BRPI0709895A2 - composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

<B>COMPOSIçAO FARMACêUTICA<D>A invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo oligonucleotídeos de fita única, com um comprimento de entre 8 e 26 nucleobases, os quais são complementares a micro-RNAs humanos selecionados do grupo consistindo em miR1 9b, miR2l, miRi 22a, miRi 55 e miR375. Os oligonucleotídeos curtos são particularmente eficazes no alívio de repressão de miRNA ín vivo. Descobriu-se que a incorporação de análogos de nucleotídeo de alta afinidade nos oligonucleotídeos resulta em moléculas de anti-micro-RNA altamente eficazes os quais parecem funcionar via a formação de duplas quase irreversíveis com o alvo de miRNA ao invés de mecanismos baseados em clivagem de RNA, tais como mecanismos associados à RNaseH ou RISC.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à composições farmacêuticascompreendendo oligonucleotídeos de fita única contendo LNA capazes deinibição de micro-RNAs que induzem à doença, particularmente micro-RNAshumanos miR-19b, miR-21, miR-122A, miR-155 e miR-375.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Micro-RNAs- novos reguladores de expressão de gene

Micro-RNAs (miRNAs) são uma classe abundante de RNAs en-dógenos curtos que atuam como reguladores pós-transcricionais de expres-são de gene através de emparelhamento de base com seus mRNAs alvo.Os miRNAs maduros são seqüencialmente processados a partir de transcri-tos de hairpina mais longos pelas ribonucleases de RNAse Ill de Drosha(Lee e outros 2003) e Dicer (Hutvagner e outros 2001, Ketting e outros2001). Até o momento, mais de 3400 miRNAs foram anotados em vertebra-dos, invertebrados e plantas de acordo com a liberação 7.1 do banco de da-dos de micro-RNA miRBase em outubro de 2005 (Griffith-Jones 2004, Griffi-th-Jones e outros 2006) e muitos miRNAs que correspondem a genes putati-vos também foram identificados.

A maioria dos miRNAs de animais reconhece seus sítios alvoslocalizados em 3'-UTRs através de emparelhamento de base incompleto,resultando em repressão traducional dos genes alvo (Bartel 2004). Um grupocrescente de pesquisa mostra que miRNAs de animal exercem papéis bioló-gicos fundamentais no crescimento e apoptose celular (Brennecke e outros2003), diferenciação de linhagem hematopoiética (Chen e outros 2004), re-gulação da expectativa de vida (Boehm e Slack 2005), diferenciação de fo-torreceptor (Li e Carthew 2005), regulação de gene de homeobox (Yekta eoutros 2004, Hornstein e outros 2005), assimetria neuronal (hnston e outros2004), secreção de insulina (Poy e outros 2004), morfogênese cerebral (Gi-raldez e outros 2005), proliferação e diferenciação muscular (Chen, Mandeie outros 2005, Kwon e outros 2005, Sokol e Ambros 2005), cardiogênese(Zhao e outros 2005) e desenvolvimento embriônico em vertebrados (Wie-nholds e outros 2005).Micro-RNAs em doenças humanas

miRNAs estão envolvidos em uma ampla variedade de doenças humanas. Uma é atrofia muscular espinhal (SMA), uma doença neurodege-nerativa pediátrica causada por níveis reduzidos de proteína ou mutaçõesque causam perda de função da sobrevivência do gene de neurônios moto-res (SMN) (Paushkin e outros 2002). Recentemente, foi mostrado que umamutação no sítio alvo de miR-189 no gene SLITRK1 humano está associadaà síndrome de Tourette (Abelson e outros 2005), enquanto que outro estudorecente reportou que o genoma de RNA do vírus da hepatite C (HCV) intera-ge com um micro-RNA da célula hospedeira, o miR-122a fígado-específico,para facilitar sua replicação no hospedeiro (Jopling e outros 2005). Outrasdoenças nas quais um miRNAs ou sua maquinaria de processamento foram implicados incluem retardo mental X frágil (FXMR) causado por ausência daproteína de retardo mental X frágil (FMRP) (Nelson e outros 2003, Jin e ou-tros 2004) e síndrome de DiGeorge (Landthaler e outros 2004).

Além disso, padrões de expressão de miRNA alterados foramreportados em muitos cânceres humanos. Por exemplo, os genes de miRNAhumanos miR15a e miR16-1 são deletados ou sub-regulados na maioria doscasos de leucemia linfocítica crônica de células B (CLL), onde uma assinatu-ra única de 13 genes de miRNA foi recentemente mostrada estar associadaao prognóstico e progressão (Calin e outros 2002, Calin e outros 2005). Opapel de miRNAs em câncer é ainda sustentado pelo fato de que mais de50% dos genes de miRNA humanos estão localizados em regiões genômi-cas câncer-associadas ou em sítios frágeis (Calin e outros 2004). Recente-mente, análise de expressão sistemática de uma diversidade de câncereshumanos revelou uma sub-regulação geral de miRNAs em tumores compa-rado com tecidos normais (Lu e outros 2005). De modo interessante, classi-ficação miRNA-baseada de tumores pobremente diferenciados obteve su-cesso, enquanto que perfis de mRNA eram altamente imprecisos quandoaplicados às mesmas amostras. Também foi mostrado que miRNAs sãodesregulados em câncer de mama (lorio e outros 2005), câncer de pulmão(Johnson e outros 2005) e câncer de cólon (Michael e outros 2004), enquan-to que o agrupamento miR-17-92, o qual é amplificado em Iinfomas de célulaB humanos e miR-155, o qual é super-regulado em Iinfoma de Burkitt, foramreportados como os primeiros oncogenes de miRNA humano (Eis e outros2005, He e outros 2005). Assim, miRNAs humanos não seriam apenas alta-mente úteis como biomarcadores para futuro diagnóstico de câncer, masestão emergindo rapidamente como alvos atraentes para intervenção emdoenças através de tecnologias de oligonucleotídeo.

Inibição de miRNAs usando oligonucleotídeos de fita únicaVárias abordagens de oligonucleotídeo foram reportadas paravárias abordagens de oligonucleotídeo foram reportadas para inibição demiRNA.

O W003/029459 (TuschI) reivindica oligonucleotídeos os quaiscodificam miRNAs e seus complementos de entre 18-25 nucleotídeos decomprimento os quais podem compreender análogos de nucleotídeo. LNA ésugerido como um possível análogo de nucleotídeo, embora nenhum oligo-nucleotídeo contendo LNA seja divulgado. Tuschl reivindica que oligonucleo-tídeos de miRNA podem ser usados em terapia.

O US2005/0182005 divulga um oligorribonucleotídeo de 2'OMeRNA de 24 meros complementares à forma mais longa de miR 21, o qualdescobriu-se que reduz a repressão induzida por miR 21, enquanto que umoligonucleotídeo contendo DNA equivalente não. O termo 2'OMe-RNA serefere a um análogo RNA onde há uma substituição para metila na posição2' (2'OMetila).

O US2005/0227934 (TuschI) se refere a moléculas antimir comaté 50% de resíduos de DNA. Ele também reporta que antimirs contendo 2'OMe RNA foram usados contra miRNAs pancreáticos, mas parece que ne-nhuma estrutura de oligonucleotídeo real é divulgada.

O US20050261218 (ISIS) reivindica um composto oligoméricocompreendendo uma primeira região e uma segunda região, em que pelomenos uma região compreende uma modificação e uma porção do compos-to oligomérico é objetivada a um ácido nucléico alvo de RNA de não codifi-cação pequeno, em que o ácido nucléico alvo de RNA de não-codificaçãopequeno é um miRNA. Compostos oligoméricos de entre 17 e 25 nucleotí-deos de comprimento são reivindicados. Os exemplos se referem a compos-tos PS totalmente 2' OMe, 21 meros e 20 meros e oligonucleotídeos de gap-mero 2'OMe objetivados contra uma faixa de pré-miRNA e alvos de miRNAmaduro.

Boutla e outros 2003 (Nucleic Acids Research 31: 4973-4980)descrevem o uso de oligonucleotídeo de DNA anti-sentido complementaresa 11 diferentes miRNAs em Drosophila, bem como a seu uso para inativar osmiRNAs através de injeção dos oligonucleotídeos de DNA em embriões demosca. Dos 11 oligonucleotídeos de DNA anti-sentido, apenas 4 estruturasmostraram interferência grave com o desenvolvimento normal, enquanto queos 7 oligonucleotídeos restantes não mostram quaisquer fenótipos, presumi-velmente em virtude de sua incapacidade de inibir o miRNA em questão.

Uma abordagem alternativa a isso foi reportada por Hutvagner eoutros (2004) e Leaman e outros (2005), na qual oligonucleotídeos anti-sentido 2'-O-metila, complementares ao miRNA maduro, poderiam ser usa-dos como inibidores potente e irreversíveis de RNA de interferência curto(siRNA) e função de miRNA in vitro e in vivo em Drosophila e C. elegans,desse modo, induzindo a um fenótipo de perda de função. Uma deficiênciadesse método é a necessidade de altas concentrações de oligonucleotídeo2'-O-metila (100 micromolar) em experimentos de transfecção e injeção, asquais podem ser tóxicas para o animal. Esse método foi recentemente apli-cado a estudos com camundongos, através de conjugação de oligonucleotí-deos anti-sentido 2'-O-metila complementares a quatro diferentes miRNAsem colesterol para silenciamento de miRNAs in vivo (Krützfedt e outros2005). Esses assim denominados antagomirs foram administrados a camun-dongos através de injeções intravenosas. Embora esses experimentos te-nham resultado em silenciamento eficaz de miRNAs endógenos in vivo, oqual descobriu-se ser específico, eficiente e de longa duração, uma principaldeficiência era a necessidade de alta dosagem (80 mg/kg) de antagomir 2'-O-Me para silenciamento eficiente.

Inibição de micro-RNAs usando oligonucleotídeos LNA-modifica-dos foi anteriormente descrita por Chan e outros Câncer Research 2005, 65(14) 6029-6033, Lecellier e outros Science 2005, 308, 557-560, Naguibnevae outros Nature Cell Biology 2006 8 (3), 278-84 e 0rum e outros Gene 2006,(Disponível online em 24 de fevereiro de 2006). Em todos os casos, os oli-gonucleotídeos anti-mir LNA-modificados eram complementares a todo omicro-RNA maduro, isto é, 20-23 nucleotídeos de comprimento, o que impe-de a captação eficiente in vivo e ampla biodistribuição das moléculas.

Naguibneva (Naguibneva e outros Nature Cell Biology 2006 8)descrevem o uso de um oligonucleotídeo anti-sentido de DNA-LNA-DNAmixmer anti-mir para inibir a função do micro-RNA miR-181 in vitro, o qual éum bloco de 8 nucleotídeos de LNA localizado no centro da molécula flan-queada por 6 nucleotídeos de DNA na extremidade 5" e 9 nucleotídeos deDNA na extremidade 3', respectivamente. Uma principal deficiência dessedesign anti-sentido é a baixa estabilidade in vivo em virtude de baixa resis-tência à nuclease das extremidade de DNA de flanqueamento.

Embora Chan e outros (Chan e outros Câncer Research 2005,65 (14) 6029-6033), e 0rum e outros (0rum e outros Gene 2006, (Disponívelonline em 24 de Fevereiro de 2006) não divulguem o design das moléculasanti-mir LNA-modificadas usadas em seu estudo, Lecellier e outros (Lecelliere outros Science 2005, 308, 557-560) descrevem o uso de um oligonucleotí-deo anti-sentido de gap-mero LNA-DNA-LNA anti-mir para inibir a função demicro-RNA, no qual um bloco 4 nucleotídeos de LNA está localizado na ex-tremidade 5' e na extremidade 3', respectivamente, com uma janela de 13nucleotídeos de DNA no centro de cada molécula. Uma principal deficiênciadesse design anti-sentido é a baixa captação in vivo, bem como baixa esta-bilidade em virtude do trecho de DNA de 13 nucleotídeos do oligonucleotí-deo anti-mir.

Assim, há uma necessidade no campo por oligonucleotídeosaperfeiçoados capazes de inibir micro-RNAs.SUMARIO DA INVENÇÃO

A presente invenção está baseada na descoberta de que o usode oligonucleotídeos curtos projetados para se ligar com alta afinidade a al-vos de miRNA são altamente eficazes para aliviar a repressão de mRNA pormicro-RNAs in vivo.

Embora não desejando estar preso a qualquer teoria específica,a evidência divulgada aqui indica que a objetivação altamente eficiente demiRNAs in vivo é obtida projetando oligonucleotídeo com o objetivo de for-mação de uma dupla altamente estável com o miRNA alvo in vivo. Isso éobtido através do uso de análogos de nucleotídeos de alta afinidade, tal co-mo pelo menos uma unidade de LNA e, adequadamente, outros análogos denucleotídeo de alta afinidade, tais como LNA1 2'-MOE RNA de análogos denucleotídeo 2'-Fluoro, em um oligonucleotídeo curto, tal como, 10-17 ou ΙΟ-16 nucleobases. Em um aspecto, o objetivo é gerar um oligonucleotídeo deum comprimento o qual é improvável de formar um complexo de siRNA (istoé, um oligonucleotídeo curto) e com uma carga suficiente de análogos denucleotídeo de alta afinidade, de modo que o oligonucleotídeo adere quasepermanentemente a seu miRNA alvo, formando eficazmente uma dupla es-tável e não funcional com o miRNA alvo. Descobriu-se que tais designs sãoconsideravelmente mais eficientes do que os oligonucleotídeos da técnicaanterior, particularmente designs de gap-mero e bloc-âmero e oligonucleotí-deos os quais têm um comprimento longo, por exemplo, 20-23 meros. Otermo 2'-Fluoro DNA se refere a um análogo de DNA onde há uma substitui-ção para flúor na posição 2' (2'F).

A invenção proporciona uma composição farmacêutica compre-endendo um oligonucleotídeo tendo um comprimento de entre 8 e 17, talcomo 10 e 17, tal como 8-16 ou 10-16 unidades de nucleobase, um diluente,veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, em que pelo menos umadas unidades de nucleobase do oligonucleotídeo de fita única é um análogode nucleotídeo de alta afinidade, tal como uma unidade de nucleobase de

Ácido Nucléico Bloqueado (LNA) e em que o oligonucleotídeo de fita única écomplementar a uma seqüência de micro-RNA humana selecionada do gru-po consistindo em micro-RNAs humanos miR-19b, miR-21, miR-122A, miR-155 e miR-375.

A invenção proporciona uma composição farmacêutica compre-endendo um oligonucleotídeo tendo um comprimento de 10 a 26 unidadesde nucleobase e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente acei-tável, em que o oligonucleotídeo compreende uma seqüência de DNA cen-tral a partir das posições dois a sete ou das posições três a oito, contando apartir da extremidade 3' de 3' acgttt 5' (SEQ ID NO 6, 5'tttgca3'), em que pelomenos uma, tal como uma, de preferência, pelo menos duas, tal como duasou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por suaunidade de LNA correspondente e, opcionalmente, em que o referido oligo-nucleotídeo não compreende uma região de mais de 7 unidades de DNAcontínuas.

A invenção proporciona uma composição farmacêutica compre-endendo um oligonucleotídeo tendo um comprimento de 10 a 26 unidadesde nucleobase e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente acei-tável, em que o oligonucleotídeo compreende uma seqüência de DNA cen-tral a partir das posições dois a sete ou das posições três a oito, contando apartir da extremidade 3' de 3' ctcaca 5' (SEQ ID NO 7, 5' acactc 3'), em quepelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal comoduas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas porsua unidade de LNA correspondente e, opcionalmente, em que o referidooligonucleotídeo não compreende uma região de mais de 7 unidades deDNA contínuas.

A invenção proporciona uma composição farmacêutica compre-endendo um oligonucleotídeo tendo um comprimento de 10 a 26 unidadesde nucleobase e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente acei-tável, em que o oligonucleotídeo compreende uma seqüência de DNA cen-tral a partir das posições dois a sete ou das posições três a oito, contando apartir da extremidade 3' de 3' ttacga 5' (SEQ ID NO 8, 5'agcatt3'), em quepelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal comoduas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas porsua unidade de LNA correspondente e, opcionalmente, em que o referidooligonucleotídeo não compreende uma região de mais de 7 unidades deDNA contínuas.

A invenção proporciona uma composição farmacêutica compre-endendo um oligonucleotídeo tendo um comprimento de 10 a 26 unidadesde nucleobase e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente acei-tável, em que o oligonucleotídeo compreende uma seqüência de DNA cen-tral a partir das posições dois a sete ou das posições três a oito, contando apartir da extremidade 3' de 3' acaagc 5' (SEQ ID NO 9, 5' cgaaca 3'), em quepelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal comoduas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas porsua unidade de LNA correspondente e, opcionalmente, em que o referidooligonucleotídeo não compreende uma região de mais de 7 unidades deDNA contínuas.

A invenção proporciona uma composição farmacêutica compre-endendo um oligonucleotídeo tendo um comprimento de 10 a 26 unidadesde nucleobase e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente acei-tável, em que o oligonucleotídeo compreende uma seqüência de DNA cen-tral a partir das posições dois a sete ou das posições três a oito, contando apartir da extremidade 3' de 3" cgaata 5' (SEQ ID NO 10, 5' ataagc3'), em quepelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal comoduas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas porsua unidade de LNA correspondente e, opcionalmente, em que o referidooligonucleotídeo não compreende uma região de mais de 7 unidades deDNA contínuas.

Os análogos de nucleotídeo de alta afinidade são análogos denucleotídeo os quais resultam em um oligonucleotídeo o qual tem uma maiorestabilidade térmica da dupla com um nucleotídeo de RNA complementar doque a afinidade de ligação de um nucleotídeo de DNA equivalente. Isso é,tipicamente, determinado medindo a Tm.

Não identificam-se quaisquer efeitos que não sobre o alvo signi-ficativos quando usando esses oligonucleotídeos curtos de alta afinidadeobjetivados contra miRNAs específicos. Na verdade, a evidência fornecidaaqui indica que os efeitos sobre a expressão de mRNA são em virtude dapresença de uma seqüência complementar ao miRNA objetivado (alvos demRNA primários) dentro do mRNA ou efeitos secundários sobre mRNAs osquais são regulados por alvos de mRNA primários (alvos de mRNA secundá-rios). Nenhum efeito de toxicidade foi identificado, indicando nenhum efeitoprejudicial significativo que não sobre o alvo.

A invenção ainda proporciona o uso de um oligonucleotídeo deacordo com a invenção, tal como aquele o qual pode formar parte da com-posição farmacêutica, para a fabricação de um medicamento para o trata-mento de uma doença ou distúrbio médico associado à presença ou super-expressão (super-regulação) do micro-RNA.

A invenção ainda proporciona um método para o tratamento deuma doença ou distúrbio médico associado à presença ou superexpressãodo micro-RNA compreendendo a etapa de administração de uma composi-ção (tal como a composição farmacêutica) de acordo com a invenção a umapessoa que precisa de tratamento.

A invenção ainda proporciona um método para redução daquantidade eficaz de um miRNA em uma célula ou um organismo compre-endendo administração de uma composição (tal como a composição farma-cêutica) de acordo com a invenção ou um oligonucleotídeo de fita única deacordo com a invenção à célula ou ao organismo. Redução da quantidadeeficaz, nesse contexto, se refere à redução do miRNA funcional presente nacélula ou organismo. É reconhecido que os oligonucleotídeos preferidos deacordo com a invenção podem nem sempre reduzir significativamente aquantidade real de miRNA na célula ou organismo uma vez que, tipicamen-te, eles formam duplas muito estáveis com seus miRNAs alvo.

A invenção ainda proporciona um método para a reversão derepressão de um mRNA alvo de um miRNA em uma célula ou um organismocompreendendo administração de uma composição (tal como a composiçãofarmacêutica) ou um oligonucleotídeo de fita única de acordo com a inven-ção à célula ou organismo.A invenção ainda proporciona o uso de um oligonucleotídeo defita única de entre 8-16, tal como entre 10-16 nucleobases de comprimento,para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença oudistúrbio médico associado à presença ou superexpressão do micro-RNA.

A invenção ainda proporciona um método para o tratamento deuma doença ou distúrbio médico associado à presença ou superexpressãodo micro-RNA compreendendo a etapa de administração de uma composi-ção (tal como a composição farmacêutica) compreendendo um oligonucleo-tídeo de fita única de entre 8-16, tal como entre 10-16 nucleobases de com-primento a uma pessoa que precisa de tratamento.

A invenção ainda proporciona um método para redução daquantidade eficaz de um miRNA alvo (isto é, a quantidade de miRNA a qualestá disponível para reprimir mRNAs alvo) em uma célula ou organismocompreendendo administração de uma composição (tal como a composiçãofarmacêutica) compreendendo um oligonucleotídeo de fita única de entre 8-16, tal como entre 10-16 nucleobases, à célula ou ao organismo.

A invenção ainda proporciona um método para reversão de re-pressão de um mRNA alvo de um miRNA em uma célula ou um organismocompreendendo um oligonucleotídeo de fita única de entre 8-16, tal como10-16 nucleobases ou uma composição compreendendo o referido oligonu-cleotídeo à célula ou ao organismo.

A invenção ainda proporciona um método para a síntese de umoligonucleotídeo de fita única objetivado contra um micro-RNA humano sele-cionado do grupo consistindo em micro-RNAs humanos miR-19b, miR-21,miR-122A, miR-155 e miR-375, tal como um oligonucleotídeo de fita únicadescrito aqui, o referido método compreendendo as etapas de:

a. Opcionalmente seleção de uma primeira nucleobase, contan-do a partir da extremidade 3', a qual é um análogo de nucleotídeo, tal comouma nucleobase de LNA.

b. Opcionalmente, seleção de uma segunda nucleobase, con-tando a partir da extremidade 3', a qual é um análogo de nucleotídeo, talcomo uma nucleobase de LNA.c. Seleção de uma região do oligonucleotídeo de fita única aqual corresponde à região de cultura de miRNA, em que a referida região éconforme definido aqui.

d. Opcionalmente, seleção de uma sétima e oitava nucleobasesconforme definido aqui.

e. Opcionalmente seleção entre 1 e 10 outras nucleobases asquais podem ser selecionadas do grupo consistindo em nucleotídeos (x) eanálogos de nucleotídeo (X), tal como LNA.

f. Opcionalmente, seleção de uma região 5' do oligonucleotídeode fita única conforme definido aqui.

g. Opcionalmente, seleção de um 51 término do oligonucleotídeode fita única conforme definido aqui.

em que a síntese é realizada através de síntese seqüencial das regiões defi-nidas nas etapas a-g, em que a referida síntese pode ser realizada na díre-ção 3'-5' (a para g) ou 5' - 3' (g para a) e em que o referido oligonucleotídeode fita única é complementar a uma seqüência do miRNA alvo.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo da invenção é projetadopara não ser recrutado por RISC ou para mediar a clivagem RISC-dirigida domiRNA alvo. Considera-se que, usando oligonucleotídeos longos, isto é, de21 ou 22 meros. Particularmente oligonucleotídeos de RNA ou um oligonu-cleotídeo "análogo" de RNA o qual é complementar ao miRNA alvo, o oligo-nucleotídeo pode competir contra o mRNA alvo em termos de associação aocomplexo RISC e, desse modo, aliviar a repressão de miRNA dos mRNAsalvos de miRNA via a introdução de um oligonucleotídeo o qual competecomo um substrato pelo miRNA.

Contudo, a presente invenção busca prevenir tal clivagem demRNA alvo indesejável ou inibição traducional através de fornecimento deoligonucleotídeos capazes de complementar e, aparentemente, em algunscasos, se ligar quase que irreversivelmente ao micro-RNA maduro. Isso pa-rece resultar em uma forma de proteção contra degradação ou clivagem (porexemplo, pelo RISC ou RNAseH ou outras endo- ou exo-nucleases), o quepode não resultar em redução substancial ou mesmo significativa do miRNA(por exemplo, conforme detectado através de Northern blot usando sondasde LNA) dentro de uma célula, mas assegura que a quantidade eficaz domiRNA, conforme medido através de análise de reversão de repressão, éreduzida consideravelmente. Portanto, em um aspecto, a invenção propor-ciona oligonucleotídeos os quais são projetados propositalmente para nãoserem compatíveis com o complexo RISC, mas removem miRNA através detitulação pelo oligonucleotídeo. Embora não desejando estar preso a umateoria específica sobre porque os oligonucleotídeos da presente invençãosão tão eficazes, em analogia aos oligonucleotídeos baseado em RNA (ou2'OMe oligonucleotídeos completos), parece que os oligonucleotídeos deacordo com a presente invenção funcionam através de inibição não competi-tiva da função de miRNA, uma vez que eles removem mais eficazmente omiRNA disponível do citoplasma onde, conforme os oligonucleotídeos datécnica anterior, proporcionam um substrato alternativo ao miRNA, o qualpode atuar como um inibidor de competidor, a eficácia do qual seria maisdependente da concentração do oligonucleotídeo no citoplasma, bem comoda concentração do mRNA e miRNA alvos.

Embora não desejando estar preso a qualquer teoria específica,uma outra possibilidade que pode existir com o uso de oligonucleotídeos decomprimento aproximadamente similar aos miRNAs alvo (isto é, o miRNA) éque os oligonucleotídeos poderiam formar uma dupla semelhante a siRNAcom o miRNA alvo, uma situação a qual reduziria a eficácia do oligonucleotí-deo. Também é possível que os oligonucleotídeos em si possam ser usadoscomo a fita guia dentro do complexo RISC, desse modo, gerando a possibili-dade de degradação RISC-dirigida de alvos não específicos, o que aconteceapenas para ter complementaridade suficiente ao guia de oligonucleotídeo.

Através de seleção de oligonucleotídeos curtos para objetivaçãode seqüências de miRNA, tais problemas são evitados.

Oligonucleotídeos curtos os quais incorporam LNA são conhecidosda área de reagentes, tal como o LNA (veja, por exemplo, W02005/098029 eWO 2006/069584). Contudo, as moléculas projetadas para uso diagnóstico ereagente são de design muito diferente daquele para uso farmacêutico. Porexemplo, as nucleobases terminais dos oligos reagentes, tipicamente, nãosão LNA1 mas DNA, e as ligações de internucleosídeo são, tipicamente, ou-tras que não fosforotioato, a ligação preferida para uso nos oligonucleotídeosda presente invenção. A invenção, portanto, proporciona uma nova classede oligonucleotídeos per se.

A invenção ainda proporciona um oligonucleotídeo (fita única),conforme descrito no contexto da composição farmacêutica da invenção, emque o referido oligonucleotídeo compreende:

i) pelo menos uma ligação de fosforotioato e/ou

ii) pelo menos uma unidade de LNA 3'terminal e/ou

iii) pelo menos uma unidade de LNA 5' terminal.

É preferível, para a maioria dos usos terapêuticos, que o oligo-nucleotídeo seja completamente fosforotiolado - a exceção sendo para oli-gonucleotídeos terapêuticos para uso no CNS, tal como no cérebro ou colu-na, onde a fosforotioação pode ser tóxica e, em virtude da ausência de nu-cleases, ligações de fosfodiéster podem ser usadas, mesmo entre unidadesde DNA consecutivas. Conforme mencionado aqui, outros aspectos preferi-dos do oligonucleotídeo de acordo com a invenção é que a segunda nucleo-base 3' e/ou as 9§ e 10§ (a partir da extremidade 3') também podem ser LNA.

Os inventores descobriram que outros métodos para evitar cli-vagem de RNA (tal como degradação por exo-nuclease no soro sangüíneoou clivagem RISC-associada do oligonucleotídeo de acordo com a invençãosão possíveis e, como tal, a invenção também proporciona um oligonucleotí-deo de fita única o qual compreende:

a. uma unidade de LNA na posição 1 e 2 contando a partir daextremidade 3' e/ou

b. uma unidade de LNA na posição 9 e/ou 10, também contan-do a partir da extremidade 3' e/ou

c. uma ou duas unidades de LNA 5'

Embora os benefícios desses outros aspectos possam ser ob-servados com oligonucleotídeos mais longos, tal como um nucleotídeo deaté 26 unidades de nucleobase de comprimento, considera-se que essascaracterísticas podem também ser usadas com os oligonucleotídeos maiscurtos mencionados aqui, tal como os oligonucleotídeos de entre 8 - 17, 8 -16, 10 - 17 ou 10 - 16 nucleobases descritos aqui. É altamente preferidoque os oligonucleotídeos compreendam análogos de nucleotídeo de alta afi- nidade, tais como aqueles referidos aqui, mais preferivelmente unidades deLNA.

Os inventores, portanto, descobriram, surpreendentemente, queoligonucleotídeos de fita única cuidadosamente projetados compreendendounidades de ácido nucléico bloqueado (LNA) em uma ordem particular mos- tram silenciamento significativo de micro-RNAs, resultando em níveis reduzi-dos de micro-RNA. Descobriu-se que ligação hermética dos referidos oligo-nucleotídeos à assim denominada seqüência de cultura, nucleotídeos de 2 a8 ou 2-7, contando a partir da extremidade 5', dos micro-RNAs alvo, era im-portante. O nucleotídeo 1 dos micro-RNAs alvo é uma base de não empare- Ihamento e está, mais provavelmente, oculto em uma bolsa de ligação naproteína Ago 2. Embora não desejando estar preso a uma teoria específica,os presentes inventores consideram que, através de seleção das seqüênciasde região de cultura, particularmente com oligonucleotídeos que compreen-dem LNA, de preferência unidades de LNA na região a qual é complementar à região de cultura, a dupla entre miRNA e oligonucleotídeo é particularmen-te eficaz na objetivação de miRNAs, evitando efeitos que não sobre o alvo e,possivelmente, proporcionando uma outra característica a qual impede afunção de miRNA RISC-dirigida.

Os inventores descobriram, surpreendentemente, que silencia- mento de micro-RNA é ainda mais intensificado quando oligonucleotídeos defita única LNA-modificados não contêm um nucleotídeo na extremidade 3'correspondendo a esse nucleotídeo 1 não emparelhado. Descobriu-se aindaque duas unidades de LNA na extremidade 3' dos oligonucleotídeos de a-cordo com a presente invenção tornam os referidos oligonucleotídeos alta- mente resistentes à nuclease.

Ainda, descobriu-se que os oligonucleotídeos da invenção osquais têm pelo menos um análogo de nucleotídeo, tal como um nucleotídeode LNA nas posições correspondendo às posições 10 e 11, contando a partirda extremidade 5' do micro-RNA alvo, podem impedir a clivagem dos oligo-nucieotídeos da invenção.

Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção se refere a umoligonucleotídeo tendo um comprimento de 12 a 26 nucleotídeos, em que:

i) o primeiro nucleotídeo, contando a partir da extremidade 3',é uma unidade de ácido núcleo bloqueada (LNA),

ii) o segundo nucleotídeo, contando a partir da extremidade 3',é uma unidade de LNA; e

iii) os nono e/ou décimo nucleotídeos, contando a partir da ex-tremidade 3', são uma unidade de LNA.

A invenção ainda proporciona oligonucleotídeos conforme defi-nido aqui para uso como um medicamento.

A invenção ainda refere-se a composições compreendendo osoligonucleotídeos definidos aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Conforme mencionado acima, micro-RNAs estão relacionados auma série de doenças. Conseqüentemente, um quarto aspecto da invenção,se refere ao uso de um oligonucleotídeo conforme definido aqui para a fabri-cação de um medicamento para o tratamento de uma doença associada àexpressão de miRNAs selecionadas do grupo consistindo em atrofia muscu-lar espinhal, síndrome de Tourette, vírus da hepatite C, retardo mental X frá-gil, síndrome de DiGeorge e câncer, tal como leucemia linfocítica crônica,câncer de mama, câncer de pulmão e câncer de cólon, em particular câncer.

Um outro aspecto da invenção é um método para reduzir os ní-veis de micro-RNA alvo através de contato do micro-RNA alvo com um oli-gonucleotídeo conforme definido aqui, em que o oligonucleotídeo:

1. é complementar ao micro-RNA alvo,

2. não contém um nucleotídeo na extremidade 3' que corres-ponde ao primeiro nucleotídeo da extremidade 5' do micro-RNA alvo.

A invenção ainda proporciona um oligonucleotídeo compreen-dendo uma seqüência de nucleobase selecionada do grupo consistindo emSEQ ID NO 20, SEQ ID NQ 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ IDNO 82, SEQ ID NO 83, SEQ ID NO 84, SEQ ID NO 85, SEQ ID NO 86, SEQID NO 87, SEQ ID NO 88, e SEQ ID NO 89; em que uma letra minúsculaidentifica a base nitrogenosa de uma unidade de DNA e uma letra maiúsculaidentifica a base nitrogenosa de uma unidade de LNA; e em que as citosinasde LNA são opcionalmente metiladas ou um conjugado dos mesmos.

A invenção ainda proporciona um oligonucleotídeo compreen-dendo uma seqüência de nucleobase selecionada do grupo consistindo emSEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ IDNO 90, SEQ ID NO 91, SEQ ID NO 92, SEQ ID NO 93, SEQ ID NO 94, SEQID NO 95, SEQ ID NO 96, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 98, SEQ ID NO 99,SEQ ID NO 100, e SEQ ID NO 101; em que uma letra minúscula identifica abase nitrogenosa de uma unidade de DNA e uma letra maiúscula identifica abase nitrogenosa de uma unidade de LNA; e em que as citosinas de LNAsão opcionalmente metiladas ou um conjugado dos mesmos.

A invenção ainda proporciona um oligonucleotídeo compreen-dendo uma seqüência de nucleobase selecionada do grupo consistindo emSEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ IDNO 102, SEQ ID NO 103, SEQ ID NO 104, e SEQ ID NO 105; em que umaletra minúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidade de DNA e umaletra maiúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidade de LNA; e emque as citosinas de LNA são opcionalmente metiladas ou um conjugado dosmesmos.

A invenção ainda proporciona um oligonucleotídeo compreen-dendo uma seqüência de nucleobase selecionada do grupo consistindo emSEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55, SEQ IDNO 106, SEQ ID NO 107, SEQ ID NO 108 e SEQ ID NO 109; em que umaletra minúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidade de DNA e umaletra maiúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidade de LNA; e emque as citosinas de LNA são opcionalmente metiladas ou um conjugado dosmesmos.

A invenção ainda proporciona um oligonucleotídeo compreen-dendo uma seqüência de nucleobase selecionada do grupo consistindo emSEQ ID NO 65, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO 67, SEQ ID NO 68, e SEQ IDNO 69, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, SEQID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45, e SEQ ID NO 46;em que uma letra minúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidadede DNA e uma letra maiúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidadede LNA; e em que as citosinas de LNA são opcionalmente metiladas ou umconjugado dos mesmos.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo pode ter uma seqüên-cia de nucleobase de entre 1-17 nucleobases, tal como 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16 ou 17 nucleobases e, como tal, a oligonucleobase em tal modali-dade pode ser uma sub-seqüência contínua dentro dos oligonucleotídeosdivulgados aqui.

Os inventores da presente invenção descobriram, surpreenden-temente, que oligonucleotídeos anti-sentido de um determinado comprimen-to compreendendo uma seqüência de DNA central em particular e ácidosnucléicos bloqueados (LNAs) na referida seqüência central exibem proprie-dades superiores de inibição de micro-RNA.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1. O efeito de tratamento com diferentes oligonucleotídeosanti-miR de LNA sobre a expressão de ácido nucléico alvo na linhagem decélula expressando miR-122a Huh-7. São mostradas as quantidades demiR-122a (unidades arbitrárias) derivado de uma qRT-PCR miR-122a-específica quando comparado com células não tratadas (placebo). Os oligo-nucleotídeos anti-miR de LNA foram usados em duas concentrações, 1 e100 nM, respectivamente. Também está incluído um controle de combinaçãoerrônea (SPC3350) ao SPC3349 (também referido aqui como SPC3549).

Fig. 2a. Avaliação de dose-resposta de knock-down de anti-miR-122a de LNA para SPC3548 e SPC3549 em comparação com SPC3372 invivo em fígados de camundongo usando RT-PCR em tempo real de miR-122a.

Fig. 2b. Níveis de miR-122 no fígado de camundongo após tra-tamento com diferentes LNA-antimiRs. As moléculas de LNA-antimiR5 SPC3372 e SPC3649 foram administradas a camundongos normais atravésde três injeções i.p. dia sim, dia não durante um período de seis dias nasdoses indicadas e os mesmos foram sacrificados 48 horas após a última do-se. RNA total foi extraído dos fígados dos camundongos e miR-122 foi medi-do através de qPCR miR-122-específica.

