durante 20 minutos a 2000 g y a temperatura ambiente en una microcentrífuga. El filtrado se diluyó 5, 10 y 20 veces y se transfirieron muestras de 100 gl a una placa de microtitulación (poliestireno negro NUNC-237108). La fluorescencia se detectó usando un lector de ELISA FLUOstar Optima con excitación a 458 nm y emisión a 520 nm. La cantidad de n.° 3205 marcado con FAM no unido se calculó a partir de una curva patrón derivada de plasma filtrado adicionado con n.° 3205 marcado con FAM a 12 concentraciones diferentes (0,45-1000 nM). Los números se corrigieron con el índice de recuperación establecido a partir de experimentos de filtración con concentraciones de la n.° 3205 de 0,167, 1,67, 5,01, 10,02, 16,7, 25,05 y 50,1 gM en plasma filtrado. La recuperación de n.° 3205 marcado con FAM fue de un 86 %.
Ejemplo 37. Estudio de autorradiografía de cuerpo entero cuantitativa en ratones hembra pigmentados después de administración intravenosa única de LNA-antimiR-21 de n.° 3205 marcado con 35S.
Para determinar la biodistribución de un LNA-antimiR completamente modificado con LNA (n.° 3205, octamérico), se realizó una distribución tisular de cuerpo entero del compuesto marcado radiactivamente en ratones. Se dosificó n.°
3205 marcado con 35S a ratones con una única administración intravenosa y los ratones fueron sacrificados en diferentes puntos temporales, que iban desde 5 min a 21 días.
Tabla 6(i). Concentraciones en los tejidos individuales (|jg de n.° 3205/g de tejido) después de una única 5 administración intravenosa de n.° 3205 marcado con 35S en ratones hembra pigmentados. Las cifras son valores medios de tres mediciones para cada tejido y proporción. El coeficiente de variación (CV) generalmente es de aproximadamente un 10 %.
Tejido
Conc. máx. de oligo pg de n.° 3205/g de tejido Tiempo de concentración máxima horas T1/2 horas
Gl. suprarrenal
13,6 0,083 374
Bilis
4 1
Médula ósea
7,2 0,083 411
Cerebro
0,4 0,083
Grasa parda
8,8 0,083
Mucosa gástrica
10,1 0,083
Sangre del corazón
26,2 0,083 10,3
Corteza renal
58,7 24 104
Hígado
11,8 0,083 588
10,7 24
Pulmón
13,2 0,083 289
Ganglio linfático
5 0,083 262
2,4 48
Linfa
18,8 4
20,8 168
Miocardio
8,1 0,083 662
Ovario
13 0,083 198
Páncreas
5 0,083
Gl. pituitaria
6,7 0,083
Gl. salivar
8,6 0,083 405
5,5 168
Músculo esquelético
4,8 0,083
Pig. cutáneo
5,4 0,25
Bazo
9,8 0,083 564
Timo
3,8 0,083 185
Gl. tiroidea
10,9 0,083 592
Orina
328,9 0,083
Útero
9,6 0,25 177
Úvea ocular
13,6 0,083
LOQ
0,045 0,083
0,033 24
0,03 168
10
Tabla 6 (ii) Proporciones de tejido respecto a hígado después de la administración intravenosa única de n.° 3205 marcado con 35S en ratones hembra pigmentados.
35S-n.° 3205
N.° de animal
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tiempo de supervivencia (h)
0,083 0,25 1 h 4 h 24 h 48 h 96 h 168 504
Órgano
Gl. suprarrenal
Hígado Hígado Hígado Hígado Hígado Hígado Hígado Hígado Hígado
Bilis
1,15 1,08 0,52 0,27 0,24 0,26 0,23 0,18 0,17
Médula ósea
0,03 0,11 0,55 0,10 0,03 0,07 0,04 0,03 0,04
Cerebro
0,61 0,81 0,55 0,45 0,40 0,48 0,43 0,42 0,34
Grasa parda
0,03 0,03 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Mucosa gástrica
0,75 0,57 0,29 0,12 0,07 0,12 0,08 0,10 0,07
Sangre del corazón
0,86 0,71 0,31 0,22 0,10 0,21 0,15 0,16 0,12
Corteza renal
2,23 1,91 0,74 0,11 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00
Hígado
2,87 3,94 6,45 6,95 5,51 6,68 3,92 2,24 0,40
Pulmón
1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Ganglio linfático
1,12 0,97 0,63 0,09 0,04 0,04 0,03 0,02 0,02
Linfa
0,43 0,30 0,25 0,19 0,11 0,32 0,20 0,17 0,12
Miocardio
0,82 1,09 1,78 2,78 1,03 2,05 1,62 3,17 1,89
Ovario
0,69 0,63 0,30 0,13 0,10 0,15 0,09 0,11 0,12
Páncreas
1,10 1,40 0,61 0,31 0,27 0,28 0,21 0,21 0,08
Glándula pituitaria
0,42 0,37 0,22 0,18 0,12 0,17 0,12 0,15 0,11
Glándula salival
0,57 0,54 0,28 0,11 0,15 0,16 0,12 0,10 0,08
Músculo esquel.
