CN102105580B - 多潜能细胞的处理 - Google Patents

多潜能细胞的处理 Download PDF

Info

Publication number
CN102105580B
CN102105580B CN200980124647.2A CN200980124647A CN102105580B CN 102105580 B CN102105580 B CN 102105580B CN 200980124647 A CN200980124647 A CN 200980124647A CN 102105580 B CN102105580 B CN 102105580B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
alkyl
compound
expression
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980124647.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102105580A (zh
Inventor
J·E·戴维斯
J·刘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Biotech Inc
Original Assignee
Centocor Ortho Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centocor Ortho Biotech Inc filed Critical Centocor Ortho Biotech Inc
Priority to CN201710406073.4A priority Critical patent/CN107189978A/zh
Publication of CN102105580A publication Critical patent/CN102105580A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102105580B publication Critical patent/CN102105580B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0609—Oocytes, oogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/48—Regulators of apoptosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及处理多潜能细胞的方法，其中通过用GSK‑3B酶活性抑制剂处理所述多潜能细胞，所述多潜能细胞可在培养物中有效扩增和分化。

Description

多潜能细胞的处理
技术领域
本发明涉及处理多潜能细胞的方法，其中通过用GSK-3B酶活性抑制剂处理多潜能细胞，该多潜能细胞可在培养物中有效扩增和分化。
背景技术
由于I型糖尿病细胞替代疗法的进步和可移植胰岛的不足，人们已重点关注于开发适于移植的胰岛素生成细胞或β细胞来源。一种方法是从多潜能细胞(例如胚胎干细胞)产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的一组细胞。诸如例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，例如HNF-3β、GATA-4、Mixll、 CXCR4和SOX-17。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞可表达胰-十二指肠同源盒基因PDX-1。在不存在PDX-1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因此，PDX-1的表达标志着胰腺器官形成中的关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
产生足够量的细胞物质用于移植需要可在培养物中有效扩增并有效分化成所关注的组织(例如功能性β细胞)的细胞物质来源。
当前培养胚胎干细胞的方法很复杂，它们需要使用外源因子或化学成分确定的培养基，以便细胞在不丧失其多潜能性的情况下分化。此外，胚胎干细胞的分化通常导致细胞在培养物中扩增减少。
例如，Cheon等人(BioReprod DOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养细胞的无血清培养系统，其中胚胎 干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
又如，US20050233446公开了一种用于培养干细胞，包括未分化的灵长类原始干细胞的限定培养基。在溶液中，此培养基较于在培养的干细胞基本上是等渗的。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持胚性干细胞进行基本上非分化性生长所必需。
又如，WO2005086845公开了维持未分化干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于量足以将细胞维持在未分化状态的转化生长因子-β(TGFβ)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，维持足够的时间以实现所需的结果。
已知糖原合成酶激酶-3(GSK-3)的抑制剂可促进成体干细胞的增殖和扩增。例如，Tateishi 等人(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications(2007)352：635)显示，抑制GSK-3可增强从新生儿或成人心脏回收并具有间质特征的人心脏干细胞(hCSC)的生长和存活。
例如，Rulifson等人(PNAS 144，6247-6252，(2007))声称“Wnt信号传导可刺激胰岛β细胞增殖”。
又如，WO2007016485报道，添加GSK-3抑制剂至非胚胎干细胞(包括专能(multipotent)成体祖细胞)可导致在扩增期间维持多潜能表型，并导致更强的分化响应。
又如，US2006030042利用通过添加Wnt或GSK-3的小分子抑制剂来抑制GSK-3的方法，来在不使用饲养细胞层的情况下维持胚胎干细胞。
又如，WO2006026473报道添加GSK-3B抑制剂，通过转录激活c-myc和稳定c-myc蛋白来使多潜能细胞保持稳定。
又如，WO2006100490报道使用含有GSK-3抑制剂和gp130激动剂的干细胞培养基来维持多能干细胞(包括小鼠或人胚胎干细胞)的自我更新群体。
又如，Sato等人(Nature Medicine(2004)10：55-63)表明，用特异性药理性化合物抑制GSK-3可维持胚胎干细胞的未分化表型以及维持多潜能状态特异性转录因子例如Oct-3/4、Rex-1和Nanog的表达。
又如，Maurer等人(Journal of Proteome Research(2007)6：1198-1208)表明，用GSK-3抑制剂处理成体神经元干细胞可显示出神经元分化的增强，特别是通过促进β-连环蛋白靶基因的转录和使凋亡降低。
又如，Gregory等人(Annals of the New York Academy of Sciences(2005)1049：97-106)报道，GSK-3B的抑制剂可增强体外成骨作用。
又如，Feng等人(Biochemical and Biophysical Research Communcations(2004)324：1333-1339)表明，胚胎干细胞向造血分化与Wnt/β-连环蛋白途径的下调相关，其中Wnt是GSK3的天然抑制剂。
因此，仍然非常需要开发用于处理多能干细胞而使得多能干细胞可被扩增以满足当前临床需要，同时保持分化为胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞或胰腺激素分泌细胞的潜能的方法。
发明内容
本发明提供了通过用GSK-3B酶活性抑制剂处理多潜能细胞而使多潜能细胞扩增和分化的方法。
在一个实施例中，本发明提供了使多潜能细胞扩增和分化的方法，该方法包括如下步骤：
a.培养多潜能细胞，以及
b.用GSK-3B酶活性抑制剂处理所述多潜能细胞。
在一个实施例中，所述多潜能细胞分化成可表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
多潜能细胞可以是人胚胎干细胞，或者它们可以是根据60/913475中公开的方法衍生自人胚胎干细胞的表达多潜能标志物的细胞。
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂是式(I)化合物：
式(I)
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂是式(II)化合物：
式(II)
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂是式(III)化合物：
式(III)
附图说明
图1示出了一系列浓度的化合物JNJ 17189731对细胞数目的作用(分图A)和对Sox-17表达的作用(分图B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用INCell Analyzer 1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图2示出了一系列浓度的化合物JNJ 17163796对细胞数目的作用(分图A)和对Sox-17表达的作用(分图B)，其中细胞数目通过所观察到的 细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用INCell Analyzer 1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图3示出了一系列浓度的化合物JNJ 17223375对细胞数目的作用(分图A)和对Sox-17表达的作用(分图B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用INCell Analyzer 1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图4示出了一系列浓度的化合物JNJ 18157698对细胞数目的作用(分图A)和对Sox-17表达的作用(分图B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用INCell Analyzer 1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图5示出了一系列浓度的化合物JNJ 26158015对细胞数目的作用(分图A)和对Sox-17表达的作用(分图B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用INCell Analyzer 1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图6示出了一系列浓度的化合物JNJ 26483197对细胞数目的作用(分图A)和对Sox-17表达的作用(分图B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用INCell Analyzer 1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图7示出了一系列浓度的化合物JNJ 26483249对细胞数目的作用(分图A)和对Sox-17表达的作用(分图B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用INCell Analyzer 1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图8示出了一系列浓度的化合物JNJ 10220067对细胞数目的作用(分图A)和对Sox-17表达的作用(分图B)，其中细胞数目通过所观察到的 细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用INCell Analyzer 1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图9示出了在用所示化合物根据实例8中所述的方法处理过的细胞上，CXCR4在细胞表面上的表达，该表达通过免疫荧光染色和流式细胞检测分析测定。
图10示出了在用所示化合物根据实例8中所述的方法处理过的细胞上，CXCR4(分图A)、HNF-3β(分图B)和Sox-17(分图C)的表达，该表达通过实时PCR测定。
图11示出了一系列浓度的所示化合物对细胞数目的作用(分图A)和对Pdx-1表达的作用(分图B)，其中使用IN Cell Analyzer 1000(GEHealthcare)，细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Pdx-1表达通过免疫荧光染色的强度确定。细胞根据实例9中所述的方法进行处理。
图12示出了一系列浓度的所示化合物对Pdx-1表达(白色柱条)和HNF-6表达(黑色柱条)的作用，所述Pdx-1表达通过实时PCR测定。细胞根据实例9中所述的方法进行处理。
图13示出了一系列浓度的所示化合物对细胞数目的作用(分图A)和对胰岛素表达的作用(分图B)，其中使用IN Cell Analyzer 1000(GEHealthcare)，细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Pdx-1表达通过免疫荧光染色的强度确定。细胞根据实例10中所述的方法进行处理。
图14示出了一系列浓度的所示化合物对Pdx-1表达(白色柱条)和胰岛素表达(黑色柱条)的作用，所述表达通过实时PCR测定。细胞根据实例10中所述的方法进行处理。
图15示出了一系列浓度的所示化合物对细胞数目的作用(分图A)和对胰岛素表达的作用(分图B)，其中使用IN Cell Analyzer 1000(GEHealthcare)，细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Pdx-1表达通过免疫荧光染色的强度确定。细胞根据实例11中所述的方法进行处理。
具体实施方式
将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或举例说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞的能力、移植后产生多种胚层的组织的能力以及注射入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。
根据它们的发育潜能将干细胞分为：(1)全能干细胞，意指能够产生所有胚胎或胚外细胞类型；(2)多能干细胞，意指能够产生所有胚胎细胞类型；(3)专能干细胞，意指能够产生一亚群的细胞谱系，但这些细胞都位于特定的组织、器官或生理系统内(例如，造血干细胞(HSC)能够产生包括HSC(自我更新)、血细胞限制性寡能祖细胞和为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板)的子代；(4)寡能干细胞，意指能够产生比专能干细胞更为有限的一亚群细胞谱系；以及(5)单能干细胞，意指能够产生单种细胞谱系(如精原干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。如本文所用，“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标记物是指与所关注谱系的细胞表型特异性相关并能够用于评价非定向细胞向所关注谱系的分化的特征。
“β-细胞谱系”是指具有转录因子PDX-1和下列转录因子中的至少一种的阳性基因表达的细胞：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞包括β细胞。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞”是指可表达下列标记物中的至少一种的细胞：SOX-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
如本文所用，“表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞”是指表达下列标记物中的至少一种的细胞：PDX-1、HNF-1β、PTF-1α、HNF-6或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞包括胰腺内胚层细胞。
如本文所用，“表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞”是指表达下列标记物中的至少一种的细胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3或PTF-1α。表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内分泌细胞、胰激素表达细胞、胰激素分泌细胞和β-细胞谱系的细胞。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标记物：HNF-3β、GATA-4、SOX-17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和Mixl1。
如本文所用，“胚外内胚层”是指表达下列标记物中的至少一种的细胞群：SOX-7、AFP和SPARC。
如本文所用，“标记物”是指在所关注细胞内差异表达的核酸或多肽分子。在这个情形中，差异表达意思是阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。与其他细胞相比，所关注细胞中的核酸或多肽标记物的可检测水平足够高或足够低，使得可以使用本领域已知的多种方法识别所关注细胞，并将所关注细胞与其他细胞区相区分。
如本文所用，“中内胚层细胞”是指表达下列标记物中的至少一种的细胞：CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、SOX-17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF17、GATA-6。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”或“表达胰激素的细胞”是指能够表达下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用，“分泌胰激素的细胞”是指能够分泌下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用，“原条前体细胞”是指表达下列标记物中的至少一种的细胞：Nodal或FGF8
如本文所用，“原条细胞”是指表达下列标记物中的至少一种的细胞：Brachyury、Mix样同源盒蛋白或FGF4。
在一个实施例中，本发明提供了使多潜能细胞扩增和分化的方法，该方法包括用GSK-3B酶活性抑制剂处理多潜能细胞。
在一个实施例中，本发明提供了使多潜能细胞扩增和分化的方法，该方法包括如下步骤：
c.培养多潜能细胞，以及
d.用GSK-3B酶活性抑制剂处理所述多潜能细胞。
在一个实施例中，所述多潜能细胞分化成可表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX17、GATA4、Hnf-3β、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。本发明中还考虑的是衍生自多潜能细胞的表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞为原条前体细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞为中内胚层细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞为定形内胚层细胞。
可将多潜能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约1至约72小时。作为另一种选择，可将多潜能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约12至约48小 时。作为另一种选择，可将多潜能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约48小时。
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂以约100nM至约100μM的浓度使用。或者，GSK-3B酶活性抑制剂以约1μM至约10μM的浓度使用。或者，GSK-3B酶活性抑制剂以约10μM的浓度使用。
适用于本发明方法的化合物
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂是式(I)化合物以及其可药用盐：
式(I)
其中：
R1是苯基、取代的苯基(其中所述苯基取代基选自C1-5烷基、卤素、硝基、三氟甲基和腈)或嘧啶基；
R2是苯基、取代的苯基(其中所述苯基取代基选自C1-5烷基、卤素、硝基、三氟甲基和腈)或嘧啶基(其任选被C1-4烷基取代)，并且R1和R2中的至少一者是嘧啶基；
R3是氢、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、C1-5烷氧羰基、芳氧羰基、芳基C1-5烷氧羰基、芳基C1-5烷基、取代的芳基C1-5烷基(其中一个或多个芳基取代基独立地选自C1-5烷基、C1-5烷氧基、卤素、氨基、C1-5烷基氨基和二C1-5烷基氨基)、邻苯二甲酰亚胺基C1-5烷基、氨基C1-5烷基、二氨基C1-5烷基、琥珀酰亚胺基C1-5烷基、C1-5烷基羰基、芳基羰基、C1-5烷基羰基C1-5烷基和芳氧羰基C1-5烷基；
R4是-(A)-(CH2)q-X；
A是乙烯撑基、亚乙炔基或
R5选自氢、C1-5烷基、苯基和苯基C1-5烷基；
q为0-9；
X选自氢、羟基、乙烯基、取代的乙烯基(其中一个或多个乙烯基取代基各自选自氟、溴、氯化和碘)、乙炔基、取代的乙炔基(其中乙炔基取代基选自氟、溴、氯和碘)、C1-5烷基、取代的C1-5烷基(其中一个或多个烷基取代基各自选自C1-5烷氧基、三卤代烷基、邻苯二甲酰亚胺基和氨基)、C3-7环烷基、C1-5烷氧基、取代的C1-5烷氧基(其中烷基取代基选自邻苯二甲酰亚胺基和氨基)、邻苯二甲酰亚胺基氧基、苯氧基、取代的苯氧基(其中一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基)、苯基、取代的苯基(其中一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基)、芳基C1-5烷基、取代的芳基C1-5烷基(其中一个或多个芳基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基)、芳氧基C1-5烷基氨基、C1-5烷基氨基、二C1-5烷基氨基、腈、肟、苄氧基亚胺基、C1-5烷氧基亚胺基、邻苯二甲酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、C1-5烷基羰氧基、苯基羰氧基、取代的苯基羰氧基(其中一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基)、苯基C1-5烷基羰氧基(其中一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基)、氨基羰氧基、C1-5烷基氨基羰氧基、二C1-5烷基氨基羰氧基、C1-5烷氧羰氧基、取代的C1-5烷氧羰氧基(其中一个或多个烷基取代基各自选自甲基、乙基、异丙基和己基)、苯氧基羰氧基、取代的苯氧基羰氧基(其中一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、C1-5烷氧基和卤素)、C1-5烷硫基、取代的C1-5烷硫基(其中烷基取代基选自羟基和邻苯二甲酰亚胺基)、C1-5烷基磺酰基、苯基磺酰基、取代的苯基磺酰基(其中一个或多个苯基取代基各自选自溴、氟、氯、C1-5烷氧基和三氟甲基)；前提条件是，如果A是 q为0且X是H，则R3可以不是2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基。
本发明的例子包括其中R1为取代的苯基且R2为嘧啶-3-基的式(I)化合物。
本发明的例子包括其中R1为4-氟代苯基的式(I)化合物。
本发明的例子包括其中R3为氢、芳基C1-5烷基或取代的芳基C1-5烷基的式(I)化合物。
本发明的例子包括其中R3为氢或苯基C1-5烷基的式(I)化合物。
本发明的例子包括其中A为亚乙炔基且q为0-5的式(I)化合物。
本发明的例子包括其中X是琥珀酰亚胺基、羟基、甲基、苯基、C1-5烷基磺酰基、C3-6环烷基、C1-5烷基羰氧基、C1-5烷氧基、苯基羰氧基、C1-5烷基氨基、二C1-5烷基氨基或腈的式(I)化合物。
共同转让的美国专利号6,214,830中公开了式(I)化合物，将该专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。
本发明的例子包括其中化合物选自如下化合物的式(I)化合物：
本发明的例子包括其中化合物为下式表示的化合物5的式(I)化合物：
化合物5
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂是式(II)化合物以及其可药用盐：
式(II)
其中：
R选自Ra、-C1-8烷基-Ra、-C2-8烯基-Ra、-C2-8炔基-Ra和氰基；
Ra选自环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
R1选自氢、-C1-8烷基-R5、-C2-8烯基-R5、-C2-8炔基-R5、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-C(O)-NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6；其中杂环基和杂芳基通过杂环基或杂芳基环碳原子与1号位上的氮杂吲哚氮原子连接；
