ES2574625T3

ES2574625T3 - Antagonistas de miARN de oligonucleótido conjugado con aglutinante del surco menor (MGB)

Info

Publication number: ES2574625T3
Application number: ES10788176.5T
Authority: ES
Inventors: Anastasia Khvorova; Annaleen Vermeulen; Rob Kaiser; Jon Karpilow; Nicolaas Vermeulen; Walt Mahoney
Original assignee: Elitechgroup BV; Dharmacon Inc
Current assignee: Elitechgroup BV; Dharmacon Inc
Priority date: 2009-11-25
Filing date: 2010-11-23
Publication date: 2016-06-21
Anticipated expiration: 2030-11-23
Also published as: CA2781618A1; US20120245219A1; ZA201206925B; US8980855B2; JP2013511984A; AU2010324860A1; US20110172289A1; EP2547769B1; EP2547769A1; US9334495B2; CN103025872A; WO2011066312A1

Abstract

Una composición inhibidora para inhibir ARN no codificantes que comprende: un oligonucleótido; y un aglutinante del surco menor (MGB), en la que el oligonucleótido comprende nucleótidos, en la que todos los nucleótidos del oligonucleótido comprenden ribofuranosa que tiene la siguiente estructura:**Fórmula** en la que Rz es -OCH3, en la que B es una base normal o una base modificada; y en la que el MGB está conjugado con el extremo 5' o con el extremo 3' del oligonucleótido; y en la que el oligonucleótido es esencialmente complementario a una secuencia de miARN o ARNpi madura endógena.

Description

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DESCRIPCION

Antagonistas de miARN de oligonucleotido conjugado con aglutinante del surco menor (MGB) Antecedentes

La presente invencion se refiere a composiciones y a procedimientos de inhibicion de las acciones de ARN no codificantes tales como miARN y ARNpi.

La interferencia del ARN es una via casi omnipresente implicada en la modulacion genica posterior a la transcripcion. La molecula efectora clave de la interferencia del ARN es el microARN ("miARN" o "miR"). Estos ARN pequenos, no codificantes, se transcriben como miARN primarios, mostrados en la Figura 1, y son procesados en el nucleo por Drosha (una ribonucleasa de tipo III) para generar estructuras de horquilla cortas denominadas miARN precursores. Estas moleculas se transportan luego al citoplasma y son procesadas por una segunda nucleasa (Dicer) para generar la forma duplex, madura, del miARN que luego se puede incorporar al complejo de silenciamiento inducido por ARN ("RISC"). Las interacciones entre el miARN maduro-complejo RISC y el ARN mensajero diana ("ARNm") estan mediadas (en parte) por la region semilla de la cadena grna del miARN (nucleotidos 2-7), y conducen a la desactivacion genica mediante la escision de transcripciones y/o atenuacion de la traduccion.

Las herramientas que permiten a los investigadores comprender los papeles que los miARN y las dianas de miARN desempenan en la enfermedad, la diferenciacion celular y la homeostasis tienen un valor incalculable. Dichas herramientas incluyen, pero sin limitacion, los inhibidores de miARN. Las clases de inhibidores de miARN se han descrito anteriormente (vease Meister, 2004 y Hutvagner, 2004). Estas moleculas son monocatenarias, vanan en tamano de 21 a 31 nucleotidos ("nts") de longitud y contienen sustituciones de O-metilo en la posicion 2' del anillo de ribosa. Desde el descubrimiento original de los inhibidores de miARN, se han identificado multiples elementos de diseno, que se han incorporado para mejorar la eficacia de estas moleculas en un entorno biologico. Por ejemplo, se ha demostrado que los inhibidores que tienen mayores longitudes o que llevan incorporadas estructuras secundarias (por ejemplo, inhibidores bicatenarios) muestran un rendimiento superior frente a un diseno monocatenario mas corto, de 2l a 31 nucleotidos (Vermeulen y col., 2007). Otros disenos incluyen la incorporacion de acidos nucleicos bloqueados (“LNA") (Orom y col., 2006).

Gracias al artfculo "Investment Firm Accelerator Launches miRNA Drug Developer, Licenses Nanogen MGB Tech" de Doug Macron, publicado en la pagina Web
www.genomeweb.com/print/67776, y al artfculo "Nanogen Spins Out Firm and Plans to Merge with the Elitech Group", que se puede descargar en
www.genengnews.com/kevwordsandtools/print/4/693C. se conocen agentes terapeuticos dirigidos a microARN que se basan en aglutinantes del surco menor. El documento WO2006/020768 describe composiciones que comprenden agentes oligonucleotfdicos modificados qmmicamente para su uso en la inhibicion de la expresion genica.

Sumario

De acuerdo con la presente invencion, se proporciona una composicion inhibidora de acuerdo con la reivindicacion

1. La presente invencion proporciona composiciones y procedimientos de inhibicion de las acciones de los ARN no codificantes tales como miRNA y ARNpi. Las composiciones comprenden oligonucleotidos monocatenarios o bicatenarios conjugados con aglutinantes del surco menor ("MGB"). La longitud de la parte oligonucleotfdica de la composicion puede variar considerablemente. Ademas, el oligonucleotido puede tener incorporadas estructuras secundarias que incluyen, pero sin limitacion, las procedentes de horquillas, protuberancias y/o desapareamientos. Preferentemente, los oligonucleotidos contienen una secuencia que es (al menos) esencialmente complementaria (aproximadamente en un 70 %) a una o varias secuencias de miARN o ARNpi maduras endogenas.

Sin desear quedar ligado a teona alguna, la mejora del rendimiento de los inhibidores de miARN probablemente se debe a una mayor afinidad de union entre el inhibidor y la molecula diana. Por lo tanto, las estrategias alternativas para mejorar la estabilidad del duplex o bloquear el complejo de inhibidor-miARN-RISC en una configuracion mas deseable senan mejorar aun mas la funcionalidad de los disenos actuales de los inhibidores de miARN.

Los oligonucleotidos conjugados con aglutinantes del surco menor ("MGB") pueden formar duplex estables con secuencias complementarias (Kutyavin, 1. V., y col., 2000). Aunque todavfa no se comprende del todo el mecanismo de las acciones de los MGB, se ha sugerido que los MGB provocan cambios conformacionales que mejoran la estabilidad de los duplex. Del mismo modo, se espera que la conjugacion de los MGB a moleculas inhibidoras cortas mejore significativamente su potencia frente a los inhibidores no MGB de tamano similar.

El componente de aglutinante del surco menor tambien puede variar en gran medida e incluir cualquier numero de estructuras. En la patente de EE.UU. n.° 5.801.155 y en la patente de EE.UU. n.° 7.582.739, se pueden encontrar ejemplos no limitantes de las estructuras de los MGB. Estos MGB pueden conjugarse con el extremo 5' y/o 3' de uno o mas oligonucleotidos, o se pueden asociar con uno o mas nucleotidos en el interior de un oligonucleotido.

Las composiciones desveladas en el presente documento son utiles en diversos procedimientos in vivo o in vitro de inhibicion de las acciones del miARN. Por ejemplo, las composiciones se pueden usar en el tratamiento de una

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enfermedad o afeccion caracterizada por la sobreexpresion de un miARN mediante la administracion de una cantidad optima de un antagonista de MGB de la invencion contra dicho miARN.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra un esquema general de la v^a de interferencia del ARN.

La Figura 2(a) muestra un esquema de dos configuraciones de MGB (fracciones de DPI3 y CDPI3) conjugadas con oligonucleotidos. La Figura 2(b) muestra un esquema de las posiciones ilustrativas en las que los MGB se pueden sustituir.

La Figura 3 muestra un esquema del ensayo de la luciferasa doble.

La Figura 4a muestra el rendimiento de multiples disenos de inhibidores de miARN en la construccion indicadora de la luciferasa doble let-7c. La Figura 4b muestra el rendimiento de multiples disenos de inhibidores de miARN en la construccion indicadora de la luciferasa doble miR-21.

