ES2531964T3 - Medios y métodos para contrarrestar, demorar y/o prevenir cambios adversos del metabolismo energético en enfermedades del corazón - Google Patents

Abstract

Una secuencia de ácidos nucleicos con una longitud de al menos 19 nucleótidos con una identidad de la secuencia de al menos el 90% con el complemento de un ácido nucleico que comprende al menos 19 nucleótidos consecutivos de la secuencia ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU, para uso en el tratamiento, disminución, demora y/o prevención de una enfermedad del corazón.

Description

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de complejos de nucleoproteínas) se añadieron a cada una de las muestras 0,3 ml de cloroformo por cada 1 ml de TRIzol. La centrifugación a 12.000 g durante 15 minutos a 4ºC resulta en la separación de ARN (fase acuosa superior) a partir de ADN y proteínas (fase orgánica inferior e intermedia). Las fases acuosas (60% del volumen de la muestra) se recogieron en nuevos tubos exentos de RNasa, y el ARN se precipitó con 0,5 ml de isopropanol mediante incubación a -20ºC durante al menos 1 hora y centrifugación a 12.000 g durante 30 minutos a 4ºC. Los sedimentos, que contenían el ARN, se lavaron dos veces con 1 ml de etanol al 70% a 12.000 g durante 5 minutos a 4ºC. Después de la decantación del etanol y de la separación total mediante evaporación, las muestras se disolvieron en 20-30 µl de agua exenta de RNasa. La cantidad de ARN procedente de los tejidos individuales se midió con un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 UV-Vis (Wilmington), y la calidad del ARN se vigiló utilizando un bioanalizador Agilent 2100.

Perfilado de Expresión de microARN y Análisis de los Datos. El análisis de expresión de 875 secuencias de miARN humano maduro (miRBase V12) se realizó mediante un servicio de perfilado de miARN (LC Sciences Inc., Houston). En síntesis, cinco µg de ARN total agrupado de 4 muestras testigo (4 corazones testigo humanos explantados) y 7 muestras de corazón humano enfermo (7 corazones con cardiomiopatía dilatados humanos explantados) se sometieron al servicio de perfilado de la expresión utilizando la tecnología µParaflo® y un diseño de sonda propietaria, que permite una detección directa muy sensible y específica de miARNs mediante marcaje con un solo color, hibridación, procesamiento de datos de imagen y análisis de datos. El análisis de datos incluyó una normalización multimatriz, prueba t, ANOVA, calculadora de Tasa de descubrimiento falso y análisis de agrupaciones.

Transferencia Northern. Tres microgramos de ARN total procedente de corazón u otros tejidos diferentes se fraccionaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12% que contenía urea 8 M, se transfirieron a una membrana Nytran N (Schleicher & Schuell, Alemania) por el método capilar y se fijaron mediante reticulación UV de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las membranas se hibridaron con sondas de detección de LNA marcadas con 5’-Dig-oxigenina (Dig) específicas (Exiqon) para hsa-miR214 o Rnub-2 (testigo de carga). La detección se realizó con un anticuerpo contra Dig (Roche).

Cultivos de cardiomiocitos de rata neonatales primarios y transfecciones de precursor de miARN/anti-miR.

