ES2606636T3 - Composición que comprende un antagomir encapsulado - Google Patents

Abstract

Composición que comprende una cantidad efectiva de por lo menos un inhibidor de un miARN involucrado en la angiogénesis, en la que tal inhibidor se microencapsula en microesferas biodegradables y biocompatibles poliméricas, en la que por lo menos 50% de dichas microesferas presentan un diámetro comprendido entre 5 y 15 μm, y en la que el dicho por lo menos un inhibidor consiste en un oligonucleótido antisentido dirigido a o que es complementario a miR-92a.

Description

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DESCRIPCION

Composicion que comprende un antagomir encapsulado Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de las formulaciones farmaceuticas destinadas para la prevencion o el tratamiento de trastornos ca^acos, incluyendo trastornos isquemicos ca^acos.

Antecedentes de la invencion

El infarto agudo de miocardio (AMI), tambien conocido como infarto de miocardio y comunmente conocido como un ataque al corazon, representa un riesgo importante para la salud en los pafses mas industrializados de todo el mundo y sigue siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo.

En general, el AMI es causado por una carencia repentina y prolongada de flujo de sangre al tejido del corazon, que es, generalmente, el resultado de un estrechamiento u oclusion de una arteria coronaria. Sin el suministro adecuado de sangre, el tejido se vuelve isquemico, lo que lleva a la muerte de los cardiomiocitos (celulas del musculo cardfaco) y estructuras vasculares.

Ha habido muchos avances en el tratamiento del AMI en las ultimas decadas, principalmente con relacion a la reperfusion coronaria en conjunto con la terapia farmacologica. La terapia de reperfusion ha logrado cambiar la progresion natural del AMI reduciendo el area infartada y mejorando la morbilidad y la mortalidad a corto plazo y a largo plazo. Sin embargo, existen limitaciones sustanciales en el uso de las dos estrategias de reperfusion disponibles en la actualidad: la fibrinolisis da como resultado un bajo grado de permeabilidad coronaria y la angioplastia primaria no puede aplicarse con frecuencia durante las primeras horas de evolucion del AMI. Ademas, en algunos pacientes cateterizados, se produce el fenomeno de “no reflujo” o ausencia de reperfusion microvascular a pesar del flujo epicardico normal, lo que da como resultado resultados funcionales adversos. Esto significa que la terapia de reperfusion no ha impedido la aparicion de remodelacion perjudicial del miocardio, un complejo proceso de reparacion intrmseca de la formacion de cicatrices de colageno que da como resultado la dilatacion ventricular, disfuncion contractil y la insuficiencia cardfaca subsecuente. Su aparicion, en aproximadamente el 30% de los AMIs, se ha asociado principalmente a un mayor tamano del infarto, obstruccion microvascular y reacciones de reparacion desfavorables aun poco conocidas.

Dado que la fibrosis reparativa y la recuperacion funcional de los tejidos isquemicos es dependiente del establecimiento de redes que suministran sangre oxigenada, se han hecho esfuerzos para mejorar el lecho vascular mediante la induccion de la neoangiogenesis en el area de cicatrizacion para lograr la conversion directa de las areas lesionadas al tejido funcional in situ.

La induccion terapeutica de la angiogenesis podna atenuar la aparicion de este fenomeno. No obstante, los resultados de varios anos de pruebas clmicas con factores proangiogenicos intravenosos han sido insatisfactorios. Sin estar ligado por una teona, se considera que una de las razones que explican este fracaso puede ser que la ruta intravenosa puede no ser capaz de alcanzar y mantener una concentracion efectiva de farmaco en el tejido diana para promover y mantener una red vascular funcional bajo condiciones cardfacas severamente comprometidas.

A fin de abordar este problema y prevenir la insuficiencia cardfaca post-AMI, se inicio la investigacion sobre la posibilidad de regenerar el musculo cardfaco y los vasos en la ultima decada. Los estudios iniciales que administran las celulas progenitoras pluripotentes y que infunden factores de crecimiento vasculares mostraron resultados prometedores, pero la traduccion para el entorno clmico mostro incapacidad de estas terapias para regenerar la neovasculatura de una manera adecuada para permitir que se recupere el musculo cardfaco destruido.

Bonauer et al. (“MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice”; Science; vol.324, n° 5935, paginas 1710-1713; 2009) ensenan la implicacion de miR-92a en angiogenesis y el uso del inhibidor de mir-92a en modelos de raton de isquemia e infarto de miocardio.

D'Angelo et al. (“Improved delivery of angiogenesis inhibitors from PLGA:poloxamer blend micro- and nanoparticles”; Journal of Microencapsulation; vol.27, n° 1, paginas 57-66; 2010) ensenan el suministro de inhibidores de la angiogenesis en micropartfculas.

Hoy en dfa, la angiogenesis y la repoblacion del corazon danado con la terapia celular, asf como los farmacos espedficos y la terapia de resincronizacion pueden disminuir la progresion de este fenomeno, pero la prevencion de su ocurrencia sigue siendo un reto dudoso para la medicina cardfaca. Por lo tanto, se requieren nuevas estrategias de tratamiento que impidan el remodelado ventricular izquierdo adverso.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere al tratamiento de los trastornos cardfacos, de preferencia isquemicos, mediante la administracion de una composicion que revierte o previene la remodelacion ventricular mediante la modulacion de la actividad o expresion de miR-92a. Mas particularmente, la invencion proporciona una composicion que comprende

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un inhibidor de un miR-92a involucrado en la angiogenesis, en donde el inhibidor se incorpora preferentemente en un nuevo vehnculo de suministro capaz de liberar el inhibidor localmente al tejido diana isquemico. Ademas, la invencion proporciona composiciones y kits utiles para un metodo para revertir o prevenir la remodelacion ventricular.

Esta invencion se refiere a una composicion que comprende una cantidad efectiva de por lo menos un inhibidor de un miARN involucrado en la angiogenesis, en el que el inhibidor se microencapsula en microesferas polimericas biodegradables y biocompatibles, en el que por lo menos 50% de dichas microesferas presentan un diametro comprendido entre 5 y 15 |im, y en el que el dicho por lo menos un inhibidor consiste en un oligonucleotido antisentido dirigido a o que es complementario a miR-92a.

En algunas realizaciones de la composicion descrita anteriormente, el dicho inhibidor de un miARN es un oligonucleotido de 8-49 nucleotidos de longitud que tiene una secuencia dirigida a tal miARN. En algunas realizaciones, el oligonucleotido es un oligonucleotido antisentido que es por lo menos parcialmente complementario a la secuencia de miARN diana. El oligonucleotido antisentido puede seleccionarse del grupo que consiste en un ribonucleotido, un desoxirribonucleotido, un antagomir, un LNA, un PNA, un oligonucleotido de morfolino o una combinacion de los mismos.

En algunas realizaciones de la composicion descrita anteriormente, el dicho inhibidor de un miARN consiste en un antagomir, comprendiendo dicho antagomir preferiblemente una secuencia nucleotidica que comprende por lo menos 16 nucleotidos contiguos complementarios a los nucleotidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No. 1, 2, 21, 22 y 23.

En algunas realizaciones de la composicion descrita anteriormente, el dicho inhibidor de un miARN consiste en un antagomir que comprende la secuencia de SEC ID No. 59 o 60 y modificaciones sin incluir las sustituciones base de la misma, y fragmentos que consisten en subsecuencias de la SEC ID NO: 59 o 60 de por lo menos 8 nucleotidos contiguos de los mismos.

En algunas realizaciones de la composicion descrita anteriormente, las dichas microesferas se presentan en un diametro que no excede 25 |im, que abarca microesferas que tienen un diametro comprendido entre 5 y 15 |im.

En algunas realizaciones de la composicion descrita anteriormente, las dichas microesferas se elaboran de un polfmero que consiste en poli-d,l-lactida (PLA), siendo el polfmero mezclado opcionalmente con uno o mas de otros polfmeros.

Esta invencion tambien se refiere a cualquier composicion como se define anteriormente para revertir o prevenir la remodelacion ventricular en un paciente en necesidad del mismo.

De este modo, la invencion tambien se refiere a cualquier composicion como se define anteriormente para revertir o prevenir la remodelacion ventricular en un paciente en necesidad del mismo, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de una composicion.

Esta invencion tambien se refiere a una poblacion de microesferas biodegradables y biocompatibles para el uso en el tratamiento o la prevencion de infarto de miocardio, en el que las microesferas:

- tienen un diametro medio comprendido entre 5 y 15 |im;

- se elaboran de poli-d,l-lactida-co-glicolida (PLGA); poli-d,l-lactida (PLA) o una mezcla de las mismas;

- se incorporan de 1% a 15% p/p de un agente terapeutico capaz de prevenir la remodelacion ventricular,

en el que el agente terapeutico consiste en un inhibidor de una miARN seleccionado del grupo que consiste en miR- 92a.

Descripcion de las figuras

La Figura 1 ilustra la morfologfa de microesferas de antagomir-92a - PLGA determinada por microscopfa electronica de barrido;

La Figura 2 ilustra la distribucion de tamanos de microesferas de antagomir-92a - PLGA determinada por dispersion de luz laser;

La Figura 3 ilustra los efectos en hemodinamica y contractilidad ventricular izquierda por inyecciones repetidas de microesferas hasta 120 mg;

La Figura 4 ilustra los efectos en hemodinamica y contractilidad ventricular izquierda por inyecciones repetidas de microesferas hasta 240 mg;

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La Figura 5 ilustra el protocolo del estudio del efecto molecular de una sola inyeccion intracoronaria de microesferas de acuerdo con la invencion;

La Figura 6 ilustra la especificidad de inhibicion de miR-92a por las microesferas de acuerdo con la invencion;

La Figura 7 ilustra que el antagomir-92a encapsulado induce la angiogenesis en el tejido infartado. La densidad vascular en la zona infartada, calculada dividiendo el numero total de vasos por el area infartada total. N = 20. * P < 0,01;

Figura 8: fndice de resistencia microvascular basal y mmimo medido un mes despues de AMI, en la arteria relacionada con el infarto de cerdos enanos tratados con antagomir-92a encapsulado, placebo o disolucion salina. (a) El mdice de resistencia microvascular basal (MRI) se calculo multiplicando la presion (mmHg) evaluada con un alambre de presion colocado en la LAD apical (Pd) y flujo coronario (ml/min.) cuantificado por un detector colocado en el segmento distal de LAD. El mdice de resistencia microvascular mmimo (MRIhyp) se calculo con los mismos parametros medidos en hiperemia maxima alcanzada con la infusion intravenosa de 140 micro/kg/min. de adenosina administrada a traves de la vaina de la vena femoral 12F. n = 12 * p <0,01 **p = 0,05 (b) Correlacion entre el numero total de vasos en el area necrotica y la MRI. R2 0,41, p = 0,02, n = 12. (C) Correlacion entre el numero total de vasos en la zona necrotica y la mRi mmimo. R2 0,27, p = 0,08, n = 12;

Figura 9: Un mes despues de AMI, se evaluo la presencia de discinesia septoapical por un ecocardiografo que desconoda el tratamiento asignado. Se muestra el porcentaje de animales con discinesia septoapical en animales tratados y no tratados (83,3% frente a 16,7%, p = 0,03). n = 20.

Descripcion detallada de la invencion

Se dan a continuacion algunas definiciones que son relevantes en cuanto a la descripcion de las realizaciones completas que estan comprendidas por la presente invencion.

Los microARN (miRs) son ARNs pequenos no codificantes que estan surgiendo como reguladores cruciales de los procesos biologicos.