R5是1至2个独立地选自如下基团的取代基：氢、-O-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-OH、-O-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-NH2、-O-(C1-8)烷基-NH(C1-8烷基)、-O-(C1-8)烷基-N(C1-8烷基)2、-O-(C1-8)烷基-S-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-SO2-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-SO2-NH2、-O-(C1-8)烷基-SO2-NH(C1-8烷基)、-O-(C1-8)烷基-SO2-N(C1-8烷基)2、-O-C(O)H、-O-C(O)-(C1-8)烷基、-O-C(O)-NH2、-O-C(O)-NH(C1-8烷基)、-O-C(O)-N(C1-8烷基)2、-O-(C1-8)烷基-C(O)H、-O-(C1-8)烷基-C(O)-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-CO2H、-O-(C1-8)烷基-C(O)-O-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-C(O)-NH2、-O-(C1-8)烷基-C(O)-NH(C1-8烷基)、-O-(C1-8)烷基-C(O)-N(C1-8烷基)2、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基)、-C(O)-N(C1-8烷基)2、-SH、-S-(C1-8)烷基、-S-(C1-8)烷基-S-(C1-8)烷基、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基-OH、-S-(C1-8)烷 基-O-(C1-8)烷基-NH2、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基-NH(C1-8烷基)、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基-N(C1-8烷基)2、-S-(C1-8)烷基-NH(C1-8烷基)、-SO2-(C1-8)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基)、-SO2-N(C1-8烷基)2、-N-R7、氰基、(卤素)1-3、羟基、硝基、氧代基、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6；
R6是1至4个独立地选自如下基团的与碳或氮原子连接的取代基：氢、-C1-8烷基、-C2-8烯基、-C2-8炔基、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基)、-C(O)-N(C1-8)烷基)2、-SO2-(C1-8)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基)、-SO2-N(C1-8烷基)2、-(C1-8)烷基-N-R7、-(C1-8)烷基-(卤素)1-3、-(C1-8)烷基-OH、-芳基-R8、-(C1-8)烷基-芳基-R8和-(C1-8)烷基-杂芳基-R8；前提条件是，当R6与碳原子连接时，R6进一步选自-C1-8烷氧基、-(C1-8)烷氧基-(卤素)1-3、-SH、-S-(C1-8)烷基、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、氧代基和-杂芳基-R8；
R7是2个独立地选自如下基团的取代基：氢、-C1-8烷基、-C2-8烯基、-C2-8炔基、-(C1-8)烷基-OH、-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基、-(C1-8)烷基-NH2、-(C1-8)烷基-NH(C1-8烷基)、-(C1-8)烷基-N(C1-8烷基)2、-(C1-8)烷基-S-(C1-8)烷基、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基、-C(O)-O-(C1-8)烷基、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基)、-C(O)-N(C1-8烷基)2、-SO2-(C1-8)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基)、-SO2-N(C1-8烷基)2、-C(N)-NH2、-环烷基-R8、-(C1-8)烷基-杂环基-R8、-芳基-R8、-(C1-8)烷基-芳基-R8和-(C1-8)烷基-杂芳基-R8；
R8是1至4个独立地选自如下基团的与碳或氮原子连接的取代基：氢、-C1-8烷基、-(C1-8)烷基-(卤素)1-3和-(C1-8)烷基-OH；前提条件是，当R8与碳原子连接时，R8进一步选自-C1-8烷氧基、-NH2、-NH(C1-8烷基)、-N(C1-8烷基)2、氰基、卤素、-(C1-8)烷氧基-(卤素)1-3、羟基和硝基；
R9是1至2个独立地选自如下基团的取代基：氢、-C1-8烷氧基、-NH2、-NH(C1-8烷基)、-N(C1-8烷基)2、氰基、(卤素)1-3、羟基和硝基；
R2是1个选自如下基团的与碳或氮原子连接的取代基：氢、-C1-8烷基-R5、-C2-8烯基-R5、-C2-8炔基-R5、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-CO2H、- C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-芳基-R6和-(C1-8)烷基-N-R7；前提条件是，当R2与碳原子连接时，R2进一步选自-C1-8烷氧基-R5、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、氧代基、-杂环基-R6和-杂芳基-R6；
R3是1至3个独立地选自如下基团的与碳原子连接的取代基：氢、-C1-8烷基-R10、-C2-8烯基-R10、-C2-8炔基-R10、-C1-8烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8；
R4是1至4个独立地选自如下基团的与碳原子连接的取代基：氢、-C1-8烷基-R10、-C2-8烯基-R10、-C2-8炔基-R10、-C1-8烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SH、-S-(C1-8)烷基-R10、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基-R9)、-SO2-N(C1-8烷基-R9)2、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8；
R10是1至2个独立地选自如下基团的取代基：氢、-NH2、-NH(C1-8烷基)、-N(C1-8烷基)2、氰基、(卤素)1-3、羟基、硝基和氧代基；并且，
Y和Z独立地选自O、S、(H、OH)和(H、H)；前提条件是，Y和Z其中一者是O而另一者选自O、S、(H、OH)和(H、H)。
本发明的实施例包括其中R选自Ra、-C1-4烷基-Ra、-C2-4烯基-Ra、-C2-4炔基-Ra和氰基的式(II)化合物。
本发明的实施例包括其中Ra选自杂环基、芳基和杂芳基的式(II)化合物。
在一个实施例中，Ra选自二氢-吡喃基、苯基、萘基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、氮杂吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并呋喃基和二苯并噻吩基。
本发明的实施例包括其中R1选自如下基团的式(II)化合物：氢、-C1-4烷基-R5、-C2-4烯基-R5、-C2-4炔基-R5、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-SO2-(C1-4)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6；其中杂环基和杂芳基通过杂环基或杂芳基环碳原子与1号位上的氮杂吲哚氮原子连接。
在一个实施例中，R1选自氢、-C1-4烷基-R5、-芳基-R6和-杂芳基-R6；其中杂芳基通过杂芳基环碳原子与1号位上的氮杂吲哚氮原子连接。
在一个实施例中，R1选自氢、-C1-4烷基-R5和-萘基-R6。
本发明的实施例包括其中R5是1至2个独立地选自如下基团的取代基的式(II)化合物：氢、-O-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-OH、-O-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-NH2、-O-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-O-(C1-4)烷基-N(C1-4烷基)2、-O-(C1-4)烷基-S-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-SO2-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-SO2-NH2、-O-(C1-4)烷基-SO2-NH(C1-4烷基)、-O-(C1-4)烷基-SO2-N(C1-4烷基)2、-O-C(O)H、-O-C(O)-(C1-4)烷基、-O-C(O)-NH2、-O-C(O)-NH(C1-4烷基)、-O-C(O)-N(C1-4烷基)2、-O-(C1-4)烷基-C(O)H、-O-(C1-4)烷基-C(O)-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-CO2H、-O-(C1-4)烷基-C(O)-O-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-C(O)-NH2、-O-(C1-4)烷基-C(O)-NH(C1-4烷基)、-O-(C1-4)烷基-C(O)-N(C1-4烷基)2、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基)、-C(O)-N(C1-4烷基)2、-SH、-S-(C1-4)烷基、-S-(C1-4)烷基-S-(C1-4)烷基、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-OH、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-NH2、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-N(C1-4烷基)2、-S-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-SO2-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)、-SO2-N(C1-4烷基)2、-N-R7、氰基、(卤素)1-3、羟基、硝基、氧代基、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6。
在一个实施例中，R5是1至2个独立地选自如下基团的取代基：氢、-O-(C1-4)烷基、-N-R7、羟基和-杂芳基-R6。
在一个实施例中，R5是1至2个独立地选自如下基团的取代基：氢、-O-(C1-4)烷基、-N-R7、羟基、-咪唑基-R6、-三唑基-R6和-四唑基-R6。
本发明的实施例包括其中R6是1至4个独立地选自如下基团的与碳或氮原子连接的取代基的式(II)化合物：氢、-C1-4烷基、-C2-4烯基、-C2-4炔基、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基)、-C(O)-N(C1-4)烷基)2、-SO2-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)、-SO2-N(C1-4烷基)2、-(C1-4)烷基-N-R7、-(C1-4)烷基-(卤素)1-3、-(C1-4)烷基-OH、-芳基-R8、-(C1-4)烷基-芳基-R8和-(C1-4)烷基-杂芳基-R8；前提条件是，当R6与碳原子连接时，R6进一步选自-C1-4烷氧基、-(C1-4)烷氧基-(卤素)1-3、-SH、-S-(C1-4)烷基、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、氧代基和-杂芳基-R8。
在一个实施例中，R6是氢。
本发明的实施例包括其中R7是2个独立地选自如下基团的取代基的式(II)化合物：氢、-C1-4烷基、-C2-4烯基、-C2-4炔基、-(C1-4)烷基-OH、-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基、-(C1-4)烷基-NH2、-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-(C1-4)烷基-N(C1-4烷基)2、-(C1-4)烷基-S-(C1-4)烷基、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基)、-C(O)-N(C1-4烷基)2、-SO2-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)、-SO2-N(C1-4烷基)2、-C(N)-NH2、-环烷基-R8、-(C1-4)烷基-杂环基-R8、-芳基-R8、-(C1-4)烷基-芳基-R8和-(C1-4)烷基-杂芳基-R8。
在一个实施例中，R7是2个独立地选自如下基团的取代基：氢、-C1-4烷基、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)和-SO2-N(C1-4烷基)2。
本发明的实施例包括其中R8是1至4个独立地选自如下基团的与碳或氮原子连接的取代基的式(II)化合物：氢、-C1-4烷基、-(C1-4)烷基-(卤素)1-3和-(C1-4)烷基-OH；前提条件是，当R8与碳原子连接时，R8进一步选自-C1-4烷氧基、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、卤素、-(C1-4)烷氧基-(卤素)1-3、羟基和硝基。
在一个实施例中，R8是氢。
本发明的实施例包括其中R9是1至2个独立地选自如下基因的取代基的式(II)化合物：氢、-C1-4烷氧基、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、(卤素)1-3、羟基和硝基。
在一个实施例中，R9是氢。
本发明的实施例包括其中R2是1个选自如下基团的与碳或氮原子连接的取代基的式(II)化合物：氢、-C1-4烷基-R5、-C2-4烯基-R5、-C2-4炔基-R5、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-4)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-芳基-R6和-(C1-4)烷基-N-R7；前提条件是，当R2与碳原子连接时，R2进一步选自-C1-4烷氧基-R5、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、氧代基、-杂环基-R6和-杂芳基-R6。
在一个实施例中，R2是1个选自如下基团的与碳或氮原子连接的取代基：氢、-C1-4烷基-R5、-C2-4烯基-R5、-C2-4炔基-R5、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-环烷基-R6、-芳基-R6和-(C1-4)烷基-N-R7；前提条件是，当R2与氮原子连接时，不形成季铵盐；并且，前提条件是，当R2与碳原子连接时，R2进一步选自选自-C1-4烷氧基-R5、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、氧代基、-杂环基-R6和-杂芳基-R6。
在一个实施例中，R2是1个选自如下基团的与碳或氮原子连接的取代基：氢、-C1-4烷基-R5和-芳基-R6；前提条件是，当R2与氮原子连接时，不形成季铵盐；并且，前提条件是，当R2与碳原子连接时，R2进一步选自-N-R7、卤素、羟基和-杂芳基-R6。
本发明的实施例包括其中R3是1至3个独立地选自如下基团的与碳原子连接的取代基的式(II)化合物：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-N-R7、-(C1-4)烷基-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8。
在一个实施例中，R3是1个选自如下基团的与碳原子连接的基团：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、- C(O)H、-CO2H、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、卤素、羟基和硝基。
在一个实施例中，R3是1个选自如下基团的与碳原子连接的取代基：氢、-C1-4烷基-R10、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、卤素和羟基。
本发明的实施例包括其中R4是1至4个独立地选自如下基团的与碳原子连接的取代基的式(II)化合物：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SH、-S-(C1-4)烷基-R10、-SO2-(C1-4)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基-R9)、-SO2-N(C1-4烷基-R9)2、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8。
在一个实施例中，R4是1至4个独立地选自如下基团的与碳原子连接的取代基：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、-C(O)H、-CO2H、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基、-杂环基、-芳基和-杂芳基。
在一个实施例中，R4是1至4个独立地选自如下基团的与碳原子连接的取代基：氢、C1-4烷基-R10、C1-4烷氧基-R10、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、卤素和羟基。
在一个实施例中，R4是1至4个独立地选自如下基团的与碳原子连接的取代基：氢、C1-4烷基-R10、C1-4烷氧基-R10、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氯、氟和羟基。
本发明的实施例包括其中R10是1至2个独立地选自如下基团的取代基的式(II)化合物：氢、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、(卤素)1-3、羟基、硝基和氧代基。
在一个实施例中，R10是1至2个独立地选自氢和(卤素)1-3的取代基。
在一个实施例中，R10是1至2个独立地选自氢和(氟)3的取代基。
本发明的实施例包括其中Y和Z独立地选自O、S、(H、OH)和(H、H)的式(II)化合物；前提条件是，Y和Z其中一者是O而另一者选自O、S、(H、OH)和(H、H)。
在一个实施例中，Y和Z独立地选自O和(H、H)；前提条件是，Y和Z其中一者是O而另一者选自O和(H、H)。
在一个实施例中，Y和Z独立地选自O。
共同转让的美国专利号7,125,878中公开了式(II)化合物，将该专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。
本发明的例子包括其中化合物选自如下化合物的式(II)化合物：
本发明的例子包括其中化合物选自如下化合物的式(II)化合物：
化合物11 化合物26 化合物40
化合物41 化合物42 化合物43
化合物44
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂是式(III)化合物以及其可药用盐：
式(III)
其中
A和E独立地选自氢取代的碳原子和氮原子；其中 独立地选自1H-吲哚、1H-吡咯并[2，3-b]吡啶、1H-吡唑并[3，4-b]吡啶和1H-吲唑；Z选自O；或者，Z选自二氢，其中每个氢原子通过单键连接；
R4和R5独立地选自任选被氧代基取代的C1-8烷基、C2-8烯基和C2-8炔基；R2选自-C1-8烷基-、-C2-8烯基-、-C2-8炔基-、-O-(C1-8)烷基-O-、-O-(C2-8)烯基-O-、-O-(C2-8)炔基-O-、-C(O)-(C1-8)烷基-C(O)-(其中上述烷基、烯基和炔基连接基团中任一者是直链碳链，任选被1至4个独立地选自如下基团的取代 基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、-C(O)O-(C1-8)烷基、-C1-8烷基-C(O)O-(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤素)1-3(C1-8)烷基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、羟基、羟基(C1-8)烷基和氧代基；并且，其中上述烷基、烯基和炔基连接基团中任一者任选被一个或两个独立地选自如下基团的取代基取代：杂环基、芳基、杂芳基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基、杂芳基(C1-8)烷基、螺环烷基和螺杂环基(其中上述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基取代基中任一者任选被1至4个独立地选自如下基团的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤素)1-3(C1-8)烷基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且，其中上述杂环基取代基中任一者任选被如下取代基取代：氧代基))、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基(其中环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选被1至4个独立地选自如下基团的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤素)1-3(C1-8)烷基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且，其中杂环基任选被氧代基取代)、-(O-(CH2)1-6)0-5-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-(O-(CH2)1-6)0-5-NR6-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-、-(O-(CH2)1-6)0-5-S-、-O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-、-NR6-、-NR6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-、-NR6-C(O)-、-C(O)-NR6-、-C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-、-NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-、-NR6-C(O)-NR7-、-NR6-C(NR7)-NR8-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-、-NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7-和-SO2-(其中R6、R7和R8独立地选自氢、C1-8烷基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基(C1-8)烷基、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、羟基(C1-8)烷基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基和杂芳基 (C1-8)烷基(其中上述杂环基、芳基和杂芳基取代基任选被1至4个独立地选自如下基团的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基任选被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤素)1-3(C1-8)烷基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且，其中杂环基任选被氧代基取代))；前提条件是，如果A和E选自氢取代的碳原子，则R2选自-C2-8炔基-、-O-(C1-8)烷基-O-、-O-(C2-8)烯基-O-、-O-(C2-8)炔基-O-、-C(O)-(C1-8)烷基-C(O)-(其中上述烷基、烯基和炔基连接基中任一者是直链碳链，任选被1至4个独立地选自如下基团的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、-C(O)O-(C1-8)烷基、-C1-8烷基-C(O)O-(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤素)1-3(C1-8)烷基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、羟基、羟基(C1-8)烷基和氧代基；并且，其中上述烷基、烯基和炔基连接基团中任一者任选被一个或两个独立地选自如下基团的取代基取代：杂环基、芳基、杂芳基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基、杂芳基(C1-8)烷基、螺环烷基和螺杂环基(其中上述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基取代基中任一者任选被1至4个独立地选自如下基团的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤素)1-3(C1-8)烷基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且，其中上述杂环基取代基中任一者任选被如下取代基取代：氧代基))、环烷基(其中环烷基任选被1至4个独立地选自如下基团的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤素)1-3(C1-8)烷基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基)、-(O-(CH2)1-6)1-5-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-(O-(CH2)1-6)1-5-NR6-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-、-(O-(CH2)1-6)0-5-S-、-O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6- O-(CH2)1-6-S-、-NR6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-、-NR9-C(O)-、-C(O)-NR9-、-C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-、-NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-、-NR6-C(O)-NR7-、-NR6-C(NR7)-NR8-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-和-NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7-(其中R6、R7和R8独立地选自氢、C1-8烷基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基(C1-8)烷基、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、羟基(C1-8)烷基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基和杂芳基(C1-8)烷基(其中上述杂环基、芳基和杂芳基取代基任选被1至4个独立地选自如下基团的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤素)1-3(C1-8)烷基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且，其中杂环基任选被氧代基取代)；并且，其中R9选自C1-8烷基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基(C1-8)烷基、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、羟基(C1-8)烷基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基和杂芳基(C1-8)烷基(其中上述杂环基、芳基和杂芳基取代基任选被1至4个独立地选自如下基团的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤素)1-3(C1-8)烷基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且，其中杂环基任选被氧代基取代))；并且，