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas

I. General

La presente invencion se dirige a composiciones y a procedimientos de inhibicion de la interferencia del ARN, incluyendo ARNip, ARNpi y el silenciamiento genico inducido por miARN.

La presente invencion proporciona composiciones y procedimientos de inhibicion de las acciones de los ARN no codificantes tales como miARN y ARNpi. Las composiciones comprenden oligonucleotidos monocatenarios o bicatenarios conjugados con aglutinantes del surco menor ("MGB") a traves de un engarce. La parte oligonucleotfdica de la molecula se puede componer de ARN, ADN o fubridos de ARN-ADN con cualquiera de los nucleotidos de los anteriores modificados o sin modificar. La longitud de la parte oligonucleotfdica de la composicion puede variar considerablemente, y vana de tan corta como de 6 nucleotidos o pares de bases (por ejemplo, la longitud minima de la region semilla) hasta tan larga como de 100 nucleotidos o pares de bases. Ademas, el oligonucleotido puede llevar incorporadas estructuras secundarias entre las que se incluyen, pero sin limitacion, las procedentes de horquillas, protuberancias y/o desapareamientos. Preferentemente, los oligonucleotidos contienen una secuencia que es (al menos) esencialmente complementaria (aproximadamente en un 70 %) a una o varias secuencias de miARN o ARNpi maduras endogenas.

La Figura 1 es un esquema que describe los detalles mas basicos de la via de interferencia del ARN. Primero se transcriben miARN endogenos como miARN primarios, que consisten, como mmimo, en una estructura de horquilla con regiones flanqueantes 5' y 3'. Los miARN primarios son procesados por Drosha, proporcionando miARN precursores, que consisten en estructuras de horquilla simplificadas. Los miARN precursores son transportados fuera del nucleo al citoplasma, donde vuelven a ser procesados por Dicer en las formas duplex maduras de miARN, que son capaces de entrar en RISC y silenciar la expresion genica mediante cualquier escision de ARNm o atenuacion de la traduccion.

II. Definiciones

A menos que se indique lo contrario, los siguientes terminos y expresiones tienen los significados indicados a continuacion:

El termino "indicador" o la expresion "gen indicador" se refieren a un gen cuya expresion se puede controlar. Por ejemplo, los niveles de expresion de un indicador se pueden analizar para evaluar el exito del silenciamiento de genes por sustratos de la via de interferencia del ARN.

La expresion "complejo de silenciamiento inducido por el ARN" y sus siglas "RISC" se refieren al conjunto de protemas que forman complejos con polinucleotidos monocatenarios tales como el miARN maduro o el ARNip, para dirigirse a moleculas de acido nucleico (por ejemplo, ARNm) para la escision, la atenuacion de la traduccion, la metilacion y/u otras alteraciones. Los componentes conocidos de RISC incluyen, sin limitacion, Dicer, R2D2 y la familia de protemas Argonaute, asf como cadenas de ARNip y miARN.

La expresion "interferencia del ARN" se refiere al procedimiento mediante el cual un polinucleotido (a miARN o ARNip) que comprende al menos una unidad de polirribonucleotido ejerce un efecto sobre un proceso biologico. El procedimiento incluye, pero sin limitacion, el silenciamiento de genes mediante la degradacion de ARNm, la atenuacion de la traduccion, las interacciones con los ARNt, ARNr, ARNnh, ADNc y ADN genomico, asf como la metilacion de ADN con protemas auxiliares.

La expresion "silenciamiento genico" se refiere a un procedimiento mediante el cual la expresion de un determinado producto genico se reduce o se atenua por interferencia del ARN. El nivel de silenciamiento genico (tambien denominado a veces grado de "desactivacion") se puede medir mediante una variedad de medios, incluyendo, pero sin limitacion, la medicion de los niveles de transcripcion por analisis de transferencia Northern, las tecnicas de B-

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ADN, construcciones indicadoras sensibles a la transcripcion, perfiles de expresion (por ejemplo, chips de ADN), qRT-PCR y tecnolog^as relacionadas. Como alternativa, el nivel de silenciamiento se puede medir mediante la evaluacion del nivel de la protema codificada por un gen espedfico. Esto se puede lograr mediante la realizacion de una serie de estudios que incluyen analisis Western, la medicion de los niveles de expresion de una protema indicadora que tenga, por ejemplo, propiedades fluorescentes (por ejemplo, GFP) o actividad enzimatica (por ejemplo, fosfatasas alcalinas) u otros varios procedimientos.

Todos los terminos "microARN", "miARN" o "miR" se refieren a ARN no codificantes (y tambien, segun lo indique el contexto, a secuencias de ADN que codifican dichos ARN) que son capaces de entrar en la via de interferencia del ARN y regular la expresion genica. El "miARN primario" representa la transcripcion no codificante previa al procesamiento por parte de Drosha, e incluye la/s estructura/s de tallo-bucle, asf como las secuencias 5' y 3' flanqueantes. Los "miARN precursores" representan la transcripcion no codificante posterior al procesamiento por parte de Drosha del miARN primario. La expresion "miARN maduro" puede referirse al producto bicatenario procedente del procesamiento por parte de Dicer del miARN precursor o el producto monocatenario que se introduce en RISC tras el procesamiento por parte de Dicer. En algunos casos, solo entra una sola cadena de un miARN en la ruta de interferencia del ARN. En otros casos, dos cadenas de un miARN son capaces de entrar en la via de interferencia del ARN.

La expresion "cadena madura" se refiere a la secuencia de un miARN endogeno que es el complemento inverso total o parcial de (es decir, es total o parcialmente complementario a) un ARN diana de interes. Las expresiones "secuencia madura" o "cadena de direccion" y "secuencia de direccion" son sinonimos del termino "cadena madura", y se usan indistintamente en el presente documento.

Las expresiones "inhibidor de MGB", "inhibidor de miARN de MGB", "antagonista de MGB" y "antagonista de miARN de oligonucleotido-MGB" se usan indistintamente, y se refieren a una molecula que tiene un componente oligonucleotfdico conjugado con un aglutinante del surco menor ("MGB") y que es capaz de inhibir la accion de un miARN o ARNpi.

La expresion "secuencia diana" se refiere a una secuencia de un ARN o un ADN diana que es parcial o totalmente complementaria a la cadena madura. La secuencia diana se puede describir usando las cuatro bases de ADN (A, T, G y C) o las cuatro bases de ARN (A, U, G y C).

La expresion "ARN diana" se refiere a un ARN espedfico que se dirige por la via de interferencia del ARN, generando una reduccion de la actividad funcional del ARN. En algunos casos, el ARN diana es un ARNm cuya actividad funcional es su capacidad de ser traducido. En dichos casos, la via de interferencia del ARN disminuira la actividad funcional del ARNm mediante la atenuacion de la traduccion o por escision. En la presente divulgacion, los ARN diana son miARN, RNApi o moleculas relacionadas, cuya funcion puede inhibirse mediante la union. El termino "diana" tambien puede referirse a ADN.

El termino "complementario" se refiere a la capacidad de los polinucleotidos para formar pares de bases entre sf. Los pares de bases normalmente se forman mediante enlaces de hidrogeno entre unidades de nucleotidos de cadenas de polinucleotidos antiparalelas. Las cadenas de polinucleotidos complementarias pueden formar pares de bases de la forma de Watson-Crick (por ejemplo, A con T, A con U, C con G), o en cualquier otra forma que permita la formacion de duplex, incluyendo el par de bases oscilante formado entre U y G. Como los expertos en la materia saben, al usar ARN en lugar de ADN, el uracilo en lugar de la timina es la base que se considera que es complementaria a la adenosina. Sin embargo, cuando, en el contexto de la presente invencion, se indica un U, esta implfcita la capacidad de sustituir una T, a menos que se indique lo contrario.