“MicroARN”, “miARN” o “miR” significa un ARN no codificante de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleotidos de longitud. Estos miRs podnan provenir de multiples ongenes, que incluyen: un gen individual que codifica un miARN, de intrones del gen que codifica la protema, o de transcrito policistronico que a menudo

codifican multiples microARNs, estrechamente relacionados.

El conocimiento actual demuestra que miARNs se transcriben por ARN polimerasa II (pol II) o ARN polimerasa III (pol III) y surgen de transcritos iniciales, denominados transcritos de miARN primarios (pri-miARNs), que son generalmente varios miles de bases de longitud. Pri-miARNs se procesan en el nucleo por la RNasa Drosha en precursores en forma de horquilla de aproximadamente 70 a 100 nucleotidos (pre-miARNs). Tras el transporte al citoplasma, el pre-miARN de horquilla se procesa adicionalmente por Dicer para producir un microARN de doble hebra; una de las hebras, llamada microARN maduro, (a veces pueden usarse ambas hebras) se incorpora despues en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), en donde se asocia con sus ARNms diana por complementariedad de pares de bases. En los casos relativamente raros en los que una base de miARN se empareja perfectamente con una diana de ARN mensajero (ARNm), promueve la degradacion de ARNm. Mas comunmente, los microARNs forman heteroduplex imperfectos con ARNms diana, que afectan la estabilidad del ARNm o que inhiben la traduccion del ARNm.

“Secuencia de tallo-bucle” significa un ARN que tiene una estructura de horquilla y que contiene una secuencia de microARN maduro. Las secuencias de pre-miARN y las secuencias de tallo-bucle pueden solapar. Ejemplos de las secuencias de tallo-bucle se encuentran en la base de datos de microARN conocidas como miRBase.

“Precursor de microARN” significa un transcrito que se origina a partir de un ADN genomico y que comprende un ARN estructurado no codificante que comprende una o mas secuencias de microARN. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un precursor de microARN es un pre-miARN. Un precursor de microARN es un pri-miARN.

La siguiente memoria descriptiva seguira el sistema de nomenclatura estandar con el “mir-X” en minusculas que se refiere al pre-miARN, mientras que un “miR-X” con mayusculas se refiere a la forma madura. Cuando dos microARNs maduros se originan en los brazos opuestos del mismo pre-miARN, se denotan con el sufijo -3p o -5p. Cuando se conocen los niveles relativos de expresion, un asterisco despues del nombre indica un microARN expresado en niveles bajos con relacion al microARN en el brazo opuesto de una horquilla.

En la siguiente memoria descriptiva, a menos que se especifique lo contrario, el uso de la expresion de miR-X se refiere al miARN maduro, incluyendo ambas formas -3p y -5p, si existieran.

Para evitar dudas, en la presente memoria descriptiva, las expresiones microARN, miARN y miR designan el mismo producto.

En el contexto de la presente invencion, es un objetivo modular la angiogenesis o procesos angiogenicos con, como consecuencia, un enfoque particular en miR-92a implicados en la angiogenesis. Es por lo tanto un objetivo de la invencion modular por lo menos un miR-92a que pertenece a una familia de microARNs implicados en la modulacion de la angiogenesis.

5 Por la expresion “familia de microARN”, se pretende un grupo de microARN con una funcion relacionada que consiste en la modulacion de la angiogenesis o procesos angiogenicos. Mas particularmente, sin limitacion, tales microARNs se seleccionan del grupo que consiste en microARNs que presentan una actividad antiangiogenica.

Para evitar dudas, la expresion de microARN en la siguiente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario, se referira al ARN maduro o procesado despues de que se ha escindido de su precursor. Para las formas 10 no maduras, se usara la expresion “precursores” o “precursores de microARN”.

La siguiente tabla 1 reagrupa las diferentes secuencias de los precursores de microARN.

Tabla 1

SEC ID n°:

Nombre Secuencia

1

mir-92a-1 CUUOCUACAGAGGUUGGGAUCGGUUGCAAUGCUGUGUUUCUGUAUGGDADUG CACUUGUCCCGGCCGGUUGAGUUUGG

2

mir-92a-2 OCAUCCCUGGGUGGGGAUUUGUOGCAUUACUUGUGUUCUAUAUAAAGUAUUG CACUOGUCCCGGCCDGUGGAAGA

3

mir-92b CGGGCCCCGGGCGGGCGGGAGGGACGGGACGCGGUGCAGUGUUGUDUUUUCC CCCGCCAAUAUUGCACUCGUCCCGGCCDCCGGCCCCCCCGGCCC

4

mir-17 GUCAGAAUAAUGUCAAAGUGCUUACAGGGCAGGUAGUGAOAUGUGCAUCnAC UGCAGUGAAGGCACUUGUAGCAUUAUGGUGAC

5

mir-503 ugcccuagcagcgggaacaguucugcagugagcgaucggugcucugggguau UGUUUCCGCUGCCAGGGUA

6

mir-16-1 GUCAGCAGUGCCUUAGCAGCACGUAAAUAUUGGCGUUAAGADUCtJAAAAUUA UCUCCAGUAUUAACUGtTGCUGOJGAAGUAAGGUUGAC

7

mir-16-2 guuccacucuagcagcacguaaauauuggcguagcjgaaaijauadauuaaaca CCAAUAUUACUGUGCUGCUUUAGUGUGAC

8

mir-374a UACAUCGGCCAUUAUAAUACAACCUGAUAAGUGUUAUAGCACUUAUCAGAUU GUAOUGUAAUUGUCUGUGUA

9

mir-374b ACUCGGAUGGAUAUAAUACAACCUGCUAAGUGUCCUAGCACUUAGCAGGOUG UAUUAUCAUUGUCCGUGUCU

10

mir-374c acacggacaaugauaauacaaccugcuaagugcuaggacacuuagcagguug UAUUAUAUCCAUCCGAGU

11

mir-24-1 COCOGGUGCCUACUGAGCUGAUAUCAGUUCUCAOUUUACACACUGGCUCAGU UCAGCAGGAACAGGAG

12

mir-24-2 CUCUGCCUCCCGUGCCUACUGAGCUGAAACACAGUUGGUUUGUGUACACUGG CUCAGOUCAGCAGGAACAGGG

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mir-483 GAGGGGGAAGACGGGAGGAAAGAAGGGAGUGGUUCCAUCACGCCUCCDCACU CCUCUCCUCCCGUCUUCDCCUCUC

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mir-34a GGCCAGCUGUGAGUGUUDCUUUGGCAGUGUCUUAGCUGGUDGUtJCUGAGCAA UAGUAAGGAAGCAAUCAGCAAGUAUACUGCCCUAGAAGUGCtJGCACGUUGUG GGGCCC

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mir-34b gugcucggutoguaggcagugucauuagcugauuguacuguggugguuacaa DCACUAACUCCACUGCCAUCAAAACAAGGCAC

16

mir-34c AGUCUAGUUACUAGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGCDAAOAGUACCAAUCACU AACCACACGGCCAGGUAAAAAGAIPU

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mir-20a GUAGCACUAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAGUGUUUAGUUAUCUACGGCAUUA UGAGCACDUAAAGUACUGC

18

mir-20b AGUACCAAAGUGCUCAGAGUGCAGGUAGUUUUGGCAUGACUCUACUGUAGUA UGG3CACUUCCAGUACU

19

mir-15a CCUUGGAGUAAAGUAGCAGCACAUAAUGGUUUGUGGAUUUUGAAAAGGUGCA GGCCAUAUUGUGCUGCCUCAAAAAUACAAGG

20

mir-15b uogaggccuuaaaguacuguagcagcacaucaogguuuacadgcuacaggca agaugcgaaucauuauuugcugcucuagaaauuuaaggaaacucau

La siguiente tabla 2 indica, para cada microARN, las secuencias del microARN y los residuos correspondientes en las secuencias precursoras correspondientes (vease la tabla 1).

Tabla 2

SEC ID n°:

Nombre Secuencia Restos del precursor

21

miR-92a-3p uauugcacuugucccggccugu 48-69

22

miR-92a-1-5p agguugggaucgguugcaaugcu 11-33

23

miR-92a-2-5p ggguggggauuuguugcauuac 9-30

24

miR-92b-3p uauugcacucguaccggccucc 61-82

25

miR-92b-5p agggacgggacgcggugcagug 20-41

26

miR-17-3p acugcagugaaggcacuuguag 51-72

27

miR-17-5p caaagugcuuacagugcagguag 14-36

28

miR-503-3p gggguauuguuuccgcugccagg 46-68

29

miR-503-5p uagcagcgggaacaguucugcag 6-28

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miR-16-1-3p ccaguauuaacugugcugcuga 56-77

31

miR-16-2-3p ccaauauuacugugcugcuuua 53-74

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miR-16-5p uagcagcacguaaauauuggcg 14-35 (para miR-16-1) o 10-31 (para miR-16-2)

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miR-374a-3p cuuaucagauuguauuguaauu 42-63

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miR-374a-5p uuauaauacaaccugauaagug 12-33

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miR-374b-3p cuuagcagguuguauuaucauu 41-62

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miR-374-5p auauaauacaaccugcuaagug 11-32

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miR-374c-3p cacuuagcagguuguauuauau 39-60

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miR-374c-5p auaauacaaccugcuaagugcu 13-34

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miR-24-1-3p uggcucaguucagcaggaacag 44-65

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miR-24-1-5p ugccuacugagcugauaucagu 7-28

41

miR-24-2-3p uggcucaguucagcaggaacag 50-71

42

miR-24-2-5p ugccuacugagcugaaacacag 13-34

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miR-483-3p ucacuccucuccucccgucuu 48-68

44

miR-483-5p aagacgggaggaaagaagggag 8-29

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miR-34a-3p caaucagcaaguauacugcccu 64-85

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miR-34a-5p uggcagugucuuagcugguugu 22-43

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miR-34b-3p caaucacuaacuccacugccau 50-71

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miR-34b-5p uaggcagugucauuagcugauug 13-35

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miR-34c-3p aaucacuaaccacacggccagg 46-67

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miR-34c-5p aggcaguguaguuagcugauugc 13-35

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miR-20a-3p acugcauuaugagcacuuaaag 44-65

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miR-20a-5p uaaagugcuuauagugcagguag 8-30

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miR-20b-3p acuguaguaugggcacuuccag 44-65

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miR-20b-5p caaagugcucauagugcagguag 6-28

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miR-15a-3p caggccauauugugcugccuca 51-72

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miR-15a-5p uagcagcacauaaugguuugug 14-35

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miR-15b-3p cgaaucauuauuugcugcucua 58-79

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miR-15b-5p uagcagcacaucaugguuuaca 20-41

A menos que se indique lo contrario, las secuencias del precursor y de microARN a que se hace referencia en la solicitud son secuencias humanas. Sin embargo, en algunos casos, las secuencias de microARN humanas son homologas a las secuencias de microARN de otras especies.

Como ejemplo, se puede mencionar en la presente que el miR-92a humano es homologo a miRs de otras especies. Mas particularmente, miR-92a humano es homologo a miRs de dme (Drosophila melanogaster), mmu (Mus musculus), rno (Rattus norvegicus), dps (Drosophila pseudoobscura), aga (Anopheles gambiae), dre (Danio rerio), mml (Macaca mulata), xrt (Xenopus tropicalis), ame (Apis mellifera), odi (Oikopleura dioica), cin (Ciona intestinalis), esa (Ciona savignyi), cfa (Canis familiaris) y cerdo o ssc (Sus scrofa).