Fig. 3. Avaliação dos níveis de colesterol no plasma em camun-dongos tratados com LNA-antimiR-122a comparado com os camundongosde controle que receberam solução salina.

Fig. 4a. Avaliação os níveis relativos de mRNA de Bckdk emcamundongos tratados com LNA antimiR-122a em comparação com camun-dongos de controle com solução salina usando RT-PCR quantitativa emtempo real.

Fig. 4b. Avaliação os níveis relativos de mRNA de aldolase A emcamundongos tratados com LNA antimiR-122a em comparação com camun-dongos de controle com solução salina usando RT-PCR quantitativa emtempo real.

Fig 4c. Avaliação os níveis de mRNA de GAPDH em camun-dongos tratados com LNA antimiR-122a (animais 4-30) em comparação comcamundongos de controle com solução salina (animais 1-3) usando RT-PCRquantitativa em tempo real.

Fig. 5. Avaliação da dose-resposta de knock-down de LNA-antimiR® -122a in vivo em fígados de camundongo usando RT-PCR emtempo real de miR-122a. Seis grupos de animais (5 camundongos por gru-po) foram tratados da seguinte maneira. Os animais do Grupo 1 foram inje-tados com 0,2 ml de solução salina através de i.v. em 3 dias sucessivos, oGrupo 2 recebeu 2,5 mg/kg de SPC3372, o Grupo 3 recebeu 6,25 mg/kg, oGrupo 4 recebeu 12,5 mg/kg e o Grupo 5 recebeu 25 mg/kg, enquanto que oGrupo 6 recebeu 25 mg/kg de SPC 3373 (oligonucleotídeo LNA-antimiR®erroneamente combinado), todos da mesma maneira. O experimento foi re-petido (portanto, η = 10) e os resultados combinados são mostrados.

Fig. 6. Northern blot comparando SPC3649 com SPC3372. RNAtotal de um camundongo em cada grupo foi submetido à Northern blot miR-122-específico. miR-122 maduro e a dupla (micro-RNA bloqueado) formadaentre o LNA-antimiR e miR-122 são indicados.

Fig. 7. Os camundongos foram tratados com 25 mg/kg/dia deLNA-antimiR ou solução salina durante três dias consecutivos e sacrificados1, 2 ou 3 semanas após a última dose. Também são incluídos os valores dosanimais sacrificados 24 horas após a última dose (exemplo 11 "design anti-go"). Os níveis de miR-122 foram avaliados através de qPCR e normaliza-dos para a média do grupo com solução salina em cada ponto de tempo in-dividual. São também incluídos os valores dos animais sacrificados 24 horasapós a última dose (mostrada a média e SD, η = 7, 24h η = 10). Dia 9, 16 ou23 de sacrifício corresponde a sacrifício 1, 2 ou 3 semanas após a últimadose).

Fig. 8. Os camundongos foram tratados com 25 mg/kg/dia deLNA-antimiR ou solução salina durante três dias consecutivos e sacrificados1, 2 ou 3 semanas após a última dose. Também são incluídos os valores dosanimais sacrificados 24 horas após a última dose (exemplo 11 "design anti-go").© colesterol no plasma foi medido e normalizado para o grupo com so-lução salina em cada ponto de tempo (mostrada a média e SD, η = 7, 24h η= 10).

Fig. 9. Indução dose-dependente de miR-122a alvo através deinibição com SPC3372 de miR-122a. Os camundongos foram tratados comdiferentes doses de SPC3372 durante três dias consecutivos, conforme des-crito acima, e sacrificados 24 horas depois da última dose. O RNA total ex-traído do fígado foi submetido à qPCR. Genes com um sítio previsto de miR-122 alvo e observados como estando super-regulados através de análise demicroarranjo foram investigados com relação à indução dose-dependenteatravés de aumento das doses de SPC3372 usando qPCR. RNA total defígado de 2 a 3 camundongos por grupo sacrificados 24 horas após a últimadose foi submetido à qPCR para os genes indicados. São mostrados na figu-ra 9 os níveis de mRNA com relação ao grupo com solução salina, η = 2-3(2,5 - 12,5 mg/kg/dia: η = 2, sem SD). Também é mostrado o controle decombinação errônea (mm, SPC3373)

Fig. 10. Indução transitória de mRNAs de miR-122a alvo apóstratamento com SPC3372. Camundongos NMRI fêmeas foram tratados com25 mg/kg/dia de SPC3372 junto com um controle de solução salina durantetrês dias consecutivos e sacrificados 1, 2 ou 3 semanas após a última dose.RNA foi extraído dos fígados e os níveis de mRNA de mRNAs previstos demiR-122a alvo, selecionados através de dados de microarranjo, foram inves-tigados através de qPCR. Três animais de cada grupo foram analisados.

Fig. 11. Indução de Vldlr em fígado através de tratamento comSPC3372. As mesmas amostras de RNA de fígado conforme no exemploanterior (figura 10) foram investigadas com relação à indução de Vldlr.

Fig. 12. Estabilidade da dupla miR-122a/ SPC3372 no plasmade camundongo. A estabilidade do SPC3372 e da dupla SPC3372/miR-122afoi testada no plasma de camundongo a 37°C durante 96 horas. É mostradona figura 12 um PAGE corado com SYBR-Gold.

Fig. 13. Captura de miR-122a maduro por SPC3372 leva à for-mação de dupla. É mostrada na figura 13 uma membrana hibridizada comuma sonda miR-122a-específica (painel superior) e re-hibridizada com umasonda Let-7-específica (painel inferior). Com a sonda miR-122, duas bandaspuderam ser detectadas, uma correspondendo ao miR-122 maduro e umacorrespondendo a uma dupla entre SPC3372 e miR-122.

Fig. 14. Captura de miR-122a por SPC3372 junto com a distribu-ição de SPC3372 avaliada através de hibridização in situ de seções de fíga-do. Criosseções de fígado de animais tratados foram.

Fig. 15. Expressão de gene no fígado em camundongos tratadoscom LNA-antimiR miR-122. Camundongos tratados com solução salina eLNA-antimiR foram comparados através de caracterização de perfil por ex-pressão ampla em genoma usando arranjos Affymetrix Mouse Genome 4302.0. (a,1) Mostrado o número de sondas que mostraram expressão diferen-ciai, em amostras de fígado, de camundongos tratados com LNA-antimiR-122 e solução salina 24 horas após tratamento. (b,2) A ocorrência de se-qüência de cultura de miR-122 em genes diferencialmente expressos. A plo-tagem mostra o percentual de transcritos com pelo menos uma seqüência dereconhecimento de cultura de miR-122 em sua 3' UTR. Aleatório: seqüên-cias aleatórias foram geradas e pesquisas com relação a seqüências de re-conhecimento de cultura de miR-122. Perfis de expressão de gene no fígadotemporais em camundongos tratados com LNA-antimiR. Os camundongosforam tratados com 25 mg/kg/dia de LNA-antimiR ou solução salina durantetrês dias consecutivos e sacrificados 1, 2 ou 3 semanas depois da últimadose. Incluídos também são os valores dos animais sacrificados 24 horasapós a última dose. (c,3) Amostras de RNA de diferentes pontos de tempotambém foram submetidas à caracterização de perfil de expressão. Análisede agrupamento hierárquico dos perfis de expressão de genes identificadoscomo diferencialmente expressos entre camundongos tratados com LNA-antimiR e solução salina 24 horas, uma semana ou três semanas pós-tratamento. (d,4) Perfis de expressão de genes identificados como diferenci-almente expressos entre camundongos tratados com LNA-antimiR e soluçãosalina 24 horas pós-tratamento foram acompanhados com o tempo. As pro-porções de expressão e genes super- e sub-regulados em camundongostratados com LNA-antimiR se aproxima de 1 na maioria do curso de tempo,indicando um efeito reversível do tratamento com LNA-antimiR.

Fig. 16. O efeito de tratamento com SPC3372 e 3595 sobre osníveis de miR-122 em fígados de camundongo.

Fig. 17. O efeito de tratamento com SPC3372 e 3595 sobre osníveis de Aldolase A em fígados de camundongo.

Fig. 18. O efeito de tratamento com SPC3372 e 3595 sobre osníveis de Bckdk em fígados de camundongo.

Fig. 19. O efeito de tratamento com SPC3372 e 3595 sobre osníveis de CD320 em fígados de camundongo.

Fig. 20. O efeito de tratamento com SPC3372 e 3595 sobre osníveis de Ndrg3 em fígados de camundongo.Fig.21. O efeito de tratamento a longo prazo com SPC3649 so-bre o colesterol total no plasma em camundongos hipercolesterolêmicos enormais. Amostras semanais de plasma sangüíneo foram obtidas dos ca-mundongos de controle tratados com solução salina e tratados comSPC3649 uma vez por semana, seguido por avaliação do colesterol total noplasma. Os camundongos foram tratados com 5 mg/kg de SPC3649,SPC3744 ou solução salina duas vezes por semana. Camundongos normaisforam tratados em paralelo.

Fig.22. O efeito de tratamento a longo prazo com SPC3649 so-bre os níveis de miR-122 em camundongos hipercolesterolêmicos e normais.

Fig. 23. O efeito de tratamento a longo prazo com SPC3649 so-bre os níveis de Aldolase A em camundongos hipercolesterolêmicos e nor-mais.

Fig. 24. O efeito de tratamento a longo prazo com SPC3649 so-bre os níveis de Bckdk em camundongos hipercolesterolêmicos e normais.

Fig. 25. O efeito de tratamento a longo prazo com SPC3649 so-bre os níveis de AST em camundongos hipercolesterolêmicos e normais.

Fig. 26. O efeito de tratamento a longo prazo com SPC3649 so-bre os níveis de ALT em camundongos hipercolesterolêmicos e normais.

Fig. 27. Modulação de replicação de HCV por SPC3649 em ummodelo com células Huh-7. Análise de Northern blot do RNA de HCV emcélulas Huh-7 após transfecção com diferentes moléculas de LNA-antimiR(SPC3648, SPC3649 e SPC3550) e 2" OMe antago-mir-122 (painel superi-or). As intensidades de sinal de hibridização foram quantificadas e normali-zadas para os sinais de mRNA de espectrina em cada fileira (painel inferior).

Fig. 28. Reversão de repressão funcional de Iuciferase Renillacom miR-19b alvo através de oligonucleotídeos de bloqueio de miR-19b emuma linhagem de célula expressando miR-19b endogenamente, HeLa. "miR-19b alvo" é o plasmídeo com miR-19b alvo, mas não co-transfectado comoligo de bloqueio miR-19b e, conseqüentemente, representa expressão deluciferase Renilla totalmente reprimida por miR-19b.

Fig. 29. Reversão de repressão funcional de Iuciferase Renillacom o miR-122 alvo através de oligonucleotídeos de bloqueio de miR-122em uma linhagem de célula expressando miR-122 endogenamente, Huh-7."miR-122 alvo" é o plasmídeo correspondente com miR-122 alvo, mas nãoco-transfectado com o oligo de bloqueio miR-122 e, conseqüentemente, re-presenta expressão de Iuciferase Renilla totalmente reprimida por miR-122.

Fig. 30. Diagrama ilustrando o alinhamento de um oligonucleotí-deo de acordo com a invenção e um micro-RNA alvo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O oligonucleotídeo da invenção é, tipicamente, fita única. Por-tanto, deve ser compreendido que, dentro do contexto da invenção, o termooligonucleotídeo pode ser usado permutavelmente com o termo oligonucleo-tídeo de fita única.

Em uma modalidade, a invenção proporciona composições far-macêuticas compreendendo oligonucleotídeos curtos (fita única), com umcomprimento de entre 8 e 17 nucleobases de comprimento, tal como entre10 e 17 nucleobases de comprimento, os quais são complementares a mi-cro-RNAs humanos. Os oligonucleotídeos curtos são particularmente efica-zes para aliviar repressão de miRNA in vivo. Descobriu-se que a incorpora-ção de análogos de nucleotídeo de alta afinidade nos oligonucleotídeos re-sulta em moléculas anti-micro-RNA altamente eficazes as quais parecemfuncionar via a formação de duplas quase irreversíveis com o miRNA alvo,ao invés de mecanismos baseados em clivagem de RNA, tais como meca-nismo associados à RNaseH ou RISC.

É altamente preferível que o oligonucleotídeo de fita única deacordo com a invenção compreenda uma região de seqüência de nucleoba-se contínua a qual é 100% complementar à região de cultura de micro-RNAhumana.

É preferível que o oligonucleotídeo de fita única de acordo coma invenção seja complementar à seqüência de micro-RNA humano maduro.

Oligonucleotídeos preferidos de acordo com a invenção sãocomplementares a uma seqüência de micro-RNA selecionada do grupo con-sistindo em has-miR19b, hsa-miR21, hsa-miR 122, hsa-miR 142 a7b, hsa-miR 155, hsa-miR 375.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com a inven-ção não compreende uma nucleobase na extremidade 3' que correspondeao primeiro nucleotídeo na extremidade 5' do micro-RNA alvo.

Em uma modalidade, a primeira nucleobase do oligonucleotídeode fita única de acordo com a invenção, contando a partir da extremidade 3',é um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA.

Em uma modalidade, a segunda nucleobase do oligonucleotídeode fita única de acordo com a invenção, contando a partir da extremidade 3',é um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA.

Em uma modalidade, os nono e/ou décimo nucleotídeos do oli-gonucleotídeo de fita única de acordo com a invenção, contando a partir daextremidade 3' é, um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade deLNA.

Em uma modalidade, a nona nucleobase do oligonucleotídeo defita única de acordo com a invenção, contando a partir da extremidade 3' é,um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA.

Em uma modalidade, a décima nucleobase do oligonucleotídeode fita única de acordo com a invenção, contando a partir da extremidade 3'é, um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA.

Em uma modalidade, as nona e décima nucleobases do oligo-nucleotídeo de fita única de acordo com a invenção, calculado a partir daextremidade 3' é, um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade deLNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única de acordocom a invenção não compreende uma região de mais de 5 unidades de nu-cleotídeo de DNA consecutivas. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo defita única de acordo com a invenção não compreende uma região de mais de6 unidades de nucleotídeo de DNA consecutivas. Em uma modalidade, ooligonucleotídeo de fita única de acordo com a invenção não compreendeuma região de mais de 7 unidades de nucleotídeo de DNA consecutivas. Emuma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única de acordo com a invençãonão compreende uma região de mais de 8 unidades de nucleotídeo de DNAconsecutivas. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única de acor-do com a invenção não compreende uma região de mais de 3 unidades denucleotídeo de DNA consecutivas. Em uma modalidade, o oligonucleotídeode fita única de acordo com a invenção não compreende uma região de maisde 2 unidades de nucleotídeo de DNA consecutivas.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos uma região consistindo em pelo menos duas unidades deanálogo de nucleotídeo consecutivas, tal como pelo menos duas unidadesconsecutivas de LNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos uma região consistindo em pelo menos três unidades de aná-logo de nucleotídeo consecutivas, tal como pelo menos três unidades con-secutivas de LNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única da inven-ção não compreende uma região de mais de 7 unidades de análogo de nu-cleotídeo consecutivas, tal como unidades consecutivas de LNA. Em umamodalidade, o oligonucleotídeo de fita única da invenção não compreendeuma região de mais de 6 unidades de análogo de nucleotídeo consecutivas,tal como unidades consecutivas de LNA Em uma modalidade, o oligonucleo-tídeo de fita única da invenção não compreende uma região de mais de 5unidades de análogo de nucleotídeo consecutivas, tal como unidades con-secutivas de LNA. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única dainvenção não compreende uma região de mais de 4 unidades de análogo denucleotídeo consecutivas, tal como unidades consecutivas de LNA. Em umamodalidade, o oligonucleotídeo de fita única da invenção não compreendeuma região de mais de 3 unidades de análogo de nucleotídeo consecutivas,tal como unidades consecutivas de LNA. Em uma modalidade, o oligonu-cleotídeo de fita única da invenção não compreende uma região de mais de2 unidades de análogo de nucleotídeo consecutivas, tal como unidades con-secutivas de LNA.

Em uma modalidade, a primeira ou segunda 3' nucleobase dooligonucleotídeo de fita única corresponde ao segundo 5' nucleotídeo da se-qüência do micro-RNA.

Em uma modalidade, as unidades de nucleobase 1 a 7 (incluin-do) do oligonucleotídeo de fita única, conforme medido a partir da extremi-dade 3' da região do oligonucleotídeo de fita única são complementares àseqüência de região de cultura de micro-RNA.

Em uma modalidade, as unidades de nucleobase 2 a 7 (incluin-do) do oligonucleotídeo de fita única, conforme medido a partir da extremi-dade 3' da região do oligonucleotídeo de fita única são complementares àseqüência de região de cultura de micro-RNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos uma unidade de análogo de nucleotídeo, tal como pelo me-nos uma unidade de LNA, em uma posição a qual está dentro da regiãocomplementar à região de cultura de miRNA. O oligonucleotídeo de fita úni-ca pode, em uma modalidade, compreender entre 1 e 6 ou entre 1 e 7 uni-dades de análogo de nucleotídeo, tal como entre 1 e 6 e 1 e 7 unidades deLNA, em uma posição a qual está dentro da região complementar à regiãode cultura de miRNA.

Em uma modalidade, a seqüência de nucleobase do oligonucle-otídeo de fita única a qual é complementar à seqüência da região de culturade micro-RNA é selecionada do grupo consistindo em (X)Xxxxxx, (X)xXxxxx,(X)xxXxxx, (X)xxxXxx, (X)xxxxXx e (X)xxxxxX, conforme lido em uma direção3' - 5', em que "X" denota um análogo de nucleotídeo, (X) denota um análo-go de nucleotídeo opcional, tal como uma unidade de LNA, e "x" denota umaunidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos duas unidades de análogo de nucleotídeo, tal como pelo me-nos duas unidades de LNA, em posições as quais são complementares àregião de cultura de miRNA.

Em uma modalidade, a seqüência de nucleobase do oligonucle-otídeo de fita única a qual é complementar à seqüência da região de culturade micro-RNA, é selecionado do grupo consistindo em (X)XXxxxx,(X)XxXxxxi (X)XxxXxx, (X)XxxxXx, (X)XxxxxXj (Χ)χΧΧχχχ, (Χ)χΧχΧχχ,(Χ)χΧχχΧχ, (Χ)χΧχχχΧ, (X)xxXXxx, (X)xxXxXx, (Χ)χχΧχχΧ, (Χ)χχχΧΧχ,(Χ)χχχΧχΧ e (Χ)χχχχΧΧ, em que "Χ" denota um análogo de nucleotídeo, talcomo uma unidade de LNA, (X) denota um análogo de nucleotídeo opcional,tal como uma unidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nucleotídeo deDNA ou RNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos três unidades de análogo de nucleotídeo, tal como pelo me-nos três unidades de LNA, em posições as quais são complementares à re-gião de cultura de miRNA.

Em uma modalidade, a seqüência de nucleobase do oligonucle-otídeo de fita única a qual é complementar à seqüência da região de culturade micro-RNA, é selecionado do grupo consistindo em (X)XXXxxx,(X)xXXXxx, (X)xxXXXx, (X)xxxXXX, (X)XXxXxx, (X)XXxxXx, (X)XXxxxX,(X)xXXxXx, (X)xXXxxX, (X)xxXXxX, (X)XxXXxx, (X)XxxXXx, (X)XxxxXX,(X)xXxXXx, (X)xXxxXX, (X)xxXxXX, (X)xXxXxX e (X)XxXxXx, em que "X"denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, (X) deno-ta um análogo de nucleotídeo opcional, tal como uma unidade de LNA, e "x"denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos quatro unidades de análogo de nucleotídeo, tal como pelomenos quatro unidades de LNA, em posições as quais são complementaresà região de cultura de miRNA.

Em uma modalidade a seqüência de nucleobase do oligonucleo-tídeo de fita única a qual é complementar à seqüência da região de culturade micro-RNA, é selecionado do grupo consistindo em (X)xxXXX,(X)xXxXXX, (X)xXXxXX, (X)xXXXxX, (X)xXXXXx, (X)XxxXXXX, (X)XxXxXX,(X)XxXXxX, (X)XxXXx, (X)XXxxXX, (X)XXxXxX, (X)XXxXXx, (X)XXXxxX,(X)XXXxXx, e (X)XXXXxx, em que "X" denota um análogo de nucleotídeo, talcomo uma unidade de LNA, (X) denota um análogo de nucleotídeo opcional,tal como uma unidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nucleotídeo deDNA ou RNA.Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos cinco unidades de análogo de nucleotídeo, tal como pelomenos cinco unidades de LNA1 em posições as quais são complementares àregião de cultura de miRNA.

Em uma modalidade, a seqüência de nucleobase do oligonucle-otídeo de fita única a qual é complementar à seqüência da região de culturade micro-RNA, é selecionado do grupo consistindo em (X)xXXXXX,(X)XxXXXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX, (X)XXXXxX e (X)XXXXXx, em que "X"denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA1 (X) deno-ta um análogo de nucleotídeo opcional, tal como uma unidade de LNA, e "x"denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos seis unidades de análogo de nucleotídeo, tal como pelo me-nos seis unidades de LNA, em posições as quais são complementares à re-gião de cultura de miRNA.

Em uma modalidade, a seqüência de nucleobase do oligonucle-otídeo de fita única a qual é complementar à seqüência da região de culturade micro-RNA, é selecionado do grupo consistindo em XXXXXX, XxXXXXX,XXxXXXX, XXXxXXX, XXXXxXX, XXXXXxX e XXXXXXx, em que "X" denotaum análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, tal como umaunidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

Em uma modalidade, os dois motivos de nucleobase nas posi-ções 7 a 8, contando a partir da extremidade 3' do oligonucleotídeo de fitaúnica é selecionado do grupo consistindo em xx, XX, xX e Xx, em que "X"denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, tal comouma unidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ouRNA.

Em uma modalidade, os dois motivos de nucleobase nas posi-ções 7 a 8, contando a partir da extremidade 3' do oligonucleotídeo de fitaúnica é selecionado do grupo consistindo em XX, xX e Xx, em que "X" deno-ta um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, tal como umaunidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.m uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreendepelo menos 12 nucleobases e em que os dois motivos de nucleobase nasposições 11 a 12, contando a partir da extremidade 3' do oligonucleotídeo defita única é selecionado do grupo consistindo em xx, XX, xX e Xx, em que"X" denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, talcomo uma unidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nucleotídeo deDNA ou RNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos 12 nucleobases e em que os dois motivos de nucleobase nasposições 11 a 12, contando a partir da extremidade 3' do oligonucleotídeo defita única é selecionado do grupo consistindo em XX, xX e Xx, em que "X"denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, tal comouma unidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ouRNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos 13 nucleobases e em que os três motivos de nucleobase nasposições 11 to 13, contando a partir da extremidade 3', é selecionado dogrupo consistindo em xxx, Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX e XXX, em que "X"denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, tal comouma unidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ouRNA.

Em uma modalidade, os três motivos de nucleobase nas posi-ções 11 a 13, contando a partir da extremidade 3' do oligonucleotídeo de fitaúnica, é selecionado do grupo consistindo em Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX e XXX, em que "X" denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unida-de de LNA, tal como uma unidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nu-cleotídeo de DNA ou RNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos 14 nucleobases e em que os quatro motivos de nucleobasenas posições 11 a 14, contando a partir da extremidade 3', é selecionado dogrupo consistindo em xxxx, Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX,xXXx, xXxX, xxXX, XXXx, XxXX, xXXX, XXxX e XXXX em que "X" denotaum análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA1 tal como umaunidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

Em uma modalidade, os quatro motivos de nucleobase nas po-sições 11 a 14 do oligonucleotídeo de fita única, contando a partir da extre-midade 3', é selecionado do grupo consistindo em Xxxx1 xXxx, xxXx, xxxX,XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX, xxXX, XXXx, XxXX, xXXX, XXxX e XXXX,em que "X" denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade deLNA, e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de 15 nucleobases e os cinco motivos de nucleobase nas posições 11 a 15,contando a partir da extremidade 3', é selecionado do grupo consistindo emXxxxx, xXxxx, xxXxx, xxxXx, xxxxX, XXxxx, XxXxx, XxxXx, XxxxXl xXXxx,xXxXx, xXxxX, xxXXx, xxXxX, xxxXX, XXXxx, XXxxX, XxxXX, xXXXx,xxXXX, XXxXX, XxXxX, XXXXx, XXXxX, XXxXX, XxXXXX, xXXXX, eXXXXX em que "X" denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unida-de de LNA, tal como uma unidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nu-cleotídeo de DNA ou RNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de 16 nucleobases e os seis motivos de nucleobase nas posições 11 a 16,contando a partir da extremidade 3', é selecionado do grupo consistindo emXxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx, xxxxxX, XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx,XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx,xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX, xxxxXX, XXXxxx, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX,XxXXxx, XxXxXx, XxXxxX, XxxXXx, XxxXxX, XxxxXX, xXXXxx, xXXxXx,xXXxxX, xXxXXx, xXxXxX, xXxxXX, xxXXXx, xxXXxX, xxXxXX, xxxXXX,XXXXxx, XXXxxX, XXxxXX, XxxXXX, xxXXXX, xXxXXX, XxXxXX, XXxXxX,XXXxXx, xXXxXX, XxXXxX, XXxXXx, xXXXxX, XxXXXx, xXXXXx, xXXXXX,XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX, XXXXXx, e XXXXXX em que "X" de-nota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, tal comouma unidade de LNA, e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ouRNA.

Em uma modalidade, os seis motivos de nucleobase nas posi-ções 11 a 16 do oligonucleotídeo de fita única, contando a partir da extremi-dade 3', is xxXxxX, em que "X" denota um análogo de nucleotídeo, tal comouma unidade de LNA1 tal como uma unidade de LNA1 e "x" denota uma uni-dade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

Em uma modalidade, as três nucleobases mais 5' são selecio-nadas do grupo consistindo em Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX e XXX, emque "X" denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA,tal como uma unidade de LNA1 e "x" denota uma unidade de nucleotídeo deDNA ou RNA.

Em uma modalidade, x" denota uma unidade de DNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de uma unidade de análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA,na extremidade 5'.

Em uma modalidade, as unidades de análogo de nucleotídeo, talcomo X, são independentemente selecionadas do grupo consistindo em:unidade de 2'-0-alquil-RNA, unidade de 2'-OMe-RNA, unidade de 2'-amino-DNA, unidade de 2'-fluoro-DNA, unidade de LNA, unidade de PNA, unidadede HNA, unidade de INA.

Em uma modalidade, todas as nucleobases do oligonucleotídeode fita única da invenção são unidades de análogo de nucleotídeo.

Em uma modalidade, as unidades de análogo de nucleotídeo, talcomo X, são independentemente selecionadas do grupo consistindo em:unidade de 2'-OMe-RNAs, unidade de 2'-fluoro-DNAs, e unidades de LNA,

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de a referida pelo menos uma unidade de análogo de LNA e pelo menosuma outra unidade de análogo de nucleotídeo que não LNA.

Em uma modalidade, a unidade de análogo de nucleotídeo denão-LNA é independentemente selecionada de unidades de 2'-OMe RNA eunidades de 2'-fluoro DNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única consistede pelo menos uma seqüência XYX ou YXY, em que X é LNA e Y é umaunidade de 2'-OMe RNA e uma unidade de 2'-fluoro DNA.Em uma modalidade, a seqüência de nucleobases do oligonu-cleotídeo de fita única consiste de unidades XeY alternadas.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de unidades de LNA e DNA alternadas (Xx) ou (xX).

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de um motivo de LNA alternado, seguido por 2 unidades de DNA (Xxx), xXxou xxX.

Em uma modalidade, pelo menos uma unidade de análogo denucleotídeo de DNA ou não-LNA são substituídas por uma nucleobase de LNA em uma posição selecionada das posições identificadas como unidadesde nucleobase de LNA em qualquer uma das modalidades mencionadasacima.

Em uma modalidade,"X" denota uma unidade de LNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen- de pelo menos 2 unidades de análogo de nucleotídeo, tal como pelo menos3 unidades de análogo de nucleotídeo, tal como pelo menos 4 unidades deanálogo de nucleotídeo, tal como pelo menos 5 unidades de análogo de nu-cleotídeo, tal como pelo menos 6 unidades de análogo de nucleotídeo, talcomo pelo menos 7 unidades de análogo de nucleotídeo, tal como pelo me- nos 8 unidades de análogo de nucleotídeo, tal como pelo menos 9 unidadesde análogo de nucleotídeo, tal como pelo menos 10 unidades de análogo denucleotídeo.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos 2 unidades de LNA, tal como pelo menos 3 unidades de LNA, tal como pelo menos 4 unidades de LNA, tal como pelo menos 5 unidadesde LNA, tal como pelo menos 6 unidades de LNA, tal como pelo menos 7unidades de LNA, tal como pelo menos 8 unidades de LNA, tal como pelomenos 9 unidades de LNA, tal como pelo menos 10 unidades de LNA.

Em uma modalidade em que pelo menos um dos análogos de nucleotídeo, tal como unidades de LNA, é citosina ou guanina, tal como en-tre 1 — 10 dos análogos de nucleotídeo, tal como unidades de LNA, é citosi-na ou guanina, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 dos análogos de nucleotídeo,tal como unidades de LNA, é citosina ou guanina.

Em uma modalidade pelo menos dois dos análogos de nucleotí-deo tal como unidades de LNA é citosina ou guanina. Em uma modalidadepelo menos três dos análogos de nucleotídeo tal como unidades de LNA écitosina ou guanina. Em uma modalidade pelo menos quatro dos análogosde nucleotídeo tal como unidades de LNA é citosina ou guanina. Em umamodalidade pelo menos cinco dos análogos de nucleotídeo tal como unida-des de LNA é citosina ou guanina. Em uma modalidade pelo menos seis dosanálogos de nucleotídeo tal como unidades de LNA é citosina ou guanina.Em uma modalidade pelo menos sete dos análogos de nucleotídeo tal comounidades de LNA é citosina ou guanina. Em uma modalidade pelo menosoito dos análogos de nucleotídeo tal como unidades de LNA é citosina ouguanina.

Em uma modalidade preferida, os análogos de nucleotídeo têmuma elevada estabilidade térmica da dupla a um RNA complementar do quea afinidade de ligação de um nucleotídeo de DNa equivalente ao referidonucleotídeo de RNA complementar.

Em uma modalidade, os análogos de nucleotídeo conferem es-tabilidade intensificada no soro ao oligonucleotídeo de fita única.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única forma umaconformação de A - hélice com uma molécula de RNA fita única comple-mentar.

Uma dupla entre duas moléculas de RNA existe, tipicamente,em uma conformação de A- forma, onde uma dupla entre duas moléculas deDNA existe, tipicamente, em uma conformação de B- forma. Uma dupla en-tre uma molécula de DNA e RNA existe, tipicamente em uma conformaçãointermediária (forma A/B). O uso de análogos de nucleotídeo, tal como beta-D-óxi LNA pode ser usado para promover uma conformação semelhante àforma A. Dicromismos circulares (CD) padrões ou análise por NMR é usadapara determinar a forma de duplas entre os oligonucleotídeos da invenção emoléculas de RNA complementares.

Uma vez que se acredita que o recrutamento pelo complexoRISC é dependente da conformação estrutural específica do miRNA/mRNAalvo, os oligonucleotídeos de acordo com a presente invenção podem, emuma modalidade formar uma dupla A/B- com uma molécula de RNA com-plementar.

Contudo, também determinou-se que o uso de análogos de nu-cleotídeo os quais promovem a estrutura de A - forma também podem sereficazes, tal como o isômero alfa-L de LNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única forma umaconformação de A/B-forma com uma molécula de RNA fita única comple-mentar.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única forma umaconformação de A - forma com uma molécula de RNA fita única complementar.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única de acordocom a invenção não media a clivagem baseada em RNAseH de uma molé-cula de RNA fita única complementar. Tipicamente, um trecho de pelo me-nos 5 (tipicamente não efetivo de recrutamento de RNAseH), mais preferi-velmente pelo menos 6, mais preferivelmente pelo menos 7 ou 8 nucleoba-ses de DNA consecutivas (ou nucleobases alternadas as quais podem recru-tar RNAseH, tal como alfa L-amino LNA) são requeridas de forma que umoligonucleotídeo seja eficaz no recrutamento de RNAseH.

O EP 1 222 309 proporciona métodos in vitro para determinaçãode atividade de RNAseH os quais podem ser usados para determinar a ca-pacidade de recrutar RNAaseH. Um composto é considerado capaz de re-crutar RNAseH se, quando fornecido com o RNA alvo complementar, eletem uma taxa inicial, conforme medido pmol/l/min, de pelo menos 1 %, talcomo pelo menos 5%, tal como pelo menos 10% ou menos de 20% do DNAequivalente do oligonucleotídeo, sem 2' substituições com grupos de ligaçãode fosforotioato entre todos os nucleotídeos no oligonucleotídeo, usando ametodologia fornecida pelo Exemplo 91 - 95 do EP 1 222 309.

Um composto é considerado incapaz de recrutar RNaseH quan-do fornecido com o RNA alvo complementar, ele tem uma taxa inicial, con-forme medido pmol/l/min, de menos de 1%, tal como menos de 5%, tal comomenos de 10% ou menos de 20% da taxa inicial determinada usando o oli-gonucleotídeo de DNA equivalente apenas, sem 2' substituições, com gru-pos de ligação de fosforotioato entre todos os nucleotídeos no oligonucleotí-deo usando a metodologia fornecida pelo Exemplo 91 - 95 do EP 1 222 309.

Em uma modalidade altamente preferida o oligonucleotídeo defita única da invenção é capaz de forma uma dupla com uma molécula deácido nucléico de RNA fita única complementar (tipicamente de cerca domesmo comprimento que o referido oligonucleotídeo de fita única) com Iiga-ções internucleosídeo de fosfodiéster, em que a dupla tem uma Tm de pelomenos cerca de 60 °C; na verdade, é preferido que o oligonucleotídeo de fitaúnica seja capaz de formar uma dupla com uma molécula de ácido nucléicode RNA fita única complementar com ligações internucleosídeo de fosfodiés-ter, em que a dupla tem uma Tm de entre cerca de 70 °C a cerca de 95 °C,tal como uma Tm de entre cerca de 70 °C a cerca de 90 °C, tal como entrecerca de 70 °C e cerca de 85 °C.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única é capaz deformar uma dupla com uma molécula de ácido nucléico de DNA fita únicacomplementar com ligações internucleosídeo de fosfodiéster, em que a du-pLa tem uma Tm de entre cerca de 50 °C a cerca de 95 °C, tal como entrecerca de 50 °C a cerca de 90 °C, tal como pelo menos cerca de 55 °C, talcomo pelo menos cerca de 60 °C ou não mais de cerca de 95 °C.

O oligonucleotídeo de fita única pode, em uma modalidade, terum comprimento de entre 14-16 nucleobases, incluindo 15 nucleobases.

Em uma modalidade, a unidade ou unidades de LNA são inde-pendentemente selecionadas do grupo consistindo em óxi-LNA, tio-LNA, eamino-LNA,na configuração de D-β e L-aou combinações das mesmas.

Em uma modalidade específica, as unidades de LNA podem seruma nucleobase de ΕΝΑ.

Em uma modalidade, as unidades de LNA são beta D óxi-LNA.

Em uma modalidade, as unidades de LNA são alfa-L aminoLNA.Em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo de fita únicacompreende entre 3 e 17 unidades de LNA.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos um grupo de ligação internucleosídeo o qual difere de fosfato.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos uma ligação internucleosídeo de fosforotioato.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de ligações de fosfodiéster e fosforotioato.

Em uma modalidade, todas as ligações internucleosídeo sãoligações de fosforotioato.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de fita única compreen-de pelo menos uma ligação internucleosídeo de fosfodiéster.

Em uma modalidade, todas as ligações internucleosídeo do oli-gonucleotídeo de fita única da invenção são ligações de fosfodiéster.

Em uma modalidade, uma composição farmacêutica de acordocom a invenção compreende um veículo, tal como solução salina ou soluçãosalina tamponada.

Em uma modalidade, o método para a síntese de oligonucleotí-deo de fita única objetivado contra um micro-RNA humano é realizado nadireção 3' a 5' a -f.

O método para a síntese do oligonucleotídeo de fita única deacordo com a invenção pode ser realizado usando síntese de oligonucleotí-deo em fase sólida padrão.

Outras modalidades da invenção as quais podem ser combina-das com as modalidades acima são mostradas nas reivindicações e sob otítulo Outras Modalidades".

Definições

O termo 'nucleobase' se refere a nucleotídeo, tai como DNA eRNA, e análogos de nucleotídeo.