El termino "duplex" se refiere a una estructura bicatenaria formada por dos polinucleotidos complementarios o esencialmente complementarios que forman pares de bases entre sf, incluyendo pares de bases de Watson-Crick y pares oscilantes de U-G que permiten una estructura bicatenaria estabilizada entre las cadenas de polinucleotidos que son al menos parcialmente complementarias. Las cadenas de un duplex no necesitan ser perfectamente complementarias para que se forme un duplex, es decir, un duplex puede incluir uno o mas desapareamientos de bases. Ademas, se pueden formar duplex entre dos regiones complementarias dentro de una sola cadena (por ejemplo, una horquilla).

El termino "nucleotido" se refiere a un ribonucleotido o a un desoxirribonucleotido o a una forma modificada de los mismos, asf como a un analogo de los mismos. Los nucleotidos incluyen especies que comprenden purinas, por ejemplo, adenina, hipoxantina, guanina, y sus derivados y analogos, asf como pirimidinas, por ejemplo, citosina, uracilo, timina, y sus derivados y analogos. Los analogos de nucleotidos incluyen nucleotidos que tienen modificaciones en la estructura qrnmica de la base, azucar y/o fosfato, incluyendo, pero sin limitacion, las modificaciones en la pirimidina de la posicion 5, modificaciones en la purina de la posicion 8, modificaciones en aminas exodclicas de la citosina y la sustitucion de 5-bromo-uracilo; y las modificaciones en el azucar de la posicion 2', incluyendo, pero sin limitacion, ribonucleotidos de azucar modificado en los que el OH de 2' se reemplaza por un grupo tal como un H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 o CN, en los que R es una fraccion alquilo. Los analogos de nucleotidos tambien pretenden incluir nucleotidos con bases tales como inosina, queuosina, xantina, azucares tales como 2'-metilribosa, enlaces fosfodiester no naturales tales como en los etilfosfonatos, fosforotioatos y

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peptidos.

Las bases modificadas se refieren a bases de nucleotido tales como, por ejemplo, adenina, guanina, citosina, timina, uracilo, xantina, inosina y queuosina que han sido modificadas mediante el reemplazo o la adicion de uno o mas atomos o grupos. Algunos ejemplos de los tipos de modificaciones que pueden comprender nucleotidos que estan modificados con respecto a las fracciones de base incluyen, pero sin limitacion, bases alquiladas, halogenadas, tioladas, aminadas, amidadas o acetiladas, individualmente o en combinacion. Los ejemplos mas concretos incluyen, por ejemplo, 5-propiniIuridina, 5-propinilcitidina, 6-metiladenina, 6-metilguanina, W,W-dimetiladenina, 2-propiladenina, 2-propilguanina, 2-aminoadenina, 1-metilinosina, 3-metiluridina, 5-metilcitidina, 5-metiluridina y otros nucleotidos que tienen una modificacion en la posicion 5, 5-(2-amino)propil-uridina, 5-halocitidina, 5-halouridina, 4-acetilcitidina, 1- metiladenosina, 2-metiladenosina, 3-metilcitidina, 6-metiluridina, 2-metilguanosina, 7-metilguanosina, 2,2- dimetilguanosina, 5-metilaminoetiluridina, 5-metiloxiuridina, desazanucleotidos tales como 7-desaza-adenosina, 6- azouridina, 6-azocitidina, 6-azotimidina, 5-metil-2-tiouridina, otras bases tio tales como 2-tiouridina y 4-tiouridina y 2- tiocitidina, dihidrouridina, pseudouridina, queuosina, arcaeosina, naftilo y grupos naftilo sustituidos, cualquier purina y pirimidina O- y N-alquilada tal como N6-metiladenosina, 5-metilcarbonilmetiluridina, acido 5-oxiacetico de uridina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo y grupos fenilo modificados tales como aminofenol o 2,4,6-trimetoxi-benceno, citosinas modificadas que actuan como nucleotidos sujetos a G, adeninas y guaninas 8-sustituidas, uracilos y timinas 5-sustituidos, azapirimidinas, nucleotidos de carboxihidroxialquilo, nucleotidos de carboxialquilamino y nucleotidos alquilcarbonilalquilados. Los nucleotidos modificados tambien incluyen aquellos nucleotidos que estan modificados con respecto a la fraccion de azucar, tales como aquellos que contienen un puente de metileno 2'-O, 4'- C, asf como nucleotidos que tienen azucares o analogos de los mismos que no son ribosilo. Por ejemplo, las fracciones de azucar pueden ser, o estar basadas en, manosas, arabinosas, glucopiranosas, galactopiranosas, 4'- tiorribosa y otros azucares, heterociclos o carbociclos.

El termino nucleotido tambien pretende incluir lo que se conoce en la tecnica como bases universales. A modo de ejemplo, las bases universales incluyen, pero sin limitacion, 3-nitropirrol, 5-nitroindol o nebularina. El termino "nucleotido" tambien pretende incluir el fosforamidato N3' a P5', producido por la sustitucion de un oxfgeno 3' de ribosilo con un grupo amina. Ademas, el termino nucleotido tambien incluye aquellas especies que tienen un marcador detectable tales como, por ejemplo, una fraccion radioactiva o fluorescente, o un marcador de masa unido al nucleotido.

III. Descripcion de las realizaciones

En una realizacion, un inhibidor de miARN de MGB comprende un componente oligonucleotfdico y una combinacion de engarce y MGB, teniendo el engarce de aproximadamente 3 a 100 atomos de cadena principal, seleccionados entre C, O, N, S, P y Si. El engarce puede ser un engarce trivalente, una cadena alifatica ramificada, una cadena de heteroalquilo, una o mas estructuras anulares sustituidas, o combinaciones de los mismos. En una realizacion preferida, el inhibidor comprende un oligonucleotido monocatenario que (1) puede variar entre 6 y 100 nucleotidos de longitud; (2) tiene regiones que son esencialmente complementarias a uno o mas miARN o ARNpi maduros, o partes de miARN o ARNpi maduros; y (3) se conjuga con uno o mas aglutinantes del surco menor (MGB) a traves de un engarce. Preferentemente, la molecula comprende un MGB que es DPI3 o CDPI3.

Otra realizacion se refiere a un procedimiento de modulacion de la expresion genica; procedimiento que comprende introducir en una celula, in vitro, un inhibidor de miARN de MGB a una concentracion que inhiba la funcion de un acido nucleico diana, preferentemente de un miARN o ARNpi.

Otro aspecto se refiere a un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o afeccion producida como consecuencia de la mala expresion de un gen o de la expresion de un gen que tiene una funcion no deseada. El procedimiento comprende la administracion de cantidades suficientes de uno o mas inhibidores de miARN de MGB desvelados en el presente documento, con o sin un vetuculo farmaceutico adecuado, a un paciente sospechoso de tener dicha enfermedad o afeccion.

Preferentemente se modifican uno o mas nucleotidos de la parte oligonucleotidica del inhibidor de MGB. La modificacion preferida es una modificacion O-alquilo del atomo de carbono 2' del anillo de ribosa de algunos o todos los nucleotidos. Dichas modificaciones mejoran en gran medida la afinidad de la molecula por el acido nucleico diana. Dicho esto, los inhibidores de MGB de la invencion presentan varias mejoras con respecto a los inhibidores monocatenarios modificados, simples, de longitud equivalente. Lo mas importante es que los inhibidores de MGB presentan una mayor potencia de silenciamiento.

Cuando se desarrollan los inhibidores de MGB altamente funcionales descritos en el presente documento, se tienen en cuenta multiples elementos de diseno. Estos incluyen (1) disenos de una sola cadena frente a los de multiples cadenas; (2) la longitud del oligonucleotido; (3) el contenido de oligonucleotido (de la parte de direccion y/o de las partes de no direccion del oligonucleotido); (4) las modificaciones qmmicas de los oligonucleotidos; (5) el tipo de conjugado de MGB; (6) la posicion del conjugado de MGB en el oligonucleotido; y (7) el tipo de engarce que se usa para asociar la fraccion de MGB con el oligonucleotido. Las siguientes descripciones abordan cada uno de estos elementos con mayor detalle.