R1和R3独立地选自氢、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基(其中烷基、烯基和炔基任选被选自如下基团的取代基取代：C1-8烷氧基、烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、(卤素)1-3、(卤素)1-3(C1-8)烷基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、羟基、羟基(C1-8)烷基和氧代基)、C1-8烷氧基、C1-8烷氧羰基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、C1-8烷硫基、芳基、杂芳基(其中芳基和杂芳基任选被选自如下基团的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立 地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤素)1-3(C1-8)烷基、(卤素)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基)、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氰基、卤素、羟基和硝基。
在一个实施例中，式(III)化合物是选自如下的化合物以及其可药用盐：
式(IIIa) 式(IIIb)
式(IIIc) 式(IIId)
式(IIIe) 式(IIIf)
式(IIIg) 式(IIIh)
式(IIIi) 式(IIIj)
式(IIIk) 式(IIIi)
式(IIIm) 式(IIIn)
其中所有其他变量是如此前所定义的。
在一个实施例中，式(III)化合物是选自如下的化合物以及其可药用盐：
式(IIIa) 式(IIIb)
式(IIIf) 式(IIIi)
式(IIIj)
其中所有其他变量是如此前所定义的。
共同转让的美国专利号6,828,327中公开了式(III)化合物，将该专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。
本发明的一个例子包括其中化合物选自如下的式(III)化合物：
本发明的一个例子包括其中化合物选自如下的式(III)化合物：
化合物1 化合物2 化合物5
化合物6
本发明的另一个例子包括选自如下的化合物：
本发明的另一个例子包括选自如下的化合物：
化合物1a 化合物2a 化合物3a
化合物4a 化合物5a 化合物6a
化合物7a 化合物8a 化合物9a
化合物10a 化合物11a 化合物12a
化合物13a 化合物14a 化合物15a
化合物16a 化合物17a 化合物18a
化合物19a 化合物20a 化合物21a
化合物22a 化合物23a 化合物24a
化合物25a 化合物26a 化合物27a
化合物28a 化合物29a 化合物30a
化合物31a 化合物32a
适于根据本发明方法的处理的细胞
适用本发明的多潜能细胞表达至少一种选自如下的多潜能标志物：ABCG2、cripto、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、SOX-2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60和Tra1-81。
在一个实施例中，多潜能细胞是胚胎干细胞。在一个替代实施例中，多潜能细胞是衍生自胚胎干细胞的表达多潜能标志物的细胞。在一个实施例中，胚胎干细胞是人胚胎干细胞。
人胚胎干细胞的分离、扩增和培养
人胚胎干细胞的表征：人胚胎干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体(Thomson等人，Science282：1145，1998)检测的标志物中的一种或多种。人胚胎干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的人胚胎干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显影来检测，如生产商(Vector Laboratories，Burlingame Calif)所描述的。未分化的多能干细胞通常还表达Oct-4和TERT，这可由RT-PCR检测。
增殖的人胚胎干细胞的另一期望表型是有潜能分化成所有三个胚层：内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞。可以例如通过如下方式来确定干细胞的多潜能性：将细胞注射入SCID小鼠，用4％的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对其进行组织学检验，找出来自三个胚层的细胞类型的证据。作为另外一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中三个胚层相关的标记物的存在来确定多能性。
可以使用标准G带显带技术并与相应灵长类物种的已公开的核型进行比较来分析增殖的人胚胎干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”(其意指细胞是整倍体的)的细胞，其中所有人染色体都存在并且无明显的改变。
人胚胎干细胞的来源选自人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。
在一个实施例中，人胚胎干细胞是如Thomson等人(美国专利No.5,843,780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133 ff.，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：7844，1995)所描述制备。
人胚胎干细胞的培养：在一个实施例中，将人胚胎干细胞在基本上不含饲养细胞、但仍支持人胚胎干细胞增殖而不进行大量分化的培养系统中培养。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持人胚胎干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持人胚胎干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
在一个替代实施例中，将人胚胎干细胞最初在饲养细胞层上培养，该饲养细胞可以多种方式支持人胚胎干细胞。然后将人胚胎转移至基本上无饲养细胞、但仍支持人胚胎干细胞增殖而不进行大量分化的培养系统中培养。
适用于本发明的调理培养基的例子在US20020072117、US6642048、WO2005014799和Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004)中有所公开。
适用于本发明的化学成分确定的培养基的例子可在US20070010011找到。
合适的培养基可以由下列组分制成，例如为：达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco#11965-092；Knockout达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KO DMEM)，Gibco#10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM的L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。
在一个实施例中，将人胚胎干细胞接种在合适的培养基质上，该培养基质在根据本发明方法处理前进行了处理。在一个实施例中，处理物是细胞外基质组分，例如衍生自基底膜或可形成粘附分子受体-配体配偶体的部分的那些。在一个实施例中，合适的培养基质是 (Becton Dickenson)。 是来自于Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下会发生胶化从而形成重构基底膜。
其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。这可以包括层粘连蛋白、纤粘蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等等，它们可以单独使用或多种组合使用。
可在存在促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
衍生自人胚胎干细胞的表达多潜能标志物的细胞的分离、扩增和培养
在一个实施例中，可表达多潜能标志物的细胞通过包括如下步骤的方法而衍生自人胚胎干细胞：
a.培养人胚胎干细胞，
b.使所述人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层细胞特征性标志物的细胞，以及
c.移出细胞，随后将它们在低氧条件下在组织培养基质上培养，在培养细胞之前该组织培养基质没有用蛋白质或细胞外基质进行预处理。
在一个实施例中，可表达多潜能标志物的细胞通过包括如下步骤的方法而衍生自人胚胎干细胞：
a.培养人胚胎干细胞，并且
b.移出细胞，随后将它们在低氧条件下在组织培养基质上培养，该组织培养基质没有用蛋白质或细胞外基质进行预处理。
细胞在低氧条件下在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基质上的培 养
在一个实施例中，将细胞在低氧条件下，在未用细胞外基质涂覆的组织培养基质上培养约1至约20天。在一个替代实施例中，将细胞在低氧条件下，在未用细胞外基质涂覆的组织培养基质上培养约5至约20天。在一个替代实施例中，将细胞在低氧条件下，在未用细胞外基质涂覆的组织培养基质上培养约15天。
在一个实施例中，低氧条件是约1％的O2至约20％的O2。在一个替代实施例中，低氧条件是约2％的O2至约10％的O2。在一个替代实施例中，低氧条件是约3％的O2。
可将细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基质上在含有血清、激活素A和Wnt配体的培养基中培养。作为另一种选择，该培养基还可含有IGF-1。
该培养基可具有在约2％至约5％的范围内的血清浓度。在一个替代实施例中，血清浓度可以为约2％。
激活素可以约1pg/mL至约100μg/mL的浓度使用。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约1μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
Wnt配体可选自Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体是Wnt-1。在一个替代实施例中，Wnt配体是Wnt-3a。
Wnt配体可以约1ng/mL至约1000ng/mL的浓度使用。在一个替代实施例中，Wnt配体可以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度使用。在一个实施例中，Wnt配体的浓度是约20ng/mL。
IGF-1可以约1ng/mL至约100ng/mL的浓度使用。在一个替代实施例中，IGF-1可以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度使用。在一个实施例中，IGF-1的浓度是约50ng/mL。
通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞能够在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基质上，在低氧条件下在培养物中扩增。
通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞可表达至少一种选自如下的多潜能标志物：ABCG2、cripto、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、SOX-2、Nanog、 hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60和Tra1-81。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的进一步分化
可以通过本领域的任何方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，还通过下述方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞：用成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，随后将细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和KAA-环巴胺的培养基中进行培养。该方法的一个例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，24：1392-1401，(2006)有所公开。
胰腺内胚层谱特征性标志物选自Pdx1、HNF-1β，PTF1a、HNF-6、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞为胰腺内胚层细胞。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的进一步分化
可以通过本领域的任何方法，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D'Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
胰腺内分泌谱系特征性标记物选自NGN-3、神经源性分化蛋白(NeuroD)、Islet-1、Pdx-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3以及PTF-1α。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达至少一种以下激素：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的细胞为表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞为胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以是胰激素表达细胞。或者，胰腺内分泌细胞可以是胰激素分泌细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标记物的细胞可表达Pdx1以及至少一种以下转录因子：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、 MAFA、Pax4和Pax6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可以通过在特定方案前后检测标志物的存在情况来确定。多能干细胞通常不表达这类标志物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多潜能细胞的分化。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印记、原位杂交(参见例如，Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人(编辑)，2001增刊))以及免疫测定法(例如切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印记以及针对完整细胞中可触及的标志物的流式细胞分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的例子在表IA中列出。应该指出的是，针对表IA所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可获得的，或可容易开发还可以采用这种替代抗体来评价根据本发明的分离细胞中标志物的表达。
例如，多能干细胞的特征是本领域技术人员所熟知的，并且多能干细胞的其他特征不断地被鉴别。多能干细胞标志物包括(例如)如下标志物中的一者或多者的表达：ABCG2、cripto、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过将处理过的细胞群体暴露于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(例如CXCR4)来进行纯化。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内胚层谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内胚层谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内胚层谱系特征性特性。胰腺内胚层谱系的特异性标志物包括一种或多种转录因子，例如Hlxb9、PTF-1a、PDX-1、HNF-6、HNF-1β的表达。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印记、原位杂交(参见例如，Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人(编辑)，2001增刊))以及免疫测定法(例如切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印记以及针对完整细胞中可触及的标志物的流式细胞分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的例子在表IA中列出。应该指出的是，针对表IA所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可获得的，或可容易开发还可以采用这种替代抗体来评价根据本发明的分离细胞中标志物的表达。
表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内分泌谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内分泌谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内分泌谱系特征性特性。胰腺内分泌谱系的特异性标志物包括一种或多种转录因子，例如NGN-3、NeuroD、Islet-1的表达。
β细胞谱系特征性标志物是本领域技术人员熟知的，并且其他的β细胞谱系特征性标志物有待继续辨别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得β细胞谱系特征性特性。β细胞谱系特异性特征包括一种或多种转录因子例如Pdx1(胰十二指肠同源盒基因-1)、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6、Pax4、NeuroD、Hnf1b、Hnf-6、Hnf-3β和MafA等的 表达。这些转录因子在内分泌细胞鉴别领域中已得到公认。参见例如Edlund(Nature Reviews Genetics 3：524-632(2002))。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。或者，可以通过将处理过的细胞群暴露于特别地识别以下蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来测定分化效率，该标志物由表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印记、原位杂交(参见例如，Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人(编辑)，2001增刊))以及免疫测定法(例如切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印记以及针对完整细胞中可触及的标志物的流式细胞分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的例子在表IA中列出。应该指出的是，针对表IA所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可获得的，或可容易开发还可以采用这种替代抗体来评价根据本发明的分离细胞中标志物的表达。
本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。
实例1
人胚胎干细胞培养物
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞的能力以及移植后产生多种胚层的组织的能力和注射入胚泡后相当有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。
从WiCell Research Institute，Inc.，(Madison，WI)获得人胚胎干细胞系H1、H7和H9，并根据该来源公司提供的说明进行培养。简而言之，在ES细胞培养基中，在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养细胞，所述培养 基由补充有20％的Knockout血清替代品、100nM的MEM非必需氨基酸、0.5mM的β-巯基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺和4ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(全部得自Invitrogen/GIBCO)的DMEM/F 12(Invitrogen/GIBCO)组成。衍生自E13至13.5小鼠胚胎的MEF细胞从Charles River购得。将MEF细胞在补充有10％FBS(Hyclone)、2mM谷氨酰胺和100mM MEM非必需氨基酸的DMEM培养基中扩增。用10μg/ml丝裂霉素C(Sigma(St.Louis，MO))处理亚汇合态MEF细胞培养物3小时，以阻止细胞分裂，然后用胰蛋白酶处理并以2×104/cm2的密度接种在用0.1％牛明胶涂布的培养皿上。将传代两次至四次的MEF细胞用作饲养层。将铺在MEF细胞饲养层上的人胚胎干细胞在增湿的组织培养箱中于37℃在含5％的CO2的大气中培养。当汇合时(接种后大约5-7天)，用1mg/ml IV型胶原酶(Invitrogen/GIBCO)处理人胚胎干细胞5-10分钟，然后用5ml吸管轻轻刮落。将细胞以900rpm离心5分钟，然后将沉淀物以细胞在新鲜培养基中为1∶3至1∶4的比率重新悬浮，并再次接种。
同时，将H1、H7和H9人胚胎干细胞也接种于包被有低生长因子MATRIGELTM(BDBiosciences)的1∶30稀释物的板上并在补充有8ng/mL的bFGFMEF调理培养基中培养。将在MATRIGELTM上培养的细胞用胶原酶IV(Invitrogen/GIBCO)、分散酶(BD Biosciences)或Liberase酶(Source)进行常规的传代。将该人胚胎干细胞培养中的一些在低氧条件(大约3％的O2)下孵育。
实例2
衍生自人胚胎干细胞的可表达多潜能标志物的细胞的衍生和培养
将来自人胚胎干细胞系H1和H9多个传代(第30-54代)的细胞在低氧条件(大约3％的O2)下培养至少三代。根据实例1将细胞在补充有8ng/mL bFGF的MEF-CM中培养并接种于包被有MATRIGEL的板上。
然后用补充有0.5％FBS、20ng/mL WNT-3a(目录号1324-WN-002，R&D Systems，MN)和100ng/mL激活素-A(R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基处理细胞两天，然后用补充有2％FBS和100ng/mL激活素-A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理3至4天。该方案导致定形内胚层标志物显著上调。
然后将细胞用TrypLETM Express溶液(Invitrogen，CA)处理5分钟。将脱离的细胞再悬浮于DMEM-F12+2％FBS培养基中，离心回收，并用血球计进行计数。将脱离的细胞以1000-10,000个细胞/cm2接种组织培养聚苯乙烯(TCPS)处理过的培养瓶上并在标准组织培养箱中，于37℃在低氧条件(大约3％的O2)下在DMEM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A+20ng/mLWNT-3A中培养。该TCPS培养瓶未用MATRIGEL或其他细胞外基质蛋白包被。每日更换培养基。在某些培养物中，该培养基还补充有10-50ng/mL的IGF-I(胰岛素生长因子-I，购自R&D Systems，MN)或1X ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒，购自Invitrogen，Ca)。在某些培养条件下，基础培养基(DM-F12+2％FBS)还补充有0.1mM的巯基乙醇(Invitrogen，CA)和非必需氨基酸(1X，NEAA，购自Invitrogen，CA)。