O termo "oligonucleotídeo" (ou simplesmente "oligo") se refere,no contexto da presente invenção, a uma molécula formada através de liga-ção covalente de duas ou mais nucleobases quando usado no contexto dooligonucleotídeo da invenção (também referido como oligonucleotídeo de fitaúnica), o termo "oligonucleotídeo" pode ter, em uma modalidade, por exem-plo, entre 8 -26 nucleobases, tal como entre 10 a 26 nucleobases, tal comoentrei2 a 26 nucleobases. Em uma modalidade preferida, conforme deta-Ihado aqui, o oligonucleotídeo da invenção tem um comprimento de entre 8 -17 nucleobases, tal como entre 20 -27 nucleobases tal como entre 8-16nucleobases, tal como entre 12-15 nucleobases.

Em tal modalidade, o oligonucleotídeo da invenção pode ter umcomprimento de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 25 ou 26 nucleobases.

Será reconhecido que, para oligonucleotídeos mais curtos, podeser necessário aumentar a proporção de análogos de nucleotídeo (alta afini-dade), tal como LNA. Portanto, em uma modalidade pelo menos cerca de30% das nucleobases são análogos de nucleotídeo, tal como pelo menoscerca de 33%, tal como pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de50% ou pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 66%, talcomo pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, ou pe-lo menos cerca de 90%. Será também evidente que o oligonucleotídeo podecompreender uma seqüência de nucleobase a qual consiste unicamente deseqüências de análogo de nucleotídeo.

Aqui, o termo "base nitrogenosa" se destina a abranger purinase pirimidinas, tal como as nucleobases de DNA A, C, T e G, as nucleobasesde RNA A, C, U e G, bem como nucleobases de não-DNA/RNA, tais como 5-metilcitosina (MeC), isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracila, 5-propiniluracila, 5-propinil-6-fluoroluracila, 5-metiltiazoleuracila, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, 2,6-diaminopurina, 7-propino-7-deazaadenina, 7-propino-7-deazaguanina e 2-cloro-6-aminopurina, em parti-cular MeC. Será compreendido que a seleção real da nucleobases de não-DNA/RNA dependerá do nucleotídeo correspondente (ou equivalente) pre-sente na fita de micro-RNA, o qual é o oligonucleotídeo que se deseja objeti-var. Por exemplo, no caso em que o nucleotídeo correspondente é G, nor-malmente será necessário selecionar uma nucleobase de não-DNA/RNA aqual é capaz de estabelecer ligações de hidrogênio a G. Nesse caso especí-fico, onde o nucleotídeo correspondente é G, um exemplo típico de uma nu-cleobase de não-DNA/RNA é MeC.

O termo "grupo de ligação internucleosídeo" se destina a signifi-car um grupo capaz de acoplamento covalente junto com duas nucleobases,tal como entre unidades de DNA, entre unidades de DNA e análogos de nu-cleotídeo, entre duas unidades de não-LNA, entre uma unidade de não-LNAe uma unidade de LNA e entre duas unidades de LNA, etc. Exemplos prefe-ridos incluem grupos de fosfato, fosfodiéster e fosforotioato.

A ligação internucleosídeo pode ser selecionada do grupo con-sistindo em: -O-P(O)2-O-, -O-P(O1S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(0,S)-0-,-S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O1S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(Rh)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRh)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-,-O-PO(NHRh)-O-, -O-P(O)2-NRh-, -NRh-P(O)2-O-, -NRh-CO-O-, -NRh-CO-NRh-, e/ou a ligação internucleosídeo e pode ser selecionada do grupo con-sistindo em: -O-CO-O-, -O-CO-NRh-, -NRh-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRh-,-O-CH2-CH2-NRh-, -CO-NRh-CH2-, -CH2-NRh-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRh-, -O-CH2-CH2-NRh-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-, onde Rh é selecionado de hidrogênio e C1-4-alquila. Adequadamente, em algumas modalidades, ligações internucleosí-deo contendo enxofre (S), conforme proporcionado acima, pode ser preferi-das.

Os termos "correspondendo a" e "corresponde a", conforme u-sado no contexto de oligonucleotídeos se referem a uma comparação entreuma seqüência de nucleobase do composto da invenção e o comprimentoinverso do mesmo ou, em uma modalidade, entre uma seqüência de nucleo-base e uma seqüência de nucleobase equivalente (idêntica) a qual pode, porexemplo, compreender outras nucleobases, mas retêm a mesma seqüênciade base ou complemento da mesma. Análogos de nucleotídeo são compa-rados diretamente com seus nucleotídeos equivalentes ou naturais corres-pondentes. Seqüências as quais formam o complemento reverso de umaseqüência são referidas como a seqüência complementar da seqüência.Quando de referência ao comprimento de uma molécula de nu-cleotídeo, conforme referido aqui, o comprimento corresponde ao número deunidades monoméricas, isto é, nucleobases, a despeito do fato de se essasunidades monoméricas são nucleotídeo ou análogos de nucleotídeo. Comrelação às nucleobases, os termos monômero e unidade são usados permu-tavelmente aqui.

Deverá ser compreendido que quando o termo "cerca" é usadono contexto de valores específicos ou faixas de valores, a descrição deveráser lida como incluindo o valor específico ou faixa relacionada.

Análogos de DNA preferidos incluem análogos de DNA onde ogrupo 2'-H é substituído por uma outra substituição que não -OH (RNA), porexemplo, através de substituição por -O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH ou -F.

Análogos de RNA preferidos incluem análogos de RNA os quaisforam modificados em seu grupo 2'-0H, por exemplo, através de substitui-ção por um outro grupo que não -H (DNA), por exemplo, -O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH ou -F.

Em uma modalidade, o análogo de nucleotídeo é ΈΝΑ".

Quando usados no presente contexto, os termos "unidade deLNA", "monômero de LNA", "resíduo de LNA", "unidade de ácido nucléicobloqueado", "monômero de ácido nucléico bloqueado" ou "resíduo de ácidonucléico bloqueado", se referem a um análogo de nucleosídeo bicíclico. Uni-dades de LNA são descritas, inter alia, no WO 99/14226, WO 00/56746, WO00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 e WO 03/095467. Aunidade de LNA pode também ser definida com relação à sua fórmula quí-mica. Assim, uma "unidade de LNA", conforme usado aqui, tem a estruturaquímica mostrada no Esquema 1 abaixo:<table>table see original document page 41</column></row><table>

em que

X é selecionado do grupo consistindo em O, S e NRh, onde Rh é

H ou Ci-4-alquila;

Y é (-CH2)r, onde r é um número inteiro de 1-4; e

B é uma base nitrogenosa.

Quando de referência à substituição de uma unidade de DNApor sua unidade de LNA correspondente no contexto da presente invenção,o termo "unidade de LNA correspondente" se destina a significar que a uni-dade de DNA foi substituída por uma unidade de LNA contendo a mesmabase nitrogenosa que a unidade de DNA que ela substitui, por exemplo, aunidade de LNA correspondente de uma unidade de DNA contendo a basenitrogenosa A também contém a base nitrogenosa A. A exceção é que,quando uma unidade de DNA contém a base C, a unidade de LNA corres-pondente contém a base C ou a base MeC, de preferência MeC.

Aqui, o termo, "unidade de não-LNA" se refere a um nucleosídeodiferente de uma unidade de LNA, isto é, o termo "unidade de não LNA" in-clui uma unidade de DNA, bem como uma unidade de RNA. Uma unidadede não-LNA preferida é uma unidade de DNA.

Os termos "unidade", "resíduo" e "monômero" são usados per-mutavelmente aqui.

No presente contexto, o termo "conjugado" se destina a indicaruma molécula heterogênea formada através da ligação covalente de um oli-gonucleotídeo conforme descrito aqui a uma ou mais porções de não-nucleotídeo ou não-polinucleotídeo. Exemplos de porções de não-nucleotídeo ou não-polinucleotídeo incluem agentes macromoleculares, taiscomo proteínas, cadeias de ácido graxo, resíduos de açúcar, glicoproteínas,polímeros ou combinações dos mesmos. Tipicamente, proteínas podem seranticorpos para uma proteína alvo. Polímeros típicos podem ser polietilenoglicol.

O termo "pelo menos um" abrange um número inteiro maior doque ou igual a 1, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18,19, 20 e assim por diante.

Os termos "um" e "uma", conforme usado sobre um nucleotídeo,um agente, uma unidade de LNA, etc., se destina a significar um ou mais.

Em particular, a expressão "um componente (tal como um nucleotídeo, umagente, uma unidade de LNA ou semelhante) selecionado do grupo consis-tindo em..." se destina a significar que um ou mais dos componentes citadospodem ser selecionados. Assim, expressões tais como "um componente se-lecionado do grupo consistindo em A, B e C" se destina a incluir todas ascombinações de A, B e C, isto é, A, B, C, A+B, A+C, B+C e A+B+C.

O termo "unidade de tio-LNA" se refere a uma unidade de LNAna qual X no Esquema 1 é S. Uma unidade de tio-LNA pode estar na formabeta-D e na forma alfa-L. Geralmente, a forma beta-D da unidade de tio-LNAé preferida. A forma beta-D e a forma alfa-L de uma unidade de tio-LNA sãomostradas no Esquema 3 como compostos 3A e 3B, respectivamente.

O termo "unidade de amino-LNA" se refere a uma unidade deLNA na qual X no Esquema 1 é NH ou NRh, onde Rh é hidrogênio ou C1-4-alquila. Uma unidade de amino-LNA pode estar na forma beta-D e na formaalfa-L. Geralmente, a forma beta-D da unidade de amino-LNA é preferida. Aforma beta-D e a forma alfa-L de uma unidade de amino-LNA são mostradasno Esquema 4 como compostos 4A e 4B, respectivamente.

O termo "unidade de óxi-LNA" se refere a uma unidade de LNAna qual X no Esquema 1 é O. Uma unidade de óxi-LNA pode estar na formabeta-D e na forma alfa-L. Geralmente, a forma beta-D da unidade de óxi-LNA é preferida. A forma beta-D e a forma alfa-L de uma unidade de óxi-LNA são mostradas no Esquema 5 como compostos 5A e 5B, respectiva-mente.No presente contexto, o termo "C1-6-alquila" se destina a signifi-car uma cadeia de hidrocarboneto saturada linear ou ramificada em que ascadeias mais longas têm de um a seis átomos de carbono, tais como metila,etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, pentila,isopentila, neopentila e hexila. Uma cadeia de hidrocarboneto ramificada sedestina a significar uma C1-6-alquila substituída em qualquer carbono poruma cadeia de hidrocarboneto.

No presente contexto, o termo "C1-4-alquila" se destina a signifi-car uma cadeia de hidrocarboneto saturada linear ou ramificada, em que ascadeias mais longas têm de um a quatro átomos de carbono, tal como meti-la, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila e terc-butila. Umacadeia de hidrocarboneto ramificada se destina a significar uma C1-4-alquilasubstituída em qualquer carbono por uma cadeia de hidrocarboneto.

Quando usado aqui, o termo "C1-6-alcóxi" se destina a significarC1-6-alquil-óxi, tal como metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n-butóxi, isobu-tóxi, sec-butóxi, terc-butóxi, pentóxi, isopentóxi, neopentóxi e hexóxi.

No presente contexto, o termo "C2-6-alquenila" se destina a signi-ficar um grupo hidrocarboneto linear ou ramificado tendo de dois a seis áto-mos de carbono e contendo um ou mais ligações duplas. Exemplos ilustrati-vos de grupos C2-6-alquenila incluem alila, homo-alila, vinila, crotila, butenila,butadienila, pentenila, pentadienila, hexenila e hexadienila. A posição da in-saturação (a ligação dupla) pode ser em qualquer posição ao longo da ca-deia de carbono.

No presente contexto, o termo "C2-6-alquínila" se destina a signi-ficar um grupo hidrocarboneto linear ou ramificado contendo de dois a seisátomos de carbono e contendo uma ou mais ligações triplas. Exemplos ilus-trativos de grupos C2-6-alquinila incluem acetileno, propinila, butinila, pentini-la e hexinila. A posição de insaturação (a ligação tripla) pode ser em qual-quer posição ao longo da cadeia de carbono. Mais de uma ligação pode serinsaturada, de modo que a "C2-6-alquinila" é uma di-ina ou enodi-ina, con-forme é conhecido por aqueles habilitados na técnica.

Conforme usado aqui, "hibridização" significa ligação de hidro-gênio, a qual pode ser ligação de hidrogênio de Watson-Críck, Hoogsteen,Hoogsteen invertida, etc., entre bases de nucleosídeo ou nucleotídeo com-plementares. As quatro nucleobases comumente encontradas em DNA sãoG, A, T e C, das quais G se emparelha com C e A se emparelha com T. EmRNA, T é substituído por uracila (U), a qual, então se emparelha com A. Osgrupos químicos nas nucleobases que participam na formação de dupla pa-drão constituem a face de Watson-Crick. Hoogsteen mostrou, anos depois,que as nucleobases de purina (G e A), além de sua face de Watson-Crick,têm uma face de Hoogsteen que pode ser reconhecida do exterior da duplae usada para ligar oligonucleotídeos de pirimidina via ligação de hidrogênio,desse modo, formando uma estrutura de hélice tripla.

No contexto da presente invenção, "complementar" se refere àcapacidade de emparelhamento preciso entre duas seqüências de nucleotí-deo uma com a outra. Por exemplo, se um nucleotídeo em uma determinadaposição de um oligonucleotídeo é capaz de ligação de hidrogênio com umnucleotídeo na posição correspondente de uma molécula de DNA ou RNA,então, o oligonucleotídeo e o DNA ou RNA são considerados como sendocomplementares um ao outro nessa posição. A fita de DNA ou RNA é consi-derada complementar uma à outra quando um número suficiente de nucleo-tídeos no oligonucleotídeo pode formar ligações de hidrogênio com nucleotí-deos correspondentes no RNA ou DNA alvo para permitir a formação de umcomplexo estável. Para ser estável in vitro ou in vivo, a seqüência de umoligonucleotídeo não precisa ser 100% complementar a seu micro-RNA alvo.Os termos "complementar" e "se hibridiza especificamente", assim, implicamque o oligonucleotídeo se liga suficientemente forte e específico à moléculaalvo para proporcionar a interferência desejada com a função normal do al-vo, ao mesmo tempo em que deixa a função de RNAs não-alvo inalterada.

Em um exemplo preferido, o oligonucleotídeo da invenção é100% complementar a uma seqüência de micro-RNA humano, tal como umadas seqüências de micro-RNA mencionadas aqui.

Em um exemplo preferido, o oligonucleotídeo da invenção com-preende uma seqüência contínua a qual é 100% complementar à região decultura da seqüência do micro-RNA humano.

Micro-RNAs são RNAs curtos de não codificação derivados degenes endógenos que atuam como reguladores pós-transcricionais de ex-pressão de gene. Eles são processados a partir de precursores semelhantesà hairpina mais longos (aproximadamente 70-80 nt) denominados pré-miRNAs através da enzima RNAse III Dicer. Micro-RNAs se montam emcomplexos de ribonucleoproteína denominados miRNPs e reconhecem seussítios alvo através de complementaridade anti-sentido, desse modo, medi-ando a sub-regulação de seus genes alvo. Complementaridade quase queperfeita ou perfeita entre o miRNA e seu sítio alvo resulta em clivagem domRNA alvo, enquanto que complementaridade limitada entre o micro-RNA eo sítio alvo resulta em inibição traducional do gene alvo.

O termo "micro-RNA" ou "miRNA", no contexto da presente in-venção, significa um oligonucleotídeo de RNA consistindo em entre 18 a 25nucleotídeos. Em termos funcionais, miRNAs são, tipicamente, moléculas deRNA endógenas regulatórias.

Os termos "micro-RNA alvo" ou "miRNA alvo" ou "alvo de miR-NA" se referem a um micro-RNA com um papel biológico em doença huma-na, por exemplo, um miRNA oncogênico super-regulado ou um miRNA su-pressor de tumor em câncer, desse modo, sendo um alvo para intervençãoterapêutica da doença em questão.

Os termos "gene alvo" ou "mRNA alvo" se referem a mRNAsalvos regulatórios de micro-RNAs, nos quais o referido "gene alvo" ou "mR-NA alvo" é regulado pós-transcricionalmente pelo micro-RNA baseado emcomplementaridade quase que perfeita ou perfeita entre o miRNA e seu sítioalvo, resultando em clivagem de mRNA alvo; ou complementaridade limita-da, freqüentemente conferida à complementaridade entre a assim denomi-nada seqüência de cultura (nucleotídeos 2-7 do miRNA) e o sítio alvo, resul-tando em inibição traducional do mRNA alvo.

O contexto da presente invenção, o oligonucleotídeo é fita única,isso se referindo à situação onde o oligonucleotídeo está na ausência denucleobase oligonucleotídeo complementar - isto é, ele não é um complexode oligonucleotídeo de fita dupla, tal como um siRNA. Em uma modalidade,a composição de acordo com a invenção não compreende um outro oligonu-cleotídeo o qual tem uma região de complementaridade com o oligonucleotí-deo de fita única de cinco ou mais nucleobases consecutivas, tal como oito ou mais ou 12 ou mais das nucleobases consecutivas. Considera-se que ooutro oligonucleotídeo não está covalentemente ao oligonucleotídeo de fitaúnica.

Oligonucleotídeo contendo LNA da invenção

Embora unidades de LNA e unidades de não-LNA possam sercombinadas em uma série de maneiras para formar oligonucleotídeos, sur-preendentemente, foi descoberto pelos inventores da presente invenção queuma determinada seqüência de DNA central e uma determinada presençade unidades de LNA na referida seqüência de DNA resulta em uma inibiçãoparticularmente alta de micro-RNA. Essa presença de unidades de LNA na referida seqüência central dos oligonucleotídeos da presente invenção tornaos referidos oligonucleotídeos altamente resistentes à nuclease.

Os nucleotídeos fora da seqüência central podem ser unidadesde LNA e/ou unidades de não-LNA. Em uma modalidade, as unidades denão-LNA fora da seqüência central são unidades de DNA.

A seqüência central

De forma que os oligonucleotídeos anti-sentido da presente in-venção inibiam seus micro-RNAs alvo tão eficientemente quanto possível, épreciso haver um determinado grau de complementaridade entre o oligonu-cleotídeo anti-sentido da presente invenção e o micro-RNA alvo correspon-dente.

É particularmente importante que os oligonucleotídeos da pre-sente invenção sejam complementares às posições 3 a 8, contando a partirda extremidade 5', do micro-RNA alvo correspondente. O nucleotídeo 1, con-tando a partir da extremidade 5', em alguns dos micro-RNAs alvo, é uma base de não-emparelhamento e está mais provavelmente oculta em umabolsa de ligação na proteína Ago 2. Conseqüentemente, o oligonucleotídeoda invenção pode ou não ter um nucleotídeo na posição 1, contando a partirda extremidade 3', correspondendo ao nucleotídeo 1, contando a partir daextremidade 5' do micro-RNA alvo correspondente. Em alguns casos, osprimeiros dois nucleotídeos, contando a partir da extremidade 5' do micro-RNA alvo correspondente, podem ser deixados não combinados.

A seqüência central dos oligonucleotídeos da presente invençãoé, portanto, uma seqüência de DNA das posições um a seis, dois a sete ouposições três a oito, contando a partir da extremidade 3', correspondendo àsposições três a oito, contando a partir da extremidade 5', do micro-RNA alvocorrespondente.

miR-19b

Um micro-RNA alvo particular é denominado miR-19b. A se-qüência do miR-19b das posições três a oito, contando a partir da extremi-dade 5', é ugcaaa (veja GenBank Ioci AJ421740 e AJ421739). A seqüênciade DNA correspondente é acgttt. Os inventores da presente invenção, alémdisso, descobriram que, de forma a maximizar a inibição dos micro-RNAsalvo, os oligonucleotídeos da presente invenção devem conter pelo menosuma unidade de LNA em sua seqüência central.

Conseqüentemente, um primeiro aspecto da invenção se referea um oligonucleotídeo de acordo com a invenção, tal como um oligonucleotí-deo tendo um comprimento de12 a 26 nucleotídeos tendo a seqüência deDNA das posições um a seis, dois a sete ou três a oito, de preferência dasposições dois a sete ou três a oito, contando a partir da extremidade 3':

acgttt,(SEQ ID NO 6)

em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituí-das por sua unidade de LNA correspondente.

Complementaridade com outros nucleotídeos do micro-RNA al-vo podem intensificar a inibição do referido micro-RNA alvo. Portanto, umamodalidade é o oligonucleotídeo conforme definido acima tendo uma se-qüência de DNA das posições um a sete, dois a oito ou três a nove, de pre-ferência das posições dois a oito ou três a nove, contando a partir da extre-midade 3':acgttta,(SEQ ID NO 70)em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

Em outra modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com a pre-sente invenção tem uma seqüência de DNA das posições um a oito, dois anove ou três a dez, de preferência das posições dois a nove ou três a 10,contando a partir da extremidade 3':

acgtttag, (SEQ ID NO 71)

em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

Em ainda outra modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com apresente invenção tem uma seqüência de DNA das posições um a nove,dois a dez ou três a onze, de preferência das posições dois a dez ou três aonze, contando a partir da extremidade 3':

acgtttagg, (SEQ ID NO 72)em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três, ainda maispreferivelmente pelo menos quatro, tal como quatro ou cinco unidades deDNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidade de LNA cor-respondente.

miR-122a

Outro micro-RNA alvo interessante é miR-122a. A seqüência domiR-122a das posições três a oito, contando a partir da extremidade 5', égagugu (veja entrada no miRBase HGNC:MIRN122A). A seqüência de DNAcorrespondente é ctcaca.

Conseqüentemente, um segundo aspecto da presente invençãose refere a um oligonucleotídeo de acordo com a invenção, tal como um oli-gonucleotídeo tendo um comprimento de 12 a 26 nucleotídeo tendo a se-qüência de DNA das posições um a seis, dois a sete ou três a oito, de prefe-rência das posições dois a sete ou três a oito, contando a partir da extremi-dade 3':

ctcaca,(SEQ ID NO 7)em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituí-das por sua unidade de LNA correspondente.

Uma modalidade se refere ao oligonucleotídeo antagomir miR-122a conforme descrito acima tendo a seqüência de DNA das posições um asete, dois a oito ou três a nove, de preferência das posições dois a oito outrês a nove, contando a partir da extremidade 3':

ctcacac,(SEQ ID NO 73)em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

Em outra modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com a pre-sente invenção tem uma seqüência de DNA das posições um a oito, dois anove ou três a dez, de preferência das posições dois a nove ou três a dez,contando a partir da extremidade 3':ctcacact,(SEQ ID NO 74)em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

Em ainda outra modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com apresente invenção tem uma seqüência de DNA das posições um a nove,dois a dez" ou três a onze, de preferência das posições dois a dez ou três aonze, contando a partir da extremidade 3':ctcacactg,(SEQ ID NO 75)

em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três, ainda maispreferivelmente pelo menos quatro, tal como quatro ou cinco unidades deDNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidade de LNA cor-respondente.miR-155

Outro micro-RNA alvo interessante é miR-155. A seqüência domiR-155 das posições três a oito, contando a partir da extremidade 5', é a-augcu (veja entrada no miRBase HGNC:MIRN155). A seqüência de DNAcorrespondente é ttacga.

Conseqüentemente, um terceiro aspecto da invenção se refere aum oligonucleotídeo de acordo com a invenção, tal como um oligonucleotí-deo tendo um comprimento de 12 a 26 nucleotídeos tendo a seqüência deDNA das posições um a seis, dois a sete ou três a oito, de preferência dasposições dois a sete ou três a oito, contando a partir da extremidade 3':ttacga,(SEQ ID NO 8)

em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituí-das por sua unidade de LNA correspondente.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo antagomir miR-155 co-mo descrito acima tendo uma seqüência de DNA das posições um a sete,dois a oito ou três a nove, de preferência das posições dois a oito ou três anove, contando a partir da extremidade 3':

ttacgat,(SEQ ID NO 76)em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

Em outra modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com a pre-sente invenção tem uma seqüência de DNA das posições um a oito, dois anove ou três a dez, de preferência das posições dois a nove ou três a dez,contando a partir da extremidade 3':ttacgatt,(SEQ ID NO 77)em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

Em ainda outra modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com apresente invenção tendo uma seqüência de DNA das posições um a nove,dois a dez ou três a onze, de preferência das posições dois a dez ou três aonze, contando a partir da extremidade 3':

ttacgatta,(SEQ ID NO 78)

em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três, ainda maispreferivelmente pelo menos quatro, tal como quatro ou cinco unidades deDNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidade de LNA cor-respondente.

miR-375

Ainda outro micro-RNA alvo interessante é miR-375. A seqüên-cia do miR-375 das posições três a oito, contando a partir da extremidade 5',é uguucg (veja entrada no miRBase HGNC:MIRN375). A seqüência de DNAcorrespondente é caagc.

Conseqüentemente, um quarto aspecto da invenção se refere aum oligonucleotídeo de acordo com a invenção, tal como um oligonucleotí-deo tendo um comprimento de 12 a 26 nucleotídeos tendo a seqüência deDNA das posições um a seis, dois a sete ou três a oito, de preferência dasposições dois a sete ou três a oito, contando a partir da extremidade 3':

acaagc; ,(SEQ ID NO 9)

em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituí-das por sua unidade de LNA correspondente.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo antagomir miR-375conforme descrito acima tem uma seqüência de DNA das posições um asete, dois a oito ou três a nove, de preferência das posições dois a oito outrês a nove, contando a partir da extremidade 3':

acaagca,(SEQ ID NO 79)em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

Em outra modalidade,o oligonucleotídeo de acordo com a pre-sente invenção tem uma seqüência de DNA das posições um a oito, dois anove ou três a dez, de preferência das posições dois a nove ou três a dez,contando a partir da extremidade 3':

acaagcaa,(SEQ ID NO 80)

em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

Em ainda outra modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com apresente invenção tem uma seqüência de DNA das posições um a nove,dois a dez ou três a onze, de preferência das posições dois a dez ou três aonze, contando a partir da extremidade 3':

acaagcaag, (SEQ ID NO 81)

em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três, ainda maispreferivelmente pelo menos quatro, tal como quatro ou cinco unidades deDNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidade de LNA cor-respondente.

Modificação de nucleotídeo na seqüência central

Conforme mencionado acima, na seqüência central dos oligonu-cleotídeos da presente invenção pelo menos uma, tal como uma, de prefe-rência pelo menos duas, tal como duas ou três unidades de DNA na referidaseqüência foram substituídas por sua unidade de LNA correspondente. Ospresentes inventores ainda descobriram que inlbição dos micro-RNAs alvopode ser adicionalmente aumentada certificando-se de quem duas unidadesde LNA na referida seqüência central são separadas por pelo menos umaunidade de DNA.Conseqüentemente, uma modalidade da invenção se refere aooligonucleotídeo conforme descrito acima, em que pelo menos duas, tal co-mo duas ou três unidades de DNA das posições um a seis, dois a sete outrês a oito, de preferência das posições dois a sete ou três a oito, contando apartir da extremidade 3', foram substituídas por sua unidade de LNA corres-pondente e em que as unidades de LNA são separadas por pelo menos umaunidade de DNA.

Os presentes inventores também descobriram que inibição demicro-RNAs pode ser ainda aumentada certificando-se de que duas unida-des de LNA na seqüência central são separadas por no máximo duas unida-des de DNA. Conseqüentemente, em uma modalidade, a presente invençãose refere ao oligonucleotídeo conforme descrito acima, em que o número deunidades de DNA consecutivas das posições um a seis, dois a sete ou três aoito, de preferência das posições dois a sete ou três a oito, contando a partirda extremidade 3', é de no máximo dois.

As referidas descobertas se aplicam à seqüência central per se,isto é, as descobertas se aplicam às posições do oligonucleotídeo da pre-sente invenção correspondendo à seqüência central. Conseqüentemente,outra modalidade se refere ao oligonucleotídeo conforme descrito acima, emque pelo menos duas, tal como duas, três ou quatro unidades de DNA dasposições um a sete, dois a oito ou três a nove, de preferência das posiçõesdois a oito ou três a nove, contando a partir da extremidade 3', foram substi-tuídas por sua unidade de LNA correspondente e em que as unidades deLNA são separadas por pelo menos uma unidade de DNA. Uma outra moda-Iidade se refere ao oligonucleotídeo conforme descrito acima, em que o nú-mero de unidades de DNA consecutivas das posições um a sete, dois a oitoou três a nove, de preferência das posições dois a oito ou três a nove, con-tando a partir da extremidade 3', é de no máximo dois.

Ainda outra modalidade se refere ao oligonucleotídeo conformedescrito acima, em que pelo menos duas, tal como duas, três ou quatro uni-dades de DNA das posições um a oito, dois a nove ou três a dez, de prefe-rência das posições dois to nine ou três a dez, contando a partir da extremi-dade 3', foram substituídas por sua unidade de LNA correspondente e emque as unidades de LNA são separadas por pelo menos uma unidade deDNA. Ainda uma outra modalidade se refere ao oligonucleotídeo conformedescrito acima, em que o número de unidades de DNA consecutivas dasposições um a oito, dois a nove ou três a dez, de preferência das posiçõesdois a nove ou três a dez, contando a partir da extremidade 3', é de no má-ximo dois.

Ainda outra modalidade se refere ao oligonucleotídeo conformedescrito acima, em que pelo menos duas, tal como duas, três, quatro ou cin-co unidades de DNA das posições um a nove, dois a dez ou três a onze, depreferência das posições dois to dez ou três a onze, contando a partir daextremidade 3', foram substituídas por sua unidade de LNA correspondentee em que as unidades de LNA são separadas por pelo menos uma unidadede DNA. Ainda uma outra modalidade se refere ao oligonucleotídeo confor-me descrito acima, em que o número de unidades de DNA consecutivas dasposições um a nove, dois a dez ou três a onze, de preferência das posiçõesdois a dez ou três a onze, contando a partir da extremidade 3', é de no má-ximo dois.

Modificação de nucleotídeo fora da seqüência central

Conforme mencionado acima, os nucleotídeos fora da seqüên-cia central podem ser unidades de LNA e/ou unidades de não-LNA. Em umamodalidade, a invenção se refere ao oligonucleotídeo conforme descrito a-cima, em que o número de unidades de LNA fora da seqüência central é pe-lo menos um, tal como um, dois, três ou quatro, e em que as referidas uni-dades de LNA são separadas por pelo menos uma unidade de não-LNA. Emuma outra modalidade, o padrão de substituição fora da seqüência central étal que o número de unidades consecutivas de não-LNA fora da seqüênciacentral é de no máximo dois.

Modificação de nucleotídeo nas posições 3 a 8, contando a partir da extre-midade 3'.

Nas modalidades a seguir as quais se referem à modificação denucleotídeos nas posições 3 a 8, contando a partir da extremidade 3', as u-nidades de LNA podem ser substituídas por outros análogos de nucleotídeo,tais como aqueles referidos aqui. "X" pode, portanto, ser selecionado dogrupo consistindo em unidade de 2'-0-alquil-RNA, unidade de 2'-OMe-RNA,unidade de 2'-amino-DNA, unidade de 2'-fluoro-DNA, unidade de LNA, uni-dade de PNA, unidade de HNA, unidade de INA. "x" é, de preferência, DNAou RNA, mais preferivelmente DNA.

Em uma modalidade interessante da invenção, os oligonucleotí-deos da invenção são modificados nas posições 3 a 8, contando a partir daextremidade 3'. O design dessa seqüência pode ser definido pelo número de unidades de não-LNA presentes ou pelo número de unidades de LNA pre-sentes. Em uma modalidade preferida da primeira, pelo menos um, tal comoum, dos nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremi-dade 3', é uma unidade de não-LNA. Em outra modalidade, pelo menos dois,tal como dois, de os nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partirda extremidade 3', são unidades de não-LNA. Em ainda outra modalidade,pelo menos três, tal como três, dos nucleotídeos nas posições três a oito,contando a partir da extremidade 3', são unidades de não-LNA. Em aindaoutra modalidade pelo menos quatro, tal como quatro, dos nucleotídeos nasposições três a oito, contando a partir da extremidade 3', são unidades denão-LNA. Em uma outra modalidade pelo menos cinco, tal como cinco, de osnucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3',são unidades de não-LNA. Em ainda uma outra modalidade, todos os seisnucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3',são unidades de não-LNA. Em uma modalidade preferida, a referida unidadede não-LNA é uma unidade de DNA.

Alternativamente definido, em uma modalidade preferida, o oli-gonucleotídeo de acordo com a invenção compreende pelo menos uma uni-dade de LNA nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3'.Em uma modalidade da mesma, o oligonucleotídeo de acordo com a presen-te invenção compreende uma unidade de LNA nas posições três a oito, con-tando a partir da extremidade 3'. O padrão de substituição para os nucleotí-deos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', pode serselecionado do grupo consistindo em Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx,xxxxXx e xxxxxX, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota umaunidade de não-LNA.

Em outra modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com a pre-sente invenção compreende pelo menos dois unidades de LNA nas posiçõestrês a oito, contando a partir da extremidade 3'.Em uma modalidade damesma, o oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção compreendeduas unidades de LNA nas posições três a oito, contando a partir da extre-midade 3'. O padrão de substituição para os nucleotídeos nas posições trêsa oito, contando a partir da extremidade 3', pode ser selecionado do grupoconsistindo em XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx,xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX e xxxxXX, emque "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA.Em uma modalidade preferida, o padrão de substituição para os nucleotí-deos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', é sele-cionado do grupo consistindo em XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXxXxx,xXxxXx, xXxxxX, xxXxXx, xxXxxX e xxxXxX, em que "X" denota uma unida-de de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em uma modalidade maispreferida, o padrão de substituição para os nucleotídeos nas posições três aoito, contando a partir da extremidade 3', é selecionado do grupo consistindoem xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXxXx, xxXxxX e xxxXxX, em que "X" denotauma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em uma moda-lidade ainda mais preferida, o padrão de substituição para os nucleotídeosnas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', é selecionadodo grupo consistindo em xXxXxx, xXxxXx e xxXxXx, em que "X" denota umaunidade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em uma modalidadeainda mais preferida, o padrão de substituição para os nucleotídeos nas po-sições três a oito, contando a partir da extremidade 3', is xXxXxx, em que "X"denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA.

Em ainda outra modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com apresente invenção compreende pelo menos três unidades de LNA nas posi-ções três a oito, contando a partir da extremidade 3'. Em uma modalidade damesma, o oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção compreendetrês unidades de LNA nas posições três a oito, contando a partir da extremi-dade 3'. O padrão de substituição para os nucleotídeos nas posições três aoito, contando a partir da extremidade 3', pode ser selecionado do grupoconsistindo em XXXxxx, xXXXxx, xxXXXx, xxxXXX, XXxXxx, XXxxXx,XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx, XxxxXX, xXxXXx,xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX e XxXxXx, em que "X" denota uma unidade deLNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em uma modalidade preferida,o padrão de substituição para os nucleotídeos nas posições três a oito, con-tando a partir da extremidade 3', é selecionado do grupo consistindo emXXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx,XxxxXX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX e XxXxXx, em que "X" denotauma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em uma moda-lidade mais preferida, o padrão de substituição para os nucleotídeos nas po-sições três a oito, contando a partir da extremidade 3', é selecionado do gru-po consistindo em xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX exXxXxX, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidadede não-LNA. Em uma modalidade ainda mais preferida, o padrão de substi-tuição para os nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir daextremidade 3', is xXxXxX ou XxXxXx, em que "X" denota uma unidade deLNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em uma modalidade ainda maispreferida, o padrão de substituição para os nucleotídeos nas posições três aoito, contando a partir da extremidade 3', is xXxXxX, em que "X" denota umaunidade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA.

Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com apresente invenção compreende pelo menos quatro unidades de LNA nasposições três a oito, contando a partir da extremidade 3'. Em uma modalida-de da mesma, o oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção com-preende four unidades de LNA nas posições três a oito, contando a partir daextremidade 3'. O padrão de substituição para os nucleotídeos nas posiçõestrês a oito, contando a partir da extremidade 3', pode ser selecionado dogrupo consistindo em xxXXXX, xXxXXX, xXXxXX, xXXXxX, xXXXXx,XxxXXX, XxXxXX, XxXXxX, XxXXXx, XXxxXX, XXxXxX, XXxXXxi XXXxxXiXXXxXx e ΧΧΧΧχχ, em que "Χ" denota uma unidade de LNA e "x" denotauma unidade de não-LNA.