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A. Diseno del inhibidor

Los disenos del inhibidor que son compatibles con las mejoras del MGB incluyen los disenos tanto de una sola cadena como de multiples cadenas. Por ejemplo, la parte oligonucleotidica del inhibidor puede ser monocatenaria, completamente bicatenaria, o una combinacion de regiones monocatenarias y bicatenarias (por ejemplo, la que contiene bucle/s de horquilla). En el documento WO2007/095387, se puede encontrar mas informacion sobre los disenos de inhibidores compatibles con los MGB.

B. Longitud del oligonucleotido

La longitud del oligonucleotido que esta asociado con un MGB puede variar dependiendo de una serie de factores entre los que se incluyen la longitud del miARN endogeno al que se dirige la molecula y los atributos de diseno deseados del inhibidor. Los miARN maduros pueden variar de aproximadamente 18 pb a 28 pares de bases de longitud. Como tal, en una realizacion, la longitud del oligonucleotido conjugado con el MGB es el complemento inverso a la cadena madura del miARN diana. Los complementos inversos de todos los miARN conocidos se pueden determinar a partir de secuencias de la cadena madura de miARN que se pueden encontrar en la miRBase (
https://microrna.sanger.ac.uk/). mantenida por el Instituto Sanger. Cabe senalar que se predice que la lista de las secuencias disponibles en la miRBase aumentara a medida que vaya aumentando el numero de secuencias de miARN de todas las especies. Como tal, se espera que el numero de posibles secuencias a las que dirigir los inhibidores de MGB crezca.

En otros casos, los estudios han demostrado que el rendimiento de los inhibidores no de MGB aumenta al aumentar la longitud (vease Vermeulen y col., 2007). Como tal, en otra realizacion, los inhibidores de MGB pueden incluir secuencias que flanqueen la secuencia que es el complemento inverso del miARN diana. La longitud de estas secuencias vana enormemente (de 5 a 100 nucleotidos en el extremo 5' y/o 3') y puede comprender: (1) el complemento inverso de las secuencias que flanquean la secuencia madura del miARN precursor o miARN primario; o (2) las secuencias parcialmente relacionadas o no relacionadas con el complemento inverso del miARN precursor o miARN primario.

C. Componente MGB de los inhibidores de miARN de MGB

En el diseno de inhibidor de MGB, se pueden incorporar multiples MGB. En un ejemplo no limitante, los ligandos de aglutinante del surco menor DPI3 y CDPI3 se pueden unir al oligonucleotido en cualquier serie de orientaciones usando una amplia seleccion de qmmicas de engarces conocidas en la tecnica. Preferentemente, los aglutinantes del surco menor se conjugan con el extremo bien 3' o 5' de la cadena del inhibidor que es el complemento inverso de, por ejemplo, la cadena de direccion del miARN diana.

La Figura 2(a) es un esquema de dos configuraciones de MGB (fracciones DPI3 y CDPI3) conjugadas con oligonucleotidos. La Figura 2(b) es un esquema que muestra las posiciones en las que los MGB se pueden sustituir. En la Figura 2(b), W es un engarce que tiene de aproximadamente 3 a 100 atomos de cadena principal, seleccionados entre C, O, N, S, P y Si. En general, W representa un engarce trivalente, una cadena alifatica ramificada, una cadena de heteroalquilo, una o mas estructuras anulares sustituidas, o combinaciones de los mismos. [A-B]n representa un oligomero de acido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, PNA o cualquier combinacion de los mismos, incluyendo aquellos con bases y azucares modificados), en el que A representa una cadena principal de fosfato de azucar, cadena principal de fosfato de azucar modificada, cadena principal de acido nucleico bloqueada, cadena principal peptfdica o una variante de las mismas usada en la preparacion de acido nucleico; y B representa una base de acido nucleico, una base modificada o un analogo de base como se describe en mas detalle a continuacion. El submdice n es un numero entero de aproximadamente 3 a aproximadamente 100, preferentemente de 6 a aproximadamente 50 y mas preferentemente de 8 a aproximadamente 20. Los sfmbolos Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf representan sustituyentes seleccionados entre H, halogeno, alquilo (C1.Cs), ORg, N(Rg)2, N+(Rg)3, SRg, CORg, CO2Rg, CON(Rg)2, (CH2)mSO3-, (CH2)mCO2-, (CH2)mOPOs y NHC(O)(CH2)mCO2-, y esteres y sales de los mismos, en los que cada Rg es independientemente H o alquilo (C1.Cs), y el submdice m es un numero entero de 0 a 6. El sfmbolo Rh y Rw representa H o un grupo (normalmente, el vestigio de un grupo de union usado en la smtesis en fase solida) que tiene de 1 a 30 atomos seleccionados entre C, N, O, P y S, que es bien dclico, adclico o una combinacion de los mismos, y que tiene atomos de hidrogeno adicionales para llenar las valencias disponibles. En la publicacion de solicitud de patente EE.UU. n.° 2005/0118623, se pueden encontrar ejemplos adicionales de sustituyentes.

Como se ha indicado anteriormente, el sustituyente A puede incluir una cadena principal de fosfato de desoxirribofuranosa o una cadena principal de fosfato de ribofuranosa. En realizaciones preferidas, la ribofuranosa esta sustituida como se muestra a continuacion:

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en la que Rz es -ORaa, donde Raa es -O-alquiloi-12, -(CH2)nO-alquiloi-i2, donde n es de 1 a 6, halogeno o -CF3; y B es una base normal o una base modificada como se ha definido anteriormente o en la patente de EE.UU. n.° 7.045.610. La cadena principal de fosfato de los oligonucleotidos modificados descritos anteriormente tambien se puede 5 modificar de manera que los oligonucleotidos contengan enlaces de fosforotioato y/o metilfosfonatos y/o fosforamidatos (Chen y col., Nucl. Acids Res., 23:2662-2668 (1995)). Las combinaciones de enlaces oligonucleotfdicos en conjugados de MB-oligonucleotido tambien pertenecen al ambito de la presente invencion. Hay otras modificaciones mas de la cadena principal que son conocidas por los expertos en la materia.

Algunos aglutinantes del surco menor contienen diferentes unidades de repeticion. Los aglutinantes del surco menor 10 preferidos son:

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en los que el subrndice m es un numero entero de 2 a 5; el subrndice r es un numero entero de 2 a 10; y cada Ra y Rb es independientemente un grupo de union al oligonucleotido (ya sea directa o indirectamente a traves de un desactivador), H, -ORc, -NRcRd, -COORc o -CONRcRd, en los que cada Rc y Rd se selecciona entre H, heteroalquilo 15 (C2-C12), heteroalquenilo (C3-C12), heteroalquinilo (C3-C12), alquilo (C1-C12), alquenilo (C2-C12), alquinilo (C2-C12),

arilalquilo (C1.C12) y arilo, con la condicion de que uno de Ra y Rb representa una grupo de union a un ODN o fluoroforo. En una realizacion adicional, cada uno de los anillos de cada estructura puede contener una o mas sustituciones adicionales seleccionadas entre H, halogeno, alquilo (C1.Cs), ORg, N(Rg)2, N+(Rg)3, SRg, CORg, CO2Rg, CON(Rg)2, (CH2)mSO3-, (CH2)mCO2-, (CH2)mOPO3-2 y NHC(O)(CH2)mCO2-, AsO'32-, y esteres y sales de los mismos, 20 en los que cada Rg es independientemente H o alquilo (C1-Cs), y el subrndice m es un numero entero de 0 a 6. En las publicaciones de solicitud de patente de EE.Uu. n.° 2004/32665 y 2006/0229441, se puede encontrar mas informacion sobre estas estructuras.