在培养5至15天后，明显的细胞集落呈现出被大量扩大的细胞围绕，这些扩大的细胞看起来处于衰老状态。在大约50至60％汇合时，通过在室温下暴露于TrypLETMExpress溶液5分钟来使培养物传代。将脱离的细胞再悬浮于DMEM-F12+2％FBS培养基中，离心回收，在组织培养聚苯乙烯(TCPS)处理过的培养瓶上以10,000个细胞/cm2接种于DMEM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT-3A+/-50ng/mL的IGF-I中。该培养基将另外称为“生长培养基”。
实例3
从人胚胎干细胞的单细胞悬浮液衍生可表达多潜能标志物的细胞
将来自人胚胎干细胞系H1第33代和H9第45代的细胞在低氧条件(大约3％的O2)下培养至少三代。根据实例1将细胞在补充有8ng/mLbFGF的MEF-CM中培养并接种于包被有MATRIGEL的板上。在大约60％汇合时，使培养物暴露于TrypLETMExpress溶液(Invitrogen，CA)5分钟。将脱离的细胞再悬浮于DMEM-F12+2％FBS培养基中，离心回收，并用血球计进行计数。将脱离的细胞以1000至10,000个细胞/cm2接种于组织培养聚苯乙烯(TCPS)处理过的培养瓶上并在标准组织培养箱中，于37℃在低氧条件(大约3％的O2)下在DM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT-3A+50ng/mL的IGF-I+0.1mM巯基乙醇(Invitrogen，CA)和非必需氨基酸(1X，NEAA，购自Invitrogen，CA)中培养。该TCPS培养瓶未 用MATRIGEL或其他细胞外基质蛋白包被。每日更换培养基。将第一代细胞称为P1。
实例4
可用于衍生自人胚胎干细胞的可表达多潜能标志物的细胞的扩增的多种生长培 养基
已经在如下培养基组合物中成功培养衍生自人胚胎干细胞的可表达多潜能标志物的细胞至少2-30代：
1.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+20ng/mLWNT-3A
2.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+50ng/mLIGF-I
3.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+20ng/mLWNT-3A+10ng/mLIGF-I
4.DM-F12+2％FBS+50ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+50ng/mLIGF-I
5.DM-F12+2％FBS+50ng/mLAA+10ng/mL WNT-3A+50ng/mLIGF-I
6.DM-F12+2％FBS+50ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+10ng/mLIGF-I
7.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+10ng/mLWNT-3A+10ng/mLIGF-I
8.HEScGRO确定培养基(Chemicon，CA)
上面列出的培养基的基础组分可用类似的培养基例如RPMI、DMEM、CRML、KnockoutTMDMEM和F12替代。
实例4
GSK-3β酶活性抑制剂对可表达多潜能标志物的细胞的活力的作用
可表达多潜能标志物的细胞的衍生和维持按已在实例2中描述的进行。使细胞在补充有2％FCS(Invitrogen)、100ng/mL激活素A、20ng/mLWnt-3a和50ng/mL IGF(R&DBiosystems)的DMEM:F12中生长。将细胞以10,000个细胞/cm2的密度接种于Falcon聚苯乙烯培养瓶上并在37℃、5％CO2、低氧条件下以单层培养物培养。在达到60-70％汇合后，通过用PBS 洗涤该单层并用TrypLE(Invitrogen)孵育3-5分钟使细胞脱离以及单个细胞散开而进行传代。
用来自专有小分子库的测试化合物进行筛选，选择它们抑制GSK-3B酶活性的能力。使来自该库的化合物以96孔板的形式作为50mM HEPES、30％DMSO中的1mM母液供使用。对于测定法，将表达多潜能标志物的细胞洗涤、计数并在底部透明、孔黑色的96孔板(Costar)中以每孔20,000个细胞的接种密度接种于标准的培养基中。该接种密度此前确定可在过夜培养物中产生最佳的单层形成。第二天，移除培养基，用PBS冲洗细胞单层三次，将测试化合物以80μL等分试样加至孔中，每份等分试样被稀释进测定培养基中至最终测试浓度为10μM。在测定的2天，从每孔移除培养基并用新鲜的稀释进测定培养基中的测试化合物等分试样替换。培养的第1和第2天的测定培养基由补充有0.5％FCS和100ng/mL激活素A的DMEM:F12组成。在培养的第3和第4天，将培养基从每个孔移除并用补充有2％FCS和100ng/mL激活素A(无测试化合物)的DMEM:F12替换。在测定的第4天，将15μL的MTS (Promega)加至每个孔，将板在37℃下孵育1.5至4小时，然后在SpectraMax(Molecular Devices)仪器上于490nm处读取光密度。对每个重复组(duplicate set)，计算由平均值、标准偏差和变异系数组成的统计学度量。对每个试验孔，计算相对于阳性对照(在培养的第1和第2天用激活素A和Wnt3a处理的孔)的毒性。
表II是所有筛选结果的汇编。表达多潜能标志物的细胞在本测定法中最初作为汇合单层接种；因此，这些结果代表这四天培养期的毒性度量。结果以对照的活力百分数表示，证明了在所使用的10μM筛选浓度下一些化合物具有不同程度的毒性。在此基于细胞的测定法中更大比例的化合物具有极少的毒性或者没有可测量的毒性。
将一小批选定的化合物在窄的剂量滴定范围内重复进行试验，这同样是使用表达多潜能标志物的细胞按上述类似测定法进行。表III是这些结果的汇总，显示了一系列毒性和非毒性化合物的可变剂量滴定效应。
实例5
用高内涵筛选测定法测定的GSK-3β酶活性抑制剂对人胚胎干细胞的分化和增殖 的作用
人胚胎干细胞(H9系)的维持按实例1中所述进行。将细胞集落维持在未分化、多潜能状态，平均每四天传代一次。传代是这样进行：使细胞培养物在37℃下暴露于胶原酶溶液(1mg/mL；Sigma-Aldrich)10至30分钟，然后用移液管头小心刮擦以回收细胞簇。让细胞簇借重力沉淀下来，然后进行洗涤以除去残余的胶原酶。将细胞簇以1∶3的比例分传以进行常规维持培养，或以1∶1比例分传以立即进行测试。将所用的人胚胎干细胞系以小于50代的传代数目进行维持，并例行评估核型表型是否正常和支原体污染是否存在。
将本测定中所用的细胞簇均匀重悬于正常培养基中，并以100μL/孔的体积接种到MATRIGEL包被的96孔Packard VIEWPLATES(PerkinElmer)上。补充有8ng/mL bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和回收。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测试期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。
用来自专有小分子库的测试化合物进行筛选，选择它们抑制GSK-3B酶活性的能力。使来自该库的化合物以96孔板的形式作为50mM HEPES、30％DMSO中的1mM母液供使用。将筛选化合物以三次重复组或两次重复组进行测试。如下开始初级筛选测定法：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。回加80至100μL/孔的测试体积，其含有补充有0.5％FCS(HyClone)和100ng/mL激活素A(R&DBiosystems)及10μM测试化合物的DMEM:F12基础培养基(Invitrogen)。阳性对照孔含有相同的基础培养基，但用10-20ng/mL Wnt3a(R&D Biosystems)替代测试化合物。阴性对照孔含有基础培养基，同时含0.5％FCS和仅激活素A(仅AA)，或者含0.5％FCS但不含激活素A或Wnt3a(无处理)。在测定的第2天，抽吸各孔并再供应相同的溶液。在第3和第4天，抽吸所有的测定孔并转换成补充有2％FCS和100ng/mL激活素A(无测试化合物或Wnt3a)的DMEM:F12；平行的阴性对照孔孔则维持在DMEM:F12基础培养基加上2％FCS和激活素A(仅仅AA)或者2％FCS但不加激活素A(无处理)。
在培养结束时，将96孔板中的细胞用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，用PBS洗涤三次，然后用0.5％Triton X-100在室温下透化处理20分 钟。或者，将细胞用冰冷的70％乙醇在-20℃下固定过夜，用PBS洗涤三次，然后用Triton X-100在4℃下透化处理5分钟。在固定和透化处理后，将细胞再用PBS洗涤三次，然后用PBS中的4％鸡血清(Invitrogen)在室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人Sox17和山羊抗人HNF-3β；R&DSystems)在4％鸡血清中1∶100稀释，在室温下加至细胞中保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes)在PBS中1∶200稀释，并在用PBS洗涤细胞三次后加入。为对细胞核进行复染，在室温下加入5mM Draq5(Alexis Biochemicals)保持五分钟。将细胞用PBS洗涤一次，并保留在100mL/孔PBS中以用于成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)对细胞进行成像，对于用Draq5和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。用阳性对照孔和只用二抗染色作为无处理阴性对照的孔来优化曝光时间。每孔获取12个视野，以补偿处理和染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell
Developer Toolbox 1.6(GE Healthcare)软件测量Sox-17和HNF-3β的总细胞数目和总细胞密度。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算三次重复测试的平均值和标准偏差。总蛋白质表达以总强度或积分强度报告，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在300至3000之间且形状系数大于或等于0.4的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以Wnt3a/激活素A阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
表IV是所有筛选结果的代表性汇总。表V得自该筛选的命中化合物的列表。强命中化合物定义为大于或等于对照值的120％；中等命中化合物定义为落入对照值的60-120％的范围内。大量的化合物在本测定中能引起增殖响应。同时，大量的化合物在本测定中能引起分化，这由Sox17和Hnf-3b转录因子的蛋白质表达测量。
实例6
用读板仪测定法测定的GSK-3β酶活性抑制剂对人胚胎干细胞的增殖的作用
人胚胎干细胞(H9或H1系)的维持按实例1中所述进行。将细胞集落维持在未分化、多潜能状态，平均每四天传代一次。传代是这样进行的：使细胞培养物在37℃下暴露于胶原酶溶液(1mg/mL；Sigma-Aldrich)10至30分钟，然后用移液管头小心刮擦以回收细胞簇。让细胞簇沉淀下来，洗涤以除去残余的胶原酶。将细胞簇以1∶3单层面积的比例分传以进行常规培养，或者以1∶1比例分传以立即进行测试。将用于这些实例的人胚胎干细胞系以小于50的传代数目进行维持，并例行评估核型表型是否正常和支原体污染是否存在。
将测试中所用的细胞簇均匀重悬于正常培养基中，并以100μL孔的体积接种到MATRIGEL包被的96孔Packard VIEWPLATES(PerkinElmer)上。补充有8ng/mL bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和回收。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测试期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。
如下开始初级筛选测定法：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。回加80-100μL/孔的测试体积，其含有补充有0.5％FCS(HyClone)和100ng/mL激活素A(R&D Biosystems)及10μM测试化合物的DMEM:F12基础培养基(Invitrogen)。阳性对照孔含有相同的培养基，但用10-20ng/mL Wnt3a(R&D Biosystems)替代测试化合物。阴性对照孔含有基础培养基加上0.5％FCS，但无激活素A或Wnt3a。将筛选化合物重复测试三次。在测定的第2天，抽吸各孔并再供应相同的溶液。在第3和第4天，抽吸所有的测定孔并转成补充有2％FCS和100ng/mL激活素A的DMEM:F12，但阴性对照孔例外，其维持在含2％FCS的DMEM:F12基础培养基中。
在测定的第4天，将15-20μL的MTS(Promega)加至每个孔，将板在37℃下孵育1.5至4小时。用Molecular Devices公司的分光光度读板仪于OD490处测定密度读数。计算各重复组的平均读数以及标准偏差和变异系数。将实验孔与激活素A/Wnt3a阳性对照进行比较以计算对照值百分数，作为增殖的度量。
表VI是所有筛选结果的代表性汇总。表VII是得自该筛选的命中化合物的列表。强命中化合物定义为大于或等于对照值的120％；中等命中化合 物定义为落入对照值的60-120％的范围内。大量的化合物在本测定中能引起增殖响应。
实例7
GSK-3β酶抑制剂对人胚胎干细胞的分化和增殖的作用：先导化合物的剂量滴定
确认从初级筛选鉴定到的命中化合物的活性并通过剂量滴定进一步分析活性范围，这是重要的。获得选择的初级筛选命中化合物亚组的新样品干粉，将其增溶以制备新鲜储备试剂，并稀释到二级确认测定中以评估对人胚胎干细胞的作用。
两种人胚胎干细胞(H1和H9)按实例1中所述进行。将细菌集落在MatrigelTM(Invitrogen)包被的聚苯乙烯塑料(用MatrigelTM于DMEM:F12中的1∶30稀释液包被表面)上维持在未分化、多潜能状态。细胞平均每四天通过酶促传代进行分传。传代是这样进行的：使细胞单层在37℃下暴露于胶原酶溶液(1mg/mL；Sigma-Aldrich)10至60分钟，然后用移液管头小心刮擦以回收细胞簇。让细胞簇借重力沉淀下来，然后进行洗涤以除去残余的胶原酶。将细胞簇以1∶3比例分传以进行维持培养，或者以1∶1比例分传以随后进行测试。将人胚胎干细胞系以小于50代进行维持，并例行评估核型表型是否正常和支原体污染是否存在。
测定用细胞的制备：将用于本测试的H1或H9人胚胎干细胞系的细胞簇均匀重悬于培养基中，并以100μL/孔的体积接种到MatrigelTM包被的96孔Packard VIEWPLATES(PerkinElmer)上。补充有8ng/mL bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和增殖。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在接种后让培养物增殖一至三天，然后再开始测试。在整个测试期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。
化合物和测定培养基的制备：将从初级筛选得到的命中化合物亚组用于后续研究和随后的二级测定法。将二十个作为干粉可利用的化合物在DMSO中增溶成10mM原液，并在-20℃下干燥保藏备用。在临测定前，将化合物原液在补充有0.5％FCS(HyClone)和100ng/mL激活素A(R&DBiosystems)的DMEM:F12基础培养基(Invitrogen)中进行1∶1000稀释以制备10μM测试化合物。将此稀释液同样在补充有0.5％FCS(HyClone)和 100ng/mL激活素A的DMEM:F12基础培养基中进一步进行系列两倍稀释，以给每种化合物制作七点稀释曲线。
二级筛选测定法：如下开始测试：从每个孔中的细胞单层抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。回加100μL/孔的测试体积，其含有培养基加上0.5％FCS和不同浓度的抑制剂化合物加上100ng/mL激活素A，无Wnt3a。阳性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％FCS和加上20ng/mL Wnt3a(R&D Biosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％FCS，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物或对照溶液。在第3和第4天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％FCS和100ng/mL激活素A但无测试化合物或Wnt3a的DMEM:F12。在第3和第4天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS的DMEM:F12基础培养基中。
测定评估：在培养结束时，将96孔板中的细胞用PBS洗涤两次，然后用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，用PBS再洗涤三次，然后用0.5％Triton X-100在室温下透化处理20分钟。在固定和透化处理后，将细胞再用PBS洗涤三次，然后用PBS中的4％鸡血清(Invitrogen)在室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人Sox17；R&D Systems)在4％鸡血清中1∶100稀释，在室温下加至细胞中保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes)在PBS中1∶200稀释，并在用PBS洗涤细胞三次后加至每个孔。为对细胞核进行复染，在室温下加入2μg/mLHoechst 33342(Invitrogen)保持十分钟。将细胞用PBS洗涤一次，并保留在100μL孔PBS中以进行成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)对细胞进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。用阳性对照孔和只用二抗染色作为无处理阴性对照的孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿处理和染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GEHealthcare)软件获得每个孔的总细胞数目和总Sox-17密度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总 Sox17蛋白质表达以总强度或积分强度报告，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在300至3000之间且形状系数大于或等于0.4的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以Wnt3a/激活素A阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
结果
显示了八种GSK-3B酶抑制剂的结果，其中活性得到确认，效价通过本二级测定法中的滴定来确定。所给出的数据显示了化合物对细胞数目和Sox17强度的作用，其中各个数据点是从重复组取平均值，并据以挖掘来自相同视野和孔的每个参数。在本实例中，Sox17表达指示定形内胚层分化。用H1人胚胎干细胞系取得的细胞数目和Sox17强度的结果分别在表VIII和表IX中显示。H9人胚胎干细胞系的结果在表X和表XI中显示。将细胞数目和Sox17强度的阳性对照值归一化为1.000。两种细胞系的细胞数目阴性对照值均小于0.388，Sox17强度阴性对照值均小于0.065。在图1至8中提供了这些数据的图示，比较了两种人胚胎干细胞系，并包括每种化合物的剂量滴定。细胞数目在分图A中显示；Sox 17强度在分图B中显示。这些数据确认每种化合物都能促进hES细胞增殖和定形内胚层分化，并确定出最佳活性范围。
实例8
GSK-3β酶抑制剂对与定形内胚层相关的另外标志物的表达的作用
证明除了转录因子Sox17之外先导化合物还能诱导其他指示定形内胚层分化的标志物，这是重要的。对选定的命中化合物亚组测试它们促进CXCR4(一种表面受体蛋白)和HNF-3β(一种同样与定形内胚层分化相关的转录因子)的表达的能力。
测定用细胞的制备：将用于本测定的H1人胚胎干细胞系的细胞簇均匀重悬于培养基中，并以2mL/孔的体积接种到MATRIGELTM包被(1∶30稀释)的6孔板(Corning)上。补充有8ng/mL bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和增殖。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在接种后让培养物增殖一至三天，然后再开始测试。在测试期间，将板维持在37℃、5％CO2下。
化合物和测定培养基的制备：将从初级筛选得到的七个命中化合物亚组用于后续研究和随后的二级测定法。将纯化合物在DMSO中增溶成10mM原液，并在-20℃下干燥保藏备用。在临测试前，将化合物原液在补充有0.5％FCS(HyClone)和100ng/mL激活素A(R&DBiosystems)的DMEM:F12基础培养基(Invitrogen)中稀释至在1μM至5μM之间的终浓度。
测试：如下开始测试：从每个孔中的细胞单层抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。回加2mL/孔的测试体积，其含有培养基加上0.5％FCS和不同浓度的抑制剂化合物加上100ng/mL激活素A，无Wnt3a。阳性对照孔含有相同的基础培养基和0.5％FCS加上100ng/mL激活素A和20ng/mL Wnt3a(R&D Biosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有基础培养基加上0.5％FCS，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物或对照溶液。在第3和第4天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％FCS和100ng/mL激活素A但无测试化合物或Wnt3a的DMEM:F12。在第3和第4天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS的DMEM:F12基础培养基中。
测定评估：在培养结束时，将细胞单层用PBS洗涤，并通过与TrypLETM Express溶液(Invitrogen，CA)一起孵育5分钟从培养板收获。将细胞重悬于MEF调理培养基中，分成两等份样品。一组样品进一步用各种荧光标记抗体染色，并进行流式细胞术(FACS)分析。另一平行组样品进行定量PCR。
将用于FACS分析的细胞洗涤到PBS中，在稀释于PBS和BD FACS染色缓冲液中的0.125％人γ-球蛋白(Sigma目录号为G-4386)中于4℃封闭15分钟。用直接缀合到荧光标记且对CD9PE(BD#555372)、CD99PE(Caltag#MH CD9904)或CXCR-4APC(R&D Systems目录号为FAB 173A)有特异性的抗体，将细胞的等分试样(各自大约为105个细胞)在4℃下染色30分钟。在BD FACS染色缓冲液中进行一系列洗涤后，将细胞用7-AAD(BD#559925)染色以评估活力，并在BD FACS Array仪器(BD Biosciences)上进行分析，收集至少10,000个事件。用针对PE和APC两者的小鼠IgG1k同种型对照抗体来测量(gate)阳性细胞百分数。
将用于定量PCR的细胞进行处理，以供RNA提取、纯化和cDNA合成。RNA样品通过在含乙醇的高盐缓冲液存在下结合到硅胶膜(Rneasy MiniKit，Qiagen，CA)然后洗涤除去污染物来进行纯化。用TURBO无DNA试剂盒(Ambion，Inc.)进一步纯化RNA，将高质量的RNA在水中洗脱。通过在分光光度计上读取A260和A280读数来评估产率和纯度。用AppliedBiosystems，Inc.(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒，从纯化的RNA制备cDNA拷贝。
除非另有规定，否则实时PCR扩增和定量用的所有试剂均购自ABI。实时PCR反应用ABI PRISM 7900序列检测系统进行。将TAQMAN通用PCR主混合物(ABI，CA)与20ng的反转录RNA一起用于20μL的总反应体积中。每种cDNA样品重复运行两次以校正吸量误差。引物和FAM标记的TAQMAN探针以200nm的浓度使用。用ABI之前开发的人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内源对照品，将每种靶标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组列出如下：CXCR4(Hs00237052)、GAPDH(4310884E)、HNF3b(Hs00232764)、SOX17(探针部分#450025，正向和反向部分#4304971)。
在50℃下初始孵育2分钟然后95℃下孵育10分钟后，将样品进行40次的两阶段循环：变性步骤，95℃15秒，随后的退火/延伸步骤，60℃1分钟。数据分析用GENEAMP 7000序列检测系统的软件进行。对于每个引物/探针组，Ct值确定为荧光强度达到扩增指数区中部中的特定值时的循环数。用比较性Ct方法来计算相对基因表达水平。简而言之，对于每个cDNA样品，从所关注基因Ct减去内源对照CT值，以得到ΔCt值(ΔCt)。假定扩增效率为100％，将靶标的归一化含量计算为2-ΔCt。最终的数据是相对于校准样品表示的。
结果
图9显示了在用各种GSK3抑制剂处理后，表达CXCR4表面受体的阳性细胞百分数的FACS分析。相对于无处理的细胞群体(阴性对照)或用激活素A和Wnt3处理的细胞(阳性对照)，显示了每个化合物的在1μM和5μM之间的两个浓度。图10的分图a、b和c显示了CXCR4、Sox17和HNF3β(它们也被认为是定形内胚层的标志物)的实时PCR数据。ACS和实时PCR分析都证明，相对于无处理的对照细胞，在分化的细胞中观察到 这些标志物的每一种都显著增加。这些定形内胚层标志物的表达水平在一些情况中与阳性对照相当，这表明GSK3抑制剂在这个分化阶段可代替Wnt3a。
实例9
GSK-3β酶抑制剂对胰腺内胚层的形成的作用
证明在定形内胚层诱导过程中用GSK3β抑制剂处理不会妨碍其他细胞类型(例如胰腺内胚层)随后的分化，这是重要的。对选择的命中化合物亚组测试它们促进PDX1和HNF6(与胰腺内胚层相关的关键转录因子)的表达的能力。