Miocitos ventriculares de rata neonatales se obtuvieron mediante disociación enzimática de ventrículos neonatales de rata de 1-2 días de edad según se describe previamente en detalle5. Los ventrículos se almacenaron en DMEM tamponado con HEPES (pH 7,4) antes de realizar múltiples rondas de digestión enzimática en base de DMEM mezcla de nutrientes F-12 Ham (Sigma), suplementados con 0,7 mg/ml de colagenasa tipo 2 (Invitrogen) y 1 mg/ml de pancreatina (Sigma). Las células se recogieron mediante centrifugación a 61 x g durante 10 min, se volvieron a suspender en suero de ternero neonatal (Invitrogen) y se almacenaron en una incubadora a 37ºC. Todas las suspensiones celulares se agruparon, se centrifugaron a 61 x g durante 10 min y se volvieron a suspender en DMEM (Invitrogen) suplementado con suero de caballo al 10% (Invitrogen) y suero de ternero fetal al 5% (Invitrogen). Subsiguientemente, las células se extendieron diferencialmente durante 3 h en placas de cultivo celular no revestidas para eliminar no miocitos contaminantes. Los cardiomiocitos (que contenían menos de 5% de no miocitos) se extendieron luego en placas de cultivo de 6 pocillos no revestidas con fibronectina (Sigma). Aproximadamente 24 horas después de la extensión en placas, el medio se reemplazó por medio DMEM:M199

(4:1) (medio exento de suero). Para la transfección, cardiomiocitos de ratas neonatales se extendieron en placas en DMEM suplementado con Nutridoma (Roche) en placas revestidas con gelatina de 6 pocillos con una densidad de 2*105 células por pocillo. Al día siguiente, las células se transfectaron transitoriamente con precursor o moléculas anti-miR. El precursor de miR-199a, miR-214 o las moléculas anti-miR se obtuvieron de Ambion (precursor de miARN Pre-miR™ mmu-miR-214, pre-miR-199a/214; moléculas de miARN anti-miR™, anti-miR199a/214). Se transfectó una concentración 30 nM de pre-miR-199a, pre-miR-214, anti-miR-199a, anti-miR-214 o los testigos revueltos respectivos, con reactivo oligofectamina (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células se lavaron al día siguiente y se dejaron sin tratar, se estimularon con 10 µM de fenilefrina (PE) durante 24 horas antes de la fijación de las células o el aislamiento de ARN.

Inmunocitoquímica y microscopía confocal. Para visualizar el tamaño de los cardiomiocitos y la organización sarcomérica, cardiomiocitos cultivados se fijaron durante 10 min en paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 5 minutos. Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron utilizando BSA al 1% en TBS y las incubaciones se llevaron a cabo a la temperatura ambiente durante 1 hora. Las células se lavaron 3 veces con PBS durante 5 minutos, se montaron con cubreobjetos en medio de montaje Vectashield para fluorescencia (Vector Laboratories) y se analizaron mediante microscopía confocal utilizando un microscopio Zeiss LSM 510 META. Los anticuerpos utilizados incluían anti α-actinina monoclonal de ratón (Sigma, 1:500); anti ANF policlonal de conejo (Peninsula Laboratories), anti-conejo de cabra Cy5 y anti-ratón de cabra Cy3 (Jackson Immuno Research, 1:100 y 1:500, respectivamente); y TOPRO-3 (1:100, Invitrogen). Las superficies

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específicas de las células se determinaron utilizando el software de visualización de imágenes SPOT (Diagnostic Instruments) en 80-100 cardiomiocitos en 10 a 20 campos en tres experimentos independientes.