En la patente de EE.UU. n.° 6.312.894, se han desvelado otros aglutinantes del surco menor de interes. En un grupo de realizaciones, el MGB se selecciona del grupo que consiste en CC1065, lexitropsinas, distamicina, netropsina, 25 berenil, duocarmicina, pentamidina, 4,6-diamino-2-fenilindol, estilbamidina, bis(guanilhidrazona) de 4,4'- diacetildifenilurea (DDUG) y pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepinas o cualquiera de sus analogos.

D. Contenido de oligonucleotido de un inhibidor de MGB

La parte oligonucleotfdica de los inhibidores de MGB puede consistir en ARN, ADN, hforidos de ARN-ADN y modificaciones de los mismos. En general, la secuencia de la misma parte de cada inhibidor esta disenada para ser 30 el complemento inverso de un miARN dado expresado por la celula de interes. Como alternativa, en los casos en los que un miARN no es mas que un representante de una familia de secuencias relacionadas (por ejemplo, la familia let-7), la parte oligonucleotfdica del inhibidor de MGB puede comprender el complemento inverso de, por ejemplo, un miembro de la familia, pero tienen una o mas protuberancias o desapareamientos de pares de bases cuando se alinean con otros miembros de la familia de miARN. Como tal, preferentemente la parte oligonucleotfdica del 35 inhibidor de MGB tiene al menos del 70 al 80 % de complementariedad con un miARN diana. Mas preferentemente, la parte oligonucleotfdica del inhibidor de MGB tiene al menos del 80 al 99 % de complementariedad con un miARN diana. Y lo mas preferentemente, la parte oligonucleotfdica del inhibidor de MGB tiene el 100% de complementariedad con un miARN diana.

Los nucleotidos de la parte oligonucleotfdica de los inhibidores de MGB pueden contener una variedad de modificaciones qmmicas que mejoren la capacidad de resistencia contra la accion de nucleasas, la capacidad de administracion de la molecula a las celulas, la especificidad o la estabilidad del duplex (es decir, entre el miARN diana y la parte oligonucleotfdica del inhibidor de MGB). Las modificaciones qmmicas que proporcionan estas 5 caractensticas deseadas son bien conocidas en la tecnica, e incluyen, pero sin limitacion, las

alteraciones/modificaciones de la base, el enlace internucleotfdico, asf como el residuo de azucar del oligonucleotido. Algunas modificaciones preferidas se enumeran a continuacion y se describen en la patente de EE.UU. n.° 7.045.610. Estas incluyen modificaciones de 2'-O-alquilo (por ejemplo, 2'-O-metilo), modificaciones de 2'- halogeno (por ejemplo, 2'F), modificaciones de colesterol 5' y/o 3', y mas. Ademas, los inhibidores de MGB pueden 10 incluir modificaciones adicionales que proporcionen atributos beneficiosos a la/s molecula/s. Asf pues, por ejemplo, los inhibidores de MGB se pueden modificar adicionalmente con, por ejemplo, colorantes fluorescentes, asf como, por ejemplo, modificaciones de colesterol para mejorar la visualizacion y la administracion de los inhibidores de MGB, respectivamente.

A continuacion, se muestra un ejemplo de una modificacion que puede estar asociada con la cadena principal 15 polimerica de los antagonistas de MGB:

imagen3

en la que Rz es -H y R—CEC-CH2CH2OH. Esta estructura tambien se conoce como Super A.

E. Procedimiento de introduccion y deteccion de los efectos de los inhibidores de MGB

Los inhibidores de la presente invencion se pueden usar in vitro o administrarse a una celula o a un animal, 20 incluyendo los seres humanos, mediante cualquier procedimiento conocido para un experto en la materia. Por ejemplo, las moleculas de la invencion se pueden administrar de forma pasiva a las celulas. La absorcion pasiva de un inhibidor se puede modular, por ejemplo, mediante la presencia de un conjugado tal como una fraccion de polietilenglicol o una fraccion de colesterol, o cualquier otra fraccion hidrofoba asociada con el extremo 5', el extremo 3', o regiones internas del oligonucleotido. Como alternativa, la administracion pasiva se puede modular mediante la 25 conjugacion de un ligando que es absorbido por una celula a traves de endocitosis mediada por receptor. Otros procedimientos de administracion de inhibidores incluyen, pero sin limitacion, tecnicas de transfeccion (usando tecnicas de transfeccion directa o inversa) empleando DEAE-dextrano, fosfato de calcio, lfpidos/liposomas cationicos, microinyeccion, electroporacion, immunoporacion y el acoplamiento de los inhibidores a conjugados o ligandos espedficos tales como anticuerpos, peptidos, antfgenos o receptores.

30 El procedimiento de evaluacion del nivel de inhibicion no se limita a uno en particular. Por lo tanto, los efectos de cualquier inhibidor se pueden estudiar mediante uno de cualquier serie de procedimientos ensayados que incluyen, pero sin limitacion, analisis Northern, RT-PCR, perfiles de expresion, y otros. En un procedimiento preferido, se modifica un indicador que codifica un vector o un plasmido cuyo producto proteico se ensaya facilmente para que contenga el sitio diana (complemento inverso del miARN, ARNpi o ARNip maduro) en la UTR 5', el ORF o la UTR 3' 35 de la secuencia. Dichos genes indicadores incluyen fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), protema verde fluorescente (GFP), variantes de luciferasa (Luc) y sus derivados. En ausencia del inhibidor, los miARN endogenos (o anadidos exogenamente) se dirigen al ARNm indicador para el silenciamiento (bien por escision de la transcripcion o por atenuacion de la traduccion) lo que conduce a un bajo nivel global de expresion del indicador. Por el contrario, en presencia de los inhibidores de la invencion, la direccion 40 mediada por los miARN (ARNpi o ARNip) se suprime, dando asf lugar a un mayor nivel de expresion del indicador. Las construcciones indicadoras preferidas incluyen el indicador de luciferasa doble psiCHECK-2 (Promega).

IV. Aplicaciones

Los inhibidores de la presente invencion se pueden usar en un conjunto diverso de aplicaciones, incluyendo la investigacion basica. Por ejemplo, la presente invencion se puede usar para validar si un miARN o la diana de un 45 miARN es una diana para el descubrimiento o el desarrollo de farmacos. Los inhibidores de la invencion que inhiben un determinado miARN o grupo de miARN se introducen en una celula o en un organismo, y dicha celula o dicho

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organismo se mantiene en condiciones que permitan la inhibicion espedfica de la molecula diana. Luego se mide el grado de cualquier reduccion de la expresion o la actividad de la diana, junto con el efecto de dicha reduccion de la expresion o actividad, y se determina que si se reduce la expresion o la actividad, entonces la diana es un agente para el descubrimiento o el desarrollo de farmacos. De esta manera, los efectos fenotipicos pueden estar asociados con la inhibicion de la diana particular de interes y, en los casos apropiados, se pueden realizar estudios de la toxicidad y farmacocinetica, y desarrollarse preparados terapeuticos.

Las moleculas de la invencion se pueden usar para inhibir una o varias dianas simultaneamente. La desactivacion de varias dianas puede tener lugar mediante la introduccion de combinaciones de inhibidores dirigidos a diferentes moleculas. Los disenos de inhibidores anteriores caredan de potencia y, como tales, requenan altas concentraciones para inhibir parcialmente, por ejemplo, un solo miARN. La introduccion de combinaciones de inhibidores usando los disenos anteriores requerina concentraciones excesivamente altas que podnan ser citotoxicas. Por el contrario, la potencia mejorada de las moleculas de la invencion permite a los usuarios inhibir una o mas dianas espedficas a concentraciones que conservan la funcionalidad global de la via de interferencia del ARN con los mmimos efectos inespedficos.