Con base en su conocimiento general, la persona experimentada en la tecnica encontrara facilmente la homologfa entre otras secuencias de microARN humanas y las secuencias de microARN de otras especies.

Las secuencias nucleotfdicas de microARNs maduros y sus secuencias de tallo-bucle correspondientes descritas en la presente son las secuencias encontradas en miRBase, una base de datos en lmea de secuencias de microARN y anotacion. Las entradas en la base de datos miRBase Sequence representan una porcion de horquilla predicha de un transcrito de microARN (el tallo-bucle), con informacion sobre la ubicacion y la secuencia de la secuencia de microARN maduro. Las secuencias de tallo-bucle de microARN en la base de datos no son estrictamente miARNs precursores (pre-miARNs), y pueden, en algunos casos, incluir el pre-miARN y alguna secuencia de flanqueo del transcrito primario presunto.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invencion proporcionar composiciones para el tratamiento o la prevencion de la remodelacion ventricular despues de AMI, que comprende un inhibidor de miR-92a, o una combinacion de inhibidores de varios miR-92a, involucrados en diferentes reacciones que regulan la fisiologfa de la angiogenesis, o precursores de los mismos.

Sin embargo, en la mayona de los estudios publicados, la via intravenosa se usa para la administracion de inhibidores de microARN en animales. La manipulacion de microARN implicado en la regulacion de la expresion de genes vasculares representa una nueva diana terapeutica en la enfermedad isquemica. Dentro del sector biomedico, ha habido un aumento exponencial en la investigacion sobre la administracion de moduladores de ARN especialmente disenados para inhibir una secuencia de ARN particular.

Dimmeler et al. han mostrado una mejora en la contractilidad y la recuperacion de la funcion del ventnculo izquierdo despues de la inhibicion de miR-92a por el inhibidor de microARN espedfico administrado sistemicamente. Dado que el racimo 17-92a microARN policistronico se ha relacionado con la tumorigenesis y debido a la ubicuidad de tipo celular de microARNs, la administracion intravenosa en las inyecciones repetitivas de miR o anti-miRs plantea problemas sobre la seguridad.

Debido al hecho de que los microARNs controlan los procesos complejos y estan presentes en diversas rutas celulares, es altamente probable que tambien provoquen efectos secundarios significativos. Un problema, entre otros, en la actualidad es que los tratamientos con inhibidores de miARN no son selectivos.

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Ademas, dada la ubicuidad y la baja especificidad por el organo de estas moleculas, la administracion sistemica podna conducir a ejercer funciones de regulacion en los tejidos en los que estos miARNs tienen diferentes funciones espedficas celulares o en los que no se expresan normalmente. Esta regulacion erronea podna llevar probablemente a desencadenar efectos secundarios. Entre los riesgos potenciales, la tumorigenesis asociada con la manipulacion de microARN sigue siendo una de las principales preocupaciones cuando se aplica esta terapia a la patologfa humana. Por otra parte, para obtener una concentracion prolongada adecuada en las celulas diana, los inhibidores de microARN deben inyectarse repetidamente a dosis muy altas. Aunque la experimentacion en animales pequenos en condiciones controladas conlleva limitaciones menores, la transposicion a los seres humanos presupone obstaculos para la bioseguridad, asf como impedimentos logfsticos y economicos.

Para resolver estos problemas y permitir que este nuevo enfoque terapeutico sea transferido a los pacientes, se considera generar un veldculo de liberacion para el transporte de inhibidores de microARN y la liberacion de estos directamente en el organo diana. Un veldculo apropiado dirigiria el inhibidor de microARN directamente al tejido enfermo permitiendo de este modo una reduccion de la dosis, con el fin de evitar la administracion de inyecciones repetidas y minimizar los efectos biologicos potencialmente no deseados en otros organos.

Por lo tanto, el objetivo es mejorar la selectividad con el fin de evitar los efectos secundarios de estos tratamientos por medio de la liberacion de los inhibidores de microARN solo en el tejido diana. Este problema se resuelve, de acuerdo con la invencion, microencapsulando los inhibidores de microARN en microesferas biodegradables y biocompatibles.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invencion proporcionar composiciones para el tratamiento o la prevencion de la remodelacion ventricular despues de AMI, que comprende por lo menos un inhibidor microencapsulado de miR-92a que pertenece a la familia de microARN relacionada con la modulacion de la angiogenesis.

Microencapsulando los inhibidores de microARN en microesferas, se facilita la administracion intra-arterial despues de la angioplastia transluminal, de modo que las microesferas se liberan y retienen solamente en los microvasos, tambien llamados capilares, de la zona danada; de esta manera los inhibidores de microARN encapsulados pueden liberarse localmente.

La inyeccion intracoronaria a traves de la arteria causante del AMI permite la retencion de las microesferas en la microcirculacion coronaria y la liberacion sostenida de los inhibidores de microARN directamente en el tejido isquemico diana. Los inhibidores de microARN inducen la neoangiogenesis que mejora la recuperacion funcional de la contractilidad del tejido danado, asf como la remodelacion post-infarto favorable.

Inesperadamente, se muestra en la presente que, cuando se microencapsula en las microesferas apropiadas, un inhibidor de microARN y especialmente un inhibidor de un miR-92a que pertenece a la familia de microARN relacionada con la modulacion de la angiogenesis, el microARN se libera con exito a la zona danada del miocardio para bloquear la actividad biologica del microARN diana. Como se muestra en los ejemplos en la presente, la administracion, por via intracoronaria selectiva, de un inhibidor de miR-92a, que esta microencapsulado en microesferas biodegradables y biocompatibles polimericas a las personas que han sufrido de un infarto de miocardio conduce a una recuperacion funcional del miocardio.

Por lo tanto, las microesferas retenidas en la microcirculacion permiten la liberacion prolongada del inhibidor de microARN directamente en el tejido isquemico diana. El efecto prolongado de los inhibidores de microARN (tambien conocidos como reduccion) de microARN seleccionado diana dio como resultado un crecimiento significativo de los vasos y la supresion de remodelado adverso en el area de curacion un mes despues de la lesion.

Como se muestra en los ejemplos en la presente, se ha demostrado que la ocurrencia de la remodelacion ventricular adversa puede ser prevenida mediante la induccion de la vasculogenesis a traves de la inhibicion local y prolongada de un miR-92a perteneciente a la familia de microARN relacionada con la modulacion de la angiogenesis por el inhibidor de microARN apropiado encapsulado administrado en la arteria relacionada infartada. Esto representa un nuevo metodo de suministro que facilitara la siguiente traslacion segura de la terapia de modulacion genica a pacientes que sufren de un infarto agudo del miocardio.

Estos resultados muestran claramente que una composicion que comprende un inhibidor de miR-92a que consiste en un oligonucleotido antisentido dirigido a o que es complementario a miR-92a como se describe en la presente, permite una liberacion local eficaz del inhibidor en cantidades terapeuticamente efectivas y a una velocidad de liberacion terapeuticamente efectiva.

En un primer aspecto, la invencion se refiere a una composicion que comprende una cantidad efectiva de por lo menos un inhibidor de un microARN involucrado en la angiogenesis, en el que dicho inhibidor se microencapsula en microesferas polimericas biodegradables y biocompatibles, en el que por lo menos 50% de dichas microesferas presentan un diametro comprendido entre 5 y 15 |im, y en el que el dicho por lo menos un inhibidor consiste en un oligonucleotido antisentido dirigido a o que es complementario a miR-92a.

Por la expresion “microesferas”, debe entenderse partfculas esfericas de tamano de 1 |im a pocos cientos de |im, que incluye un diametro comprendido entre 5 y 15 |im. La expresion “micropartfculas” incluye tanto “microesferas”

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como “microcapsulas”. En la presente memoria descriptiva, se usa la expresion “microesferas”, pero debe entenderse que, cuando la sustitucion con una “microcapsula” es posible y de interes de segun la persona experta en la tecnica, el uso de “microesferas” y “microcapsulas” es equivalente.

Por la expresion “encapsulado” o “microencapsulado”, debe entenderse que incluye o se incrusta en partfculas de proteccion o de liberacion modificada.

En otras palabras, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una cantidad efectiva de por lo menos un inhibidor de un microARN involucrado en la angiogenesis, en el que dicho inhibidor se microencapsula en microesferas polimericas biodegradables y biocompatibles, en el que por lo menos 50% de dichas microesferas presentan un diametro comprendido entre 5 y 15 |im, y en el que el dicho por lo menos un inhibidor consiste en un oligonucleotido antisentido dirigido a o que es complementario a miR-92a.

“Composicion farmaceutica” significa una mezcla de sustancias adecuadas para su administracion a un individuo que incluye un agente farmaceutico. Por ejemplo, una composicion farmaceutica puede comprender un inhibidor de miARN y una disolucion acuosa esteril.

En una realizacion de la composicion de la invencion, el dicho microARN consiste en el miR-92a maduro que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No. 21, 22 o 23, o una secuencia que tiene por lo menos 90% de identidad de nucleotidos con una de SEC ID No. 21, 22 o 23.

En otra realizacion de la composicion de la invencion, el dicho miR-92a consiste en el miR-92a maduro que comprende la secuencia SEC ID No. 21 o una secuencia que tiene por lo menos 90%, preferiblemente 95% de identidad de nucleotidos con SEC ID No. 21.

En otra realizacion de la composicion de la invencion, el dicho miR-92a consiste en el miR-92a maduro que comprende la secuencia SEC ID No. 22 o una secuencia que tiene por lo menos 90%, preferiblemente 95% de identidad de nucleotidos con SEC ID No. 22.

En otra realizacion de la composicion de la invencion, el dicho miR-92a consiste en el miR-92a maduro que comprende la secuencia SEC ID No. 23 o una secuencia que tiene por lo menos 90%, preferiblemente 95% de identidad de nucleotidos con SEC ID No. 23.

En el sentido de la presente invencion, el “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de acidos nucleicos significa el porcentaje de residuos de nucleotidos identicos entre las dos secuencias a ser comparadas, obtenido despues de la alineacion optima, siendo este porcentaje puramente estadfstico y distribuyendose las diferencias entre las dos secuencias aleatoriamente a lo largo de su longitud. La comparacion de dos secuencias de acidos nucleicos se lleva a cabo tradicionalmente mediante la comparacion de las secuencias despues de haberlas alineado de manera optima, siendo tal comparacion capaz de ser llevada a cabo por segmento o usando una “ventana de alineamiento”. El alineamiento optimo de las secuencias para la comparacion puede llevarse a cabo, ademas de la comparacion manual, por medio del algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman (1981), por medio del algoritmo de homologfa local de Neddleman y Wunsch (1970, por medio del metodo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) o por medio de programas de computadora que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TfASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o por el programa de comparacion BLAST NR o BLAST P).

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de acidos nucleicos se determina comparando las dos secuencias alineadas de manera optima, en la que la secuencia de acido nucleico a comparar puede tener adiciones o eliminaciones en comparacion con la secuencia de referencia para un alineamiento optimo entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el numero de posiciones en las que el residuo de nucleotidos es identico entre las dos secuencias, de preferencia entre las dos secuencias completas, dividiendo el numero de posiciones identicas por el numero total de posiciones en la ventana de alineamiento y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre las dos secuencias.

Tal como se pretende en la presente, las secuencias nucleotidicas que tienen por lo menos 90% de identidad de nucleotidos con una secuencia de referencia abarcan las que tienen por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de nucleotidos con tal secuencia de referencia.