人胚胎干细胞(H1和H9系)的维持按实例1中所述进行。将细胞集落维持在未分化、多潜能状态，平均每四天传代一次。传代是这样进行的：使细胞培养物在37℃下暴露于胶原酶溶液(1mg/mL；Sigma-Aldrich)10至30分钟，然后用移液管头小心刮擦以回收细胞簇。让细胞簇借重力沉淀下来，然后进行洗涤以除去残余的胶原酶。将细胞簇以1∶3比例分传以进行例行维持培养，或者以1∶1比例分传以随后进行测试。将所用的人胚胎干细胞系以小于50代进行维持，并例行评估核型表型是否正常和支原体污染是否存在。
测定用细胞的制备：将本测试中所用的H1人胚胎干细胞系的细胞簇均匀重悬于培养基中，并以1mL/孔的体积接种到MATRIGELTM包被(1∶30稀释)的24孔板(黑孔；ArcticWhite公司)上。补充有8ng/mL bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和增殖。在第二个实验，将来自H9系的hES细胞簇接种在96孔板中小鼠胚胎饲养(MEF)层上，所述层之前通过用丝裂霉素C(Sigma Chemical Co)处理使其失活。MEF单层上hES细胞的培养基组成为：DMEM:F12，含20％Knockout血清替代品(Invitrogen)，补充有极限必需氨基酸(Invitrogen)、L-谷氨酰胺和2-巯基乙醇。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在接种后让培养物增殖一至三天，然后再开始测试。在测试期间，将板维持在37℃、5％CO2下。
化合物和测定培养基的制备：将从初级筛选得到的八种命中化合物亚组用于后续研究和随后的二级测定法。将纯化合物在DMSO中增溶成 10mM原液，并在-20℃下干燥保藏备用。在临测试前，将化合物原液在含添加物的基础培养基中稀释至在1μM至5μM之间的最终浓度。
测定法：在本测定法中，仅在定形内胚层分化步骤的第1和第2天包括GSK3抑制剂，取代Wnt3a。如以上实例7和实例8中所述，通过从每个孔中的细胞单层抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清，来开始MATRIGELTM上的胚胎干细胞培养。为分化成定形内胚层，加入测试体积(对于24孔板为0.5mL/孔，对于96孔板为100μL/孔)，其含有DMEM:F12培养基加上0.5％FCS和不同浓度的抑制剂化合物加上100ng/mL激活素A，无Wnt3a。阳性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％FCS和加上100ng/mL激活素A和20ng/mL Wnt3a(R&DBiosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％FCS，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物或对照溶液。在第3和第4天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％FCS和100ng/mL激活素A但无测试化合物或Wnt3a的DMEM:F12。在第3和第4天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS的DMEM:F12基础培养基中。为分化成胰腺内胚层，将细胞处理三天，每日供应含有2％FCS加上0.25μM KAA 环巴胺(EMDBiosciences)和20ng/mL FGF7(R&DBiosystems)的DMEM:F12基础培养基。然后将细胞再处理四天，每日供应含有1％B27(Invitrogen)、0.25μM KAAD环巴胺、2μM视黄酸(RA；Sigma-Aldrich)和20ng/mL FGF7的DMEM:F12。平行的阴性对照孔自始至终维持在补充有2％FCS(阶段2)或1％B27(阶段3)但无任何其他添加物的DMEM:F12基础培养基中。
使H9人胚胎细胞的平行培养物在MEF饲养层上生长并分化成胰腺内胚层。将细胞在如下培养基中进行培养来实现定形内胚层分化，所述培养基的组成为：RPMI-1640(Invitrogen)，在第1天不含血清，在第2和第3天含0.2％FCS，加上不同浓度的抑制剂化合物和100ng/mL激活素A。阳性对照孔含有相同的基础培养基(加入或不加入血清)加上100ng/mL激活素A和20ng/mL Wnt3a(R&D Biosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有相同的基础培养基(加入或不加入血清)，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物或对照溶 液。在第3天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％FCS和100ng/mL激活素A但无测试化合物和Wnt3a的RPMI-1640。在第3天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS的RPMI-1640基础培养基中。通过将细胞处理四天，每日供应含有2％FCS加上0.25mM KAAD环巴胺(EMD Biosciences)和50ng/mL FGF10(R&D Biosystems)的RPMI-1640基础培养基，使细胞分化成胰腺内胚层。随后，将细胞处理三天时间，每日供应含有1％B27(Invitrogen)、0.25mM KAAD环巴胺、2mM视黄酸(RA；Sigma-Aldrich)和50ng/mL FGF10的RPMI-1640。平行的阴性对照孔自始至终维持在补充有2％FCS(阶段2)或1％B27(阶段3)但无任何其他添加物的RPMI-1640基础培养基中。
测定评估：在分化结束时，如实例8中所述通过实时PCR检查细胞的基因表达。对于高含量荧光染色，将96孔板中的细胞用PBS洗涤两次，然后用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，再用PBS洗涤三次，然后用0.5％Triton X-100在室温下透化处理20分钟。在固定和透化处理后，将细胞再用PBS洗涤三次，然后用PBS中的4％鸡血清(Invitrogen)在室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人Pdx1；Santa Cruz)在4％鸡血清中1∶100稀释，在室温下加到细胞中保持两小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes)在PBS中1∶200稀释，并在用PBS洗涤细胞三次后加至每个孔。为对细胞核进行复染，在室温下加入2μg/mL Hoechst 33342(Invitrogen)保持十分钟。将细胞用PBS洗涤一次，并保留在100μL./孔PBS中以进行成像。
用INCell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)对细胞进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。用阳性对照孔和只用二抗染色的孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿处理和染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell DeveloperToolbox 1.7(GE Healthcare)软件获得每个孔的总细胞数目和总Pdx1强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总Pdx1蛋白质表达以总强度或积分强度报告，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在300至3000之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以 Wnt3a/激活素A阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
将用于定量PCR的细胞在RLT缓冲液(Qiagen)中裂解，然后进行处理以供RNA提取、纯化和cDNA合成。RNA样品通过在含乙醇的高盐缓冲液存在下结合到硅胶膜(Rneasy MiniKit，Qiagen，CA)然后洗涤除去污染物来进行纯化。用TURBO无DNA试剂盒(Ambion，Inc.)进一步纯化RNA，将高质量的RNA在水中洗脱。通过在分光光度计上读取A260和A280读数来评估产率和纯度。用Applied Biosystems，Inc.(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒，从纯化的RNA制备cDNA拷贝。
除非另有规定，否则实时PCR扩增和定量用的所有试剂均购自ABI。实时PCR反应用ABI PRISM 7900序列检测系统进行。将TAQMAN通用PCR主混合物与20ng的反转录RNA一起用于20μL的总反应体积中。每种cDNA样品重复运行两次以校正吸量误差。引物和FAM标记的TAQMAN探针以200nm的浓度使用。用ABI之前开发的人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内源对照品，将每种靶标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组列出如下：PDX1(Hs00236830_ml)、GAPDH(4310884E)和HNF6(Hs00413554_ml)。
在50℃下初始孵育2分钟然后95℃下孵育10分钟后，将样品进行40次的两阶段循环：变性步骤，95℃15秒，随后的退火/延伸步骤，60℃1分钟。数据分析用 7000序列检测系统的软件进行。对于每个引物/探针组，Ct值确定为荧光强度达到扩增指数区中部中的特定值时的循环数。用比较性Ct方法来计算相对基因表达水平。简而言之，对于每个cDNA样品，从所关注基因Ct减去内源对照CT值，以得到ΔCt值(ΔCt)。假定扩增效率为100％，将靶标的归一化含量计算为2-ΔCt。最终的数据是相对于校准样品表示的。
结果
显示了八种GSK-3β酶抑制剂的结果。图11中给出的来自高内涵分析的数据显示了对H1hES细胞系的细胞数目(分图A)和Pdx1强度(分图B)的作用，其中各个数据点是从重复样品组取平均值，并据以挖掘来自相同视野和孔的每个参数。图12给出的来自实时PCR的数据显示了这些小分 子抑制剂对两种转录因子Pdx1和HNF6的诱导表达的作用。在这些实例中，Pdx1和HNF6表达指示胰腺内胚层分化。GSK3β抑制剂化合物在这些测试中在细胞谱系定向的早期阶段中可替代Wnt3a；所得的细胞保持了在分化的随后各相续阶段中形成胰腺内胚层的能力。
实例10
GSK-3β酶抑制剂对胰腺内分泌细胞的形成的作用
证明在定形内胚层诱导过程中用GSK3抑制剂处理不会妨碍其他细胞类型(例如胰腺内分泌细胞或产胰岛素细胞)随后的分化，这是重要的。对选定的命中化合物亚组测试了它们促进胰激素的表达的能力。
测定用细胞的制备：使按照实例9中所述的方法获得的胰腺内胚层细胞(在96孔板和24孔板上培养)随后暴露于会造成这些细胞分化成表达胰激素的细胞的物质。
如以上实例7-9中所述，通过从每个孔中的细胞单层抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清，来开始MATRIGELTM上的H1人胚胎干细胞系培养物的测定。为分化成定形内胚层，加入测试体积(对于24孔板为0.5mL/孔，对于96孔板为100μL/孔)，其含有培养基加上0.5％FCS和不同浓度的抑制剂化合物加上100ng/mL激活素A，无Wnt3a。阳性对照孔含有相同的基础培养基和0.5％FCS加上100ng/mL激活素A和20ng/mLWnt3a(R&D Biosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％FCS，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物或对照溶液。在第3、第4和第5天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％FCS和100ng/mL激活素A但无测试化合物或Wnt3a的DMEM:F12。在第3、第4和第5天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS的DMEM:F12基础培养基中。为分化成胰腺内胚层，将细胞处理三天，每日供应含有2％FCS加上0.25μM KAAD环巴胺(EMD Biosciences)和20ng/mL FGF7(R&D Biosystems)的DMEM:F12基础培养基。随后将细胞处理四天，每日供应含有1％B27(Invitrogen)、0.25μM KAAD环巴胺、2μM视黄酸(RA；Sigma-Aldrich)和20ng/mL FGF7的DMEM:F 12。在阶段2和阶段3期间，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS或1％B27但无任何其 他添加物的DMEM:F12基础培养基中。在胰腺内胚层形成后，再将细胞处理六天时间，每日供应含有1％B27加上1μM DAPT(γ分泌酶抑制剂：EMD Biosciences)和50ng/mL毒蜥外泌肽4(Sigma-Aldrich)的DMEM:F12基础培养基。然后将细胞再处理三天时间，每日供应含有1％B27、50ng/mL毒蜥外泌肽4、50ng/mL IGF(R&D Biosystems)和50ng/mL HGF(R&DBiosystems)的DMEM:F12基础培养基。平行的阴性对照孔自始至终维持在补充有1％B27但无任何其他添加物的DMEM:F12基础培养基中。
测定评估：在培养结束时，如以上实例7和实例8中对细胞进行处理，以通过高内涵分析或实时PCR进行评估。
对于高含量荧光染色，将96孔板中的细胞用PBS洗涤两次，然后用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，再用PBS洗涤三次，然后用0.5％TritonX-100在室温下透化处理20分钟。在固定和透化处理后，将细胞再用PBS洗涤三次，然后用PBS中的4％鸡血清(Invitrogen)在室温下封闭30分钟。将一抗(豚鼠抗猪胰岛素，可与人胰岛素交叉反应；DakoCytomation)在4％山羊血清中1∶500稀释，然后在室温下加到细胞中保持一小时。将细胞用PBS洗涤三次，然后用在4％山羊血清中1∶100稀释的Alexa Fluor 488缀合的二抗(山羊抗豚鼠IgG；Molecular Probes)染色。为对细胞核进行复染，在室温下加入2μg/mLHoechst 33342(Invitrogen)保持十分钟。将细胞用PBS洗涤一次，并保留在100μL/孔PBS中以进行成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)对细胞进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。用阳性对照孔和只用二抗染色的孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿处理和染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell DeveloperToolbox 1.7(GE Healthcare)软件获得每个孔的总细胞数目和总胰岛素强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总胰岛素蛋白质表达以总强度或积分强度报告，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在300至3000之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以Wnt3a/激活素A阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个三次重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
将用于定量PCR的细胞在RLT缓冲液(Qiagen)中裂解，然后进行处理以供RNA提取、纯化和cDNA合成。RNA样品通过在含乙醇的高盐缓冲液存在下结合到硅胶膜(Rneasy MiniKit，Qiagen，CA)然后洗涤除去污染物来进行纯化。用TURBO无DNA试剂盒(Ambion，Inc.)进一步纯化RNA，将高质量的RNA在水中洗脱。通过在分光光度计上读取A260和A280读数来评估产率和纯度。用Applied Biosystems，Inc.(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒，从纯化的RNA制备cDNA拷贝。
除非另有规定，否则实时PCR扩增和定量用的所有试剂均购自ABI。实时PCR反应用ABI 7900序列检测系统进行。将 通用PCR主混合 (ABI，CA)与20ng的反转录RNA一起用于20μL的总反应体积中。每种cDNA样品重复运行两次以校正吸量误差。引物和FAM标记的 深针以200nM的浓度使用。用ABI之前开发的人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内源对照品，将每种靶标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组列出如下：PDX1(Hs00236830_ml)、胰岛素(Hs00355773)和GAPDH(4310884E)。
在50℃下初始孵育2分钟然后95℃下孵育10分钟后，将样品进行40次的两阶段循环：变性步骤，95℃15秒，随后的退火/延伸步骤，60℃1分钟。数据分析用 7000序列检测系统的软件进行。对于每个引物/探针组，Ct值确定为荧光强度达到扩增指数区中部中的特定值时的循环数。使用比较性Ct法计算相对基因表达水平。简而言之，对于每个cDNA样品，从目的基因的Ct值减去内源对照的Ct值，以得到ΔCt值(ΔCt)。假定扩增效率为100％，将靶标的归一化含量计算为2-ΔCt。最终的数据是相对于校准样品表示的。
结果
显示了八种GSK-3B酶抑制剂的结果。图13中给出的来自高内涵分析的数据显示了化合物对H1hES细胞系的细胞数目(分图A)和胰岛素强度(分图B)的作用，其中各个数据点是从三次重复组取平均值，并据以挖掘来自相同视野和孔的每个参数。图14中给出的来自实时PCR的数据显示了化合物对Pdx1的胰岛素的作用。在这些实例中，Pdx1和胰岛素表达指示胰腺内胚层的分化和激素阳性细胞的产生。选择性GSK3β抑制剂化合物在这 些测试中在细胞谱系定向的早期阶段中能代替Wnt3a，且在分化的随后各相续阶段中能诱导和维持胰岛β细胞形成，这由胰岛素免疫染色和实时PCR两者明显看出。
实例11
GSK-3β酶抑制剂对胰腺内分泌细胞的形成的累加效果
证明GSK3β抑制剂如果在细胞命运定向的多个时期中加入的话，抑制剂所进行的处理能改进胰岛β细胞分化，这是重要的。将选定的命中化合物亚组通过相续定时加入以提高与胰腺激素阳性细胞相关的胰岛素表达来进行测试。
测定用细胞的制备：用于测定法的细胞制备物：使按照实例9和实例10中所述的方法获得的胰腺内胚层细胞(在96孔板上培养)随后暴露于会造成这些细胞分化成表达胰激素的细胞的物质。
如以上实例7-9中所述，通过从每个孔中的细胞单层抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清，来开始MATRIGELTM上的H1人胚胎干细胞系培养物的测定。为分化成定形内胚层，加入测试体积(对于96孔板为100μL/孔)，其含有培养基加上0.5％FCS和不同浓度的抑制剂化合物加上100ng/mL激活素A，无Wnt3a。阳性对照孔含有相同的基础培养基和0.5％FCS加上100ng/mL激活素A和20ng/mL Wnt3a(R&D Biosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％FCS，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物或对照溶液。在第3、第4和第5天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％FCS和100ng/mL激活素A但无测试化合物或Wnt3a的DMEM:F12。在第3、第4和第5天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS的DMEM:F12基础培养基中。为分化成胰腺内胚层，将细胞处理三天，每日供应含有2％FCS加上0.25μM KAA 环巴胺(EMD Biosciences)和20ng/mL FGF7(R&DBiosystems)的DMEM:F12基础培养基。随后将细胞处理四天，每日供应含有1％B27(Invitrogen)、0.25μM KAAD环巴胺、2μM视黄酸(RA；Sigma-Aldrich)和20ng/mL FGF7的DMEM:F12。平行的阴性对照孔自始至终维持在补充有2％FCS或1％B27但无任何其他添加物的DMEM:F12基础培养基 中。在胰腺内胚层形成后，再将细胞处理六天时间，隔日供应含有1％B27加上1μM DAPT(γ分泌酶抑制剂：EMD Biosciences)和50ng/mL毒蜥外泌肽4(Sigma-Aldrich)及1μM TGFβR1抑制剂II(ALK5抑制剂；EMDBiosciences)的DMEM:F12基础培养基。在这六天时间中，将GSK3β抑制剂回加到各个孔，在分化开始时使用与之前的处理相同的浓度。然后再将细胞处理三天时间，隔日供应含有1％B27、50ng/mL毒蜥外泌肽4、50ng/mLIGF(R&D Biosystems)和50ng/mL HGF(R&DBiosystems)及1μM TGFβR 1抑制剂II(ALK5抑制剂；EMD Biosciences)的DMEM:F12基础培养基。在这三天时间中，将GSK3β抑制剂回加到各个孔，在分化开始时使用与之前的处理相同的浓度。平行组的阳性对照孔在20ng/mL Wnt3a存在或不存在下进行处理。平行的阴性对照孔自始至终维持在补充有1％B27但无任何其他添加物的DMEM:F12基础培养基中。
测定评估：在培养结束时，如以上实例10中对细胞进行处理，以通过高内涵分析进行评估。
对于高含量荧光染色，将96孔板中的细胞用PBS洗涤两次，然后用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，再用PBS洗涤三次，然后用0.5％TritonX-100在室温下透化处理20分钟。在固定和透化处理后，将细胞再用PBS洗涤三次，然后用PBS中的4％鸡血清(Invitrogen)在室温下封闭30分钟。将一抗(豚鼠抗猪胰岛素，可与人胰岛素交叉反应；DakoCytomation)在4％山羊血清中1∶500稀释，然后在室温下加到细胞中保持一小时。将细胞用PBS洗涤三次，然后用在4％山羊血清中1∶100稀释的Alexa Fluor 488缀合二抗(山羊抗豚鼠IgG；Molecular Probes)染色。为对细胞核进行复染，在室温下加入2μg/mL Hoechst33342(Invitrogen)保持十分钟。将细胞用PBS洗涤一次，并保留在100μL/孔PBS中以进行成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)对细胞进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。用阳性对照孔和只用二抗染色的孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿处理和染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell DeveloperToolbox 1.7(GE Healthcare)软件获得每个孔的总细胞数目和总胰岛素强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情 况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总胰岛素蛋白质表达以总强度或积分强度报告，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在300至3000之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以Wnt3a/激活素A阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个三次重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
结果
显示了八种GSK-3B酶抑制剂的结果。图15中给出的来自高内涵分析的数据显示了化合物对H1hES细胞系的细胞数目(分图A)和胰岛素强度(分图B)的作用，其中各个数据点是从三次重复组取平均值，并据以挖掘来自相同视野和孔的每个参数。在这些实例中，胰岛素表达指示向激素阳性胰腺细胞的分化。在这些测定法中选择的GSK3β抑制剂化合物在细胞谱系定向的早期阶段中能代替Wnt3a，且当在分化的随后各阶段加入时似乎能促进胰岛素表达相对于阳性对照样品而言得到提高。
藉此将整篇文档中引用的出版物全文以引用方式并入。尽管已通过参考实例和优选的实施例对本发明的多个方面进行了阐述，但应当理解，本发明的范围不由前面的描述限定，而是由专利法的原理正确解释的权利要求书所限定。
表IA：用于FACS和免疫染色分析的一抗列表
表IB：用于FACS和免疫染色分析的缀合的二抗列表
缀合的二抗 供应商 稀释度
APC缀合的山羊抗小鼠IgG Jackson ImmunoResearch(PA) 1∶200
PE缀合的山羊抗小鼠IgG Jackson ImmunoResearch(PA) 1∶200
PE或APC缀合的驴抗兔抗体 Jackson ImmunoResearch(PA) 1∶200
PE或APC缀合的驴抗山羊抗体 Jackson ImmunoResearch(PA) 1∶200
PE缀合的山羊抗小鼠IgM SouthernBiotech(AL) 1∶200
PE缀合的山羊抗大鼠IgM SouthernBiotech(AL) 1∶200
PE缀合的山羊抗小鼠IgG3 SouthernBiotech(AL) 1∶200
表II：GSK-3B酶活性抑制剂对可表达多潜能标志物的细胞的活力的作用
表III：GSK-3B酶活性抑制剂对可表达多潜能标志物的细胞的活力的作用
表VI：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞增殖的作用
表VII：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞增殖的作用
表VIII：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞系H1的细胞增殖的剂量依赖性效 果。
表IX：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞系H1的细胞分化的剂量依赖性效果。
表X：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞系H9的细胞增殖的剂量依赖性效果。
表XI：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞系H9的细胞分化的剂量依赖性效果。

