KR20170110742A - 다능성 세포의 처리 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리함으로써, 다능성 세포가 배양액 중에서 효과적으로 증가되어 분화될 수 있는 다능성 세포의 처리 방법에 관한 것이다.

Description

다능성 세포의 처리{TREATMENT OF PLURIPOTENT CELLS}
본 발명은 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리함으로써, 다능성 세포가 배양액 중에서 효과적으로 증가되어 분화될 수 있는 다능성 세포의 처리 방법에 관한 것이다.
제 1 형 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포 대체 요법의 발전으로, 생착 (engraftment)에 적합한 인슐린 생성 세포, 또는 β 세포 공급원을 개발하는데 관심이 집중되어 왔다. 한 가지 접근법은 예를 들어, 배아 줄기 세포와 같은 다능성 세포로부터 기능성 β 세포를 생성하는 것이다.
척추동물 배아 발생에서, 다능성 세포는 낭배형성 (gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층 (three germ layers) (외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽 (definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 다수의 마커, 예컨대 HNF-3 베타, GATA-4, Mixl1, CXCR4 및 SOX-17을 발현한다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽 세포는 췌장-십이지장 호메오박스 유전자, PDX-1을 발현한다. PDX-1이 없는 경우, 췌장은 복측아 (ventral bud) 및 배측아 (dorsal bud) 형성을 능가하여 발현하지 못한다. 따라서, PDX-1 발현은 췌장 기관 형성에 있어서 중요한 단계가 된다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
이식을 위한 충분한 양의 세포 물질의 생성은 배양액 중에서 효과적으로 증가되어, 대상 조직, 예를 들어 기능성 β 세포로 효과적으로 분화될 수 있는 세포 물질 공급원을 필요로 한다.
인간 배아 줄기 세포를 배양하기 위한 현행 방법은 복잡하며; 이는 세포가 이의 다능성을 잃지 않고 증식하도록 외인성 인자 또는 화학적 규명 배지 (chemically defined medium)의 사용을 필요로 한다. 게다가, 배아 줄기 세포의 분화에 의해, 종종 배양액 중에서 증가하는 세포가 감소된다.
일례를 들면, 문헌 [참조: Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005)]은 배아 줄기 세포 자가 재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자가 보충된 비조절된 혈청 대체 (serum replacement, SR) 배지에서 배아 줄기 세포가 유지되는 영양 세포가 없는 무혈청 배양계를 개시하고 있다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는데 유용한 한정 배지 (defined medium)를 개시하고 있다. 용액 중에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 소정의 배양액에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는데 필요한 양의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.
다른 예에서, 국제 특허 출원 공개 제WO2005086845호는 미분화 줄기 세포의 유지 방법을 개시하며, 상기 방법은 세포를 원하는 결과를 달성하기에 충분한 시간 동안 미분화 상태로 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타 (TGFβ) 패밀리 단백질 구성원, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 패밀리 단백질 구성원, 또는 니코틴아미드 (NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.
글리코겐 합성효소 키나제-3 (GSK-3)의 저해제는 성체 줄기 세포의 증식 및 증가를 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 일례를 들면, 문헌 [참조: Tateishi et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications (2007) 352: 635)]에는 GSK-3의 저해가 신생아 또는 성인 심장으로부터 회수된, 중간엽 특성을 갖는 인간 심장 줄기 세포 (hCSC)의 성장 및 생존을 향상시키는 것으로 나타나 있다.
예를 들어, 문헌 [Rulifson et al (PNAS 144, 6247-6252, (2007))]에는 Wnt 시그널링이 섬 β 세포 증식을 자극하는 것으로 개시되어 있다.
다른 예에서, 국제 특허 출원 공개 제WO2007016485호에는 다능성 성인 전구 세포 (progenitor)를 비롯한 비배아 줄기 세포의 배양액에 GSK-3 저해제를 첨가하면, 증가 시에 다능성 표현형 유지를 유도하며, 훨씬 더 강한 분화 반응을 일으키는 것으로 보고되어 있다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제US2006030042호는 영양세포층을 사용하지 않고 배아 줄기 세포를 유지하도록 Wnt 또는 GSK-3 효소 활성의 소분자 저해제를 첨가하여 GSK-3를 저해하는 방법을 사용한다.
다른 예에서, 국제 특허 출원 공개 제WO2006026473호에는 GSK-3B 저해제를 첨가하여, c-myc의 전사 활성화 및 c-myc 단백질의 안정화를 통해 다능성 세포를 안정화시키는 것으로 보고되어 있다.
다른 예에서, 국제 특허 출원 공개 제WO2006100490호에는 마우스 또는 인간 배아 줄기 세포를 비롯한 다능성 줄기 세포의 자가 재생 집단을 유지하도록 GSK-3 저해제 및 gp130 작용제를 함유하는 줄기 세포 배지의 용도가 보고되어 있다.
다른 예에서, 문헌 [Sato et al. (Nature Medicine (2004) 10:55-63)]에는 GSK-3를 특정한 약리학적 화합물로 저해하여, 배아 줄기 세포의 미분화 표현형을 유지하고, 다능성 상태에 특이적인 전사 인자, 예컨대 Oct-3/4, Rex-1, 및 Nanog (나노그)의 발현을 유지할 수 있는 것으로 나타나 있다.
다른 예에서, 문헌 [Maurer et al (Journal of Proteome Research (2007) 6:1198-1208)]에는 GSK-3 저해제로 처리된 성인 뉴런 줄기 세포가 특히 β-카테닌 표적 유전자의 전사를 향상시켜, 아폽토시스를 감소시킴으로써, 뉴런 분화를 향상시키는 것으로 나타나 있다.
다른 예에서, 문헌 [Gregory et al (Annals of the New York Academy of Sciences (2005) 1049:97-106)]에는 GSK-3B 저해제가 체외 골형성을 향상시키는 것으로 보고되어 있다.
다른 예에서, 문헌 [Feng et al (Biochemical and Biophysical Research Communcations (2004) 324:1333-1339)]에는 배아 줄기 세포의 조혈 분화가 Wnt/β-카테닌 경로의 하향 조절과 관련되어 있으며, Wnt가 GSK3의 천연 저해제인 것으로 나타나 있다.
따라서, 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 또는 췌장 호르몬 분비 세포에로의 분화능을 보유하면서, 현재의 임상적 필요성에 대처하게 증가될 수 있도록 다능성 줄기 세포의 처리 방법을 개발하는 것이 여전히 상당히 필요하다.
다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리함으로써, 다능성 세포가 배양액 중에서 효과적으로 증가되어 분화될 수 있는 다능성 세포의 처리 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리하여, 다능성 세포를 증가 및 분화시키는 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은:
a. 다능성 세포를 배양하는 단계, 및
b. 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리하는 단계를 포함하는 다능성 세포의 증가 및 분화 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 다능성 세포는 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화된다.
60/913475에 개시된 방법에 따르면, 다능성 세포는 인간 배아 줄기 세포일 수 있거나, 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포일 수 있다.
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (I)의 화합물이다:
[화학식 I]
Figure pat00001
.
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (II)의 화합물이다:
[화학식 II]
Figure pat00002
.
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (III)의 화합물이다:
[화학식 III]
Figure pat00003
본 발명에 의한 방법에 따라 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리함으로써, 다능성 세포를 배양액 중에서 효과적으로 증가, 분화시킬 수 있다.
<도 1>
도 1은 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (패널 A) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 Sox-17 발현 (패널 B)에 대한 화합물 JNJ 17189731의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 (Cell Analyzer) 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
<도 2>
도 2는 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (패널 A) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 Sox-17 발현 (패널 B)에 대한 화합물 JNJ 17163796의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
<도 3>
도 3는 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (패널 A) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 Sox-17 발현 (패널 B)에 대한 화합물 JNJ 17223375의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
<도 4>
도 4는 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (패널 A) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 Sox-17 발현 (패널 B)에 대한 화합물 JNJ 18157698의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
<도 5>
도 5는 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (패널 A) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 Sox-17 발현 (패널 B)에 대한 화합물 JNJ 26158015의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
<도 6>
도 6는 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (패널 A) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 Sox-17 발현 (패널 B)에 대한 화합물 JNJ 26483197의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
<도 7>
도 7은 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (패널 A) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 Sox-17 발현 (패널 B)에 대한 화합물 JNJ 26483249의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
<도 8>
도 8은 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (패널 A) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 Sox-17 발현 (패널 B)에 대한 화합물 JNJ 10220067의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
<도 9>
도 9는 실시예 8에 기재된 방법에 따라, 도시된 화합물로 처리된 세포에 대한 면역형광염색 및 유세포 분석 (flow cytometric analysis)에 의해 측정된 세포 표면의 CXCR4 발현을 나타낸다.
<도 10>
도 10은 실시예 8에 기재된 방법에 따라, 도시된 화합물로 처리된 세포에서의 실시간 PCR에 의해 측정된 CXCR4 (패널 A), HNF-3 베타 (패널 B), 및 Sox-17 (패널 C)의 발현을 나타낸다.
<도 11>
도 11은 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (패널 A) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 Pdx-1 발현 (패널 B)에 대한 도시된 화합물의 농도 범위 효과를 나타낸다. 세포를 실시예 9에 기재된 방법에 따라 처리하였다.
<도 12>
도 12는 실시간 PCR에 의해 측정된 Pdx-1 발현 (백색 막대) 및 HNF-6 (흑색 막대)에 대한 도시된 화합물의 농도 범위 효과를 나타낸다. 세포를 실시예 9에 기재된 방법에 따라 처리하였다.
<도 13>
도 13은 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (패널 A) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 인슐린 발현 (패널 B)에 대한 도시된 화합물의 농도 범위 효과를 나타낸다. 세포를 실시예 10에 기재된 방법에 따라 처리하였다.
<도 14>
도 14는 실시간 PCR에 의해 측정된 Pdx-1 발현 (백색 막대) 및 인슐린 (흑색 막대)에 대한 도시된 화합물의 농도 범위 효과를 나타낸다. 세포를 실시예 10에 기재된 방법에 따라 처리하였다.
<도 15>
도 15는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (패널 A) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 인슐린 발현 (패널 B)에 대한 도시된 화합물의 농도 범위 효과를 나타낸다. 세포를 실시예 11에 기재된 방법에 따라 처리하였다.
개시 내용의 명확함을 위하여, 그리고 제한하지 않고서, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 특정한 특성, 실시 형태, 또는 응용을 설명하거나 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 레벨에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포 (progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 (in vitro) 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직을 발생시키며, 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 이들의 발생능에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배아외 세포형을 발생시킬 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포형을 발생시킬 수 있음을 의미하는 다능성; (3) 세포 계통의 서브세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 서브세트를 발생시킬 수 있음을 의미하는 다분화능 (multipotent) (예를 들어, 조혈 줄기 세포 (HSC)는 HSC (자가 재생), 혈액 세포 제한된 소기능성 (oligopotent) 전구 세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포형 및 요소 (예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다분화능 줄기 세포보다 더 제한된 세포 계통의 서브세트를 발생시킬 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통 (예를 들어, 정자발생 줄기 세포)을 발생시킬 수 있음을 의미하는 단능성.
분화는 특화되지 않은 ("미결정된 (uncommitted)") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화 유도된 세포는 세포 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된 (committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화는 세포가 세포 계통 내의 덜 특화된 (또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포 계통은 세포의 유전, 즉, 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포를 발생시킬 수 있는지를 규정한다. 세포 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 대상 계통의 세포 표현형과 특이적으로 관련되며, 미결정된 세포가 대상 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
"β-세포 계통"은 전사 인자 PDX-1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나에 대해 양성 (positive) 유전자 발현을 가진 세포를 말한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. β 세포 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, Cer1, 노달 (Nodal), FGF8, 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민 (eomesodermin) (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1베타, PTF-1 알파, HNF-6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, 또는 PTF-1 알파. 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "완성 내배엽"은 낭배형성 동안에 상배엽으로부터 생기는 세포의 특징을 보유하며, 위장관을 형성하는 세포및 이의 파생 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, 세르베루스 (Cerberus), OTX2, 구스코이드 (goosecoid), C-Kit, CD99, 및 Mixl1.
본 명세서에 사용되는 "배아외 내배엽"은 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 말한다: SOX-7, AFP, 및 SPARC.
본 명세서에 사용되는 "마커"는 대상 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 레벨 증가 및 음성 마커의 레벨 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "중내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: CD48, 에오메소데르민 (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 베타, GSC, FGF17, GATA-6.
본 명세서에 사용되는 "췌장 내분비 세포" 또는 "췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 "전원시선 (pre-primitive streak) 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 노달 또는 FGF8.
본 명세서에 사용되는 "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질 또는 FGF4.
일 실시 형태에서, 본 발명은 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리하는 것을 포함하는 다능성 세포의 증가 및 분화 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은:
c. 다능성 세포를 배양하는 단계, 및
d. 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리하는 단계를 포함하는 다능성 세포의 증가 및 분화 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 다능성 세포는 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화된다.
완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커는 SOX17, GATA4, Hnf-3베타, GSC, Cer1, 노달, FGF8, 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민 (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, 및 OTX2로 구성되는 그룹 중에서 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 다능성 세포로부터 유래된 세포가 본 발명에 고려된다. 본 발명의 한 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 다른 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
다능성 세포는 약 1 내지 약 72 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리될 수 있다. 대안적으로, 다능성 세포는 약 12 내지 약 48 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리될 수 있다. 대안적으로, 다능성 세포는 약 48 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리될 수 있다.
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 약 100nM 내지 약 100μM의 농도로 사용된다. 대안적으로, GSK-3B 효소 활성 저해제는 약 1μM 내지 약 10μM의 농도로 사용된다. 대안적으로, GSK-3B 효소 활성 저해제는 약 10μM의 농도로 사용된다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 화합물
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (I)의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 이의 염이다:
[화학식 I]
Figure pat00004
상기 식에서,
R1은 페닐, 페닐 치환기가 C1- 5알킬, 할로겐, 니트로, 트라이플루오로메틸 및 니트릴로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 페닐, 또는 피리미디닐이고;
R2는 페닐, 페닐 치환기가 C1- 5알킬, 할로겐, 니트로, 트라이플루오로메틸 및 니트릴로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 페닐, 또는 임의로 C1- 4알킬 치환된 피리미디닐이며, R1 및 R2 중 적어도 하나는 피리미디닐이고;
R3는 수소, 2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸, C1- 5알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 아릴C1 - 5알킬옥시카르보닐, 아릴C1 - 5알킬, 하나 이상의 아릴 치환기가 C1- 5알킬, C1- 5알콕시, 할로겐, 아미노, C1- 5알킬아미노, 및 다이C1 - 5알킬아미노로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환된 아릴C1 - 5알킬, 프탈이미도C1 - 5알킬, 아미노C1 -5알킬, 다이아미노C1 - 5알킬, 석신이미도C1 - 5알킬, C1- 5알킬카르보닐, 아릴카르보닐, C1-5알킬카르보닐C1-5알킬 및 아릴옥시카르보닐C1 - 5알킬이며;
R4는 -(A)-(CH2)q-X이고;
A는 비닐렌, 에티닐렌 또는
Figure pat00005
이며;
R5는 수소, C1- 5알킬, 페닐 및 페닐C1 - 5알킬로 구성되는 그룹 중에서 선택되고;
q는 0 내지 9이며;
X는 수소, 하이드록시, 비닐, 하나 이상의 비닐 치환기가 각각 불소, 브롬, 염소 및 요오드로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 비닐, 에티닐, 에티닐 치환기가 불소, 브롬, 염소 및 요오드로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 에티닐, C1- 5알킬, 하나 이상의 알킬 치환기가 각각 C 1- 5알콕시, 트라이할로알킬, 프탈이미도 및 아미노로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 C1- 5알킬, C3- 7사이클로알킬, C1- 5알콕시, 알킬 치환기가 프탈이미도 및 아미노로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 C1- 5알콕시, 프탈이미도옥시, 페녹시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1- 5알콕시로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 페녹시, 페닐, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1- 5알킬, 할로겐 및 C1- 5알콕시로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 페닐, 아릴C1 - 5알킬, 하나 이상의 아릴 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1- 5알콕시로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 아릴C1 - 5알킬, 아릴옥시C1 - 5알킬아미노, C1- 5알킬아미노, 다이C1 - 5알킬아미노, 니트릴, 옥심, 벤질옥시이미노, C1- 5알킬옥시이미노, 프탈이미도, 석신이미도, C1- 5알킬카르보닐옥시, 페닐카르보닐옥시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1- 5알킬, 할로겐 및 C1- 5알콕시로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 페닐카르보닐옥시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1- 5알킬, 할로겐 및 C1- 5알콕시로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 페닐C1 -5알킬카르보닐옥시, 아미노카르보닐옥시, C1- 5알킬아미노카르보닐옥시, 다이C1 - 5알킬아미노카르보닐옥시, C1- 5알콕시카르보닐옥시, 하나 이상의 알킬 치환기가 각각 메틸, 에틸, 아이소프로필 및 헥실로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 C1- 5알콕시카르보닐옥시, 페녹시카르보닐옥시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1- 5알킬, C1-5알콕시 및 할로겐으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 페녹시카르보닐옥시, C1- 5알킬티오, 알킬 치환기가 하이드록시 및 프탈이미도로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 C1- 5알킬티오, C1- 5알킬설포닐, 페닐설포닐, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 브롬, 불소, 클로라이드, C1- 5알콕시 및 트라이플루오로메틸로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환된 페닐설포닐로 구성되는 그룹 중에서 선택되나; 단, A가
Figure pat00006
이고, q가 0이며, X가 H이면, R3는 2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸이 아닐 수 있다.