Dado que los inhibidores de la invencion actuan independiente del tipo de celula o especie en la que se introducen, la presente invencion es aplicable en una amplia seleccion de organismos, incluyendo, pero sin limitacion, plantas, animales, protozoos, bacterias, virus y hongos. La presente invencion es particularmente ventajosa para su uso en marnfferos tales como ganado vacuno, caballos, cabras, cerdos, ovejas, perros, aves, roedores tales como hamsteres, ratones y ratas, y primates tales como gorilas, chimpances, y seres humanos.

La presente invencion se puede usar ventajosamente con diversos tipos de celulas, incluyendo, pero sin limitacion, celulas primarias y celulas somaticas. Por ejemplo, los tipos de celulas pueden ser adipocitos, fibroblastos, miocitos, cardiomiocitos, endotelio, neuronas, celulas gliales, celulas sangumeas, megacariocitos, linfocitos, macrofagos, neutrofilos, eosinofilos, basofilos, mastocitos, leucocitos, granulocitos, queratinocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos y celulas de las glandulas endocrinas o exocrinas. Es importante senalar que la presente invencion se puede usar para inhibir una amplia seleccion de miARN, ARNpi, incluyendo, pero sin limitacion: (1) miARN y ARNpi del genoma humano implicado en enfermedades tales como diabetes, enfermedad de Alzheimer y cancer; y (2) los asociados con los genomas de patogenos (por ejemplo, virus patogenos).

Es mas, la presente invencion se puede usar en aplicaciones de interferencia del ARN tales como aplicaciones de diagnostico, profilacticas y terapeuticas, incluyendo el uso de las composiciones en la fabricacion de un medicamento en animales, preferentemente mairnferos, mas preferentemente seres humanos en el tratamiento de enfermedades. En particular, los agentes de la invencion se pueden usar para revertir la accion de los miARN o ARNpi que se estan usando como agentes terapeuticos.

En el caso de tener fines terapeuticos o profilacticos, las dosis de los medicamentos fabricados de acuerdo con la presente invencion pueden variar de microgramos por kilogramo a cientos de miligramos por kilogramo de un sujeto. Como se sabe en la tecnica, la dosificacion variara de acuerdo con la masa del mamffero que recibe la dosis, la naturaleza del mamffero que recibe la dosis, la gravedad de la enfermedad o del trastorno y la estabilidad del medicamento en el suero del sujeto, entre otros factores bien conocidos por los expertos en la materia. Para estas aplicaciones, un organismo sospechoso de tener una enfermedad o un trastorno que es susceptible a la modulacion mediante la manipulacion de un acido nucleico diana de interes en particular se trata mediante la administracion de los inhibidores de la invencion. Los resultados del tratamiento pueden ser de mejora, paliativos, profilacticos y/o de diagnostico de una enfermedad o un trastorno en particular.

Las aplicaciones terapeuticas o profilacticas de la presente invencion se pueden realizar con una variedad de composiciones terapeuticas y procedimientos de administracion. Los vehfculos y diluyentes farmaceuticamente aceptables son conocidos por los expertos en la materia. Los procedimientos de administracion a celulas y organismos tambien son conocidos por los expertos en la materia. Las pautas posologicas, por ejemplo, se sabe que dependen de la gravedad y del grado de capacidad de respuesta de la enfermedad o del trastorno que se vaya a tratar, con un curso de tratamiento que abarca de dfas a meses, o hasta que se consigue el efecto deseado sobre el trastorno o el estado patologico. La administracion cronica de inhibidores de la invencion puede ser necesaria para obtener efectos deseados duraderos con algunas enfermedades o trastornos. Las pautas posologicas adecuadas se pueden determinar mediante, por ejemplo, la administracion de cantidades variables de uno o mas inhibidores en un vehfculo o diluyente farmaceuticamente aceptable, por una via de administracion farmaceuticamente aceptable, y la cantidad de farmaco acumulado en el cuerpo del organismo receptor se pueden determinar en diversos momentos tras la administracion. Del mismo modo, el efecto deseado se puede medir en diversos momentos despues de la administracion del inhibidor, y estos datos se pueden correlacionar con otros datos farmacocineticos, tales como la acumulacion en el organismo o en un organo. Los expertos pueden determinar las dosis optimas, pautas posologicas y similares. Los expertos pueden emplear datos de CE50 de modelos animales in vivo e in vitro como grnas para los estudios en seres humanos.

Los inhibidores de la invencion se pueden administrar en una crema o pomada topica, un preparado oral tal como una capsula o un comprimido, una suspension o una solucion, y similares. La via de administracion puede ser intravenosa, intramuscular, dermica, subdermica, cutanea, subcutanea, intranasal, oral, rectal, por colirio, por la

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implantacion en tejido de un dispositivo que libere el inhibidor en una ubicacion ventajosa, tal como cerca de un organo o de un tejido, o tipo de celula que alberga un acido nucleico diana de interes.

Las realizaciones anteriores se presentan con el fin de ayudar a comprender la presente invencion y, bajo ningun concepto, deben pretenden ser ni se deben interpretar como limitantes de la invencion.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no limitar, la presente invencion reivindicada.

Ejemplo 1. Preparacion de inhibidores de MGB

Se prepararon oligonucleotidos modificados con DPl3 usando el soporte solido de smtesis de ADN de DPl3 como se describe en la patente de EE.UU. n.° 7.381.818. En la preparacion de los oligonucleotidos modificados con CDPh, se realizaron las siguientes etapas.

1. Purificacion mediante HPLC e intercambio de sales de los oligos modificados con amina. Se disolvieron oligonucleotidos modificados con amina (escala de smtesis de 0,2-1 jl) en tampon de TEAB 0,1 M (bicarbonato de trietilamonio) hasta ~ 1 ml, y se cromatografiaron en una columna Luna C18 (10 jm) de 4,6 x 250 mm (Phenominex), eluyendo con un gradiente de CH3CN en tampon de TEAB 0,1 M. Se recogio la fraccion que contema el producto y se seco en un concentrador SpeedVac hasta que se obtuvieron microgranulos secos.

2. Reaccion de conjugacion con CDPh. Se anadio a cada tubo que contema un oligonucleotido modificado con amina (escala de smtesis de ADN inicial de 0,2-1 jl) una solucion de 1 mg de CDPh TFP ester mostrado a continuacion (y tambien descrito ademas en la patente de EE.UU. n.° 5.801.155) y 2 ml de TEA en 80 jl de DMSO. Se agitaron suavemente los tubos con movimientos vorticiales para disolver los solidos. Se dejo que las reacciones de conjugacion se produjeran durante 5-18 h.

imagen4

3. Purificacion del conjugado. Se diluyeron las reacciones con 2 ml de tampon de TEAB 0,1 M, se cargaron en una columna Luna C18 y se eluyeron con un gradiente (CH3CN al 8-40%) en tampon de TEAB 0,1 M. Se recogio la fraccion que contema el producto y se seco en un concentrador SpeedVac hasta que se obtuvieron microgranulos secos.

Ejemplo 2. Ensayo de evaluacion de la funcion inhibidora del miARN

Para la mayona de los experimentos publicados, la cuantificacion del nivel de inhibicion se realizo usando el sistema indicador de luciferasa doble, psiCheck 2 (Promega). La Figura 3 es un esquema del ensayo de luciferasa doble. El indicador de luciferasa doble contiene tanto (1) el indicador Fluc como (2) un indicador Rluc que contiene un sitio diana de miARN (sitio diana de miR-X) en la UTR 3'. En casos en los que (1) hay un control del inhibidor del miARN no diana presente; y (2) se expresa un miARN endogeno (miARN-X) capaz de dirigir la construccion Rluc, se suprime la proporcion relativa de Rluc con respecto a Fluc. Por el contrario, cuando tambien hay presente un inhibidor de miARN capaz de dirigirse el miARN expresado de forma endogena (miARN-X), la capacidad del miARN para dirigirse a la construccion Rluc se suprime y, por lo tanto, se aumenta la proporcion de Rluc con respecto a Fluc.