Claims (10)

1. 一种使人多潜能细胞扩增和分化的方法，所述方法包括如下步骤：
a. 培养人多潜能细胞，以及
b. 用3-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲哚-3-基]-4-(1-吡啶-3-基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮处理所述人多潜能细胞，
其中所述人多潜能细胞为选自H1、H7或H9的已确立的人胚胎干细胞系。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多潜能细胞是表达胚胎干细胞的多潜能标志物的细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达至少一种选自如下的多潜能标志物：ABCG2、cripto、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、SOX-2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60和Tra1-81。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多潜能细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中将所述多潜能细胞用3-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲哚-3-基]-4-(1-吡啶-3-基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮处理1至72小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其中将所述多潜能细胞用3-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲哚-3-基]-4-(1-吡啶-3-基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮处理12至48小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其中将所述多潜能细胞用3-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲哚-3-基]-4-(1-吡啶-3-基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮处理48小时。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中3-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲哚-3-基]-4-(1-吡啶-3-基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮以100nM至100μM的浓度使用。
9.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中3-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲哚-3-基]-4-(1-吡啶-3-基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮以1μM至10μM的浓度使用。
10.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中3-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲哚-3-基]-4-(1-吡啶-3-基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮以10μM的浓度使用。
CN200980124647.2A 2008-04-24 2009-04-22 多潜能细胞的处理 Active CN102105580B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710406073.4A CN107189978A (zh) 2008-04-24 2009-04-22 多潜能细胞的处理