본 발명의 일례는 R1이 치환된 페닐이고, R2가 피리미딘-3-일인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 일례는 R1이 4-플루오로페닐인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 일례는 R3가 수소, 아릴C1 - 5알킬, 또는 치환된 아릴C1 - 5알킬인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 일례는 R3가 수소 또는 페닐C1 - 5알킬인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 일례는 A가 에티닐렌이고, q가 0 내지 5인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 일례는 X가 석신이미도, 하이드록시, 메틸, 페닐, C1- 5알킬설포닐, C3-6사이클로알킬, C1- 5알킬카르보닐옥시, C1- 5알콕시, 페닐카르보닐옥시, C1- 5알킬아미노, 다이C1-5알킬아미노 또는 니트릴인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
화학식 (I)의 화합물은 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 동일 출원인에 의한 미국 특허 제6,214,830호에 개시되어 있다.
본 발명의 일례는 하기로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화학식 (I)의 화합물을 포함한다:
Figure pat00007
Figure pat00008
본 발명의 일례는 하기 화학식의 화합물 5인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다:
Figure pat00009
화합물 5 .
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (II)의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 이의 염이다:
[화학식 II]
Figure pat00010
상기 식에서,
R은 Ra, -C1- 8알킬-Ra, -C2- 8알케닐-Ra, -C2- 8알키닐-Ra 및 시아노로 구성되는 그룹 중에서 선택되고;
Ra는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 구성되는 그룹 중에서 선택되며;
R1은 수소, -C1- 8알킬-R5, -C2- 8알케닐-R5, -C2- 8알키닐-R5, -C(O)-(C1- 8)알킬-R9, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-O-(C1- 8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -C(O)-NH(C1- 8알킬-R9), -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-N(C1- 8알킬-R9)2, -SO2-(C1- 8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 선택되고; 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴은 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 환 탄소 원자를 통해 하나의 위치에서 아자인돌 질소 원자에 결합되며;
R5는 수소, -O-(C1- 8)알킬, -O-(C1- 8)알킬-OH, -O-(C1- 8)알킬-O-(C1- 8)알킬, -O-(C1-8)알킬-NH2, -O-(C1- 8)알킬-NH(C1- 8알킬), -O-(C1- 8)알킬-N(C1- 8알킬)2, -O-(C1- 8)알킬-S-(C1-8)알킬, -O-(C1- 8)알킬-SO2-(C1- 8)알킬, -O-(C1- 8)알킬-SO2-NH2, -O-(C1- 8)알킬-SO2-NH(C1-8알킬), -O-(C1- 8)알킬-SO2-N(C1- 8알킬)2, -O-C(O)H, -O-C(O)-(C1- 8)알킬, -O-C(O)-NH2, -O-C(O)-NH(C1- 8알킬), -O-C(O)-N(C1- 8알킬)2, -O-(C1- 8)알킬-C(O)H, -O-(C1-8)알킬-C(O)-(C1-8)알킬, -O-(C1- 8)알킬-CO2H, -O-(C1- 8)알킬-C(O)-O-(C1- 8)알킬, -O-(C1-8)알킬-C(O)-NH2, -O-(C1- 8)알킬-C(O)-NH(C1- 8알킬), -O-(C1- 8)알킬-C(O)-N(C1- 8알킬)2, -C(O)H, -C(O)-(C1- 8)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1- 8)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬), -C(O)-N(C1- 8알킬)2, -SH, -S-(C1- 8)알킬, -S-(C1- 8)알킬-S-(C1- 8)알킬, -S-(C1- 8)알킬-O-(C1- 8)알킬, -S-(C1- 8)알킬-O-(C1- 8)알킬-OH, -S-(C1- 8)알킬-O-(C1-8)알킬-NH2, -S-(C1- 8)알킬-O-(C1- 8)알킬-NH(C1- 8알킬), -S-(C1- 8)알킬-O-(C1- 8)알킬-N(C1-8알킬)2, -S-(C1- 8)알킬-NH(C1- 8알킬), -SO2-(C1- 8)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1- 8알킬), -SO2-N(C1- 8알킬)2, -N-R7, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로, 옥소, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이고;
R6는 수소, -C1- 8알킬, -C2- 8알케닐, -C2- 8알키닐, -C(O)H, -C(O)-(C1- 8)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1- 8)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1- 8알킬), -C(O)-N(C1-8)알킬)2, -SO2-(C1- 8)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1- 8알킬), -SO2-N(C1- 8알킬)2, -(C1- 8)알킬-N-R7, -(C1- 8)알킬-(할로)1-3, -(C1- 8)알킬-OH, -아릴-R8, -(C1- 8)알킬-아릴-R8 및 -(C1-8)알킬-헤테로아릴-R8으로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 결합된 1개 내지 4개의 치환기이나; 단, R6가 탄소 원자에 결합되면, R6는 추가로 -C1- 8알콕시, -(C1- 8)알콕시-(할로)1-3, -SH, -S-(C1- 8)알킬, -N-R7, 시아노, 할로, 하이드록시, 니트로, 옥소 및 -헤테로아릴-R8으로 구성되는 그룹 중에서 선택되며;
R7은 수소, -C1- 8알킬, -C2- 8알케닐, -C2- 8알키닐, -(C1- 8)알킬-OH, -(C1- 8)알킬-O-(C1-8)알킬, -(C1- 8)알킬-NH2, -(C1- 8)알킬-NH(C1- 8알킬), -(C1- 8)알킬-N(C1- 8알킬)2, -(C1-8)알킬-S-(C1-8)알킬, -C(O)H, -C(O)-(C1- 8)알킬, -C(O)-O-(C1- 8)알킬, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬), -C(O)-N(C1- 8알킬)2, -SO2-(C1- 8)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1- 8알킬), -SO2-N(C1- 8알킬)2, -C(N)-NH2, -사이클로알킬-R8, -(C1- 8)알킬-헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8, -(C1- 8)알킬-아릴-R8 및 -(C1- 8)알킬-헤테로아릴-R8으로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 2개의 치환기이고;
R8은 수소, -C1- 8알킬, -(C1- 8)알킬-(할로)1-3 및 -(C1- 8)알킬-OH로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 결합된 1개 내지 4개의 치환기이나; 단, R8이 탄소 원자에 결합되면, R8은 추가로 -C1- 8알콕시, -NH2, -NH(C1- 8알킬), -N(C1- 8알킬)2, 시아노, 할로, -(C1- 8)알콕시-(할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성되는 그룹 중에서 선택되며;
R9은 수소, -C1- 8알콕시, -NH2, -NH(C1- 8알킬), -N(C1- 8알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이고;
R2는 수소, -C1- 8알킬-R5, -C2- 8알케닐-R5, -C2- 8알키닐-R5, -C(O)H, -C(O)-(C1- 8)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1- 8알킬-R9), -C(O)-N(C1- 8알킬-R9)2, -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -CO2H, -C(O)-O-(C1- 8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1- 8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -아릴-R6 및 -(C1- 8)알킬-N-R7으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 결합된 1개의 치환기이나; 단, R2가 탄소 원자에 결합되면, R2는 추가로 -C1- 8알콕시-R5, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, 옥소, -헤테로사이클릴-R6 및 -헤테로아릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 선택되며;
R3는 수소, -C1- 8알킬-R10, -C2- 8알케닐-R10, -C2- 8알키닐-R10, -C1- 8알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1- 8)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1- 8알킬-R9), -C(O)-N(C1- 8알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1- 8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1- 8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8으로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 결합된 1개 내지 3개의 치환기이고;
R4는 수소, -C1- 8알킬-R10, -C2- 8알케닐-R10, -C2- 8알키닐-R10, -C1- 8알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1- 8)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1- 8알킬-R9), -C(O)-N(C1- 8알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1- 8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SH, -S-(C1-8)알킬-R10, -SO2-(C1- 8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1- 8알킬-R9), -SO2-N(C1-8알킬-R9)2, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8으로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 결합된 1개 내지 4개의 치환기이며;
R10은 수소, -NH2, -NH(C1- 8알킬), -N(C1- 8알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로 및 옥소로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이고;
Y 및 Z는 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되나; 단, Y 및 Z 중 하나는 O이고, 다른 하나는 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성되는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 R이 Ra, -C1- 4알킬-Ra, -C2- 4알케닐-Ra, -C2- 4알키닐-Ra 및 시아노로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 실시 형태는 Ra가 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, Ra는 다이하이드로-피라닐, 페닐, 나프틸, 티에닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 아자인돌릴, 인다졸릴, 벤조푸릴, 벤조티에닐, 다이벤조푸릴 및 다이벤조티에닐로 구성되는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 R1이 수소, -C1- 4알킬-R5, -C2- 4알케닐-R5, -C2- 4알키닐-R5, -C(O)-(C1- 4)알킬-R9, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-O-(C1- 4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -C(O)-NH(C1-4알킬-R9), -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-N(C1- 4알킬-R9)2, -SO2-(C1- 4)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 선택되며; 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 환 탄소 원자를 통해 하나의 위치에서 아자인돌 질소 원자에 결합되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R1은 수소, -C1- 4알킬-R5, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 선택되며; 여기서, 헤테로아릴은 헤테로아릴 환 탄소 원자를 통해 하나의 위치에서 아자인돌 질소 원자에 결합된다.
일 실시 형태에서, R1은 수소, -C1- 4알킬-R5 및 -나프틸-R6로 구성되는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 R5가 수소, -O-(C1- 4)알킬, -O-(C1- 4)알킬-OH, -O-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬, -O-(C1- 4)알킬-NH2, -O-(C1- 4)알킬-NH(C1- 4알킬), -O-(C1- 4)알킬-N(C1-4알킬)2, -O-(C1- 4)알킬-S-(C1- 4)알킬, -O-(C1- 4)알킬-SO2-(C1- 4)알킬, -O-(C1- 4)알킬-SO2-NH2, -O-(C1- 4)알킬-SO2-NH(C1- 4알킬), -O-(C1- 4)알킬-SO2-N(C1- 4알킬)2, -O-C(O)H, -O-C(O)-(C1-4)알킬, -O-C(O)-NH2, -O-C(O)-NH(C1- 4알킬), -O-C(O)-N(C1- 4알킬)2, -O-(C1-4)알킬-C(O)H, -O-(C1- 4)알킬-C(O)-(C1- 4)알킬, -O-(C1- 4)알킬-CO2H, -O-(C1- 4)알킬-C(O)-O-(C1-4)알킬, -O-(C1- 4)알킬-C(O)-NH2, -O-(C1- 4)알킬-C(O)-NH(C1- 4알킬), -O-(C1-4)알킬-C(O)-N(C1-4알킬)2, -C(O)H, -C(O)-(C1- 4)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1- 4)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1- 4알킬), -C(O)-N(C1- 4알킬)2, -SH, -S-(C1- 4)알킬, -S-(C1-4)알킬-S-(C1-4)알킬, -S-(C1- 4)알킬-O-(C1- 4)알킬, -S-(C1- 4)알킬-O-(C1- 4)알킬-OH, -S-(C1- 4)알킬-O-(C1- 4)알킬-NH2, -S-(C1- 4)알킬-O-(C1- 4)알킬-NH(C1- 4알킬), -S-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬-N(C1-4알킬)2, -S-(C1- 4)알킬-NH(C1- 4알킬), -SO2-(C1- 4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1- 4알킬), -SO2-N(C1- 4알킬)2, -N-R7, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로, 옥소, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R5는 수소, -O-(C1- 4)알킬, -N-R7, 하이드록시 및 -헤테로아릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이다.
일 실시 형태에서, R5는 수소, -O-(C1- 4)알킬, -N-R7, 하이드록시, -이미다졸릴-R6, -트라이아졸릴-R6 및 -테트라졸릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이다.
본 발명의 실시 형태는 R6가 수소, -C1- 4알킬, -C2- 4알케닐, -C2- 4알키닐, -C(O)H, -C(O)-(C1- 4)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1- 4)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬), -C(O)-N(C1-4)알킬)2, -SO2-(C1- 4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1- 4알킬), -SO2-N(C1- 4알킬)2, -(C1- 4)알킬-N-R7, -(C1- 4)알킬-(할로)1-3, -(C1- 4)알킬-OH, -아릴-R8, -(C1- 4)알킬-아릴-R8 및 -(C1- 4)알킬-헤테로아릴-R8로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 결합된 1개 내지 4개의 치환기이나; 단, R6가 탄소 원자에 결합되면, R6가 추가로 -C1- 4알콕시, -(C1- 4)알콕시-(할로)1-3, -SH, -S-(C1-4)알킬, -N-R7, 시아노, 할로, 하이드록시, 니트로, 옥소 및 -헤테로아릴-R8으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R6는 수소이다.
본 발명의 실시 형태는 R7이 수소, -C1- 4알킬, -C2- 4알케닐, -C2- 4알키닐, -(C1-4)알킬-OH, -(C1- 4)알킬-O-(C1- 4)알킬, -(C1- 4)알킬-NH2, -(C1- 4)알킬-NH(C1- 4알킬), -(C1-4)알킬-N(C1-4알킬)2, -(C1- 4)알킬-S-(C1- 4)알킬, -C(O)H, -C(O)-(C1- 4)알킬, -C(O)-O-(C1-4)알킬, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1- 4알킬), -C(O)-N(C1- 4알킬)2, -SO2-(C1- 4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1- 4알킬), -SO2-N(C1- 4알킬)2, -C(N)-NH2, -사이클로알킬-R8, -(C1-4)알킬-헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8, -(C1- 4)알킬-아릴-R8 및 -(C1- 4)알킬-헤테로아릴-R8으로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 2개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R7은 수소, -C1- 4알킬, -C(O)H, -C(O)-(C1- 4)알킬, -C(O)-O-(C1-4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1- 4알킬) 및 -SO2-N(C1- 4알킬)2로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 2개의 치환기이다.