Em ainda uma outra modalidade, o oligonucleotídeo de acordocom a presente invenção compreende pelo menos cinco unidades de LNAnas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3'. Em uma moda-lidade da mesma, o oligonucleotídeo de acordo com a presente invençãocompreende cinco unidades de LNA nas posições três a oito, contando apartir da extremidade 3'. O padrão de substituição para os nucleotídeos nasposições três a oito, contando a partir da extremidade 3', pode ser selecio-nado do grupo consistindo em xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX,XXXXxX e XXXXXx, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denotauma unidade de não-LNA.

De preferência, o oligonucleotídeo de acordo com a presenteinvenção compreende uma ou duas unidades de LNA nas posições três aoito, contando a partir da extremidade 3'. Isso é considerado vantajoso paraa estabilidade da A-hélice formada pela dupla oligo:micro-RNA, uma duplasemelhante a uma estrutura da dupla RNA:RNA.

Em uma modalidade preferida, a referida unidade de não-LNA éuma unidade de DNA.

Variação do comprimento dos oligonucleotídeos

O comprimento do oligonucleotídeos da invenção não precisaser equivalente ao comprimento dos micro-RNAs alvo exatamente. Na ver-dade, considera-se vantajoso ter um oligonucleotídeo curto, tal como entre10-17 ou 10-16 nucleobases.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com a pre-sente invenção tem um comprimento de 8 a 24 nucleotídeo, tal como 10 a24, entre 12 a 24 nucleotídeo, tal como um comprimento de 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleotídeo, de preferênciaum comprimento de 10 - 22, tal como entre 12 to 22 nucleotídeo, tal comoUm comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 nu-cleotídeo, mais preferivelmente um comprimento de 10 - 20, tal como entre12 to 20 nucleotídeo, tal como um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19 ou 20 nucleotídeo, ainda mais preferivelmente um comprimentode 10 a 19, tal como entre 12 a 19 nucleotídeo, tal como um comprimento de10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 nucleotídeo, por exemplo, um com-primento de 10 a 18, tal como entre 12 a 18 nucleotídeo, tal como um com-primento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeo, mais preferi-velmente um comprimento de 10 - 17, tal como de 12 a 17 nucleotídeos, talcomo um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 nucleotídeos,mais preferivelmente um comprimento de 10 a 16, tal como entre 12 a 16nucleotídeo, tal como um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nu-cleotídeo.

Modificação do nucleotídeo da posição 11, contando a partir da extremidade3' para a extremidade 5'

O padrão de substituição para o nucleotídeo a partir da posição11, contando a partir da extremidade 3', para a extremidade 5' pode incluirunidades de análogo de nucleotídeo (tal como LNA) ou não. Em uma moda-lidade preferida, o oligonucleotídeo de acordo com a presente invençãocompreende pelo menos um unidade de análogo de nucleotídeo (tal comoLNA), tal como uma unidade de análogo de nucleotídeo, a partir da posição11, contando a partir da extremidade 3' para a extremidade 5'. Em outra mo-dalidade preferida, o oligonucleotídeo de acordo com a presente invençãocompreende pelo menos duas unidades de análogo de nucleotídeo, tal comounidades de LNA, tal como duas unidades de análogo de nucleotídeo, a par-tir da posição 11, contando a partir da extremidade 3' para a extremidade 5'.

Nas modalidades a seguir as quais se referem à modificação denucleotídeo nas nucleobases a partir das posição 11 para a extremidade 5'do oligonucleotídeo, as unidades de LNA podem ser substituídas por seusanálogos de nucleotídeo, tais como aqueles referidos aqui."X" pode, portan-to, ser selecionado do grupo consistindo em unidade de 2'-0-alquil-RNA,unidade de 2'-OMe-RNA, unidade de 2'-amino-DNA, unidade de 2'-fluoro-DNA, unidade de LNA, unidade de PNA, unidade de HNA, unidade de INA."x" is de preferência DNA ou RNA, mais preferivelmente DNA.Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com a pre-sente invenção tem o seguinte padrão de substituição, o qual é repetido apartir do nucleotídeo onze, contando a partir da extremidade 3'para a extre-midade 5': xXxX ou XxXx1 em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" de-nota uma unidade de não-LNA. Em outra modalidade,o oligonucleotídeo deacordo com a presente invenção tem o seguinte padrão de substituição, oqual é repetido a partir do nucleotídeo onze, contando a partir da extremida-de 3'para a extremidade 5': XxxXxx, xXxxXx ou xxXxxX, em que "X" denotauma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em ainda outramodalidade, o oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção tem oseguinte padrão de substituição, o qual é repetido a partir do nucleotídeoonze, contando a partir da extremidade 3'para a extremidade 5': XxxxXxxx,xXxxxXxx, xxXxxxXx ou xxxXxxxX, em que "X" denota uma unidade de LNAe "x" denota uma unidade de não-LNA.

O padrão de substituição específico para o nucleotídeo a partirda posição 11, contando a partir da extremidade 3'para a extremidade 5' de-pende do número de nucleotídeo no oligonucleotídeos de acordo com a pre-sente invenção. Em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo de acordocom a presente invenção contém 12 nucleotídeo e o padrão de substituiçãopara as posições 11 a 12, contando a partir da extremidade 3', é selecionadodo grupo consistindo em xX e Xx, em que "X" denota uma unidade de LNA e"x" denota uma unidade de não-LNA. Em uma modalidade mais preferida damesma, o padrão de substituição para as posições 11 a 12, contando a partirda extremidade 3', é xX, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" deno-ta uma unidade de não-LNA. Alternativamente, nenhuma unidade de LNAestá presente nas posições 11 a 12, contando a partir da extremidade 3', istoé, o padrão de substituição é xx.

Em uma outra modalidade preferida, o oligonucleotídeo de acor-do com a presente invenção contém 13 nucleotídeo e o padrão de substitui-ção para as posições 11 a 13, contando a partir da extremidade 3', é sele-cionado do grupo consistindo em Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX e XXX, emque "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA.Em uma modalidade mais preferida da mesma, o padrão de substituição pa-ra as posições 11 a 13, contada a partir da extremidade 3', é selecionado dogrupo consistindo em xXx, xxX e xXX, em que "X" denota uma unidade deLNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em uma modalidade ainda maispreferida, o padrão de substituição para as posições 11 a 13, contando apartir da extremidade 3', é xxX, em que "X" denota uma unidade de LNA e"x" denota uma unidade de não-LNA. Alternativamente, nenhuma unidade deLNA está presente nas posições 11 a 13, contando a partir da extremidade3', isto é, o padrão de substituição é xxx.

Em uma outra modalidade preferida, o oligonucleotídeo de acor-do com a presente invenção contém, 14 nucleotídeo e o padrão de substitui-ção para as posições 11 a 14, contando a partir da extremidade 3', é sele-cionado do grupo consistindo em Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX,xXXx, xXxX e xxXX, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denotauma unidade de não-LNA. Em uma modalidade preferida da mesma, o pa-drão de substituição para as posições 11 a 14, contando a partir da extremi-dade 3', é selecionado do grupo consistindo em xXxx, xxXx, xxxX, xXxX exxXX, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade denão-LNA. Em uma modalidade mais preferida da mesma, o padrão de subs-tituição para as posições 11 a 14, contando a partir da extremidade 3', isxXxX, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade denão-LNA. Alternativamente, nenhuma unidade de LNA está presente nasposições 11 a 14, contando a partir da extremidade 3', isto é, o padrão desubstituição é xxxx.

Em uma outra modalidade preferida, o oligonucleotídeo de acor-do com a presente invenção contém 15 nucleotídeos e o padrão de substitu-ição para as posições 11 a 15, contando a partir da extremidade 3', é sele-cionado do grupo consistindo em Xxxxx, xXxxx, xxXxx, xxxXx, xxxxX, XXxxx,XxXxx, XxxXx, XxxxX, xXXxx, xXxXx, xXxxX, xxXXx, xxXxX, xxxXX eXxXxX, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidadede não-LNA. Em uma modalidade preferida da mesma, o padrão de substitu-ição para as posições 11 a 15, contando a partir da extremidade 3", é sele-cionado do grupo consistindo em xxXxx, XxXxx, XxxXx, xXxXx, xXxxX exxXxX, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidadede não-LNA. Em uma modalidade mais preferida da mesma, o padrão desubstituição para as posições 11 a 15, contando a partir da extremidade 3', éselecionado do grupo consistindo em xxXxx, xXxXx, xXxxX e xxXxX, em que"X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Emuma modalidade ainda mais preferida da mesma, o padrão de substituiçãopara as posições 11 a 15, contando a partir da extremidade 3\ é selecionadodo grupo consistindo em xXxxX e xxXxX, em que "X" denota uma unidadede LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em uma modalidade aindamais preferida, o padrão de substituição para as posições 11 a 15, contandoa partir da extremidade 3\ is xxXxX, em que "X" denota uma unidade de LNAe "x" denota uma unidade de não-LNA. Alternativamente, no unidades deLNA está presente nas posições 11 a 15, contando a partir da extremidade3', isto é, o padrão de substituição é xxxxx.

Em ainda uma outra modalidade preferida, o oligonucleotídeo deacordo com a presente invenção contém 16 nucleotídeo e o padrão de subs-tituição para as posições 11 a 16, contando a partir da extremidade 3', é se-lecionado do grupo consistindo em Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx,xxxxxX, XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx,xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX, xxxxXX,XXXxxx, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, XxXXxx, XxXxXx, XxXxxX, XxxXXx,XxxXxX, XxxxXX, xXXXxx, xXXxXx, xXXxxX, xXxXXx, xXxXxX, xXxxXX,χχΧΧΧχ, χχΧΧχΧ, xxXxXX e xxxXXX, em que "X" denota uma unidade deLNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em uma modalidade preferidada mesma, o padrão de substituição para as posições 11 a 16, contando apartir da extremidade 3', é selecionado do grupo consistindo em XxxXxx,xXxXxx, xXxxXx, xxXxXx, xxXxxX, XxXxXx, XxXxxX, XxxXxX, xXxXxX,xXxxXX e xxXxXX, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denotauma unidade de não-LNA. Em uma modalidade mais preferida da mesma, opadrão de substituição para as posições 11 a 16, contando a partir da ex-tremidade 3', é selecionado do grupo consistindo em xXxXxx, xXxxXx,χχΧχΧχ, χχΧχχΧ, χΧχΧχΧ, χΧχχΧΧ e χχΧχΧΧ, em que "Χ" denota uma uni-dade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em uma modalidadeainda mais preferida da mesma, o padrão de substituição para as posições11 a 16, contando a partir da extremidade 3', é selecionado do grupo consis-tindo em χχΧχχΧ, χΧχΧχΧ, xXxxXX e xxXxXX, em que "X" denota uma uni-dade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. Em ainda uma outramodalidade preferida da mesma, o padrão de substituição para as posições11 a 16, contando a partir da extremidade 3', é selecionado do grupo consis-tindo em xxXxxX e xXxXxX, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x"denota uma unidade de não-LNA. Em uma modalidade ainda mais preferidada mesma, o padrão de substituição para as posições 11 a 16, contando apartir da extremidade 3', é xxXxxX, em que "X" denota uma unidade de LNAe "x" denota uma unidade de não-LNA. Alternativamente, no unidades deLNA está presente nas posições 11 a 16, contando a partir da extremidade3', isto é, o padrão de substituição é xxxxxx.

Em uma modalidade preferida da invenção, o oligonucleotídeode acordo com a presente invenção contém uma unidade de LNA na extre-midade 5'. Em outra modalidade preferida, o oligonucleotídeo de acordo coma presente invenção contém uma unidade de LNA nas duas primeiras posi-ções, contando a partir da extremidade 5'.

Em uma modalidade particularmente preferida, o oligonucleotí-deo de acordo com a presente invenção contém 13 nucleotídeos e o padrãode substituição, começando a partir da extremidade 3', é XXxXxXxxXXxxX,em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. A seqüência preferida para essa modalidade, começando a partir daextremidade 3' é CCtCaCacTGttA, em que uma letra maiúscula denota umabase nitrogenosa em uma unidade de LNA e uma letra minúscula denotauma base nitrogenosa em uma unidade de não-LNA.

Em outra modalidade particularmente preferida, o oligonucleotí-deo de acordo com a presente invenção contém 15 nucleotídeos e o padrãode substituição, começando a partir da extremidade 3' é XXxXxXxxXXxxXxX,em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não-LNA. A seqüência preferida para essa modalidade, começando a partir daextremidade 3', é CCtCaCacTGttAcCl em que uma letra maiúscula denotauma base nitrogenosa em uma unidade de LNA e uma letra minúscula deno-ta uma base nitrogenosa em uma unidade de não-LNA.

Modificação do grupo de ligação internucleosídeo

Grupos de ligação internucleosídeo típicos em oligonucleotídeosão grupos fosfato, mas esses podem ser substituídos por grupos de ligaçãointernucleosídeo diferentes de fosfato. Em uma outra modalidade interessan-te da invenção, o oligonucleotídeo da invenção é modificado em sua estrutu-ra de grupo de ligação internucleosídeo, isto é, o oligonucleotídeo modifica-do compreende um grupo de ligação internucleosídeo o qual difere de fosfa-to. Conseqüentemente, em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo deacordo com a presente invenção compreende pelo menos uma.

Exemplos específicos de grupos de ligação internucleosídeo osquais diferem de fosfato (-O-P(O)2-O-) incluem -O-P(OjS)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O1S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O1S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(Rh)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRh)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRh)-O-, -O-P(O)2-NRh-, -NRh-P(O)2-O-,-NRh-CO-O-, -NRh-CO-NRh-, -O-CO-O-, -O-CO-NRh-, -NRh-CO-CH2-, -20 O-CH2-CO-NRh-, -O-CH2-CH2-NRh-, -CO-NRh-CH2-, -CH2-NRh-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRh-, -O-CH2-CH2-NRh-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-, onde Rh é hidrogênio ou C1-4-alquila.

Quando o grupo de ligação internucleosídeo é modificado, ogrupo de ligação internucleosídeo é, de preferência, um grupo fosforotioato(-O-P(O1S)-O-). Em uma modalidade preferida, todos os grupos de ligaçãointernucleosídeo dos oligonucleotídeos de acordo com a presente invençãosão fosforotioato.

Designs para micro-RNAs específicos

A tabela a seguir proporciona exemplos de oligonucleotídeo deacordo com a presente invenção, tal como aqueles usados em composiçõesfarmacêuticas, quando comparado com o tipo de molécula da técnica anterior.<table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>

Letras maiúsculas sem um superescrito M ou F, se referem a

unidades de LNA. Letra minúscula = DNA, exceto para a letra minúscula emnegrito = RNA. As citocinas de LNA podem ser opcionalmente metiladas).Letras maiúsculas seguido por um superescrito M se referem a unidades de2ΌΜΕ RNA. Letras maiúsculas seguido por um superescrito F se referem àunidades de 2'fluoro DNA, letra minúscula se refere ao DNA. Os oligos aci-ma podem, em uma modalidade, ser totalmente fosforotioato, mas outrasligações de nucleobase, conforme aqui descrito, podem ser usadas. Em umamodalidade, as ligações de nucleobase são todas fosfodiéster. Considera-seque, para uso dentro da coluna espinhal/cérebro, é preferível usar ligaçõesde fosfodiéster, por exemplo, para o uso dos antimiRs que objetivam miR21.

Os oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem, emuma modalidade, ter uma seqüência de nucleobases 5' - 3' selecionada dogrupo consistindo em:

LdLddLLddLdLdLL (Novo design)LdLdLLLddLLLdLL (Novo design intensificado)LMLMMLLMMLMLMLL (Novo design - 2'MOE)LMLMLLLMMLLLMLL (Novo design intensificado- 2'MOE)LFLFFLLFFLFLFLL (Novo design - 2' Fluoro)LFLFLLLFFLLLFLL (Novo design intensificado- 2' Fluoro)LddLddLddL(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d) Ά cada três'dLddLddLdd(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L) Ά cada três'ddLddLddLd(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d) Ά cada três'LMMLMMLMML(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M) Ά cada três'MLMMLMMLMM(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L) Ά cada três'MMLMMLMMLM(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M) Ά cada três*LFFLFFLFFL(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F) Ά cada três'FLFFLFFLFF(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L) Ά cada três'FFLFFLFFLF(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F) Ά cada três'dLdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d) Ά cada dois'LdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L) Ά cada dois'MLMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M) Ά cada dois'LMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L) Ά cada dois'FLFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F) Ά cada dois'LFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L) Ά cada dois'

em que L = unidade de LNA, d = unidades de DNA, M = 2'MOE RNA, F =2'Fluoro e resíduos entre parênteses são opcionais

Exemplos específicos dos oligonucleotídeos de acordo com apresente invenção podem ser selecionados do grupo consistindo em tg-CatGgaTttGcaCa (SEQ ID NO 82), tgCatGgaTttGcaC(SEQ ID NO 83),CatGgaTttGcaC (SEQ ID NO 84), tGcAtGgAtTtGcAc (SEQ ID NO 85), cAtG-gAtTtGcAc (SEQ ID NO 86), CatGGatTtGcAC (SEQ ID NO 87), TgCatG-GatTtGeAC (SEQ ID NO 88), TgCaTgGaTTtGeACa (SEQ ID NO 89),cCatTgtCacActCca (SEQ ID NO 90), cCatTgtAacTctCca (SEQ ID NO 91),ccAttGtcAcaCtcCa (SEQ ID NO 92), cCatTgtCacActCc (SEQ ID NO 93),atTgtCacActCc (SEQ ID NO 94), ccAttGtcAcaCtcC (SEQ ID NO 95), AttGt-cAcaCtcC (SEQ ID NO 96), aTtGtCaCaCtCc (SEQ ID NO 97), AttGTca-CaCtCC (SEQ ID NO 98), CcAttGTcaCaCtCC (SEQ ID NO 99), CcaTtgTca-cAeteCa (SEQ ID NO 100), CCAttgtcacacTCCa (SEQ ID NO 101), tCaeGat-TagCatTaa (SEQ ID NO 102), aTcaCgaTtaGcaTta (SEQ ID NO 103), TcAc-GaTtAgCaTtAa (SEQ ID NO 104), AteAeGaTtAgCaTta (SEQ ID NO 105),gAgcCgaAcgAacAa (SEQ ID NO 106), gcCgaAcgAacAa (SEQ ID NO 107),GaGeCgAaCgAaCaA (SEQ ID NO 108), e GeCgAaCgAaCaA (SEQ ID NO109); em que a letra minúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidadede DNA e uma letra maiúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidadede LNA, com a letra maiúscula C se referindo a MeC.

Será reconhecido que o design de nucleobases de LNA/DNAnos exemplos específicos acima pode ser aplicado a outros oligonucleotí-deos de acordo com a invenção.

Conjugados

A invenção também proporciona conjugados compreendendo ooligonucleotídeo de acordo com a invenção.

Em uma modalidade da invenção, o composto oligomérico estáligado a ligantes/conjugados, os quais podem ser usados, por exemplo, paraaumentar a captação celular dos oligonucleotídeos anti-sentido. Essa conju-gação pode ocorrer nas posições terminais 573'-OH, mas os Iigantes podemtambém ocorrer nos açúcares e/ou nas bases. Em particular, o fator de cres-cimento ao qual o oligonucleotídeo anti-sentido pode ser conjugado podecompreender transferrina ou folato. Complexos de transferrina - polilisina -oligonucleotídeo ou complexos de folato - polisina - ou semelhante podemser preparados para captação por células expressando altos níveis do recep-tor de transferrina ou folato. Outros exemplos de conjugados/ Iigantes sãoporções de colesterol, intercaladores de dupla tais como acridina, poli -L-lisina, "revestimento de extremidade" com um ou mais grupos de ligação re-sistentes à nuclease, tal como fosforomonotioato e semelhantes. A invençãotambém proporciona um conjugado compreendendo o composto de acordocom a invenção conforme descrito aqui e pelo menos uma porção de não-nucleotídeo ou não polinucleotídeo covalentemente presa ao referido com-posto. Portanto, em uma modalidade onde o composto da invenção consistede um ácido nucléico especificado conforme divulgado aqui, o composto po-

de também compreender pelo menos uma porção de não-nucleotídeo ounão polinucleotídeo (por exemplo, não compreendendo um ou mais nucleo-tídeos ou análogos de nucleotídeo) covalentemente ligada ao referido com-posto. A porção de não-nuçleobase pode, por exemplo, ser ou compreenderum esterol, tal como colesterol.

Portanto, será reconhecido que o oligonucleotídeo da invenção,tal como o oligonucleotídeo usado em formulações farmacêuticas (terapêuti-cas) pode compreender outros componentes de não-nucleobase, tais comoos conjugados aqui definidos.

A unidade de LNA

Em uma modalidade preferida, a unidade de LNA tem a estrutu-ra química geral mostrada no Esquema 1 abaixo:

Esquema 1

<formula>formula see original document page 70</formula>

em que

X é selecionado do grupo consistindo em O, S e NRh, onde Rh éH ou C1-4-alquila;

Y é (-CH2, onde r é um número inteiro de 1-4; eB é uma base nitrogenosa.

Em uma modalidade preferida da invenção, r é 1ou 2, em parti-cular 1, isto é, uma unidade de LNA preferida tem a estrutura química mos-trada no Esquema 2 abaixo:

<formula>formula see original document page 71</formula>

em que XeB são conforme definido acima.

Em uma modalidade interessante, as unidades de LNA incorpo-radas nos oligonucleotídeos da invenção são independentemente seleciona-das do grupo consistindo em unidades de tio-LNA, unidades de amino-LNA eunidades de óxi-LNA.

Assim, a unidade de tio-LNA pode ter a estrutura química mos-trada no Esquema 3 abaixo:

<formula>formula see original document page 71</formula>

em que B é conforme definido acima.

De preferência, a unidade de tio-LNA está em sua forma beta-D-,isto é, tendo a estrutura mostrada em 3A acima.

Da mesma forma, a unidade de amino-LNA pode ter a estruturaquímica mostrada no Esquema 4 abaixo:<formula>formula see original document page 72</formula>

em que B e Rh são conforme definido acima.

De preferência, a unidade de amino- LNA está em sua formabeta-D-, isto é, tendo a estrutura mostrada em 4A acima.

A unidade de óxi-LNA pode ter a estrutura química mostrada noEsquema 5 abaixo

Esquema 5

<formula>formula see original document page 72</formula>

em que B é conforme definido acima.

De preferência, a unidade de óxi-LNA está em sua forma beta-D-, isto é, tendo a estrutura mostrada em 5A acima.

Conforme indicado acima, B é uma base nitrogenosa a qual po-de ser de origem natural ou não-natural. Exemplos específicos de bases ni-trogenosas incluem adenina (A), citosina (C), 5-metilcitosina (MeC), isocitosi-na, pseudoisocitosina, guanina (G), timina (T), uraeila (U)1 5-bromouracila, 5-propiniluracila, 5-propinila-6, 5-metiltiazoleuracila, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, 2,6-diaminopurina, 7-propina-7-deazaadenina, 7-propina-7-deazaguanina e 2-cloro-6-aminopurina.

Grupos Terminais

Exemplos específicos de grupos terminais incluem grupos ter-minais selecionados do grupo consistindo em hidrogênio, azida, halogênio,ciano, nitro, hidróxi, Prot-O-, Act-O-, mercapto, Prot-S-, Act-S-, C1-6-alquilatio,amino, Prot-N(RH)-, Act-N(RH)-, mono- ou di(Ci-6-alquila)amino C1-6-alcóxi ,opcionalmente substituído, C-1-6-alquila opcionalmente substituída, C2-6-alquinila opcionalmente substituída, C2-6-alquienilóxi opcionalmente substitu-ido, C2-6-alquinila opcionalmente substituída, C2-6-alquinilóxi opcionalmentesubstituída, monofosfato incluindo monofosfato protegido, monotiofosfatoincluindo monotiofosfato protegido, difosfato incluindo difosfato protegido,ditiofosfato incluindo ditiofosfato protegido, trifosfato incluindo trifosfato pro-tegido, tritiofosfato incluindo tritiofosfato protegido, onde Prot é um grupo deproteção para -OH, -SH e -NH(Rh), e Act é um grupo de ativação para -OH, -SH, e -NH(Rh), e Rh é hidrogênio ou Ci-6-alquila.

Exemplos de grupos de proteção fosfato incluem S-acetiltioetila(SATE) e S-pivaloiltioetila (f-butil-SATE).

Ainda outros exemplos de grupos terminais incluem intercalado-res de DNA, grupos fotoquimicamente ativos, grupos de queiação, gruposrepórter, ligantes, carbóxi, sulfono, hidroximetila, Prot-O-CH2-, Act-O-CH2-,aminometila, Prot-N(Rh)-CH2-, Act-N(Rhl)-CH2-, carboximetila, sulfonometila,onde Prot é um grupo de proteção -OH, -SH e -NH(Rh)i e Act é um grupo deproteção para -OH, -SH, e -NH(Rh), e Rh é hidrogênio ou Ci-6-alquila.

Exemplos de grupos de proteção para -OH e -SH incluem arilasubstituída, tritila, tal como 4,4'-dimetoxitritilóxi (DMT), 4-monometoxitritilóxi(MMT); tritilóxi, opcionalmente substituída 9-(9-fenil)xantenilóxi (pixil), opcio-nalmente substituída metoxitetrahidropiranilóxi (mthp); sililóxi, tal como tri-metil-sililóxi (TMS), triisopropil-sililóxi (TIPS), terc-butildimetil-sililóxi(TBDMS), trietil-sililóxi, fenildimetilsililóxi; terc-butiléteres; acetais (incluindodois grupos hidróxi); acilóxi, tal como acetila ou acetilas halogênio-substituídas, por exemplo cloroacetilóxi ou fluoroacetilóxi, isobutirilóxi, piva-loilóxi, benzoilóxi e benzoílas, metoximetilóxi (MOM), benzil éteres ou benziléteres tal como 2,6-diclorobenzilóxi (2,6-CI2Bzl). Além disso, quando Z ou Z*é hidroxila, eles podem ser protegidos através de fixação a um suporte sóli-do, opcionalmente através de um ligante.

Exemplos de grupo de proteção amina incluem fluorenilmetoxi-carbonilamino (Fmoc), terc-butiloxicarbonilamino (BOC), trifluoroacetilamino,aliloxicarbonilamino (alloc, AOC), Z-benziloxicarbonilamino (Cbz), benziloxi-carbonilamino substituído, tal como 2-cloro benziloxicarbonilamino (2-CIZ),monometoxitritilamino (MMT), dimetoxitritilamino (DMT), ftaloilamino, e 9-(9-fenil)xantenilamino (pixila).

O grupo de ativação, de preferência media acoplamentos a ou-tros resíduos e/ou monômeros de nucleotídeo e, após o acoplamento terterminado, o grupo de ativação é, tipicamente, convertido a uma ligação in-ternucleosídeo. Exemplos de tais grupos de ativação incluem Ο-fosforamidita opcionalmente substituída, O-fosfotriéster opcionalmente subs-tituído, O-fosfodiéster opcionalmente substituído, H-fosfonato opcionalmentesubstituído e O-fosfonato opcionalmente substituído. No presente contexto, otermo "fosforamidita" significa um grupo da fórmula -P(ORx)-N(Ry)2, em queRx designa um grupo alquila opcionalmente substituío, por exemplo metila,2-cianoetila, ou benzila e cada Ry designa grupos alquila opcionalmentesubstituídos, por exemplo etila ou isopropila ou o grupo -N(Ry)2 forma umgrupo morfolino (-N(CH2CH2)2O). Rx, de preferência, designa 2-cianoetila eos dois Ry são, de preferência, idênticos e designam isopropila. Conseqüen-temente, uma fosforoamidita particularmente é N,N- diisopropila -O - (2- cia-noetila) fosforamidita.

Os grupos terminais preferidos são hidróxi, mercapto e amino,em particular hidróxi.

Terapia e composições farmacêuticas

Conforme explicado inicialmente, os oligonucleotídeos da inven-ção constituirão fármacos adequados com propriedades aperfeiçoadas. Odesign de um fármaco potente e seguro requer sintonização de vários parâ-metros, tais como afinidade/especificidade, estabilidade em fluidos biológi-cos, captação celular, modo de ação, propriedades farmacocinéticas e toxi-cidade.

Conseqüentemente, em um outro aspecto, a presente invençãose refere a uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotí-deo de acordo com a invenção e um diluente, veículo ou adjuvante farma-ceuticamente aceitável. De preferência, o referido veículo é solução salinaou solução tamponada.

Em ainda um outro aspecto, a presente invenção se refere a umoligonucleotídeo de acordo com a presente invenção para uso como um me-dicamento.

Conforme será compreendido, a dosagem é dependente da gra-vidade e responsividade do estado doentio a ser tratado e do curso de tra-tamento durando de vários dias a vários meses ou até que uma cura sejaobtida ou uma diminuição do estado doentio seja obtida. Esquemas de do-sagem ótimos podem ser calculados a partir de medições do acúmulo defármaco no corpo do paciente. Dosagens ótimas podem variar, dependendoda potência relativa dos oligonucleotídeos individuais. Geralmente, elas po-dem ser estimadas baseado nas EC50s verificadas como sendo eficazes emmodelos com animais in vitro e in vivo. Em geral, a dosagem é de 0,01 μg a1 g por kg de peso corporal e pode ser fornecida uma vez ou mais ao dia,semanalmente, mensalmente ou anualmente ou mesmo uma vez a cada 2 a10 anos ou através de infusão contínua durante horas até vários meses. Astaxas de repetição para dosagem podem ser estimadas baseado nos temposde residência medidos e nas concentrações do fármaco em fluidos corporaisou tecidos. Após tratamento com sucesso, pode ser desejável que o pacien-te sofra uma terapia de manutenção para prevenir a recorrência do estadodoentio.

Composições farmacêuticas

Conforme indicado acima, a invenção também se refere a umacomposição farmacêutica, a qual compreende pelo menos um oligonucleotí-deo da invenção como um ingrediente ativo. Será compreendido que a com-posição farmacêutica de acordo com a invenção compreende opcionalmenteum veículo farmacêutico e que a composição farmacêutico compreende op-cionalmente outros compostos, tais como compostos quimioterapêuticos,compostos antiinflamatórios, compostos antivirais e/ou compostos para imu-nomodulação.

Os oligonucleotídeos da invenção podem ser usados "como es-tão" ou na forma de uma variedade de sais farmaceuticamente aceitáveis.Conforme usado aqui, o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" se referea sais que retêm a atividade biológica desejada dos oligonucleotídeos aquiacima identificados e exibem efeitos toxicológicos indesejados mínimos. E-xemplos não Iimitativos de tais sais podem ser formados com aminoácidoorgânico e sais de adição de base formados com cátions de metal, tais comozinco, cálcio bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel,cádmio, sódio, potássio e semelhantes ou com um cátion formado a partir deamônia, N,N-dibenzietieno-diamina, D-glicosamina, tetraetilamônio ou etile-nodiamina.

Em uma modalidade da invenção, o oligonucleotídeo pode estarna forma de um pró-fármaco. Os oligonucleotídeos são íons negativamentecarregados. Em virtude da natureza lipofílica de membranas celulares, acaptação celular de oligonucleotídeo é reduzida comparado com equivalen-tes neutros ou lipofílicos. Esse "impedimento" na polaridade pode ser evitadousando a abordagem de pró-fármaco (veja, por exemplo, Crooke, R. M.(1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag,Berlin, Alemanha, vol. 131, páginas 103-140).

Agentes aglutinantes farmaceuticamente aceitáveis e adjuvantespodem compreender parte do fármaco formulado.

Exemplos de métodos de distribuição para distribuição dos a-gentes terapêuticos descritos aqui, bem como detalhes de formulações far-macêuticas, sais, podem ser descritos em qualquer parte, por exemplo, nosPedidos Provisórios U.S. 60/838,710 e 60/788,995, os quais são aqui incor-porados por referência e Pedido Dinamarquês PA 2006 00615, o qual étambém aqui incorporado por referência.

As composições farmacêuticas da presente invenção incluem,mas não estão limitadas a, soluções e formulações contendo lipossoma. Es-sas composições podem ser geradas de uma variedade de componentesque incluem, mas não estão limitados a, líquidos preformados, sólidos deauto-emulsificação e semi-sólidos de auto-emulssificação. A distribuição defármaco ao tecido com tumor pode ser intensificada através de veículo-mediada incluindo, mas não limitada a, Iipossomas catiônicos, ciclodextrinas,derivados de porfirina, dendrímeros com cadeia ramificada, polímeros depolietilenimina, nanoparticulas e microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol2002; 54(1):3-27). As formulações farmacêuticas da presente invenção, asquais podem, convenientemente, ser apresentadas em uma forma de dosa-gem unitária, podem ser preparadas de acordo com métodos convencionaisna indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de manterem asso-ciação os ingrediente ativos com o(s) veículo(s) farmacêutico(s) ou excipien-te(s). Em geral, as formulações são preparadas mantendo em associaçãouniforme e intimamente os ingredientes ativos com veículos líquidos ou veí-culos sólidos finamente divididos, ou ambos e, então, se necessário, forma-tação do produto. As composições da presente invenção podem ser formu-ladas em qualquer uma de muitas formas de dosagem possíveis tais como,mas não limitado a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líqui-dos, géis macios e supositórios. As composições da presente invenção po-dem também ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não-aquosos ou misturados. Suspensões aquosas podem ainda conter substân-cias as quais aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo,por exemplo, carboximetil celulose de sódio, sorbitol e/ou dextrana. A sus-pensão pode também conter estabilizantes. Os compostos da invenção po-dem também ser conjugados a substâncias de fármaco ativas, por exemplo,aspirina, ibuprofen, um fármaco de sulfa, um anti-diabético, uma antibacteri-ano ou um antibiótico.

Em outra modalidade, as composições da invenção podem con-ter um ou mais compostos de oligonucleotídeo, objetivados a um primeiromicro-RNA e um ou mais compostos de oligonucleotídeo adicionais objetiva-dos a um segundo micro-RNA alvo. Dois ou mais compostos combinadospodem ser usados juntos ou seqüencialmente.

Os compostos divulgados aqui são úteis para uma série de apli-cações terapêuticas, conforme indicado acima. Em geral, métodos terapêuti-cos da invenção incluem a administração de uma quantidade terapeutica-mente eficaz de um oligonucleotídeo a um mamífero, particularmente um serhumano. Em uma determinada modalidade, a presente invenção proporcio-na composições farmacêuticas contendo (a) um ou mias compostos da in-venção e (b) um ou mais agentes quimioterapêuticos. Quando usados comos compostos da invenção, tais agentes quimioterapêuticos podem ser usa-dos individualmente, seqüencialmente ou em combinação com um ou maisde outros desses agentes quimioterapêuticos ou em combinação com radio-terapia. Todos os agentes quimioterapêuticos conhecidos por aqueles habili-tados na técnica são aqui incorporados como tratamentos combinados comum composto de acordo com a invenção. Outros agentes ativos, tais comofármacos antiinflamatórios incluindo, mas não limitado a, fármacos antiinfla-matórios não estereoidais e corticosteróides, fármacos antivirais e fármacospara imunomodulação, também podem ser combinados nas composições dainvenção. Dois ou mais compostos combinados podem ser usados juntos ouseqüencialmente.

Exemplos de indicações terapêuticas as quais podem ser trata-das pelas composições farmacêuticas da invenção:

<table>table see original document page 78</column></row><table>

O mRNA do gene supressor tropomisina 1 (TPM1) foi indicadocomo um miR-21 alvo. mRNA de miotropina (mtpn) foi indicado como ummiR 375 alvo.

Em ainda um outro aspecto, a presente invenção se refere aouso de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção para a fabricação deum medicamento para o tratamento de uma doença selecionada do grupoconsistindo em: aterosclerose, hipercolesterolemia e hiperlipidemia; câncer,glioblastoma, câncer de mama, linfoma, câncer de pulmão; diabetes, distúr-bios metabólico; diferenciação de mioblasto; distúrbios imunes.A invenção ainda refere-se a um oligonucleotídeo de acordocom a invenção para o uso no tratamento de uma doença selecionada dogrupo consistindo em: aterosclerose, hipercolesterolemia e hiperlipidemia;câncer, glioblastoma, câncer de mama, linfoma, câncer de pulmão, diabetes,distúrbios metabólicos; diferenciação de mioblasto; distúrbios imunes.

A invenção proporciona um método de tratamento de um indiví-duo sofrendo de uma doença ou condição selecionada do grupo consistindoem: aterosclerose, hipercolesterolemia e hiperlipidemia; câncer, glioblasto-ma, câncer de mama, linfoma, câncer de pulmão, diabetes, distúrbios meta-bólicos; diferenciação de mioblasto; distúrbios imunes, o método compreen-dendo a etapa de administração de um oligonucleotídeo ou composição far-macêutica da invenção ao indivíduo que precisa da mesma.