0,73 0,81 0,38 0,25 0,25 0,42 0,23 0,85 0,24
Pigm. cutáneo
0,40 0,28 0,14 0,04 0,02 0,04 0,03 0,03 0,03
Bazo
0,34 0,69 0,65 0,36 0,20 0,26 0,20 0,19 0,13
Timo
0,83 0,86 0,44 0,32 0,24 0,34 0,35 0,29 0,31
Glándula tiroidea
0,32 0,31 0,14 0,07 0,09 0,08 0,05 0,04 0,02
Orina
0,9 1,2 0,43 0,28 0,25 0,34 0,19 0,26 0,25
Útero
27,96 39,48 9,90 5,44 0,24 0,39 0,12 0,15 0,03
Úvea ocular
0,56 1,23 0,65 0,30 0,30 0,07 0,27 0,16 0,08
5 Conclusiones La n.° 3205 muestra un aclaramiento sanguíneo de la radiactividad con semividas de eliminación de 810 horas. Se registraron altos niveles de radiactividad en la corteza renal, la linfa, el hígado, la médula ósea, el bazo, el ovario y el útero. El nivel más alto de radiactividad se registró en la corteza renal y muestra niveles cinco veces superiores a los del hígado para la n.° 3205. Se observó una fuerte retención de radiactividad en la corteza renal, la linfa, el hígado, la médula ósea y el bazo para LNA-antimiR n.° 3205.
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Administración de dosis: Se pesaron todos los ratones antes de la administración. Nueve ratones hembra recibieron 10 mg/kg de n.° 3205 marcado con 35S por vía intravenosa en una vena de la cola. El volumen administrado a cada animal fue de 10 ml/kg de la formulación problema. La actividad específica es 75,7 gCi/mg. Los ratones individuales se sacrificaron 5 min, 15 min, 1 hora, 4 horas, 24 horas, 2 días, 4 días, 7 días y 21 días después de la administración de n.° 3205. Autorradiografía de cuerpo entero: Se anestesió a los ratones con sevoflurano, y luego se les sumergió inmediatamente en heptano y se les enfrió con hielo seco a -80 °C, ABR-SOP-0130. Los cadáveres congelados se incluyeron en un gel de carboximetilcelulosa acuosa (CMC), se congelaron en etanol, se enfriaron con nieve carbónica (-80 oC) y se seccionaron de forma sagital para autorradiografía de cuerpo entero de acuerdo con el procedimiento estándar, ABR-SOP-0131. De cada animal se cortaron secciones de 20 gm a diferentes niveles con un criomicrótomo (Leica CM 3600) a una temperatura de aproximadamente -20 °C. Las secciones obtenidas se recogieron en cinta (Minnesota Mining and Manufacturing Co., n.° 810) y se numeraron consecutivamente con tinta radiactiva. Después de liofilizar a -20 °C durante aproximadamente 24 horas, las secciones seleccionadas se cubrieron con una capa fina de lámina de Mylar y se colocaron en placas de formación de imágenes (Fuji, Japón). La exposición se llevó a cabo en módulos herméticos a la luz en una caja protectora de plomo a -20 °C, para proteger las placas de imagen de la radiación ambiental. Después de la exposición, las placas de imágenes se escanearon a un tamaño de píxel de 50 gm y se analizaron mediante radioluminografía usando un sistema de análisis de bioimagen (Bas 2500, Fuji, Japón), y descrito en ABR-SOP-0214. Se mezcló una solución problema de radioactividad estándar hidrosoluble con sangre completa y se usó para la producción de una escala de calibración, ABR-SOP-0251. Sin embargo, los diferentes patrones de sangre se disolvieron en 500 ul de Soluene-35. Luego se añadieron 4,5 ml de Ultima Gold a las muestras disueltas. Como 35S y 14C tienen espectros de energía muy similares, se usó un programa de 14C estándar (Packard 2200CA) cuando se estableció la radiactividad para las diferentes muestras de sangre.