En resumen, el plasmido psiCheck codifica dos variantes de luciferasa, de Renilla y luciernaga. Se insertaron las secuencias diana en el sitio de clonacion multiple de la UTR 3' del gen de la luciferasa de Renilla, permitiendo de este modo el uso de la secuencia de luciernaga como un control interno. Para determinar la viabilidad de diferentes disenos de inhibidores, se transfectaron conjuntamente el/los oligonucleotido/s de la invencion y el plasmido psiCheck 2 modificado a celulas (100 ng de ADN indicador por pocillo, inhibidor 25-100 nM, lfpido = DharmaFECT Duo, Thermo Fisher Scientific). De veinticuatro a noventa y seis horas despues, se lisaron las celulas y se

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determinaron las cantidades relativas de cada luciferasa usando el ensayo Dual Glo (Promega). En ninguno de los experimentos, a menos que se especifique lo contrario, se observaron niveles significativos de toxicidad celular.

Se midieron las actividades de las luciferasas de luciernaga y Renilla usando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo™ (Promega, n.° de cat. E2980) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con una ligera modificacion. Al lisar las celulas, se aspiro el medio de crecimiento de las celulas antes de la adicion de 50 pl de sustrato de luciferasa de luciernaga y 50 pl de sustrato de luciferasa de Renilla.

Todos los ensayos de luciferasa se leyeron con un contador de multiples marcadores Victor2 1420 de Wallac (Perkin Elmer), usando los programas segun las recomendaciones de los fabricantes.

Diseno experimental y analisis de datos: todos los tratamientos se realizaron por triplicado. Ademas, cada tratamiento experimental con un plasmido indicador se duplico con el plasmido de control psiCHEC™-2 (sin insercion). Para tener en cuenta los efectos inespedficos sobre los plasmidos indicadores, los resultados experimentales se expresan como una proporcion normalizada (Rluc/Fluc)norma: la proporcion de la expresion de la luciferasa de Renilla con respecto a la expresion de la luciferasa de luciernaga para un plasmido indicador de miARN dado (Rluc/Fluc)miARN dividida entre la proporcion (Rluc/Fluc)control para el plasmido indicador psiCHEC™-2 tratado de forma identica. Los valores maximos obtenidos a partir del plasmido indicador vanan debido a la secuencia. Lo ideal es que los valores en torno a 1 indiquen una baja funcion de miARN, mientras que los valores cercanos a cero indiquen una alta funcion de miARN. Los datos se presentan como la media de los tres pocillos, y las barras de error son la desviacion estandar de las tres proporciones (Rluc/Fluc)miARN del tratamiento experimental, a escala por el factor de normalizacion (la media de (Rluc/Fluc)control). Aunque las proporciones no siguen una distribucion normal, los valores de la desviacion estandar dan una buena idea de la variabilidad de los datos.

En los casos en los que se compararon los valores entre los diferentes plasmidos indicadores de miARN, se uso la proporcion (Rluc/Fluc)norma normalizada maxima como un factor de escala adicional para que todos los indicadores tuvieran un maximo de aproximadamente 1. La escala adicional se realizo para facilitar la comparacion, y no afecta a los resultados.

Cultivo de celulas. Se cultivaron celulas HeLa en condiciones convencionales y se liberaron del soporte solido mediante tratamiento con tripsina. Para la mayona de los ensayos, las celulas se diluyeron a 1 x 105 celulas/ml, seguido de la adicion de 100 pl de celulas/pocillo. Entonces, se incubaron las placas durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %.

Ejemplo 3. Ensayo de diferentes disenos de inhibidores de aglutinantes del surco menor

Usando el ensayo de luciferasa doble descrito anteriormente, se evaluo una serie de oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados y conjugados de MGB-oligonucleotido como inhibidores de la funcion de los miARN. Las secuencias diana insertadas en la UTR 3' de Rluc fueron Let7cTcomp de la Tabla 1 (para Let7c) y _miR21Tcomp de la Tabla 2 (para miR-21). Las secuencias para los inhibidores de miARN de let-7c y miARN de miR-21 se muestran en la Tabla 1 y Tabla 2, respectivamente. En las Tablas 1 y 2, la presencia de un azucar de 2'- O-Metilribofuranosa en un oligonucleotido se muestra en negrita y cursiva. La presencia de una base modificada Super A se muestra con una letra "a" en minuscula.

Tabla 1. Secuencias de let7c e inhibidores de Iet7c

Abreviatura del inhibidor: Secuencia Descripcion

Let7c: 5-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3' (SEQ ID NO: 1) Cadena madura de ARN

Let7cT: 5-TGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT-3' (SEQ ID NO: 2) Cadena madura equivalente de ADN

Let7cTcomp: 5'-AACCATACAACCTACTACCTCA-3' (SEQ ID NO: 3) Complemento de ADN

2'-OMet: 5-AACCATACAACCTACTACCTCA-3' (SEQ ID NO: 4) Es un ARN de 2'-OMe

ADN: 5'-AACCATACAACCTACTACCTCA-3' (SEQ ID NO: 3) Es un ADN equivalente

3MGB-ADN: 5'-AACCATACAACCTACTACCTCA-MGB-3' (SEQ ID NO: 5) MGB es ligando DPI3

ADN Super A: 5'-AaCCaTaCAaCCTaCTaCCTCA-3' (SEQ ID NO: 6) "a" es Super A

5MGB-ADN: 5'-MGB-AACCATACAACCTACTACCTCA-3' (SEQ ID NO: 7)

2'-OMet Super A: 5'-AaCCaTaCAaCCTaCTaCCTCA-3' (SEQ ID NO: 8) "a" es ADN de Super A; Otras bases 2'-OMe

5'MGB-2'-OMet: 5-MGB-AACCATACAACCTACTACCTCA-3' (SEQ ID NO: 9) 5'-MGB-2'-ARN de OMe

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(Continuacion)

Abreviatura del inhibidor: Secuencia Descripcion

3'MGB-2'-OMet: 5-AACCATACAACCTACTACCTCA-MGB-3' (SEQ ID NO: 10) 3'-MGB-2'-ARN de OMe

Tabla 2. Secuencias de mir21 e inhibidores de mir21

Abreviatura del inhibidor: Secuencia Descripcion

mir21: 5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3' (SEQ ID NO: 11) Cadena madura de ARN

mir21T: 5'- TAGCTTATCAGACTGATGTTGA -3' (SEQ ID NO: 12) Cadena madura equivalente de ADN

mir21Tcomp: 5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3' (SEQ ID NO: 13) Complemento de ADN

2'-OMe: 5 -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3' (SEQ ID NO: 14) Es un ARN de 2'-OMe

ADN: 5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3' (SEQ ID NO: 13) Es un ADN equivalente

3MGB-ADN: 5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-MGB-3' (SEQ ID NO: 15) MGB es ligando DPI3

ADN Super A: 5'-TCaaCaTCaGTCTGaTAaGCTA-3' (SEQ ID NO: 16) "a" es Super A de un 2'- desoxirribonucleotido

5MGB-ADN: 5'-MGB-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3' (SEQ ID NO: 17) MGB es ligando DPI3

2'-OMet Super A: 5'-TCaaCaTCaGTCTGaTAaGCTA-3' (SEQ ID NO: 18) "a" es ADN de Super A; Otras bases 2'-OMe

5'MGB-2'-OMet: 5' MGB-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3' (SEQ ID NO: 19) 5'-MGB-2'-OMe-ARN

3'MGB-2'-OMet: 5-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3' (SEQ ID NO: 20) 3'-MGB-2'-OMc-ARN

La Figura 4 muestra el rendimiento de los multiples disenos de inhibidores de miARN. Los inhibidores de diferentes disenos se introdujeron en celulas junto con la construccion de indicador de la luciferasa doble adecuada (let-7c o miR-21). Los controles consistfan en celulas no tratadas (nada) o celulas tratadas con moleculas de inhibidores de complemento inverso modificadas con 2'-O-metilo, simples (2'-Omet).