Câncer

Em ainda um outro aspecto, a presente invenção se refere aouso de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção ou um conjugado domesmo para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para o trata-mento de ou profilaxia contra câncer, o referido método compreendendoadministração de um oligonucleotídeo da invenção ou um conjugado domesmo ou uma composição farmacêutica da invenção a um paciente queprecisa da mesma.

Tais cânceres podem incluir neoplasia linfo-reticular, leucemialinfoblástica, tumores cerebrais, tumores gástricos, plasmacitomas, mielomamúltiplo, leucemia, tumores do tecido conectivo, Iinfomas e tumores sólidos.

No uso de um composto da invenção ou um conjugado domesmo para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer,o referido câncer pode, adequadamente estar na forma de um tumor sólido.Analogamente, no método para tratamento de câncer divulgado aqui, o refe-rido câncer pode, adequadamente, estar na forma de um tumor sólido.

Além disso, o referido câncer também é, adequadamente, umcarcinoma. O carcinoma é, tipicamente, selecionado do grupo consistindoem melanoma maligno, carcinoma de células basais, carcinoma ovariano,carcinoma de mama, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinomade células renais, carcinoma da bexiga, câncer de bexiga superficial recor-rente, carcinoma de estomago, carcinoma prostático, carcinoma pancreático,carcinoma de pulmão, carcinoma cervical, displasia cervical, papilomatoselaringeal, carcinoma de cólon, carcinoma colorretal e tumores sólidos. Maistipicamente, o referido carcinoma é selecionado do grupo consistindo emmelanoma maligno, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinomade mama, carcinoma de cólon e carcinoma de células renais. O melanomamaligno é, tipicamente, selecionado do grupo consistindo em melanoma dedispersão superficial, melanoma nodular, melanoma maligno lentigo, mela-noma acral, melanoma amelanótico e melanoma desmoplástico.

Alternativamente, o câncer pode ser, adequadamente, um sar-coma. O sarcoma está, tipicamente, na forma selecionada do grupo consis-tindo em osteosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, histiocitomafibroso maligno, fibrosarcoma e sarcoma de Kaposi.

Alternativamente, o câncer pode ser, adequadamente, um glioma.

Uma outra modalidade é dirigida ao uso de um oligonucleotídeode acordo com a invenção ou um conjugado do mesmo para a fabricação deum medicamento para o tratamento de câncer, em que o referido medica-mento ainda compreende um agente quimioterapeutico selecionado do gru-po consistindo em adrenocorticosteróides, tais como prednisona, dexameta-sona ou decadron; altretamina (Hexalen, hexametilmelamina (HMM)); ami-fostina (Ethyol); aminoglutetimida (Cytadren); amsacrina (M-AMSA); anas-trozola (Arimidex); androgênios, tal como testosterona; asparaginase (Els-par); bacillus de Calmette-Gurin; bicalutamida (Casodex); bleomicina (bleno-xano); busulfan (Myleran); carboplatina (paraplatina); carmustina (BCNU,BiCNU); clorambucila (Leukeran); clorodeoxiadenosina (2-CDA, cladribina,leustatina); cisplatina (platinol); arabinosídeo de citosina (citarabina); dacar-bazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, Cosmegen); daunorubicina(cerubidina); docetaxel (taxotero); doxorubicina (adriamicina); epirubicina;estramustina (Emcyt); estrogênios, tal como dietil-estilbestrol (DES); etopo-sídeo (VP-16, VePesid, Etopophos); fludarabina (Fludara); flutamida (Eule-xin); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracila (5-FU); gemcitabina (Gemzar); go-serelina (Zodalex); herceptina (Trastuzumab); hidróxiuréia (Hydrea); idarubi-cina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina); interferon alfa(Intron A, Roferon A); irinotecan (Camptosar); Ieuprolida (Lupron); Ievamisola(ergamisola); Iomustina (CCNU); mecloratamina (Mustargen, mostarda denitrogênio); melphalan (Alkeran); mercaptopurina (Purinethol, 6-MP); meto-trexato (mexato); mitomicina-C (mutamucina); mitoxantrona (novantrona);octreotida (sandostatina); pentostatina (2-deoxicoformicina, Nipent); plicami-cina (mitramicina, mitracina); prorocarbazina (matulano); estreptozocina; ta-moxifina (Nolvadex); taxol (Paclitaxel); teniposídeo (Vumon, VM-26); tiotepa;topotecan (Hycamtin); tretinoína (Vesanoid, ácido all-trans-retinóico); vinblas-tina (Valban); vincristina (Oncovin) e vinorelbina (Navelbine). Aequadamente1o referido tratamento ainda ocmpreende a administração de um outro agentequimioterapêutico selecionado de taxanos, tais como Taxol1 Paclitaxel ouDocetaxel.

Similarmente, a invenção ainda é dirigida ao uso de um oligonu-cleotídeo de acordo com a invenção ou um conjugado do mesmo para a fa-bricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o referi-do tratamento ainda compreende a administração de um outro agente quimi-oterapeutico selecionado do grupo consistindo em adrenocorticosteróides,tais como prednisona, dexametasona ou decadron; altretamina (Hexalen,hexametilmelamina (HMM)); amifostina (Ethyol); aminoglutetimida (Cyta-dren); amsacrina (M-AMSA); anastrozola (Arimidex); androgênios, tal comotestosterona; asparaginase (Elspar); bacillus de Calmette-Gurin; bicalutami-da (Casodex); bleomicina (blenoxano); busulfan (Myleran); carboplatina (pa-raplatina); carmustina (BCNU, BiCNU); clorambucila (Leukeran); clorodeoxi-adenosina (2-CDA, cladribina, leustatina); cisplatina (platinol); arabinosídeode citosina (citarabina); dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D,Cosmegen); daunorrubicina (cerubidina); docetaxel (taxotero); doxorrubicina(adriamicina); epirubicina; estramustina (Emcyt); estrogênios, tal como dietil-estilbestrol (DES); etoposídeo (VP-16, VePesid, Etopophos); fludarabina(Fludara); flutamida (Eulexin); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracila (5-FU);gemcitabina (Gemzar); goserelina (Zodalex); herceptina (Trastuzumab); hi-dróxiuréia (Hydrea); idarubicina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, al-desleucina); interferon alfa (Intron A, Roferon A); irinotecan (Camptosar);Ieuprolida (Lupron); Ievamisola (ergamisola); Iomustina (CCNU); meclorata-mina (Mustargen, mostarda de nitrogênio); melphalan (Alkeran); mercapto-purina (Purinethol, 6-MP); metotrexato (mexato); mitomicina-C (mutamuci-na); mitoxantrona (novantrona); octreotida (sandostatina); pentostatina (2-deoxicoformicina, Nipent); plicamicina (mitramicina, mitracina); prorocarbazi-na (matulano); estreptozocina; tamoxifina (Nolvadex); taxol (Paclitaxel); teni-posídeo (Vumon, VM-26); tiotepa; topotecan (Hycamtin); tretinoína (Vesa-noid, ácido all-trans retinóico); vinblastina (Valban); vincristina (Oncovin) evinorelbina (Navelbine). Aequadamente1 o referido tratamento ainda ocm-preende a administração de um outro agente quimioterapeutico selecionadode taxanos, tais como Taxol, Paclitaxel ou Docetaxel.

Alternativamente estabelecido, a invenção é ainda dirigida a ummétodo para o tratamento de câncer, o referido método compreendendoadministração de um oligonucleotídeo da invenção ou um conjugado domesmo ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção a umpaciente que precisa da mesma e ainda compreendendo a administração deum outro agente quimioterapeutico. A referida administração adicional podeser tal que o outro agente quimioterapeutico esteja conjugado ao compostoda invenção, esteja presente na composição farmacêutica ou seja adminis-trado em uma formulação distinta.

Doenças infecciosas

Considera-se que os compostos da invenção podem ser am-plamente aplicáveis a uma ampla faixa de doenças infecciosas, tais comodifeteria, tétano, coqueluche, pólio, hepatite B, hepatitce C, hemophilus influ-enza, sarampo, caxumba e rubéola.

Hsa-miR122 é indicado em infecção por hepatite C e, como tal,o oligonucleotídeo de acordo com a invenção o qual objetiva miR-122 alvopode ser usado para tratar infecção por hepatite C.

Conseqüentemente, em ainda outro aspecto, a presente inven-ção se refere ao uso de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção ouum conjugado do mesmo para a fabricação de um medicamento para o tra-tamento de uma doença infecciosa, bem como a um método para o trata-mento de uma doença infecciosa, o referido método compreendendo admi-nistração de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção ou um conjuga-do do mesmo ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção aum paciente que precisa da mesma.Doenças inflamatórias

A resposta inflamatória é um mecanismo essencial de defesa doorganismo contra o ataque de agentes infecciosos e também está implicadana patogênese de muitas doenças agudas e crônicas, incluindo distúrbiosauto-imunes. A despeito de ser necessária para combater patógenos, osefeitos de uma explosão inflamatória podem ser devastadores. Portanto, fre-qüentemente é necessário restringir a sintomatologia da inflamação com ouso de fármacos antiinflamatórios. A inflamação é um processo complexonormalmente disparado por lesão tecidual que inclui ativação de um grandeconjunto de enzimas, o aumento na permeabilidade vascular e extravasa-mento de fluidos sangüíneos, migração celular e liberação de mediadoresquímicos, todos objetivados para destruir e reparar o tecido lesado.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção se refere ao usode um oligonucleotídeo de acordo com a invenção ou um conjugado domesmo para a fabricação de um medicamento para o tratamento de umadoença inflamatória, bem como a um método para o tratamento de uma do-ença inflamatória, o referido método compreendendo administração de umoligonucleotídeo de acordo com a invenção ou um conjugado do mesmo ouuma composição farmacêutica de acordo com a invenção a um paciente queprecisa da mesma.

Em uma modalidade preferida da invenção, a doença inflamató-ria é uma doença reumática e/ou uma doença do tecido conectivo, tal comoartrite reumatóide, Iupus eritematoso sistêmico (SLE) ou lupus, escleroder-ma, polimiosite, doença inflamatória do intestino, dermatomiosite, colite ulce-rativa, doença de Crohn, vasculite, artrite psoriática, dermatite psoriática es-foliativa, pênfigo vulgaris e síndrome de Sjorgren, em particular doença in-flamatória do intestino e doença de Crohn.

Alternativamente, a doença inflamatória pode ser uma inflama-ção não reumática, tal como bursite, sinovite, capsulite, tendinite e/ou outraslesões inflamatórias de origem traumática e/ou esportiva.

Doenças metabólicas

Uma doença metabólica é um distúrbio causado pelo acúmulode produtos químicos produzidos naturalmente pelo corpo. Essas doençassão usualmente graves, algumas mesmo ameaçam a vida. Outras podemdiminuir o desenvolvimento físico ou causar retardo mental. A maioria dosbebês com esses distúrbios, a princípio, não mostram sinais óbvios da do-ença. Busca apropriada ao nascimento pode, freqüentemente, descobrir es-ses problemas. Com diagnóstico e tratamento precoces, as doenças meta-bólicas podem ser freqüentemente tratadas eficazmente.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção se refere ao usode um oligonucleotídeo de acordo com a invenção ou um conjugado domesmo para a fabricação de um medicamento para o tratamento de umadoença metabólica, bem como a um método para o tratamento de uma do-ença metabólica, o referido método compreendendo administração de umoligonucleotídeo de acordo com a invenção ou um conjugado do mesmo ouuma composição farmacêutica de acordo com a invenção a um paciente queprecisa da mesma.

Em uma modalidade preferida da invenção, a doença metabóli-ca é selecionada do grupo consistindo em Amiloidose, Biotinidase, OMIM(Hereditariedade Mendelina Online no Homem), síndrome de Crigler Najjar,Diabetes, Grupo de Suporte & Informação de Fabry, distúrbios de oxidaçãode ácido graxo, Galactosemia, deficiência de dehidrogenase de glicose-6-fosfato (G6PD), aciduria glutárica, Organização Internacional de AcidemiaGlutárica, Acidemia glutárica do tipo I, Acidemia glutárica do tipo II, acidemiaglutárica do tipo I, acidemia glutárica do tipo II, Hipofosfatemia familial F-HYPDRR, Rickets resistente à vitamina D, doença de Krabbe, deficiência dedehidrogenase de 3 hidroxiacil CoA de cadeia longa (LCHAD), grupos comManosidose, doença urinária de xarope de bordo, distúrbios mitocondriais,sindromes de mucopolissacaridose: Niemann Pick1 acidemias orgânicas,PKU, doença de Pompe, Porfiria, síndrome metabólica, Hiperlipidemia e dis-túrbios de lipídios hereditários, Trimetilaminuria: a síndrome do mal-odor depeixe e distúrbios do ciclo de uréia.Distúrbios do fígado

Em ainda outro aspecto, a presente invenção se refere ao usode um oligonucleotídeo de acordo com a invenção ou um conjugado domesmo para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um dis-túrbio do fígado, bem como a um método para o tratamento de um distúrbiodo fígado, o referido método compreendendo administração de um oligonu-cleotídeo de acordo com a invenção ou um conjugado do mesmo ou umacomposição farmacêutica de acordo com a invenção a um paciente que pre-cisa da mesma.

Em uma modalidade preferida da invenção, o distúrbio do fígadoé selecionado do grupo consistindo em atresia biliar, síndrome de AlagillelAlfa-1 Antitripsina, Tirosinemia, hepatite neonatal e doença de Wilson.Outros usos

Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser utilizadoscomo reagentes de pesquisa para produtos diagnósticos, terapêuticos e pro-filáticos. Em pesquisa, o oligonucleotídeo pode ser usado para inibir especi-ficamente a síntese de genes alvo em células e animais experimentais, des-se modo, facilitando a análise funcional do alvo ou uma apreciação de suautilidade como um alvo para intervenção terapêutica. Em diagnóstico, os oli-gonucleotídeos podem ser usados para detectar e quantificar expressão doalvo em células e tecidos através de Northern blotting, hibridização in situ outécnicas similares. Para produtos terapêuticos, um animal ou ser humanosuspeito de ter uma doença ou distúrbio, o qual pode ser tratado através demodulação da expressão do alvo, é tratado através de administração doscompostos de oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção. Aindaproporcionados são métodos de tratamento de um animal, em particular ca-mundongo e rato, e tratamento de um ser humano suspeito de ter ou estarpropenso a ter uma doença ou condição associada à expressão do alvo a-través de administração de uma quantidade terapêutica ou profilaticamenteeficaz de um ou mais dos compostos ou composições de oligonucleotídeoda invenção.

Uso terapêutico de oligonucleotídeo objetivando miR-122a

Na seção exemplos, é demonstrado que um LNA-antimiR®, talcomo SPC3372, objetivando miR-122a, reduz os níveis de colesterol noplasma. Portanto, outro aspecto da invenção é o uso do oligonucleotídeoacima descrito objetivando miR-122a como um medicamento.

Ainda outro aspecto da invenção é o uso do oligonucleotídeo

descrito acima objetivando miR-122a para o preparo de um medicamentopara o tratamento de níveis aumentados de colesterol no plasma. Aqueleshabilitados na técnica apreciarão que níveis aumentados de colesterol noplasma são indesejáveis, uma vez que isso aumenta o risco de várias condi-ções, por exemplo, aterosclerose.

Ainda outro aspecto da invenção é o uso do oligonucleotídeoacima descrito que objetiva miR-122a para super-regulação dos níveis demRNA de Nrdg3, Aldo A, Bckdk ou CD320.Outras modalidades:

As modalidades a seguir podem ser combinadas com as outrasmodalidades da invenção, conforme descrito aqui.

1. Um oligonucleotídeo tendo um comprimento de 12 a 26 nu-cleotídeos tendo uma seqüência de DNA central das posições dois a sete oudas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3': acgttt, em quepelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal comoduas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas porsua unidade de LNA correspondente; ou um conjugado do mesmo.

2. Um oligonucleotídeo tendo um comprimento de12 a 26 nucle-otídeos tendo uma seqüência de DNA central das posições dois a sete oudas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3': ctcaca,em quepelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal comoduas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas porsua unidade de LNA correspondente; ou um conjugado do mesmo.

3. Um oligonucleotídeo tendo um comprimento de12 a 26 nucle-otídeos tendo uma seqüência de DNA central das posições dois a sete oudas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3': ttacga.em quepelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal comoduas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas porsua unidade de LNA correspondente; ou um conjugado do mesmo.

4. Um oligonucleotídeo tendo um comprimento de12 a 26 nucle-otídeos tendo uma seqüência de DNA central das posições dois a sete oudas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3': acaagc;em quepelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal comoduas ou três unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas porsua unidade de LNA correspondente; ou um conjugado do mesmo.

5. O oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das modali-dades 1 a 4 ou um conjugado do mesmo, em que pelo menos duas, tal comoduas ou três unidades de DNA das posições um a seis, dois a sete ou três aoito, contando a partir da extremidade 3', foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente e em que as unidades de LNA são separadas porpelo menos uma unidade de DNA.

6. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 5 ou um con-jugado do mesmo, em que o número de unidades de DNA consecutivas dasposições um a seis, dois a sete ou três a oito, contando a partir da extremi-dade 3', é de no máximo dois.

7. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 6 ou um con-jugado do mesmo, em que cada segundo nucleotídeo das posições um aseis, dois a sete ou três a oito, contando a partir da extremidade 3', é umaunidade de LNA.

8. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 6 ou um con-jugado do mesmo, em que cada terceiro nucleotídeo das posições um aseis, dois a sete ou três a oito, contando a partir da extremidade 3', é umaunidade de LNA.

9. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 6 ou um con-jugado do mesmo, em que o padrão de substituição para os nucleotídeosnas posições um a seis, dois a sete ou três a oito, contando a partir da ex-tremidade 3', é selecionado do grupo consistindo em: Χ, χ, χ, χ, χ, Χ, χ, X, eX; em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade deDNA.

10. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 9 ou umconjugado do mesmo, em que o padrão de substituição para os nucleotídeosnas posições um a seis, dois a sete ou três a oito, contando a partir da ex-tremidade 3', é selecionado do grupo consistindo em Χ, χ, χ, X, e x; em que"X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de DNA.

11.0 oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 1 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a sete,dois a oito ou três a nove, contando a partir da extremidade 3': acgttta, emque pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

12. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 2 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a sete,dois a oito ou três a nove, contando a partir da extremidade 3': ctcacac, emque pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

13. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 3 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a sete,dois a oito ou três a nove, contando a partir da extremidade 3': ttacgat, emque pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

14. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 4 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a sete,dois a oito ou três a nove, contando a partir da extremidade 3': acaagca, emque pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

15. O oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das moda-lidades 11 a 14 ou um conjugado do mesmo, em que pelo menos duas, talcomo duas, três ou quatro unidades de DNA das posições um a sete, dois aoito ou três a nove, contando a partir da extremidade 3', foram substituídaspor sua unidade de LNA correspondente e em que as unidades de LNA sãoseparadas por pelo menos uma unidade de DNA.

16. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 15 ou umconjugado do mesmo, em que o número de unidades de DNA consecutivasdas posições um a sete, dois a oito ou três a nove, contando a partir da ex-tremidade 3', é de no máximo dois.

17. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 16 ou umconjugado do mesmo, em que cada segundo nucleotídeo das posições um asete, dois a oito ou três a nove, contando a partir da extremidade 3', é umaunidade de LNA.

18. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 16 ou umconjugado do mesmo, em que cada terceiro nucleotídeo das posições um asete, dois a oito ou três a nove, contando a partir da extremidade 3', é umaunidade de LNA.

19. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 16 ou umconjugado do mesmo, em que o padrão de substituição para os nucleotídeosnas posições um a sete, dois a oito ou três a nove, contando a partir da ex-tremidade 3', é selecionado do grupo consistindo em Xx, xx, xx, xX, xX, xX,Xx, xX, Xx, Xx, xx, e xX;em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" deno-ta uma unidade de DNA.

20. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 19 ou umconjugado do mesmo, em que o padrão de substituição para os nucleotídeosnas posições um a sete, dois a oito ou três a nove, contando a partir da ex-tremidade 3', é selecionado do grupo consistindo em Xx1 xx, xX, Xx, xX, e xx;em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de DNA.

21. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 11 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a oito,dois a nove ou três a dez, contando a partir da extremidade 3': acgtttag, emque pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

22. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 12 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a oito,dois a nove ou três a dez, contando a partir da extremidade 3': ctcacact, emque pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

23. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 13 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a oito,dois a nove ou três a dez, contando a partir da extremidade 3': ttacgatt, emque pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

24. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 14 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a oito,dois a nove ou três a dez, contando a partir da extremidade 3': acaagcaa,em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três ou quatrounidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidadede LNA correspondente.

25. O oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das moda-lidades 21 to 24 ou um conjugado do mesmo, em que pelo menos duas, talcomo duas, três ou quatro unidades de DNA das posições um a oito, dois anove ou três a dez, contando a partir da extremidade 3', foram substituídaspor sua unidade de LNA correspondente e em que as unidades de LNA sãoseparadas por pelo menos uma unidade de DNA.

26. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 25 ou umconjugado do mesmo, em que o número de unidades de DNA consecutivasdas posições um a oito, dois a nove ou três a dez, contando a partir da ex-tremidade 3', é de no máximo dois.

27. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 26 ou umconjugado do mesmo, em que cada segundo nucleotídeo das posições um aoito, dois a nove ou três a dez, contando a partir da extremidade 3', é umaunidade de LNA.

28. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 26 ou umconjugado do mesmo, em que cada terceiro nucleotídeo das posições um aoito, dois a nove ou três a dez, contando a partir da extremidade 3', é umaunidade de LNA.

29. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 26 ou umconjugado do mesmo, em que o padrão de substituição para os nucleotídeosnas posições um a oito, dois a nove ou três a dez, contando a partir da ex-tremidade 3', é selecionado do grupo consistindo em Xxx, XxX, xxX, xXx,xxX, xXx, xXx, Xxx, xXx, Xxx, Xxx, XxX, xxX, XxX, XxX, e xXx; em que "X"denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de DNA.

30. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 29 ou umconjugado do mesmo, em que o padrão de substituição para os nucleotídeosnas posições um a oito, dois a nove ou três a dez, contando a partir da ex-tremidade 3', é selecionado do grupo consistindo em Xxx, xxX, xXx, XxX,xXx, e xxX; em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma uni-dade de DNA.

31. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 21 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a no-ve, dois a dez ou três a onze, contando a partir da extremidade 3': acgtttagg,em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três, ainda maispreferivelmente pelo menos quatro, tal como quatro ou cinco unidades deDNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidade de LNA cor-respondente.

32. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 22 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a no-ve, dois a dez ou três a onze, contando a partir da extremidade 3': ctcacactg,em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três, ainda maispreferivelmente pelo menos quatro, tal como quatro ou cinco unidades deDNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidade de LNA cor-respondente.

33. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 23 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a no-ve, dois a dez ou três a onze, contando a partir da extremidade 3': ttacgatta,em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, talcomo duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três, ainda maispreferivelmente pelo menos quatro, tal como quatro ou cinco unidades deDNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidade de LNA cor-respondente.

34. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 24 ou umconjugado do mesmo tendo uma seqüência de DNA das posições um a no-ve, dois a dez ou três a onze, contando a partir da extremidade 3': acaagca-ag,em que pelo menos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas,tal como duas, mais preferivelmente pelo menos três, tal como três, aindamais preferivelmente pelo menos quatro, tal como quatro ou cinco unidadesde DNA na referida seqüência foram substituídas por sua unidade de LNAcorrespondente.

35. O oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das moda-lidades 21 to 24 ou um conjugado do mesmo, em que pelo menos duas, talcomo duas, três, quatro ou cinco unidades de DNA das posições um a nove,dois a dez ou três a onze, contando a partir da extremidade 3', foram substi-tuídas por sua unidade de LNA correspondente e em que as unidades deLNA são separadas por pelo menos uma unidade de DNA.

36. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 35 ou umconjugado do mesmo, em que o número de unidades de DNA consecutivasdas posições um a nove, dois a dez ou três a onze, contando a partir da ex-tremidade 3', é de no máximo dois.

37. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 36 ou umconjugado do mesmo, em que cada segundo nucleotídeo das posições um anove, dois a dez ou três a onze, contando a partir da extremidade 3', é umaunidade de LNA.

38. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 36 ou umconjugado do mesmo, em que cada terceiro nucleotídeo das posições um anove, dois a dez ou três a onze, contando a partir da extremidade 3', é umaunidade de LNA.

39. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 36 ou umconjugado do mesmo, em que o padrão de substituição para os nucleotídeosnas posições um a nove, dois a dez ou três a onze, contando a partir da ex-tremidade 3', é selecionado do grupo consistindo em XxxX, XxXx, xxXx,

xXxx, xxXx, xXxx, xXxx, xXxx, xXxX, xXxX, xXxX, XxxX, xXxX, XxxX, XxxX,XxXx, XxXx, xxXx, xXxx, e xXxX; em que "X" denota uma unidade de LNA e"x" denota uma unidade de DNA.

40. O oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das moda-lidades precedentes ou um conjugado do mesmo, em que o referido nucleo-tídeo tem um comprimento de 12 a 24 nucleotídeos, tal como um compri-mento de 12 a 22 nucleotídeo, de preferência um comprimento de 12 a 20nucleotídeos, tal como um comprimento de 12 a 19 nucleotídeos, mais prefe-rivelmente um comprimento de 12 a 18 nucleotídeos, tal como um compri-mento de 12 a 17 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente um comprimentode 12 a 16 nucleotídeos.

41. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 1 tendouma seqüência selecionada do grupo consistindo em tgMeCatGgaTttGcaMe-Ca, tgMeCatGgaTttGca MeC, MeCatGgaTttGcaMeC, tGcAtGgAtTtGcAc, cAtG-gAtTtGcAc, MeCatGGatTtGcAMeC, TgMeCatGGatTtGcAMeC, e TgMeCaTg-GaTTtGcACa; em que a letra minúscula identifica a base nitrogenosa deuma unidade de DNA e uma letra maiúscula identifica a base nitrogenosa deuma unidade de LNA; ou um conjugado do mesmo. (SEQ IDs NO 82-89)

42. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 2 tendouma seqüência selecionada do grupo consistindo em cMeCatTgtCacActMeC-ca, cMeCatTgtAacTctMeCca, ccAttGtcAcaMeCtcMeCa, cMeCatTgtMeCacActMeCc,atTgtMeCacActMeCc, ccAttGtcAcaMeCtcMeC, AttGtcAcaMeCtcMeC, aTtGtMeCa-CaMeCtMeCc, AttGTcaMeCaMeCtMeCMeC, MeCcAttGTcaMeCaMeCtMeCMeC, MeC-caTtgTcacActcMeCa, e MeCMeCAttgtcacacTMeCMeCa; em que a letra minúscu-la identifica a base nitrogenosa de uma unidade de DNA e uma letra maiús-cula identifica a base nitrogenosa de uma unidade de LNA; ou um conjugadodo mesmo. (SEQ IDs NO 90-101)

43. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 3 tendouma seqüência selecionada do grupo consistindo em tMeCacGatTagMeCat-Taa1 aTcaMeCgaTtaGcaTta, TcAcGaTtAgMeCaTtAa, AtcAcGaTtAgweCaTta;em que a letra minúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidade deDNA e uma letra maiúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidade deLNA; ou um conjugado do mesmo. (SEQ IDs NO 102-105).

44. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 4 tendouma seqüência selecionada do grupo consistindo em gAgcMeCgaAcgAacAa,gcMeCgaAcgAacAa, GaGcMeCgAaMeCgAaMeCaA, e GcMeCgAaMeCgAaMeCaA;em que a letra minúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidade deDNA e uma letra maiúscula identifica a base nitrogenosa de uma unidade deLNA; ou um conjugado do mesmo. (SEQ IDs NO 106-109).

45. O oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das moda-lidades precedentes ou um conjugado do mesmo, em que o oligonucleotídeocompreende pelo menos um grupo de ligação internucleosídeo o qual diferede fosfodiéster.

46. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 45 ou umconjugado do mesmo, em que o referido grupo de ligação internucleosídeo oqual difere de fosfodiéster é fosforotioato.

47. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 46 ou umconjugado do mesmo, em que todos os grupos de ligação internucleosídeosão fosforotioato.

48. O oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das moda-lidades precedentes ou um conjugado do mesmo, em que as referidas uni-dades de LNA são independentemente selecionadas do grupo consistindoem unidades de tio-LNA, unidades de amino-LNA e unidades de óxi-LNA.

49. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 48 ou umconjugado do mesmo, em que as referidas unidades de LNA estão na formabeta-D.

50. O oligonucleotídeo de acordo com a modalidade 48 ou umconjugado do mesmo, em que as referidas unidades de LNA são unidadesde óxi-LNA na forma beta-D.

51.0 oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das moda-lidades precedentes ou um conjugado do mesmo para uso como um medi-camento.

52. Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonu-cleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 -50 ou um conju-gado do mesmo e um veículo farmaceuticamente aceitável.

53. A composição de acordo com a modalidade 52, em que oreferido veículo é solução salina ou solução salina tamponada.

54. Uso de um oligonucleotídeo de acordo com qualquer umadas modalidades 1-50 ou um conjugado do mesmo ou uma composição deacordo com a modalidade 52 para a fabricação de um medicamento para otratamento de câncer.

55. Método para o tratamento de câncer compreendendo a eta-pa de administração de um oligonucleotídeo de acordo com qualquer umadas modalidades 1 -50 ou um conjugado do mesmo ou uma composição deacordo com a modalidade 52.

56. Uso de um oligonucleotídeo de acordo com qualquer umadas modalidades 1 -50 ou um conjugado do mesmo ou uma composição deacordo com a modalidade 52 para o preparo de um medicamento para o tra-tamento de níveis aumentados de colesterol no plasma.

57. Uso de um oligonucleotídeo de acordo com qualquer umadas modalidades 1-50 ou um conjugado do mesmo ou uma composição deacordo com a modalidade 52 para super-regulação dos níveis de mRNA deNrdg3, Aldo A, Bckdk ou CD320.

EXPERIMENTAL

Exemplo 1: Síntese de monômero

Os blocos de construção monoméricos de LNA e derivados dosmesmos foram preparados seguindo procedimentos publicados e referênciascitadas nos mesmos; veja, por exemplo, WO 03/095467 A1 e D. S. Peder-sen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites,Synthesis 6, 802-808.

Exemplo 2: Síntese de oligonucleotídeo

Oligonucleotídeos foram sintetizados usando a abordagem co-mo fosforoamidita sobre um sintetizador Expedite 89OO/MOSS (Multiple Oli-gonucleotide Synthesis System) em uma escala de 1 pmol ou 15 pmoles.Para síntese em larga escala, um Akta Oligo Pilot (GE Healthcare) foi usado.Ao final da síntese (DMT-on), os oligonucleotídeos foram clivados do suportesólido usando amônia aquosa durante 1-2 horas em temperatura ambiente eainda desprotegidos durante 4 horas a 65°C. Os oligonucleotídeos forampurificados através de HPLC de fase reversa HPLC (RP-HPLC). Após remo-ção do grupo DMT, os oligonucleotídeos foram caracterizados através deAE-HPLC, RP-HPLC e CGE e a massa molecular foi ainda confirmada atra-vés de ESI-MS. Veja abaixo para maiores detalhes.

Preparação do suporte sólido de LNA:

Preparação do hemiéster de succinila de LNA

Monômero de 5'-0-Dmt-3'-hidróxi-LNA (500 mg), anidrido succí-nico (1,2 eq.) e DMAP (1,2 eq.) foram dissolvidos em DCM (35 mL). A rea-ção foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. Após extraçõescom NaH2PO4 a 0,1 M, pH de 5,5 (2x) e salmoura (1x), a camada orgânicafoi ainda seca com Na2SO4 anídrico, filtrada e evaporada. O derivado dehemi-éster foi obtido em um rendimento de 95% e foi usado sem qualqueroutra purificação.Preparação do LNA-suporte

O derivado de hemiéster preparado acima (90 pmoles) foi dis-solvido em uma quantidade mínima de DMF1 DIEA e pyBOP (90 pmoles)foram adicionados e misturados juntos durante 1 min. Essa mistura pré-ativada foi combinada com LCAA-CPG (500 À, tamanho de malha de 80-120, 300 mg) em um sintetizador manual e agitada. Após 1,5 hora em tem-peratura ambiente, o suporte foi filtrado e lavado com DMF, DCM e MeOH.Após secagem, o carregamento foi determinado como sendo de 57 pmoles/g(veja Tom Brown, Dorcas J.S.Brown. Modem machine-aided methods of oli-godeoxyribonucleotide synthesis. Em: F.Eckstein, editor. Oligonucleotidesand Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991:13-14).

Alongamento do oliqonucleotídeo

O acoplamento de fosforoamiditas (A(bz), G(ibu), 5-metil-C(bz))ou Τ-β-cianoetilfosforoamidita) é realizado usando uma solução de 0,1 M daamidita 5'-0-DMT-protegida em acetonitrilo e DCI (4,5-dicianoimidazola) emacetonitrilo (0,25 M) como ativador. A tiolação é realizada usando cloreto dexantano (0,01 M em acetonitrilo:piridina a 10%). O resto dos reagentes são aqueles tipicamente usados para síntese de oligonucleotídeo.Purificação através de RP-HPLC:

Coluna: Xterra RPi8

Taxa de fluxo: 3 mL/min

Tampões: acetato de amônio a 0,1 M, pH de 8, e acetonitrila

Abreviações:

DMT: Dimetoxitritila

DCI: 4,5-Dicianoimidazol

DMAP: 4-Dimetilaminopiridina

DCM: Diclorometano

DMF: Dimetilformamida

THF: Tetrahidrofurano

DIEA: /V,/V-diisopropiletilaminaPyBOP: Hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -il-óxi-tris-pirrolidino-fosfônio

Bz: Benzoíla

lbu: Isobutirila

Exemplo 3: Design do oligonucleotídeo de LNA anti-miR e temperaturas de fusão

Micro-RNA alvo:

miR-122a: 5'-uggagugugacaaugguguuugu-3' SEQ ID NO: 1miR-122a 3' a 5': 3'-uguuugugguaacagugugaggu-5' (SEQ IDNO: 1 orientação reversa)

Tabela 1: seqüências de oligonucleotídeo de LNA anti-miR e Tm:

<table>table see original document page 98</column></row><table>

Letra minúscula: DNA, letra maiúscula: LNA (todos as C do LNA foram meti-ladas), sublinhado: combinação errônea.

As temperaturas de fusão foram avaliadas com relação à se-qüência de miR-122a maduro, usando um oligonucleotídeo de RNA de miR-122a sintético com ligação de fosforotioato.

O anti-miR da dupla LNA/miR-122a oligo foi diluído para 3 μΜem 500 μl de H2O isenta de RNase a qual foi, então, misturada com 500 μlde 2x tampão de dimerização (concentração final de oligo/dupla de 1,5 μΜ,2x tampão de Tm: NaCl a 200 mM, EDTA a 0,2 mM, NaP a 20 mM, pH de7,0, tratada com DEPC para remover RNases). A mistura foi primeiro aque-cida para 95 graus durante 3 minutos, então, deixada esfriar para a tempera-tura ambiente (RT) durante 30 minutos.

Após incubação em RT, a Tm foi medida sobre um Lambda 40UV/VIS Spectrophotometer com um programador de temperatura PeltierPTP6 usando o software PE Templab (Perkin Elmer). A temperatura foi ele-vada de 20°C para 95°C e, então, diminuída novamente para 20°C, regis-trando continuamente a absorção a 260 nm. Primeiro derivado e máximoslocais da temperatura de fusão e anelamento foram usados para avaliar oponto de fusão/anelamento (Tm), ambos proporcionando valores de Tm simi-lares/semelhantes. Para o primeiro derivado, 91 pontos foram usados paracalcular o declínio.

Substituindo o oligonucleotídeo antimir e a molécula de RNAcomplementar, o ensaio acima pode ser usado para determinar a Tm de ou-tros oligonucleotídeos, tais como os oligonucleotídeos de acordo com a in-venção.

Contudo, em uma modalidade, a Tm pode ser feita com uma mo-lécula de DNA complementar (ligação de fosforotioato). Tipicamente, a Tmmedida contra uma molécula complementar de DNA é cerca de 10°C menordo que a Tm com um complemento de RNA equivalente. A Tm medida usan-do o complemento de DNA pode, portanto, ser usada em casos onde a du-pla tem uma Tm muito alta.Medições da temperatura de fusão (Tm):

<table>table see original document page 100</column></row><table>

É reconhecido que, para oligonucleotídeos com Tm muito alta, osensaios de Tm acima podem ser insuficientes para determinar a Tm. Em talcaso, o uso de uma molécula complementar de DNA fosforotioada pode di-minuir adicionalmente a Tm.