Predicción de la diana, diseño del cebador y PCR en tiempo real. Para encontrar los genes diana de un microARN específico, los autores de la invención hicieron uso de varios servidores de la web basados en algoritmos bio-informáticos predictivos (PicTar, miRanda, miRBase). Estos son interfases intuitivas que incorporan algoritmos de procesamiento y potentes herramientas de búsqueda de dianas miARN para investigar las dianas miARN frente a las secuencia 3’UTR más conservadas procedentes de UCSC Genome Browser. Comparando las listas de genes diana que resultan de cada uno de los algoritmos, los autores de la invención acortaron las listas iniciales de cientos de genes diana potenciales a una lista de 10 genes comunes a todos los algoritmos utilizados. Los autores de la invención diseñaron cebadores dirigidos contra transcritos de los genes indicados y L7. Los cebadores eran específicos para secuencias de ratón (www.ensembl.org) y se seleccionaron utilizando el software Beacon Designer (Invitrogen) basado en los siguientes requisitos: i) temperatura de fusión del cebador de ~ 60ºC, ii) contenido en GC de ~ 55%, iii) preferiblemente ninguna G en el extremo 5’, iv) evitar operaciones de más de 3 nucleótidos idénticos y v) longitud del amplicón de ~ 100 nucleótidos. La especificidad se verificó con la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica -Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) y el punto de fusión específico de los amplicones se analizó utilizando el software de curva de Disociación Biorad (iCycler, Biorad). Todos los conjuntos de cebadores se sometieron a ensayo en cuanto a la eficacia de la PCR, y se diseñaron cebadores alternativos en el caso de que cayeran por fuera del intervalo de eficacia del 5% (3,14 < pendiente < 3,47). Tres µg de ARN procedente de corazones indicados se transcribió inversamente utilizando transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). La amplificación por PCR se realizó (por duplicado) en forma de una reacción en singleplex con cebadores directos e inversos 400 nM en 40 ng de ADNc en un volumen total de la reacción de 25 µl. La PCR se cicló entre 95ºC/30 s y 60ºC/30s durante 40 ciclos, siguiendo una etapa de desnaturalización inicial a 95ºC durante 3 min. Los resultados de la PCR en tiempo real se verificaron mediante electroforesis del material transcrito inversamente en geles de agarosa al 1,2% y se visualizó bajo iluminación UV después de tinción con bromuro de etidio. Se compararon las cantidades de transcrito con la cantidad de testigo endógeno (L7). Las secuencias de los cebadores están disponibles con previa solicitud.

Análisis de Transferencia Western. Se extrajeron proteínas de células cultivadas o muestras de corazón utilizando tampón de lisis celular (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 al 1%) suplementado con un coctel de inhibidores de proteasa (Complete Mini, Roche). Se realizaron una electroforesis SDS-PAGE y transferencia según se describe en detalle6. Los anticuerpos utilizados incluían el anticuerpo policlonal de conejo contra PPARδ y el anticuerpo monoclonal de ratón contra GAPDH (ambos de Santa Cruz), seguido de correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (DAKO) y detección ECL.

Validación de genes diana. Secuencias reguladoras 3’ UTR han demostrado ser importantes para la estabilidad, traducción y transporte de ARNm. Los autores de la invención diseñaron cebadores (5'-AGGCCGCAGCCCAGGCCTCCCC-3' y 5'-CTGGGAATATGGCTCCCGGCC-3') específicos para secuencias de ratón que fijan como objetivo el sitio de unión específico de miR-214 en la 3’ UTR de ppard de ratón (nucleótidos 1549-2128). Los autores de la invención clonaron parte de 3’ UTR de ppard de ratón que contenía los sitios de unión de miR-199a y miR-214. Después de la amplificación por PCR de esta secuencia específica, se visualizó un producto de la PCR con el tamaño esperado (579 pb) y se aisló a partir de un gel de agarosa 1.2. Después de purificación, el fragmento 3’UTR se clonó en un vector informador de la expresión de miARN pMIR-REPORT™ (Ambion). Este vector contiene luciferasa de luciérnaga bajo el control del promotor de mamíferos CMV, con una región de clonación diana de miARN situada más abajo de la secuencia de traducción de luciferasa. Este vector está optimizado para clonar dianas de miARN y para la evaluación de la regulación de miARN y, por lo tanto, se puede utilizar como una herramienta de rastreo para identificar dianas de miARN. Después del aislamiento y la secuenciación del plásmido, el plásmido se utilizó para transfectar células HEK293/ppard. Se cultivaron células en placas de 96 pocillos, se transfectaron con el plásmido de PPARδ pmiR-informador-3’UTR o el vector vacío y se incubaron durante 24 horas a 37ºC. Después de 1 lavado con PBS, las células se dejaron sin tratar o se trataron con el precursor indicado o moléculas anti-miR o vectores de expresión para Twist1 y/o HIF-1α durante 48 horas antes de medir la actividad de luciferasa.