En la Figura 4a, se muestra el rendimiento de los inhibidores de let-7c. Se obtuvo una proporcion basal de Rluc/Fluc en ausencia de cualquier molecula de inhibidor (vease "nada"). En comparacion con el control no tratado (nada) los inhibidores monocatenarios modificados con 2'-O-metilo mostraron un aumento en la proporcion de Rluc/Fluc, lo que indica que este diseno es capaz de proporcionar un cierto nivel de inhibicion de Iet-7c. El "ADN", "3-MGB-ADN", "5'- MGB-ADN", "ADN sustituido con Super A" (que se refiere a un 2-desoxirribonucleosido desvelado en la patente de EE.UU. n.° 7.045.610) y la quimera "super A-2'OMet" mostraron niveles basales de inhibicion similares a los controles no tratados, lo que sugiere que estas configuraciones de diseno no pudieron inhibir la funcion de let-7c. Sin embargo, mientras que el "3'-MGB-2'-OMet" indujo niveles similares de inhibicion a los de 2'-OMet, el 22-mero "5'- MGB-2'-OMe" indujo niveles aproximadamente de inhibicion 3,4 veces superiores a los del diseno de 2'-OMet. Los resultados de un experimento paralelo realizado en miR-21 muestran resultados muy similares (vease la Figura 4b). Las configuraciones de los inhibidores 5'-MGB-2'-OMet y 3'-MGB-2'-OMet presentaron mejoras en el rendimiento de aproximadamente 10 veces y 3 veces frente al diseno de 2'-OMet, respectivamente.

Referencias

Documentos de patente de EE.UU.

Patente de EE.UU. n.° 5.801.155;

Patente de EE.UU. n.° 6.312.894;

Patente de EE.UU. n.° 7.045.610;

Patente de EE.UU. n.° 7.381.818;

Patente de EE.UU. n.° 7.582.739;

Publicacion de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2004/32665;

Publicacion de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2005/0118623;

Publicacion de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2006/0229441.

Documentos de patentes internacionales Publicacion de solicitud PCT n.° WO2007/095387.

5 Otras publicaciones

Chen y col., Nucl. Acids Res., 23:2662-2668 (1995);

Hutvagner, G. y col. (2004) "Sequence-specific inhibition of small RNA function". PLoS Biol. Apr; 2(4):E98;

Kutyavin, I. V., y col., (2000) "3'-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures". NAR, 28(2):655-661;

10 Meister, G. y col., (2004) "Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing". RNA

10(3):544-50;

Orom y col., (2006) "LNA-modified oligonucleotides mediate specific inhibition of microRNA function", Gene 372:137-141;

Vermeulen y col., RNA, 2007 13(5):723-30.

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Claims

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REIVINDICACIONES

1. Una composicion inhibidora para inhibir ARN no codificantes que comprende: un oligonucleotido; y

un aglutinante del surco menor (MGB), en la que el oligonucleotido comprende nucleotidos,

en la que todos los nucleotidos del oligonucleotido comprenden ribofuranosa que tiene la siguiente estructura:

imagen1

en la que Rz es -OCH3, en la que B es una base normal o una base modificada; y en la que el MGB esta conjugado con el extremo 5' o con el extremo 3' del oligonucleotido; y en la que el oligonucleotido es esencialmente complementary a una secuencia de miARN o ARNpi madura endogena.
2. La composicion inhibidora de la reivindicacion 1, que comprende ademas un engarce mediante el cual el MGB se une al oligonucleotido.
3. La composicion inhibidora de la reivindicacion 1, en la que el oligonucleotido es monocatenario, bicatenario o una combinacion de los mismos.
4. La composicion inhibidora de la reivindicacion 1, en la que el oligonucleotido comprende ARN, ADN o una combinacion de los mismos.
5. La composicion inhibidora de la reivindicacion 1, en la que el oligonucleotido comprende una o mas bases modificadas o bases universales.
6. La composicion inhibidora de la reivindicacion 5, en la que una o mas bases modificadas comprenden una o mas bases que tienen la siguiente estructura:

imagen2

en la que Rz es -H y R=-C=C-CH2CH2OH.
7. La composicion inhibidora de la reivindicacion 1, en la que el oligonucleotido comprende uno o mas nucleotidos que tienen un marcador detectable.
8. La composicion inhibidora de la reivindicacion 1, en la que el oligonucleotido comprende una secuencia que es un complemento inverso a una cadena madura de una secuencia diana.
9. La composicion inhibidora de la reivindicacion 1, en la que el MGB comprende una estructura seleccionada del siguiente grupo:

imagen3

en las que el subindice m es un numero entero de 2 a 5; el subindice r es un nUmero entero de 2 a 10; y

cada Ra y Rb es independientemente un engarce al oligonucleotido, un engarce a un fluoroforo, H, -ORc, -NRcRd, 5 -COORc o -CONRcRd, en los que cada Rc y Rd se selecciona entre H, heteroalquilo (C2-C12), heteroalquenilo (C3-

C12), heteroalquinilo (C3-C12), alquilo (C1-C12), alquenilo (C2-C12), alquinilo (C2-C12), arilalquilo (C1-C12) y arilo, en las que uno de Ra y Rb es un engarce al oligonucleotido o a un fluoroforo.
10. La composicion inhibidora de la reivindicacion 9, en la que los anillos de las estructuras contienen una o mas sustituciones seleccionadas entre H, halogeno, alquilo (C1-C8), ORg, N(Rg)2, N+(Rg)3, SRg, CORg, CO2Rg, CON(Rg)2,

10 (CH2)mSO3-, (CH2)mCO2-, (CH2)mOPO3-2 y NHC(O)(CH2)mCO2-, y esteres y sales de los mismos, en las que cada Rg

es independientemente H o alquilo (C1-C8), y el subindice m es un nUmero entero de 0 a 6.
11. La composicion inhibidora de la reivindicacion 1, en la que el MGB se selecciona del grupo que consiste en DPI3, CDPI3, CC1065, lexitropsinas, distamicina, netropsina, berenil, duocarmicina, pentamidina, 4,6-diamino-2-fenilindol, estilbamidina, bis(guanilhidrazona) de 4,4'-diacetildifenilurea (DDUG) y pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepinas o

15 cualquiera de sus analogos.
12. La composicion inhibidora de la reivindicacion 1, en la que la composicion inhibidora comprende una de las siguientes estructuras:

imagen4

o

imagen5

10

15

en las que W es un engarce que tiene de aproximadamente 3 a 100 atomos de cadena principal, seleccionados entre C, O, N, S, P y Si; [A-B]n es un oligonucleotido, en el que A representa una cadena principal de fosfato de azucar, cadena principal de fosfato de azucar modificado, cadena principal de acido nucleico bloqueado, cadena principal peptidica o una variante de las mismas, usada en la preparacion de acido nucleico; y en las que [A-B]n comprende nucleotidos que comprenden ribofuranosa que tiene la siguiente estructura:

imagen6

en la que Rz es -OCH3, y B es una base;

n es un numero entero de aproximadamente 3 a aproximadamente 100;

Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf son sustituyentes seleccionados entre H, halogeno, alquilo (C1-C8), ORg, N(Rg)2, N+(Rg)3, SRg, CORg, CO2Rg, CON(Rg)2, (CH2)mSO3-, (CH2)mCO2-, (CH2)mOPO3-2 y NHC(O)(CH2)mCO2", y esteres y sales de los mismos, en los que cada Rg es independientemente H o alquilo (C1-C8), y el submdice m es un numero entero de 0 a 6; Rh y Rw son H o un grupo que tiene de 1 a 30 atomos seleccionados entre C, N, O, P y S, y que es dclico, adclico o una combinacion de los mismos.
13. Un procedimiento de inhibicion de la actividad de miARN in vitro que comprende introducir la composicion inhibidora de la reivindicacion 1 en una ubicacion in vitro en la que existe actividad de miRNA.
14. Una composicion inhibidora de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso como un medicamento.