O uso de formamida é rotina na análise de hibridização de oli-gonucleotídeo (veja Hutton 1977, NAR 4 (10) 3537-3555). No ensaio acima,a inclusão de formamida a 15%, tipicamente, diminui a Tm em cerca de 9°C ea inclusão de formamida a 50%, tipicamente, diminui a Tm em cerca de 30°C.Usando essas proporções, portanto, é possível determinar a Tm comparativade um oligonucleotídeo contra sua molécula de RNA complementar (fosfodi-éster), mesmo quando a Tm da dupla é, por exemplo, maior do que 95°C (naausência de formamida).

Para oligonucleotídeos com uma Tm muito alta, um método al-ternativo de determinação da Tm é fazer titulações e operar sobre um gelpara observar fita única versus dupla e, através dessas concentrações eproporções, determinar a Kd (a constante de dissociação) a qual está rela-cionada a deltaG e também à Tm.

Exemplo 4: Estabilidade de oligonucleotídeos de LNA em plasma humano oude rato

A estabilidade do oligonucleotídeo de LNA foi testada em plas-ma de seres humanos ou rato (poderia ser também plasma de camundongo,macaco ou cão). Em 45 μΙ de plasma, 5 μΙ de oligonucleotídeo de LNA sãoadicionados (em uma concentração final de 20 μΜ). Os oligonucleotídeos deLNA são incubados em plasma durante tempos oscilando de 0 a 96 horas a37ºC (o plasma é testado com relação à atividade de nuclease durante até96 horas e não mostra diferença no padrão de clivagem de nuclease).

No tempo indicado, a amostra foi congelada em nitrogênio líqui- do. 2 μL (igual a 40 pmoles) de oligonucleotídeo de LNA no plasma foramdiluídos através da adição de 15 pL de água e 3 µL 6x corante de carrega-mento (Invitrogen). Como marcador, um Iadder de 10 bp (Invitrogen, EUA10821-015) é usado. A 1 μl de Iadder1 1 μl de 6x tampão da carregamento e4 μl de água são adicionados. As amostras são misturadas, aquecidas para 65ºC durante 10 min e carregadas a um gel de pré-operação (acrilamida a16%, UREIA a 7 Μ, 1x TBE, pré-operado a 50 Watt durante 1 h) e operado a50-60 Watt durante 2Vz horas. Subseqüentemente, o gel é corado com 1xSyBR gold (Molecular Probes) em 1x TBE durante 15 min. As bandas sãovisualizadas usando o Phosphoimager da BioRad. Exemplo 5: Modelo in vitro: Cultura de célula

O efeito de oligonucleotídeos de LNA sobreexpressão do ácidonucléico alvo (quantidade) pode ser testado em qualquer um de uma varie-dade de tipos de célula, contanto que o ácido nucléico alvo esteja presenteem níveis mensuráveis. O alvo pode ser expresso endogenamente ou atra- vés de transfecção transitória ou estável de um ácido nucléico que codifica oreferido ácido nucléico.

O nível de expressão de ácido nucléico alvo pode ser rotineira-mente determinado usando, por exemplo, análise de Northern blot (incluindoNorthern de micro-RNA), PCR Quantitativa (incluindo qPCR de micro-RNA), ensaios de proteção de Ribonuclease. Os tipos de célula a seguir são forne-cidos para fins ilustrativos, mas outros tipos de células podem ser rotineira-mente usados, contanto que o alvo seja expresso no tipo de célula escolhi-do.

As células são cultivadas no meio apropriado conforme descrito abaixo e mantidas a 37°C em 95-98% de umidade e 5% de CO2. As célulasforam rotineiramente passadas 2-3 vezes por semana.

15PC3: A linhagem de célula de câncer de próstata humano15PC3 foi gentilmente doada pelo Dr. F. Baas, Neurozintuigen Laboratory,AMC, Países Baixos e cultivada em DMEM (Sigma) + soro bovino fetal a10% (FBS) + Glutamax I + gentamicina.

PC3: A linhagem de célula de câncer de próstata humano PC3foi adquirida da ATCC e foi cultivada em F12 Coon com glutamina (Gibco) +FBS a 10% + gentamicina.

518A2: A linhagem de célula de câncer de melanoma humano518A2 foi gentilmente doada pelo Dr. B. Jansen, Section of ExperimentalOncology, Molecular Pharmacology, Department of Clinicai Pharmacology,University of Vienna e foi cultivada em DMEM (Sigma) + soro bovino fetal a10% (FBS) + Glutamax I + gentamicina.

HeLa: A linhagem de célula de carcinoma cervical HeLa foi culti-vada em MEM (Sigma) contendo soro bovino fetal a 10%, gentamicina, a37°C, umidade de 95% e 5% de CO2.

MPC-11: A linhagem de célula de mieloma de murino MPC-11foi adquirida da ATCC e mantida em DMEM com Glutamax a 4 mM+ Soro decavalo a 10%.

DU-145: A linhagem de célula de câncer de próstata humanoDU-145 foi adquirida da ATCC e mantida em RPMI com Glutamax + FBS a 10%.

RCC-4 +/- VHL: A linhagem de célula de câncer renal humanoRCC4 estavelmente transfectada com plasmídeo expressando VHL ouplasmídeo vazio foi adquirida da ECACC e mantida de acordo com as instru-ções dos fabricantes.

786-0: A linhagem de célula de carcinoma renal humano 786-0foi adquirida da ATCC e mantida de acordo com as instruções do fabricante.

HUVEC: A linhagem de célula endotelial de via umbilical huma-na HUVEC foi adquirida da Camcrex e mantida em meio EGM-2.

K562: A linhagem de célula de leucemia mielogênea crônicahumana K562 foi adquirida da ECACC e mantida em RPMI com Glutamax +FBSa 10%.

U87MG: A linhagem de linhagem de glioblastoma humanoU87MG foi adquirida da ATCC e mantida de acordo com as instruções dofabricante.

B16: A linhagem de célula de melanoma de murino B16 foi ad-quirida da ATCC e mantida de acordo com as instruções do fabricante.

LNCap: A linhagem de célula de câncer de próstata humano

LNCap foi adquirida da ATCC e mantida em RPMI com Glutamax + FBS a10%.

Huh-7: fígado humano, semelhante a epitelial, cultivada em Ea-gles MEM com FBS a 10 %, Glutamax I a 2 mM, 1x aminoácidos não essen-ciais, Gentamicina a 25 pg/ml.

L428: (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM,Braunschwieg, Alemanha)): Iinfoma de células B humano mantido em RPMI1640 suplementado com FCS a 10%, L-glutamina e antibióticos.

L1236: (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM,Braunschwieg, Alemanha)): Linfoma de células B humano mantido em RPMI1640 suplementado com FCS a 10%, L-glutamina e antibióticos.Exemplo 6: Modelo in vitro: tratamento com oligonucleotídeo anti-sentidoanti-miR de LNA

A linhagem de célula Huh-7 expressando miR-122a foi transfec-tada com anti-miRs de LNA em concentrações de 1 e 100 nM de acordo como protocolo otimizado com Lipofectamine 2000 (LF2000, Invitrogen) (comosegue).

Células Huh-7 foram cultivadas em Eagles MEM com FBS a 10%, Glutamax I a 2 mM, 1x aminoácidos não essenciais, Gentamicina a 25Mg/ml. As células foram cultivadas em lâminas com 6 cavidades (300000células por cavidade), em um volume total de 2,5 ml um dia antes de trans-fecção. No dia da transfecção, uma solução contendo LF2000 diluída emOptimem (Invitrogen) foi preparada (1,2 ml de Optimem + 3,75 μΙ de LF2000por cavidade, final de 2,5 pg de LF2000/ml, volume final total de 1,5 ml).

Oligonucleotídeos de LNA (anti-miRs de LNA) também foramdiluídos em Optimem. 285 μl de Optimem + 15 μl de oligonucleotídeo deLNA (estoque de oligonucleotídeo a 10 μΜ para uma concentração final de100 nM e 0,1 μΜ para uma concentração final de 1 nM). As células foramlavadas uma vez em Optimem, então, a mistura de 1,2 ml de Opti-mem/LF2000 foi adicionada a cada cavidade. As células foram incubadas 7min em temperatura ambiente na mistura LF2000 onde, após o que, 300 μlde solução de oligonucleotídeo/Optimem foram adicionados.

As células foram ainda incubadas durante quatro horas com oli-gonucleotídeo e Lipofectamine2000 (em uma incubadora de células regulara 37 °C, 5% de C02). Após essas quatro horas, o meio/mistura foi removidae meio completo regular foi adicionado. As células foram deixadas crescerdurante mais 20 horas. As células foram coletadas em Trizol (Invitrogen) 24horas após transfecção. RNA foi extraído de acordo com um protocolo pa-drão com Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen), es-F pecialmente para reter o micro-RNA na extração de RNA total.

Exemplo 7: Modelo in vitro e in vivo: análise de inibição por oligonucleotídeode expressão de miR através de PCR quantitativa micro-RNA-específica

Os níveis de miR-122a nas amostras de RNA foram avaliadosem um instrumento de PCR em tempo real ABI 7500 Fast (Applied Biosys-tems, EUA) usando um kit de qRT-PCR miR-122a-específico, mirVana (Am-bion, EUA) e primers ao miR-122a (Ambion, EUA). O procedimento foi con-duzido de acordo com o protocolo dos fabricantes.

Resultados:

O novo design de oligonucleotídeo anti-miR de LNA miR-122a-específico (isto é, SPC3349 (também referido como SPC 3549)) era maiseficiente na inibição de miR-122a a 1 nM comparado com os modelos dedesign anterior, incluindo os motivos "cada-terceiro" e "gap-mero"(SPC3370, SPC3372, SPC3375) a 100 nM. Descobriu-se que o controle decombinação errônea não inibe o miR-122a (SPC3350). Os resultados sãomostrados na figura 1.

Exemplo 8: Avaliação de especificidade de knock-down de LNA antago-mirusando caracterização de perfil por expressão em microarranjo de miRNAA) Rotulação de RNA para caracterização de perfil por microarranjo de miRNA

RNA total foi extraído usando reagente Trizol (Invitrogen) e aextremidade 3' rotulada usando RNA Iigase T4 e Iigante de RNA Cy3- ouCy5-rotulado (5'-P04-rUrUrU-Cy3/dT-3' ou 5'-P04-rUrUrU-Cy5/dT-3')· Asreações de rotulação continham 2-5 pg de RNA total, Iigante de RNA a 15μΜ, Tris-HCI a 50 mM (pH de 7,8), MgCI2 a 10 mM, DTT a 10 mM, ATP a 1mM, polietileno glicol a 16% e 5 unidades de RNA Iigase T4 (Ambion, EUA)e foram incubadas a 30 sC durante 2 horas, seguido por inativação térmicada RNA Iigase T4 a 80e C durante 5 minutos.

B) Hibridização de microarranjo e lavagens pós-hibridizacão

Sondas de captura de oligonucleotídeo LNA-modificadas com-preendendo sondas para todos os miRNAs mencionados de camundongo(Mus musculus) e ser humano (Homo sapiens) no banco de dados miRBaseMicro-RNA Release 7.1, incluindo um conjunto de sondas de controle positi-vo e negativo, foram adquiridas da Exiqon (Exiqon, Dinamarca) e usadaspara imprimir os microarranjos para caracterização de perfil de miRNA. Assondas de captura contêm um Iigante C6-amino modificado 5'-terminal eforam projetadas para ter uma Tm de 72e C contra miRNAs alvo complemen-tares através de ajuste do teor de LNA e comprimento das sondas de captu-ra. As sondas de captura foram diluídas para uma concentração final de 10μΜ em tampão de fosfato de sódio a 150 mM (pH de 8,5) e colocadas emquadruplicata sobre lâminas Codelink (Amersham Biosciences) usando oinstrumento MicroGrid Il Arrayer da BioRobotics em uma umidade de 45% eem temperatura ambiente. As lâminas foram pós-processadas conforme re-comendado pelo fabricante.

RNA rotulado foi hibridizado aos microarranjos de LNA durante anoite a 65s C em uma mistura de hibridização contendo 4x SSC, SDS a0,1%, 1 pg/pl de DNA de Esperma de Salmão e formamida a 38%. As lâmi-nas hibridizadas foram lavadas três vezes em 2x SSC, SDS a 0,025% a659C, seguido por três vezes em 0,08x SSC e, finalmente, três vezes em0,4x SSC em temperatura ambiente.C) Exploração de arranjo, análise de imagem e processamento de dados

Os microarranjos foram explorados usando o ArrayWorx Scan-ner (Applied Precision, EUA) de acordo com as recomendações do fabrican-te. As imagens exploradas foram importadas para o TIGR Spotfinder versão3.1 (Saeed e outros, 2003) para a extração das intensidades médias de pon-to e intensidades de base local mediana, excluindo pontos com intensidadesabaixo da base local mediana + 4x desvios padrão. As intensidades base-correlacionadas foram normalizadas usando o pacote de normalização porestabilização de variância versão 1.8.0 (Huber e outros, 2002) para R(www.r-project.org). A média das intensidades de pontos repetidos foi calcu-lada usando o Microsoft Excel. Sondas mostrando um coeficiente de variân-cia > 100% foram excluídas de análise adicional de dados.Exemplo 9: Detecção de micro-RNAs através de hibridização in situ

Detecção de micro-RNAs em seções de tecido incrustadas emparafina fixadas com formalina através de hibridização in situ.

A) Preparação das seções incrustadas em parafina, fixadas em formalinapara hibridização in situ

Amostras incrustadas em parafina guardadas foram recupera-das e divididas em seções de 5 a 10 mm e montadas em lâminas positiva-mente carregadas usando a técnica de flutuação. As lâminas são armazena-das a 4 0C até que os experimentos in situ sejam conduzidos.

B) hibridização in situ

Seções sobre as lâminas são desparafinizadas em xileno e, en-tão, reidratadas através de uma série de diluições em etanol (de 100% a25%). As lâminas são submersas em água DEPC-tratada e submetidas a umtratamento com HCI e glicina a 0,2%, refixadas em paraformaldeído a 4% etratadas com anidrido acético/trietanolamina; as lâminas são enxaguadas emvárias lavagens de 1X PBS entre os tratamentos. As lâminas são pré-hibridizadas em solução de hibridização (formamida a 50%, 5X SSC, 500mg/mL de tRNA de levedo, 1X Denhardt) a 50 sC durante 30 min. Então, 3pmoles de uma sonda de LNA FITC-rotulada (Exiqon, Dinamarca) comple-mentar a cada miRNA selecionado é adicionada à solução de hibridização ehibridizados durante uma hora em uma temperatura de 20-25 9C abaixo daTm prevista da sonda (tipicamente, entre 45-55 eC, dependendo da seqüên-cia do miRNA). Após lavagens em 0,1 X e 0,5X SCC a 65 2C1 uma reação deamplificação de sinal com tiramida foi realizada usando o kit Genpoint Fluo-rescein (FITC) (DakoCytomation, Dinamarca) seguindo as recomendaçõesdo vendedor. Finalmente, as lâminas são montadas com solução ProlongGold. A reação de fluorescência é deixada desenvolver durante 16-24 horasantes de documentação da expressão do miRNA selecionado usando ummicroscópio de epifluorescência.

Detecção de micro-RNAs através de hibridizacão in situ por montagem intei-ra de embriões de peixe-zebra, Xenopus e camundongos

Todas as etapas de lavagem e incubação são realizadas emtubos de Eppendorf de 2 ml. Os embriões são fixados durante a noite a 4 0Cem paraformaldeído a 4 0C em PBS e subseqüentemente transferidos atra-vés de uma série graduada (MeOH a 25% em PBST (PBS contendo Tween-20 a 0,1%), MeOH a 50% em PBST, MeOH a 75% em PBST) a metanol a100% e armazenados a -20 0C até vários meses. No primeiro dia da hibridi-zação in situ, os embriões são reidratados através de incubações sucessivasdurante 5 min em MeOH a 75% em PBST, MeOH a 50% em PBST, MeOH a25% em PBST e PBST a 100% (4x5 min).

Primeiro, embriões de camundongo e Xenopus são tratadoscom proteinaseK (10 pg/ml em PBST) durante 45 min a 37 °C, refixados du-rante 20 min em paraformaldeído a 4% em PBS e lavados 3x5 min comPBST. Após uma curta lavagem em água, a atividade de fosfatase alcalinaendógena é bloqueada através de incubação dos embriões em trietanolami-na a 0,1 Me anidrido acético a 2,5% durante 10 min, seguido por uma curtalavagem em água e 5 lavagens χ 5 min em PBST. Os embriões são, então,transferidos para tampão de hibridização (Formamida a 50%, 5x SSC, Twe-en a 0,1%, ácido cítrico a 9,2 mM, 50 ug/ml de heparina, 500 ug/ml de RNAde levedo) durante 2-3 horas na temperatura de hibridização. Hibridização érealizada em tampão de hibridização preaquecido contendo 10 nM de sondade LNA 3' DIG-rotulada (Roche Diagnostics) complementar a cada miRNAselecionado. Lavagens pós-hibridização são feitas na temperatura de hibridi-zação através de incubações sucessivas durante 15 min em HM- (tampão dehibridização sem heparina e RNA de levedo), HM a 75%-/2x SSCT a 25%(SSC contendo Tween-20 a 0,1%), HM a 50%-/2x SSCT a 50%, HM a 25%-/2x SSCT a 75%, 2x SSCT a 100% e 2 χ 30 min em 0,2x SSCT.

Subseqüentemente, os embriões são transferidos para PBSTatravés de incubações sucessivas durante 10 min em 0,2x SSCT a75%/PBST a 25%, 0,2x SSCT a 50%/PBST a 50%, 0,2x SSCT a 25%/PBSTa 75% e PBST a 100%. Após bloqueio durante 1 hora em tampão de blo-queio (soro de ovelha a 2%/2 mg:ml de BSA em PBST), os embriões sãoincubados durante a noite a 4 0C em tampão de bloqueio contendo fragmen-tos FAB anti-DIG-AP (Roche, 1/2000). No dia seguinte, embriões de peixe-zebra são lavados 6x15 min em PBST, embriões de camundongo e X. tro-picalis são lavados 6 χ 1 hora em TBST contendo Ievamisola a 2 mM e, en-tão, durante 2 dias a 4 0C com troca regular do tampão de lavagem.

Após as lavagens pós-anticorpo, os embriões foram lavados 3x5 min emtampão de coloração (Tris HCI a 100 mM, pH de 9,5, MgCI2 a 50 mM, NaCIa 100 mM, Tween 20 a 0,1%). Coloração foi feita em tampão fornecido com4,5 μ l/m I de NBT (Roche, estoque a 50 mg/ml) e 3,5 μΙ/ml de BCIP (Roche,estoque a 50 mg/ml). A reação é cessada com EDTA a 1 mM em PBST e osembriões são armazenados a 4°C. Os embriões são montados em soluçãode Murray (benzoato de benzila:álcool benzílico a 2:1) via uma série cres-cente de metanol (MeOH a 25% em PBST, MeOH a 50% em PBST, MeOH a75% em PBST, MeOH a 100%) antes de formação de imagem.Exemplo 10: Modelo in vitro: isolamento e análise de expressão de mRNA(isolamento de RNA total e síntese de cDNA para análise de mRNA)

RNA total foi isolado usando o minikit RNeasy (Qiagen) ou u-sando o reagente Trizol (Invitrogen). Para isolamento de RNA total usando ominikit RNeasy (Qiagen), as células foram lavadas com PBS e Cell LysisBuffer (RTL, Qiagen) suplementado com mercaptoetanol a 1% adicionadodiretamente às cavidades. Após uns poucos minutos, as amostras foramprocessadas de acordo com as instruções do fabricante.Para análise in vivo de expressão de mRNA, amostras de tecidoforam primeiro homogeneizadas usando um homogeneizador Retsch300MM e RNA total foi isolado usando o reagente Trizol ou o minikit RNe-asy, conforme descrito pelo fabricante.

Síntese de primeira fita (cDNA a partir de mRNA) foi realizadausando o kit OmniScript Reverse Transcriptase ou Transcriptase Reversa M-MLV (essencialmente conforme descrito pelo fabricante (Ambion)) de acordocom as instruções do fabricante (Qiagen). Quando usando OmniScript Re-verse Transcriptase, 0,5 pg de cada amostra de RNA total foram ajustadospara 12 μl e misturados com 0,2 μl de poly (dT)12-ie (0,5 pg/μl) (Life Techno-logies), 2 μl de mistura de dNTP (5 mM cada), 2 μΙ de 10x tampão de RT, 0,5μl de inibidor RNAguard® RNase (33 unidades/ml, Amersham) e 1 μl de Om-niScript Reverse Transcriptase, seguido por incubação a 37°C durante 60min e inativação térmica a 93°C durante 5 min.

Quando síntese de primeira fita foi realizada usando decâmerosaleatórios e Transcriptase Reversa M-MLV (essencialmente conforme des-crito pelo fabricante (Ambion)), 0,25 pg de RNA total de cada amostra foramajustados para 10,8 μl em H2O. 2 μΙ de decâmeros e 2 μl de mistura dedNTP (2,5 mM cada) foram adicionados. As amostras foram aquecidas para70°C durante 3 min e esfriadas imediatamente em água gelada e 3,25 μΙ deuma mistura contendo (2 μl de 10x tampão de RT; 1 μl de Transcriptase Re-versa M-MLV; 0,25 μΙ de inibidor RNAase) adicionados. cDNA é sintetizadoa 42°C durante 60 min, seguido por uma etapa de inativação por aquecimen-to a 95 0C durante 10 min e, finalmente, esfriado para 4°C. O cDNA podeainda ser usado para quantificação de mRNA, por exemplo, através de PCRquantitativa em tempo real.

Expressão de mRNA pode ser avaliada em uma variedade deformas conhecidas na técnica. Por exemplo, os níveis de mRNA podem serquantificados, por exemplo, através de análise de Northern blot, reação emcadeia de polimerase competitiva (PCR), ensaio de proteção de Ribonuclea-se (RPA) ou PCR em tempo real. PCR quantitativa em tempo real é presen-temente preferida. Análise de RNA pode ser realizada sobre RNA celulartotal ou mRNA.

Métodos de isolamento de RNA e análise de RNA, tal como aná-lise de Northern blot, são rotina na técnica e ensinados, por exemplo, emCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.

PCR quantitativa em tempo real (PCR) pode ser conveniente-mente realizada usando o iQ Multicolor Real Time PCR Detection Systemcomercialmente disponível da BioRAD. PCR quantitativa em tempo real éum método bem conhecido na técnica e é ensinada, por exemplo, em Heid eoutros Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994.

Exemplo 11: Captação e eficácia de oligonucleotídeo de LNA in vivo

Estudo in vivo: Seis grupos de animais (5 camundongos porgrupo) foram tratados da seguinte maneira. Os animais do Grupo 1 foraminjetados com 0,2 ml de solução salina através de i.v. em 3 dias sucessivos,o Grupo 2 recebeu 2,5 mg/kg de SPC3372, o Grupo 3 recebeu 6,25 mg/kg, o Grupo 4 recebeu 12,5 mg/kg e o Grupo 5 recebeu 25 mg/kg, enquanto que oGrupo 6 recebeu 25 mg/kg de SPC 3373 (oligonucleotídeo LNA-antimiR® decombinação errônea), todos da mesma maneira. Todas as doses foram cal-culadas a partir dos pesos corporais de cada animal no Dia 0.

Antes de dosagem (Dia 0) e 24 horas após a última dose (Dia3), sangue retro-orbital foi coletado em tubos contendo EDTA e a fraçãoplasmática coletada e armazenada congelada a -80°C para análise e coles-terol. No sacrifício, os fígados foram dissecados e uma porção foi cortadaem cubos de 5 mm e imersa em 5 volumes de RNAIater gelado. Uma se-gunda porção foi congelada em nitrogênio líquido e armazenada para criodi-visão.

RNA total foi extraído de amostras de fígado conforme descritoacima e analisadas com relação aos níveis de miR-122a através de qPCRmicro-RNA-específica. A Figura 5 demonstra uma dose-resposta clara obtidacom SPC3372, com uma IC50 em aproximadamente 3-5 mg/kg, enquantoque nenhuma inibição de miR-122a foi detectada usando o LNA antago-mirde combinação errônea SPC 3373 para miR-122a.Exemplo 12: Dose-resposta de LNA-antimiR-122a in vivo em camundongosfêmeas C57/BL7J

Estudo in vivo: Dez grupos de animais (C57/BL6 fêmeas; 3 ca-mundongos por grupo) foram tratados da seguinte maneira. Os animais doGrupo 1 foram injetados com 0,2 ml de solução salina através de i.p. no dia0, dia 2 e dia 4. Os Grupos 2-10 foram dosados através de i.p. com três dife-rentes concentrações (25 mg/kg, 5 mg/kg e 1 mg/kg) de LNA antimiR-122a/SPC3372 (grupo 2-4), LNA antimir-122a/SPC3548 (grupo 5-7) ou LNAantimir-122a/SPC3549 (grupo 8-10); as seqüências de LNA antimir-122a sãofornecidas na Tabela 1. Todos os três oligonucleotídeos LNA antimiR-122aobjetivam miR-122a fígado-específico. As doses foram calculadas a partirdos pesos corporais de cada animal no Dia 0.

Os animais foram sacrificados 48 horas após a última dose (Dia6), sangue retro-orbital foi coletado em tubos contendo EDTA e a fraçãoplasmática foi coletada e armazenada congelada a -80°C para análise decolesterol. No sacrifício, os fígados foram dissecados e uma porção foi cor-tada em cubos de 5 mm e imersa em 5 volumes de RNAIater gelado. Umasegunda porção foi congelada em nitrogênio líquido e armazenada para cri-odivisão.

RNA total foi extraído de amostras de fígado usando reagenteTrizol de acordo com as recomendações do fabricante (Invitrogen, EUA) eanalisados com relação aos níveis de miR-122a através de qPCR micro-RNA-específica de acordo com as recomendações do fabricante (Ambion,EUA). A Figura 2 demonstra uma dose-resposta clara obtida com todas astrês moléculas de LNA antimir-122a (SPC3372, SPC3548, SPC3549).SPC3548 e SPC3549 mostram eficácia significativamente aperfeiçoada invivo no silenciamento de miR-122a (conforme observado a partir dos níveisreduzidos de miR-122a) comparado com SPC3372, com SPC3549 sendomais potente (IC50 de aproximadamente 1 mg/kg).

O exemplo acima foi repetido usando SPC3372 e SPC 3649usando 5 camundongos por grupo e os dados combinados (total de oito ca-mundongos por grupo) são mostrados na Figura. 2b.Exemplo 12a: Northern Blot

Northern blot micro-RNA-específica mostrou bloqueio intensifi-cado de miR-122 pelo SPC3649 comparado com o SPC3372 em fígados decamundongos tratados com LNA-antimiR.

Oligos usados nesse exemplo:

<table>table see original document page 112</column></row><table>

Decidiu-se avaliar o efeito de SPC3649 sobre os níveis de mR-NA de miR-122 nos fígados de camundongos tratados com SPC3649. OsLNA-antimiRs SPC3649 e SPC3372 foram administrados a camundongosatravés de três injeções i.p. dia sim, dia não durante um período de seis diasIJD nas doses indicadas, seguido por sacrifício dos animais 48 horas após a úl-tima dose. RNA total foi extraído dos fígados. Os níveis de miR-122 foramavaliados através de Northern blot micro-RNA-específica (figura 6).Tratamento de camundongos normais com SPC3649 resultou em uma redu-ção dose-dependente dramaticamente aperfeiçoada de miR-122. Northernblot micro-RNA-específica comparando SPC3649 com SPC3372 foi realiza-da (figura 6). SPC3649 bloqueou completamente o miR-122 em 5 e 25mg/kg, conforme observado pela ausência de miR-122 fita única maduro eapenas a presença da banda dupla entre o LNA-antimiR e miR-122. Compa-rando a banda da dupla versus maduro sobre a Northern blot, o SPC3649parece igualmente eficiente a 1 mg/kg, assim como o SPC3372 a 25 mg/kg.Exemplo 13: Avaliação dos níveis de colesterol no plasma em camundongostratados com anti-miR de LNA122

O nível de colesterol total foi medido no plasma usando um en-saio colorimétrico Cholesterol CP da ABX Pentra. O colesterol foi medidoacompanhando a hidrólise enzimática e oxidação (2,3). 21,5 μΙ de água fo-ram adicionados a 1,5 μΙ de plasma. 250 μΙ de reagente foram adicionadose, dentro de 5 min, o teor de colesterol medido em um comprimento de ondade 540 nM. Medições sobre cada animal foram feitas em duplicata. A sensi-bilidade e linearidade foram testadas com composto de controle diluído 2vezes (controle ABX Pentra Ν). O nível de colesterol foi determinado subtra-indo-se a base e o apresentado com relação aos níveis de colesterol noplasma de camundongos tratados com solução salina.

A Figura 3 demonstra um nível acentuadamente diminuído decolesterol no plasma nos camundongos que receberam SPC3548 eSPC3549, comparado com o controle de solução salina no Dia 6.

Exemplo 14: Avaliação dos níveis de mRNA de miR-122a alvo em camun-dongos tratados com LNA antimiR-122a

Os animais tratados com controle de solução salina e diferentesLNA-antimiR-122a foram sacrificados 48 horas após a última dose (Dia 6) eRNA total foi extraído de amostras de fígado usando reagente Trizol de a -cordo com as recomendações do fabricante (Invitrogen, EUA). Os níveis demRNA foram avaliados através de RT-PCR quantitativa em tempo real paradois genes de miR-122a alvo, Bckdk (quínase de dehidrogenase de cetoáci-do com cadeia ramificada, ENSMUSG00000030802) e aldolase A (aldoA,ENSMUSG00000030695), respectivamente, bem como para GAPDH comocontrole, usando ensaios Taqman de acordo com as instruções do fabricante(Applied biosystems, EUA). As Figuras 4a e 4b demonstram uma super-regulação dose-dependente clara dos dois genes de miR-122a alvo, Bckdk eAldoA, respectivamente, como uma resposta ao tratamento com todas astrês moléculas de LNA antimiR-122a (SPC3372, SPC3548, SPC3549). Emcontraste, os ensaios de qPCR para controle GAPDH não revelaram quais-quer diferenças significativas nos níveis de mRNA de GAPD nos camundon-gos tratados com LNA-antimiR-122a comparado com os animais de controlecom solução salina (figura 4c). Os níveis de mRNA de Bckdk e AIdoA eramsignificativamente maiores nos camundongos tratados com SPC3548 eSPC3549 comparado com os camundongos tratados com SPC3372 (figuras4a e 4b), desse modo, demonstrando sua eficácia aperfeiçoada in vivo.

Exemplo 15: Duração de ação de oligonucleotídeo de LNA in vivo

Estudo in vivo: Dois grupos de animais (21 camundongos porgrupo) foram tratados da seguinte maneira. Os animais do Grupo 1 foraminjetados com 0,2 ml de solução salina através de i.v em 3 dias sucessivos,o Grupo 2 recebeu 25 mg/kg de SPC3372 da mesma maneira. Todas as do-ses foram calculadas a partir dos pesos corporais de cada animal no Dia 0.

Após a última dose (Dia 3), 7 animais de cada grupo foram sa-crificados no Dia 9, Dia 16 e Dia 23, respectivamente. Antes disso, em cadadia, sangue retro-orbital foi coletado em tubos contendo EDTA e a fraçãoplasmática coletada e armazenada congelada a -80°C para análise de co-lesterol de cada dia. No sacrifício, os fígados foram dissecados e uma por-ção foi cortada em cubos de 5 mm e imersa em 5 volumes de RNAIater ge-lado. Uma secunda porção foi congelada em nitrogênio líquido e armazena-da para criodivisão.

RNA total foi extraído de amostras do fígado conforme descritoacima e analisados com relação aos níveis de miR-122a através de qPCRmicro-RNA-específica. A Figura 7 (Sacrifício nos dias 9, 16 ou 23 correspon-dem ao sacrifício 1, 2 ou 3 semanas após a última dose) demonstra umainibição de duas vezes nos camundongos que receberam SPC3372 compa-rado com o controle de solução salina e essa inibição ainda pôde ser detec-tada no Dia 16, enquanto que, no Dia 23, os níveis de miR-122a se aproxi-maram daqueles do grupo com solução salina.Exemplo 16: Duração de ação de oligonucleotídeo de LNA in vivo

Estudo in vivo: Dois grupos de animais (21 camundongos porgrupo) foram tratados da seguinte maneira. Animais do Grupo 1 foram inje-tados com 0,2 ml de solução salina através de i.v. durante 3 dias sucessivos,o Grupo 2 recebeu 25 mg/kg de SPC3372 da mesma maneira. Todas as do-ses foram calculadas a partir dos pesos corporais de cada animal no Dia 0.

Após a última dose (Dia 3), 7 animais de cada grupo foram sa-crificados no Dia 9, Dia 16 e Dia 23, respectivamente. Antes disso, em cadadia, sangue retro-orbital foi coletado em tubos contendo EDTA e a fraçãoplasmática coletada e armazenada congelada a -80°C para análise de co-lesterol de cada dia. No sacrifício, os fígados foram dissecados e uma por-ção foi cortada em cubos de 5 mm e imersa em 5 volumes de RNAIater ge-lado. Uma secunda porção foi congelada em nitrogênio líquido e armazena-da para criodivisão.

RNA total foi extraído de amostras de fígado conforme descritoacima e analisados com relação aos níveis de miR-122a através de qPCRmicro-RNA-específica. A Figura 8 demonstra uma inibição de duas vezesnos camundongos que receberam SPC3372 comparado com o controle desolução salina e essa inibição ainda pôde ser detectada no Dia 16, enquantoque no Dia 23, os níveis de miR-122a se aproximaram daqueles no grupocom solução salina.

Conforme os exemplos 17-22, os seguintes procedimentos seaplicam:

Camundongos NMRI foram administrados intravenosamentecom SPC3372 usando doses diárias oscilando de 2,5 a 25 mg/kg durantetrês dias consecutivos. Os animais foram sacrificados 24 horas, 1, 2 ou 3semanas após a última dose. Os fígados foram coletados, divididos em pe-daços e submersos em RNAIater (Ambion) ou congelado aos pedaços. RNAfoi extraído com reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante(Invitrogen) a partir do tecido RNAIater, exceto que o RNA precipitado foilavado em etanol a 80% e não submetido a turbilhonamento. O RNA foi usa-do para qPCR de mRNA TaqMan de acordo com o fabricante (Applied bi-osystems) ou Northern blot (veja abaixo). Os pedaços congelados foram cri-odivididos para hibridizações in situ.

Ainda, conforme as figuras 9-14, SPC3372 é designado LNA-antimiR e SPC3373 (o controle de combinação errônea) é designado "mm"ao invés de usar o número de SPC.

Exemplo 17: Indução de mRNA de miR-122a alvo dose-dependente peloSPC3372

Camundongos foram tratados com diferentes doses de SPC3372durante três dias consecutivos, conforme descrito acima, e sacrificados 24horas após a última dose. RNA total extraído de fígado foi submetido à qP-CR. Genes com sítio de miR-122 alvo previsto e observados como estandosuper-regulados através de análise em microarranjo foram investigados comrelação à indução dose-dependente através de aumento das doses deSPC3372 usando qPCR. RNA de fígado total de 2 a 3 camundongos porgrupo sacrificados 24 horas após a última dose foi submetido à qPCR paraos genes indicados. São mostrados na figura 9 os níveis de mRNA com rela-ção ao grupo com solução salina, η = 2-3 (2,5 - 12,5 mg/kg/dia: η = 2, sem SD).Também é mostrado o controle de combinação errônea (mm, SPC3373).

Genes ensaiados: Nrdg3 Aldo A, Bckdk, CD320 com sítio demiR-122 alvo previsto. Aldo B e Gapdh não têm um sítio de miR-122a alvoprevisto.

Uma indução dose-dependente clara foi observada dos genesde miR-122a alvo após tratamento com diferentes doses de SPC3372.Exemplo 18: Indução transitória de mRNAs de miR-122a alvo após trata-mento com SPC3372

Camundongos fêmeas NMRI foram tratados com 25 mg/kg/diade SPC3372, junto com controle de solução salina durante três dias conse-cutivos e sacrificados 1, 2 ou 3 semanas após a última dose, respectivamen-te. RNA foi extraído dos fígados e os níveis de mRNA de mRNAs de miR-122a alvo previsto, selecionado através de dados de microarranjo, foraminvestigados através de qPCR. Três animais de cada grupo foram analisa-dos.