Cálculos farmacocinéticos: La radioactividad de 35S medida en sangre completa y tejidos se expresó como nCi/g de tejido y se volvió a calcular en nmol de equiv/g de tejido para la evaluación farmacocinética. Los parámetros farmacocinéticos Cmáx, t1/2 y AUC se determinaron para la sangre completa y los tejidos mediante análisis no compartimental utilizando WinNonlin Professional (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, EE. UU.). Después de la administración intravenosa, la concentración se extrapoló de vuelta a cero y se expresó como (C0). La constante de tasa de eliminación A se estimó por análisis de regresión lineal de la pendiente terminal de la curva logarítmica de concentración plasmática-tiempo. La semivida de eliminación, t1/2, se calculó usando la ecuación, t1/2 = ln2/A. Los tres últimos puntos temporales superiores al LOQ se usaron en los cálculos de la semivida de eliminación, si no se señala lo contrario.
Ejemplo 38. Valoración de la inhibición de let-7 in vivo por un LNA-antimiR octamérico, según se determina a través de la cuantificación de proteína Ras en pulmón y riñón de ratón.
Para investigar la posibilidad de antagonizar la familia de let-7 expresada abundantemente in vivo, a los ratones se les inyectó por vía intravenosa (iv) un antagonista de LNA-antimiR octamérico o solución salina. Para medir el efecto del tratamiento, se aislaron proteínas de los pulmones y los riñones. Debido a que Johnson et al. (Cell, 2005) mostrado previamente que la familia de las proteínas Ras (N-Ras, K-Ras y H-Ras), en particular N-Ras y K-Ras, está regulada (reprimida) por la familia de let-7, el objetivo era analizar si estas dianas de let-7 podrían desreprimirse in vivo.
Resultados: Como se ve en la Figura 37, el LNA-antimiR octamérico desreprimía potentemente los niveles de proteína Ras en los riñones de los ratones tratados, normalizados frente a los controles de solución salina. La regulación positiva en este órgano era de más de 3 veces, mostrando un claro efecto in vivo. En los pulmones, sin embargo, solo se observó una desrepresión mínima de Ras (1,2 veces) (Fig. 1B), lo que sugiere que han entrado cantidades insuficientes de LNA-antimiR en este órgano para inhibir sus cantidades masivas de let-7, como se describe previamente por Johnson et al. (Cancer Research, 2007).
Conclusión: El LNA-antimiR octamérico muestra un claro efecto en la regulación del miARN de let-7 diana in vivo, según se evaluó basándose en los niveles de proteína Ras en ratones tratados frente a controles. Mientras que el efecto parece ser menor en los pulmones, los niveles de Ras en el riñón muestran una regulación positiva sustancial después del tratamiento con antimiR.
Materiales y procedimientos: Animales y dosificación: Se trataron ratones C57BL/6 hembra con 10 mg/kg de LNA- antimiR o solución salina durante tres días consecutivos (0, 1 y 2) y se sacrificaron el día 4. Las muestras tisulares de los pulmones y los riñones se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C hasta su procesamiento posterior.
Análisis de transferencia Western: Las proteínas de pulmón y riñón de ratones tratados con solución salina y LNA- antimiR se separaron en NuPAGE Bis Tris al 4-12 % (Invitrogen), usando 100 gg por muestra. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando iBlot (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El bloqueo, dilución y detección de anticuerpos se realizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Para la detección de Ras, se usó un anticuerpo primario anti-Ras de conejo (SC-3339, Santa Cruz Biotechnology) y un anticuerpo secundario porcino contra inmunoglobulinas de conejo conjugado con HRP (P0399, Dako), y para la detección de tubulina, una tubulina alfa primaria (MS-581-P1, Neomarkers) y un anticuerpo secundario caprino contra inmunoglobulinas de ratón conjugado con HRP (P0447, Dako).
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Ejemplo 40. Valoración de la eficacia in vivo del LNA-antimiR octamérico (n.° 3205) al dirigirse a miR-21, según se determina por la regulación positiva de la proteína Pdcd4 en riñón de ratón.
Se ha demostrado que un LNA-antimiR octamérico que está completamente modificado con LNA antagoniza miR-21 y tiene la capacidad de regular los niveles de proteína de la diana de miR-21 Pdcd4 in vitro. Por lo tanto, se inyectó el LNA-antimiR en ratones para determinar los efectos del LNA-antimiR in vivo. Los ratones recibieron 25 mg/kg de n.° 3205 por inyección i.v. cada dos días durante 14 días (un total de 5 dosis). Se sacrificó a los ratones el día 14, se extrajo el riñón y se aisló la proteína. Para determinar la regulación de la diana, se realizó un análisis de transferencia Western.