본 발명의 실시 형태는 R8이 수소, -C1- 4알킬, -(C1- 4)알킬-(할로)1-3 및 -(C1- 4)알킬-OH로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 결합된 1개 내지 4개의 치환기이나; 단, R8이 탄소 원자에 결합되면, R8이 추가로 -C1- 4알콕시, -NH2, -NH(C1- 4알킬), -N(C1- 4알킬)2, 시아노, 할로, -(C1- 4)알콕시-(할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R8은 수소이다.
본 발명의 실시 형태는 R9이 수소, -C1- 4알콕시, -NH2, -NH(C1- 4알킬), -N(C1- 4알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R9은 수소이다.
본 발명의 실시 형태는 R2가 수소, -C1- 4알킬-R5, -C2- 4알케닐-R5, -C2- 4알키닐-R5, -C(O)H, -C(O)-(C1- 4)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1- 4알킬-R9), -C(O)-N(C1- 4알킬-R9)2, -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -CO2H, -C(O)-O-(C1- 4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1- 4)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -아릴-R6 및 -(C1- 4)알킬-N-R7으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 결합된 1개의 치환기이나; 단, R2가 탄소 원자에 결합되면, R2가 -C1- 4알콕시-R5, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, 옥소, -헤테로사이클릴-R6 및 -헤테로아릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R2는 수소, -C1- 4알킬-R5, -C2- 4알케닐-R5, -C2- 4알키닐-R5, -CO2H, -C(O)-O-(C1- 4)알킬-R9, -사이클로알킬-R6, -아릴-R6 및 -(C1- 4)알킬-N-R7으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 결합된 1개의 치환기이나; 단, R2가 질소 원자에 결합되면, 쿼터늄 염 (quaternium salt)은 형성되지 않고; R2가 탄소 원자에 결합되면, R2는 추가로 -C1- 4알콕시-R5, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, 옥소, -헤테로사이클릴-R6 및 -헤테로아릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 선택된다.
일 실시 형태에서, R2는 수소, -C1- 4알킬-R5 및 -아릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 결합된 1개의 치환기이나; 단, R2가 질소 원자에 결합되면, 쿼터늄 염은 형성되지 않고; R2가 탄소 원자에 결합되면, R2는 추가로 -N-R7, 할로겐, 하이드록시 및 -헤테로아릴-R6로 구성되는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 R3가 수소, -C1- 4알킬-R10, -C2- 4알케닐-R10, -C2- 4알키닐-R10, -C1- 4알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1- 4)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1- 4알킬-R9), -C(O)-N(C1- 4알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1- 4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1- 8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -N-R7, -(C1- 4)알킬-N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8으로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 결합된 1개 내지 3개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R3는 수소, -C1- 4알킬-R10, -C2- 4알케닐-R10, -C2- 4알키닐-R10, -C1-4알콕시-R10, -C(O)H, -CO2H, -NH2, -NH(C1- 4알킬), -N(C1- 4알킬)2, 시아노, 할로겐, 하이드록시 및 니트로로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 탄소 원자에 결합된 1개의 치환기이다.
일 실시 형태에서, R3는 수소, -C1- 4알킬-R10, -NH2, -NH(C1- 4알킬), -N(C1- 4알킬)2, 할로겐 및 하이드록시로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 탄소 원자에 결합된 1개의 치환기이다.
본 발명의 실시 형태는 R4가 수소, -C1- 4알킬-R10, -C2- 4알케닐-R10, -C2- 4알키닐-R10, -C1- 4알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1- 4)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1- 4알킬-R9), -C(O)-N(C1- 4알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1- 4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SH, -S-(C1- 4)알킬-R10, -SO2-(C1- 4)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1- 4알킬-R9), -SO2-N(C1- 4알킬-R9)2, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8으로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 결합된 1개 내지 4개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R4는 수소, -C1- 4알킬-R10, -C2- 4알케닐-R10, -C2- 4알키닐-R10, -C1-4알콕시-R10, -C(O)H, -CO2H, -NH2, -NH(C1- 4알킬), -N(C1- 4알킬)2, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬, -헤테로사이클릴, -아릴 및 -헤테로아릴로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 결합된 1개 내지 4개의 치환기이다.
일 실시 형태에서, R4는 수소, C1- 4알킬-R10, C1- 4알콕시-R10, -NH2, -NH(C1- 4알킬), -N(C1- 4알킬)2, 할로겐 및 하이드록시로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 결합된 1개 내지 4개의 치환기이다.
일 실시 형태에서, R4는 수소, C1- 4알킬-R10, C1- 4알콕시-R10, -NH2, -NH(C1- 4알킬), -N(C1- 4알킬)2, 염소, 불소 및 하이드록시로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 결합된 1개 내지 4개의 치환기이다.
본 발명의 실시 형태는 R10이 수소, -NH2, -NH(C1- 4알킬), -N(C1- 4알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로 및 옥소로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R10은 수소 및 (할로)1- 3로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이다.
일 실시 형태에서, R10은 수소 및 (플루오로)3로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이다.
본 발명의 실시 형태는 Y 및 Z가 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되나; 단, Y 및 Z 중 하나가 O이고, 다른 하나가 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, Y 및 Z는 O 및 (H,H)로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되나; 단, Y 및 Z 중 하나는 O이고, 다른 하나는 O 및 (H,H)로 구성되는 그룹 중에서 선택된다.
일 실시 형태에서, Y 및 Z는 O로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 (II)의 화합물은 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 동일 출원인에 의한 미국 특허 제7,125,878호에 개시되어 있다.
본 발명의 일례는 하기로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다:
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00014
본 발명의 일례는 하기로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다:
Figure pat00015
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (III)의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 이의 염이다:
[화학식 III]
Figure pat00016
상기 식에서,
A 및 E는 수소 치환된 탄소 원자 및 질소 원자로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되며;
Figure pat00017
는 1H-인돌, 1H-피롤로[2,3-b]피리딘, 1H-피라졸로[3,4-b]피리딘 및 1H-인다졸로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
Z는 O로부터 선택되거나;
Z는 다이하이드로로부터 선택되며; 각각의 수소 원자는 단일 결합에 의해 결합되며;
R4 및 R5는 옥소로 임의로 치환된 C1- 8알킬, C2- 8알케닐 및 C2- 8알키닐 중에서 독립적으로 선택되고;
R2는 -C1- 8알킬-, -C2- 8알케닐-, -C2- 8알키닐-, -O-(C1- 8)알킬-O-, -O-(C2- 8)알케닐-O-, -O-(C2- 8)알키닐-O-, -C(O)-(C1- 8)알킬-C(O)- (여기서, 상술한 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결기는 C1- 8알킬, C1- 8알콕시, C1- 8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, -C(O)O-(C1- 8)알킬, -C1- 8알킬-C(O)O-(C1- 8)알킬, 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 할로겐, (할로)1- 3(C1-8)알킬, (할로)1- 3(C1-8)알콕시, 하이드록시, 하이드록시(C1-8)알킬 및 옥소로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환된 직선상 탄소 쇄이고; 상술한 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결기는 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬, 헤테로아릴(C1-8)알킬, 스피로사이클로알킬 및 스피로헤테로사이클릴 (여기서, 상술한 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기 중 어느 하나는 C1- 8알킬, C1- 8알콕시, C1- 8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 할로겐, (할로)1- 3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 상술한 헤테로사이클릴 치환기 중 어느 하나는 옥소로 임의로 치환된다)로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기로 임의로 치환된다), 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 (여기서, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 C1- 8알킬, C1- 8알콕시, C1- 8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 할로겐, (할로)1- 3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환된다), -(O-(CH2)1- 6)0 -5-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -(O-(CH2)1- 6)0 -5-NR6-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-, -(O-(CH2)1- 6)0 -5-S-, -O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-, -NR6-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-, -NR6-C(O)-, -C(O)-NR6-, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-, -NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-, -NR6-C(O)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7- 및 -SO2- (여기서, R6, R7 및 R8은 수소, C1- 8알킬, C1- 8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 하이드록시(C1-8)알킬, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬 및 헤테로아릴(C1-8)알킬 (여기서, 상술한 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기는 C1- 8알킬, C1- 8알콕시, C1- 8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 할로겐, (할로)1- 3(C1-8)알킬, (할로)1- 3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환된다)로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택된다)로 구성되는 그룹 중에서 선택되나; 단, A 및 E가 수소 치환된 탄소 원자로부터 선택되면, R2는 -C2- 8알키닐-, -O-(C1- 8)알킬-O-, -O-(C2- 8)알케닐-O-, -O-(C2-8)알키닐-O-, -C(O)-(C1- 8)알킬-C(O)- (여기서, 상술한 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결기는 C1- 8알킬, C1- 8알콕시, C1- 8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, -C(O)O-(C1- 8)알킬, -C1- 8알킬-C(O)O-(C1- 8)알킬, 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 할로겐, (할로)1- 3(C1-8)알킬, (할로)1- 3(C1-8)알콕시, 하이드록시, 하이드록시(C1-8)알킬 및 옥소로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환된 직선상 탄소 쇄이고; 상술한 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결기는 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬, 헤테로아릴(C1-8)알킬, 스피로사이클로알킬 및 스피로헤테로사이클릴 (여기서, 상술한 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기 중 어느 하나는 C1- 8알킬, C1- 8알콕시, C1- 8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 할로겐, (할로)1- 3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 상술한 헤테로사이클릴 치환기 중 어느 하나는 옥소로 임의로 치환된다)로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기로 임의로 치환된다), 사이클로알킬 (여기서, 사이클로알킬은 C1- 8알킬, C1- 8알콕시, C1- 8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 할로겐, (할로)1- 3(C1-8)알킬, (할로)1- 3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환된다), -(O-(CH2)1-6)1-5-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -(O-(CH2)1-6)1-5-NR6-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-, -(O-(CH2)1-6)0-5-S-, -O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-, -NR9-C(O)-, -C(O)-NR9-, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-, -NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-, -NR6-C(O)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S- 및 -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7- (여기서, R6, R7 및 R8은 수소, C1- 8알킬, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 하이드록시(C1-8)알킬, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬 및 헤테로아릴(C1-8)알킬 (여기서, 상술한 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기는 C1- 8알킬, C1- 8알콕시, C1- 8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 할로겐, (할로)1- 3(C1-8)알킬, (할로)1- 3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환된다)로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; R9은 C1- 8알킬, C1- 8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 하이드록시(C1-8)알킬, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬 및 헤테로아릴(C1-8)알킬 (여기서, 상술한 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기는 C1- 8알킬, C1- 8알콕시, C1- 8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 할로겐, (할로)1- 3(C1-8)알킬, (할로)1- 3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환된다)로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택된다)로 구성되는 그룹 중에서 선택되며;
R1 및 R3는 수소, C1- 8알킬, C2- 8알케닐, C2- 8알키닐 (여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 C1- 8알콕시, 알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), (할로)1-3, (할로)1- 3(C1-8)알킬, (할로)1- 3(C1-8)알콕시, 하이드록시, 하이드록시(C1-8)알킬 및 옥소로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환기로 임의로 치환된다), C1- 8알콕시, C1- 8알콕시카르보닐, (할로)1- 3(C1-8)알콕시, C1-8알킬티오, 아릴, 헤테로아릴 (여기서, 아릴 및 헤테로아릴은 C1- 8알킬, C1- 8알콕시, 알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서 아미노는 수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환된다), 할로겐, (할로)1- 3(C1-8)알킬, (할로)1- 3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 치환기로 임의로 치환된다), 아미노 (수소 및 C1- 4알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 시아노, 할로겐, 하이드록시 및 니트로로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택된다.
일 실시 형태에서, 화학식 (III)의 화합물은 하기로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화합물 및 약제학적으로 하용가능한 이의 염이다:
Figure pat00018
Figure pat00019
상기 식에서, 모든 다른 변수는 이전에 정의한 바와 같다.
일 실시 형태에서, 화학식 (III)의 화합물은 하기로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화합물 및 약제학적으로 하용가능한 이의 염이다:
Figure pat00020
상기 식에서, 모든 다른 변수는 이전에 정의한 바와 같다.
화학식 (III)의 화합물은 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 동일 출원인에 의한 미국 특허 제6,828,327호에 개시되어 있다.
본 발명의 일례는 하기로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화학식 (III)의 화합물을 포함한다:
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
Figure pat00024
본 발명의 일례는 하기로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화학식 (III)의 화합물을 포함한다:
Figure pat00025
본 발명의 다른 예는 하기로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화합물을 포함한다:
Figure pat00026
Figure pat00027
Figure pat00028
Figure pat00029
본 발명의 다른 예는 하기로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화합물을 포함한다:
Figure pat00030
Figure pat00031
Figure pat00032
Figure pat00033
본 발명의 방법에 따른 처리에 적합한 세포
본 발명에 사용하기에 적합한 다능성 세포는 ABCG2, 크립토 (cripto), FoxD3, 커넥신 (Connexin)43, 커넥신45, Oct4, SOX-2, 나노그, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, 및 Tra1-81로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하기 다능성 마커 중 적어도 하나를 발현한다.
일 실시 형태에서, 다능성 세포는 배아 줄기 세포이다. 다른 실시 형태에서, 다능성 세포는 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포이다. 일 실시 형태에서, 배아 줄기 세포는 인간이다.
인간 배아 줄기 세포의 단리, 발현 및 배양
인간 배아 줄기 세포의 특성화: 인간 배아 줄기 세포는 단계 특이적 배아 항원 (SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). 시험관 내에서의 인간 배아 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra- 1-60, 및 Tra-1-81 발현 (존재한다면)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 인간 배아 줄기 세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (Vector Laboratories, Burlingame Calif.)가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드 (Vector Red)를 이용하여 현상함으로써 검출될 수 있다. 미분화된 다능성 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출된 Oct-4 및 TERT를 발현한다.
번식된 인간 배아 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직으로 분화할 가능성이 있다. 인간 배아 줄기 세포의 다능성은 예를 들어, 세포를 SCID 마우스에 주사하여, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정시킨 다음에, 삼배엽층으로부터의 세포형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배양체 (embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
번식된 인간 배아 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하여, 대응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며, 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
인간 배아 줄기 세포 공급원: 사용될 수 있는 인간 줄기 세포형은 전배아 (pre-embryonic) 조직 (예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 중에, 그러나 전형적으로 반드시 약 10 내지 12 주간의 임신 전이 아닌 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후에 형성된 조직으로부터 유래된 수립된 인간 배아 세포주를 포함한다. 비제한적인 예로는 수립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아 생식 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 다능성 세포일 것이다. 영양세포의 부재하에서 이미 배양된 다능성 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (BresaGen (Athens, GA))가 또한 적합하다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨 (Thomson) 등에 의해 문헌 [참조: 미국 특허 제5,843,780호; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995]에 기재된 바와 같이 제조된다.
인간 배아 줄기 세포의 배양: 일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포가 기본적으로 영양세포를 포함하지 않는 배양계에서 배양되지만, 그렇다 하더라도 실질적인 분화를 행하지 않고, 인간 배아 줄기 세포 증식을 지지한다. 영양세포를 포함하지 않는 배양액 중에서의 분화 없는 인간 배아 줄기 세포의 성장은 미리 다른 세포형을 사용하여 배양함으로써 조절된 배지를 사용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양액 중에서 분화 없는 인간 배아 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 사용하여 지지된다.
다른 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 다양한 방법으로 인간 배아 줄기 세포를 지지하는 영양세포의 초기 배양층이다. 그 다음에, 인간 배아 줄기 세포는 기본적으로 영양세포를 포함하지 않는 배양계로 이동되지만, 그렇다 하더라도 실질적인 분화를 행하지 않고, 인간 배아 줄기 세포 증식을 지지한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 조절된 배지의 예는 US20020072117, US6642048, WO2005014799, 및 문헌 [참조: Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004)]에 개시되어 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 화학적 규명 배지의 일례는 US20070010011에 발견될 수 있다.