En terminos generales, un inhibidor es una molecula que reprime o impide que otra molecula se acople en una reaccion.

Tal como se usa en la presente, el termino “inhibidor de mir-X, o mir-X” se refiere a cualquier molecula o compuesto que disminuye o reduce la expresion y/o la actividad de miR-X o mir-X. Esta inhibicion debena, como consecuencia, evitar la inhibicion de la neo-angiogenesis, es decir, promover la neoangiogenesis a fin de evitar el remodelado adverso del musculo cardfaco despues del infarto.

En una realizacion de la invencion, el dicho inhibidor de miR-92a es un oligonucleotido de 8-49 nucleotidos de longitud que tiene una secuencia dirigida a tal miR-92a.

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La expresion “dirigido a” significa que tiene una secuencia nucleotidica que va a permitir la hibridacion a un acido nucleico diana para inducir un efecto deseado. En algunas realizaciones, un efecto deseado es la reduccion y/o inhibicion de un acido nucleico diana.

“Hibridar” significa la hibridacion de acidos nucleicos complementarios que se produce a traves de “complementariedad de nucleotidos”, es decir, la capacidad de dos nucleotidos para emparejarse de forma no covalente via enlazamiento de hidrogeno.

En algunas realizaciones, los oligonucleotidos del inhibidor de miARN tienen 8-49 nucleotidos de longitud.

Un experto en la tecnica apreciara que esto es un ejemplo de oligonucleotidos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo dentro. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos de acuerdo con la invencion, son de 10 a 20 nucleotidos de longitud. Un experto en la tecnica apreciara que esto es un ejemplo de oligonucleotidos de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo dentro.

En algunas realizaciones, el oligonucleotido tiene una secuencia que es complementaria a un miR-92a.

En una realizacion de la composicion de la invencion, el dicho oligonucleotido es un oligonucleotido antisentido que es al menos parcialmente complementario a la secuencia de miR-92a.

La expresion “oligonucleotido antisentido” se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia nucleotfdica complementaria a una secuencia nucleotfdica espedfica (referida como una secuencia sentido) y capaz de hibridarse con la secuencia sentido.

“Complementariedad” significa la capacidad de apareamiento de nucleotidos entre un primer acido nucleico y un segundo acido nucleico.

En algunas realizaciones, un oligonucleotido antisentido tiene una secuencia nucleotfdica que es complementaria a un miR-92a, lo que significa que la secuencia del oligonucleotido antisentido es por lo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99%

identica al complemento de un miR-92a, o que las dos secuencias se hibridan en condiciones de hibridacion

rigurosas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la secuencia nucleotfdica del oligonucleotido antisentido

puede tener uno o mas pares de bases no coincidentes con respecto a miR-92a, y es capaz de hibridarse a su secuencia diana. En algunas realizaciones, el oligonucleotido antisentido tiene una secuencia que es totalmente complementaria a miR-92a, lo que significa que la secuencia nucleotfdica del oligonucleotido antisentido es 100% identica del complemento de miR-92a.

En el contexto de la presente invencion, “complementario” se entiende un oligonucleotido antisentido que tiene una secuencia nucleotfdica que es por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100%, identica al complemento de la secuencia nucleotfdica de miR-92a, sobre una region de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,

42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleotidos, o que las dos secuencias se hibridan en condiciones de hibridacion

rigurosas.

“Porcentaje de complementariedad” significa el numero de nucleotidos complementarios en un acido nucleico dividido por la longitud del acido nucleico. En algunas realizaciones, el porcentaje de complementariedad de un oligonucleotido significa el numero de nucleotidos que son complementarios al acido nucleico diana, dividido por la longitud del oligonucleotido.

En una realizacion, la secuencia del oligonucleotido antisentido es “totalmente complementaria” a la secuencia del miR-92a diana, lo que significa que cada nucleotido del oligonucleotido antisentido es capaz de aparearse con un nucleotido en cada posicion correspondiente en el microARN diana.

En alguna realizacion, el oligonucleotido antisentido de acuerdo con la invencion, tiene una secuencia que es parcial o totalmente complementaria a la secuencia de miR-92a que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No. 21, 22 o 23 o una secuencia que tiene identidad de nucleotidos de por lo menos 90% con una de las SEC ID No. 21, 22 o 23.

En una realizacion, el oligonucleotido antisentido comprende una cadena principal modificada. Ejemplos de tales cadenas principales se proporcionan por cadenas principales de morfolino, cadenas principales de carbamato, cadenas principales de siloxano, cadenas principales de sulfuro, sulfoxido y sulfona, cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo, cadenas principales de metilenformacetilo, cadenas principales de riboacetilo, cadenas principales que contienen alqueno, cadenas principales de sulfamato, sulfonato y sulfonamida, cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino, y cadenas principales de amida.

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Los oligonucleotidos de morfolino tienen una cadena principal no cargada, en la que el azucar desoxirribosa del ADN se sustituye por un anillo de seis miembros y el enlace fosfodiester se reemplaza por un enlace fosforodiamidato. Los oligonucleotidos de morfolino son resistentes a la degradacion enzimatica y parecen funcionar como agentes antisentido mediante la detencion de traduccion o interfieren con el ayuste de pre-ARNm en lugar de la activacion de la ARNasa H.

Una cadena principal modificada se destina tipicamente para aumentar la resistencia a nucleasa. Una cadena principal modificada tambien puede ser preferida debido a su afinidad alterada para la secuencia diana en comparacion con una cadena principal no modificada. Una cadena principal no modificada puede ser ARN o ADN.

Otro oligonucleotido antisentido adecuado comprende un acido nucleico peptfdico (PNA), que tiene una cadena principal de poliamida modificada. Las moleculas a base de PNA son verdaderos imitadores de las moleculas de ADN en terminos de reconocimiento de pares de bases. La cadena principal del PNA se compone de unidades de 7V-(2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces peptfdicos, en donde las nucleobases se enlazan a la cadena principal por enlaces metilencarbonilo.

Una cadena principal adecuada adicional comprende un analogo nucleotidico de morfolino o equivalente, en el que el azucar de ribosa o desoxirribosa se sustituye por un anillo de morfolino de 6 miembros. Un analogo nucleotidico mas preferido o equivalente comprende un oligomero de fosforodiamidato morfolino (PMO), en el que el azucar de ribosa o desoxirribosa se reemplaza por un anillo de morfolino de 6 miembros, y el enlace fosfodiester anionico entre los anillos adyacentes de morfolino se reemplaza por un enlace de fosforodiamidato no ionico.

En aun una realizacion adicional, un oligonucleotido antisentido de la invencion comprende una sustitucion de uno de los oxfgenos sin puente en el enlace fosfodiester. Esta modificacion desestabiliza ligeramente el apareamiento de bases, pero anade una resistencia significativa a la degradacion por nucleasas.

Un oligonucleotido antisentido adecuado adicional de la invencion comprende uno o mas restos de azucar que estan mono- o disustituidos en la posicion 2', 3' y/o 5', tal como un -OH; -F; alquilo inferior (C1-C10) sustituido o no sustituido, lineal o ramificado, alquenilo, alquinilo, alcarilo, alilo, arilo o aralquilo, que puede estar interrumpido con uno o mas heteroatomos; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; O-, S- o N-alilo; O-alquil-O- alquilo, -metoxi, -aminopropoxi; -aminoxi; -metoxietoxi; -dimetilaminooxietoxi y -dimetilaminoetoxietoxi.

El resto de azucar puede ser una piranosa o derivado de la misma, o una desoxipiranosa o derivado de la misma, de preferencia una ribosa o un derivado de la misma, o una desoxirribosa o un derivado de la misma. Tales restos de azucares derivatizados preferidos comprenden el acido nucleico bloqueado.

Un LNA es un nucleotido de ARN modificado en el que el radical de ribosa del nucleotido de LNA se modifica con un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4'. Esto mejora el apilamiento y la pre-organizacion de bases, y aumenta significativamente la estabilidad termica. Este puente “bloquea” la ribosa en la conformacion estructural 3'- endo, que a menudo se encuentra en la forma A de ADN o ARN. Los nucleotidos de LNA usados en la presente invencion se pueden mezclar con las bases de ADN o ARN en el oligonucleotido siempre que se desee.

De acuerdo con la invencion, el dicho oligonucleotido antisentido se selecciona en el grupo constituido por un ribonucleotido, un desoxirribonucleotido, un antagomir, un LNA, un PNA, un oligonucleotido de morfolino o una combinacion de los mismos.

En una realizacion preferida de la composicion de la invencion, el dicho oligonucleotido antisentido es un antagomir.

Los antagomirs son oligonucleotidos disenados qmmicamente que se usan para silenciar el microARN endogeno. Un antagomir es un ARN o ADN sintetico pequeno que es perfectamente complementario a la diana de microARN espedfico, ya sea con desemparejamiento en el sitio de escision o algun tipo de modificacion de base para inhibir la escision. Por lo general, los antagomirs tienen algun tipo de modificacion para que sea mas resistente a la degradacion y facilitar la internalizacion celular. No esta claro como funciona la antagomirizacion (el proceso por el cual un antagomir inhibe la actividad de microARN), pero se cree que inhibe de forma irreversible la union del microARN. Los antagomirs se usan para inhibir constitutivamente la actividad de microARNs espedficos.

En una realizacion de la invencion, el dicho antagomir comprende una secuencia de nucleotidos que comprende por lo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleotidos contiguos complementarios al mir-92a de secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No. 1 y 2.

En una realizacion de la invencion, el dicho antagomir comprende una secuencia nucleotfdica que comprende por lo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleotidos contiguos complementarios al miR-92a de secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID No. 21, 22 o 23.

En otra realizacion, el dicho antagomir comprende una secuencia nucleotfdica que comprende por lo menos 16 nucleotidos contiguos complementarios a los nucleotidos de la secuencia SEC ID No. 21.

En una realizacion de la invencion, el dicho antagomir posee una cadena principal de ADN.

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En tal realizacion de la composicion de la invencion, el dicho antagomir comprende la secuencia de SEC ID No. 59 y las modificaciones que excluyen las sustituciones de bases de la misma, y fragmented que consisten en subsecuencias de la SEC ID NO: 59 de por lo menos 8 nucleotidos contiguos de la misma.

En otra realizacion de la invencion, el dicho antagomir posee una cadena principal de ARN.

En tal realizacion de la composicion de la invencion, el dicho antagomir comprende la secuencia de SEC ID No. 60 y modificaciones sin incluir sustituciones de bases de la misma, y fragmentos que consisten en subsecuencias de la SEC ID NO: 60 de por lo menos 8 nucleotidos contiguos de la misma.

En una realizacion, el antagomir, de acuerdo con la invencion, es un fragmento que consiste en una subsecuencia de la SEC ID NO: 59 o 60 de por lo menos 8 nucleotidos contiguos de la misma.

En una realizacion, el antagomir de acuerdo con la invencion es un fragmento que consiste en una subsecuencia de la SEC ID NO: 59 o 60 de por lo menos 9 nucleotidos contiguos de la misma.

En una realizacion, el antagomir de acuerdo con la invencion es un fragmento que consiste en una subsecuencia de la SEC ID NO: 59 o 60 de por lo menos 10 nucleotidos contiguos de la misma.

En una realizacion, el antagomir de acuerdo con la invencion es un fragmento que consiste en una subsecuencia de la SEC ID NO: 59 o 60 de por lo menos 11 nucleotidos contiguos de la misma.