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/108,852 US8623648B2 (en) 2008-04-24 2008-04-24 Treatment of pluripotent cells
US12/108852 2008-04-24
PCT/US2009/041356 WO2009132068A2 (en) 2008-04-24 2009-04-22 Treatment of pluripotent cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710406073.4A Division CN107189978A (zh) 2008-04-24 2009-04-22 多潜能细胞的处理

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102105580A CN102105580A (zh) 2011-06-22
CN102105580B true CN102105580B (zh) 2017-06-27

Family

ID=40793135

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710406073.4A Pending CN107189978A (zh) 2008-04-24 2009-04-22 多潜能细胞的处理
CN200980124647.2A Active CN102105580B (zh) 2008-04-24 2009-04-22 多潜能细胞的处理

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710406073.4A Pending CN107189978A (zh) 2008-04-24 2009-04-22 多潜能细胞的处理

Country Status (16)

Country Link
US (3) US8623648B2 (zh)
EP (2) EP2664669B1 (zh)
JP (4) JP2011518563A (zh)
KR (4) KR20160070157A (zh)
CN (2) CN107189978A (zh)
AU (1) AU2009239447B2 (zh)
BR (1) BRPI0910738A2 (zh)
CA (2) CA2722623C (zh)
ES (2) ES2656265T3 (zh)
MX (1) MX2010011738A (zh)
PH (2) PH12014502257A1 (zh)
PL (2) PL2283114T3 (zh)
RU (2) RU2528764C2 (zh)
SG (2) SG10201802522SA (zh)
WO (1) WO2009132068A2 (zh)
ZA (1) ZA201008392B (zh)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017395B2 (en) 2004-12-17 2011-09-13 Lifescan, Inc. Seeding cells on porous supports
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
BRPI0814894A2 (pt) 2007-07-31 2014-10-21 Lifescan Inc Diferenciação de células-tronco embrionárias de ser humano.
WO2009070592A2 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US10066203B2 (en) 2008-02-21 2018-09-04 Janssen Biotech Inc. Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment
US7939322B2 (en) * 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US8623648B2 (en) * 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
EP2942392B1 (en) 2008-06-30 2018-10-03 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
US9234178B2 (en) 2008-10-31 2016-01-12 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human pluripotent stem cells
CN102333862B (zh) 2008-10-31 2018-04-27 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
CN102257132B (zh) 2008-11-20 2014-09-03 森托科尔奥索生物科技公司 用于在平面基底上进行细胞附着和培养的方法和组合物
JP2012509085A (ja) 2008-11-20 2012-04-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド マイクロキャリア上での多能性幹細胞の培養
GB2484873B (en) 2009-07-20 2014-04-30 Janssen Biotech Inc Differentiation of pancreatic endoderm cells.
EP2470643A2 (en) * 2009-11-27 2012-07-04 Stem Cells For Safer Medicines Limited Composition and method for differentiation of human embryonic stem cells
US9005604B2 (en) 2009-12-15 2015-04-14 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Aligned and electrospun piezoelectric polymer fiber assembly and scaffold
RU2610176C2 (ru) 2009-12-23 2017-02-08 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
US9969981B2 (en) 2010-03-01 2018-05-15 Janssen Biotech, Inc. Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
ES2728900T3 (es) 2010-05-12 2019-10-29 Janssen Biotech Inc Diferenciación de células madre embrionarias humanas
RU2599420C2 (ru) 2010-08-31 2016-10-10 Янссен Байотек, Инк. Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток
SG187944A1 (en) 2010-08-31 2013-04-30 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
CN103221536B (zh) 2010-08-31 2016-08-31 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
EP2474541A1 (en) * 2010-12-23 2012-07-11 Johannes- Gutenberg-Universität Mainz Conjugated 3-(indolyl)- and 3-(azaindolyl)-4-arylmaleimide compounds and their use in tumor treatment
WO2012175633A1 (en) * 2011-06-21 2012-12-27 Novo Nordisk A/S Efficient induction of definitive endoderm from pluripotent stem cells
WO2013095953A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells
EP2823037A4 (en) 2012-03-07 2015-09-16 Janssen Biotech Inc DEFINED MEDIA FOR THE EXPANSION AND CARE OF PLURIPOTENTAL STEM CELLS
JP6469003B2 (ja) 2012-06-08 2019-02-13 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 膵内分泌細胞へのヒト胚性幹細胞の分化
EP2861723A4 (en) * 2012-06-14 2016-01-20 Janssen Biotech Inc DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS IN ENDOCRINE PANCREAS CELLS
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
JP6529440B2 (ja) 2012-12-31 2019-06-12 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 膵内分泌細胞への分化のためのヒト多能性細胞の懸濁及びクラスタリング
CN105008518B (zh) 2012-12-31 2020-08-07 詹森生物科技公司 在空气-液体界面处培养人胚胎干细胞以用于分化成胰腺内分泌细胞
KR101942769B1 (ko) 2012-12-31 2019-01-28 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
RU2016100219A (ru) 2013-06-11 2017-07-17 Президент Энд Феллоус Оф Гарвард Колледж КЛЕТКИ SC-β И КОМПОЗИЦИИ, И СПОСОБЫ ДЛЯ ИХ СОЗДАНИЯ
GB201322334D0 (en) 2013-12-17 2014-01-29 Agency Science Tech & Res Maleimide derivatives as modulators of WNT pathway
JP6588969B2 (ja) 2014-05-16 2019-10-09 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 膵内分泌細胞内のｍａｆａ発現を強化するための小分子の使用
WO2016100909A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED β CELLS AND USES THEREOF
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
US10253298B2 (en) 2014-12-18 2019-04-09 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived beta cells and methods of use thereof
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
IL312134A (en) 2017-11-15 2024-06-01 Vertex Pharma Preparations for the production of islet cells and methods of use
KR20200110338A (ko) 2018-01-18 2020-09-23 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 디하이드로인돌리지논 유도체
CA3108275A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
US20220133740A1 (en) 2019-02-08 2022-05-05 Frequency Therapeutics, Inc. Valproic acid compounds and wnt agonists for treating ear disorders
AU2020283150B2 (en) 2019-05-31 2023-08-17 Viacyte, Inc. Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
JP2022535239A (ja) 2019-05-31 2022-08-05 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティド 生体適合性メンブレン複合体
WO2020243663A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
WO2020243665A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
JP7553030B2 (ja) 2019-07-08 2024-09-18 国立大学法人東京工業大学 ジヒドロインドリジノン誘導体を用いたインスリン産生細胞の作製法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007030870A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-22 Es Cell International Pte Ltd Cardiomyocyte production