적절한 배지는 하기 성분들, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM), Gibco # 11965-092; 녹아웃 (Knockout) 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), Gibco # 10829-018; 햄 (Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, Gibco # 15039-027; 비필수 아미노산 용액, Gibco 11140-050; β-메르캅토에탄올, Sigma # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), Gibco # 13256-029로부터 제조될 수 있다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 본 발명의 방법에 따라 처리되기 전에 처리된 적절한 배양 기질에 플레이팅된다. 일 실시 형태에서, 처리는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막에서 유래되거나 또는 접착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시 형태에서, 적절한 배양 기질은 매트리젤 (Matrigel)® (Becton Dickenson)이다. 매트리젤®은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐 (Engelbreth-Holm-Swarm) 종양 세포 유래의 가용성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
인간 배아 줄기 세포는 바람직한 특성을 갖는 세포 생존, 번식, 및 유지를 증진하는 배지의 존재하에 적절한 분포로 기질에 플레이팅될 수 있다. 모든 이들 특성은 시딩 분포에 세심한 주의를 기울여 이익을 얻으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포의 단리, 발현 및 배양
일 실시 형태에서, 다능성 마커를 발현하는 세포는,
a. 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 인간 배아 줄기 세포를 완성 내배엽 세포의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
c. 세포를 제거하고, 이어서 세포를 배양하기 전에, 세포를 단백질 또는 세포외 매트릭스로 전처리되지 않은 조직 배양 기질에서 저산소 조건하에 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된다.
일 실시 형태에서, 다능성 마커를 발현하는 세포는,
a. 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계, 및
b. 세포를 제거하고, 이어서 세포를 단백질 또는 세포외 매트릭스로 전처리되지 않은 조직 배양 기질에서 저산소 조건하에 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된다.
단백질 또는 세포외 매트릭스로 전처리되지 않은 조직 배양 기질에서의 저산소 조건하에서의 세포 배양
일 실시 형태에서, 세포는 세포외 매트릭스로 코팅되지 않은 조직 배양 기질에서 약 1 내지 약 20 일간 저산소 조건하에 배양된다. 다른 실시 형태에서, 세포는 세포외 매트릭스로 코팅되지 않은 조직 배양 기질에서 약 5 내지 약 20 일간 저산소 조건하에 배양된다. 다른 실시 형태에서, 세포는 세포외 매트릭스로 코팅되지 않은 조직 배양 기질에서 약 15 일간 저산소 조건하에 배양된다.
일 실시 형태에서, 저산소 조건은 약 1% O2 내지 약 20% O2이다. 다른 실시 형태에서, 저산소 조건은 약 2% O2 내지 약 10% O2이다. 다른 실시 형태에서, 저산소 조건은 약 3% O2이다.
세포는 혈청, 액티빈 (activin) A, 및 Wnt 리간드를 포함하는 배지 중에서 단백질 또는 세포외 매트릭스로 전처리되지 않은 조직 배양 기질에서 저산소 조건하에 배양된다. 대안적으로, 배지는 또한 IGF-1을 포함할 수 있다.
배지는 혈청 농도가 약 2% 내지 약 5%의 범위일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 혈청 농도는 약 2%일 수 있다.
액티빈 A는 약 1 pg/mL 내지 약 100 μg/mL의 농도로 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/mL 내지 약 1 μg/mL일 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/mL 내지 약 100 ng/mL일 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 농도는 약 50 ng/mL 내지 약 100 ng/mL일 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 농도는 약 100 ng/mL일 수 있다.
Wnt 리간드는 Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a 및 Wnt-7a로 구성되는 그룹 중에서 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-1이다. 다른 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-3a이다.
Wnt 리간드는 약 1ng/mL 내지 약 1000 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, Wnt 리간드는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, Wnt 리간드의 농도는 약 20 ng/mL이다.
IGF-1은 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, IGF-1은 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, IGF-1의 농도는 약 50 ng/mL이다.
본 발명의 방법에 의해 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포는 단백질 또는 세포외 매트릭스로 전처리되지 않은 조직 배양 기질에서 저산소 조건하에 배양액 중에서 증가될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포는 ABCG2, 크립토, FoxD3, 커넥신43, 커넥신45, Oct4, SOX-2, 나노그, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, 및 Tra1-81로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 다능성 마커 중 적어도 하나를 발현한다.
완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 추가의 분화
완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 문헌 [참조: D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민으로 처리한 다음에, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 그 후에 세포를 레티노산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이러한 방법의 일례는 문헌 [참조: D' Amour et al, Nature Biotechnology, 24: 1392-1401, (2006)]에 개시되어 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커는 Pdx1, HNF-1베타, PTF1a, HNF-6, HB9 및 PROX1로 구성되는 그룹 중에서 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 한 측면에서, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 추가의 분화
췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 문헌 [참조: D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커는 NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, 및 PTF-1 알파로 구성되는 그룹 중에서 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 한 측면에서, 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 Pdx1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. 본 발명의 한 측면에서, β 세포 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 검출
완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 형성은 특정 프로토콜을 이행하기 전후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다. 다능성 줄기 세포는 전형적으로 그러한 마커를 발현하지 않는다. 따라서, 다능성 세포의 분화는 세포가 그들을 발현하기 시작할 때에 검출된다.
분화 효율은 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정될 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 하이브리다이제이션 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참조), 및 면역분석, 예컨대 재료 단편의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅, 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우, 유세포 분석 (FACS) (예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참조)을 포함한다.
특정한 단백질 마커를 검출하는데 유용한 항체의 예는 표 IA에 나타나 있다. 표 IA에 나타낸 항체에 의해 인식되는 동일한 마커에 관한 대체 항체가 이용가능하거나, 용이하게 개발될 수 있음을 주목해야 한다. 이러한 대체 항체는 또한 본 발명에 따라 단리된 세포에서 마커의 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 다능성 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 다능성 줄기 세포의 추가 특징은 계속 확인되고 있다. 다능성 줄기 세포 마커는 예를 들어, 하기 중 하나 이상의 발현을 포함한다: ABCG2, 크립토, FoxD3, 커넥신43, 커넥신45, Oct4, Sox2, 나노그, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
다능성 줄기 세포를 본 발명의 방법으로 처리한 후, 분화된 세포는 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내배엽 계통 특이적 마커는 예를 들어, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1베타와 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
분화 효율은 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 하이브리다이제이션 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참조), 및 면역분석, 예컨대 재료 단편의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅, 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우, 유세포 분석 (FACS) (예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참조)을 포함한다.
특정한 단백질 마커를 검출하는데 유용한 항체의 예는 표 IA에 나타나 있다. 표 IA에 나타낸 항체에 의해 인식되는 동일한 마커에 관한 대체 항체가 이용가능하거나, 용이하게 개발될 수 있음을 주목해야 한다. 이러한 대체 항체는 또한 본 발명에 따라 단리된 세포에서 마커의 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내분비 계통의 세포의 특징을 나타내는 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내분비 계통 특이적 마커는 예를 들어, NGN-3, NeuroD, Islet-1과 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
β 세포 계통의 세포의 특징을 나타내는 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, β 세포 계통의 특징을 나타내는 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 β-세포 계통의 특징을 나타내는 특성을 획득했는지를 확인하는데 사용될 수 있다. β 세포 계통 특이적 특징은 예를 들어, 그 중에서도 특히 Pdx1 (췌장 및 십이지장 호메오박스 유전자-1), Nkx2.2, Nkx6.1, Isl1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnf1b, Hnf-6, Hnf-3베타, 및 MafA와 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다. 이들 전사 인자는 내분비 세포의 확인을 위해 당업계에 잘 수립되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002))]을 참조한다.
분화 효율은 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다. 대안적으로, 분화 효율은 β 세포 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 하이브리다이제이션 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참조), 및 면역분석, 예컨대 재료 단편의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅, 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우, 유세포분석 (FACS) (예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참조)을 포함한다.
특정한 단백질 마커를 검출하는데 유용한 항체의 예는 표 IA에 나타나 있다. 표 IA에 나타낸 항체에 의해 인식되는 동일한 마커에 관한 대체 항체가 이용가능하거나, 용이하게 개발될 수 있음을 주목해야 한다. 이러한 대체 항체는 또한 본 발명에 따라 단리된 세포에서 마커의 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.
실시예 1
인간 배아 줄기 세포 배양
줄기 세포는 단일 세포 레벨에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직을 발생시키며, 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
인간 배아 줄기 세포주 H1, H7 및 H9을 위셀 리서치 인스티튜트, 인코포레이티드 (WiCell Research Institute, Inc. (Madison, WI))로부터 입수하였으며, 공급처인 상기 기관에 의해 제공된 설명서에 따라 배양하였다. 요약하면, 세포를 20% 녹아웃 혈청 대체물이 보충된 DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO), 100 nM MEM 비필수 아미노산, 0.5 mM 베타-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민 - 4 ng/mL 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)를 포함함 - (모두 Invitrogen/GIBCO로부터 입수)으로 이루어진 ES 세포 배지에서 마우스 배아 섬유아세포 (MEF) 영양세포에서 배양하였다. E13 내지 13.5 마우스 배아로부터 유래된 MEF 세포를 찰스 리버 (Charles River)로부터 구입하였다. MEF 세포를 10% FBS (Hyclone), 2 mM 글루타민, 및 100 mM MEM 비필수 아미노산이 보충된 DMEM 배지에서 증가시켰다. 서브컨플루언트 (sub-confluent) MEF 세포 배양액을 3시간 동안 10 ㎍/mL 마이토마이신 C (Sigma (St. Louis, MO))로 처리하여 세포 분열을 중지시키고, 이어서 트립신처리하여, 0.1% 소 젤라틴으로 코팅된 디쉬에 2x104/㎠로 플레이팅하였다. 2 내지 4 계대로부터의 MEF 세포를 영양세포층으로 사용하였다. MEF 세포 영양세포층 상에 플레이팅된 인간 배아 줄기 세포를 가습된 조직 배양 인큐베이터 내에서 5% CO2/의 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 컨플루언트일 때 (플레이팅 후 약 5 내지 7일), 인간 배아 줄기 세포를 5 내지 10분간 1 mg/mL의 제 IV 형 콜라게나아제 (Invitrogen/GIBCO)로 처리한 다음에, 5 mL 피펫을 이용하여 표면으로부터 부드럽게 긁어내었다. 세포를 5분간 900 rpm에서 회전시키고, 펠릿을 재현탁시켜, 신선한 배지에서 1:3 내지 1:4 비의 세포로 재플레이팅하였다.
동시에, H1, H7, 및 H9 인간 배아 줄기 세포를 1:30 희석율의 성장 인자가 감소된 매트리젤™ (BD Biosciences)로 코팅된 플레이트에 시딩하여, 8 ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 조절된 배지에서 배양하였다. 매트리젤™ 상에서 배양된 세포를 콜라게나아제 IV (Invitrogen/GIBCO), 디스파아제 (Dispase) (BD Biosciences) 또는 리베라아제 (Liberase) 효소 (Source)를 이용하여 일상적으로 계대시켰다. 인간 배아 줄기 세포 배양액 일부를 저산소 조건하에 (약 3% O2) 인큐베이션하였다.
실시예 2
인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포의 유래 및 배양
인간 배아 줄기 세포주 H1 및 H9의 여러 계대 (계대 30 내지 54)의 세포를 적어도 3 계대 동안 저산소 조건하에 (약 3% O2) 배양하였다. 실시예 1에 따라, 세포를 8 ng/mL bFGF가 보충된 MEF-CM에서 배양하여, 매트리젤로 코팅된 플레이트에 플레이팅하였다.
그 다음에, 세포를 0.5% FBS, 20 ng/mL WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, R&D Systems (MN)), 및 100 ng/mL 액티빈-A (R&D Systems (MN))가 보충된 DMEM/F12 배지로 2일간 처리한 다음에, 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈-A (AA)가 보충된 DMEM/F12 배지로 추가로 3 내지 4일간 처리하였다. 이러한 프로토콜에 의해, 완성 내배엽 마커가 상당히 상향 조절되었다.
그 다음에, 세포를 TrypLE™ 익스프레스 솔루션 (Express solution) (Invitrogen, CA)으로 5 분간 처리하였다. 유리된 세포를 DMEM-F12 + 2% FBS 배지에 재현탁시켜, 원심분리로 회수하여, 혈구계를 사용하여 카운트하였다. 유리된 세포를 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS)으로 처리된 플라스크에 1000 내지 10,000 세포/㎠로 시딩하여, 표준 조직 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 저산소 조건하에 (약 3% O2) DMEM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT-3A에서 배양하였다. TCPS 플라스크를 매트리젤 또는 다른 세포외 매트릭스 단백질로 코팅하지 않았다. 배지를 날마다 변경하였다. 일부의 배양에서는, 배지를 추가로 10-50 ng/mL의 IGF-I (인슐린 성장 인자-I (R&D Systems, MN)) 또는 1X ITS (인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄 (Invitrogen, CA))으로 보충하였다. 일부의 배양 조건에서, 기본 배지 (DM-F12 + 2% FBS)를 추가로 0.1 mM 메르캅토에탄올 (Invitrogen, CA) 및 비필수 아미노산 (1X, NEAA (Invitrogen, CA))으로 보충하였다.
5 내지 15 일간의 배양 후에, 상이한 세포 콜로니가 노화 시에 나타나는 다수의 확대 세포 (enlarged cell)로 둘러싸여 나타났다. 약 50 내지 60% 컨플루언스 (confluence)에서, 실온에서 5 분간 TrypLE™ 익스프레스 솔루션에 노출시켜 계대 배양시켰다. 유리된 세포를 DMEM-F12 + 2% FBS 배지에 재현탁시켜, 원심분리로 회수하여, DMEM-F12 + 2%FBS + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT-3A +/- 50 ng/mL의 IGF-I에서 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS)으로 처리된 플라스크에 10,000 세포/㎠로 시딩하였다. 이러한 배지는 "성장 배지"로도 명명될 것이다.
실시예 3
인간 배아 줄기 세포의 단세포 현탁액으로부터의 다능성 마커를 발현하는 세포의 유래
인간 배아 줄기 세포주 H1 P33 및 H9 P45의 세포를 적어도 3 계대 동안 저산소 조건하에 (약 3% O2) 배양하였다. 실시예 1에 따라, 세포를 8 ng/mL의 bFGF가 보충된 MEF-CM에서 배양하여, 매트리젤로 코팅된 플레이트에 플레이팅하였다. 약 60% 컨플루언스에서, 배양액을 5 분간 TrypLE™ 익스프레스 솔루션 (Invitrogen, CA)에 노출시켰다. 유리된 세포를 DMEM-F12 + 2% FBS 배지에 재현탁시켜, 원심분리로 회수하여, 혈구계를 사용하여 카운트하였다. 유리된 세포를 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS)으로 처리된 플라스크에 1000 내지 10,000 세포/㎠로 시딩하여, 표준 조직 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 저산소 조건하에 (약 3% O2) DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT-3A + 50 ng/mL의 IGF-I + 0.1 mM 메르캅토에탄올 (Invitrogen, CA) 및 비필수 아미노산 (1X, NEAA (Invitrogen, CA))에서 배양하였다. TCPS 플라스크를 매트리젤 또는 다른 세포외 매트릭스 단백질로 코팅하지 않았다. 배지를 날마다 변경하였다. 제 1 계대 세포는 P1으로 명명된다.
실시예 4
인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포의 증가에 유용한 다양한 성장 배지
인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포를 적어도 2 내지 30 계대 동안 하기 배지 조성물에서 성공적으로 배양하였다:
1. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT-3A
2. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT-3A + 50 ng/mL IGF-I
3. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT-3A + 10 ng/mL IGF-I
4. DM-F12 + 2% FBS + 50 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT-3A + 50 ng/mL IGF-I
5. DM-F12 + 2% FBS + 50 ng/mL AA + 10 ng/mL WNT-3A + 50 ng/mL IGF-I
6. DM-F12 + 2% FBS + 50 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT-3A + 10 ng/mL IGF-I
7. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL AA + 10 ng/mL WNT-3A + 10 ng/mL IGF-I
8. HEScGRO 규명 배지 (Chemicon, CA)
상기에 나타낸 배지의 기본 성분은 유사한 배지, 에컨대 RPMI, DMEM, CRML, 녹아웃™DMEM, 및 F12로 교체될 수 있다.