Resultados: Como se muestra en la Figura 38, el tratamiento de ratones con n.° 3205 mostró niveles de proteína Pdcd4 significativamente aumentados en comparación con el control de solución salina. Si bien la proporción normalizada de Pdcd4 frente a Gapdh era constante en ambas muestras de solución salina, la regulación positiva de la proteína en los dos ratones tratados con LNA-antimiR (n.° 32059) se midió a 3,3 y 6,3 veces, respectivamente, demostrando un efecto farmacológico in vivo del LNA-antimiR octamérico de n.° 3205.
Conclusión: El LNA-antimiR n.° 3205 octamérico completamente modificado con LNA antagoniza miR-21 in vivo, como se demuestra por su capacidad de desreprimir (regular positivamente) los niveles en riñón de ratón de Pdcd4, una diana de miR-21 validada.
Materiales y procedimientos:
Animales y dosificación: Se usaron ratones C57BL/6 hembra con un promedio de 20 g de peso corporal en la primera dosificación en todos los experimentos y recibieron dieta de pienso regular (Altromin n.° 1324, Brogaarden, Gentofte, Dinamarca). Las sustancias se formularon en solución salina fisiológica (NaCl al 0,9 %). Se administró a los animales LNA-antimiR o solución salina (NaCl al 0,9 % ), recibiendo una inyección de 25 mg/kg cada dos días durante 14 días, un total de 5 dosis. Los animales fueron sacrificados el día 14.
Análisis de transferencia Western: Se separaron 80 gg de tejido renal de ratones tratados con solución salina o LNA en NuPAGE Bis Tris al 4-12 % (invitrogen). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando iBlot (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La membrana se incubó con anticuerpo contra Pdcd4 (Bethyl Laboratories), seguido de anticuerpo porcino contra inmunoglobulinas de conejo conjugado con HRP (Dako). Como control de igual carga, se usó GAPDH (Abcam), seguido de anticuerpo porcino contra inmunoglobulinas de ratón conjugado con HRP. Las membranas se visualizaron por quimioluminiscencia (ECL, Amersham).
Tabla 1
microARN
Secuencia de microARN SEQ ID NO Nonámero SEQ ID NO Octámero SEQ ID NO Heptámero SEQ ID NO
ebv-miR-BARTl-3p
UAGCACCGCUAUCCACUAUGUC 40 AGCGGTGCT 977 GCGGTGCT 1914 CGGTGCT 2851
ebv-miR-BARTl-5p
UCUUAGUGGAAGUGACGUGCUGUG 41 TCCACTAAG 978 CCACTAAG 1915 CACTAAG 2852
ebv-miR-BARTIO
UACAUAACCAUGGAGUUGGCUGU 42 TGGTTATGT 979 GGTTATGT 1916 GTTATGT 2853
ebv-miR-BARTIO*
GCCACCUCOUUGGUUCUGUACA 43 AAGAGGTGG 980 AGAGGTGG 1917 GAGGTGG 2854
ebv-miR-BARTll-3p
ACGCACACCAGGCUGACUGCC 44 tggtgtgcg 981 GGTGTGCG 1918 GTGTGCG 2855
ebv-miR-BARTll-5p
UCAGACAGUUUGGUGCGCUAGUUG 45 AACTGTCTG 982 ACTGTCTG 1919 CTGTCTG 2856
ebv-miR-BART12
UCCUGUGGUGUUUGGUGUGGUU 46 CACCACAGG 983 ACCACAGG 1920 CCACAGG 2857
ebv-miR-BART13
UGUAACUUGCCAGGGACGGCUGA 47 GCAAGTTAC 984 CAAGTTAC 1921 AAGTTAC 2858
ebv-miR-BART13*
AACCGGCUCGUGGCUCGUACAG 48 CGAGCCGGT 985 GAGCCGGT 1922 AGCCGGT 2859
ebv-miR-BART14
UAAAUGCUGCAGUAGUAGGGAU 49 GCAGCATTT 986 CAGCATTT 1923 AGCATTT 2860
ebv-miR-BART14*
UACCCUACGCUGCCGAUUUACA 50 GCGTAGGGT 987 CGTAGGGT 1924 gtagggt 2861
ebv-miR-BART15
GUCAGUGGUUUUGUUUCCUUGA 51 AACCACTGA 988 ACCACTGA 1925 CCACTGA 28 62
ebv-miR-BART16