Análisis estadístico. Los resultados se presentan como valores medios + error típico de la media (SEM). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Prism 5 (GraphPad Software Inc.) y consistían en ANOVA seguido de un post-ensayo de Turkey cuando se detectaron diferencias entre grupos a un nivel de significancia de 5%, o el test-T de Student cuando se comparan dos grupos experimentales.

RESULTADOS

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Expresión diferencial de microARNs en insuficiencia cardíaca humana. Los autores de la invención perfilaron los niveles de expresión de microARNs en miocardio humano sano frente a una cardiomiopatía dilatada humana. Se aisló ARN de biopsias de paredes congeladas exentas del ventrículo izquierdo y los autores de la invención realizaron el perfilado de microARN en estas muestras. Los autores de la invención detectaron microARNs que se co-regulan con el desarrollo de una insuficiencia cardíaca humana y analizaron la localización genómica de dos microARNs específicos: hsa-miR-199a-2 y hsa-miR-214 (Fig. 1a; miR-199a-2/miR-214). Ambos microARNs se coexpresan en una agrupación con una región intrónica del gen dinamina 3 (dnm3) y se expresan en un único transcrito denominado dnmos3 en un modo antisentido con relación a la transcripción de dnm3. Los autores de la invención validaron sus resultados de perfilado de la expresión de micromatriz utilizando análisis de PCR en tiempo real (Fig. 1b) y pudieron confirmar una inducción muy similar de tanto miR-199a-3 como miR-214 en las biopsias humanas de cardiomiopatía dilatada en comparación con corazones humanos sanos.

Se predice que Mir-199a-2/miR-214 fija como objetivo PPARδ. A pesar del gran número de miARNs identificados en varias situaciones patológicas, sólo se han caracterizado funcionalmente un puñado de miARNs. Los complicados modelos de expresión y los grandes números de genes diana predichos excluyen un análisis directo de su función biológica precisa. Con el fin de comprender el papel de miR-199a-2/miR-214 en la insuficiencia cardíaca humana, los autores de la invención realizaron un análisis de expresión de las dianas de ARNm hsa-miR-199a-2/miR-214 previstas enumeradas en varios conjuntos de datos públicos que se desarrollaron basándose en varios estudios. Una diana constante de ambos microARNs en esta agrupación fue la isoforma delta del receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPARδ), que se expresa a partir del gen humano ppard en el cromosoma 13. Los autores de la invención identificaron los sitios de unión tanto para miR-199a como para miR-214 en la 3’ UTR de PPARδ y los sitios de unión se conservaron entre los de ratón y los humanos, especialmente el sitio de siembra de microARN (Fig. 1c), lo cual sugiere la funcionalidad de estos sitios de unión.

PPARδ está sub-regulado por mir-199a-2/miR-214. Para evaluar más directamente si PPARδ es un gen diana directo de miR-199a-2/miR-214, los autores de la invención transfectaron transitoriamente las moléculas precursoras respectivas de miR-199a-2 y miR-214 en células HEK293 y realizaron una transferencia Western para niveles de PPARδ endógeno. Los datos muestran que tanto la expresión de miR-199a como la de miR-214 provocaron directamente la sub-regulación de PPARδ. El nivel de sub-regulación fue similar entre la transfección del precursor de miR-199a y el precursor de miR-214, y no se observó ningún efecto aditivo cuando se cotransfectaron ambos precursores (Fig. 1d). Para evaluar si, en condiciones de supra-regulación de miR-199a/miR214 in vivo, la expresión de PPARδ también se veía sub-regulada, los autores de la invención realizaron una transferencia Western en corazones de ratón con sobrecarga de presión y muestras de corazón humano de pacientes con cardiomiopatía dilatada. En ambas situaciones, la expresión de PPARδ ascendió a aproximadamente la mitad de la de las condiciones testigo (Fig. 1e). Considerados conjuntamente, estos datos muestran que la expresión de miR-199a-2/miR-214 se correlacionó inversamente con la expresión de PPARδ en células cultivadas, corazones de ratón con sobrecarga de presión y en corazones humanos con insuficiencia.