실시예 4
다능성 마커를 발현하는 세포 생존율에 대한 GSK - 3β 효소 활성 저해제의 효과
다능성 마커를 발현하는 세포의 유래 및 유지를 실시예 2에 기재된 바와 같이 행하였다. 세포를 2% FCS (Invitrogen), 100 ng/mL 액티빈 A, 20 ng/mL Wnt-3a, 및 50 ng/mL IGF (R&D Biosystems)가 보충된 DMEM:F12에서 성장시켰다. 세포를 팔콘 (Falcon) 폴리스티렌 플라스크에서 10,000 세포/㎠의 밀도로 시딩하여, 37℃, 5% CO2, 저산소에서 단층 배양액에서 성장시켰다. 60 내지 70% 컨플루언스에 도달한 후에, 단층을 PBS로 세정하고, TrypLE (Invitrogen)로 3 내지 5 분간 인큐베이션하여, 분리 및 단세포 분산시키도록 세포를 계대시켰다.
GSK-3B 효소 활성을 저해하는 이들의 능력에 대하여 선택된 소분자의 범용 라이브러리 (proprietary library)의 시험 화합물을 사용하여 스크리닝을 행하였다. 이러한 라이브러리의 화합물은 50mM HEPES, 30% DMSO 중에서의 96-웰 플레이트 포맷에서 1mM 스톡으로서 이용할 수 있었다. 분석을 위해, 다능성 마커를 발현하는 세포를 세정하고, 카운트하여, 96-웰 클리어-바텀, 다크-웰 플레이트 (Costar)에서 20,000 세포/웰의 시딩 밀도로 표준 배지에서 플레이팅하였다. 하룻밤 배양 시에 최적 단층 형성을 얻기 위해, 상기 시딩 밀도를 미리 측정하였다. 그 다음날에, 배지를 제거하고, 세포 단층을 PBS로 3회 린스하여, 시험 화합물을 80㎕ 분취량으로 웰에 첨가하였으며, 각각은 10μM의 최종 분석 농도로 분석 배지로 희석되었다. 분석 2 일째에, 배지를 각각의 웰로부터 제거하여, 분석 배지로 희석된 새로운 시험 화합물의 분취량으로 교체하였다. 배양 1 일째 및 2 일째의 분석 배지는 0.5% FCS 및 100ng/mL 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12로 구성되었다. 배양 3 일째 및 4 일째에, 배지를 각각의 웰로부터 제거하여, 2% FCS 및 100ng/mL 액티빈 A (시험 화합물 비함유)가 보충된 DMEM:F12로 교체하였다. 분석 4 일째에, MTS (Promega) 15μ를 각각의 웰에 첨가하고, 스펙트라맥스 (SpectraMax) (Molecular Devices) 인스트루먼트에서 490 ㎚에서 광학 밀도를 리딩하기 전에, 플레이트를 37℃에서 1.5 내지 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 평균, 표준 편차, 및 변동 계수로 구성되는 통계적 측정은 각각의 이중 세트에 대하여 계산하였다. 양성 대조군에 대한 각각의 시험 웰에 관하여 독성을 계산하였다 (웰을 배양 1일째 및 2일째에 액티빈 A 및 Wnt3a로 처리하였다).
표 II는 모든 스크리닝 결과의 편집이다. 상기 분석에서 다능성 마커를 발현하는 세포를 초기에 컨플루언트 단층으로서 플레이팅하였으므로, 결과는 4일간의 배양 기간에 걸친 독성 측정을 나타낸다. 결과는 대조군의 생존율로서 나타내며, 사용된 10μM 스크리닝 농도에서 일부의 화합물에 대한 가변 독성을 증명한다. 높은 비율의 화합물은 이러한 세포에 기초한 분석에서 최소 독성을 나타내거나 측정가능한 독성을 나타내지 않는다.
상술한 바와 같이 유사한 분석에서 다시 다능성 마커를 발현하는 세포를 사용하여, 선택 화합물의 작은 패널을 좁은 용량 적정 범위에 대하여 반복 시험하였다. 표 III는 이들 결과를 요약한 것으로, 다양한 독성 및 비독성 화합물에 대한 가변 용량 적정 효과를 증명한다.
실시예 5
하이컨텐트 스크리닝 분석을 이용하여 측정한 인간 배아 줄기 세포의 분화 및 증식에 대한 GSK-3β 효소 활성 저해제의 효과
인간 배아 줄기 세포 (H9 세포주)의 유지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 행하였다. 세포 콜로니를 평균적으로 4일 마다 계대하면서, 미분화 다능성 상태로 유지하였다. 세포 배양액을 10 내지 30 분간 37℃에서 콜라게나아제 용액 (1 mg/mL; Sigma-Aldrich)에 노출시킨 다음에, 피펫 팁으로 부드럽게 긁어내어, 세포 클러스터를 회수하여, 계대 배양을 행하였다. 클러스터를 중력에 의해 침강시킨 다음에, 세정하여, 잔류 콜라게나아제를 제거하였다. 세포 클러스터를 통상적인 유지 배양을 위해서는 1:3 비율 또는 즉각적인 분석을 위해서는 1:1 비율로 분할하였다. 사용된 인간 배아 줄기 세포주를 계대 50 미만의 계대 수로 유지하여, 통상적으로 정상 핵형 표현형 및 마이코플라스마 오염 결손을 평가하였다.
분석에 사용된 세포 클러스터를 표준 배지에 균등하게 재현탁시켜, 100㎕/웰의 체적으로 매트리젤로 코팅된 96-웰 팩커드 뷰플레이츠 (Packard VIEWPLATES) (PerkinElmer)에 플레이팅하였다. 8ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 조절된 배지를 초기 플레이팅 및 회수를 위해 사용하였다. 각각의 웰의 쓰고 난 배지를 흡인하여, 동일 체적의 새로운 배지로 교체함으로써 매일 공급을 행하였다. 플레이트를 분석 지속 기간을 통해 가습 박스에서 37℃, 5% CO2로 유지하였다.
GSK-3B 효소 활성을 저해하는 이들의 능력에 대하여 선택된 소분자의 범용 라이브러리의 시험 화합물을 사용하여 스크리닝을 행하였다. 이러한 라이브러리의 화합물은 50mM HEPES, 30% DMSO 중에서의 96-웰 플레이트 포맷에서 1mM 스톡으로서 이용할 수 있었다. 스크리닝 화합물을 삼중 또는 이중 세트로 시험하였다. 각각의 웰로부터 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 일차 스크리닝 분석을 개시하였다. 0.5% FCS (HyClone) 및 100ng/mL 액티빈 A (R&D Biosystems)에다가, 10μM 시험 화합물이 보충된 DMEM:F12 기본 배지 (Invitrogen)를 포함하는 80 내지 100㎕/웰의 시험 체적을 다시 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물 대신에 10-20ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 사용한 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 0.5% FCS 및 액티빈 A 단독 (AA 만)을 포함하거나, 그 대안으로는 액티빈 A 또는 Wnt3a (미처리)를 함유하지 않는 0.5% FCS를 포함하는 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 웰을 흡인하여, 동일한 용액을 다시 공급하였다. 3 및 4일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 2% FCS 및 100ng/mL 액티빈 A (시험 화합물 또는 Wnt3a를 함유하지 않음)가 보충된 DMEM:F12로 전환하고; 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS 및 액티빈 A 단독 (AA 만)을 포함하거나, 그 대안으로는 액티빈 A (미처리)를 함유하지 않는 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하였다.
배양 종료시에, 96-웰 플레이트의 세포를 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 20분간 0.5% 트리톤 (Triton) X-100으로 투과화 (permeabilization)하였다. 택일적으로, 세포를 -20℃에서 하룻밤 동안 얼음처럼 차가운 70% 에탄올로 고정시키고, PBS로 3회 세정한 다음에, 4℃에서 5분간 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 고정 및 투과화 후에, 세포를 다시 PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 30분간 PBS 중에서 4% 닭 혈청 (Invitrogen)으로 블로킹하였다. 일차 항체 (염소 항-인간 Sox17 및 염소 항-인간 HNF-3베타; R&D Systems)를 4% 닭 혈청에서 1:100로 희석하여, 실온에서 1 시간 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS로 3회 세정한 후에, 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 488으로 컨쥬게이트된 이차 항체 (닭 항-염소 IgG; Molecular Probes)를 PBS 중에서 1:200으로 희석하여 첨가하였다. 핵을 대비염색하기 위해, 5 mM 드래크 (Draq)5 (Alexis Biochemicals)를 실온에서 5분간 첨가하였다. 세포를 PBS로 1회 세정한 다음에, 이미징을 위해 100 mL/웰 PBS에 정치시켰다.
드래크5 및 알렉사 플루오르 488으로 염색된 세포에 대하여 이색성인 51008bs를 사용하여 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 이용하여, 세포를 이미징하였다. 양성 대조군 웰, 및 미처리 음성 대조군에 대해서만 수반되는 웰을 사용하여 노출 시간을 최적화하였다. 처리 및 염색 절차시에 임의의 세포 손실을 보상하기 위해 12개의 필드/웰을 얻었다. Sox-17 및 HNF-3베타에 관한 전체 세포수 및 전체 세포 강도를 IN 셀 디벨로퍼 툴박스 (Cell Developer Toolbox) 1.6 (GE Healthcare) 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. 그레이 스케일 레벨 (베이스라인 범위 100 내지 300) 및 핵 사이즈에 기초하여, 핵분열을 측정하였다. 반복 실험에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 단백질 발현을 세포 x 세포 면적의 전체 형광성으로서 정의되는 전체 강도 또는 집적 강도로서 기록하였다. 백그라운드를 300 내지 3000의 그레이 스케일 범위 및 0.4 이상의 형태 인자의 허용 기준에 기초하여 제거하였다. 전체 강도 데이터를 각각의 웰의 전체 강도를 Wnt3a/액티빈 A 양성 대조군의 평균 전체 강도로 나눔으로써 정규화하였다. 각각의 복제 세트에 대한 평균 및 표준 편차에 대하여 정규화 데이터를 계산하였다.
표 IV는 모든 스크리닝 결과의 대표적인 요약이다. 표 V는 이러한 스크리닝로부터의 히트 (hit) 리스트이다. 강한 히트는 대조값의 120% 이상으로서 정의되고; 중간 정도의 히트는 대조값의 60 내지 120%에 포함되는 것으로서 정의된다. 상당수의 화합물은 이러한 분석에서 두가지의 증식 반응을 유도한다. 동시에, 상당수의 화합물은 Sox17 및 Hnf-3b 전사 인자의 단백질 발현에 의해 측정된 바와 같이, 이러한 분석에서 분화를 유도한다.
실시예 6
플레이트 리더 분석을 이용하여 측정한 인간 배아 줄기 세포의 증식에 대한 GSK-3β 효소 활성 저해제의 효과
인간 배아 줄기 세포 (H9 또는 H1 세포주)의 유지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 행하였다. 세포 콜로니를 평균적으로 4일 마다 계대 배양하여, 미분화 다능성 상태로 유지하였다. 세포 배양액을 10 내지 30 분간 37℃에서 콜라게나아제 용액 (1 mg/mL; Sigma-Aldrich)에 노출시킨 다음에, 피펫 팁으로 부드럽게 긁어내어, 세포 클러스터를 회수하여, 계대 배양을 행하였다. 클러스터를 침강시킨 다음에, 세정하여, 잔류 콜라게나아제를 제거하였다. 세포 클러스터를 통상적인 배양을 위해서는 1:3 단층 면적 비율 또는 즉각적인 분석을 위해서는 1:1 비율로 분할하였다. 사용된 인간 배아 줄기 세포주를 50 미만의 계대 수로 유지하여, 통상적으로 정상 핵형 표현형 및 마이코플라스마 오염 결손을 평가하였다.
분석에 사용된 세포 클러스터를 표준 배지에 균등하게 재현탁시켜, 100㎕ /웰의 체적으로 매트리젤로 코팅된 96-웰 팩커드 뷰플레이츠 (PerkinElmer)에 플레이팅하였다. 8ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 조절된 배지를 초기 플레이팅 및 회수를 위해 사용하였다. 각각의 웰의 쓰고 난 배지를 흡인하여, 동일 체적의 새로운 배지로 교체함으로써 매일 공급을 행하였다. 플레이트를 분석 지속 기간을 통해 가습 박스에서 37℃, 5% CO2로 유지하였다.
각각의 웰로부터 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 일차 스크리닝 분석을 개시하였다. 0.5% FCS (HyClone), 100ng/mL 액티빈 A (R&D Biosystems) 및 10μM 시험 화합물이 보충된 DMEM:F12 기본 배지 (Invitrogen)를 포함하는 80 내지 100㎕/웰의 시험 체적을 다시 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 10-20ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 사용한 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A 또는 Wnt3a를 함유하지 않고, 0.5% FCS를 함유하는 기본 배지를 포함하였다. 스크리닝 화합물을 삼중으로 시험하였다. 분석 2일째에, 웰을 흡인하여, 동일한 용액을 다시 공급하였다. 3 및 4일째에, 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하는 것을 제외하고는, 모든 분석 웰을 흡인하여, 2% FCS 및 100ng/mL 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12로 전환하였다.
분석 4일째에, 15 내지 20㎕의 MTS (Promega)를 각각의 웰에 첨가하여, 플레이트를 37℃에서 1.5 내지 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 몰레큘러 디바이스 (Molecular Devices) 분광광도계 플레이트 리더를 사용하여, OD490에서 농도 리딩을 측정하였다. 복제 세트에 대한 평균 리딩을 표준 편차 및 변동 계수에 따라 계산하였다. 실험 웰을 액티빈 A/Wnt3a 양성 대조군과 비교하여, 증식도로서 퍼센트 대조값을 계산하였다.
표 VI는 모든 스크리닝 결과의 대표적인 요약이다. 표 VII은 이러한 스크리닝의 히트 리스트이다. 강한 히트는 대조값의 120% 이상으로서 정의되고; 중간 정도의 히트는 대조값의 60 내지 120%에 포함되는 것으로서 정의된다. 상당수의 화합물은 이러한 분석에서 증식 반응을 유도한다.
실시예 7
인간 배아 줄기 세포의 분화 및 증식에 대한 GSK - 3β 효소 저해제의 효과: 납 화합물의 용량 적정
일차 스크리닝으로부터 특정된 히트 활성을 확인하고, 추가로 용량 적정에 의해 활성 범위를 분석하는 것이 중요하였다. 일차 스크리닝 히트의 선택적 서브세트의 새로운 샘플을 건조 분말로 얻어, 가용화시켜 새로운 스톡 시약을 형성하고, 이차적 확인 분석시료로 희석시켜, 인간 배아 줄기 세포에 대한 효과를 평가하였다.
2개의 인간 배아 줄기 세포 (H1 및 H9)의 배양을 실시예 1에 기재된 바와 같이 행하였다. 세포 콜로니를 표면을 코팅하도록 DMEM:F12 중의 매트리젤™의 1:30 희석율을 사용하여, 매트리젤™ (Invitrogen)으로 코팅된 폴리스티렌 플라스틱 상에서 미분화 다능성 상태로 유지하였다. 세포를 평균적으로 4일 마다 효소 계대에 의해 분할하였다. 세포 단층을 37℃에서 10 내지 60 분간 콜라게나아제 용액 (1 mg/mL; Sigma-Aldrich)에 노출시킨 다음에, 피펫 팁으로 부드럽게 긁어내어, 세포 클러스터를 회수하여, 계대 배양을 행하였다. 클러스터를 중력에 의해 침강시킨 다음에, 세정하여, 잔류 콜라게나아제를 제거하였다. 세포 클러스터를 유지 배양을 위해서는 1:3 비율 또는 후속 분석을 위해서는 1:1 비율로 분할하였다. 인간 배아 줄기 세포주를 계대 50 미만으로 유지하여, 통상적으로 정상 핵형 표현형 및 마이코플라스마 오염 결손을 평가하였다.