UUAGAUAGAGUGGGUGUGUGCUCU 52 CTCTATCTA 989 TCTATCTA 1926 CTATCTA 2863
ebv-miR-BART1T-3p
UGUAUGCCOGGUGUCCCCÜUAGU 53 CAGGCATAC 990 AGGCATAC 1927 GGCATAC 2864
ebv-miR-BART17-5p
UAAGAGGACGCAGGCAUACAAG 54 CG7CCTCTT 991 GTCCTCTT 1928 TCCTCTT 2865
ebv-miR-BART18-3p
UAUCGGAAGUUUGGGCUUCGUC 55 ACTTCCGAT 992 CTTCCGAT 1929 TTCCGAT 2866
ebv-miR-BART18-5p
UCAAGUUCGCACUUCCUAUACA 56 GCGAACTTG 993 CGAACTTG 1930 GAACTTG 2867
ebv-miR-BART19-3p
UUUÜGUUUGCUUGGGAAUGCU 57 GCAAACAAA 994 CAAACAAA 1931 AAACAAA 2868
ebv-miR-8ART19-5p
ACAUUCCCCGCAAACAUGACAUG 58 CGGGGAATG 995 GGGGAATG 1932 GGGAATG 28 69
ebv-miR-BART2-3p
AAGGAGCGAUUUGGAGAAAAUAAA 59 ATCGCTCCT 996 TCGCTCCT 1933 CGCTCCT 2870
ebv-miR-BART2-5p
UAUUUUCUGCAUÜCGCCCOUGC 60 GCAGAAAAT 997 CAGAAAAT 1934 AGAAAAT 2871
ebv-miR-BART20-3p
CAUGAAGGCACAGCCUGUUACC 61 TGCCTTCAT 998 GCCTTCAT 1935 CCTTCAT 2872
ebv-miR-BART20-5p
UAGCAGGCAUGUCUUCAUUCC 62 ATGCCTGCT 999 TGCCTGCT 1936 GCCTGCT 2873
ebv-miR-BART3
CGCACCACUAGUCACCAGGUGU 63 TAGTGGTGC 1000 AGTGGTGC 1937 GTGGTGC 2874
ebv-miR-BART3'
accuaguguuaguguugugcu 64 AACACTAGG 1001 ACACTAGG 1938 CACTAGG 2875
ebv-miR-BART4
GACCUGAUGCUGCUGGUGUGCU 65 GCATCAGGT 1002 CATCAGGT 1939 ATCAGGT 2876
ebv-miR-BART5
CAAGGUGAAUAUAGCUGCCCAUCG 66 ATTCACCTT 1003 TTCACCTT 1940 TCACCTT 2877
ebv-raiR-BART6-3p
CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA 67 CCGATCCCC 1004 CGATCCCC 1941 GATCCCC 2878
ebv-miR-BART6-5p
UAAGGUUGGUCCAAUCCAUAGG 68 accaacctt 1005 CCAACCTT 1942 CAACCTT 2879
ebv-miR-BART7
CAUCAUAGUCCAGUGUCCAGGG 69 GACTATGAT 1006 ACTATGAT 1943 CTATGAT 2880
ebv-miR-BARTT'
CCUGGACCUUGACUAUGAAACA 70 AAGGTCCAG 1007 AGGTCCAG 1944 GGTCCAG 2881
ebv-raiR-BART8
UACGGUUUCCUAGAUUGUACAG 71 GGAAACCGT 1008 GAAACCGT 1945 AAACCGT 2882
ebv-miR-BART8 *
GUCACAAUCUAUGGGGUCGUAGA 72 AGATTGTGA 1009 GATTGTGA 1946 ATTGTGA 2883
ebv-miR-BART9
UAACACUUCAUGGGUCCCGUAGU 73 tgaagtgtt 1010 GAAGTGTT 1947 AAGTGTT 2884
ebv-miR-BART9*
UAC UGGACCCUGAAUUGGAAAC 74 GGGTCCAGT 1011 GGTCCAGT 1948 GTCCAGT 2885
ebv-miR-BHRFl-1
UAACCUGAOCAGCCCCGGAGUU 75 GATCAGGTT 1012 ATCAGGTT 1949 TCAGGTT 2886
ebv-miR-BHRFl-2
UAUCUUUUGCGGCAGAAAUUGA 76 GCAAAAGAT 1013 CAAAAGAT 1950 AAAAGAT 2887
ebv-miR-BHRFl-2 *
AAAUUCUGUUGCAGCAGAOAGC 77 AACAGAATT 1014 ACAGAATT 1951 CAGAATT 2888
ebv-miR-BHRFl-3
UAACGGGAAGUGUGUAAGCACA 78 CTTCCCGTT 1015 TTCCCGTT 1952 TCCCGTT 2889
hcmv-miR-UL112
AAGUGACGGUGAGAUCCAGGC U 79 ACCGTCACT 1016 CCGTCACT 1953 CGTCACT 2890
hcmv-miR-UL148D
UCGUCCUCCCCÜUCUUCACCG 80 GGGAGGACG 1017 GGAGGACG 1954 GAGGACG 2891
hcmv-miR-UL22A
UAACUAGCCUUCCCGUGAGA 81 AGGCTAGTT 1018 GGCTAGTT 1955 GCTAGTT 2892
hcmv-miR-UL22A’
UCACCAGAAUGCUAGUUUGUAG 82 ATTCTGGTG 1019 TTCTGGTG 1956 TCTGGTG 2893
hcmv-miR-UL36
UCGUUGAAGACACCUGGAAAGA 83 TCTTCAACG 1020 CTTCAACG 1957 TTCAACG 2894
hcmv-miR-UL36'
UÜUCCAGGUGUUUUCAACGUGC 84 CACCTGGAA 1021 ACCTGGAA 1958 CCTGGAA 2895
hcmv-miR-UL70-3p
GGGGAUGGGCUGGCGCGCGG 85 GCCCATCCC 1022 CCCATCCC 1959 CCATCCC 2896
hcmv-miR-UL70-5p
UGCGOCUCGGCCÜCGUCCAGA 86 CCGAGACGC 1023 CGAGACGC 1960 GAGACGC 2897
hcmv-miR-US25-l
AACCGCUCAGUGGCUCGGACC 87 CTGAGCGGT 1024 TGAGCGGT 1961 GAGCGGT 2898
hcmv-miR-US25-l*
UCCGAACGCUAGGÜCGGUUCUC 88 AGCGTTCGG 1025 GCGTTCGG 1962 CGTTCGG 2899
hcmv-miR-US25-2- 3p