En una realizacion, el antagomir de acuerdo con la invencion es un fragmento que consiste en una subsecuencia de la SEC ID NO: 59 o 60 de por lo menos 12 nucleotidos contiguos de la misma.

En una realizacion, el antagomir de acuerdo con la invencion es un fragmento que consiste en una subsecuencia de la SEC ID NO: 59 o 60 de por lo menos 13 nucleotidos contiguos de la misma.

En una realizacion, el antagomir de acuerdo con la invencion es un fragmento que consiste en una subsecuencia de la SEC ID NO: 59 o 60 de por lo menos 14 nucleotidos contiguos de la misma.

En una realizacion, el antagomir de acuerdo con la invencion es un fragmento que consiste en una subsecuencia de la SEC ID NO: 59 o 60 de por lo menos 15 nucleotidos contiguos de la misma.

En otra realizacion, el dicho antagomir de la secuencia de SEC ID No. 59 o 60 presenta por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 nucleotidos modificados por enlace o enlaces de fosfotioato entre nucleotidos adyacentes.

En otra realizacion de la invencion, el dicho antagomir puede incluir el nucleotido modificado 2'-O-metilo, un grupo colesterol o cualquier modificacion similar o equivalente.

En general, si una formulacion farmaceutica que contiene un acido nucleico, un peptido y una protema se administra por via oral o parenteral, se degrada por enzimas en el cuerpo, y la eficacia de la formulacion farmaceutica desaparece rapidamente. Se han realizado diversas pruebas para resolver el problema. Una de las cuales es formular un inyectable de liberacion sostenida prolongada.

En la practica, se esta llevando a cabo investigacion sobre el uso de endoprotesis como un sistema para la administracion selectiva de microARNs. Sin embargo, la rapida endotelizacion de las endoprotesis podna plantear un problema con respecto a la liberacion sostenida de microARNs, especialmente para los procesos biologicos que requieren la modulacion genica prolongada. Ademas, los liposomas y nanopartteulas se han desarrollado y usado in vivo, pero no se ha evitado el paso al sistema circulatorio con el riesgo de efectos secundarios graves. Ademas, ningun estudio ha demostrado eficacia y seguridad despues de la administracion intracoronaria percutanea sin pinzamiento aortico anterior.

Otro aspecto de la invencion se basa en el uso de microesferas biodegradables y biocompatibles.

De acuerdo con la invencion, se ha disenado y fabricado un sistema de liberacion adecuado para la liberacion localizada de oligonucleotidos en la region cardfaca, con base en la microencapsulamiento de tales oligonucleotidos con polfmeros biodegradables biocompatibles. La invencion permite obtener microesferas sustancialmente cargadas con oligonucleotidos, que tienen alta eficiencia de encapsulamiento y ninguna modificacion/degradacion molecular. De acuerdo con la invencion, se conserva la pureza y la calidad de la molecula, sin anadir un agente estabilizante o una sustancia de retencion, gracias a las condiciones de fabricacion usadas, en particular las caractensticas de la emulsion creada, la concentracion de la disolucion polimerica y la relacion entre los volumenes de las fases que intervienen en el proceso de microencapsulamiento. Ademas, las microesferas tienen una distribucion de tamano de partteulas adecuada para que puedan ser retenidas en los microvasos de la zona infartada sin causar embolia arterial y sin ser destruidas por la accion fagocftica de los macrofagos.

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar una microesfera de liberacion sostenida, que encapsula de forma estable un acido desoxirribonucleico de cadena corta o un acido ribonucleico de cadena corta, y es capaz de

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inhibir, durante un largo penodo, la inhibicion de la expresion de una protema espedfica, especialmente una protema cuya inhibicion esta relacionada con una enfermedad.

En terminos generales, “biocompatible” significa compatible con celulas vivas, tejidos, organos o sistemas, y que no supone un riesgo de lesiones, toxicidad, o el rechazo por el sistema inmune. Una microesfera biocompatible significa que la microesfera, y cualquier producto de degradacion de la microesfera, no es toxica para el receptor y tampoco presenta efectos nocivos o adversos significativos en el cuerpo del receptor, tal como una reaccion inmunologica en el sitio de inyeccion.

En terminos generales, “biodegradable” significa capaz de ser descompuesto por la accion de agentes biologicos.

Una microesfera biodegradable, tal como se define en la presente, significa que la microesfera se degradara o erosionara in vivo para formar especies qmmicas mas pequenas. La degradacion puede resultar, por ejemplo, por procesos enzimaticos, qmmicos y/o ffsicos.

Los polfmeros biodegradables, biocompatibles adecuados incluyen, por ejemplo, poli(lactida)s, poli(glicolida), poli(lactida-co-glicolida), poli(acido lactico), poli(acido glicolico), poli(acido lactico-co-glicolico), policaprolactona, policarbonatos, poliesteramidas, polianddridos, poli(aminoacidos), poliortoesteres, poliacetilos, policianoacrilatos, polieteresteres, poli(dioxanona), poli(alquilato de alquileno), copolfmeros de polietilenglicol y poliortoester, poliuretanos biodegradables, mezclas y copolfmeros de los mismos.

Un numero de tecnicas para producir micropartmulas se han descrito en la tecnica anterior.

El perfil de liberacion del farmaco para una micropartmula depende de numerosos factores, que incluyen las propiedades fisicoqmmicas de los polfmeros usados, las interacciones entre polfmero-farmaco-excipiente y/o morfologfa y la composicion de las micropartmulas resultantes.

Para que las microesferas sean retenidas por los capilares del miocardio deben tener una distribucion de tamano muy espedfica de manera que se minimice su destruccion a traves de la fagocitosis por los macrofagos, por un lado, o la embolia de las arterias, por otro lado; el microencapsulamiento usando un polfmero biodegradable, biocompatible permite la liberacion controlada del producto desde las horas iniciales durante un maximo de 2-3 semanas, el principal penodo durante el cual se produce la remodelacion ventricular post-AMI.

En el contexto de la presente invencion, ya que se prefiere la via intracoronaria, el tamano promedio de estas microesferas tiene en cuenta el tamano de los capilares del miocardio; este vana entre 5 y 15 micrometros, a retener en la region cardfaca, y sin partfculas superiores a 25 micrometros para prevenir la embolia arterial.

En una realizacion de la invencion, estas microesferas presentan un diametro que no excede 25 |im.

En una realizacion, 50 a 100% de las microesferas estan comprendidas en el intervalo de 5 a 25 |im, y no hay partmulas superiores a 25 |im.

En una realizacion preferida, de 60 a 100% de las microesferas estan comprendidas en el intervalo de 5 a 25 |im, y no hay partfculas superiores a 25 |im.

En otra realizacion preferida, de 70 a 100% de las microesferas estan comprendidas en el intervalo de 5 a 25 |im, y no hay partfculas superiores a 25 |im.

En una realizacion mas preferida, de 80 a 100% de las microesferas estan comprendidas en el intervalo de 5 a 25 |im, y no hay partfculas superiores a 25 |im.

De acuerdo con la invencion, el diametro promedio de las microesferas esta en el intervalo de 5 a 15 |im.

En una realizacion alternativa, estas microesferas presentan un diametro promedio de 8 a 11 |im.

Las microesferas de acuerdo con la invencion cargan una alta cantidad del dicho inhibidor de microARN en un polfmero biodegradable y biocompatible para la liberacion sostenida del farmaco en el area infartada.

La carga de inhibidor de microARN es de aproximadamente 1 a 20% (p/p), de preferencia de 1 a 15% (p/p), y mas preferentemente de 1 a 10 y aun mas preferentemente de 5 a 10%. Se conserva la integridad del farmaco.

En una realizacion, las microesferas de acuerdo con la invencion se incorporan de 1% a 15% p/p de inhibidor.

En otra realizacion, las microesferas de acuerdo con la invencion, se incorporan de 5% a 15% p/p de inhibidor.

Todavfa en otra realizacion, las microesferas de acuerdo con la invencion, se incorporan de 1% a 10%, de preferencia de 5% a 10% p/p de inhibidor.

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Otra caractenstica de la invencion se refiere a la naturaleza del poUmero usado para la generacion de las microesferas.

En una realizacion de la invencion, estas microesferas estan hechas de un poKmero que consiste en poli-d,l-lactida (PLA). En una realizacion, las dichas microesferas se elaboran de PLA como el unico polfmero. En una realizacion, estas microesferas se elaboran de PLA que se mezcla con uno o mas de otros polfmeros biocompatibles.

En otra realizacion de la invencion, estas microesferas estan hechas de un copolfmero que consiste en poli-d,l- lactida-co-glicolida (PLGA). En una realizacion, estas microesferas estan hechas de PLGA como el unico polfmero. En una realizacion, estas microesferas se elaboran de PLGA que se mezcla con uno o mas de otros polfmeros biocompatibles.

En aun otra realizacion de la invencion, estas microesferas estan hechas de una mezcla de polfmeros que consiste en poli-d,l-lactida-co-glicolida (PLGA) y poli-d,l-lactida (PLA).

Por la expresion “mezcla”, debe entenderse que una mezcla de dos o mas polfmeros se realiza antes de la disolucion de esta mezcla en el mismo disolvente organico.

El experto en la tecnica comprendera facilmente que, contrariamente al copolfmero de PLGA, la proporcion de lactida:glicolida en el polfmero PLA esta comprendida entre la relacion molar de 100:0.

Con respecto al copolfmero de PLGA, la proporcion de lactida:glicolida en el polfmero de PLGA esta comprendida en una relacion molar de 50:50 a 95:5.

En una realizacion preferida, la relacion de lactida:glicolida en el copolfmero de PLGA esta comprendida en una relacion molar de 50:50 a 90:10, y de preferencia en una relacion molar de 50:50 a 80:20.

En una realizacion de la invencion, la viscosidad inherente del polfmero esta comprendida entre 0,1 y 0,7 dl/g.

En una realizacion preferida, la viscosidad inherente del polfmero esta comprendida entre 0,15 y 0,7 dl/g, de preferencia 0,15 a 0,5 dl/g.

Este aspecto es de interes en el sentido de que la viscosidad inherente esta relacionada con el peso molecular del polfmero y, por lo tanto, influye en la velocidad de liberacion de inhibidor de las microesferas polimericas.

Por consiguiente, se describe en la presente un metodo para producir un inhibidor microencapsulado de miR-92a que no incluye ningun adyuvante y que consiste en una sola poblacion de partfculas en terminos de la composicion polimerica.

Por lo tanto, tambien se describe en la presente un metodo para microencapsular un inhibidor de microARN en microesferas polimericas, que comprende: (a) disolver el inhibidor de microARN en agua purificada, sin ningun estabilizante, (b) disolver el polfmero en un disolvente organico; (c) anadir (a) a (b) para producir una primera emulsion; (d) anadir la emulsion de la etapa (c) a una disolucion acuosa que contiene un tensioactivo y un agente osmotico para producir una segunda emulsion; (e) endurecer y cosechar las microesferas resultantes de la etapa (d); y (f) secar.

Mas particularmente, se describe en la presente un metodo para producir una composicion como la descrita anteriormente, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) disolver el inhibidor de miARN en agua purificada, sin ningun estabilizante;

b) disolver el polfmero en un disolvente organico;

c) anadir (a) a (b) para producir una primera emulsion;

d) anadir la emulsion de la etapa (c) a una disolucion acuosa que contiene un tensioactivo y un agente osmotico para producir una segunda emulsion; y

e) endurecer y cosechar las microesferas resultantes de la etapa (d); y

f) secar las microesferas obtenidas.