분석용 세포의 제조: 분석에 사용된 H1 또는 H9 인간 배아 줄기 세포주의 세포 클러스터를 배지에 균등하게 재현탁시켜, 100㎕/웰의 체적으로 매트리젤™으로 코팅된 96-웰 팩커드 뷰플레이츠 (PerkinElmer)에 플레이팅하였다. 8ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 조절된 배지를 초기 플레이팅 및 증가를 위해 사용하였다. 각각의 웰의 쓰고 난 배지를 흡인하여, 동일 체적의 새로운 배지로 교체함으로써 매일 공급을 행하였다. 분석을 개시하기 전에 플레이팅 후에 배양을 1일 내지 3일간 증가시켰다. 플레이트를 분석 지속 기간 동안 가습 박스에서 37℃, 5% CO2로 유지하였다.
화합물 및 분석 배지의 제조: 일차 스크리닝에서 얻어진 히트 서브세트를 추적 (follow-up) 조사 및 후속 이차 분석에 사용하였다. 건조 분말로서 이용가능한 20개의 화합물을 DMSO 중의 10mM 스톡으로서 가용화하여, 사용시까지 -20℃로 건조시켜 보관하였다. 분석 직전에, 화합물 스톡을 1:1000으로 희석시켜, 0.5% FCS (HyClone) 및100ng/mL 액티빈 A (R&D Biosystems)가 보충된 DMEM:F12 기본 배지 (Invitrogen) 중의 10μM 시험 화합물을 제조하였다. 이것을 추가로 연속적으로 2배 희석하여, 0.5% FCS 및 100ng/mL 액티빈 A를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지 중에서도 각각의 화합물에 대하여 7단계 희석 곡선 (seven point dilution curve)을 형성하였다.
이차 스크리닝 분석: 각각의 웰의 세포 단층으로부터 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 분석을 개시하였다. 0.5% FCS, 및 100ng/mL 액티빈 A를 함유하고, Wnt3a를 함유하지 않는 상이한 농도의 저해제 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 100㎕/웰의 시험 체적을 다시 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에 0.5% FCS 및 20ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3 및 4일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100ng/mL 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12를 공급하였다. 3 및 4일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하였다.
분석 평가: 배양 종료시에, 96-웰 플레이트의 세포를 PBS로 2회 세정한 다음에, 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS로 3회를 초과하여 세정한 다음에, 실온에서 20분간 0.5% 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 고정 및 투과화 후에, 세포를 다시 PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 30분간 PBS 중에서 4% 닭 혈청 (Invitrogen)으로 블로킹하였다. 일차 항체 (염소 항-인간 Sox17; R&D Systems)를 4% 닭 혈청에서 1:100로 희석하여, 실온에서 1 시간 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS로 3회 세정한 후에, 알렉사 플루오르 488으로 컨쥬게이트된 이차 항체 (닭 항-염소 IgG; Molecular Probes)를 PBS 중에서 1:200으로 희석하여 각각의 웰에 첨가하였다. 핵을 대비염색하기 위해, 2㎍/mL 훽스트 (Hoechst) 33342 (Invitrogen)를 실온에서 10분간 첨가하였다. 세포를 PBS로 1회 세정한 다음에, 이미징을 위해 100 ㎕/웰 PBS에 정치시켰다.
훽스트 33342 및 알렉사 플루오르 488으로 염색된 세포에 대하여 이색성인 51008bs를 사용하여 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 이용하여, 세포를 이미징하였다. 미처리 음성 대조군으로서 이차 항체 단독으로 염색된 웰 및 양성 대조군 웰을 사용하여 노출 시간을 최적화하였다. 처리 및 염색 절차시에 임의의 세포 손실을 보상하기 위해 15개의 필드/웰의 이미지를 획득하였다. 각각의 웰에 대하여 전체 세포수 및 전체 Sox-17 강도의 측정값을 IN 셀 디벨로퍼 툴박스 1.7 (GE Healthcare) 소프트웨어를 이용하여 얻었다. 그레이 스케일 레벨 (베이스라인 범위 100 내지 300) 및 핵 사이즈에 기초하여, 핵분열을 측정하였다. 각각의 복제 데이터 세트에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 Sox17 단백질 발현을 세포 x 세포 면적의 전체 형광성으로서 정의되는 전체 강도 또는 집적 강도로서 기록하였다. 백그라운드를 300 내지 3000의 그레이 스케일 범위 및 0.4 이상의 형태 인자의 허용 기준에 기초하여 제거하였다. 전체 강도 데이터를 각각의 웰의 전체 강도를 Wnt3a/액티빈 A 양성 대조군의 평균 전체 강도로 나눔으로써 정규화하였다. 각각의 복제 세트에 대한 평균 및 표준 편차에 대하여 정규화 데이터를 계산하였다.
결과
결과는 이러한 이차 분석에서 적정에 의해 활성이 확인되고, 효능이 측정된 8개의 GSK-3B 효소 저해제에 대하여 나타낸다. 나타낸 데이터는 각각의 데이터 점을 이중 세트로부터 평균하고, 동일한 필드 및 웰로부터의 각각의 파라미터에 대하여 측정된 세포수 및 Sox17 강도에 대한 화합물 효과를 나타낸다. 본 실시예에서, Sox17 발현은 완성 내배엽 분화를 나타낸다. H1 인간 배아 줄기 세포주를 이용한 각각 세포수 및 Sox17 강도에 대한 결과는 표 VIII 및 IX에 나타낸다. H9 인간 배아 줄기 세포주에 관한 결과는 표 X 및 XI에 나타낸다. 양성 대조군 값을 세포수 및 Sox17 강도에 대하여 1.000로 정규화하였다. 음성 대조군 값은 두가지의 세포주에 대하여 세포수가 0.388 미만, Sox17 강도가 0.065 미만이었다. 두가지의 인간 배아 줄기 세포주를 비교한, 각각의 화합물의 용량 적정을 포함하는 이들 데이터의 그래픽 묘사가 도 1 내지 8에 주어진다. 세포수는 패널 A로 나타내고; Sox 17 강도는 패널 B로 나타낸다. 이들 데이터로부터, 각각의 화합물이 hES 세포 증식 및 완성 내배엽 분화를 촉진시키며, 최적 활성 범위를 특정할 수 있음을 확인한다.
실시예 8
완성 내배엽과 관련된 추가의 마커의 발현에 대한 GSK - 3β 효소 저해제의 효과
납 화합물이 또한 전사 인자 Sox17 이외에도, 완성 내배엽 분화를 나타내는 다른 마커를 유도할 수 있음을 증명하는 것이 중요하였다. 히트의 선택적 서브세트에 대하여, CXCR4, 표면 수용체 단백질, 및 HNF-3 베타, 완성 내배엽 분화와도 관련된 전사 인자의 발현을 촉진시키는 이들의 능력을 시험하였다.
분석용 세포의 제조: 분석에 사용된 H1 인간 배아 줄기 세포주의 세포 클러스터를 배지에 균등하게 재현탁시켜, 2 mL/웰의 체적으로 매트리젤™으로 코팅된 (1:30 희석율) 6-웰 플레이트 (Corning)에 플레이팅하였다. 8ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 조절된 배지를 초기 플레이팅 및 증가를 위해 사용하였다. 각각의 웰의 쓰고 난 배지를 흡인하여, 동일 체적의 새로운 배지로 교체함으로써 매일 공급을 행하였다. 분석을 개시하기 전에 플레이팅 후에 배양을 1일 내지 3일간 증가시켰다. 플레이트를 분석 지속 기간 동안 37℃, 5% CO2로 유지하였다.
화합물 및 분석 배지의 제조: 일차 스크리닝에서 얻어진 히트 서브세트를 추적 조사 및 후속 이차 분석에 사용하였다. 순수한 화합물을 DMSO 중의 10mM 스톡으로서 가용화하여, 사용시까지 -20℃로 건조시켜 보관하였다. 분석 직전에, 화합물 스톡을 0.5% FCS (HyClone) 및 100ng/mL 액티빈 A (R&D Biosystems)가 보충된 DMEM:F12 기본 배지 (Invitrogen) 중의 1μM 내지 5μM의 범위의 최종 농도로 희석시켰다.
분석: 각각의 웰의 세포 단층으로부터 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 분석을 개시하였다. 0.5% FCS, 및 100ng/mL 액티빈 A를 함유하고, Wnt3a를 함유하지 않는 상이한 농도의 저해제 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 2mL/웰의 시험 체적을 다시 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에 0.5% FCS, 및 100ng/mL 액티빈 A 및 20ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS를 함유하는 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3 및 4일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100ng/mL 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12를 공급하였다. 3 및 4일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하였다.
분석 평가: 배양 종료시에, 세포 단층을 PBS로 세정하고, TrypLE™ 익스프레스 솔루션 (Invitrogen, CA)으로 5분간 인큐베이션하여, 배양 플레이트로부터 수확하였다. 세포를 MEF로 조절된 배지에 재현탁시켜, 2개의 동일한 샘플로 분할하였다. 한 세트의 샘플을 추가로 다양한 형광 표지 항체로 염색하여, 유세포 (FACS) 분석을 행하였다. 대응하는 제 2 세트의 샘플에 대하여 정량적 PCR을 행하였다.
FACS 분석용 세포를 PBS로 세정하여, PBS 및 BD FACS 염색 완충액에 희석된 0.125% 인간 감마글로불린 (Sigma cat# G-4386)으로 4℃에서 15분간 블로킹하였다. 세포 분취량 (각각 약 105 세포)을 형광 태그에 직접 컨쥬게이트되고, CD9 PE (BD#555372), CD99 PE (Caltag#MHCD9904), 또는 CXCR-4 APC (R&D Systems cat# FAB173A)에 대한 특이성을 갖는 항체로 4℃에서 30분간 염색하였다. BD FACS 염색 완충액 중에서의 일련의 세정 후에, 세포를 7-AAD (BD# 559925)로 염색하여, 생존율을 평가하고, 적어도 10,000 이벤트를 수집하는 BD FACS 어레이 인스트루먼트 (Array instrument) (BD Biosciences)에서 분석하였다. PE 및 APC에 대한 마우스 IgG1k 아이소타입 대조 항체를 사용하여, 양성 세포 퍼센트를 게이트 (gate)하였다.
정량적 PCR용 세포를 RNA 추출, 정제, 및 cDNA 합성으로 처리하였다. 에탄올 함유, 고염 완충액의 존재하에서 실리카 겔 막 (Rneasy Mini Kit (Qiagen, CA))에 결합시킨 후 세정하여 오염물질을 제거함으로써 RNA 샘플을 정제하였다. 터보 (TURBO) DNA 비함유 키트 (Ambion, Inc.)를 이용하여 RNA를 추가로 정제하고, 이어서 고 품질 RNA를 물에 용출시켰다. 수율과 순도를 분광광도계의 A260 및 A280 리딩에 의해 평가하였다. cDNA 카피 (copy)는 어플라이드 바이오시스템즈, 인코포레이티드 (Applied Biosystems, Inc. (ABI, CA))의 고용량 cDNA 아카이브 키트 (high capacity cDNA archive kit)를 이용하여 정제 RNA로부터 제조하였다.
달리 지정하지 않는 한, 실시간 PCR 증폭 및 정량을 위한 모든 시약을 ABI로부터 구입하였다. 실시간 PCR 반응을 ABI 프리즘 (PRISM) 7900 시퀀스 디텍션 시스템 (Sequence Detection System)을 이용하여 행하였다. 태크만 유니버설 (TAQMAN UNIVERSAL) PCR 마스터 믹스 (MASTER MIX) (ABI, CA)를 20 ng의 역전사된 RNA와 함께 20 ㎕의 전체 반응 체적으로 사용하였다. 각각의 cDNA 샘플을 이중으로 행하여 피펫팅 에러에 대해 보정하였다. 프라이머 및 FAM 표지 태크만 프로브를 200 nM의 농도로 사용하였다. 각 표적 유전자의 발현 레벨은 ABI에 의해 이전에 개발된 인간 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나아제 (GAPDH) 내인성 컨트롤 (endogenous control)을 이용하여 정규화하였다. 프라이머 및 프로브 세트를 다음과 같이 나타낸다: CXCR4 (Hs00237052), GAPDH (4310884E), HNF3b (Hs00232764), SOX17 (프로브 파트 # 450025, 포워드 및 리버스 파트 # 4304971).
50℃에서 2분간, 이어서 95℃에서 10분간의 초기 인큐베이션 후에, 샘플을 두 단계, 즉, 95℃에서 15초간 변성 단계, 이어서 60℃에서 1분간 어닐링/연장 단계로 40회 사이클링시켰다. 데이터 분석은 진앰프 (GENEAMP)7000 시퀀스 디텍션 시스템 소프트웨어를 이용하여 행하였다. 각각의 프라이머/프로브 세트에 대하여, 형광 강도가 증폭의 지수 영역의 중간의 특정 값에 도달하는 사이클 수로서 Ct 값을 결정하였다. 상대적인 유전자 발현 레벨을 비교 Ct 방법을 이용하여 계산하였다. 요약하면, 각각의 cDNA 샘플에 대하여, 내인성 컨트롤 Ct 값을 대상 Ct의 유전자로부터 차감하여 델타 Ct 값 (ΔCt)을 얻었다. 증폭이 100% 효율이라고 가정하고, 표적의 정규화된 양을 2-ΔCt로서 계산하였다. 최종 데이터를 보정 샘플에 대하여 나타내었다.
결과
도 9는 다양한 GSK3 저해제로 처리한 후에 CXCR4 표면 수용체를 발현하는 양성 세포 퍼센트의 FACS 분석을 나타낸다. 1μM 내지 5μM의 범위의 각 화합물의 두 농도는 미처리 세포 집단 (음성 대조군) 또는 액티빈 A 및 Wnt3로 처리된 세포 (양성 대조군)에 대하여 나타낸다. 도 10의 패널 a, b, 및 c는 완성 내배엽의 마커로도 고려되는 CXCR4, Sox17, 및 HNF3베타에 대한 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. FACS 및 실시간 PCR 분석에 의해, 미처리 대조 세포에 대하여 분화 세포에서 관찰된 이들 마커 각각의 현저한 증가가 증명된다. 이들 완성 내배엽 마커의 발현 레벨은 경우에 따라서는 양성 대조군에 상당하는데, 이는 GSK3 저해제가 이러한 분화 단계에서 Wnt3a 대신에 사용될 수 있음을 증명한다.
실시예 9
췌장 내배엽의 형성에 대한 GSK - 3β 효소 저해제의 효과
완성 내배엽 유도 시에 GSK3β 저해제로 처리하면, 다른 세포형, 예를 들어 췌장 내배엽의 후속 분화를 저지하지 않는 것을 증명하는 것이 중요하였다. 히트의 선택적 서브세트에 대하여, PDX1 및 HNF6, 췌장 내배엽과 관련된 주요 전사 인자의 발현을 촉진시키는 이들의 능력을 시험하였다.