AUCCACUUGGAGAGCUCCCGCGG 89 CCAAGTGGA 1026 CAAGTGGA 1963 AAGTGGA 2900

Claims (33)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un oligómero de una secuencia de nucleobases contigua de 7-12 nucleobases de longitud, en el que todas las unidades de nucleobases del oligómero son unidades de LNA, y en el que al menos el 75 % de los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases de la secuencia de nucleobases contiguas son enlaces internucleosídicos de fosforotioato, y en el que el oligómero es capaz de reducir la cantidad eficaz de un microARN en una célula o in vivo.
  2. 2. Un oligómero de una secuencia de nucleobases contigua de 7-12 nucleobases de longitud, en el que todas las unidades de nucleobases del oligómero son unidades de LNA, y en el que al menos el 75 % de los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases de la secuencia de nucleobases contiguas son enlaces internucleosídicos de fosforotioato, y en el que el oligómero es capaz de reducir la cantidad eficaz de un microARN en una célula o in vivo, en el que el oligómero es para uso como medicamento.
  3. 3. El oligómero de acuerdo con la reivindicación 1 o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la secuencia de nucleobases contigua comprende una secuencia que es complementaria de una secuencia de microARN de mamífero, humana o vírica.
  4. 4. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que el oligómero tiene una longitud de 7 nucleobases.
  5. 5. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que el oligómero tiene una longitud de 8 nucleobases.
  6. 6. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que el oligómero tiene una longitud de 9 nucleobases.
  7. 7. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que el oligómero tiene una longitud de 10 nucleobases.
  8. 8. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-7, o el oligómero para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en el que todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases de la secuencia de nucleobases contigua son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
  9. 9. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-8, o el oligómero para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en el que la secuencia de nucleobases contigua comprende una secuencia que es un 100 % complementaria de la secuencia semilla de una secuencia de microARN humana.
  10. 10. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-9, o el oligómero para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en el que todas las unidades de LNA tienen la fórmula:
    imagen1
    en la que X se selecciona del grupo que consiste en O, S y NRH, en el que RH es H o alquilo C1-4 e Y es (-CH2)r, en el que r es un número entero de 1-4; y B es una base nitrogenada.
  11. 11. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-9, o el oligómero para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en el que todas las unidades de análogos de nucleósidos bicíclicos son de la fórmula:
    imagen2
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    en la que B es una base nitrogenada.