Genes ensaiados: Nrdg3 Aldo A, Bckdk, CD320 com sítio demiR-122 alvo previsto. Gapdh não tem um sítio de miR-122a alvo previsto.

Uma indução transitória, seguido por uma restauração dos ní-veis normais de expressão em analogia à restauração dos níveis normais demiR-122a foi observada (figura 10).

Os níveis de mRNA foram normalizados para os níveis deGAPDH individuais e para a média do grupo tratado com solução salina emcada ponto de tempo individual. Também são incluídos os valores dos ani-mais sacrificados 24 horas após a última dose. São mostrados a média e odesvio padrão, η = 3 (24h η = 3).

Exemplo 19: Indução de Vldlr no fígado através de tratamento com SPC3372

As mesmas amostras de RNA de fígado conforme no exemploanterior foram investigadas com relação à indução de Vldlr.

Uma super-regulação transitória foi observada após tratamentocom SPC3372, conforme com os outros mRNAs de miR-122a alvo previstos(figura 11).

Exemplo 20: Estabilidade da dupla miR-122a/ SPC3372 em plasma de ca-mundongo

A estabilidade do SPC3372 e da dupla SPC3372/miR-122a foitestada em plasma de camundongo a 37°C durante 96 horas. É mostrado nafigura 12 um PAGE corado com SYBR-Gold.

SPC3372 era completamente estável durante 96 horas. A duplaSPC3372/miR-122a foi imediatamente truncada (degradação da região demiR-122a fita única não abrangida pelo SPC3372) mas, depois, era quaseque completamente estável durante 96 horas.

O fato de que uma dupla SPC3372/miR-122 pré-formada mos-trou estabilidade no soro durante 96 horas junto com a elevada estabilidadetérmica da dupla da molécula de SPC3372 sustentou nossa observação deque inibição de miR-122a pelo SPC3372 era em virtude de formação estávelde dupla entre as duas moléculas, o que também tinha sido reportado emcultura de célula (Naguibneva e outros 2006).

Exemplo 21: Captura de miR-122a maduro pelo SPC3372 leva à formaçãode dupla

O RNA do fígado foi também submetido a uma Northern blot demicro-RNA. É mostrada na figura 13 uma membrana hibridizada com umasonda miR-122a-específica (painel superior) e re-hibridizada com uma sondaLet-7-específica (painel inferior). Com a sonda de miR-122, duas bandaspuderam ser detectadas, uma correspondendo ao miR-122 maduro e umacorrespondendo a uma dupla entre o SPC3372 e miR-122.

Para confirmar o silenciamento de miR-122, amostras de RNAde fígado foram submetidas à análise de Northern blot de pequeno RNA, aqual mostrou níveis significativamente reduzidos de miR-122 maduro detec-tável, de acordo com nossos resultados de RT-PCR em tempo real. Porcomparação, os níveis de controle let-7a não foram alterados. De modo inte-ressante, observa-se um acúmulo dose-dependente de uma banda de hete-rodupla de miR-122/ SPC3372 desviada, sugerindo que o SPC3372 não ob-jetiva o miR-122 para degradação, mas antes, se liga ao micro-RNA, dessemodo, impedindo estericamente sua função.

Análise por Northern foi realizada como segue:

Preparo de membranas para Northern foi feito conforme descritoem Sempere e outros 2002, exceto quanto às seguintes alterações: RNAtotal, 10 pg por fileira, em tampão de carregamento de formamida (formami-da a 47,5%, EDTA a 9 mM, Azul de Bromofenol a 0,0125%, Cianol de Xilenoa 0,0125%, SDS a 0,0125%) foi carregado sobre um gel de poliacrilamida deUréia-TBE a 15% Novex de desnaturação (Invitrogen) sem preaquecimentodo RNA. O RNA foi eletroforeticamente transferido para GeneScreen plusHybridization Transfer Membrane (PerkinEImer) a 200 mA durante 35 min.

As membranas foram hibridizadas com oligonucleotídeos LNA-modificados32P-rotulados complementares aos micro-RNAs maduros*. Os oligonucleo-tídeos de LNA foram rotulados e hibridizados às membranas conforme des-crito em (Válóczi e outros 2004) exceto quanto às seguintes alterações: assoluções de pré-hibridização e hibridização continham formamida a 50%,SDS a 0,5%, 5x SSC, 5x solução de Denhardt e 20 pg/ml de DNA de es-perma de salmão desnaturado cisalhado. As hibridizações foram realizadasa 45SC. As blots foram visualizadas através de exploração em um Storm 860Scanner. O sinal da membrana de base foi subtraído dos sinais radioativosoriginários das bandas de miRNA. Os valores dos sinais de miR-122 foramcorrigidos para as diferenças de carregamento baseado no sinal de let-7a.Para determinar o tamanho dos sinais radioativos, o Decade Marker System(Ambion) foi usado de acordo com as recomendações dos fornecedores.

Exemplo 22: Captura de miR-122a pelo SPC3372 junto com distribuição deSPC3372 avaliada através de hibridização in situ de seções de fígado

Crio-seções de fígado de animais tratados foram submetidas àhibridizações in situ para deleção e localização de miR-122 e SPC3372 (figu-ra 14). Uma sonda complementar ao miR-122 pôde detectar o miR-122a.

Uma segunda sonda era complementar ao SPC3372. É mostrada na figura14 uma sobreposição; em verde está a distribuição e quantidades evidentesde miR-122a e SPC3372 e em azul está o corante nuclear DAPI, em umaampliação de 10x. Ampliações de 100x revelam a distribuição intranuclearde miR-122a e SPC3372 dentro de células de fígado de camundongo.

As seções de fígado da animais de controle com solução salinamostraram um forte padrão de coloração de miR-122 por toda a seção dofígado, enquanto que as seções de camundongos tratados com SPC3372mostraram um padrão de coloração esparso significativamente reduzido. Emcontraste, a molécula SPC3372 foi prontamente detectada no fígado tratadocom SPC3372, mas não no fígado com controle de solução salina não trata-do. Maior ampliação localizou o miR-122a no citoplasma, onde o padrão demiR-122 in situ estava completamente compartimentalizado, enquanto que amolécula de SPC3372 estava uniformemente distribuída por todo o cito-plasma.

Exemplo 23: Análise de microarranjo

Nós realizamos caracterização de perfil de expressão ampla emgenoma de amostras de RNA total de fígados de camundongos tratadoscom solução salina, LNA-antimiR-122 e controle de combinação errônea deLNA 24 horas após a última dose usando arranjos Affymetrix Mouse Geno-me 430 2.0. Análise dos dados de arranjo revelou 455 transcritos que eramsuper-regulados nos fígados de camundongos tratados com LNA-antimiRcomparado com os camundongos tratados com solução salina e controle decombinação errônea de LNA, enquanto que 54 transcritos eram sub-regulados (figura 15a). Um total de 415 dos transcritos super-regulados e 53dos sub-regulados pôde ser identificado no banco de dados Ensembl. Sub-seqüentemente, nós examinamos as regiões não traduzidas 3' (UTRs) dosmRNAs diferencialmente expressos com relação à presença da seqüênciade 6 nt, CACTCC, correspondendo ao complemento reverso da região decultura dos nucleotídeos 2-7 em miR-122 maduro. O número de transcritostendo pelo menos uma seqüência de reconhecimento de miR-122 era de213 (51%) dentre os transcritos super-regulados e 10 (19%) dentro dostranscritos sub-regulados, enquanto que a freqüência em uma população deseqüência aleatória era de 25%, implicando que um reservatório significati-vo dos mRNAs super-regulados representa miR-122 alvos diretos no fígado(figura 15b).O tratamento com LNA-antimiR mostrou redução máxima dosníveis de miR-122 em 24 horas, redução de 50% em uma semana e contro-les com solução salina equivalentes em três semanas após a última dose deLNA (Exemplo 12 "design antigo"). Isso coincidia com um número acentua-damente reduzido de genes diferencialmente expressos entre os dois gruposde camundongos nos pontos de tempo posteriores. Comparado com os 509mRNAs 24 horas após a última dose de LNA, nós identificamos 251 genesdiferencialmente expressos após uma semana, mas apenas 18 genes apóstrês semanas pós-tratamento (figuras 15c e 15d). Em geral, genes super-regulados 24 horas após tratamento com LNA-antimiR, então, reverterampara os níveis de controle durante as próximas duas semanas (figura 15d).

Em conclusão, uma grande porção de genes super-regulados/reversamente reprimidos após tratamento com LNA-antimiR eram miR-122alvos, indicando um efeito muito específico para bloqueio de miR-122. Tam-bém, genes super-regulados/reversamente reprimidos se aproximam dosníveis normais 3 semanas após o final de tratamento, sugerindo um efeitoterapêutico relativamente longo mas, contudo, não causando uma alteraçãopermanente, isto é, o efeito é reversível.

MÉTODOS:

Caracterização de expressão de gene de camundongos tratados com LNA-antimiR

Os perfis de expressão nos fígados de camundongos tratadoscom solução salina e LNA-antimiR foram comparados. Camundongos fê-meas NMRI foram tratados com 25 mg/kg/dia de LNA-antimiR, junto comcontrole de solução salina durante três dias consecutivos e sacrificados 24 h,1, 2 ou 3 semanas após a última dose. Adicionalmente, os perfis de expres-são de fígados de camundongos tratados com oligonucleotídeo de controlede LNA erroneamente combinado 24 h após a última dose foram obtidos.Três camundongos de cada grupo foram analisados, proporcionando umtotal de 21 perfis de expressão. A qualidade e concentração de RNA forammedidas usando um Agilent 2100 Bioanalyzer e Nanodrop ND-1000, respec-tivamente. RNA total foi processado seguindo as instruções do kit de síntesede cDNA GeneChip Expression 3'-Amplification Reagents One-cycle (Affy-metrix Inc, Santa Clara, CA, EUA) para produzir cDNA fita dupla. Esse foiusado como um template para gerar cRNA rotulado com biotina seguindo asespecificações do fabricante. Quinze microgramas de cRNA rotulado combiotina foram fragmentados em fitas entre 35 e 200 bases de comprimento,das quais 10 microgramas foram hibridizados sobre arranjos AffymetrixMouse Genome 430 2.0 durante a noite no forno GeneChip Hybridisation6400 usando procedimentos padrão. Os arranjos foram lavados e coradosem um GeneChip Fluidics Station 450. Exploração foi realizada usando oGeneChip Scanner 3000 e análise de imagem foi realizada usando o Softwa-re GeneChip Operating. Normalização e análise estatística foram feitas u-sando o pacote de software LIMMA para o ambiente de programação R27.Sondas reportadas como ausentes pelo software GCOS em todas as hibridi-zações foram removidas do conjunto de dados. Adicionalmente, um filtro deintensidade foi aplicado ao conjunto de dados para remover sondas mos-trando intensidades interferência-corrigidas abaixo de 16. Os dados foramnormalizados usando o Quantile Normalization28. Expressão diferencial foiavaliada usando um método de modelo linear. Os P valores foram ajustadospara testagem múltipla usando o Benjamini e Hochberg. Testes foram consi-derados como sendo significativos se os ρ valores ajustados eram ρ <0,05.Agrupamento e visualização dos dados de arranjo Affymetrix foram feitosusando o software MuItiExperiment Viewer29.Previsão de sítio alvo

Transcritos com 3' UTRs anotadas foram extraídos do banco dedados Ensembl (Release 41) usando a ferramenta EnsMart Data Mining 30 epesquisados com relação à presença da seqüência CACTCC, a qual é ocomplemento reverso do nucleotídeo 2-7 de cultura na seqüência do miR-122 maduro. Como um controle de interferência, um conjunto de 1000 se-qüências com um comprimento de 1200 nt, correspondendo ao comprimentomédio da 3' UTR dos transcritos super- e sub-regulados a 24 h após a últimadose de LNA-antimiR, foram pesquisados com relação às combinações commiR-122 de 6 nucleotídeos de cultura. Isso foi realizado 500 times e a conta-gem média foi usada para comparação.

Exemplo 24: Inibição dose-dependente de miR-122 em fígado de camun-dongo pelo LNA-antimiR é intensificada quando comparado com a inibiçãode miR-122 pelo antagomir

Camundongos fêmeas NMRI foram tratados com as doses indi-cadas de LNA-antimiR (SPC3372) junto com um controle de combinaçãoerrônea (mm, SPC3373), solução salina e antagomir (SPC3595) durante trêsdias consecutivos e sacrificados 24 horas após a última dose (conforme noexemplo 11 "design antigo", η = 5). Os níveis de miR-122 foram analisadosatravés de qPCR e normalizados para o grupo tratado com solução salina.Genes com um sítio previsto de miR-122 alvo e super-regulados na caracte-rização de perfil de expressão (AldoA, Nrdg3, Bckdk e CD320) mostraramuma reversão de repressão dose-dependente através de aumento das dosesde LNA-antimiR, medido através de qPCR.

A reversão de repressão foi consistentemente maior em todosos mRNAs de miR-122 alvo testados (AldoA, Bckdk1 CD320 e Nrdg3; figuras17, 18, 19, 20) em camundongos tratados com LNA-antimiR comparado comcamundongos tratados com antagomir. Isso também foi indicado quando deanálise da inibição de miR-122 através de qPCR miR-122-específica (figura16). Conseqüentemente, LNA-antimiRs proporcionam uma inibição funcionalmais potente de miR-122 do que o antagomir em uma dose correspondente.Exemplo 25: Inibição de miR-122 por LNA-antimiR em camundongos hiper-colesterolêmicos junto com redução de colesterol e reversão de repressãode mRNA de miR-122 alvo

Camundongos fêmeas C57BU6J foram alimentados com umadieta com elevado teor de gordura durante 13 semanas antes de início detratamento com SPC3649. Isso resultou em um peso aumentado para 30-35g comparado com o peso de camundongos normais, o qual era de apenas20 g, quando pesados no início do tratamento com LNA-antimiR. Os camun-dongos sob a dieta com elevado teor de gordura tiveram um nível total decolesterol no plasma significativamente aumentado de cerca de 130 mg/dl,assim, tornando os camundongos hipercolesterolêmicos comparado com onível normal de cerca de 70 mg/dl. Camundongos hipercolesterolêmicos enormais foram tratados i.p. duas vezes por semana com 5 mg/kg deSPC3649 e o controle de combinação errônea correspondente SPC3744durante um período de estudo de 5 Vz semanas. Amostras de sangue foramcoletadas semanalmente e o colesterol total no plasma foi medido durantetodo o curso do estudo. Quando de sacrifício dos camundongos, amostrasde fígado e sangue foram preparadas para extração de RNA total, quantifi-cação de miRNA e mRNA, avaliação dos níveis de transaminase no sanguee histologia do fígado.

Tratamento de camundongos hipercolesterolêmicos comSPC3649 resultou em redução do colesterol total no plasma para cerca de30 % comparado com os camundongos de controle com solução salina jáapós 10 dias e sustentaram esse nível durante todo o estudo (Figura 21). Oefeito não foi tão pronunciado quanto nos camundongos com dieta normal.Em contraste, o controle de combinação errônea SPC3744não afetou osníveis de colesterol no plasma, nem nos camundongos hipercolesterolêmi-cos, nem nos normais.

Quantificação de inibição de miR-122 e reversão de repressãode gene de miR-122 alvo (AldoA e Bckdk) após o tratamento a longo prazocom SPC3649 revelaram um perfil comparável em camundongos hipercoles-terolêmicos e normais (Figuras 22, 23, 24), desse modo, demonstrando apotência do SPC3649 no antagonismo de miR-122 em ambos os grupos deanimais. O ensaio de qPCR de miR-122 indicou que também o controle decombinação errônea SPC3744 tinha um efeito sobre os níveis de miR-122nos fígados de camundongos tratados, embora em um grau menor compa-rado com o SPC3649. Isso poderia ser uma redução associada à qPCR"stem-loop". Consistente com essa observação, tratamento de camundongoscom o controle de combinação errônea SPC3744 não resultou em qualquerreversão de repressão funcional dos genes de miR-122 alvo diretos (Figuras23 e 24), nem redução de colesterol no plasma (Figura 21), implicando que oantagonismo SPC3649-mediado de miR-122 é altamente específico in vivo.

As enzimas no fígado em fígados de camundongos hipercoleste-rolêmicos e normais foram avaliadas após tratamento a longo prazo comSPC3649. Nenhuma alteração nos níveis de aminotransferase de alanina easpartato (ALT e AST) foram detectadas nos camundongos hipercolestero-lêmicos tratados com SPC3649 comparado com os camundongos de contro-le com solução salina (Figuras 25 e 26). Um nível de ALT possivelmente ele-vado foi observado nos camundongos normais após tratamento a longo pra-zo com SPC3649 (Figura 26).

Exemplo 26: Métodos para realização do experimento e análise de LNA-antimiFVhipercolesterolêmico

Camundongos e dosagem

Camundongos C57BL/6J fêmeas (Taconic M&B Laboratory A-nimals, Ejby, Dinamarca) foram usados. Todas as substâncias foram formu-ladas em solução salina fisiológica (NaCI a 0,9 %) para uma concentraçãofinal que permitia que os camundongos recebessem um volume de injeçãointraperitoneal de 10 ml/kg.

No estudo de obesidade induzida pela dieta, os camundongosreceberam uma dieta com elevado teor de gordura (60EN%) (D12492, Re-search Diets) durante 13 semanas para aumentar seu nível de colesterol nosangue antes da dosagem começar. O regime de dose foi prolongado para 5Vz semanas de 5 mg/kg de LNA-antimiR® duas vezes por semana. O plasmasangüíneo foi coletado foi uma vez por semana durante todo o período dedosagem. Após término do experimento, os camundongos foram sacrifica-dos e RNA extraído dos fígados para análise adicional. O soro foi tambémcoletado para análise de enzimas no fígado.

Extração de RNA total

Os fígados dissecados de camundongos sacrificados foram i-mediatamente armazenados em RNA Later (Ambion). RNA total foi extraídocom reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen),exceto que a pelota de RNA precipitada foi lavada em etanol a 80% e nãosubmetida a turbilhonamento.

RT-PCR quantitativa micro-RNA-específica

Os níveis de miRNA miR-122 e let-7a foram quantificados com oensaio de micro-RNA TaqMan (Applied Biosystems) seguindo as instruçõesdo fabricante. A reação de RT foi diluída dez vezes em água e subseqüen-temente usada para amplificação por PCR em tempo real de acordo com asinstruções do fabricante. Uma série de diluições de cDNA de duas vezes apartir do RNA total de fígado de um animal tratado com solução salina oureação de cDNA de células transfectadas com placebo (usando 2,5 vezesmais RNA total do que nas amostras) serviu como padrão para asseguraruma faixa linear (Ct versus número relativo de cópias) da amplificação. Uminstrumento de RT-PCR em tempo real Applied Biosystems 7500 ou 7900 foiusado para amplificação.RT-PCR quantitativa

Quantificação de mRNA de genes selecionados foi feita usandoensaios TaqMan padrões (Applied Biosystems). A reação de transcrição re-versa foi realizada com decâmeros aleatórios, 0,5 pg de RNA total e a enzi-ma M-MLV RT da Ambion de acordo com um protocolo padrão. cDNA deprimeira fita foi subseqüentemente diluído 10 vezes em água isenta de nu-clease antes da adição da mistura de reação de RT-PCR. Uma série de dilu-ições de cDNA de duas vezes de RNA total de fígado de um animal tratadocom solução salina ou reação de cDNA de células transfectadas com place- bo (usando 2,5 vezes mais RNA total do que nas amostras) serviu como pa-drão para assegurar uma faixa linear (Ct versus número relativo de cópias)da amplificação. Um instrumento de RT-PCR em tempo real Applied Biosys-tems 7500 ou 7900 foi usado para amplificação.

Medições metabólicas

Imediatamente antes de sacrifício, o sangue do sinus retro-orbital foi coletado em tubos revestidos com EDTA, seguido por isolamentoda fração plasmática. O colesterol total no plasma foi analisado usando umABX Pentra Cholesterol CP (Horiba Group, Horiba ABX Diagnostics) de a-cordo com as instruções do fabricante.

Medição de enzimas no fígado (ALT e AST)Soro de cada camundongo individual foi preparado como segue:amostras de sangue foram armazenadas em temperatura ambiente durante2 h antes de centrifugação (10 min, 3000 rpm em temperatura ambiente).Após centrifugação, o soro foi coletado e congelado a -20 °C.

Medição de ALT e AST foi realizada em lâminas com 96 cavida-des usando reagentes ALT e AST da ABX Pentra de acordo com as instru-ções do fabricante. Em resumo, amostras de soro foram diluídas 2,5 vezescom H2O e cada amostra foi avaliada em duplicata. Após a adição de 50 μΙde amostra diluída ou padrão (Multical da ABX Pentra) a cada cavidade, 200μΙ de mistura de reagente AST ou ALT a 37 0C foram adicionados a cadacavidade. Medições de cinética foram realizadas durante 5 min com um in-tervalo de 30s a 340 nm e 37 0C usando um espectrofotômetro.

Exemplo 27: Modulação de replicação de Hepatite C pelo LNA-antimiR(SPC3649)

Oligos usados nesse exemplo (letra maiúscula: LNA, letra mi-núscula DNA, LNA Cs são metila e LNAs são, de preferência, B-D-óxi (osubscrito após o resíduo de LNA):

<table>table see original document page 126</column></row><table>

Foi mostrado que replicação de hepatite C (HCV) é facilitadapelo miR-122 e, conseqüentemente, foi demonstrado que antagonização domiR-122 afeta a replicação de HCV em um modelo com células de hepato-ma in vitro. Avalia-se a eficácia do SPC3649 na redução de replicação deHCV no modelo baseado em células Huh-7. As diferentes moléculas deLNA-antimiR, junto com um 2' OMe oligonucleotídeo anti-sentido e mistura-do, são transfectadas em células Huh-7, o HCV é deixado se replicar duran-te 48 horas. Amostras de RNA total extraídas das células Huh-7 são subme- tidas à análise de Northern blot.

Exemplo 28: Oligonucleotídeo anti-sentido LNA-antimiR® intensificado obje-tivando miR-21

Seqüência do miR-21 maduro do Sanger Institute miRBase:>hsa-miR-21 MIMAT0000076 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID NO 4)>mmu-miR-21 MIMAT0000530UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID NO 64)Seqüência de Compostos:

SPC3521 miR-21 5'-FAM TCAgtctgataaGCTa-3' (gap-mer design) - (SEQ ID NO 65)

SPC3870 miR-21 (mm) 5'-FAM TCCgtcttagaaGATa-3' - (SEQ ID NO 66)SPC3825 miR-21 5'-FAM TcTgtCAgaTaCgAT-3'(novo design) (SEQID NO 67)

SPC3826 miR-21 (mm) 5'-FAM TcAgtCTgaTaAgCT-31- (SEQ ID NO 68) SPC3827 miR-21 5'-FAM TcAGtCTGaTaAgCT-3' (novo design intensifica-do) - (SEQ ID NO 69)

Todos os compostos têm uma parte principal total ou quase quetotalmente tiolada e, aqui, tinham também um rótulo FAM na extremidade 5'.

Foi mostrado que o miR-21 é super-regulado em glioblastoma (Chan e outros, Câncer Research 2005, 65 (14), p6029) e câncer de mama(lorio e outros, Câncer Research 2005, 65 (16), p7065) e, conseqüentemen-te, ele foi considerado um micro-RNA "oncogênico" potencial. Chan e outrostambém mostram a indução de apoptose em células de glioblastoma atravésde antagonização do miR-21 com 2'OMe ou oligonucleotídeos anti-sentido LNA-modificados. Conseqüentemente, agentes que antagonizam o miR-21têm o potencial para se tornaram produtos terapêuticos para o tratamento deglioblastoma e outros tumores sólidos, tal como câncer de mama. Apresen-tou-se um oligonucleotídeo LNA-intensificado objetivando o miR-21, umLNA-antimiR®, com propriedades surpreendentemente boas para inibir omiR-21 adequado para as finalidades terapêuticas acima mencionadas.

Vias de administração terapêuticas adequadas são, por exem-pio, injeções intracranianas em glioblastomas, injeções intratumorais em Qli-oblastoma e câncer de mama, bem como distribuição sistêmica em câncerde mama.

Inibição de miR-21 na linhagem de célula de glioblastoma U373e na linhagem de célula de câncer de mama MCF-7.

A eficácia do presente LNA-antimiR® é avaliada através detransfecção em diferentes concentrações, junto com oligonucleotídeos decontrole, nas linhagens de células U373 e MCF-7 conhecidas por expressarmiR-21 (ou outras linhagens de células expressando miR-21 também).Transfecção é realizada usando um protocolo padrão com Lipofectami-ne2000 (Invitrogen). 24 horas pós-transfecção, as células são coletadas e oRNA total extraído usando o protocolo com Trizol (Invitrogen). Avaliação dosníveis de miR-21, dependendo do tratamento e da concentração usada, éfeita através de RT-PCR em tempo real miR-21 -específica "stem-loop" (Ap-plied Biosystems) ou, alternativamente, através de análises de Northern blotmiR-21-específicas não radioativas. Os níveis de miR-21 detectados, com-parado com o controle de veículo, refletem o potencial inibitório do LNA-antimiR®.

Inibição funcional de miR-21 através de avaliação de super-regulação do gene de miR-21 alvo.

O efeito de antagonismo de miR-21 é investigado através declonagem da seqüência do miR-21 alvo perfeitamente combinada por trás deum sistema repórter de Iuciferase Renilla padrão (entre a seqüência de codi-ficação e a 3' UTR, psiCHECK-2, Promega) - veja Exemplo 29. A estruturarepórter e o LNA-antimiR™ serão co-transfectados em linhagens de célulaexpressando miR-21 (f. ex. U373, MCF-7). As células são coletadas 24 ho-ras pós-transfecção em tampão de Iise passiva e a atividade de Iuciferase émedida de acordo com um protocolo padrão (Promega, Dual Luciferase Re-porter Assay System). A indução de atividade de Iuciferase é usada parademonstrar o efeito funcional de antagonismo de miR-121 do LNA-antimiR®.Exemplo 29: Ensaio com o repórter Luciferase para avaliação de inibiçãofuncional de micro-RNA por LNA-antimiRs e outros oligos objetivando micro-RNA: Generalização de novo design e novo design intensificado como de-signs preferidos para bloqueio de função de micro-RNA

Oligos usados nesse exemplo (letra maiúscula: LNA1 letra mi-núscula: DNA) para avaliar o efeito de reversão de repressão de LNA-antimiR sobre o repórter Iuciferase com a seqüência do micro-RNA alvo a-través de bloqueio do respectivo micro-RNA:

<table>table see original document page 129</column></row><table><table>table see original document page 130</column></row><table>

SEQ ID NOs conforme antes.

Um plasmídeo repórter (psiCheck-2 Promega) que codifica asvariantes Renilla e Firefly de luciferase, foi manipulado de modo que a3'UTR da luciferase Renilla incluísse uma única cópia de uma seqüênciatotalmente complementar ao miRNA sob investigação.

Células expressando endogenamente os miRNAs investigados(HuH-7 para miR-122a, HeLa para miR-19b, 518A2 para miR-155) foram co-transfectadas com LNA-antimiRs ou outros oligonucleotídeos de ligação amiR (o complemento total, isto é, comprimento total) e o plasmídeo repórterde micro-RNA alvo correspondente usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

A transfecção e medição de atividade de luciferase foram realizadas de a-cordo com as instruções do fabricante (kit Invitrogen Lipofectamine2000/Promega Dual-luciferase) usando 150 000 to 300 000 células por cavi-dade em lâminas com 6 cavidades. Para compensar variação nas densida-des de células e eficiências de transfecção, o sinal de luciferase Renilla foinormalizado com o sinal de luciferase Firefly. Todos os experimentos foramfeitos em triplicata.

Surpreendentemente, o novo design e o novo design intensifica-do eram os inibidores mais funcionais para todos os três micro-RNAs alvo,miR-155, miR-19b e miR-122 (figuras 27, 28, 29). Os resultados são resumi-dos na tabela 3 a seguir.Sumário dos Resultados:

<table>table see original document page 131</column></row><table>

Tabela 3. Grau de reversão de repressão de função de miR-155, miR-19b emiR-122a endógenos por vários designs de LNA-antimiR's.Referências

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<110> Santaris A/S

<120> COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

<130> 16870PCT00

<160> 109

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1uggaguguga caaugguguu ugu

<210> 2<211> 23<212> RNA<213> Homo sapiens

<400> 2ugugcaaauc caugcaaaac uga

<210> 3<211> 22<212> RNA<213> Homos sapiens

<400> 3uuaaugcuaa ucgugauagg gg

<210> 4<211> 22<212> RNA<213> Homo sapiens

<400> 4uagcuuauca gacugauguu ga

<210> 5<211> 22<212> RNA<213> homo sapiens

<400> 5uuuguucguu cggcucgcgu ga

<210> 6<211> 6<212> DNA<213> homo sapiens

<400> 6tttgca<210> 7

<211> 6

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 7

acactc 6

<210> 8

<211> 6

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

agcatt 6

<210> 9

<211> 6

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

cgaaca 6

<210> 10

<211> 6

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10ataagc

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Gap-mero de complemento total, LNA nas posições 1-4 e 20-23

<400> 11

acaaacacca ttgtcacact cca 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bloc-âmero de complemento total, LNA nas posições 7-14

<400> 12

acaaacacca ttgtcacact cca 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220><223> Mix-âmero de LNA de complemento total na terceira posição e a cadatrês posições depois

<400> 13acaaacacca ttgtcacact cca 23

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Unidades de LNA nas posições 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 e 15

<400> 14ccattgtcac actcc 15

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Unidades de LNA nas posições 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15

<400> 15ccattgtcac actcc 15

<210> 16

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Unidades de LNA nas posições 1-5, 7-10, 12 & 13.

<400> 16attgtcacac tcc 13

<210> 17

<211> 11

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA Unidades de LNA nas posições 1-3, 5-8, 10 & 11.

<400> 17tgtcacactc c 11

<210> 18

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Todos resíduos de LNA, exceto nas posições 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 asquais são 2'OME

<400> 18ccattgtcac actcc 15<210> 19

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Todos resíduos de LNA, exceto nas posições 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 as

quais são 2'fluoro

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Gap-mero de complemento total, LNA nas posições 1-4 e 20-23

<400> 20

tcagttttgc atggatttgc aca 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bloc-âmero de complemento total, LNA nas posições 7-14

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Full complement LNA mixmer- LNA at third position and everythird position thereafter

<400> 22

tcagttttgc atggatttgc aca 23

<210> 23

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA units at position 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 and 15

<400> 19ccattgtcac actcc

15

<400> 21

tcagttttgc atggatttgc aca

23

<400> 23tgcatggatt tgcac

15

<210> 24<211> 15<212> DNA

<213> artificial<220>

<223> LNA units at positions 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15

<400> 24tgcatggatt tgcac

15

<210> 25

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA units at positions 1, 3-5, 7-10, 12 & 13.

<400> 25

catggatttg cac 13

<210> 26

<211> 11

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA Unidades de LNA nas posições 1-3, 5-8, 10 & 11.

<210> 27

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Todos resíduos de LNA, exceto nas posições 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 as

quais são 2'OME

<210> 28

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Todos resíduos de LNA, exceto nas posições 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 as

quais são 2'OME

<400> 26tggatttgca c

11

<400> 27tgcatggatt tgcac

15

2'fluoro

<400> 28tgcatggatt tgcac

15

<210> 29<211> 22<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Gap-mero de complemento total, LNA nas posições 1-4 e 20-23<400> 29

cccctatcac gattagcatt aa

22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bloc-âmero de complemento total, LNA nas posições 7-14

<400> 30

cccctatcac gattagcatt aa 22

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Full complement LNA mixmer- LNA at third position and everythird position thereafter

<210> 32

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA units at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14, 15

<400> 32

tcacgattag catta 15

<210> 33

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA units at positions 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15

<210> 34

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA units at positions 1-5, 8-11, 12 & 13.

<400> 34

acgattagca tta 13

<400> 31

cccctatcac gattagcatt aa

22

<400> 33tcacgattag catta

15

<210> 35<211> 11<212> DNA<213> artificial

<220>

<223> LNA units at positions 1-3, 5-7, and 9-11<400> 35

gattagcatt a

<210> 36

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Todos resíduos de LNA, exceto nas posições 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 as

quais são 2'OME

<400> 36

tcacgattag catta

<210> 37

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Todos resíduos de LNA, exceto nas posições 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 asquais são 2'OME2'fluoro

<400> 37

tcacgattag catta

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Gap-mero de complemento total, LNA nas posições 1-4 e 20-23

<400> 38

tcaacatcag tctgataagc ta

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bloc-âmero de complemento total, LNA nas posições 7-14

<400> 39

tcaacatcag tctgataagc ta

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial<220>

<223> Full complement LNA mixmer- LNA at third position and everythird position thereafter

<400> 40

tcatcatcag tctgataagc tt 22

<210> 41<211> 15<212> DNA<213> artificial

<220>

<223> LNA units at position 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 and 15<400> 41

tcagtctgat aagct 15

<210> 42

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA units at positions 1, 3,

<400> 42tcagtctgat aagct

5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15

15

<210> 43

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Unidades de LNA nas posições 1-5, 7-10, 12 & 13.<400> 43

agtctgataa gct 13

<210> 44

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA units at positions 1-3, 5, 7-11<400> 44

tcagtctgat aagct 15

<210> 45

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Todos resíduos de LNA, exceto nas posições 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 asquais são 2'OME

<400> 45tcagtctgat aagct 15

<210> 46

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Todos resíduos de LNA, exceto nas posições 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 asquais são 2'OME2'fluoro

<400> 46

tcagtctgat aagct 15

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Gap-mero de complemento total,<400> 47

tctcgcgtgc cgttcgttct tt

LNA nas posições 1-4 e 20-23

22

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Blockmer, LNA at positions 7-14<400> 48

tctcgcgtgc cgttcgttct tt 22

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Full complement LNA mixmer- LNA at third position and everythird position thereafter

<400> 49

tctcgcgtgc cgttcgttct tt 22

<210> 50

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14, 15<400> 50

gtgccgttcg ttctt 15

<210> 51<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA at positions 1, 3, 5-7, 10-12, 14 & 15

<400> 51

gtgccgttcg ttctt 15

<210> 52

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA at positions 1-5, 7, 9-13

<400> 52

gccgttcgtt ctt 13

<210> 53

<211> 11

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LNA at positions 1-4, 6-11

<400> 53

cgttcgttct t 11

<210> 54

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Todos resíduos de LNA, exceto nas posições 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 asquais são 2'OME

<400> 54

gtgccgttcg ttctt 15

<210> 55

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Todos resíduos de LNA, exceto nas posições 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 asquais são 2'OME

2'fluoro

<400> 55gtgccgttcg ttctt 15

<210> 56

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial<220>

<223> Phosphorothioate backbone, LNA at position 2 and every thirdtherafter.

<400> 56

ccattgtcac actcca 16

<210> 57

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Phosphorothioate backbone, LNA at position 3 and every thirdtherafter.

<400> 57

ccattgtcac actcca 16

<210> 58<211> 16<212> DNA<213> artificial<220> <223> Phosphorothioate

1-3, Sc 13-15

<400> 58ccattgtcac actcca

16

<210> 59

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Phosphorothioate backbone, LNA at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12,14 &15

<400> 59

ccattgtcac actcc 15

<210> 60

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Phosphorothioate backbone, LNA at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12,14 &15, LNA cytosines are methylated

<400> 60

ccattctgac cctac 15

<210> 61

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220><223> phosphorothioate backbone, LNA at posi.tion 3 and every thirdthereafter

<400> 61

ccattgtctc aatcca 16

<210> 62

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Phosphorothioate backbone,13

<400> 62attgtcacac tcc

LNA at position 1, 4, 5, 8, 10, 12 &

13

<210> 63

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Fully phosphorothioate, LNA at16, ali C LNAs are methylated.

<400> 63ccattctgac cctac

positions 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 &LNA is preferably Beta-D-oxy LNA.

15

<210> 64

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 64

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 65

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Gapmer design, Optional FAM label at 5' end, LNA at positions 1-3and

13-15<400> 65

tcagtctgat aagcta 16

<210> 66

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Gapmer design, Optional FAM label at 5' end, LNA at positions 1-3and

13-15.