인간 배아 줄기 세포 (H1 및 H9 세포주)의 유지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 행하였다. 세포 콜로니를 평균적으로 4일 마다 계대하면서, 미분화 다능성 상태로 유지하였다. 세포 배양액을 10 내지 30 분간 37℃에서 콜라게나아제 용액 (1 mg/mL; Sigma-Aldrich)에 노출시킨 다음에, 피펫 팁으로 부드럽게 긁어내어, 세포 클러스터를 회수하여, 계대 배양을 행하였다. 클러스터를 중력에 의해 침강시킨 다음에, 세정하여, 잔류 콜라게나아제를 제거하였다. 세포 클러스터를 통상적인 유지 배양을 위해서는 1:3 비율 또는 후속 분석을 위해서는 1:1 비율로 분할하였다. 사용된 인간 배아 줄기 세포주를 계대 50 미만으로 유지하여, 통상적으로 정상 핵형 표현형 및 마이코플라스마 오염 결손을 평가하였다.
분석용 세포의 제조: 분석에 사용된 H1 인간 배아 줄기 세포주의 세포 클러스터를 배지에 균등하게 재현탁시켜, 1 mL/웰의 체적으로 매트리젤™으로 코팅된 (1:30 희석율) 24-웰 플레이트 (흑색 웰; Arctic White)에 플레이팅하였다. 8ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 조절된 배지를 초기 플레이팅 및 증가를 위해 사용하였다. 제 2 실험에서, H9 세포주로부터의 hES 세포 클러스터를, 이전에 마이토마이신 C (Sigma Chemical Co)로 처리하여 불활성화된 마우스 배아 영양세포 (MEF) 층에서 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. MEF 단층의 hES 세포 배지를, 최소 필수 아미노산 (Invitrogen), L-글루타민, 및 2-메르캅토에탄올이 보충된 20% 녹아웃 혈청 리플레이서 (Replacer (Invitrogen))를 포함하는 DMEM:F12로 구성하였다. 각각의 웰의 쓰고 난 배지를 흡인하여, 동일 체적의 새로운 배지로 교체함으로써 매일 공급을 행하였다. 분석을 개시하기 전에 플레이팅 후에 배양을 1일 내지 3일간 증가시켰다. 플레이트를 분석 지속 기간 동안 37℃, 5% CO2로 유지하였다.
화합물 및 분석 배지의 제조: 일차 스크리닝에서 얻어진 8개의 히트 서브세트를 추적 조사 및 후속 이차 분석에 사용하였다. 순수한 화합물을 DMSO 중의 10mM 스톡으로서 가용화하여, 사용시까지 -20℃로 건조시켜 보관하였다. 분석 직전에, 화합물 스톡을 첨가제를 포함하는 기본 배지 중의 1μM 내지 5μM의 범위의 최종 농도로 희석시켰다.
분석: 이러한 분석에서, 완성 내배엽 분화 단계의 1 및 2일째에만 Wnt3a 대신에 GSK3 저해제를 포함하였다. 각각의 웰의 세포 단층으로부터 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 매트리젤™에서 배아 줄기 세포 배양을 상기 실시예 7 및 8에 기재된 바와 같이 개시하였다. 완성 내배엽으로의 분화를 위해, 0.5% FCS, 및 100 ng/mL 액티빈 A를 함유하고, Wnt3a를 함유하지 않는 상이한 농도의 저해제 화합물을 포함하는 DMEM:F12 배지를 포함하는 시험 체적 (24-웰 플레이트에 대해서는 0.5 mL/웰, 96-웰 플레이트에 대해서는 100 ㎕/웰)을 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에 0.5% FCS, 및 100ng/mL 액티빈 A 및 20ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3 및 4일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100ng/mL 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12를 공급하였다. 3 및 4일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하였다. 췌장 내배엽으로의 분화를 위해, 세포를 3일간 처리하고, 0.25 μM KAAD 사이클로파민 (EMD Biosciences) 및 20 ng/mL FGF7 (R&D Biosystems)과 함께 2% FCS를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 매일 공급하였다. 그 다음에, 세포를 추가로 4일간 처리하고, 1% B27 (Invitrogen), 0.25 μM KAAD 사이클로파민, 2 μM 레티노산 (RA; Sigma-Aldrich) 및 20 ng/mL FGF7을 함유하는 DMEM:F12를 매일 공급하였다. 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS (단계 2) 또는 1% B27 (단계 3)을 함유하고 임의의 다른 첨가제를 함유하지 않는 DMEM:F12 기본 배지를 통해 유지하였다.
대응하는 H9 인간 배아 세포의 배양액을 MEF 영양세포층에서 성장시켜, 췌장 내배엽으로 분화시켰다. 상이한 농도의 저해제 화합물 및 100 ng/mL 액티빈 A와 함께, 1일째에 혈청을 함유하지 않고, 2 및 3일째에 0.2% FCS를 함유하는 RPMI-1640 (Invitrogen)으로 구성되는 배지에서 세포를 배양하여, 완성 내배엽 분화를 달성하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에, 100ng/mL 액티빈 A 및 20ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 함유하는 동일한 기본 배지 (혈청 함유 또는 비함유)를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 혈청 함유 또는 비함유의 동일한 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100ng/mL 액티빈 A가 보충된 RPMI-1640을 공급하였다. 3일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 RPMI-1640 기본 배지에서 유지하였다. 세포를 4일간 처리하고, 0.25 mM KAAD 사이클로파민 (EMD Biosciences) 및 50 ng/mL FGF10 (R&D Biosystems)과 함께 2% FCS를 함유하는 RPMI-1640 기본 배지를 매일 공급하여, 세포를 췌장 내배엽으로 분화하였다. 그 후에, 세포를 3일간의 지속 기간 동안 처리하고, 1% B27 (Invitrogen), 0.25 mM KAAD 사이클로파민, 2 mM 레티노산 (RA; Sigma-Aldrich) 및 50 ng/mL FGF10을 함유하는 RPMI-1640을 매일 공급하였다. 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS (단계 2) 또는 1% B27 (단계 3)을 함유하고 임의의 다른 첨가제를 함유하지 않는 RPMI-1640 기본 배지를 통해 유지하였다.
분석 평가: 분화 종료시에, 세포를 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 실시예 8에 기재된 바와 같이 조사하였다. 하이컨텐트 형광 염색을 위해, 96-웰 플레이트의 세포를 PBS로 2회 세정한 다음에, 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS로 3회를 초과하여 세정한 다음에, 실온에서 20분간 0.5% 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 고정 및 투과화 후에, 세포를 다시 PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 30분간 PBS 중에서 4% 닭 혈청 (Invitrogen)으로 블로킹하였다. 일차 항체 (염소 항-인간 Pdx1; Santa Cruz)를 4% 닭 혈청에서 1:100으로 희석하여, 실온에서 2시간 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS로 3회 세정한 후에, 알렉사 플루오르 488으로 컨쥬게이트된 이차 항체 (닭 항-염소 IgG; Molecular Probes)를 PBS 중에서 1:200으로 희석하여 각각의 웰에 첨가하였다. 핵을 대비염색하기 위해, 2㎍/mL 훽스트 33342 (Invitrogen)를 실온에서 10분간 첨가하였다. 세포를 PBS로 1회 세정한 다음에, 이미징을 위해 100 ㎕/웰 PBS에 정치시켰다.
훽스트 33342 및 알렉사 플루오르 488으로 염색된 세포에 대하여 이색성인 51008bs를 사용하여 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 이용하여, 세포를 이미징하였다. 이차 항체 단독으로 염색된 웰 및 양성 대조군 웰을 사용하여 노출 시간을 최적화하였다. 처리 및 염색 절차시에 임의의 세포 손실을 보상하기 위해 15개의 필드/웰의 이미지를 획득하였다. 각각의 웰에 대하여 전체 세포수 및 전체 Pdx1 강도의 측정값을 IN 셀 디벨로퍼 툴박스 1.7 (GE Healthcare) 소프트웨어를 이용하여 얻었다. 그레이 스케일 레벨 (베이스라인 범위 100 내지 300) 및 핵 사이즈에 기초하여, 핵분열을 측정하였다. 각각의 복제 데이터 세트에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 Pdx1 단백질 발현을 세포 x 세포 면적의 전체 형광성으로서 정의되는 전체 강도 또는 집적 강도로서 기록하였다. 백그라운드를 300 내지 3000의 그레이 스케일 범위의 허용 기준에 기초하여 제거하였다. 전체 강도 데이터를 각각의 웰의 전체 강도를 Wnt3a/액티빈 A 양성 대조군의 평균 전체 강도로 나눔으로써 정규화하였다. 각각의 복제 세트에 대한 평균 및 표준 편차에 대하여 정규화 데이터를 계산하였다.
정량적 PCR용 세포를 RLT 완충액 (Qiagen)에 용해시킨 다음에, RNA 추출, 정제, 및 cDNA 합성으로 처리하였다. 에탄올 함유, 고염 완충액의 존재하에서 실리카 겔 막 (Rneasy Mini Kit (Qiagen, CA))에 결합시킨 후 세정하여 오염물질을 제거함으로써 RNA 샘플을 정제하였다. 터보 DNA 비함유 키트 (Ambion, Inc.)를 이용하여 RNA를 추가로 정제하고, 이어서 고 품질 RNA를 물에 용출시켰다. 수율과 순도를 분광광도계의 A260 및 A280 리딩에 의해 평가하였다. cDNA 카피는 어플라이드 바이오시스템즈, 인코포레이티드 (ABI, CA)의 고용량 cDNA 아카이브 키트를 이용하여 정제 RNA로부터 제조하였다.
달리 지정하지 않는 한, 실시간 PCR 증폭 및 정량을 위한 모든 시약을 ABI로부터 구입하였다. 실시간 PCR 반응을 ABI 프리즘 7900 시퀀스 디텍션 시스템을 이용하여 행하였다. 태크만 유니버설 PCR 마스터 믹스를 20 ng의 역전사된 RNA와 함께 20 ㎕의 전체 반응 체적으로 사용하였다. 각각의 cDNA 샘플을 이중으로 행하여 피펫팅 에러에 대해 보정하였다. 프라이머 및 FAM 표지 태크만 프로브를 200 nM의 농도로 사용하였다. 각 표적 유전자의 발현 레벨은 ABI에 의해 이전에 개발된 인간 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나아제 (GAPDH) 내인성 컨트롤을 이용하여 정규화하였다. 프라이머 및 프로브 세트를 다음과 같이 나타낸다: PDX1 (Hs00236830_m1), GAPDH (4310884E), 및 HNF6 (Hs00413554_m1).
50℃에서 2분간, 이어서 95℃에서 10분간의 초기 인큐베이션 후에, 샘플을 두 단계, 즉, 95℃에서 15초간 변성 단계, 이어서 60℃에서 1분간 어닐링/연장 단계로 40회 사이클링시켰다. 데이터 분석은 진앰프® 7000 시퀀스 디텍션 시스템 소프트웨어를 이용하여 행하였다. 각각의 프라이머/프로브 세트에 대하여, 형광 강도가 증폭의 지수 영역의 중간의 특정 값에 도달하는 사이클 수로서 Ct 값을 결정하였다. 상대적인 유전자 발현 레벨을 비교 Ct 방법을 이용하여 계산하였다. 요약하면, 각각의 cDNA 샘플에 대하여, 내인성 컨트롤 Ct 값을 대상 Ct의 유전자로부터 차감하여 델타 Ct 값 (ΔCt)을 얻었다. 증폭이 100% 효율이라고 가정하고, 표적의 정규화된 양을 2-ΔCt로서 계산하였다. 최종 데이터를 보정 샘플에 대하여 표현하였다.
결과
결과는 8개의 GSK-3β 효소 저해제에 대하여 나타낸다. 하이컨텐트 분석으로부터의 도 11에 나타낸 데이터는 각각의 데이터 점을 이중 샘플 세트로부터 평균하고, 동일한 필드 및 웰로부터의 각각의 파라미터에 대하여 측정된 H1 hES 세포주에 대한 세포수 (패널 A) 및 Pdx1 강도 (패널 B)에 대한 효과를 나타낸다. 실시간 PCR로부터의 도 12에 나타낸 데이터는 2개의 전사 인자, Pdx1 및 HNF6의 유도 발현에 대한 이들 소분자 저해제의 효과를 나타낸다. 이들 실시예에서, Pdx1 및 HNF6 발현은 췌장 내배엽 분화를 나타낸다. 이들 분석에 있어서의 GSK3β 저해제 화합물은 세포 계통 결정 (commitment)의 초기 단계 시에 Wnt3a 대신에 사용될 수 있으며; 얻어진 세포는 분화의 후속 순차적 단계 시에 췌장 내배엽을 형성할 용량을 유지한다.
실시예 10
췌장 내분비 세포의 형성에 대한 GSK-3β 효소 저해제의 효과
완성 내배엽 유도 시에 GSK3 저해제로 처리하면, 다른 세포형, 예를 들어 췌장 내분비 세포 또는 인슐린 생성 세포의 후속 분화를 저지하지 않는 것을 증명하는 것이 중요하였다. 히트의 선택적 서브세트에 대하여, 췌장 호르몬의 발현을 촉진시키는 이들의 능력을 시험하였다.
분석용 세포의 제조: 실시예 9에 기재된 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 세포 (96-웰플레이트 및 24-웰 플레이트에서 배양됨)를, 계속해서 세포를 췌장 호르몬 발현 세포로 분화시키는 제제에 노출시켰다.
각각의 웰의 세포 단층으로부터 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 매트리젤™에서 H1 인간 배아 줄기 세포주의 배양액 분석을 상기 실시예 7 내지 9에 기재된 바와 같이 개시하였다. 완성 내배엽으로의 분화를 위해, 0.5% FCS, 및 100 ng/mL 액티빈 A를 함유하고, Wnt3a를 함유하지 않는 상이한 농도의 저해제 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 시험 체적 (24-웰 플레이트에 대해서는 0.5 mL/웰, 96-웰 플레이트에 대해서는 100 ㎕/웰)을 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에, 100ng/mL 액티빈 A 및 20ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)와 함께, 0.5% FCS 및 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3, 4 및 5일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100ng/mL 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12를 공급하였다. 3, 4, 및 5일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하였다. 췌장 내배엽으로의 분화를 위해, 세포를 3일간 처리하고, 0.25 μM KAAD 사이클로파민 (EMD Biosciences) 및 20 ng/mL FGF7 (R&D Biosystems)과 함께 2% FCS를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 매일 공급하였다. 그 후에, 세포를 4일간 처리하고, 1% B27 (Invitrogen), 0.25 μM KAAD 사이클로파민, 2 μM 레티노산 (RA; Sigma-Aldrich) 및 20 ng/mL FGF7을 함유하는 DMEM:F12를 매일 공급하였다. 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS 또는 1% B27을 함유하고 임의의 다른 첨가제를 함유하지 않는 DMEM:F12 기본 배지를 통해 유지하였다. 췌장 내배엽의 형성 후에, 세포를 추가로 6일간의 지속 기간 동안 처리하고, 1 μM DAPT (감마 세크리타아제 저해제: EMD Biosciences) 및 50 ng/mL 엑센딘 (Exendin) 4 (Sigma-Aldrich)과 함께 1% B27을 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 매일 공급하였다. 그 다음에, 세포를 추가로 3일간의 지속 기간 동안 처리하고, 1% B27, 50 ng/mL 엑센딘 4, 50 ng/mL IGF (R&D Biosystems) 및 50 ng/mL HGF (R&D Biosystems)를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 매일 공급하였다. 대응하는 음성 대조군 웰을 1% B27을 함유하고 임의의 다른 첨가제를 함유하지 않는 DMEM:F12 기본 배지를 통해 유지하였다.
분석 평가: 배양 종료시에, 세포를 하이컨텐트 분석 또는 실시간 PCR에 의해 상기 실시예 7 및 8에서와 같이 처리하였다.