Otro aspecto de la invencion consiste en el uso de la composicion de acuerdo con la invencion en el tratamiento de infarto de miocardio.

En otras palabras, la invencion se refiere a una composicion que comprende una cantidad efectiva de por lo menos un inhibidor de microARN, en la que dicho inhibidor se microencapsula en microesferas polimericas biodegradables y biocompatibles, en la que por lo menos 50% de dichas microesferas presentan un diametro comprendido entre 5 y 15 |im, y en la que el dicho por lo menos un inhibidor consiste en un oligonucleotido antisentido dirigido a o que es complementario a miR-92a, para uso en el tratamiento de infarto de miocardio.

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En una realizacion preferida, el dicho infarto de miocardio consiste en el infarto agudo de miocardio.

La invencion tambien se refiere a una composicion que comprende una cantidad efectiva de por lo menos un inhibidor de microARN, en la que el inhibidor se microencapsula en microesferas polimericas biodegradables y biocompatibles, en el que por lo menos 50% de dichas microesferas presentan un diametro comprendido entre 5 y 15 |im, y en el que el dicho por lo menos un inhibidor consiste en un oligonucleotido antisentido dirigido a o que es complementario a miR-92a, para uso en un metodo para revertir o prevenir la remodelacion ventricular en un sujeto que lo necesite.

De este modo, la invencion tambien se refiere a una composicion como se define anteriormente para revertir o prevenir la remodelacion ventricular en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de dicha composicion.

Como ya se ha mencionado, la composicion de acuerdo con la invencion es adecuada para una administracion por via intracoronaria.

Para la administracion por via intracoronaria, las microesferas deben suspenderse en un vehmulo apropiado, ya sea una disolucion salina (PBS) con o sin un tensioactivo o en otro vehmulo apropiado para la administracion intravenosa. Los dispersantes adecuados incluyen, por ejemplo, tensioactivos tales como polisorbato 80, polisorbato 20, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado 60, carboximetilcelulosa, o polisacaridos tales como alginato de sodio; tambien es posible anadir un agente isotonificante, tal como, por ejemplo, cloruro de sodio, manitol, sorbitol o glucosa. Dado el tamano de las arterias coronarias, la concentracion de microesferas en el medio de administracion se ajusta con el fin de limitar la alteracion del flujo sangumeo y prevenir el riesgo de embolia arterial. Esta concentracion puede variar entre 0,05% y 1%, de preferencia entre 0,1% y 0,5%. La administracion puede ser por una sola inyeccion o inyecciones repetidas, seguido opcionalmente por una inyeccion de disolucion salina. La administracion puede llevarse a cabo despues de la angioplastia coronaria percutanea, sin limitacion, usando el mismo cateter.

El metodo de la invencion se caracteriza por que dicha administracion consiste en una administracion por via intracoronaria.

Este aspecto es de particular interes ya que aborda varias limitaciones presupuestas de la administracion intravenosa directa de compuestos, tal como el oligonucleotido como antagomir. Entre otras limitaciones presupuestas, se puede mencionar i) la bioseguridad de nivel bajo debido a la ubicuidad y la baja especificidad de organos de miARNs, ii) las dosis altas e inyecciones repetidas para que el inhibidor de microARN produzca su efecto, y iii) alto coste teorico de la dosis intravenosa calculada.

Sorprendentemente, como sera evidente despues de la lectura de los siguientes ejemplos, todos estos aspectos se abordan por la invencion.

Mas particularmente, se demuestra que:

a) es posible administrar selectivamente el antagomir encapsulado en la arteria que irriga el tejido enfermo (vease el Ejemplo 5);

b) las microesferas se retienen en la coronaria (vease el Ejemplo 6);

c) la administracion intra-arterial de microesferas se usa para la embolia del tumor, lo que permite la interrupcion del flujo sangumeo permanente y la prevencion de la progresion del tumor, opcionalmente en combinacion con sustancias activas de liberacion. Teniendo en cuenta estos elementos, se considero la existencia del riesgo de embolia. Por esta razon, se disenaron estudios con el objetivo de comprobar que las microesferas no causaran ningun dano al musculo cardfaco o produjeran alteraciones significativas en la tasa de flujo coronario (vease el Ejemplo 7);

d) buena estabilidad del inhibidor de microARN en el vehmulo y la liberacion sostenida de dicho inhibidor desde las microesferas; esto se demuestra por su efecto biologico mientras se inhibe microARN durante un tiempo de hasta 10 dfas despues de que se administra (Ejemplo 8);

e) la administracion de microesferas con el inhibidor de miARN promueve la recuperacion contractil del tejido danado y evita la aparicion de remodelacion adversa post-infarto (vease el Ejemplo 9);

f) con la administracion localizada de microesferas, la dosis de inhibidor podna reducirse a una sola inyeccion, lo que supone una reduccion significativa de los efectos secundarios potenciales y una clara reduccion en el coste.

La disponibilidad de un vehmulo/sistema apropiado para la administracion controlada, el suministro y liberacion de inhibidores de microARN, de acuerdo con la invencion tiene las siguientes ventajas:

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- bioseguridad mejorada, dado que esta limitada la bio-distribucion del farmaco por los tejidos y organos que no son la diana del tratamiento

- evita inyecciones intravenosas repetidas i) reduce los ingresos hospitalarios y las visitas al hospital para pacientes externos, mejorando la calidad de apoyo al paciente, ii) evita la necesidad de mantenimiento prolongado para la administracion de farmacos, asf como los riesgos potenciales como resultado de esto, y iii) minimiza los riesgos inherentes a la administracion intravenosa de productos (infecciones, reacciones localizadas...)

- la reduccion de la dosis permite la reduccion de los efectos adversos relacionados dependientes de la dosis

- reduccion de los costes debido a una reduccion en la dosis requerida, asf como el personal y los equipos necesarios para inyecciones repetidas.

En otra realizacion, la invencion se refiere a una poblacion de microesferas biodegradables y biocompatibles para el uso en el tratamiento o la prevencion de la remodelacion ventricular tras un infarto de miocardio, en donde tales microesferas:

- tienen un diametro promedio comprendido entre 5 y 15 |im;

- se elaboran de poli-d,l-lactida-co-glicolida (PLGA); poli-d,l-lactida (PLA) o una mezcla de los mismos;

- se incorporan de 1% a 15% p/p de un agente terapeutico capaz de prevenir la remodelacion ventricular, que incluye de 1% a 10% p/p de dicho agente terapeutico;

en las que dicho agente terapeutico consiste en un inhibidor de un microARN que consiste en miR-92a, en las que dicho inhibidor de microARN es preferentemente un antagomir.

La invencion tambien se refiere a un kit que comprende por lo menos: i) una composicion y/o microesferas de acuerdo con la invencion y ii) una jeringuilla o vial o ampolla en la que se dispone la composicion.

En una realizacion, el kit de la invencion ademas comprende un disolvente dispuesto en un recipiente de disolvente. El recipiente del disolvente puede ser un vial, una ampolla o una jeringuilla llenada previamente.

Las microesferas y el disolvente pueden estar dispuestos en una jeringuilla llenada previamente de compartimiento doble.

En una realizacion, el kit de la invencion puede comprender las microesferas en un vial y el disolvente en un vial separado.

En una realizacion, el kit de la invencion puede comprender las microesferas en un vial y el disolvente en una ampolla separada.

En una realizacion, el kit de la invencion puede comprender las microesferas en un vial y el disolvente en una jeringuilla llenada previamente.

En una realizacion, el kit de la invencion puede comprender las microesferas en una jeringuilla llenada previamente y el disolvente en un vial separado.

En una realizacion, el kit de la invencion puede comprender las microesferas en una jeringuilla llenada previamente y el disolvente en una ampolla separada.

En una realizacion, el kit de la invencion puede comprender las microesferas y el disolvente separadamente en una jeringuilla de compartimiento doble.

La invencion se entendera mejor con respecto a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Preparacion de microesferas cargadas con antagomir-92a

Las microesferas se prepararon mediante un metodo de evaporacion de emulsion w/o/w /disolvente usando un copolfmero de PLGA 50:50, viscosidad intrmseca de aproximadamente 0,2 dl/g, que contiene grupos carboxilo terminales libres. Se anadieron 3 ml de cloruro de metileno a 0,6 g de PLGA. Se anadieron 0,3 ml de una disolucion concentrada de antagomir-92a (I-Ssc-miR-92a; masa molecular: 5366 g/mol; secuencia: CCGGGACAAGTGCAAT; Bases de ADN: 9; Bases de LNA: 7; fabricante: IDT (Exiqon)) (222 mg/ml) en agua purificada a la disolucion organica de PLGA, y se emulsiono mediante ultrasonidos durante 20 s. Esta emulsion primaria se anadio a una fase externa que consiste en una disolucion acuosa de 1% (p/v) de alcohol polivimlico y 1% (p/v) de cloruro de sodio, y se homogeneizo durante 60 s a aproximadamente 10300 rpm. La segunda emulsion (w/o/w) obtenida se anadio a un volumen de agua purificada, y el cloruro de metileno se dejo evaporar por agitacion. Las microesferas obtenidas se recogieron por centrifugacion, se lavaron dos veces con agua purificada, y luego se liofilizaron. El diametro promedio

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de las microesferas fue de 9 |im (82% entre 5-25 |im y 0% por encima de 25 |im) mientras que la eficiencia de encapsulamiento fue de 74%.

Una imagen de las microesferas obtenidas se representa en la Figura 1.

La Figura 2 ilustra la distribucion del tamano de las microesferas.

Ejemplo 2: Preparacion de microesferas cargadas con ARN

Las microesferas se prepararon mediante un metodo de evaporacion de emulsion w/o/w /disolvente usando un copolfmero de PLGA 50:50, viscosidad intrmseca de aproximadamente 0,2 dl/g, que contiene grupos carboxilo terminales libres. Se anadieron 3 ml de cloruro de metileno a 0,6 g de PLGA. Se anadieron 0,3 ml de una disolucion concentrada de ARN (222 mg/ml) (RNA Sigma 5000-10000 Da) en agua purificada libre de ARNasa a la disolucion organica de PLGA y se emulsiono por ultrasonidos durante 20 s. Esta emulsion primaria se anadio a una fase externa que consiste en una disolucion acuosa libre de ARNasa de 1% (p/v) de alcohol polivimlico y 5% (p/v) de manitol, y se homogeneizo durante 60 s a aproximadamente 10300 rpm. La segunda emulsion (w/o/w) obtenida se anadio a un volumen de agua purificada libre de ARNasa, y el cloruro de metileno se dejo evaporar por agitacion. Las microesferas obtenidas se recogieron por centrifugacion, se lavaron dos veces con agua purificada libre de ARNasa, y luego se liofilizaron. El diametro promedio de las microesferas fue 10 |im, (86%) entre 5-25 |im y 0% por encima de 25 |im) mientras que la eficiencia de encapsulamiento fue de 73%.

Ejemplo 3: Preparacion de microesferas de placebo

Las microesferas se prepararon mediante un metodo de evaporacion de emulsion w/o/w /disolvente usando un copolfmero de PLGA 50:50, la viscosidad intrmseca de aproximadamente 0,2 dl/g, que contiene grupos carboxilo terminales libres. Se anadieron 3 ml de cloruro de metileno a 0,6 g de PLGA. Se anadieron 0,3 ml de agua purificada a la disolucion organica de PLGA y se emulsiono mediante ultrasonidos durante 20 s. Esta emulsion primaria se anadio a una fase externa que consiste en una disolucion acuosa de 1% (p/v) de alcohol polivimlico y 1% (p/v) de cloruro de sodio, y se homogeneizo durante 60 s a aproximadamente 10.300 rpm. La segunda emulsion (w/o/w) obtenida se anadio a un volumen de agua purificada, y el cloruro de metileno se dejo evaporar por agitacion. Las microesferas obtenidas se recogieron por centrifugacion, se lavaron dos veces con agua purificada, y luego se liofilizaron. El diametro promedio de las microesferas fue 7 |im (84% entre 5-25 |im y 0% por encima de 25 |im).