  12. 12. El oligómero de acuerdo con la reivindicación 10, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el oligómero es de 7 nucleobases contiguas de longitud, y en el que todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases del oligómero son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
  13. 13. El oligómero de acuerdo con la reivindicación 11, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el oligómero es de 7 nucleobases contiguas de longitud, y en el que todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases del oligómero son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
  14. 14. El oligómero de acuerdo con la reivindicación 10, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el oligómero es de 8 nucleobases contiguas de longitud, y en el que todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases del oligómero son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
  15. 15. El oligómero de acuerdo con la reivindicación 11, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el oligómero es de 8 nucleobases contiguas de longitud, y en el que todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases del oligómero son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
  16. 16. El oligómero de acuerdo con la reivindicación 10, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el oligómero es de 9 nucleobases contiguas de longitud, y en el que todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases del oligómero son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
  17. 17. El oligómero de acuerdo con la reivindicación 11, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el oligómero es de 8 nucleobases contiguas de longitud, y en el que todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases del oligómero son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
  18. 18. El oligómero de acuerdo con la reivindicación 10, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el oligómero es de 10 nucleobases contiguas de longitud, y en el que todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases del oligómero son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
  19. 19. El oligómero de acuerdo con la reivindicación 11, o el oligómero para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el oligómero es de 10 nucleobases contiguas de longitud, y en el que todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleobases del oligómero son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
  20. 20. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-19, o el oligómero para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-19, en el que la secuencia de nucleobases contigua del oligómero es un 100 % complementaria de una secuencia de una secuencia de microARN humana y comprende una secuencia que es un 100 % complementaria de la secuencia semilla de dicha secuencia de microARN humana.
  21. 21. Un conjugado que comprende el oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1,3-20 y al menos un resto no nucleotídico unido covalentemente con el mismo.
  22. 22. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, o el conjugado de acuerdo con la reivindicación 21, para uso en medicina.
  23. 23. Una composición farmacéutica que comprende el oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-20, o el conjugado de la reivindicación 21, y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
  24. 24. Un procedimiento in vitro para reducir la cantidad eficaz de un microARN en una célula, que comprende administrar un oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-20, un conjugado de acuerdo con la reivindicación 21, o la composición de acuerdo con la reivindicación 23 a la célula que está expresando dicho microARN para reducir la cantidad eficaz del microARN en la célula.
    imagen3
    semilla
    3 ¿ s $ 7 & s u>
    RISC
    Posición de escisión
    Bü si o de unión 5
    Secuencia semilla
    de 7 umdactes
    + microARN
    Secuencia semii a
    de 8 unidades
    Posición
    (HHHHHHHH)
    Secuencia semilla
    de LNA
    de 9 unidades
    (HHHHKHKHH]
    Secuencia semi la
    de 10 unidades
    ti R 21
    mlR-1 5a
    ti R- '22.
    Figura 1
    ■Jl . U
    □ mni,1
    □ rip-J
    . itji ir.- -■ i -.1 1D nM 25 r -.1 -|M
    : i, - i S11M 0 i -.1 2r. i ■' tu i M
    SEO ID NO: 02HlJt
    SEQ ID NO: 3205
    Figura 2
    imagen4
    imagen5
    ropa tí*- iH'F ron
    PC3
    imagen6
    ■ “ 1 * ™ 1 • “ • ™ ■ "*>,*,*,>**>m*^m*
    (InM 1 nM 5rM ^0 rM 25 nM DO rM OnM 1 hM SnM 10 i M 25 nM 50 rM
    SEQ ID NO: 3204
    SEQ ID NO: 3205
    serta
    i i -3 *■ -E é Ti D lú 11 -2 1S16 15 -e 1T M lú ¡S 21 ¡2
    H-H I I i I I I I I I I I I I I I I I I
    serte
    i ü :i * a n mi mu n la n ia ti ir >1 ih yj 31 m
    H I I M i H H I I I I I I I I I I I
    (HKHHWXH)
    imagen7
    Figura 8
    mtifrtl&ÚA l»¡F- iMrníüíiejrJñ fiyiür ■■* f! uPJPi
    imagen8
    imagen9
    imagen10
    pmparddn ^R'f- reprnt. fnanlc ni r.nntraL D nMj
    imagen11
    proporción ¡FL'F ■ nnrrn frente ni con Ira I Ü nL1j
    imagen12
    ■l h .** ■:sl:íl«-I I': :fJ\
    imagen13
    Figura 18
    \
    imagen14
    snLNA SCO ID NO 3223 SEQ ID NO: 3224 SEQIO NO 3224*3223
    SEQ ID NO; 3223 SEQ ID NO: 3224
    semilla
    1 2 $ 1 5 6 I í J 10 ti 111» H 1S1S171$ I) 2) 21 22
    I M 11 I I I H * > I 11 I M I I 11
    proporción íRi'F - nom treme al centro* 0 nM)
    imagen15
    O nM 1 nM 5 W 10 tA 2í nV
    SFQ ID NO- :l??5
    semilla
    t ¿5 4 $ 6 7 $ 91411 12 t$14 lili 1? 1$ 19 24 21 22
    milllinilMII 1 III II SEQ ID NO: 3225
    0-0" í"'“Crl>}
    ¡rmihi'i .ir ií:f ríJip)
    imagen16
    imagen17
    C rr/ 0.5 nw 1 im 5 nM iDnil
    SEQ ID NO: 3218
    CrW QriiU - r|/ SnU JrnV
    SEO ID NO: 3204
    SEQ D NO: 3205
    semilla
    ShQ IL> NO: '¿2Jó
    SEQ ID NO: 3216
    SEQ ID NO- 32CM
    Figura 21
    l’dftU I ulmliiu
    proBorctótt I_2? 2." 0.62 «.70
    SEQ ID NO: 3205 5 - GATAAGCT - 3
    SEQ ID NO: 3219 5'- CGTAATGA- 3
    5 - GGTAAACT- 3
    SEQ ID NO: 3218
    Figura 22
    A5T
    imagen18
    ALT
    ZOQ-i
    150 -
    imagen19
    Figura 23
    sin LIMA SEQ ID NO: 3207 control de LIMA
    imagen20
    pre-m¡R-155 PU. 1 tubulina
    imagen21
    SEQ ID NO: 3225 5 - ATGTAGC -3' control de LNA 5 - GTAGACT -3
    Figura 25
    ** *
    imagen22
    .Vi.WJjVl
    kl-a
    kl-7b
    lri' ■ L
    IcItTJ
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    lcl-7f
    Ic1-7j
    fel*7Í
    rniPí-ÍK
    imagen23
    ¿ fMj?