하이컨텐트 형광 염색을 위해, 96-웰 플레이트의 세포를 PBS로 2회 세정한 다음에, 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS로 3회를 초과하여 세정한 다음에, 실온에서 20분간 0.5% 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 고정 및 투과화 후에, 세포를 다시 PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 30분간 PBS 중에서 4% 닭 혈청 (Invitrogen)으로 블로킹하였다. 일차 항체 (기니아 피그 항-스와인 인슐린, 인간 인슐린과 교차반응성을 지님; DakoCytomation)를 4% 염소 혈청에서 1:500으로 희석하여, 실온에서 1시간 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS로 3회 세정한 후에, 4% 염소 혈청 중에서 1:100으로 희석된 알렉사 플루오르 488으로 컨쥬게이트된 이차 항체 (염소 항-기니아 피그 IgG; Molecular Probes)로 염색하였다. 핵을 대비염색하기 위해, 2㎍/mL 훽스트 33342 (Invitrogen)를 실온에서 10분간 첨가하였다. 세포를 PBS로 1회 세정한 다음에, 이미징을 위해 100 ㎕/웰 PBS에 정치시켰다.
훽스트 33342 및 알렉사 플루오르 488으로 염색된 세포에 대하여 이색성인 51008bs를 사용하여 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 이용하여, 세포를 이미징하였다. 이차 항체 단독으로 염색된 웰 및 양성 대조군 웰을 사용하여 노출 시간을 최적화하였다. 처리 및 염색 절차시에 임의의 세포 손실을 보상하기 위해 15개의 필드/웰의 이미지를 획득하였다. 각각의 웰에 대하여 전체 세포수 및 전체 인슐린 강도의 측정값을 IN 셀 디벨로퍼 툴박스 1.7 (GE Healthcare) 소프트웨어를 이용하여 얻었다. 그레이 스케일 레벨 (베이스라인 범위 100 내지 300) 및 핵 사이즈에 기초하여, 핵분열을 측정하였다. 각각의 복제 데이터 세트에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 인슐린 단백질 발현을 세포 x 세포 면적의 전체 형광성으로서 정의되는 전체 강도 또는 집적 강도로서 기록하였다. 백그라운드를 300 내지 3000의 그레이 스케일 범위의 허용 기준에 기초하여 제거하였다. 전체 강도 데이터를 각각의 웰의 전체 강도를 Wnt3a/액티빈 A 양성 대조군의 평균 전체 강도로 나눔으로써 정규화하였다. 각각의 삼중 세트에 대한 평균 및 표준 편차에 대하여 정규화 데이터를 계산하였다.
정량적 PCR용 세포를 RLT 완충액 (Qiagen)에 용해시킨 다음에, RNA 추출, 정제, 및 cDNA 합성으로 처리하였다. 에탄올 함유, 고염 완충액의 존재하에서 실리카 겔 막 (Rneasy Mini Kit (Qiagen, CA))에 결합시킨 후 세정하여 오염물질을 제거함으로써 RNA 샘플을 정제하였다. 터보 DNA 비함유 키트 (Ambion, INC)를 이용하여 RNA를 추가로 정제하고, 이어서 고 품질 RNA를 물에 용출시켰다. 수율과 순도를 분광광도계의 A260 및 A280 리딩에 의해 평가하였다. cDNA 카피는 어플라이드 바이오시스템즈, 인코포레이티드 (ABI, CA)의 고용량 cDNA 아카이브 키트를 이용하여 정제 RNA로부터 제조하였다.
달리 지정하지 않는 한, 실시간 PCR 증폭 및 정량을 위한 모든 시약을 ABI로부터 구입하였다. 실시간 PCR 반응을 ABI 프리즘® 7900 시퀀스 디텍션 시스템을 이용하여 행하였다. 태크만® 유니버설 PCR 마스터 믹스® (ABI, CA)를 20 ng의 역전사된 RNA와 함께 20 ㎕의 전체 반응 체적으로 사용하였다. 각각의 cDNA 샘플을 이중으로 행하여 피펫팅 에러에 대해 보정하였다. 프라이머 및 FAM 표지 태크만® 프로브를 200 nM의 농도로 사용하였다. 각 표적 유전자의 발현 레벨은 ABI에 의해 이전에 개발된 인간 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나아제 (GAPDH) 내인성 컨트롤을 이용하여 정규화하였다. 프라이머 및 프로브 세트를 다음과 같이 나타낸다: PDX1 (Hs00236830_m1), 인슐린 (Hs00355773), 및 GAPDH (4310884E).
50℃에서 2분간, 이어서 95℃에서 10분간의 초기 인큐베이션 후에, 샘플을 두 단계, 즉, 95℃에서 15초간 변성 단계, 이어서 60℃에서 1분간 어닐링/연장 단계로 40회 사이클링시켰다. 데이터 분석은 진앰프®7000 시퀀스 디텍션 시스템 소프트웨어를 이용하여 행하였다. 각각의 프라이머/프로브 세트에 대하여, 형광 강도가 증폭의 지수 영역의 중간의 특정 값에 도달하는 사이클 수로서 Ct 값을 결정하였다. 상대적인 유전자 발현 레벨을 비교 Ct 방법을 이용하여 계산하였다. 요약하면, 각각의 cDNA 샘플에 대하여, 내인성 컨트롤 Ct 값을 대상 Ct의 유전자로부터 차감하여 델타 Ct 값 (ΔCt)을 얻었다. 증폭이 100% 효율이라고 가정하고, 표적의 정규화된 양을 2-ΔCt로서 계산하였다. 최종 데이터를 보정 샘플에 대하여 나타내었다.
결과
결과는 8개의 GSK-3B 효소 저해제에 대하여 나타낸다. 하이컨텐트 분석으로부터의 도 13에 나타낸 데이터는 각각의 데이터 점을 삼중 세트로부터 평균하고, 동일한 필드 및 웰로부터의 각각의 파라미터에 대하여 측정된 H1 hES 세포주에 대한 세포수 (패널 A) 및 인슐린 강도 (패널 B)에 대한 화합물 효과를 나타낸다. 실시간 PCR로부터의 도 14에 나타낸 데이터는 Pdx1 및 인슐린에 대한 화합물 효과를 나타낸다. 이들 실시예에서, Pdx1 및 인슐린 발현은 췌장 내배엽 분화 및 호르몬 양성 세포의 생성을 나타낸다. 인슐린 면역 염색 및 실시간 PCR로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 이들 분석에 있어서의 선택적 GSK3β 저해제 화합물은 세포 계통 결정의 초기 단계 시에 Wnt3a 대신에 사용될 수 있으며, 분화의 후속 순차적 단계 시에 췌장 베타 세포 형성을 유도하여 유지할 수 있다.
실시예 11
췌장 내분비 세포의 형성에 대한 GSK - 3β 효소 저해제의 상가 효과 (additive effect)
GSK3β 저해제로 처리하면, 다수의 세포 운명 결정 단계시에 첨가되는 경우, 췌장 베타 세포 분화를 향상시킬 수 있음을 증명하는 것이 중요하였다. 히트의 선택적 서브세트를 췌장 호르몬 양성 세포와 관련된 인슐린 발현을 향상시키도록 순차적 시한 첨가 (sequential timed addition)에 의해 시험하였다.
분석용 세포의 제조: 분석용 세포의 제조: 실시예 9 및 10에 기재된 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 세포 (96-웰플레이트에서 배양됨)를 계속해서 췌장 호르몬 발현 세포로 분화시키는 제제에 노출시켰다.
각각의 웰의 세포 단층으로부터 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 매트리젤™에서 H1 인간 배아 줄기 세포주의 배양액 분석을 상기 실시예 7 내지 9에 기재된 바와 같이 개시하였다. 완성 내배엽으로의 분화를 위해, 0.5% FCS, 및 100 ng/mL 액티빈 A를 함유하고, Wnt3a를 함유하지 않는 상이한 농도의 저해제 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 시험 체적 (96-웰 플레이트에 대해서는 100 ㎕/웰)을 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에, 100ng/mL 액티빈 A 및 20ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)와 함께, 0.5% FCS 및 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3, 4 및 5일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100ng/mL 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12를 공급하였다. 3, 4, 및 5일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하였다. 췌장 내배엽으로의 분화를 위해, 세포를 3일간 처리하고, 0.25 μM KAAD 사이클로파민 (EMD Biosciences) 및 20 ng/mL FGF7 (R&D Biosystems)과 함께 2% FCS를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 매일 공급하였다. 그 후에, 세포를 4일간 처리하고, 1% B27 (Invitrogen), 0.25 μM KAAD 사이클로파민, 2 μM 레티노산 (RA; Sigma-Aldrich) 및 20 ng/mL FGF7을 함유하는 DMEM:F12를 매일 공급하였다. 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS 또는 1% B27을 함유하고 임의의 다른 첨가제를 함유하지 않는 DMEM:F12 기본 배지를 통해 유지하였다. 췌장 내배엽의 형성 후에, 세포를 추가로 6일간의 지속 기간 동안 처리하고, 1 μM DAPT (감마 세크리타아제 저해제: EMD Biosciences) 및 50 ng/mL 엑센딘 4 (Sigma-Aldrich)와 함께, 1% B27을 포함하는 DMEM:F12 기본 배지 및 1 μM TGF베타 R1 저해제 II (ALK5 저해제; EMD Biosciences)를 하루걸러 공급하였다. 이러한 6일간의 기간 동안에, GSK3β 저해제를 분화 개시 시에 전처리와 동일한 농도를 사용하여, 각각의 웰에 다시 첨가하였다. 그 다음에, 세포를 추가로 3일간의 지속 기간 동안 처리하고, 1% B27, 50 ng/mL 엑센딘 4, 50 ng/mL IGF (R&D Biosystems) 및 50 ng/mL HGF (R&D Biosystems)를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지 및 1 μM TGF베타 R1 저해제 II (ALK5 저해제; EMD Biosciences)를 하루걸러 공급하였다. 이러한 3일간의 기간 동안에, GSK3β 저해제를 분화 개시 시에 전처리와 동일한 농도를 사용하여, 각각의 웰에 다시 첨가하였다. 대응하는 양성 대조군 웰의 세트를 20ng/mL Wnt3a의 존재 또는 부재하에 처리하였다. 대응하는 음성 대조군 웰을 1% B27을 함유하고 임의의 다른 첨가제를 함유하지 않는 DMEM:F12 기본 배지를 통해 유지하였다.
분석 평가: 배양 종료시에, 세포를 하이컨텐트 분석에 의해 상기 실시예 10에서와 같이 처리하였다.
하이컨텐트 형광 염색을 위해, 96-웰 플레이트의 세포를 PBS로 2회 세정한 다음에, 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS로 3회를 초과하여 세정한 다음에, 실온에서 20분간 0.5% 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 고정 및 투과화 후에, 세포를 다시 PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 30분간 PBS 중에서 4% 닭 혈청 (Invitrogen)으로 블로킹하였다. 일차 항체 (기니아 피그 항-스와인 인슐린, 인간 인슐린과 교차반응성을 지님; DakoCytomation)를 4% 염소 혈청에서 1:500으로 희석하여, 실온에서 1시간 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS로 3회 세정한 후에, 4% 염소 혈청 중에서 1:100으로 희석된 알렉사 플루오르 488으로 컨쥬게이트된 이차 항체 (염소 항-기니아 피그 IgG; Molecular Probes)로 염색하였다. 핵을 대비염색하기 위해, 2㎍/mL 훽스트 33342 (Invitrogen)를 실온에서 10분간 첨가하였다. 세포를 PBS로 1회 세정한 다음에, 이미징을 위해 100 ㎕/웰 PBS에 정치시켰다.
훽스트 33342 및 알렉사 플루오르 488으로 염색된 세포에 대하여 이색성인 51008bs를 사용하여 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 이용하여, 세포를 이미징하였다. 이차 항체 단독으로 염색된 웰 및 양성 대조군 웰을 사용하여 노출 시간을 최적화하였다. 처리 및 염색 절차시에 임의의 세포 손실을 보상하기 위해 15개의 필드/웰의 이미지를 획득하였다. 각각의 웰에 대하여 전체 세포수 및 전체 인슐린 강도의 측정값을 IN 셀 디벨로퍼 툴박스 1.7 (GE Healthcare) 소프트웨어를 이용하여 얻었다. 그레이 스케일 레벨 (베이스라인 범위 100 내지 300) 및 핵 사이즈에 기초하여, 핵분열을 측정하였다. 각각의 복제 데이터 세트에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 인슐린 단백질 발현을 세포 x 세포 면적의 전체 형광성으로서 정의되는 전체 강도 또는 집적 강도로서 기록하였다. 백그라운드를 300 내지 3000의 그레이 스케일 범위의 허용 기준에 기초하여 제거하였다. 전체 강도 데이터를 각각의 웰의 전체 강도를 Wnt3a/액티빈 A 양성 대조군의 평균 전체 강도로 나눔으로써 정규화하였다. 각각의 삼중 세트에 대한 평균 및 표준 편차에 대하여 정규화 데이터를 계산하였다.
결과
결과는 8개의 GSK-3B 효소 저해제에 대하여 나타낸다. 하이컨텐트 분석으로부터의 도 15에 나타낸 데이터는 각각의 데이터 점을 삼중 세트로부터 평균하고, 동일한 필드 및 웰로부터의 각각의 파라미터에 대하여 측정된 H1 hES 세포주에 대한 세포수 (패널 A) 및 인슐린 강도 (패널 B)에 대한 화합물 효과를 나타낸다. 본 실시예에서, 인슐린 발현은 호르몬 양성 췌장 세포에로의 분화를 나타낸다. 이들 분석에 있어서의 선택적 GSK3β 저해제 화합물은 세포 계통 결정의 초기 단계 시에 Wnt3a 대신에 사용될 수 있으며, 분화의 후속 단계 시에 첨가되는 경우, 양성 대조군 샘플에 대한 인슐린 발현 증가를 촉진시키는 것으로 보인다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 다양한 본 발명의 측면이 실시예 및 바람직한 실시 형태를 참조하여 상기에서 예시되었지만, 본 발명의 범위가 상술한 설명에 의해 한정되지 않으나, 특허법의 원칙하에 적절히 추론된 하기의 특허청구범위에 의해 한정되는 것을 인지할 것이다.
[표 IA]
Figure pat00034
[표 Ib]
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[표 II]
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[표 III]
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[표 IV]
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[표 V]
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[표 VI]
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[표 VII]
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[표 VIII]
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[표 X]
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[표 XI]
Figure pat00060

Claims (16)

  1. a. 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계, 및
    b. 인간 배아 줄기 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제인 3-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온으로 처리하는 단계를 포함하는, 인간 배아 줄기 세포의 증가 또는 분화 방법.
  2. 3-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온으로 보충된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아 줄기 세포의 증가 또는 분화 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 인간 배아 줄기 세포는 1 내지 72 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 인간 배아 줄기 세포는 12 내지 48 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리되는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 인간 배아 줄기 세포는 48 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리되는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 100nM 내지 100μM의 농도로 사용되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 1μM 내지 10μM의 농도로 사용되는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 10μM의 농도로 사용되는 방법.
  9. 제 2 항에 있어서, 인간 배아 줄기 세포가 3-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온으로 1 내지 72시간 동안 처리되는 방법.
  10. 제 2 항에 있어서, 인간 배아 줄기 세포가 3-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온으로 12 내지 48시간 동안 처리되는 방법.
  11. 제 2 항에 있어서, 인간 배아 줄기 세포가 3-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온으로 48시간 동안 처리되는 방법.
  12. 제 2 항에 있어서, 3-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온이 100nM 내지 100μM의 농도로 사용되는 방법.
  13. 제 2 항에 있어서, 3-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온이 1μM 내지 10μM의 농도로 사용되는 방법.
  14. 제 2 항에 있어서, 3-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온이 10μM의 농도로 사용되는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 배아 줄기는 완성 내배엽 계통 (definitive endoderm lineage)의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화되는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 완성 내배엽 계통 (definitive endoderm lineage)의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포 (definitive endoderm cell)인 방법.
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