<400> 66tccgtcttag aagata

<210> 67

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Optional FAM label at 5' end,13 & 15

<400> 67tctgtcagat acgat

16

LNA at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12,

<210> 68

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Optional FAM label at 5' end,13 & 15

<400> 68tcagtctgat aagct

<210> 69

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Optional FAM label at 5' end,12,

14 & 15

<400> 69tcagtctgat aagct

LNA at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12,

15

LNA at positions 1, 3, 4 6, 7, 8, 10,

15

<210> 70

<211> 7

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 70

atttgca 7

<210> 71

<211> 8

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 71gatttgca

<210> 72

<211> 9

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 72ggctttgca

<210> 73

<211> 7

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 73cacactc

<210> 74

<211> 8

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 74tcacactc

<210> 75

<211> 9

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 75gtcacactc

<210> 76

<211> 7

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 76

tagcatt

<210> 77

<211> 8

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 77ttagcatt

<210> 78

<211> 9

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 78attagcatt

<210> 79

<211> 7

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 79acgaaca

<210> 80<211> 8

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 80

aacgaaca 8

<210> 81

<211> 9

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 81

gaacgaaca 9

<210> 82

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 82

tgcatggatt tgcaca 16

<210> 83

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 83

tgcatggatt tgcac 15

<210> 84

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1 and every third basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 84

catggatttg cac 13

<210> 85

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every other basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.<400> 85tgcatggatt tgcac 15

<210> 86

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every other basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 86

catggatttg cac 13

<210> 87

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 4, 5, 8, 10, 12 & 13.Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNACs are methylated.

<400> 87catggatttg cac 13

<210> 88

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 &15. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. PreferablyLNA Cs are methylated.

<400> 88

tgcatggatt tgcac 15

<210> 89

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 3, 5, 7, 9, 10, 14 &15. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. PreferablyLNA Cs are methylated.

<400> 89

tgcatggatt tgcaca 16

<210> 90

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every other basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 90

ccattgtcac actcca 16

<210> 91

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every thris basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 91

ccattgtaac tctcca 16

<210> 92

<211> 16

<212> DNA

<213> artificiai

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 92

ccattgtcac actcca 16

<210> 93

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every third basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 93

ccattgtcac actcc 15

<210><211><212><213>

9413DNA

artificial

<220><223>

DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 94attgtcacac tcc

13

<210> 95<211> 15<212> DNA<213> artificial

<220><223>

DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 95ccattgtcac actcc

<210> 96<211> 13<212> DNA<213> artificial

<220><223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 96attgtcacac tcc

<210> 97<211> 13

<212> DNA<213> artificial

<220><223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every other basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 97attgtcacac tcc

<210> 98<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220><223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 4, 5, 8, 10, 12 & 13.Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNACs are methylated.

<400> 98attgtcacac tcc

<210> 99<211> 15<212> DNA<213> artificial

<220><223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 &15. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. PreferablyLNA Cs are methylated.

<400> 99ccattgtcac actcc<210> 100

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 4, 7, 11, 15.

Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNACs are methylated.

<400> 100

ccattgtcac actcca 16

<210> 101

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA gapmer oligonucleotide, LNA at position 1-3, & 13-15,

Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNACs are methylated.

<400> 101

ccattgtcac actcca 16

<210> 102

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every third basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 102

tcacgattag cattaa 16

<210> 103

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 103

atcacgatta gcatta 16

<210> 104

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1 and every other basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.<400> 104

tcacgattag cattaa 16

<210> 105

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14 &16. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. PreferablyLNA Cs are methylated.

<400> 105

atcacgatta gcatta 16

<210> 106

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every third basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 106

gagccgaacg aacaa 15

<210> 107

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 107

gccgaacgaa caa 13

<210> 108

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1 and every other basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 108

gagccgaacg aacaa 15

<210> 109

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1 and every other basethereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA.Preferably LNA Cs are methylated.

<400> 109gccgaacgaa caa

Claims (113)

1. Composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotí-deo de fita única ou um conjugado do mesmo tendo um comprimento de 8 a-26 unidades de nucleobase e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuti-camente aceitável, em que o oligonucleotídeo compreende uma seqüênciade DNA central das posições dois a sete ou das posições três a oito, con-tando a partir da extremidade 3' de 3' acgttt 5' (SEQ ID NO 6) em que pelomenos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal como duasou três, unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por suaunidade de LNA correspondente.

2. Composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotí-deo de fita única ou um conjugado do mesmo, tendo um comprimento de 8 a-26 unidades de nucleobase e um diluente. veículo ou adjuvante farmaceuti-camente aceitável, em que o oligonucleotídeo compreende uma seqüênciade DNA central das posições dois a sete ou das posições três a oito, con-tando a partir da extremidade 3' de 3' ctcaca 5' (SEQ ID NO 7) em que pelomenos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal como duasou três, unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por suaunidade de LNA correspondente.

3. Composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotí-deo de fita única ou um conjugado do mesmo, tendo um comprimento de 8 a-26 unidades de nucleobase e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuti-camente aceitável, em que o oligonucleotídeo compreende uma seqüênciade DNA central das posições dois a sete ou das posições três a oito, con-tando a partir da extremidade 3' de 3' ttacga 5' (SEQ ID NO 8) em que pelomenos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal como duasou três, unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por suaunidade de LNA correspondente.

4. Composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotí-deo de fita única ou um conjugado do mesmo, tendo um comprimento de 8 a-26 unidades de nucleobase e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuti-camente aceitável, em que o oligonucleotídeo compreende uma seqüênciade DNA central das posições dois a sete ou das posições três a oito, con-tando a partir da extremidade 3' de 3' acaagc 5' (SEQ ID NO 9) em que pelomenos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal como duasou três, unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por suaunidade de LNA correspondente.

5. Composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotí-deo de fita única ou um conjugado do mesmo, tendo um comprimento de 8 a-26 unidades de nucleobase e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuti-camente aceitável, em que o oligonucleotídeo compreende uma seqüênciade DNA central das posições dois a sete ou das posições três a oito, con-tando a partir da extremidade 3' de 3' cgaata 5' (SEQ ID NO 10) em que pelomenos uma, tal como uma, de preferência pelo menos duas, tal como duasou três, unidades de DNA na referida seqüência foram substituídas por suaunidade de LNA correspondente e em que o referido oligonucleotídeo nãocompreende uma região de mais de 7 unidades contínuas de DNA.

6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 5, em que a seqüência de nucleobase do oligonucleotídeoé complementar a uma seqüência de nucleotídeo presente em uma seqüên-cia de micro-RNA humana selecionada do grupo consistindo em(miR 19b) UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA (SEQ ID 1)(miR 122a) UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU (SEQ ID 2)(miR 155) UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG (SEQ ID 3)(miR 375) UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA (SEQ ID 4)(miR 21) UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID 5).

7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 6, em que o oligonucleotídeo tem um comprimento de en-tre 10 - 17 nucleobases.

8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 6, em que o oligonucleotídeo tem um comprimento de en-tre 10 - 16 nucleobases.

9. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 6, em que o oligonucleotídeo tem um comprimento de en-tre 12 - 26 nucleobases.

10. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 9, em que pelo menos duas unidades de DNA das posi-ções um a seis, dois a sete ou três a oito, do oligonucleotídeo, contando apartir da extremidade 3', foram substituídas por sua unidade de LNA corres-pondente e em que as unidades de LNA são separadas por pelo menos umaunidade de DNA.

11. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, em que pelo menos três unidades de DNA das posi-ções um a seis, dois a sete ou três a oito, do oligonucleotídeo, contando apartir da extremidade 3', foram substituídas por sua unidade de LNA corres-pondente e em que as unidades de LNA são separadas por pelo menos umaunidade de DNA.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10ou 11, em que o número de unidades consecutivas de DNA das posições uma seis, dois a sete ou três a oito, do oligonucleotídeo, contando a partir daextremidade 3', é no máximo dois.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12em que cada segundo nucleotídeo das posições um a seis, dois a sete outrês a oito, do oligonucleotídeo, contando a partir da extremidade 3', é umaunidade de LNA.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12,em que cada três nucleotídeos das posições um a seis, dois a sete ou três aoito, do oligonucleotídeo, contando a partir da extremidade 3', é uma unida-de de LNA.

15. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-14, em que o número total de unidades de LNA das posi-ções um a seis, dois a sete ou três a oito, do oligonucleotídeo, contando apartir da extremidade 3' está entre 2 e 6 unidades de LNA.

16. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 15, em que a primeira nucleobase do oligonucleotídeo,contando a partir da extremidade 3', é um análogo de nucleotídeo, tal comouma unidade de LNA.

17. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 16, em que a segunda nucleobase do oligonucleotídeo,contando a partir da extremidade 3', é um análogo de nucleotídeo, tal comouma unidade de LNA.

18. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 -17, em que o padrão de substituição para as nucleobasesnas posições um a seis, dois a sete ou três a oito, do oligonucleotídeo, con-tando a partir da extremidade 3', é selecionado do grupo consistindo emxxXxxX, xxXxXx, χΧχχΧχ,χΧχΧχχ, XxxXxx, xXxXxX, XxXxXx, XxxXxX eXxXxxX; xxXxxX, xXxxXx, XxxXxx, xXxXxX e XxXxXx; em que "X" denotaum análogo de nucleotídeo tal como uma unidade de LNA e "x" denota umaunidade de DNA.

19. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 18, em que o padrão de substituição para as nucleobasesnas posições um a sete, dois a oito ou três a nove, do oligonucleotídeo, con-tando a partir da extremidade 3', é selecionado do grupo consistindo emxxXxxXx, xxXxXxx, xXxxXxx, xxXxXxX,, xXxxXxX, xXxXxxX, xXxXxXx,XxxXxxX, XxxXxXx, XxXxxXx, XxXxXxx, XxXxXxX, xxXxxXx, xXxxXxx,XxxXxxX, xXxXxXx, XxXxXxX e XxXxXxx; em que "X" denota um análogo denucleotídeo tal como uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade deDNA.

20. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 -19, em que o padrão de substituição para as nucleobasesnas posições um a oito, dois a nove ou três a dez, do oligonucleotídeo, con-tando a partir da extremidade 3', é selecionado do grupo consistindo emxxXxxXxx, xxXxxXxX, xxXxXxxX, xxXxXxXx, xXxxXxxX, xXxxXxXx,xXxXxxXx, xXxXxXxx, XxxXxxXx, XxxXxXxx, XxXxxXxx, xXxXxXxX,XxXxXxxX, XxXxxXxX, XxxXxXxX, XxXxXxXx; xxXxxXxx, xXxxXxxX,XxxXxxXx, xXxXxXxX, XxXxXxXx e XxXxXxxX; em que "X" denota um aná-logo de nucleotídeo tal como uma unidade de LNA e "x" denota uma unidadede DNA.

21. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 20, em que o padrão de substituição para as nucleobasesnas posições um a nove, dois a dez ou três a onze, do oligonucleotídeo, con-tando a partir da extremidade 3', é selecionado do grupo consistindo emxxXxxXxxX, xxXxxXxXx, xxXxXxxXx, xxXxXxXxx, xXxxXxxXx, xXxxXxXxx,xXxXxxXxx, XxxXxxXxx, xxXxXxXxX, xXxxXxXxX, xXxXxxXxX, xXxXxXxxX,XxxXxxXxX, XxxXxXxxX, XxXxxXxxX, XxxXxXxXx, XxXxxXxXx, XxXxXxxXx,XxXxXxXxx e XxXxXxXxX; em que "X" denota um análogo de nucleotídeo talcomo uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de DNA.

22. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 21, em que o oligonucleotídeo compreende uma região deseqüência de nucleobase contínua a qual é 100% complementar à regiãocultivada de micro-RNA humano.

23. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 -22, em que o nono e/ou o décimo nucleotídeo do oligonu-cleotídeo, contando a partir da extremidade 3', é um análogo de nucleotídeo,tal como uma unidade de LNA.

24. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 23, em que o oligonucleotídeo não compreende uma regi-ão de mais de 5 unidades de nucleotídeo de DNA consecutivas.

25. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 24, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menosuma região consistindo em pelo menos duas unidades análogas de nucleotí-deo consecutivas, tal como pelo menos duas unidades consecutivas de LNA.

26. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 25, em que o oligonucleotídeo não compreende uma regi-ão de mais de 7 unidades análogas de nucleotídeo consecutivas, tais comounidades de LNA.

27. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26,em que o oligonucleotídeo não compreende uma região de mais de 3 unida-des análogas de nucleotídeo consecutivas, tais como unidades de LNA.

28. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações-1 - 27, em que a seqüência de nucleobase do oligonucleotídeo a qual écomplementar à seqüência da região de cultura de micro-RNA, é seleciona-da do grupo consistindo em (X)Xxxxxx, (X)xXxxxx, (X)xxXxxx, (X)xxxXxx,(X)xxxxXx e (X)xxxxxX, conforme lido em uma direção S1-S11 em que "X" de-nota um análogo de nucleotídeo, (X) denota um análogo de nucleotídeo op-cional, tal como uma unidade de LNA1 e "x" denota uma unidade de nucleo-tídeo de DNA ou RNA.

29. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 28, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menosduas unidades análogas de nucleotídeo, tal como pelo menos duas unidadesde LNA, nas posições as quais são complementares à região de cultura demiRNA.

30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 29,em que a seqüência de nucleobase do oligonucleotídeo a qual é comple-mentar à seqüência da região de cultura de micro-RNA, é selecionada dogrupo consistindo em (X)XXxxxx, (X)XxXxxx, (X)XxxXxx, (X)XxxxXx,(X)XxxxxX, (X)xXXxxx, (X)xXxXxx, (X)xXxxXx, (X)xXxxxX, (X)xxXXxx,(X)xxXxXx, (X)xxXxxX, (X)xxxXXx, (X)xxxXxX e (X)xxxxXX, em que "X" de-nota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, (X) denotaum análogo de nucleotídeo opcional, tal como uma unidade de LNA e "x"denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

31. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 28, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menostrês unidades análogas de nucleotídeo, tal como pelo menos três unidadesde LNA, nas posições as quais são complementares à região de cultura demiRNA.

32. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 31,em que a seqüência de nucleobase do oligonucleotídeo a qual é comple-mentar à seqüência da região de cultura de micro-RNA, é selecionada dogrupo consistindo em (X)XXXxxx, (X)xXXXxx, (X)xxXXXx, (X)xxxXXX,(X)XXxXxx, (X)XXxxXx, (X)XXxxxX, (X)xXXxXx, (X)xXXxxX, (X)xxXXxX,(X)XxXXxx, (X)XxxXXx, (X)XxxxXX, (X)xXxXXx, (X)xXxxXX, (X)xxXxXX,(X)xXxXxX e (X)XxXxXx, em que "X" denota um análogo de nucleotídeo, talcomo uma unidade de LNA, (X) denota um análogo de nucleotídeo opcional,tal como uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de nucleotídeo deDNA ou RNA.

33. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 28, em que o oligonucleotídeo de fita única compreendepelo menos quatro unidades análogas de nucleotídeo, tal como pelo menosquatro unidades de LNA, nas posições as quais são complementares à regi-ão de cultura de miRNA.

34. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33,em que a seqüência de nucleobase do oligonucleotídeo a qual é comple-mentar à seqüência da região de cultura de micro-RNA, é selecionada dogrupo consistindo em (X)xxXXX, (X)xXxXXX, (X)xXXxXX, (X)xXXXxX,(X)xXXXXx, (X)XxxXXXX, (X)XxXxXX, (X)XxXXxX, (X)XxXXx, (X)XXxxXX,(X)XXxXxX, (X)XXxXXx, (X)XXXxxX, (X)XXXxXx e (X)XXXXxx, em que "X"denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, (X) deno-ta um análogo de nucleotídeo opcional, tal como uma unidade de LNA e "x"denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

35. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 28, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menoscinco unidades análogas de nucleotídeo, tal como pelo menos cinco unida-des de LNA, nas posições as quais são complementares à região de culturade miRNA.

36. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 35,em que a seqüência de nucleobase do oligonucleotídeo a qual é comple-mentar à seqüência da região de cultura de micro-RNA, é selecionada dogrupo consistindo em (X)xXXXXX, (X)XxXXXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX,(X)XXXXxX e (X)XXXXXx, em que "X" denota um análogo de nucleotídeo,tal como uma unidade de LNA, (X) denota um análogo de nucleotídeo opcio-nal, tal como uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de nucleotídeode DNA ou RNA.

37. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 28, em que o oligonucleotídeo compreende seis ou seteunidades análogas de nucleotídeo, tal como seis ou sete unidades de LNA1nas posições as quais são complementares à região de cultura de miRNA.

38. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 37,em que a seqüência de nucleobase do oligonucleotídeo a qual é comple-mentar à seqüência da região de cultura de micro-RNA, é selecionada dogrupo consistindo em XXXXXX, XxXXXXX, XXxXXXX, XXXxXXX,XXXXxXX, XXXXXxX e XXXXXXx, em que "X" denota um análogo de nucle-otídeo, tal como uma unidade de LNA, tal como uma unidade de LNA e "x"denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

39. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 38, em que os dois motivos de nucleobase nas posições 7a 8, contando a partir da extremidade 3' do oligonucleotídeo de fita única sãoselecionados do grupo consistindo em xx, XX, xX e Xx, em que "X" denotaum análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, tal como umaunidade de LNA e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

40. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 39, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos 12nucleobases e em que os dois motivos de nucleobase nas posições 11 a 12,contando a partir da extremidade 3' do oligonucleotídeo de fita única são se-lecionados do grupo consistindo em xx, XX, xX e Xx1 em que "X" denota umanálogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, tal como uma unida-de de LNA e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

41. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 40, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos 13nucleobases e em que os três motivos de nucleobase nas posições 11 a 13,contando a partir da extremidade 3', são selecionados do grupo consistindoem xxx, Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX e XXX, em que "X" denota um análo-go de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, tal como uma unidade deLNA e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

42. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 41, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos 14nucleobases e em que os quatro motivos de nucleobase nas posições 11a-14, contando a partir da extremidade 3', são selecionados do grupo consis-tindo em xxxx, Xxxx1 xXxx, xxXx, xxxX, XXxx1 XxXx1 XxxX1 xXXx, xXxX,xxXX, XXXx, XxXX1 xXXX, XXxX e XXXX em que "X" denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA1 tal como uma unidade de LNA e"x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

43. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 42, em que o referido oligonucleotídeo compreende 15nucleobases e os cinco motivos de nucleobase nas posições 11 a 15, con-tando a partir da extremidade 3', são selecionados do grupo consistindo emXxxxx, xXxxx, xxXxx, xxxXx, xxxxX, XXxxx, XxXxx, XxxXx, XxxxX, xXXxx,xXxXx, xXxxX, xxXXx, xxXxX, xxxXX, XXXxx, XXxxX, XxxXX, xXXXx,xxXXX, XXxXX, XxXxX, XXXXx, XXXxX1 XXxXX1 XxXXXX1 xXXXX e XXXXXem que "X" denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA1 tal como uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de nucleotí-deo de DNA ou RNA.

44. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 43, em que o oligonucleotídeo compreende 16 nucleoba-ses e os seis motivos de nucleobase nas posições 11 a 16, contando a partir da extremidade 3', são selecionados do grupo consistindo em Xxxxxx,xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx, xxxxxX, XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx,XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX,xxxXXx, xxxXxX, xxxxXX, XXXxxx, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, XxXXxx,XxXxXx, XxXxxX, XxxXXx, XxxXxX, XxxxXX, xXXXxx, xXXxXx, xXXxxX, xXxXXx, xXxXxX, xXxxXX, xxXXXx, xxXXxX, xxXxXX, xxxXXX, XXXXxx,XXXxxX1 XXxxXX, XxxXXX1 xxXXXX, xXxXXX, XxXxXX1 XXxXxX1 XXXxXx,xXXxXX, XxXXxX, XXxXXx, xXXXxX, XxXXXx, xXXXXx, xXXXXX, XxXXXX1XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX, XXXXXx e XXXXXX em que "X" denota umanálogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, tal como uma unida- de de LNA e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

45. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 44,em que o oligonucleotídeo consiste de entre 17 e 26 nucleobases, em queas nucleobases 17-26, contando a partir da extremidade 3' são, cada uma,independentemente selecionadas do grupo consistindo em X e x, em que "X"denota um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, tal comouma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

46. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 45 em que o motivo de nucleobase para as três nucleoba-ses mais 5' do oligonucleotídeo, é selecionado do grupo consistindo em Xxx,xXx, xxX, XXx, XxX, xXX e XXX, em que "X" denota um análogo de nucleo-tídeo, tal como uma unidade de LNA, tal como uma unidade de LNA e "x"denota uma unidade de nucleotídeo de DNA ou RNA.

47. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18 - 46, em que "x" denota uma unidade de DNA.

48. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 47, em que o oligonucleotídeo de fita única compreendeuma unidade análoga de nucleotídeo, tal como uma unidade de LNA, na ex-tremidade 5'.

49. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 16-48, em que as unidades análogas de nucleotídeo, talcomo X, são independentemente selecionadas do grupo consistindo em: 2'-unidade de O-alquila-RNA, unidade de 2'-OMe-RNA, unidade de 2'-amino-DNA, unidade de 2'-fluoro-DNA, unidade de LNA, unidade de PNA, unidadede HNA, unidade de INA.

50. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 49,em que todas as nucleobases são unidades análogas de nucleotídeo.

51. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 49ou 50, em que as unidades análogas de nucleotídeo, tal como X, são inde-pendentemente selecionadas do grupo consistindo em: unidades de 2'-OMe-RNA, unidades de 2'-fluoro-DNA e unidades de LNA.

52. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 49 - 51, em que o oligonucleotídeo compreende a referidapelo menos uma unidade análoga de LNA e pelo menos uma outra unidadeanáloga de nucleotídeo que não LNA.

53. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 52,em que a unidade ou unidades análogas de nucleotídeo de não LNA sãoindependentemente selecionadas de unidades de 2'-OMe RNA e unidadesde 2'-fluoro-DNA.

54. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 53,em que o oligonucleotídeo de fita única consiste de pelo menos uma se-qüência XYX ou YXY, em que X é LNA e Y é uma unidade de 2'-0Me RNA euma unidade de 2'-fluoro-DNA.

55. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 54,em que a seqüência de nucleobases do oligonucleotídeo de fita única con-siste de unidades XeY alternadas.

56. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 49, em que o oligonucleotídeo de fita única compreendeunidades alternadas de LNA e DNA (Xx) ou (xX).

57. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 49, em que o oligonucleotídeo de fita única compreendeum motivo de LNA alternado seguido por 2 unidades de DNA (Xxx), xXx ouxxX.

58. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 54 - 57, em que pelo menos uma das unidades análogas denucleotídeo de DNA ou não LNA são substituídas por uma nucleobase deLNA em uma posição selecionada das posições identificadas como unidadesde nucleobase de LNA em qualquer uma das reivindicações precedentes.

59. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18-58, em que "X" denota uma unidade de LNA.

60. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 59, em que o oligonucleotídeo de fita única compreendepelo menos 5 unidades de LNA.

61. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 60,em que o oligonucleotídeo de fita única compreende pelo menos 7 unidadesde LNA.

62. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 61, em que pelo menos uma das nucleobases de LNA écitosina ou guanina.

63. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 62,em que pelo menos três das nucleobases de LNA são independentementeselecionadas de citosina ou guanina.

64. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 16-63, em que os análogos de nucleotídeo têm uma estabili-dade dúplex térmica maior por um nucleotídeo de RNA complementar doque a estabilidade dúplex térmica de um nucleotídeo de DNA equivalentesao referido nucleotídeo de RNA complementar.

65. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 16-64, em que os análogos de nucleotídeo conferem estabi-lidade intensificada no soro do oligonucleotídeo.

66. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 65 em que o oligonucleotídeo não media a clivagem ba-seada em RNAseH de uma molécula de RNA de fita única complementar.

67. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 66 em que o oligonucleotídeo é capaz de formação de umadúplex com uma molécula de ácido nucléico de RNA de fita única comple-mentar com ligações internucleosídeo de fosfodiéster, em que o dúplex temuma Tm de pelo menos cerca de 60°C.

68. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 67,em que o oligonucleotídeo é capaz de formar um dúplex com uma moléculade ácido nucléico de RNA de fita única complementar com ligações internu-cleosídeo de fosfodiéster, em que o dúplex tem uma Tm de entre cerca de-70°C a cerca de 95°C.

69. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 68,em que o oligonucleotídeo é capaz de formar um dúplex com uma moléculade ácido nucléico de RNA fita única complementar com ligações internucleo-sídeo de fosfodiéster, em que a dupla tem uma Tm de entre cerca de 70°C acerca de 90°C, tal como entre cerca de 70°C e cerca de 85°C.

70. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 69, em que o oligonucleotídeo é capaz de formar um dú-plex com uma molécula de ácido nucléico de RNA de fita única complemen-tar com ligações internucleosídeo de fosfodiéster, em que o dúplex tem umaTm de entre cerca de 50°C a cerca de 90°C.

71. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 70, em que o oligonucleotídeo de fita única tem um com-primento de entre 10 a 16, tal como um comprimento de 10, 11, 12, 13,14,15 ou 16 nucleobases.

72. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 71,em que o oligonucleotídeo de fita única tem um comprimento de 15 ou 16nucleobases.

73. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 72, em que a unidade ou unidades de LNA são indepen-dentemente selecionadas do grupo consistindo em óxi-LNA, tio-LNA e ami-no-LNA, nas configurações D-β e L-α ou combinações das mesmas.

74. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 73,em que a unidade ou unidades de LNA são beta D óxi-LNA.

75. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 73,em que as unidades de LNA são alfa-L amino LNA.

76. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 75, em que o oligonucleotídeo de fita única compreendeentre 3 e 17 unidades de LNA.

77. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 76, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menosum grupo de ligação internucleosídeo o qual difere de fosfato.

78. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 77,em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucle-osídeo de fosforotioato.

79. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 78,em que o oligonucleotídeo compreende ligações de fosfodiéster e fosforotio-ato.

80. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 77,em que todas as ligações internucleosídeo são ligações de fosforotioato.

81. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 79, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menosuma ligação internucleosídeo de fosfodiéster.

82. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 81,em que todas as ligações internucleosídeo são ligações de fosfodiéster.

83. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 - 82, em que o referido veículo é solução salina ou soluçãosalina tamponada.

84. Oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 - 75, em que o referido oligonucleotídeo de fita única compreendepelo menos uma ligação de fosforotioato e/ou em que pelo menos as primei-ra nucleobase 5' e/ou a última 3'é uma nucleobase de LNA.

85. Oligonucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucle-obase selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21,SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO-28, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 82, SEQ ID NO 83, SEQ IDNO 84, SEQ ID NO 85, SEQ ID NO 86, SEQ ID NO 87, SEQ ID NO 88 eSEQ ID NO 89; em que uma letra minúscula identifica a base nitrogenosa deuma unidade de DNA e uma letra maiúscula identifica a base nitrogenosa deuma unidade de LNA; e em que as citosinas de LNA são opcionalmente me-tiladas ou um conjugado do mesmo.

86. Oligonucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucle-obase selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO-17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 90, SEQ ID NO 91, SEQ IDNO 92, SEQ ID NO 93, SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 96, SEQID NO 97, SEQ ID NO 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100 e SEQ ID NO-101; em que uma letra minúscula identifica a base nitrogenosa de uma uni-dade de DNA e uma letra maiúscula identifica a base nitrogenosa de umaunidade de LNA; e em que as citosinas de LNA são opcionalmente metiladasou um conjugado do mesmo.

87. Oligonucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucle-obase selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30,SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO-35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 102, SEQ ID NO 103, SEQID NO 104 e SEQ ID NO 105; em que uma letra minúscula identifica a basenitrogenosa de uma unidade de DNA e uma letra maiúscula identifica a basenitrogenosa de uma unidade de LNA; e em que as citosinas de LNA são op-cionalmente metiladas ou um conjugado do mesmo.

88. Oligonucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucle-obase selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48,SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO-53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 106, SEQ ID NO 107, SEQID NO 108 e SEQ ID NO 109; em que uma letra minúscula identifica a basenitrogenosa de uma unidade de DNA e uma letra maiúscula identifica a basenitrogenosa de uma unidade de LNA; e em que as citosinas de LNA são op-cionalmente metiladas ou um conjugado do mesmo.

89. Oligonucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucle-obase selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 66,SEQ ID NO 67, SEQ ID NO 68 e SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO-39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ IDNO 44, SEQ ID NO 45 e SEQ ID NO 46, em que uma letra minúscula identi-fica a base nitrogenosa de uma unidade de DNA e uma letra maiúscula iden-tifica a base nitrogenosa de uma unidade de LNA; e em que as citosinas deLNA são opcionalmente metiladas ou um conjugado do mesmo.

90. Oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 - 89, em que as ligações internucleobase são como definido emqualquer uma das reivindicações 77 - 82.

91. Oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 84 - 90, em que as seqüências de nucleobase do oligonucleotídeoconsistem na referida seqüência de nucleobase.

92. Conjugado compreendendo o oligonucleotídeo como defini-do em qualquer uma das reivindicações 84-91 e pelo menos uma entidadede não-nucleobase covalentemente presa ao mesmo.

93. Conjugado de acordo com a reivindicação 92, em que a en-tidade de não-nucleobase consiste ou compreende em um esterol, tal comocolesterol.

94. Composição farmacêutica compreendendo o oligonucleotí-deo ou conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 84 --93 e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

95. Uso de um oligonucleotídeo de fita única ou conjugado comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1-93 para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio médico associ-ado à presença ou superexpressão do micro-RNA, tal como uma doençaselecionada do grupo consistindo em níveis aumentados de colesterol noplasma, aterosclerose, hipercolesterolemia ou hiperlipidemia, Hepatite C,câncer e um distúrbio metabólico, tal como diabetes.

96. Método para o tratamento de uma doença ou distúrbio médi-co associado à presença ou superexpressão do micro-RNA, compreendendoa etapa de administração de uma composição como definida em qualqueruma das reivindicações 1-93 a uma pessoa que precisa de tratamento, talcomo uma pessoa sofrendo de uma doença selecionada do grupo consistin-do em níveis aumentados de colesterol no plasma, aterosclerose, hiperco-lesterolemia ou hiperlipidemia, Hepatite C, câncer e um distúrbio metabólico,tal como diabetes.

97. Método para redução da quantidade eficaz de um alvo demiRNA em uma célula ou um organismo compreendendo administração deuma composição ou um oligonucleotídeo de fita única como definido emqualquer uma das reivindicações 1-93 à célula ou organismo.

98. Método de acordo com a reivindicação 97, em que a redu-ção da quantidade eficaz do alvo miRNA ocorre via um antagonismo in vivo.

99. Método para inversão de repressão de um mRNA alvo deum miRNA em uma célula ou organismo compreendendo administração deuma composição ou um oligonucleotídeo de fita única como definido emqualquer uma das reivindicações 1-93 à célula ou organismo.

100. Método para a síntese de um oligonucleotídeo de fita únicacomo definido em qualquer uma das reivindicações 1-93, o referido métodocompreendendo as etapas de: a. Seleção de uma primeira nucleobase, contando a partir daextremidade 3', a qual é uma nucleobase de LNA.b. Opcionalmente seleção de uma segunda nucleobase, contan-do a partir da extremidade 3', a qual é uma nucleobase de LNA.c. Seleção de uma região do oligonucleotídeo de fita única aqual corresponde a qualquer uma das regiões identificadas nas reivindica-ções 1 - 5 ou a região de cultura do miRNA.d. Opcionalmente seleção de mais duas nucleobases as quaissão as sétima e oitava nucleobases conforme de acordo com a reivindicação 39. e. Opcionalmente seleção de uma região 5' do oligonucleotídeode fita única como definido em qualquer uma das reivindicações 40 - 45.f. Opcionalmente seleção entre 1 e 10 outras nucleobases asquais podem ser selecionadas do grupo consistindo em nucleotídeos e aná-logos de nucleotídeo, tal como LNA.g. Opcionalmente seleção de uma extremidade 5' terminal dooligonucleotídeo de fita única com odefinido na reivindicação 46, em que asíntese é realizada através de síntese seqüencial das regiões definidas nasetapas a - f, em que a referida síntese pode ser realizada na direção 3'-5' ( aa f) ou 5' - 3' (f a a) e em que o referido oligonucleotídeo de fita única écomplementar a uma seqüência encontrada dentro de uma seqüência sele-cionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 e SEQ ID NO 5.

101. Método de acordo com a reivindicação 100, em que a sín-tese é realizada na direção 3' a 5' a - f.

102. Uso de um oligonucleotídeo de entre 8-16 nucleobasesde comprimento para a fabricação de um medicamento para o tratamento deuma doença ou distúrbio médico associado à presença ou superexpressãodo micro-RNA, em que o oligonucleotídeo é complementar a uma seqüênciacorrespondente presente em uma seqüência selecionada do grupo consis-tindo em SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 e SEQID NO 5.

103. Uso de acordo com a reivindicação 102, em que a doençaé selecionada do grupo consistindo em níveis aumentados de colesterol noplasma, aterosclerose, hipercolesterolemia ou hiperlipidemia, Hepatite C,câncer e um distúrbio metabólico, tal como diabetes.

104. Método para o tratamento de uma doença ou distúrbio mé-dico associado à presença ou superexpressão do micro-RNA, compreen-dendo a etapa de administração de um oligonucleotídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 1 - 100 ou um conjugado do mesmo, auma pessoa que precisa de tratamento.

105. Método de acordo com a reivindicação 104, em que a pes-soa está sofrendo de uma doença selecionada do grupo consistindo em ní-veis aumentados de colesterol no plasma, aterosclerose, hipercolesterolemiaou hiperlipidemia, Hepatite C, câncer e um distúrbio metabólico, tal comodiabetes.

106. Uso de um oligonucleotídeo como definido em qualqueruma das reivindicações 1-93 ou um conjugado do mesmo, para super-regulação dos níveis de mRNA de Nrdg3, Aldo A, Bckdk ou CD320.

107. Método para redução da quantidade eficaz de um alvo demiRNA em uma célula ou um organismo compreendendo administração deuma composição ou um oligonucleotídeo como definido em qualquer umadas reivindicações 1 - 93 ou um conjugado do mesmo à célula ou organis-mo.

108. Método para reversão de repressão de um mRNa alvo deum miRNA em uma célula ou um organismo compreendendo administraçãode uma composição ou um oligonucleotídeo como definidp em qualquer umadas reivindicações 1 - 93 ou um conjugado do mesmo à célula ou organis-mo.

109. Tratamento de uma doença ou distúrbio médico associadoà presença ou superexpressão do micro-RNA compreendendo a etapa deadministração de uma composição (tal como uma composição farmacêutica)compreendendo um oligonucleotídeo de fita única de entre 8- 16 nucleoba-ses de comprimento a uma pessoa que precisa de tratamento, em que o oli-gonucleotídeo é complementar a uma seqüência correspondente presenteem uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 1, SEQID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 e SEQ ID NO 5.

110. Método para redução da quantidade eficaz de um alvo demiRNA em uma célula ou um organismo compreendendo administração deuma composição (tal como uma composição farmacêutica) compreendendoum oligonucleotídeo de fita única de entre 8- 16 nucleobases à célula ou oorganismo, em que o oligonucleotídeo é complementar a uma seqüênciacorrespondente presente em uma seqüência selecionada do grupo consis-tindo em SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 e SEQID NO 5.

111. Método para reversão de repressão de um mRNA alvo deum miRNA em uma célula ou organismo compreendendo um oligonucleotí-deo de fita única de entre 8-16 nucleobases ou (ou uma composição com-preendendo o referido oligonucleotídeo) à célula ou ao organismo, em que ooligonucleotídeo é complementar a uma seqüência correspondente presenteem uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 1, SEQID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 e SEQ ID NO 5.

112. Composição farmacêutica compreendendo um oligonucleo-tídeo de fita única de um comprimento de entre 8 e 16 unidades de nucleo-base, um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, emque pelo menos uma das unidades de nucleobase do oligonucleotídeo defita única é um análogo de nucleotídeo e em que o oligonucleotídeo de fitaúnica é complementar a uma seqüência de micro-RNA humana, em que ooligonucleotídeo é complementar a uma seqüência correspondente presenteem uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 1, SEQID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 e SEQ ID NO 5.

113. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 112, em quea composição é para o tratamento de uma doença selecionada do grupoconsistindo em níveis aumentados de colesterol no plasma, aterosclerose,hipercolesterolemia ou hiperlipidemia, Hepatite C, câncer e um distúrbio me-tabólico, tal como diabetes.