Ejemplo 4: Preparacion de microesferas cargadas con albumina marcada con isotiocianato de fluorescema

Las microesferas se prepararon mediante un metodo de evaporacion de emulsion w/o/w /disolvente usando un copolfmero de PLGA 50:50, viscosidad intrmseca de aproximadamente 0,2 dl/g, que contiene grupos carboxilo terminales libres. Se anadio 1 ml de cloruro de metileno a 0,2 g de PLGA. Se anadieron 0,1 ml de una disolucion acuosa de albumina marcada con isotiocianato de fluorescema (20 mg/ml) a la disolucion organica de PLGA y se emulsiono mediante ultrasonidos durante 15 s. Esta emulsion primaria se anadio a una fase externa que consiste en una disolucion acuosa de 1% (p/v) de alcohol polivimlico y 1% (p/v),y se homogeneizo durante 60 s a aproximadamente 10300 rpm. La segunda emulsion (w/o/w) obtenida se anadio a un volumen de agua purificada, y el cloruro de metileno se dejo evaporar por agitacion. Las microesferas obtenidas se recogieron por centrifugacion, se lavaron dos veces con agua purificada, y luego se liofilizaron. El diametro promedio de las microesferas fue 9 |im (91% entre 5-25 |im y 0% por encima de 25 |im).

Ejemplo 5: Estudio de la administracion selectiva en la arteria que irriga el tejido diana

Despues provocar un AMI en un cerdo Large White, 30 mg de microesferas que contienen albumina fluorescente, preparadas como se indica en el Ejemplo 4, se administraron por via intra-coronaria, por medio de un balon coaxial de 2,5/12 colocado en la arteria responsable del AMI, que irriga la zona infartada. Las microesferas se suspendieron in situ en 10 ml de disolucion salina normal que contiene Tween-80; la administracion se realizo en 2 inyecciones consecutivas de 5 ml, cada una seguida de 5 ml de disolucion salina normal. Los experimentos mostraron que el antagomir encapsulado se puede administrar de forma selectiva en la arteria que irriga el tejido enfermo.

Ejemplo 6: Estudio de retencion de las microesferas en los capilares del tejido enfermo sin permitir el flujo de salida al torrente sanguineo

En un modelo de cerdo, se llevaron a cabo 4 experimentos mediante la administracion por via intra-coronaria a traves de un balon coaxial colocado en la rama descendente anterior medial, 2 inyecciones con 5 ml cada una de microesferas fluorescentes preparadas de acuerdo con el ejemplo 4. Los 4 animales se sacrificaron y se obtuvieron las muestras miocardicas del tejido contiguo a la rama descendente anterior y el tejido de control irrigado por otras arterias coronarias. Las muestras se observaron a traves de un microscopio de fluorescencia optico y se demostro la presencia de microesferas retenidas en los capilares del musculo cardfaco danado, asf como su ausencia en el tejido de control.

Para descartar la biodistribucion sistemica, en dos de los animales anteriores, ademas del tejido del miocardio isquemico y de control, se obtuvieron muestras 5 de replicas de pulmon, bazo e hugado y se visualizaron por

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microscopfa optica con luz B. La fluorescencia se detecto exclusivamente en la pared del miocardio anterior. Este analisis revelo que las microesferas quedan retenidas en el corazon evitando la liberacion sistemica de antagomir 92a (reduccion de efectos secundarios).

Ejemplo 7: Estudio de retencion de microesferas en los capilares del tejido enfermo sin danar el propio tejido diana

Se llevaron a cabo experimentos para investigar la toxicidad cardfaca local potencial y el intervalo de seguridad terapeutica de la dosis. Para detectar el dano isquemico local al musculo cardfaco, se emplearon 2 pares de cristales piezoelectricos, los cuales son altamente sensibles en su capacidad para detectar la isquemia. Cuando el tejido muscular cardfaco es afectado por isquemia, el tejido restante se convierte en discinetico y se hincha; esto, junto con la presion sangumea producida por el tejido sano contiguo restante, provoca que los microcristales se separen y se muevan mas lejos el uno del otro. En dos cerdos, despues de realizar una toracotoirna y una pericardiectoirna, se insertaron dos pares de microcristales, un par de control en la region lateral y un par en la region anterior suministrada por la rama descendente anterior, a traves de la cual se administraron las microesferas. Para cada par de cristales de tamano medio, se midio la distancia entre ellos en dos puntos durante el ciclo cardfaco: la diastole final (EDL) y la sfstole final (ESL). La relacion entre EDL y ESL se expresa por el parametro SS (acortamiento sistolico: (EDL-ESL)/EDL. Cuando la contraccion ventricular izquierda se disipa completamente EDL = ESL y SS = 0. Los valores normales oscilan entre 0,2 ± 0,1. Como se muestra en la ilustracion adjunta, las oscilaciones mmimas y transitorias despues de cada inyeccion que duran unos pocos segundos, se indujeron con la dosis del estudio, que corresponde a la primera y segunda inyecciones. Ademas y sorprendentemente, no se observaron efectos secundarios locales con inyecciones intracoronarias repetidas de microesferas fluorescentes preparadas de acuerdo con el ejemplo 4, alcanzando 14 veces la dosis del estudio. No se asocio una dosis maxima limitante con el dano isquemico irreversible, repercusion hemodinamica o arritmias.

Ademas, para detectar cambios en el flujo coronario, se coloco un sensor de flujo en el centro de la LAD que mide el flujo coronario. No se observaron cambios significativos en el flujo coronario despues de las inyecciones intracoronarias.

Los resultados se ilustran en la Figura 3, en la que se inyectaron 120 mg de microesferas, y en la Figura 4, en la que se inyectaron 240 mg de microesferas.

Ejemplo 8: Estudio del efecto molecular de una sola inyeccion intracoronaria de microesferas con una dosis pequena de antagomir

Para demostrar que pequenas dosis de antagomir microencapsulado podnan producir una respuesta molecular, la expresion de miR-92a in vivo, en el tejido isquemico y de control, se midio despues de la administracion intracoronaria de antagomir-92a encapsulado. En 3 cerdos, se suministraron en LAD 60 mg de microesferas que contienen antagomir-92a preparadas de acuerdo con el ejemplo 1 (0,1 mg/kg). Los animales se sacrificaron a uno, tres y 10 dfas despues del tratamiento y se cuantifico la expresion de miR-92a y microARN endogeno como controles (miR-123, 203 y 126) en muestras de 2 replicas de control e infartado por aislamiento de ARN total y RT- PCT cuantitativo en tiempo real usando cebadores espedficos (vease la Figura 5).

En el tejido infartado, la expresion de miR-92a resulto disminmda en 8 veces en comparacion con el tejido de control, mientras que la expresion de miRs endogenos no se vio afectada por el tratamiento. La inhibicion comenzo a estar presente tan pronto como 1 dfa y todavfa estuvo presente en el dfa 10, con niveles de expresion 5 veces menores que en el area de control.

No se detecto una regulacion significativa en miRs endogenos. Estos resultados revelan que el vetnculo/sistema proporciona las condiciones adecuadas para permitir el suministro y liberacion controlados de antagomir-92a, produciendo asf una inhibicion sostenida de microARN-92a con una sola administracion intracoronaria.

Estos resultados, representados en las Figura 6, tambien confirman que el antagomir no se degrada durante el proceso de fabricacion de microesferas.

Ejemplo 9: Estudio del efecto biologico de una sola inyeccion intracoronaria de microesferas que contienen bajas dosis de antagomir

Para demostrar si el efecto molecular del antagomir-92a transportado por microesferas esta acompanado por un efecto biologico, se llevo a cabo un estudio pre-clmico con 26 cerdos enanos adultos. El proposito de este estudio fue investigar si la inhibicion de mir-92a por la administracion selectiva intracoronaria de antagomir-92a encapsulado, conduce a mejorar la angiogenesis en el area infartada, y, de esta manera, evita la aparicion del remodelado ventricular.

Se administraron 3 formulaciones:

- disolucion salina (formulacion de control)

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- microesferas de placebo preparadas de acuerdo con el Ejemplo 3

- microesferas de antagomir-92A preparadas de acuerdo con el ejemplo 1, en una dosis de antagomir de 3 mg/cerdo enano.

4 semanas despues del tratamiento, se detecto una densidad vascular significativa mayor en la zona necrotica en los animales que recibieron antagomir-92a encapsulado en comparacion con los controles, confirmando de ese modo la actividad proangiogenica de antagomir-92a observada en el estudio anterior (161,57 ± 58,71 frente a 68,49 ± 23,56 en el grupo de placebo frente a 73,91 ± 24,97 en el grupo de disolucion salina, p = 0,001) ii) la densidad vascular (vease la Figura 7).

La microvascularidad aumento tanto dentro de la zona del infarto como del borde peri-infarto. Se demostro consistentemente un menor mdice de resistencia microvascular en los animales tratados (200,67 ± 104,46 frente a 511,73 ± 202,1 en los controles, p = 0,007) y se correlaciono significativamente con la densidad vascular (R2 0,41, p = 0,02). (Vease la Figura 8).

Estos datos indican que el antagomir-92a encapsulado induce la angiogenesis sostenida in vivo.

Habiendo encontrado el crecimiento de los vasos sangumeos, por lo tanto, se investigaron adicionalmente por lo tanto sus beneficios potenciales en el proceso de curacion que se presenta despues de un AMI. Para determinar los efectos de antagomir-92a encapsulado en la remodelacion ventricular, se compararon los parametros morfologicos y estructurales mediante formacion de imagenes de resonancia magnetica ex vivo (CMR) y los parametros funcionales analizados por ecocardiograffa intravascular (IVE), en los grupos tratados y no tratados. Estuvo presente un porcentaje mas significativo de animales con discinesia anterior y septoapical en IVE en los controles (p = 0,03) (vease principalmente la Figura 9), con tambien un adelgazamiento significativo mayor de la pared ventricular lesionada y cambios adversos en la morfometna de remodelacion en el ventnculo izquierdo en CMR ex-vivo en comparacion con los animales tratados (Tabla 3).

Mas particularmente, la Figura 9 ilustra los resultados del analisis de la disfuncion del movimiento de la pared regional por ecocardiograffa intravascular (IVE). IVE se realizo mediante el uso de una maquina de formacion de imagenes de ultrasonido Q Vivid (GE Healthcare, Belford, UK) y un cateter de ultrasonido AcuNav 10F (Siemens) colocado en el apice del ventnculo derecho.

Los resultados del estudio muestran que la administracion de microesferas de antagomir-92a se asocia con una reduccion estadfsticamente significativa en el remodelado adverso despues de un infarto de miocardio agudo.