    i.? ti-n Tiltil
    VA
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    0
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    1 i
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    l> ] i
    l>
    0 1 i
    Nú añero
    Compuesto Secuencia (5’ a 3 )“ Longitud Diana(s)
    (nt) complementaríais)
    1.
    SEQ ID NO: 3226 A-C-a-A-c-C-T-a-i>T-£*-C-c- T-C 15 let-7a/b/c
  25. 2.
    SEQ ID NO: 3236 G-C-a-A-c-C-T-a-oT-a-C-c- T-C 15 let-7d
  26. 3.
    SEQ ID NO: 3237 A-C-a-A-c-C-T-G-c-T-a-C-c- T-C 15 M-7é
  27. 4.
    SEQ ID NO: 3238 A-G-á - A-S-C-T-eJ-C-T-á.-G-C- T-C 15 let-7g/i
  28. 5.
    SEQ ID NO: 3239 C-T-A-C-C- T-C 7 todos ios miembros
  29. 6.
    SEQ ID NO: 3240 C-T-A-A-C- T-C 7 ninguno
  30. 7.
    SEQ ID NO: 3227 A-C-T-A-C-C* r-c 3 todos excepto let-7e
  31. 8.
    SEQ ID NO: 3232 T-A-C-C- T-C 6 todos ios miembros
  32. 9.
    SEQ ID NO: 3234 T-Ni-C-T-A-C-C- T-C 9 todos Iqs miembros1"
  33. 10.
    SEQ ID NO: 3235 T-N2-C-T-A-C-C- T-C 9 todos los miembros1
    6Las letras mayúsculas y minúsculas denotan LNAy DNA, respectivamente.
    aAmbas secuencias de 9 unidades se dirigen teóricamente a todos los miembros ya que contienen
    2 químicas de hibridación universal diferentes en su 2.a posición.
    Figura 27
    6IZ
    QZ ejnBu
    imagen24
    imagen25
    Proporciones de renilla/luciérnaga normalizadas
    o o ^
    ki P -j iu r*
    O Ui (n th -1 m tn
    0 nM
    1 hM 5 nM
    1C nM 25 nM 50 nM
    D nM 1 nM 5 nM 10 nM 25 nM üfi nM
    D nM 1 nM & nM 1C nM 25 nM 5C nM
    0 nM
    1 nM 5 nM
    1C nM 25 nM SC nM
    jf nM 1 nM 5 nM 10 nM 25 nM 50 n.M
    D nM 1 nM 5nM 10 nM 25 nM 50 nM
    imagen26
    I
    í
    !
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    i
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    I
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    i
    j
    !
    ;
    I
    i
    i
    imagen27
    imagen28
    1.6 XA ■
    imagen29
    control #3205 #3219
    Figura 32.
    45
    40
    imagen30
    control #3205 #3219
    Figura 33.
    imagen31
    no transfretado
    24 h
    #3205 -25 nM
    25 n M
    #3219
    no transfretado
    #3219
    as
    #3205
    0 h
    24 h
    F¡guras 34 Ay B
    ■ge einBy
    (MH-r-HH - -CKXHK1
    I I I 1 I I I I I I I I I II rl
    a i; k si s> a si sv ti o u n oí 6 0 l 9 3 t se i
    L?|| f liras
    imagen32
    imagen33
    imagen34
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