PPARδ es un gen diana directo de la agrupación miR-199a-2/miR-214. Para confirmar de forma más directa si PPARδ es un gen diana directo de esta agrupación de microARN, los autores de la invención utilizaron un vector informador de la expresión de miARN (pMiR-informador, Ambion). Este vector contiene luciferasa de luciérnaga bajo el control del promotor de mamífero de CMV. El vector contiene un sitio de clonación múltiple para la inserción de una 3’ UTR de dianas de unión de miARN previstas u otras secuencias de nucleótidos. Al clonar la región 3’ UTR de PPARδ, a la cual se predice que se unirán miR-199a-2/miR-214 (Fig. 2a), en el vector pMiR-INFORMADOR, el informador de luciferasa se someterá a una regulación que imitará la regulación de la diana de microARN (en este caso, PPARδ). Si la supra-expresión de miR-199a/miR-214 diera como resultado una reducción en la actividad luciferasa, esto proporcionaría una evidencia sólida de que la secuencia de 3’ UTR de PPARδ es una diana directa de estos microARNs. Con este fin, los autores de la invención clonaron una región que englobaba los nucleótidos 1598-2198 del ADNc de PPARδ de murino en una posición posterior a la luciferasa. Tras la co-transfección del informador de luciferasa pMiR-3'UTR-PPARδ con moléculas precursoras para miR-199a-2 o miR-214, la actividad luciferasa se inhibió significativamente en las células que supra-expresaban miR-199a-2 o miR-214, en comparación con las células que se dejaron sin tratar (Fig. 2b).

Ya que se describió que dnm3os, la hebra opuesta del gen dnm3 que codifica la agrupación miR-199a-2/miR-214, era inducido por el factor de transcripción Twist1, los autores de la invención evaluaron si la co-transfección de Twist1 (y la inducción concomitante de esta agrupación de microARN) con el informador de luciferasa pMiR3'UTR-PPARδ sería suficiente para sub-regular el informador de luciferasa. En efecto, los autores de la invención observaron una sub-regulación muy similar del informador de luciferasa que la observada con moléculas precursoras para cualquiera de los microARNs por sí solos (Fig. 2b). Se describió que Twist1 era inducido en

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también presentaron un deterioro más pronunciado en la geometría cardíaca en comparación con los ratones αMHC-MCM/ppardf/f tratados con vehículo, según demuestra un incremento del 80-90% en los diámetros internos de LV (LVIDs; Fig. 3g), lo cual indica una dilatación rápida del ventrículo izquierdo. Estos datos demuestran que la reducción de PPARδ provoca un deterioro geométrico y funcional progresivo que concuerda con un fenotipo de insuficiencia cardíaca.

La deleción de PPARδ en ratones adultos también indujo una re-activación potente de genes embriónicos tales como acta1, nppb, myh7 y nppa en corazones de αMHC-MCM/ppardf/f de 8 semanas de edad (Fig. 4). No se observó ningún cambio sustancial en la expresión de ninguno de estos genes en los corazones de genotipos testigo tratados con tamoxifeno o vehículo. Además, los autores de la invención observaron una reducción sustancial en la abundancia del transcrito para cd36 y hadha, y un incremento en glut1 (Fig. 4). Estos datos indican una reducción en la oxidación y la capacidad de transporte de ácidos grasos, y un incremento concomitante en la glicólisis. Como conclusión, la deleción de PPARδ en el corazón adulto induce una disfunción cardíaca rápida y espontánea con una inducción significativa de genes informadores hipertróficos “fetales”.

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