Tabla 3: Parametros de la remodelacion ventricular izquierda en la CMR

Disolucion salina (N=6) ME de placebo (N=5) ME de antagomir-92a (N=6) P

Numero de cortes de CMR infartados

4,8±0,3 4,8±0,4 5,3±0,2 0,38

Tpared infartada max, mm

6,07±0,9 5,61±0,5 9,01±0,6 0,006

Tpared posterior normal mm

13,23±0,5 13,52±1,8 11,82±0,7 0,49

Porcentaje de adelgazamiento mmimo, %

54,79±4,9 56,74±4,1 22,71±5,5 0,000

Tpared infartada min mm

3,17±0,4 4,02±0,9 4,35±0,5 0,33

Porcentaje de adelgazamiento maximo, %

76,40±2,1 8 69,86±4,72 62,54±4,19 0,05

Longitud del adelgazamiento de la pared, mm

32,2±1,8 31,7±4 20,5±3,6 0,03

Dr/Dn

1,93±0,2 2,02±0,2 1,29±0,1 0,03

Dn, mm

14,88±0,6 8 13,78±1,59 17,5±1,37 0,12

% de remodelacion adverso (n)

83,3 (5) 80 (4) 16,7 (1) 0,03

El antagomir-92a encapsulado previene la remodelacion ventricular izquierda adversa 1 mes despues del infarto agudo del miocardio. Se determinaron los diferentes parametros de remodelacion calculados en todos los cortes infartados de CMR ex-vivo en cada cerdo enano. Se muestra el corte L2 representativo (siendo L1 el vertice) de los

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35

40

cuatro cerdos enanos. Tpared infartada max = grosor de pared infartada maximo medio calculado como Z del grosor maximo de pared del infarto en cada corte dividido por el numero de cortes afectados; Tpared posterior normal = grosor de la pared posterior normal medido justo al lado de la insercion del musculo papilar posterior calculado como Z del grosor de la pared posterior en cada corte afectado dividido por el numero de cortes afectados; porcentaje medio de adelgazamiento mmimo calculado como [100 - (Tpared infartada max/Tpared posterior normal X 100)] ; Tpared infartada min = grosor mmimo medio de pared infartada calculado como Z del grosor mmimo de la pared infartada en cada corte afectado dividido por el numero de cortes afectados; porcentaje medio de adelgazamiento maximo calculado como [100 - (Tpared infartada min/Tpared posterior normal)] x 100]; Dr: diametro maximo medio entre la pared infartada y la pared normal contralateral calculado como Z del diametro maximo entre la pared infartada en cada corte infartado dividido por el numero de cortes afectados; Dn: diametro maximo medio entre las paredes normales, formando un angulo recto con Dr y extrafdo mas cerca del centro de la cavidad ventricular, calculado como Z del diametro maximo entre las paredes normales en cada corte infartado dividido por el numero de cortes afectados; Dr/Dn: rndice de esfericidad medio calculado como Z de Dr/Dn de cada corte infartado dividido por el numero de cortes afectados. Los datos de la tabla se expresan como la media ± s.e.m.

Los resultados de una CMR representativa muestran que:

A: RMN cardfaca e IVE de 14 cerdos enanos (muerte inmediatamente despues de la induccion del AMI): debido a la ocurrencia de la muerte inmediatamente despues del AMI, no hubo tiempo suficiente para que el proceso de remodelacion se activara. Esta es la razon de por que se observo que un ventnculo izquierdo concentrico tiene dimensiones similares en todos los segmentos.

B: RMN cardfaca e IVE del cerdo enano 20 a los 30 dfas post-AMI: evidencia de remodelado ventricular adverso: se observo un mes despues del AMI, emaciacion extrema de las secciones anterior y septal en la CMR, asf como una formacion de aneurismas con discinesia en el IVE, que es tfpico del remodelado adverso post-AMI.

C: RMN cardfaca e IVE del cerdo enano 22 a los 30 dfas post-AMI: ninguna remodelacion ventricular: un mes despues del AMI, se observo ligera reduccion de la region parietal en las zonas anterior y septal sin formacion de aneurismas y sin discinesia en el IVE. Este es un caso tfpico de las reacciones de reparacion favorables despues de AMI.

Ejemplo 10: Estudio de la induccion de tumores vasculares o efectos en la mortalidad a corto plazo de antagomir-92a encapsulado

No se observaron tumores vasculares en el analisis de la necropsia realizado a todos los animales, sugieriendo de ese modo la ausencia de supresion sistemica ectopica de microARN-92a en otros organos a distancia. La mortalidad del estudio fue de 23%. No se observaron diferencias en la mortalidad a corto plazo. Solo murio un cerdo enano asignado a antagomir-92a encapsulado (p = 0,39).

Tabla 4

N=26

Salina (n=9) ME de placebo (n=9) ME de antagomir-92a (n=8)

Seguimiento de 1 mes

6 7 7

Muerte

3 2 1

Ejemplo 11: Estudio del perfil proarntmico de antagomir-92a encapsulado.

Con el fin de conocer el potencial arritmogenico de antagomir-92a encapsulado, todos los eventos arntmicos durante los procedimientos se registraron y analizaron por el programa 5S Collect (GE). Ademas, para abordar esta cuestion, un grabador de bucle insertable se implanto de forma aleatoria en 10 de los 26 cerdos enanos del estudio para detectar episodios potenciales de arritmia hasta el sacrificio, en un mes post-infarto y tratamiento. No se observo un mayor numero de taquiarritmias malignas ni bradiarritmias en el grupo tratado en comparacion con los controles, lo que indica que el antagomir-92a intracoronario encapsulado no ejerce un efecto proarntmico.

Tabla 5: Arritmias detectadas durante el estudio

Disolucion salina (n=9) ME de placebo (n=9) ME de antagomir-92a (n=8) p

Fase isquemica (n= 26)

Sin arritmias, n(%)

2 (22,2) 0 1 (12,5) 0,37

Disolucion salina (n=9) ME de placebo (n=9) ME de antagomir-92a (n=8) p

Arritmias, n(%)

7 (77,8) (100) 7 (87,5)

PVC, n

5 7 5

NSVT, n

0 1 1

Fibrilacion ventricular, n

3 3 3

Fase de reperfusion (n=26)

Sin arritmias, n(%)

5 (55,6) 3 (33,3) 3 (37,5) 0,6

Arritmias, n(%)

4 (44,4) 6 (66,7) 5 (62,5)

Pausas sinusales, n

1 1 0

Ritmo nodal, n

1 0 0

IVR, n

0 2 1

PVC, n

4 3 3

NSVT, n

0 0 1

Durante 30 dfas despues de AMI (n=10)

Grabador de bucle implantable

n=4 n=3 n=3 0,88

Sin arritmias, n(%)

0(0) 0(0) 0(0) 0,38

Arritmias, n(%)

2(50) 3 (100) 3 (100)

Taquicardia sinusal

2 3 3

Pausa sinusal

0 1 0

PVC o PSVC

0 0 1

No evaluable

2(50) 0 0

PVC: complejos ventriculares prematuros, NSVT: taquicardia ventricular no sostenida, IVR: ritmo idioventricular, PSVC: complejos supraventriculares prematuros AMI: infarto agudo de miocardio

Claims (22)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Composicion que comprende una cantidad efectiva de por lo menos un inhibidor de un miARN involucrado en la angiogenesis, en la que tal inhibidor se microencapsula en microesferas biodegradables y biocompatibles polimericas, en la que por lo menos 50% de dichas microesferas presentan un diametro comprendido entre 5 y 15 |im, y en la que el dicho por lo menos un inhibidor consiste en un oligonucleotido antisentido dirigido a o que es complementario a miR-92a.
2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, en la que dicho miARN consiste en el miR-92a maduro que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No. 21, 22 o 23 o una secuencia que tiene por lo menos 90% de identidad de nucleotidos con una de las SEC ID No. 21, 22 o 23.
3. 3. La composicion de la reivindicacion 1, en la que el dicho oligonucleotido antisentido es un oligonucleotido de 8-49 nucleotidos de longitud.
4. 4. La composicion de la reivindicacion 1, el dicho oligonucleotido antisentido es por lo menos parcialmente complementario a la secuencia del miARN diana.
5. 5. La composicion de la reivindicacion 1, en la que dicho oligonucleotido antisentido se selecciona del grupo que consiste en un ribonucleotido, un desoxirribonucleotido, un antagomir, un LNA, un PNA, un oligonucleotido de morfolino, o una combinacion de los mismos.
6. 6. La composicion de la reivindicacion 5, en la que que dicho oligonucleotido antisentido es un antagomir.
7. 7. La composicion de la reivindicacion 6, en la que dicho antagomir comprende una secuencia nucleotidica que comprende por lo menos 16 nucleotidos contiguos complementarios a los nucleotidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID No. 1 y 2.
8. 8. La composicion de la reivindicacion 7, en la que dicho antagomir comprende la secuencia de SEC ID No. 59 o 60 y las modificaciones que excluyen las sustituciones de bases de la misma, y fragmentos que consisten en las subsecuencias de SEC ID NO: 59 o 60 de por lo menos 8 nucleotidos contiguos de la misma.
9. 9. La composicion de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dichas microesferas presentan un diametro que no excede 25 |im.
10. 10. La composicion de las reivindicaciones 1 a 9, en la que las microesferas incorporan de 1% a 15% p/p de inhibidor.
11. 11. La composicion de las reivindicaciones 1 a 9, en la que las microesferas incorporan de 1% a 10% p/p de inhibidor.
12. 12. La composicion de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dichas microesferas se elaboran de un polfmero que consiste en poli-d,l-lactida (PLA), siendo el dicho polfmero opcionalmente mezclado con uno o mas de otros polfmeros.
13. 13. La composicion de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dichas microesferas se elaboran de un copolfmero que consiste en poli-d,l-lactida-co-glicolida (PLGA), siendo el polfmero opcionalmente mezclado con uno o mas de otros polfmeros.
14. 14. La composicion de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dichas microesferas se elaboran de una mezcla de polfmeros que consiste en poli-d,l-lactida-co-glicolida (PLGA) y poli-d,l-lactida (PLA).
15. 15. La composicion de la reivindicacion 13 o 14, en la que la relacion de lactida:glicolida en el polfmero de PLGA esta comprendida entre una relacion molar de 50:50 a 95:5.
16. 16. La composicion de las reivindicaciones 13 a 15, en la que la viscosidad inherente del polfmero esta comprendida entre 0,1 y 0,70 dl/g.
17. 17. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para uso en el tratamiento de infarto de miocardio.
18. 18. La composicion de la reivindicacion para uso segun la reivindicacion 17, en la que dicho infarto de miocardio consiste en infarto agudo de miocardio.
19. 19. La composicion de las reivindicaciones 1 a 18 para uso en la reversion o prevencion del remodelado ventricular en un sujeto que lo necesite.
20. 20. Una poblacion de microesferas biodegradables y biocompatibles, para uso en el tratamiento o prevencion de infarto de miocardio, en la que tales microesferas:

    - tienen un diametro promedio comprendido entre 5 y 15 |im;

    - se elaboran de poli-d,l-lactida-co-glicolida (PLGA); poli-d,l-lactida (PLA) o una mezcla de los mismos;

    - incorporan de 1% a 15% p/p de un agente terapeutico capaz de prevenir el remodelado ventricular, en las que el agente terapeutico consiste en un inhibidor antisentido de un miARN que consiste en miR-92a.

    5 21. Las microesferas para uso segun la reivindicacion 20, en las que dicho inhibidor es un antagomir.
21. 22. Un kit que comprende por lo menos i) una composicion segun la reivindicacion 1 a 16 y/o microesferas segun las reivindicaciones 20 o 21, y ii) una jeringuilla o vial o ampolla en la que se coloca la composicion.
22. 23. El kit de la reivindicacion 22, que comprende ademas un disolvente colocado en un recipiente para disolvente.