Family Cites Families (161)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3935067A (en) * 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5089396A (en) * 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5215893A (en) * 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) * 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) * 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
CA1340581C (en) * 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US5567612A (en) * 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
US5804178A (en) * 1986-11-20 1998-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
US5837539A (en) * 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
HU218140B (hu) 1991-04-25 2000-06-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humán interleukin-6-receptorral szembeni átalakított humán antitest
US5449383A (en) * 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
US5523226A (en) * 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) * 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
US6703017B1 (en) * 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US5834308A (en) * 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
EP0800829B2 (en) 1994-12-29 2012-07-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of a pm-1 antibody or of a mh 166 antibody for enhancing the anti-tumor effect of cisplatin or carboplatin
US5843780A (en) * 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) * 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) * 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
UA65572C2 (en) * 1997-04-24 2004-04-15 Ortho Mcneil Pharm Inc Substituted imidazoles, intermediate compounds for the preparation thereof, a method for the preparation of substituted imidazoles and a method for the treatment of inflammatory diseases
DK1028737T3 (da) * 1997-07-03 2007-08-13 Osiris Therapeutics Inc Humane mesenchymale stamceller fra perifert blod
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
DK1015576T3 (da) * 1997-09-16 2005-08-29 Egea Biosciences Llc Fremgangsmåde til fuldstændig kemisk syntese og aggregering af gener og genomer
AU729377B2 (en) * 1997-10-23 2001-02-01 Asterias Biotherapeutics, Inc. Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
AR014195A1 (es) * 1997-12-29 2001-02-07 Ortho Mcneil Pharm Inc Compuestos de trifenilpropanamida utiles para el tratamiento de procesos inflamatorios, composiciones anti-inflamatorias que los comprenden, ymetodos para prepararlos
DK1066052T3 (da) 1998-03-18 2006-06-12 Osiris Therapeutics Inc Mesenchymstamceller til forebyggelse og behandling af immunreaktioner ved transplantationer
MY132496A (en) * 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6667176B1 (en) * 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
EP1135562B1 (en) * 1998-12-01 2008-01-16 EMEH, Inc. Wall protector assemblies
US6413556B1 (en) * 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
IL144359A0 (en) * 1999-01-21 2002-05-23 Vitro Diagnostics Inc Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) * 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US6306424B1 (en) * 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
US6685936B2 (en) * 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) * 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
EP1240518A4 (en) 1999-12-13 2006-05-17 Scripps Research Inst MARKERS FOR THE IDENTIFICATION AND INSULATION OF PRE-GENERIC CELLS OF A AND B PANCREAS ISOLATED CELLS
US7439064B2 (en) * 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US7005252B1 (en) * 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US6436704B1 (en) * 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
AU2001274624A1 (en) * 2000-06-26 2002-01-08 Renomedix Institute Inc. Cell fraction containing cells capable of differentiating into nervous system cells
WO2002059083A2 (en) * 2000-10-23 2002-08-01 Smithkline Beecham Corporation Novel compounds
CA2431187A1 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors
CA2431166A1 (en) 2000-12-08 2002-06-13 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Indazolyl-substituted pyrroline compounds as kinase inhibitors
US6599323B2 (en) * 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
DE10290025T1 (de) * 2001-04-19 2003-10-09 Develogen Ag Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen in Insulin-produzierende Zellen
CN100516204C (zh) 2001-04-24 2009-07-22 味之素株式会社 干细胞及其分离方法
EP1393066A4 (en) 2001-05-15 2006-01-25 Rappaport Family Inst For Res INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) * 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
WO2003014313A2 (en) * 2001-08-06 2003-02-20 Bresagen, Ltd. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) * 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1444345A4 (en) * 2001-10-18 2004-12-08 Ixion Biotechnology Inc TRANSFORMATION OF STEM CELLS AND LIVER PROGENITORS INTO FUNCTIONAL CELLS OF PANCREAS
DE60233248D1 (de) 2001-11-15 2009-09-17 Childrens Medical Center Verfahren zur isolierung, expansion und differenzierung fötaler stammzellen aus chorionzotte, fruchtwasser und plazenta und therapeutische verwendungen davon
EP2264146A1 (en) * 2001-12-07 2010-12-22 Geron Corporation Islet cells from human embryonic stem cells
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US20050208029A1 (en) * 2002-04-17 2005-09-22 Akihiro Umezawa Method of forming pancreatic beta cells from mesenchymal cells
US20040161419A1 (en) * 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
CA2485527A1 (en) * 2002-05-08 2003-11-20 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted pyrroline kinase inhibitors
US20060003446A1 (en) * 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
WO2003102134A2 (en) 2002-05-28 2003-12-11 Becton, Dickinson And Company Pancreatic acinar cells into insulin producing cells
CN1671694A (zh) * 2002-06-05 2005-09-21 詹森药业有限公司 作为激酶抑制剂的二吲哚基－顺丁烯二酰亚胺衍生物
US6877147B2 (en) * 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) * 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
EP1539930A4 (en) 2002-07-29 2006-08-09 Es Cell Int Pte Ltd METHOD IN MULTIPLE STAGES OF DIFFERENTIATION OF POSITIVE INSULIN-SENSITIVE CELLS, GLUCOSE
US20040063204A1 (en) 2002-08-14 2004-04-01 Lijun Yang Bone marrow cell differentiation
US7371576B2 (en) * 2002-09-06 2008-05-13 Reneuron, Inc. CD56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
US9969977B2 (en) * 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
US7144999B2 (en) * 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004055155A2 (en) 2002-12-16 2004-07-01 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods of preparing feeder cells-free, xeno-free human embryonic stem cells and stem cell cultures prepared using same
US20070155661A1 (en) * 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
WO2005045001A2 (en) * 2003-02-14 2005-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
CA2520861A1 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
WO2004090110A2 (en) 2003-03-31 2004-10-21 Bresagen Inc. Compositions and methods for the control, differentiation and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) * 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
CA2530533C (en) * 2003-06-27 2015-02-10 Ethicon, Incorporated Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making and using the same
IL161903A0 (en) * 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
US7569385B2 (en) * 2003-08-14 2009-08-04 The Regents Of The University Of California Multipotent amniotic fetal stem cells
US7157275B2 (en) * 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
EP1670900A4 (en) * 2003-08-27 2008-06-11 Stemcells California Inc ENHANCED PANCREATIC STEM CELL AND PRECURSOR CELL POPULATIONS AND METHOD OF IDENTIFYING, INSULATING AND ENRICHING SUCH POPULATIONS
EP1696899A1 (en) 2003-12-17 2006-09-06 Allergan, Inc. Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b
US20060030042A1 (en) * 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US7625753B2 (en) * 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
AU2004309421B2 (en) * 2003-12-23 2011-04-21 Viacyte, Inc. Definitive endoderm
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
TWI334443B (en) * 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
WO2005065354A2 (en) * 2003-12-31 2005-07-21 The Burnham Institute Defined media for pluripotent stem cell culture
US20080241107A1 (en) * 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
WO2005080598A1 (ja) * 2004-02-19 2005-09-01 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
CA2581424A1 (en) 2004-03-09 2005-09-22 Gang Xu Methods for generating insulin-producing cells
US20090155218A1 (en) 2004-03-10 2009-06-18 Alberto Hayek Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
GB2427874B (en) * 2004-04-01 2008-09-10 Wisconsin Alumni Res Found Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
EP1740612B1 (en) 2004-04-27 2019-08-07 Viacyte, Inc. Pdx1 expressing endoderm
AU2005272078B2 (en) 2004-07-09 2011-04-14 Viacyte, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
CA2576872C (en) 2004-08-13 2013-11-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells
US20080268533A1 (en) * 2004-08-25 2008-10-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
WO2006029197A1 (en) 2004-09-08 2006-03-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Medium and culture of embryonic stem cells
MX2007002389A (es) * 2004-09-08 2009-02-12 Wisconsin Alumni Res Found Cultivo de celulas progenitoras embrionarias humanas.
WO2006083782A2 (en) * 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
JP5265204B2 (ja) 2005-03-04 2013-08-14 ライフスキャン・インコーポレイテッド 成人膵臓由来間質細胞
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
EP1875234B1 (en) 2005-04-26 2011-06-22 Aarhus Universitet Biosurface structure array
CA2610598A1 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Irm Llc Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
WO2006137787A1 (en) 2005-06-21 2006-12-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell culture
WO2007003525A2 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Janssen Pharmaceutica N.V. Cyclic anilino-pyridinotriazines as gsk-3 inhibitors
WO2007016485A2 (en) 2005-07-29 2007-02-08 Athersys, Inc. Use of a gsk-3 inhibitor to maintain potency of cultured cells
WO2007012144A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
WO2007027156A1 (en) 2005-09-02 2007-03-08 Agency For Science, Technology And Research Method of deriving mesenchymal stem cells
SG169324A1 (en) 2005-10-14 2011-03-30 Univ Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
CA2626152A1 (en) * 2005-10-24 2007-05-03 Agency For Science, Technology And Research Methods of specifying mesodermal, endodermal and mesoendodermal cell fates
CN101351547A (zh) 2005-10-27 2009-01-21 赛瑟拉公司 表达pdx1的背侧和腹侧前肠内胚层
EA018039B1 (ru) * 2005-12-13 2013-05-30 Киото Юниверсити Ядерный фактор перепрограммирования
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
SG10201405107YA (en) * 2006-02-23 2014-10-30 Viacyte Inc Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
DK1999253T3 (da) 2006-03-02 2019-08-12 Viacyte Inc Endokrine precursorceller, pankreatiske hormon-udtrykkende celler og fremgangsmåder til fremstilling
US7695965B2 (en) * 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
US8741643B2 (en) * 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
SE534150C2 (sv) 2006-05-02 2011-05-10 Wisconsin Alumni Res Found Förfarande för differentiering av stamceller till celler av den endodermala och pankreatiska utvecklingslinjen
WO2007139929A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 The Burnham Institute For Medical Research Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
WO2007149182A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
CA2893679C (en) 2006-06-26 2018-10-30 Lifescan, Inc. Conditioned medium for pluripotent stem cell culture
WO2008004990A2 (en) 2006-07-06 2008-01-10 Es Cell International Pte Ltd Method for stem cell culture and cells derived therefrom
WO2008013664A2 (en) * 2006-07-26 2008-01-31 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
US8835163B2 (en) 2006-10-18 2014-09-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
WO2008094597A2 (en) 2007-01-30 2008-08-07 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (mmc)
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
RU2465323C2 (ru) 2007-07-18 2012-10-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
BRPI0814894A2 (pt) 2007-07-31 2014-10-21 Lifescan Inc Diferenciação de células-tronco embrionárias de ser humano.
WO2009070592A2 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
US20100330677A1 (en) 2008-02-11 2010-12-30 Cambridge Enterprise Limited Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained
US10066203B2 (en) 2008-02-21 2018-09-04 Janssen Biotech Inc. Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment
EP2271747B1 (en) * 2008-03-17 2016-09-07 Agency for Science, Technology And Research Microcarriers for pluripotent stem cell culture
DK2283117T3 (da) 2008-04-21 2014-01-20 Viacyte Inc Fremgangsmåde til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller
US8623648B2 (en) * 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
EP2942392B1 (en) * 2008-06-30 2018-10-03 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
US8008075B2 (en) * 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
AR077766A1 (es) 2009-07-20 2011-09-21 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007030870A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-22 Es Cell International Pte Ltd Cardiomyocyte production

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Embryonic stem cells as a source of models for drug discovery.;POUTON C W ET AL.;《NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY 200708 GB》;20070831;第6卷(第8期);605-616 *
Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor.;SATO NOBORU ET AL.;《NATURE MEDICINE》;20040131;第10卷(第1期);55-63 *
Manipulation of self-renewal in human embryonic stem cells through a novel pharmacological GSK-3 inhibitor.;SATO NOBORU ET AL.;《METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY》;20061231;115-128 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2926674C (en) 2019-10-15
JP2015119724A (ja) 2015-07-02
PL2283114T3 (pl) 2017-08-31
SG10201802522SA (en) 2018-05-30
EP2664669A1 (en) 2013-11-20
RU2528764C2 (ru) 2014-09-20
EP2283114A2 (en) 2011-02-16
EP2283114B1 (en) 2017-03-01
CA2926674A1 (en) 2009-10-29
US9845460B2 (en) 2017-12-19
CA2722623A1 (en) 2009-10-29
AU2009239447B2 (en) 2015-11-05
ZA201008392B (en) 2016-07-27
PH12014502257A1 (en) 2015-09-07
WO2009132068A2 (en) 2009-10-29
SG190577A1 (en) 2013-06-28
MX2010011738A (es) 2010-11-22
PL2664669T3 (pl) 2018-06-29
RU2014128548A (ru) 2016-02-10
JP2017012184A (ja) 2017-01-19
RU2010147818A (ru) 2012-05-27
KR101658876B1 (ko) 2016-09-22
US20180127723A1 (en) 2018-05-10
KR20160070157A (ko) 2016-06-17
AU2009239447A1 (en) 2009-10-29
PH12014502258A1 (en) 2015-09-07
CN102105580A (zh) 2011-06-22
ES2624713T3 (es) 2017-07-17
KR20110004879A (ko) 2011-01-14
EP2664669B1 (en) 2017-12-27
ES2656265T3 (es) 2018-02-26
CN107189978A (zh) 2017-09-22
JP2011518563A (ja) 2011-06-30
JP2018057397A (ja) 2018-04-12
US20090325293A1 (en) 2009-12-31
US20140080210A1 (en) 2014-03-20
CA2722623C (en) 2016-06-28
BRPI0910738A2 (pt) 2019-12-03
WO2009132068A3 (en) 2009-12-17
KR20180091974A (ko) 2018-08-16
US8623648B2 (en) 2014-01-07
KR20170110742A (ko) 2017-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102105580B (zh) 多潜能细胞的处理
JP6013196B2 (ja) 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法
CN101952415B (zh) 人胚胎干细胞的分化
US8685730B2 (en) Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
CN104603262A (zh) 使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞
CN102317443B (zh) 用人饲养细胞进行的多能干细胞分化
CN102083965B (zh) 多潜能细胞
RU2465323C2 (ru) Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
CN105358680A (zh) 用于悬浮培养内胚层祖细胞的方法和组合物
KR20120104386A (ko) 인간 배아 줄기 세포의 분화
WO2012170853A1 (en) Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
AU2015268664B2 (en) Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: American Pennsylvania

Applicant after: Centocor Ortho Biotech Inc.

Address before: American Pennsylvania

Applicant before: Centocor Ortho Biotech Inc.

COR Change of bibliographic data
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant