BRPI0910738A2 - tratamentos de células pluripotentes - Google Patents

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BRPI0910738A2
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Abstract

tratamentos de células pluripotentes a presente invenção refere-se a métodos para tratar células pluripotentes, através do qual as células pluripotentes podem ser eficientemente expandidas em cultura e diferenciadas pelo tratamento das mesmas com um inibidor de atividade da enzima gsk-38 .

Description

Córcestraçfe<fe JNúiriWSi M
Relatório Descritivo da Patente de invenção para ’’TRATAMENTOS DE CÉLULAS PLURIPOTENTES”.
CZ\MPO DA INVENÇÃO
A presente Invenção refere-se a métodos para tratar células plurípotentes, através dos quais as células pluripotentes podem ser eficientemente expandidas em cultura e diferenciadas pelo tratamento das mesmas com um inibidor da atividade da enzima GSK-3B.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os avanços na terapia de substituição celular para diabetes melliius tipo I, bem como uma escassez de ilhotas da Langerhans transplants veis, contribuiram para focalizar o interesse no desenvolvimento de fontes de células produtoras de insulina, ou células β, adequadas para enxertia. Lima abordagem é a geração de células β funcionais a padir de células pluripotentes, corno, por exemplo, célulastronco embrionárias.
No desenvolvimento embrionário de vertebrados, uma célula pluripotente dá origem a um grupo de células compreendendo três camadas germinatívas (ectoderrne, mesuderme e endodterme), em um processo conhecido como gastrulação. Tecidos como tirokte, time, pâncreas, intestinos e fígado se desenvolvem a partir da endoderme, por meio de um estágio 20 intermediário. O estágio intermediário nessa processo consiste na formação da endoderms definitivo. Células do endoderme definitivo expressão inúmeros marcadores, como, HNF-3 bete, GATA-4, Mixll. CXCR4 e SOX-17.
A formação da pâncreas tem origem na diferenciação da endoderms definitivo em endoderms pancreátíca, As células do endoderme 25 pancreátioo expressam o gene horeeobox pancreaticoduodenal, PDX-1. Na ausência de PDX-1. o pâncreas falha em desenvolver para além da formação de brotos ventral e dorsal. Portanto, a expressão de PDX-1 marca uma etapa essencial na organogénese pancreática. O pâncreas maduro contém, entre outros tipos de célula, tecido exócnno e tecido endécrino. Cs tecidos exácrino 30 e endocrine têm origem na diferenciação da endodenne pancreática.
A geração de uma quantidade suficiente de material celular para transplante exige uma fonte do material celular que pode ser eficientemente expandida em cultura, e eiflctenternente diferenciada ηα tecido de interesse, por exemplo, células β funcionais.
Métodos atuais de cultura de oélulas-tronco embrionárias de ser humano são complexos; ales exigem o uso de fatores exogenos, ou de 5 um .meio quimicamente definido em ordem para que as células se proliferem sem a perda de sua pluripotênda, Além disso, a diferenciação de cèlulas-tronco embrionárias resulta, frequentemente, em uma diminuição das células a se expandiram em cultura.
Em um exemplo, Cheun e?' a/ (BioRsprsd
DO I:10.1095/bíoi reprod. 165..646870, 19 de o utu br o de 2 005) ap resen ia um sistema de cultura isento de alimentado?' e de soro no qual células-tronco embrionárias são mantidas em meie de substituição de soro não condicionado (SR) suplementado cam diferentes fatores de crescimento capazes de acionar a autorrenovaçãu das célulasdmnco embrionárias.
E.m outro exemplo, em IJS20050233445 é apresentado um meio definido útil para a cultura de céluiasdroaca, inclusive para célulastronco primordiais de primata não diferenciadas. Em solução, o meio é subsiancialmente isotõnico, em comparação com as célulasdronco sendo cultivadas. Em uma determinada cultura, o meio especifico compreende 20 um meio de base e uma quantidade de cada um dentre bFGF, insulina a ácido ascórbico, necessárias para suporte à. proliferação substaucialmente não diferenciada das células-tronco primordiais.
Em outro exemplo, WG2005086845 apresenta um método para a manutenção de uma oélula-tronco não diferenciada, em que o dito 25 método compreende expor uma cèluladronco a um membro da família de proteínas do fator de crescimento de transfermação-beta (TGF|3); um membro da família de proteínas do fetor de crescimento de fibrobíastas (FGF), ou nicot.inamida (NIC) em uma quantidade suficiente para manter a célula em um estado não diferenciado durante um período de tempo 30 suficiente para se obter um resultado desejado.
Inibidores de glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3) são conhecidos por promover a proliferação e a expansão de eéiulas-trcmco adultas. Em urn exemplo, Tateishi ef a/. (Biochemical and Biophysical Research Commonicatians (2007) 352. 635) mostra qua a inibição de GSK3 melhora o crescimento e a sobrevivência de células-tronco cardíacas humanas (hCSCs) recuperadas do coração humano neonatal ou adulto e que têm características mesenqulmais.
Por exemple, Rulifson of a/ (PNAS 144, 624'7-6252, (2007)) declara que !>a sinalização Wnt estimula a proliferação de célula β de ilhota’'.
Em outro exemplo, W02007016485 relata que a adição de inibidores de GSK-3 para a cultura de células-tronco não embrionárias, incluindo células progenitoras adultas multipctentes, leva à manutenção de um fenótipo pluripotente durante a expansão e resulta em uma resposta de diferenciação mais robusta.
Em outro exemplo, US2606030042 usa um método de inibir GSK-3, ou pela adição de Wnt ou um inibidor de molécula pequena da atividade da enzima GSK-3, para manter as células-tronco embrionárias sem o uso de uma camada de célula mantenedora.
Em outro exemplo, W02006026473 relata a adição de um inibidor GSK-3B. para estabilizar as células pluripoteníes através de ativação transcricíonal de c-rnyc e a estabilização da proteína c-myc.
Em outro exemple, WO2086100490 relata o uso de uma meio de cultura de célula-tronco que contém um inibidor de GSK-3 e um agonista gp13Q para manter uma população autorrenevadora de células-tronco plurípotentes, incluindo células-tronco embrionárias humanas ou de camundongo.
Em outro exemplo, Bato et aí (Nature Medicine (2094) 10:55 a 63) mostra que a inibição de GSK-3 oom um composto farmaoulógícu específico pode manter o fenótipo indiferencíado de células-tronco embrionárias e sustentar a expressão de fatores de transcrição específicos de estado pluripetente como Oct-3/4, Rex-1, a Nanog,
Em outro exemplo, Maurer et at (Journal of Proteome Research (2007) 6:1198 a 1208) mostra que células-tronco neuronals adultas tratadas com um inibidor de GSK-3 demonstram diferenciação neuronal melhorada, especrficamente ao promover a transcrição de genes destino β-cateaina e a diminuição de apoptose.
Em outro exemplo, Gregory ef al (Anais da New York
Academy of Sciences (2005) 'i 049:9’7 a 106) relata que inibidores de GSK6 3B melhroam a osteogênese in vitro.
Em outro exemplo, Feng et at (Biochemical and Biophysical Research Communcations (2004) 324:1333 a 1339) mostra que a diferenciação hematopoiética de céluíss-tnonco embrionárias está associada à regulação descendente da reta Wnt/ β-catenina, onde Wnt é um inibidor natural de GSK3.
Portanto, ainda há uma necessidade significativa de desenvolver métodos para tratar célula··tronco plurípotente de mudo que elas possam ser expandidas para atender às necessidades clinicas atuais, enquanto retêm o potencial de diferenciar em células pancreáticas endourinas, células queexpressam hormônio pancreátiuo, ou células que secretam hormônio panoreátíco,
SUMÁRIO
A presente invenção apresenta um método de expansão e de diferenciação de células pluripotentes através do tratamento das células pluhpotentes corn um inibidor da atividade da enzima GSK-3B.
Ό Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para expandir e diferenciar células pluripotentes, compreendendo as etapas de:.
a. Cultivar células pluripotentes, e
b. Tratar as células pluripotentes com um inibidor de atividade da enzima GSK-3B.
!» Em uma modalidade, as células pluripotentes são diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem deendoderma definitivo.
As células pluripotentes podem ser células-tronco embrionárias de ser humano, ou elas podem ser células que expressam 10 marcadores de pluripotência derivadas das céiulastrenuo embrionárias de ser humano, de acordo com us métodos apresentados ern 60/9134 75.
Em uma modalidade. o inibidor de atividade da enzima GSK~
3B é um composto de fórmula (l):
Fórmula (t)
Em uma modalidade, o Inibidor de atividade da enzima GSK3B é um composto de fórmula (ii):
R'
Fórmula (II)
Em uma modalidade., o inibidor da atividade da enzima G8K38 é um composto de fórmula (III);
Fórmula (III)
BREVE.DESÇRlÇAO..pAS.RGURAS
A figura 1 mostra o efeito da uma faixa de concentrações do composto JNJ 17189731 em um número de célula, conforme determinado pelo número de núcleos observado (painel A) e pela expressão de Sox-17, conforme determinado pela intensidade de adoração imunofluorescente (painel B). Os resultados foram obtidos a partir de células da estirpe de células-tronco embrionárias humanas H1 (barras brancas), ou células da estirpe de células lronco embrionárias humanas HO (barras pretas), com o uso do IN Cell Analyzer 10()0 (GE Healthcare).
A figura 2 mostra o afeito de uma faixa dei concentrações do composto JNJ 17163796 sobre o número de célula, conforme determinado pelo número de núcleos observado (painel A) e pela expressão de Sox-ΤΛ conforme determinada pela intensidade da coloração imunofluorescente (painel B). Os resultados foram obtidos a partir de células da estirpe de células-tronco embrionárias humanas H1 (barras brancas), ou células da estirpe de células-tronco embrionárias humanas H9 (barras pretas), com o uso do IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare)..
A figura 3 mostra u efeito de uma faixa de concentrações do composto JNJ 17723375 sobre o número de célula, conforme determinado pele número de núcleos observado (painel A) e pela expressão de Sox-17. conforme determinado pela intensidade da coloração smunofluorescente (painel B). Os resultados foram obtidos a partir de células da estirpe de células-tronco embrionárias humanas H1 (barras brancas)., ou células da estirpe de células-tronco embrionárias humanas H9 (barras pretas), com o uso do IN Cell Analyzer 1000 (GE Heatthcare).
A figura 4 mostra u efeito de uma faixa de concentrações do composto JNd 131576® sobre o número de célula, conforme determinado pelo número de núcleos observado (painel A) e pela expressão de Sox-17r conforme determinada pela intensidade da coloração imunaflucrescente (painel B). Os resultados foram obtidas a partir de células da estirpe de células-tronco embrionárias humanas H1 (barras brancas), ou células da estirpe de células-tronco embrionárias humanas H9 (barras pretas), com o uso do IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
A figura 5 mostra o efeito de uma faixa de concentrações do composto JNJ 26158015 sobra o número de céíuía. conforme determinado pelo número de núcleos observado (painel A) e pela expressão de Sox-17: conforme determinado pela intensidade da coloração imunofluoresceníe (painel B). Os resultados foram obtidos a partir de células da estirpe de células-tronco embrionárias humanas H1 (barras brancas), eu células da estirpe de células-tronco embrionárias humanas H9 (barras pretas), com o uso do IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare)..
A figura 6 mostra a efeito da uma faixa de concentrações do composto JNJ 26483197 sobre o número de célula, conforme determinado pelo número de núcleos observado (painel A) e pela expressão de Sox-17, conforme determinado pela intensidade da coloração smunofluorescente (painel B). Os resultados foram obtidos a partir de células da estirpe de células tronuo embrionárias humanas H1 (barras brancas), ou células da estirpe de células-tronco embrionárias humanas H9 (barras pretas), com o uso do IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
A figura 7 mestra o afeito de uma faixa de concentrações du composto JNJ 26483244 sobre o número de célula, conforme determinada pela número de núcleos observado (painel A) e peta expressão de Sox-17, conforme determinado pela intensidade da coloração imunofluurescente (painel B). Os resultados foram obtidos a partir de células da estirpe de células-tronuo embrionárias humanas H1 (barras brancas), ou células da estirpe de células tronca embrionárias humanas H9 (barras pretas), com o uso do IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
A figura 8 mostra o efeito de uma faixa de concentrações do composto JNJ 10220067 sobre o número de célula, conforme determinado pelo número de núcleos observado (painel A) e pela expressão de Sox-17, conforme determinado pela intensidade da coloração imunofluorescente (painel B). Os resultados foram obtidas a partir de células da estirpe der células-tronco embrionárias humanas H1 (barras brancas), ou células da estirpe de céiulasrtronco embrionárias humanas H9 (barras pretas), com o uso do IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
A figura 9 mostra a expressão de CXCR4 sobre a superfície das células, conforme determinado pela coloração imunofluorescente e pela análise citométrioa de fluxo, em células tratadas cam os compostos apresentados, de acordo com es métodos descritos nu cxampluS.
A figura 10 mostra a expressão de CXCR4 (painel A), HNF-3 beta (painel B), e Sox-17 (painel C), conforme determinado pels PCR em tempo real·, em células tratadas com os compostos apresentados, de acordo com os métodos descritos no example 8.
A figura 11 mostra o efeito de uma faixa de concentrações dos compostos mostrados no número de célula., conforme determinado pelo número de núcleos observador {Painel A) e a expressão de Pdx-1, conforme determinado pela intensidade de coloração imunofluorescente (Painel B), oomo uso do IN Ceil Analyzer '1000 (GE. Healthcare). As células foram tratadas de acordo com cs métodos descritos no exemplo 9.
A figura 12 mestra o afeito de urna faixa de concentrações dos compostos mostrados na expressão de Pdx-1 (barras brancas) e HNF6 (barras negras), conforme determinado pela PCR em tempo real. As células foram tratadas de acordo com os métodos descritos no exemplo 9.
A figura 13 mostra o afeita de uma faixa de concentrações dos compostos mostrados no número de célula. conforme determinado pelo número de núcleos observador (Painel A) e a expressão de insulina, conforme determinado pela intensidade de coloração imunofluorescenle (f5.ai.nel B), como uso do IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). As células foram tratadas de acordo com os métodos descritos no exemplo 10.
A figura 14 mostra o efeito de ume faixa de concentrações dos compostos mostrados na expressão de Pdx-1 (barras brancas) e insulina (barras negras), conforme determinado pela PCR em tempo real. As células foram tratadas de acordo com os métodos descritos no exemplo 10.
A figura 15 mostra u efeito de uma faixa de concentrações dos compostos mostrados no número de célula, conforme determinado pelo número de núcleos observador (Painel A) e a expressão de insulina, conforme determinado pela intensidade de coloração imunofluoresoente (Painel B)„ some uso do IN Cell .Analyzer 1000 (GE Healthcare). As células foram tratadas de acordo corn os métodos descritos no exemplo 11.
DESCRlCÃO DETALHADA
Cam propósitos de esclarecimento da descrição, e corn propósitos de limitação, a descrição detalhada da invenção é dividida nas subseções a seguir que descrevem ou ilustram determinadas 5 características, modalidades ou aplicações da presente invenção.
Definições
Céiulas-íronco são células não diferenciadas definidas por sua capacidade, em nível unicelular, tanto para autorrenovação corno para diferenciação a fim de produzk céluías-progênte, inclusive progenitors 10 autorrenováveis, progenitors não-renováveis e células terminaimente diferenciadas. As células-tronco sâo também caracterizadas por sua capacidade de se diferenciar, te v/fro, em células tencionais de várias linhagens celulares de múltiplas camadas germínatívas (éndodarma, mesoderma e ertoderma), bern corno por sua capacidade de originar, apõs transplante, 15 tecidos de múltiplas camadas germinativas e de contribuir substancíalmente para a rnaioria, senão todos, dos tecidos após a injeção ar blaslocístos.
As cèlules-tronco são classificadas de acordo com seu potencial de desenvolvimento como: (1} totipotenies, o que significa que são capazes de dar origem a todos os tipos de células embrionárias e extra-embrionàrías 20 de células; (2) plurípotentes, o que significa que são capazes de dar origem a todas os tipos de célula embrionária; (3) multipotentes, o que significa que são capazes de dar origem a um subconjunto de linhagens celulares, porém iodos dentro de mm tecida, órgão ou sistema fisiológico específico (por· exemplo, oélulas-tronco hematepoléticas (HSC) podem produzir progénie que inclui 25 HSO (autorrenovação).. progenitors oligopotentes restritas a células sanguíneas e todos os tipos de células e elementos (por exemplo , plaquetas) que são componentes normais do sangue); (4) oligopotentes, o que Significa que são capazes de dar origem a subconjuntos de linhagens celulares reais restritos que aqueles das células-fronco muttipotentes: e (5) unipotenies, o 30 que significa que são capazes de dar origem a uma única linhagem celular (por exemplo, oélulas-tronoo espermatogênicas).
A diferenciação é o processo pelo qual urna célula nãoespecializada (não comprometida”) ou menos especializada adquire as características de uma célula especializada, coma uma célula nervosa ou muscular. Unia célula diferenciada ou induzida por diferenciação é aquela 5 que assumiu urna pOsSição mais especializada (comprometida”) dentro da linhagem de uma célula. O termo “comprometida, quando aplicado ac processo de diferenciação, refere-se a uma célula que avançou na rota de diferenciação até um ponto em que, sub circunstâncias normais, continuará a se; diferenciar em um tipo especifico de célula, ou em um subconjunto de;
tipos de célula, e não poderá, sob circunstâncias normais, diferenciar-se em um tipo de célula diferente, ou reverter para um tipo de célula menos diferenciado. A desdíferendaçãô refere-se ao processo pelo qual uma célula reverte a uma posição menus especializada (ou menos comprometida) dentro da linhagem celular. Para uso na presente invenção, a linhagem de uma célula define a hereditariedade da mesma, isto é, de quais células se originou e a quais células pede dar origem. A linhagem de ama célula a coloca denho de um esquema hereditário de desenvolvimento e diferenciação, Um marcador especifico de linhagem refere-se a urna caraoteristíca especificamente associada ao fenótipo das células de urna 20 linhagem em questão, e pode ser usado para avaliar a diferenciação de uma célula não comprometida em relação à linhagem em questão, ’’Linhagem celular β“ refere-se ás células com uma expressão génica positiva para o fator de transcrição PDX-1 e pelo manes um dentre os fatores de transcrição a seguir: NGN-3, Nkx2.2, Nkxb.l, NeuroD, lsl-15 25 HNF-3 beta, MAFA, Pax4. e Pax6.. Células que expressam marcadores característicos da linhagem de célula β incluem células 8, “Células que expressam marcadores característicos da linhagem de endcderma definitivo para uso na presente invenção, referese a células que expressam pelo menos um dos seguintes marcadores: 30 SOX-17, GATA-d, HNF-3 beta, GSC, Cerl, Nadai, FGF8< Brachyury, proteína Míx-like homeobox, FGF4 CD4S. eemesadermina (COMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4< C-Kit, CD99, ou OTX2. Células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo incluem células precursoras da linha primitiva., células da iinha primitiva, células da mesendoderma e células dc endoderma definitivo.
Células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pa.ncreát.ica, para uso na presente invenção, refere-se a células que expressam pelo menos um dos seguintes, marcadores: PDX-1, HNF-1bet.a.. PTF-1 alta, HNF-6, ou HB9. As células cue expressam marcadores característicos da linhagem dc endoderma pancreãboo incluem células de endoderma pancreàfico.
A expressão ’‘células expressaras de marcadores característicos da linhagem endócrína pancreática. para uso na presente invenção, refere-se a células que expressam pelo menos um dentre os seguinges marcadores: NGN-3. NeuroD. ílhota-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3 ou PTF-1 alfa. As células expressaras de marcadores característicos da linhagem endòcrina pancreàtica incluem células pancreátioas endôorinas, células pancreáticas expressaras de hormônio e células pancreâticas secreíoras de hormônio, bem corno células da linhagem de células β
O termo endoderma definitivo, para usa na presente invenção, refere-se a células que apresentam as características daquelas 0 oriundas do epiblasta durante a gastrulação, e que formam o trato gastrointestinal e seus derivados. As células de endoderma definitivo expressam os seguintes marcadores: HNF-3 beta, GATA-4, SOX-17. Cerberus, OTX2( goosecoide, C-Kit, CD99, e MfxH,
O termo endoderme extra-embrionária”, para usa na presente invenção, refere-se a uma população de células que expressa pelo menus um dentre os seguinges marcadores: SOX -7, AFP e SPARC
Marcadores, conforme usado no presente documento, são moléculas de ácidos nucléioos ou moléculas de polipeptídeos que são diferencialmente expressadas em uma célula em questão. Nesse contexto, í) “expressão diferenciai significa um nível aumentado para um marcador positivo e um nível diminuído para um marcador negativo. O nível deiectável do ácido nucléico ou polipeptídeo do marcador è suflcientemente maior ou menor nas células em questão, em comparação com outras células, de modo que a célula em questão pode ser identificada e distinguída de outras células com o usa de qualquer um de uma variedade de métodos conhecidas na técnica.
O termo ’’célula de mesendoderma, para uso na presente invenção., refere-se a uma célula que expressa pela menos um dentre os seguinges marcadores'. CD48, eomesodemMna (EOMES), SGX-17, DKK4, HNF-3 beta, GSC, FGF17 e GATA-6,
Os termos célula pancreática enddcrina ou “célula pancreãtlca expressora de hormônio, para uso na presente invenção, referem-se a uma célula capaz de expressar paio menos um dentre os seguintes hormônios.' insulina, glucagon, somatosteíina e polipeptídeo panoreático.
O termo ’’célula secretora de hormônio, para uso na presente invenção, refere-se a unia célula capaz de seoretar pelo menus um dentre os seguinte hormônios: insulina, glucagon, somatostatina e polipeptídeo pancreático;
O termo célula pré linha primitiva, para uso na presente invenção, refere-se a uma célula que expressa pelo menos um dentre os seguinges marcadores: Nodal ou FGF8.
Q termo célula da linha primitiva, para uso na presente invenção, refere-se a uma célula que expressa pelo menos um dentre os seguinges marcadores, braquiúria., proteína homeobox similar a Mix ou FGF4,
Em uma modalidade, a presente invenção apresente um método para a expansão e diferenciação de células pluripotentes que compreendem trater as células pluripotentes com um insbidor da atividade da enzima GSK-3B.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para expandir e diferenciar células pluripotentes, compreendendo as etapas de:
c. Cultivar células pluripotentes, e
d. Tratar as células pluripotentes com um inibidor de atividade da. enzima GSK-3B,
Em uma modalidade, as células pluripotentes são diferenciadas em células que expressam marcadores características da linhagem de endoderma definitivo.
Marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo são selecionados a pator do grupo consistindo em SOX17, GATA4, H'nf-3beta. GSC, Cer1t Nodal, FGF8, Brachyury. proteína Mix-like homecbox, FGF4 CD48, eomesodermina (E.OMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, e 5 OTX2. È contemplada na presente Invenção urn célula derivada de uma célula pluripotente que expressa pelo menos urn dos marcadores característicos da linhagem de enduderrna definitiva Em urn aspecto da presente invenção, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo é uma célula precursora da linha primitiva. Em um aspecto alternativo, 10 uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo é uma célula do mesendoderma. Em um aspecto alternativo, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderms definitivo ê uma célula do endoderma definitivo.
As células pluripotentes podem ser tratadas com o inibidor da 15 atividade da enzima GSK-38 durante cerca de uma a cerca de 72 horas. Alternativamenfe, as células plurlpotentes podem ser tratadas com o inibidor da atividade da enzima GSK--3B durante cerna de 12 a cerca de 48· horas. Alfemativamenfe, as células pluripotentes podem ser tratadas com o inibidor da atividade da enzima GSK-3B durante cerca de 48 horas..
Em uma modalidade, o inibidor da atividade da enzima GSK~
3B é usado a uma concentração de cerca de 100 nM a cerca da 100 pM. Alternaiivamente, o inibidor da atividade da enzima GSK-3B é usado a uma concentração de cerca de 1 pM a cerca de 10 pM, Aítemativamente, o inibidor da atividade da enzima GSK-3B é usado a uma concentração de 25 cerca de 10 pM.
CQtopbsíos.édéORêdps para uso nos métodos da presente invenção
Em uma modalidade, o inibidor de atividade da enzima GSK38 é um composto da fórmula (I):
..... /
Fórmula (l) em que:
R^ é fenila, fenila substituída, em que os substituinte» de feniía são selecionados de grupa consistindo em C^Moda. halogênio, nitro, trifiuorometila e nitrilo, ou pidmidinila:
R? ê ferdia. feniía substituída. em que os substitutes de tenha sâo selecionados do grupo que consiste em alquila C<,5, halogênio. nítrn. tnfluommetils e nitrilo, ou psrimidinila que é opclonalmente alquila Cm substituída, e pelo menos um dentre R5 e Rs é pirimidinila;
R3 é hidrogênio, 2-(trimetilshil)etoximetila, alcóxicarbordla C®.
arilóxi carbonila, anis Gv«alquiloxio^rbonlla, arila Cí-^alquila, arila Cusalquiia substituída em que o um ou mais substítuinfes de arila sue independentemente selecionados do grupo consistindo em alquila Cq.$, alcóxi Cj.s, halogênio, amino, alquiiamino Cí>;, e diGí^alquilarnlno, ftalirnido Có-salquila, amino Cs.. -alquila, diamine Cv^alquila, succinimide C^alquila, alquiicamonila (>.&
arilcarbonila, alquilcarbonila C^alquila C-m e anloxicarbonil C-^alquila.
1¾ è (Aj-CCHa^-.X:
A é vinileno, etlnileno ou
R>í è selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, alquila (m,§, feniía e fenda C^salquila:
q é 0-9:
X é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, hidróxi, vlnila, vinda substituída em que um ou mais substituintes de vinda sao, 25 cada um, selecionados do grupo consistindo em flúor, bromo, cloro e iodo, etinila, etinila substituída, em que os substituirdes de atinda são selecionados do grupo consistindo em flúor, bromo, claro e iodo, alquila C;.
5, alquila 0^..¾ substituída, em que α um ou mais substituintes de alquila são, cada um, selecionados do grupo consistindo em alcóxi C^, trihalcaíquiia, ftalirnido e amino, cicloalquila Cj.?, alcóxi C5.5, alcóxi C-,,5 substituído, em que os substituíntes de alquila são selecionados do grupa consistindo em ftalimído e amino, ttalimido ôxi, fenóxi, fenóxi substituído., em que o um ou mais substíluintes de fenila são, cada um, selecionados do grupo consistindo em alquila Cv$< halogénio e alcóxi Crs, fenila, tenila substituído, sm que o um ou mais subst.ítuintes de fenila são, cada um, selecionados do grupo consistindo em alquila C?.5, halogénio e alcóxi Os.íí( arila Ojalquila, aula substituída Cvsalquila. em que α um ou mais substitulntes de arila são, cada um, selecionados do grupo consistindo em alquila Ci-g, halogénio e alcóxi 0<.$, arilóxiCi.salquilamino, alquilamino Cts, dialquílamino £<.$, nitrilo, oxlma, benxíloxiimino, alquilóxiirnino C>.R, ftalimido, succinimide, aiquil carbonilõxi C<.5, fenilcarbonilóxi, fenil carbonilóxi substituído, em que o um ou mais substituintes de fenila são, cada um, selecionados do grupo consistindo em alquil CVs< halogénio e alcóxi 0ç5. feniiCí.íalquiloarboniioxi, em que o um ou mais substituintes de. fenila são, cada um, selecionados do grupo consistindo em alquila Ch.s> halogênio e alcóxi C<„5< aminocarbonilóxi, aíquíiamínocarbonilôxí C<..s, dialquílaminocarbonilóxi C;..5, alcóxi carbonilóxi C<.5. alcóxi carbonilóxi substituído Cv5< em que o um ou mais substituintes de alquila são, cada um, selecionados do grupo consistindo em metil, etil, isopropila e hexil, fenóxicarbonilóxi, fenóxi carbonilóxi substituído, em que o um ou mais substituintes de fenila são, cada um. selecionados do grupo consistindo em alquila C1..5, alcóxi e halogênio Cç$, alquiltiu alqulltio C1.5 substituído, em gue os substituintes de alquila sãe selecionados do grupo consistindo em hidróxi e ftalimído, alquílsulfonil Cv$5 fenilsulfonil, fenil sulfonil substituído, em que 0 um ou mais substituintes de fenila são, cada um. selecionados do grupo consistindo em bromo, fluor, cloreto, alcóxi C1.5 e trifluorometlia; com a condição de que. se A for
q è 0 e X é H. então. R3 pode .não ser 2'(ti imetilsilil)etóxímetila; e seus sais farmacetiticamente aceitáveis.
Um exemplo da invenção rnolui um composto de formula (l), em que FU é feníla substituído e R? é pífimidin-3-ila.
Um exemplo da invenção inclui um composto da formula (l), em que Ri é 4-fluorofenila.
Um exemplo da invenção inclui um composto da fórmula (I), em que R3 é hidrogênio, aril £h.« alquila, ou anla Cm-alquil substituído.
Um exemplo da invenção inclui um composto da fórmula (l). em que R3 é hidrogênio ou teailC<.saiquil.
Um exemplo da invenção incluí um composto da fórmula (I), 10 em que A é etínüeno e q è 0-S.
Um exemplo da invenção inclui um composto da fórmula (I), em que X é succinimide, hidróxi, metil fenil alquiísulfonil Cv5: dcioalqdl C3.8> alquil carbonilóxí C<.s, alcóxi G<.3> feniícarbonílóxí, alquilamino C< s, dialquHamino ou nitrilo Cv&
Compostos da fórmula (I) são apresentados na patente dos
Estados Unidos cedida à mesma requerente U.S. 6,214.830, cuja descrição completa está aqui incorporada por referenda,
Um exemplo da invenção inclui um composto de formula (I)., em que o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em:
Composto Nome
5(4)-(4-fiuoro ten íi)~4{5)-(4~piridíi)imidazol.
4-(4-fluoro fenil)-1 -(3-fenií propii)-5-(4-plridil)lmidazol
5-(4-fluom fenil)-1'-(3-fenil prcpil)-4-(4~pirídíl)imidazQl
4-(4-fiuoro)-2dodO“1-(3feníl propii)-5-(4-piridil)imidaz.nl;
4-(4-fIuero fenil)-2-'(4~hidróxíbutin-141)-1 -(3-fenii propil)-5-(4plndiljimldaz.nl,
4-(4-fluopofenil)~5-(4-pindil)-142-(tnmetilsiíil)etoximetí0imídazol
5-(4fluorofenil)-4-(4-pindíi)-1-[2-(inmetiisíhl)etoximetii]~ímidazDÍ:
5-(4-fluoro fenil) - 2 -iodo-4 -(4-pirídil)-! -[2- {trimetiísiíil)etóximetil]-imidazol;
5-(4-fluoro ten il)-4-(4-pinoil )-2- (t rimet ilsil i l)etinil 1 [2(trimetilsilil)etóximetií]-imidazol
2-(2-dorovinH)··5-(4 fluoro feni!)-4-(4 piridilpimidazol.
Co m posto Nome
11 5~(4*fiuprofenil)4’(4~pindH)1[2-(trknetifsRií)stóximetH}· imidazol--2-oa rboxi side ido.
12 2(2,2-dibrcmcerileno-1-ll)--5-(4-fluoro fenil)-4-(4-pmdii)-1 -(2- {trimatiisilil)atoximetil]-smidsz.ol-2-carbóxí aldeido,
13 5(4)-('4--fluoro feail)-2'-('3-hidraxi--3-'feail'propin-1-ilM(5)-(4piddl.l)imidazol;
1X 5-(4-fluoro fenii)-4~(4-piddil)-l-(2~(tdmetilsiHI)etóximetil|-2· oximlnolmidazol,
15 544-tluom fen0)-4-(4·piridil)-2--lmidazol cxirna,
16 2~(5-clorapentin~ l-ilH-W-fluoro fenil:)-1 ~(3-fenil pro pl 1)-5-(4piridiOimidazol,
S<— 4-(4·Πυατο fenil)-2-(4--N -fenil carbamoilbxl burin-1-il)1-(3-fenil prop 11)-5-(4 -pi rid il)im idazc 1.
.' > 2-'(4'-elarobi4in'-1-il)-'4--(4---fluam fenil)1-(3-fenil propil)-5-(4piddihimidazQl, e
18 2-(4-dimetilarmno butm~1 -II)-4-(4-4luoro fenil)-1 ~(3-fenN propll)5--(4-pi dd 11) Im idazol. Um exemplo da Invenção inclui um composto da fórmula (I),
em que o composto é o composto 5 oom a seguinte fórmula: l: . :. . < .. ........ d........................ .1 .... .. ......... cb........ F ; Composto 5 Em uma modalidade, o inibidor de atividade da enzima GSK-
311 é um composto de fórmula (II):
R3-C'''\............/ \ X„.x-RÍ < f ί ό \\ X < '3 ,A« .·γ.;«
N..........V x-K
NI
IRR’
Fórmula (It) em gue:
R ê selecionado do grupe que consiste em RSs -C^alquila-Rs, -Cz^alquenila-Rs, -Cs.galquinila-Rg e ciano;
Ra è selecionado do grupo quo consists em ddoalquila, heterociclila. arila e heteruarila;
R: é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, -0%. §alquife-R'\ -Cs^alquenila-®, -Cs^aiguinila-R, -C(O)-(Ct.e)alquila-R^ -0(0)ariía-R&, 0(0)-0-(0?.^)alquila-Ff9, 0(0)-0-arila-R85 -C(O)-NH(C ,^alquiia-R5), 0(0) NH(arila-R^), -C(O}-N(Cçí.alquila'R”h; -SOríCt^alquila-R0, -SOz-arila-R8, -cicloalquila-R”, -heterooíclila-R^. -arila-R^e -heteroarita-R^ em que heteruciclita e heteruarila sâo fixados ao átomo de nitrogênio de azaindol na uma posição por meio de um átomo de carbono com anel de heteroarila ou heterooidiia;
R'? é de 1 a 2 subsíituintes independentemente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio, -0-(CXaiquíla -O-(Ci.«)aíquiía-OH, -0(C í ,s)afquila-O-((% .$)aiquila, -O-(C ? Xalquila-NHS, -O-(C^)aíquiía-NH(C <. salquila). -O-fCb^alquila-NtCrçalquilalí, -O^C^Xiiquila-S-vCvejalquila, -0(CXalquíla-SOr (C<.s)alquila, -O~(C<^)alquila-SO;?-NH2, -O-(C v.«)alquila- S0r NH(C-^alquila), -0' (C ? ^)alquila-S0s-N(Q^alquila)3, -O-C(O)H, -0-0(0)-(01.
6)alquila, -O-C(O)-NH2, -0-C(O)··NH(C<.^alquila), -O-C(O)-N(Ch.ealquila)21 -O(Ci.^)alquila-C(O)H, O-rtta.sjaiquila-CfCfHC-í.^lalquila, -O-(Cs<?)£^íquiíaCO;íH, -O-(C-;.^)alquiia0(O)-Q-(Cí.g)aiquiía, -O-(C{.g)alquila-C(O)-NHzf -O-(C^ s)alquila-C(O)-NH(C<.^aíquila): -O-(C?.^)aiquila-C(O)-N(C^alquila)z, C(O)H, C(O)-((%.g)aiquila< -0Ο2Κ -0(0)-0-(0,«)alquíla, -C(O)-NHj, -C(NH}-NH2, - (Q)-NH(C·:.^alquila), -C(Qj-N(C?.salquila) e)aiquih-S-(C<.«)alquila. -S-(Gí.g)alquila--O-(C).$)alquila, -S-(C-:.$)alqusb-O-(C<. g)alquila-OH, S-(G<.s)alquila-O-(C^)alquiía-NH2, -S'(C;..g)slquils-(>-(C). e)alquila-NH(C<.j-.alquila), -S-(Ci^alquifa-O-íGí.^)aiqmfo-N(C j^alquilaja, -S(C í-Ualquíla-N H(CKSalquila), -SOa-ÍC i.?)alquila, SO2-NH2, -SQ?-NH(C;. itelquila), -SOg-hKCi^alquilah, -N-R'\ ciano, (halo)).?, hidróxi, nit.ro. oxo, ddoalquila-Rfí, -heterociolila-·®, -anla-R* a -heteroarib-R*;
FG é dei a 4 substituíntes fixados a um átomo de carbono ou nitrogênio selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, alquila alquenila -Ca.?, -Ca^aíquiniia, alquila-C(O)H, -0(0)-(0). ?), -COaH, alquila C(O)-O-(C^), -C(O)-NHSs -C(NH)-NH;;. -C(O)-NH(alquilaC^). -C(O)-N(Ct.e)alquiia)a, alquib-SOa-(C).8), --SOrNHs, -SOrNHfalquílaC^), -SOr N(alquilaC).3)2, -{C).?)alquila-N-R\ -(C)^)aiquila-(haio)).3, -(Cí^)a!quiia-OH. enb-Rs, -((Ifog)alquila-anb-R0 e -{C)^)aíquila-heteroanla-Rs; corn a condição de que. quando R'' for fixado a um átomo de carbono, R~ serà adicionalmente selecionado do grupo consistindo em aleòxi-C·;.?, -(C^)alcòxí-(haio)j.3, SH. slquila-S-(C?.&), -N-R\ ciano, halo, hidróxi, nitro, 0x0 e heteroarila -R3;
R? è 2 substituintes selecionados independentemente do grupo consistindo em hídscgênio, alquiia-Ct.g, alqueaila-Ca^: alquinila-Ca.?, -(Ch. ?)alquita-OH, -(í:h.sj)aíquila-(:)-((:-f.í;)alquila, -(Ci^)alquíla-NHa, -(C^)alquilaNH(C)..«alquila). -(C).«)alquila-N(Ci.?aiquite)2< -(C^)alquíla-S-(C).s)aiquiia, C(O)H, -0(())-(0 i.^alquíla, -C(O)-O-(C 1 .^alquila, -G(0)-NH2, €(O)-NH(G). salquila), -C(O)-N(Ci.«alquila)a, -SOa-(Gi.g)alquila, -SOg-NH;>s 'SOa-NHíCh.. saíqulla), ~S0rN(G-^alquila)-/. ~C(N)“NHa: -ciclaaiquiía-R6, -(Gi.?)alquila~ hete?ocíclila-R\ -arila-R*, -(Cj^aíquila-arila-Rw e -(C)^)alquila-heteroanla-Re;
R° ê de 1 a 4 substituintes fixados a um átomo de carbono cu nitrogênio selecionado independentemente da grupo consistindo em hidrogênio, alquda-C)..s, (halo)aíquite-(Ci.§)i.3 e alquila~OH-(Gi.s); com a condição de que. quando R3 é fixada a um átomo de carbono, R8 é adicionalmente selecionado de grupo consistindo em alcóxi-GalquiiaNH(C)^)< -N(alquilaC).?)a, ciano, halo, (haío)altóxi-(C).^)5.3, hidróxi e nitro;
R* é de um a deis suhstituirries independentemente selecionadas da grupa que consiste em hidrogênio, --Cp§al<toxi} -ΝΗ?, NH(C^alqtala), -NfC-i.^alquileh, cíana, (halojvs, hidróxi e nitro;
R4 ê urn substituinte fixado a um átorno de carbono ou nitrogênio selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, -Cpgaiquila-R\ -C^alquenda-R^ -C^aíquiniía-RT -C(0)H, 0(0)-(0pg)aiquila~Rs, -C(0)~ NH;?< -O(O)-NH(C<àquilo-Rs), -0(0)-N(C ^alquila-R^, -C(O)-NH(aríla-R8). -CtOl-cicloalquíla-R”, -CfOy-heterocictiía-R8, -C(O)-arila-R8, -G(O)heteroarila-R8, -CQjH. -G(O)-O-(C^g)alqulla-R, -C(O)-O-arila-F^8. -SOHCv S)aíquila-R9. -SOj-arila-R8. -cicloalquila -R\ -arila-R* e -(C5..&)alquila~N-R7; corn a condição de que, quando R2 é fixado a um átomo de carbono, R7 ê selecionado adicionalmente do grupo consistindo em -C-ualcóxi-R5, -N-R7. ciano, halogãnlo, hidróxi, nd.ro, oxo, -heterooiclfia-Rb e -hetercarila-R'i
R's á de 1 a 3 substituint.es fixados a um átomo de carbono selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, -GR. &alquila-R™, -C^alquenila-R'*, -Cg..galquinila-Rw, -G^-salcóxI-R10, -C(O)H, 0(0)-(0i.a)alquila-R$, -C(O)-NH?, -C(O)-NH(C<.«alquila-R8), -C(Q)-N(C<. salquila-R8)?, -CÇO^cicloalquila-R0, -CCOj-heterocichta-R8, -CíOt-arila-R8, C(O)-heteroarila-R8, -C(NH)-NH2, -CORÍ -C(OWCi.«)aíquiía<Rs, ~C{0>20 O-arila-R8, -SO24Ci.s)alquila-R9. -SOrariia-R!\ -N-R\ ciano, halogênio, hidróxi, nitro, -cícloaíquita-R8, heterocíciiia-Rs, --arila-R8 e -heteroarila-R8;
R4 é de 1 a 4 substituirdes fixados a um átomo de oarbano selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, -CR. galquila-f®, -O^^quenila-R, -C^alquinlia-R!°, -ϋ^ηΧϊΰχΜ®, ~C(0)K -0(0)25 (C^^alquila-Rn -C(O)-NKS, -C(O)-NH(C^alquila~FP), -Q(O)-N(Çt.galquila-R^, C(O)-cicioalquila-R8, -C(O)-hetefodcliia-R&, ~C(0>arila-R'\ 0(0)-heteroarila--R8, -CfNHHMHa, -C0;íH, -0(0)-0-(0v^alqulla-R0, -C(O)-O-anla-R8, -SH, -S-(Cr. g)alquila~R' -SOHCv^alquila-R*. -SOranla-R'i -SOg-N H-;, -SO2-NN(C <. salquila-R·’), -SOs-NCC-s^alquila-R^, -N-Rx ciano, halogênio. hidróxi, nitro, 30 cicIcalquila-R8, -heteroctdila-R8, ariia -R8 e -heieraarila-R*;
R',; é os substituintes de 1 a 2 selecionados independentemente do grupo consistindo em nidrogémo. NHfalquilaC^X -N(aiquilaC-i.sh, ciano, (halo)^, hidróxi, nitro e oxo; e,
Y e Z. são independentemente selecionados do grupo formado por O, S. (H,OH) e (H,H); com a condição de que um dentre YeZé Oeo outro é selecionado do grupo consistindo em O, S, (H,OH) e (H,H); e seus saís farmaceuticamente aceitáveis.
As modalidades da presente invenção incluem cs compostos da fórmula (II). em que R é selecionado do grupo que consiste em Rs;, -Cv 10 ^aíquila-Ra, -C^,alquerrila-Rs, -C^alquínila-Rs e ciano.
As modalidades da presente invenção incluem os compostos da fórmula (!l>, em que Rís é selecionado do grupo que consiste em heterociclíla, arila e heteroarila.
Em uma modalidade, Rs ê selecionado do grupo que consiste em di-hidro-piranila, fenil, naftila. tremia, pirrolila. imidazolila, pírazoliía, piridinsla, azaindolila. indazolila, benzofurila, benzotieníla, dibenzofuriia e dibenzotienila.
As modalidades da presente invenção incluem os compostos da fórmula (H). em que R: ê selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, -Ci. ^Iquila-R3, -G^alqueníla-R^. -C^alquinila-Rg -0(0>(Ci.éalquila-R*, -0(0)20 aríla-R8, C(Q)-O-{Ct..<)alquila-R':! t -CÇOj-O-arilaJT'·, -C(O)-NR(Cb^alquilã-R”). C(O)-NH(aril.a-R% -C(O)--N(Ci..4alquila--R%; -SOrfCi^alquifehR9, -SOg-arila-R8, -oiotealqmla-RT • hetereciclib- R^ -aríla-R0 e -heteroarila-R0; em que heterociciila e heteroarila são fixados ao átomo de nitrogênio de azaíndol na posição um por meio de um átomo de carbono com anel de heteroarila ou heterociciila,
Em uma modalidade, R‘ è selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, -Cí^alquila-R: -arila-Re e -heteroarila-R**; em que heteroarila é fixado ao átomo de nitrogémo de azamdd na posição um por meio de um átomo de carbono com anel de heteroarila.
Em uma modalidade.. R? é selecionado do grupo que consiste 30 em hidrogênio. -C<^alquila-Rt; e -naftBa~Rs,
As modalidades da presente invenção incluem os compostos da fórmula (Ui, em que R8 é os subslftuintes de 1 a 2 selecionados independentemente do grupa consistindo em hidrogênio, -O-(C^)alquila. -O(Cv-galquila-OH, -O-(Cr4)alquila--O-(C®ralquila, -0-(0-5.^alquíla-NHs, -0- (Ο-μ ^)aIquiía-NHfalquiia(<^), -0-(C<^)alqulla-N(alquiiaC? ·.<;)?, -O-(C^-)alquila-8-{G».. ^alquila, -0-(Cr4)alquila-S0;r(Ct4)aíquiía. -O-fC^Mquíla-SO^-NH;;, -0-(0),.
Ajalquila-SOrNHfalquilaC^). -O-íCv^jalquHa-SOrNíalquHaC^h, -Q-C(G)H, 0-C(0)-(Ci.4)alquOa. -Ο-Ό(0)-ΝΗ;:> -O-C(O)-NH(alqwla0M)s -0--0(0)N(alqaiía0i4)v< -O-(C^)alquÜa-C(O)H, --O-CCj^aíqoiía-C^-fCí^alquila, -D(C ;.4)ãiquiía~00;>Hs -0-(0^)alquila-C(O)-O··(CMjãlquila, -0-(01 ^)alquila-C(O)~ NH?, -O-(C;^)alquila~C(O)-NH(alquiíaC^), O-CC-i^lalqmla-CíOj-NÇaiquiiaGv «já, -C(0)H. -CCOXCwlaíQüila, -CO?H. -CtOj-O-CCi^alquüa, -C(O)-NH^, C(NH)-NH?, -C(0)-NH(alquilaCs.4), -C(G)-N(alquilaCi4h> -SH, -S-COr^alquiía, -S--(G’,.4)elquila-S-(C;^)alquila< -S-(CMMquHa--0-(05-4)aiqoíla> --3-(0-:.4jalquila0-(Cw)aíquiia--0H, -S-(CM)alquiia-O-(C-5^)aiquib-NHS: -S-(Cv4)alqulla-0-(Cr <)aiquíla-NH('alquliaCi...O, -S-CCMX^^^-O-CC^^alquHa-NCalqqilaCi^h, -S-(£\.
4)alquHa-NH(alquilaCi.4), -SOríCv^telquila, -SO^-NH^, -SO^-NHíaiquilaê®), SO^-NfalquilsCteZfe -N-R\ dano, (halag.3, hidróxi, nrtro, oxo, dcloalquiía-R6, heterooidiia-FO arila-FP e heteroanla-Rs
Επί uma modalidade, R^ è de 1 a 2 subsfiiüintes selecionados independeu temente do grupo consistindo em hidrogênio, -0-(0^. 4)alquila; 20 N-R', hidróxi e heteroariía-R!'\
Ern uma modalidade, R;> é de 1 a 2 subshimntes selecionados independerdemente da grupo consistindo em hidrogênio, -O-(C^.4)alquila, N-R·', hidróxi, imidazolila-R6, triazolila-R6 e fetrazoila-R6.
As modalidades da presente invenção incluem os compostos 25 da fórmula (lí), em que R® é os substituintes de 1 a 4 fixadas a um átomo de carbono cu nitrogênio selecionados independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, alquila-C^, aiquenila-C·^, alquinila-C^, C(Q)H, -G(0)(C-i...í)gÍquií?s, --CO^H, -C(O)-O-(Ci.á)arquHa, -C(O)-NH2, C(NH)-Nt-E, ”C(0)”NH(alquHaCv-$), -C(O)~N(C<.4)alquita)2, -S0?(C μ 3ü í5)alquila: -SOrNH'->, -3Ο;>-ΝΗ(ίΤ....·οΙρηΙΐ3); -SOa-NCalquilaC^)?, -(0^ <ialquila-hl-R\ -(Cr4)aiquíla-(halok.3. -(CM)alquila-OH. -arila-R-\ -(Cv xjalquiía-arila-R8 e -(CbDalquila-heteroariia-R8; com a condição de que.
quando R'J ê fixado a uns átomo de carbono, Rb é adicsonalmente selecionado do grupo consistindo em alcòxi-Cm: - (C^alcóxHhaloh.^ -SH, -S-(C®)alquila,. -N-R', ciano, halo, hidróxi, nitre, oxo e heteroarila-R8.
Em uma modalidade, Rf' é hidrogênio,
As modalidades da presente invenção incluem cs compostos da fórmula (11), em que R' è os substitutes 2 selecionados independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, alquila -C-m, alquenila-C®. alquinila-C^. (Cí.^Mquila-OH, •(Ci.4)alquila-0-íC:,4)alquila; -{CM)alquila-NHs, -(C^òalquilaNH(alquilaC m), -(C ;.4)aiquiia-N(C i^alquila^, -{C® alquila-SRC < 4)alquiia, 0 C(O)H, C(O)-(C;.4)aiquiía, 'CfOt-O-^C-i^jalquila, -C((})-NH>, -0(0)NHCalquilaC®, C(O)-N(alqtHÍaCh.<h; -SG^Cí.^alquila. -SG3-NHs, -SOgNH(Ci..<alquila), -SO^-NfalquisaÜj^.h, -C(N}-NH^. -cidoalquila-R5, -(C^alquilaheteroaiolila-Rq -arila-R8. -(0®alqta-anla-R8 e -(C-j.^alquila-heteroariia-R^.
Em uma modalidade, R? é 2 substitutes selecionados 5 independentemente do grupo consistmdo em hidrogênio, alquiia-C·^, C(O)H, ~C(O)~(Cbá)aiquila, -0(O)~Q-(C <. 4)alquila, -SO;<NHí, SO.?·· NH(alquilaC<.4) o -SGrNíalquiíaCMh·
As modalidades da presente invenção incluem os compostos da fórmula (II), em que R° é de 1 a 4 substituirdes fixados a um átomo de 0 carbono ou nitrogênio selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, alquüa-Cj.^, -(O®alquila-(halo)v3. © (Cv 4)alquila-OH; com a condição de que, quando R’5 foi fixado a um àtorno de carbono, R* será adicionalmente selecionado du grupo consistindo em alcòxi-C^, -ΝΗχ, -NH(aíquiíaCi^), -N(alquilaC;^)s, dano, halo, -(Cr 5 ,<,)aluóxi-(halo)^í, hidróxi e nitre.
Em uma modalidade, R8 é hidrogênio.
As modalidades da presente invenção incluem os compostos da fórmula (II), em que Rs é de 1 a 2 substituintes selecionados independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, alcaxi-C?.^, NH2, 0 -NHíafouilaC^i), -N(aíquilaCM)s< ciano. (halo)?.·*, hidróxi e nitro.
Em uma modalidade, R® è hidrogênio.
As mudalidades da presente invenção incluem os compostos da fórmula (II), em que R' ê um substituínte fixado a um âfómo de carbono ou nitrogênio selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, -C^alqulíaR5. -C^alquenila-Rq -C^alquinila-R6, -C(O)H. -C(O)-(C^)alquila-Rs, -C(Q)·· 5 NH2, ••CCOj-NHfCwalqulIa-R9), ••CCOl-NCC^alquíla-R9)?, -C(O)-NH(arila-Rs), C(O)-cicloalquila-Rs, C(O)-heterodulila-R -C(O)-anla R8, -C(O) heteroanla RÃ\ -CO2H, -C(O)O-(C^)alquila-Rs, -0(0)-0-ania-R*, -SOr(C^4)alquila-R9, SOa-aala-RA -cloloalquiía-R'\ -arila-R<; e -(C^alquiia-N-R’5; com a condição de que, quando R' for fixado a um átomo de carbono. R? será 10 adicionaimente selecionada da grupa consistindo em -Ci.4atoóx?-R‘\ -N~R'. ciano, halogênia, hidróxi, nitra, axo, heteroaíclila-Rfe e heteroanla-R'3.
Em uma modalidade, Rz é um substítuinte fixado a um átomo de carbono ou nitrogênio selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, -C?. telquila-R3, -C^alqueniía-R^, -C^alqulnila-R5. ~CO2H. -0(0)-0-(0^)alquíla-R9.
cicloalquila-'R'i arila-R e (C;.4)alquíla-N-R·; com a condição de que, quando RJ' for fixado a um ãtorno de nitrogênio, um sal quatêmiu não será formado; e, cam a condição de que, quando Rz for fixado a um átomo de carbono. Rz será selecionado adicionaimente do grupo consistindo em -CMalcòxi-R8, -N-RÈ ciano. halogênio, hidróxi, nitro, oxo. heteruoiulila-FG e heteroarila-R^.
Em uma modalidade, R* è um substítuinte fixado a um átomo de carbono ou nitrogênio selecionado da grupo consistindo em hidrogênio. Cí.íalquila-R e arila-R*’; com a condição de que, quando Rz for fixado a um átomo de nitrogênio, um sal quatêrnio não será formado; e, com a condição de que, quando Rz for fixado a um átomo de carbono, RÃ será selecionado 25 adicionalmente do grupo consistindo ern -N-R\ haíogênio, hidróxi e heteroarila-R··5.
As modalidades da presente invenção incluem os compostos da fórmula (II), em que R“' é de 1 a 3 substrtuintes fixados a um átomo de carbono selecionado independentemente da grupo consistindo em hidrogênio. -Cr 30 4aiquila-R'°, -C^^alquenrla-R10, -Cj^alquinila R^, Cu4alaóxi-R'ü, 41((1)51. -0(0)(C<.4)alqüila~Rô -C(O>NH(CMalquila-R9), -C(Q)-N(C^alquila-R9)2, CfOj-oicteaiquíla-R8, -G(0)-heterooiclila -Rb, -C(O)~arrla-R3 : -C(O)-heteroanla-Rs.
-C(NH)-NH?» -COgH. -0(0)-0-(0 i.4)akiuila-R8, -C(O)-O-ari!s-R8 -SOr(Ch. ^alquila-R'i -SOrarila-R^ -N-R\ -(Cw^alquila-N-R7, ciano, halogênio, hidróxi, nitro, cicloalquila-R^, heterociclila-R*, anla-Rri e heteroariia-f?.'.
Em uma modalidade, Rá é urn substituinte fixado a um átomo de carbono selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, CR.dalquilaR''í, -C;Malqueniia-Rk>, C^aíquinila-R*0, Cj.^alcóxi-R^, C(O)H. -00?Η, ΝΗχ, NHfalquilaCw), NíalquilaCi^, dano, halogênio, hidróxi e mtro.
Em uma modalidade, R'· é um substituinte fixado a um átomo de carbono selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, -C-b^alqulia10 Rw s -NH>, NHtalquila C-;.4), -Nfatquila Ο^, haiogênios e hidróxi.
As modalidades da presente invenção incluem os compostos da fórrnula (II), em que R4 é de 1 a 4 substif.uin.tes fixados a um átomo de carbono selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, -Ci. <alquiimRs0 -Ü^siquenslad®; -C^.^alquímla-R''3, -C^alcòxí*R^f\ -C(O)H, -0(0)15 (C^Jalquila-R5, -C(O)-NHX, -C(0)-NN(Qi4âlquila-Rs), -C(O)-N(CMalquila-R% C (O)-cicloalquila-R8 -C(O)-heterociolila- Rô. -C(O)-a rila-R8, - 0(O}-heteroarila · R-ç C(NH)-NHS, -00$, -C(0)<)-(Ct4)aiquila-R& -C(O)-O~anla-Rs, ~3H, -5-(Cv 4)alquila-RÍO -S0r(C ^alquilmR9 -SO-arila-R8 -SO2-NH2< -SOrNH(Cv ^alquila-R*), -SOs-NÇCi^alquila-R9)?. -N-R#, ciano, haiogênio, hidróxi, nitro, 20 cicloalquiia-Rt -heierociclila-Rt -ariia-R8 e -heteroariía-R8.
Em uma modalidade, R* é de 1 a 4 substituintes fixados a um átomo de carbono selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, 'C^aiquíla-F®, -C24alquenila-R*ü, -C^alquiniía-R50, -Ο;. 4aluòxí'RK'', -C(O)H, -CO^H, -hlH2, NHfalquila Cm)> -N(alquila CR®· c-iano, 25 haiogênio, hidróxi, nitro, cicloalquila, heterocicíila, arüa e heteroarifa.
Em uma modalidade, R4 é de 1 a 4 substiiuintes fixados a um átomo de carbono selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, Ci^alquila-R^, Cí.^aicòxi-R^’, -NH2; -NHtCv^alquila), -N(C<. ^alquila);;, haiogênio e hidróxi.
Em urna modalidade, R4 ê de 1 a 4 substituintes fixados a um átomo de carbono selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, G^alquila-F®, C;.„<alcôxí-RH!, NH;;, -NH(aiquila C®, N(alquíla C<®, cloro, flúor e hidróxi.
Ao modalidades da presente invenção incluam os compostos da fórmula (lí), em que Rw é de 1 a 2 substituintes selecionados independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, NH2; -NHfalquila Cm). -Nfalquila C<.®, ciano. (halojvs, hidróxi, nitro e oxo.
Em uma modalidade, R':,; é de 1 a 2 substituintes selecionados independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e (halo)^·
Em uma modalidade, R';; é de 1 a 2 substituintes selecionados independente mente do grupo consistindo em hidrogênio e (tluoro)^.
As modalidades da presente invenção incluem os compostos da fórmula (II), em que Y e Z são selecionados independentemente do grupo consistindo em O, S. (H.QH) e (H,H): com a condição de que um dentre Y e Z é O, e o outro é selecionado do grupo consistindo em O. S, (H,OH) e (H,H).
Em uma modalidade, Y e Z são selecionados independentemente do grupo consistindo em Q a com a condição de que um dentre Y e Z, é O, e o outro ê selecionado do grupo consistindo em O e (H.H),
Em uma modalidade, Y e Z, são selecionados independentemenie a partir de O.
Os compostos da fórmula (II) são apresentados na patente dos Estados Unidos cedida à mesma requerente rr 7,125,878, cuja descrição compieta está aqui incorporada por referência,
Um exemplo da invenção inclui um composto de fórmula (li) em que o composto é selecionado do grupo consistindo em:
Composto Nome
S-fSclorGfeniQ-ê-tlphidróxipropiQ-IH-pirroiop^-blpindin-B- i Ip1 H-pi rroi~2, ã-diona,
3-(2~clorofeníl)“4~í1[3-(dimetilaminc)prQpil]-1H-pirrolo|2,3·· b]pindin-3all-1H-pirrol-2,5-diona,
3'11 (3hidróxipropil)-1 H^inoia(2.3ròjpindin-3~il]-4-(1 ~ naftalenil) -1 H-pirrol-2,5-diona,
3-71 “P-(dímetiiamino)propill-1 H-pirrolo[2,3Zúpk idín -3 ·· ii)· 4 ··( 1 naftaíenilM H-pinol-2,5-díona,
Composto Nome
3--(5-cíorobenz0(ò]tíen-3-il)^-[1~(3~hídfõxÍp?opin-1H' plr rofo[2,3-bjpiridin-3 ílj- 1H-pirral-2:5-diona,
3-(1-(3hidróxiprQpil)-1/-f-pir?0lo(2;3-hjpiridin-3-il]-4-(1H- i ndazol- 3-il)-1 H-pirroi-^.S-díona,
3-(1--etü--1 /'/-'pirfoÍ£>[2>3--£j)pín<Jtn-3~íí)~4(1~(3~hidróxipropíi)
H-pirrolo[2,3-ólpir ídín-3-i I ]-1 H-pkrol-^S-diona,
3-[1 -(3-hidróxi prnpil» 1 H-pírfolo[2.3-h]piridín-3-il}-4-(2-metôxi te n i I))-1 H-pirro I-2,5 -d lona;
3'{ 1 -(3-hidrõxi prop ís})~ 1 /-/~pirrο!οΓ2,3-ó]piridín 3 ·ίψ·4-(3-metôxí feral))·· 1H- pirrd-2,5 -dlona f
3-(2-dura-4-nura'0 fenH)-4 -(1 -(3-hidróxípropií)-1 #-hpkndo[2t 3ά}ρΙπ<ϋπ-3-4|-1Η·'ρίΓΓθΙ-2.,5-όίοη»>
3-[1(3-hidráxiprGpil)-1H-pkrGlo[2>3~P|pinóin-3“ilJ~4-[2(triftoorometíl)feraiM ^-pirr0l-2>5dioaa,
341-(3-hidróxsprop>0--1H--pkrck42(3-b]pfridln-3-il)-4-(2· plrid i nil) -1 H-pirrd 2S 5 -dicna,
3-[3Cloro-5“(triHuürometH)-2-piridíníl]4~[1’(3’hidróxip?opil)-
H-pif rolo(2,3-ò]pirid rn-3-H p 1 H-pir roI-2; 5-d lona:
3-[1-(3-hídróxipropíl)-1H-pirrclo[2t3-òlpíridín3-ín-4(2-t.ienH)-
H-pirrol-S^-diona,
3-(2;5-didora-3-tienil)-44l (3--hidróxipfopil)-1/ApirrQlal2.3b]pindin~3-il]-1h-pirfd-2;5-diona:
3-( 1 -(3 · hidróxlpropíl j-1 ,N-pirazbh3dH 4 * (3-h id róxiprop i I) -1HρίΓΓοΙο[2<3-ό)ρίτΙόΙη-3-ίΙ]-·|ήί~ρΐΓϊοΙ-2,5-όίοπ3(
3~[ 1 -(3-hldró xi propil)-1 f /-pirrolo[2.3-b]piridín-3-li] -4-(1 H- í m ídazol-2-i l)-1 H-píms I- 2,5-d lona,
3-{ 1 -(3-hidrôxíprapil) -1H- ímidazoM d]-4-( 1-(3~hidrôxípmpil)-
H“pirrolc(2.3-h]piridin-3-il]-1 /Tpirroh^.S-diona,
3-(1 (2'hidrõxtetil)’1f7~imidszol-4-d]-441-(3-'hidròxipropil}-1HρίΓΓθΐ0(2,3'·0]ρίπάΙπ-3-ϋ]-1Η·ρΐΓΓθΙ-2!5-<ϋοπ3.
3-[1-[3-(dimetilamino)propíipiH-indazol-3-íl]“4-[1-(2.nafteteral)-1 H-pirrnla[2.3-úlpir idin-d-iH-l Ff-pírroÊ^S-diona,
2.1 3-(1-(3-hidróxipropil)~1 N-indazol-3 -1164-(1-(2-naftateníl)'-1Hpirr'do(2.3-h]piridín3-íll-1 H-pinol-2,5-diona,
3-((£:)-2-(4-fIuoro fenll )eteail]*4 - [ 1 -(3--hidroxipropil) -1HρίπΌΐο(2,34))ρ'^·^Ιπ-3υΗ''1Η·-ρίΓΓ0ΐ-2;5·'<Ιίαη3ί
3--(3!4--di-hidro-2H-piran--8-d)-4-[1-(3-hidrôxipropil)-1Hpirrotop.ó-hJpiridin-S-iiH rópkrdMSdiorsa,
Ο
Composto 24 Nome 4-(1(3-hidFáxipropil}-1H-pifrolo(2.3--.b]piddin-34i]-(3í3’-bi-lH· pin'oi]-2Ç5-diona,
25 3-(2-benzofuranií)~4-(143-hidróxipropíl) 1 Ζ·/-ρΙπθίθ[2,3blpindin-3ill-1/4-pirroi2,5-díona,
28 3-(1 (3-hidfòxipropil)-1 h-pírroío^.S-bJpinW- 3ΙΠ-4· (1 - metil- 1 H-pirazal-3-il)-1 H-pirroi~2,5~díona,
28 2.5- 01-510^0-4-(1-(3-hídrôxiproph)-1K-pirroio(2,3-.b]piridm-3“il]- 2.5- dioxo-1 H-pírrol-3 -earbonitríla, 3-dibanzo[ò,dJtien-4-il -441 ~(3-hidfóxlpropií) -1 H-piraNo[2, 3blpiddin-3-il] -1 /-Apinol-2,5-díons,
3-(4-dibenzofuranil)-4-[l-(3-hidròxípropil)-1/Apírrolo(2,3·· b] piridin --3- it]-1 H-pirro I-2.5-dion a ,
30 3-{2-h!drô>sfeDÍi)-4-[1-(3-metóxipíopii)-1H--pirí tOlo(2,3-ò]píridin- 3-IIJ-1 H-p irrol-2,5-diona,
31 3-(3,4-dimefáxifenil}-4-(1-(3-met.óxipropil}~1H~pkrolo[2,3- b] p i dd i n-3-i1)-1 H-plroí-d?, 5-díona ,
32 3-{3:4-díhidróxifeníl)-4-íl-(3*hidròxípropil)-1/7-pírroío(2!3- b]pindia-3-ii]--1 H-pirrol-2,5--dioaa,
3 3-'(2-metòxíferN)4'[1(2-naftaieail)-1H-píiTola(2<3-blpiddio-3- II]-1 H-pirfol-2,5-diona,
34 35 2-metílpropil èster de ácido [3-[342,5-di--hidra -4 (2·· metóxifenil)-2,5-díoxa--1/d--pirral-3-il]-1H-pirrDlo[2:3-b']piFíd!n~1íl]propíl]-carbâmica 341 ~(3-amincpropH)-1 /7-pir roloi2.3 tojpirid i n-3-il]-4 -(2 melóxifeníl)·· 1 H-pírrol-2(S-dione,
36 ^-^--(342,5-01510^0-442-1001021(0011)-2,5-0^^0--1/4-^1145-01-3-- il]-1 r/-pirrolp(2,3-b]piridin-1 -il]propil]-acetamida,
37 A/-(3-[3-(2,5-di-hidra--4-(2-mctóxífenií)-2.,5-diaxD-1/'Cpírroí-3-ilj~ 1 H-pí f rolo[2,3~b]plrid i π-141] prop! l]-s a Item id a.
38 3-{2-metéxifenii)-4-[1 -(3-(1 / /-tetrazol-1 dQpropi I]-1 //- pkralo(2,3-h]píndin-3-n]-1H-pirral-2.5-diona(
39 3-{2-metóxífenii)-4-[1(3-(2H-teírazol-2-ii)propil]-1H- pirrolo(2f3-b]píndin-3-il]~1 H-pinolClS-dicna,
40 41 42 3- (1 -(3-hid róxi-prop i 1)-1 N-piuolo(2,3-b]píddin-3 -ü] -4 -pirazin-2 1-pirrol-2,5-dÍDna, 3 - (2,4-d imefóxi-piriníídin-5-ll) -4- (1 --(3-h id róxi ·-pro p i h-1H pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-pirrol-2:5-diana, 4- (3-(4-(2,4-dimetòxípinfrddin-5-il)-2;5d!OXO-2,5-dihidrO“lHph rol-3 - li]-pírrolo(2,3- b]pkidíπ-1 -ií}-butironib iia.
Composto Nome
4-{3-[4-{ 1 -metíM Η-ρίΓ8ζοΙ-3-^)-2,5·^ίοχο-2,5-άηΜόΓ0-1 Hpirrul-Silbpirroío^^-blpirídín-liQ-buüronítFila, e
3-(2.4-dirnetôxi-piòmidin-S-íO^-CI-fenetil-IH-pinOlofS, 3b)píridin-3-il)-pinol-2;5-díona,
Um exemplo da invenção inclui um composto de fórmula (II) em qoe o composto è selecionado do grupo consistindo em:
H
o*./* <1 te
o.
H ,te *·......te n te
HO
HO
Composto 11
Composto 26
H
n. te.
Composto 40
H
O.;-., .........O
Composto 41
H >
i:<x. ........y
Composto 44
.....
>4
v.........
Site u-
Composto 4:
Em uma modalidade, o Inibidor da atividade da enzima GSK38 á um composto de fórmula (III):
R4 zR6
Fórmula (HI) sm qua
A e E são selecionados independentemente do grupo consistindo em urn átomo de carbono substituído por hidrogênio e um 5 átomo de nitrogênio; em que
é selecionado independentemente do grupo consistindo em 1/Mndol, 1Hpirrolo[2,3~.b)piridinat 1/Apirazolo[3,4-b]pirídina e 1 /Aindazoí:
Z é selecionado a partir de O: altemativamente, Z ê selecionado a partir de di-hídro; sendo que cada átomo de hidrogênio é 10 fixado por urna ligação simples.
R,< e FU sâo, independentemente. selecionados a partir de alquila C-;.$< alquenila C2..« e alquinila opcionalmente substituída por oxo;
é selecionado do grupo que consiste em aiquila-C í.&, alquenilaC2^, alquimla-Q^, -O-(C-..gjalquila-O··, -Q^C^Jalquenila-O--, -O-(C2.g)alquinila~ 15 O-, -G(O)-(Cr3)alquiía-CXO)- (sendo que qualquer um dentre os grupos de ligação alquila, alquenila e alquimia antarioras são cadelas de carbono Onerares opcionalmente substituídas por um a quatro substituintes selecionados independentemente do grupo consistindo em alquila C^s alcóxi C^, Cu 8alcõxi(Ci.3)alquila, carboxila, carboxHa(Cu.?}alquila, C(O)O-(C^)alquila, -Cs.. 2D 8aiquila-C(O)O“(Ci..8)alquila: amíno (substituída por um subshtuinte selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila Cv^), amlnofC^aiquíla (sendo que amino é substituído por um substítuinte selecionado índependaritemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila Cm), haiogênio. (haloWCh^alquila, (hslo)í..3(C^)aloõxi.. hidróxi, hidròxitOí.. g)alquiia e oxo; e, ern que qualquer um dos grupos de ligação alquila.. alquenila e alquinila anteriores sãc opcionalmente substituídos por um a dois 5 substituístes selecionados independentemente do grupo consistindo ern heterociclíla, arila, heteroarila, heteroaicíila(Ci.^)aiquíiat arila(C^)aíquila, heteroarila(C?^)alquíla. espirooicloalquila e espiroheterociclíla (ern que qualquer um dos substltuintes de cidoalquiia, heterociclila. arila e heteroarila anteriores são opcionalmente substituídos por um a quatro substltuintes selecionados 10 independeniemente do grupo consistindo em alquila Cm, alcóxi C<^, C?..
salc0xi(C-Mfelquila, oarboxila, oarboxila(CM)alqulla, amine {substituída per um substituinte selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila Cm), emino(C5^)aiquila (sendo que amine è substituído por um substituinte selecionado independentemente do grupo consistindo em 15 hidrogênio e alquila Cm), haiogênio, {halajt.gfC-í.^alquíIa, (hato);..3(CM)olcóxi, hidróxi e hidtoxiCC-s^jalquila; e, em que qualquer um des substituintes de haterocicliis antenores são opcionalmente substituídos par oxo)), cicloalquíla, heterocicliia, arila, heteroarila (em que cldoalquila, heterocicliia, arila e heteroar-la são opcionalmente substituídas por um a quatro substituístes 20 selecionados independentemente do grupo consistindo em alquila Cm, aicóxi
Ci.C}.8aícòxi(CM)olquilat carboxíla, carboxilaíC^etalquila, amino (substituído por um substituinte selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila Cm), amiso(C-!^)alquiia (em que amino é substituído por um substituinte selecionada independentemente do grupo consistindo em 25 hidrogênio e alquila Cp), haiogênio, (halo)M(C>,&)afqui!a( (halo)^alcòxí (Cm), hidróxi e hidróxi(C;S)alquila; e, em que a heterocíclila é, upcíonalmente., substituída por oxo). -(O^CH^^-O-, -0-(01¼ ^.-O-(CH£h^-O··, -O-(CHs;h §O-(CHs)<.c-O-(CH?)í 3-0-, -(O-(CH2)-0-{CH2)<.«-NíV(CH?;)-O(CH2)i^O-(CH2)m-NRs-, -(O-íCHigvArevS-, -O-lCH^t^S-CCHah^-Oa -Ό30 (CH;03.<rO-(CH?)v?rS··, -NRe-, -ΝΡδ-(0Ηί;)γίί-ΝΡΓ,
NR?-(CH;í);a-NRô-: -NRS-C(O)-, -0(0) ^1^-, -€(0)-(ΟΗ2)8.?γΝΙ^·-(ΟΗ2)ολγΟ(0)-( -NRs-(CH2)?m-C(O}-(CH2)m-C(O)-(CH?)o^NR?-, -NlqvC(O)-NRy-( -NRe-CíNR?)··
NRí;~ -O-(CH;Pn Rh»®^rS-, -S^CH^NR^CHg)m-O-, ®(CH3)m-NRs(GH2)m~S~, -NR6-(CH2h^-S-(CH2)i.6-NR?- e -SOr (em que Re, R? e Rs sao selecionado» independentemente do grupo consistindo em hidrogênio, alquila Cte. CteaicdKifCx.g)alquiia, cartíOxila(Cj.g)alquila< amino(Ci,^)alqulla (sendo que amíno è subsüiuido por um substituinte selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila Cm), hídFÓxi(CuS)alquila, hetenxiclhafCi.^alquila, arila(C^3)aiquila e heteroariía(CvS)alquila (em que a os substituinte» do heterocíclila, arila e heteroarila anteriores são upcionalmente substituídos por um a quatro substitutes selecionados independentemente do 10 grupo consistindo em alquila Cm, alcóxi Cm, C^aicóxi(C^)alquila, carbaxila, carboxila(C^<òalquiía, amíno (substituído por um substituinte selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila G®. amino(Cvs)aíquila (em que amina é substituído por um substitute selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila CMalquIa), 15 halogênio, (halo)s.^(0^e)alquila, (halo)t.3(Cí.$)alcóxi, hidróxi e hidróxi(Cr^)alqulla;
e, em que heterocidila ê substituída opcional mente por oxo)); com a condição de que, se A e E forem selecionados a partir de um átomo de carbono substituído por hidrogênio, então R2 será selecionado do grupo consistindo em alquinila C2.§, O-{C<^)alquila--O··, O-(Cs.g)alquenila-O'·, -O-fC^Jalquimls-O-, 20 C(O)-(C^)alquila C(O)·· (em que, qualquer um dos grupas de ligação alquila, alquenila e alquinila supracitadas são cadeias de carbono linerates opcionalmente substituídas por um a quatro substituirdes selecionados independentemente do grupo consistindo em alquila alcóxi Cm. C\. ealcóxi(Ct.^alquila. carboxila, oarboxíla(Cí,ç}alqusla, -C(O)O'(G<^alquila, -C 25 saiquiia-C(O)O-(C®)aiqui!a, arnino (substituído por um substituinte selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila Cm), arninu(C^)alquila (em que arnino é substituído par um substituinte selecionado indepesdeotemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila Cm), halogênio, (haio)í.3(Cv«)alqaila, (halo)us(C^)aloõxi, hidróxi. hidráxi(Ct.«)alquiía e 3D oxo: e, em que qualquer um dos grupos de ligação alquila, alquenila e alquimia supracitados são substituídas opcionalmente por um a dois substituinte» selecionados independentemente do grupo consistindo em heterocíclila, adia, heteroarila, hetemcioliia(Ci.g)alquila. ariia(Gí.g)alquila, heteroariia(C^)alquila.. espirocicicalquila e espiroheterociclila (sendo que qualquer um dos srsbatituiates de cicloalquila, hetemciclila. arila e heteroarila supracitados sac substituídos opcionaimente por um a quatro substituímos selecionados independsntemente do grupo consistindo em alquila Q;..s> alcóxi C<.g( C^aíuóxiCG-j.^aíquila, cafooxila, oarboxila(C<.s)alquiia, amino (substituído por um substitute selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila C<4 aminc(C,,g)alquiia (sendo que amino á substituído por um substitute selecionado indepemientemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila ÜMalquila), haiogênío. (hafoUXC^alquila, (halofosíC^alcóxi, hidróxi e ddróxi(Cí.í)alquiia: e. em que qualquer um dos substitulntes de heterocidila anteriores são substituídos opcionalmente por oxo)). cicloalquila (sendo que cicloalquila é substituída opckmalmeate por um a quatro substítuintes selecionados índependentemente do grupo consistindo em alquila 0^, alcóxi C<.g( Cj^alcòx^C-j^alquíla, carboxíla, carboxila(Ci.$)alqiüla, amina (substituído por um Swbstitdnte selecionado independentemente da grupa consistindo em hidrogênio e alquila Cu). amíno(C?^)alquíh (sendo que amino è substituído por um substitute selecionado independenternente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila C,,4), halogêrlo. (hab)^(C^)alqmla, (halo),..5((>..g)aícóxís hidróxi e hidròxKCr^alquíla), *(Ο(0Η2)μ)^&“0··> O“(CH2)v§-O~(CH2)bS<X -O(C44£p^-U··, (0 {UH2){^)3^-NRs4 --(>-·(0Η;5),.^*ΝΗβ-(()Ι1;;)ί, ?rO-. -O-CCHz)-(0»(CH2)^)o.§-S-. -O-(CHâ),.^S-(CH2)t ^O-, O-tCHj/i^-OqOHigi^-S-, -NRç-NRt-, -NR$-(CHg),.^-NR?~, -NRe*(GHs) Ry(OHaU-NRe··, W-C(0}-s -C(O)-NRs-< -CCOXCH^-NFMCN^{GHg)i>$G{0XGH£),.&~Vz(O)-(CH;jg,í}.$-NR?-'( -hlRa-G(O)-NR7··, --NRg-CtNR?)ΝΙΌ, -ü-íLHph-S'-NR$-(Cti;>)-!.<y'S-, —S-(OH;j)^-1^1^-(0¾)5.^-0-. -S-(CH2),.s-NR$(CHíb-s-S- e -NR?r(Cil;?);^S(C4l2),4SNR?·· (sendo que R§, R? e Rs são selecionados independeníemente do grupo consistindo em hidrogênio, alquila C,.8, CMâlcóxl(Ci.8)alquila, ^rboxíla(C:.§)ak^'ila. aminG(Ci,.8)alquila (sendo que amine é substituído por um substituinte .selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila C,.4). hidróxi(C<.g}alquila. hetorocidilafC^alquila, arilafCj^alquila e heten>arila(C^alquila (sendo que as substituintes de heterociclila. arila e heteroarila supracitados sao substituídas apaionalrnente por um a quatro substituintes selecionados mdependentemente do grupo consistindo ern alquila C®, alcóxi £®. (^.íalcóxi(Cu)^lqcHa, carboxiia. aarboxila(Ci.^)aiquiia. amino (substituído por um sabstítuínte selecionado independentemente do grupa consistindo em hidrogênio e alquila Ci.d), amlno(C^)alquila (senda que amino é substituído por um subsütuinte selecionado independentemente da grupo consistindo em hidrogênio e alquila C-s.4). halogénio, (hala)·;.*®.^alquila, (halo)v3(Crs)alcóxi. hidróxi e hidróxi(Ci. ojalquila; e. em que heterociclila é substituída opçionalmente por oxo), e, em 10 que é selecionado do grupo que consiste em alquila C®, C>.,«alcáxl(Ci.
^alquila, carboxiia® ^alquila, amino(C®alquila (sendo que amino é substituída par um substituinte selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila C®> hldmxi(Ci^)alquila5 heterocíclila(C^.. 2)alquila, arila® ,s)alquila e hetemarila(Ci.g)alquíla (sendo que os substituintes 15 de heterocidila,. arila e heteroarila supracitados são substituídos opcionalmente por um a quatro substHuintes selecionados independentemente do gmpo consistindo em alquila C®, alcóxi C^, C^alcóxi(Cí.^)alquila, oarboxila, carboxiía(C®aíquila, amino (substituído por um substituínte selecionado independentemente do gmpo consistindo em hidrogênio e alquila C®, 20 amíno(C-i.§)alquiía (sendo que amino é substituído por um subsütuinte selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila C® halogénio, (haío)^(C ojalquila, (halo)í^(Ci^)alcóxi, hidróxi e hidróxi®.. ^alquila; e, em que heterociclila é substituída opcionalmente por oxo)); e,
R? e R5 sàa seiecionados independentemente do gmpo 25 consistindo em hidrogênio, alquila C^s, alquenila (®, alquinila C2.s (sendo que alquila, alquenila e alquinila são substituídos opcionalmente por um substituínte selecionado do grupo consistindo em alcóxi C®, alcóxi®. sJalquila. carboxila, carbóxi Ia ®...$)alq ui la, amino (substituído por um substituínte selecionado índependenfemente da grupo consistindo em 30 hidrogênio s alquila C<.,<). amína(C® alquila (sendo que amino ê substituído por um substituínte selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila (halo'ni, (halo){..3(Ch;.ojalquila, (halo)®® sJaiQòXí. raaròxi» h^roxí(C-{^)aiquka e oxo.k alco.xí alcòxjcar»oníí (halo)i.;i(Cus)alcòxít Cv^alquiltso, arila, heteroarila (sendo que arila e heteroarila são substituídos opcionalmente por a substitute selecionado do -grupo consistindo ern alquila alcóxi Cs^. alcôxi(C<^)alquila, carboxlla, 5 earboxiía(Cujj)alquila. amino (substituído por um substitute selecionado independentemente do grupo consistindo em hidrogênio e alquila C^), amino(C< ^alquila (sendo que amino é substituído por um substitute selecionado índependentemente do grupo consistindo ern hidrogênio e alquila Ομ<), halogênio, (hal0}<.3(C ^alquila, (halo)vXCug)alGÓxk hidróxi e í) hidrôxi(C-j..&)alquila)} arnino (substituído por um substitute selecionado independentemente do grupo consistindo ern hidrogênio e alquila G <...<), ciano, halogênio, hidróxi e nitro; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Em uma modalidade, um composto de fórmula (III) é um composto selecionado a partir do grupo que consiste em:
Fórmula (Ills)
Fórmula (IHd)
Fórmula (Him) Fórmula (IHn) em que todas as outras variavais são conforma anteriormente definido; e, seus saís farmaceuticamente aceitáveis
Em uma modalidade,, um composto de fórmula (IH) é um composto selecionado a partir dn grupo que consiste em:
Η H
Fórmula (lilf) Fórmula (IHi)
em que todas as outras variáveis são conforme anteriarmente definido; e, seus sais farmaceutioamente aceitáveis.
Os compostos da fórmula (UI) são apresentadas na patente dos Estados Unidos cedida á mesma requerente nK 6,828.327. cuia descrição completa está aqui incorporada por referência.
Um exemplo da invenção incluí um composto de fórmula (III) em que o composto é selecionada a partir do grupo que consiste em:
Composto Nome
6,7,9,10.12,13,15.16<retahídre-23H-5.26:17.22-dirrretenc-5H· dipirido[2,3-fc3\2''<j’]pinolo|'3.4· n][ 1,4,7,10,1 ãjtrioxadiazaaiclohenicosina-23!25(24Hj-diona.
10,11,13,14,16.17.19,20,22,23-decahídro-9,4'24.29- d imeteno-1 H-dipiridn(2, 3-n:3',2‘~t]pííTOlo[3.4-q][1,4.7,10,
13. 22]tetraoxadíazacidotetracosina-1 <3(2H)-diona,
10,11,13.14.16.17.19,20,2.2,23,25,26-dodecahidroG^iZZ.ãZ-dimeteno-IH-dipirido^g^-qrSíZ-^pirrolup.é·· 0|1.4.7,10,13,16;25]penteoxadiazacicloheptacosina1/3('2/d)-diona,
8,7.9,10,12/13 -hexa-hid ro-20H-5,23? 14,19-dlmeteno-5Hdibenzo[h,n]pírrolo[3,4-/()(1,4.7.16]dioxadiazacíclocctadeoína-20,22(21 H)-diona,
8,7,9,10.12,13.15,15-octahidro-23H-5,28? 17<22dlmeteno-5/-á dibenzo(kq]pirraio(3,4”f?][1,4,7,10,1 Sllrioxadíazscidohenei·· oosina-23,26(2.4H)-diona,
10,11,13,14.16.17.19.20.22.23~decahidro-9,4:24,29d imeteno -1 H-díbenzo[r?.r]pirroío(3,4 -qj[1.4.7,10,13,22] tetraoxadiazaciclotetracbsina 1,3(2ff)-diona,
10,11,13,14.16.17/19,20,22.23,25.26-dodecahrdro-
9.4 -.27,32-dimeteno-í M-dibenzoíg. vy]píffotol3.4-/)(1,4.7, 10t13<16.25]pentaoxadiazadcloheptacosina-1,3(2 H)~ drena.
Composto Nome
8 9 12-6101-0-6/7.19/9-5,22:13,18:7,11 -trímetanopif!do[2,3 jjpkroto[3f4~n?K1,9]benzodlazacídoheptadecina-19,21 (20M)-dmna, 12-hídro-6//, 19/05,22:13,18-dímeteno -7,11nítriiopírido[2,3-/]pírrolo(3,4-m](1,9)benzodiazacicloheptadecina-19,21 (2ÔH)~diona,
10 6,7,9,10,12,13-hexa-hidro-20H-5,23:14,19-dimeteno-5Hρίπάορ,Ο-ΑΙρΙσοΙοΡ,4-^4,7. 1,1OJbenzodioxadiazaco doootadecina-20,22(21 Hj-diona,
11 6,7,9,10,12,13,15»16-octahidro-23H-5.26:17.22-dtoeteno5H-pirida(2.3m}pirroíO[3.4-q][4,7,10,1,13]benzot rioxad!azaciçfoheneíeosina-23,25(24H)~dsona.
12 11 -atii-6,7,10,11,12.13,15,16-octahidro-23H-5,26:17,22dirneteno-5H,9H-dibenzo[/c,Q]pinOlo(3,4-??](1.7,4,10,19] dioxatnaza cicloheneiGosjna-23,25(24H)djona,
13 6,7,10,11,12,13,15,16~octahidro-11-metíl-23H-5,26:.17,22dirneteno-5H(9H-dibenzo(k,q]pi{To!o[3,4-nl[1.7.4,10,19] d ioxatnazadoloheneioo$ina-23,25(24/9)-d tona,
14 15 16 17 6.7.10.11.12.13.15.16- octahidro-11-(1 -metHetil)-23H- 5.26:17,22'•dimeteno-5/'f<9H-díb6azo(A',qjpim'>lo(3,4- n][1,7.4,10,19jdfoxatrtazacjcíoheneíúo§ína-23,25(24f9)-dfona, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 -deoahidro-8,11,14-tnmetil- 6H, .23005,26:17f22-dím<4enodibenzofo, ΠρΗτοΙο(3,4 - q][1.4,7,10,13]pentaazaciGtoheneicosina -23,25(24ff)-diona, 8.7.10.11.12.13.15.16- ontahidro-l1 -ΓΠβΙί123Η-5,26-?πθΙθπο - 17,22 - rühilo-5/i 9H-d íbenzo[k,q|pi rrolo[3,4-n][1,7 <4,10,19] dtoxaMazacidoheneícos!na-23,25(24/O-diona, 11 -etT-8,7,10,11,12,13.15<ie-octahidío~23H-5,26-rneteno- 17,224·?ΗΐίΙο-5Η9Η·άίΡ^!ΊΖθ(^ρ)ρίΓτοία[3,4-^|·1,7.4.10,19) dioxatnazaoidoheneíoosína-23,25(2.4H)-dkma,
18 11 -061-6,7,10,11,12,13,15,18-octa.hk1ro-23H-5,26.17,22dimeteno-5H,9/'7dtoindo[2,3-A::3!,2’-q)pirmic43,.4ojj1 ,'7,4,10,19) díOxataaz.acíckfeeneícosína-23,25(.24/0-dfoní^,
19 6,7.9,10,12.13.15.16-ootahidro-23//-5,26:17,22^ímeteno- 5H~dipirido[2!3-/c3’.2!'-q]pírrolo(3[4-nf1,7i4í1G!19] dfoxatiadiazacicloheneicosina-23,25(24H)-diona,
20 7,8,9,10.11,12,13.14.15,16-deoahidro-(6H,23H-5,26:17,22dimetenod ipiddo[2,3-n: 3\2M]p‘rro®3,4-t$1,7,13]tnazacicioheneicosina-23.25(24H)--diona, 11 -eiii-7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-decahidro-6H,23H- 5,26.17,22 -d imoteoodipíddo[2,3 -n^'^'-^pirrolofS^ - q][1,7,13]bíazacíctoheneteDSína-23.25(24Ofi-dtana,
Composto Nome
22 6,7,8,9,10,11,12;13J4,15-decahidro~22H-5:25'.18,21- dirr}fôteno-5.Hdípírido(2:3-m:3!,2Í-s]pirmlof314·· p]( 1,6,12]triazacicloejOOSina-22,24(23N')~diçna,
23 1O-etil-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-decahidro-22H-5,25:16, 21 -dímeteno-SrMipirldop ,3~m.3!,2!-s]pirrolo(3,4-p][1 ,6, 12]triazac icloe ioosina-22,24(23W) -d lona,
2.4 25 7,8.9,15,16,17,18-heptahidro-6H,25H··5,28:19,24-dimeteno-10,14-ηΐ1πΙοόίρίπόο(2(3-ό.3',2’-ό]ρίΓΓθΙο[3.4~ο][ 1,10] dlazadclotriaosioa-25.27 (.26H)-díorra, 7,8,9,10,11,13.14.15.16-nonahidro6H23H-5,26·. 17,22dimetenGdipíndop:,3-b'.3';2''-b]pÍrrolo[3,4~e](1,1Ü]diazuoiclo~ heneico$ina-12.23,25(24A0-tnona,
26 7,8,9 J1,12,13,14 -heptaWdro-6H,21 H-5,24:15.20-dlmetenodípíndD[2,3--b'.3‘,2’-h]pkrolD[3,4-e][1.10]diazacíctonO nadecina-10,21,23(22H)4riona,
27 6.7,8.9.10.. 11.12.13.14,15~deeahidro-7,14-díhidróxi- (7R14R)-22H-5.25:16,21 -dirrfôterm-5b/-dip;rideR,3-ó:3í,2'^pirroloíS^-^íldOld.iazacicIneicosina-i^.JMl^SHI-diona.
28 6,7,9,10,12,13-hexa-hídro-20H-5(23:14,19-dimeteno-5Hdipirido[2,3-h:3,.2M]ptn'olo[3,4~/i][1,4.7416]dioxadiazaciclooota decina - 20 < 22(21 H)-d icna,
29 30 6.7.10.11.12.13.15.16- octehidro-l 1-(2-meiòxiet.íl)-23H'-5.26meieno-iy^S-nítnlo-bH.OH-dibenzo^.í^psrrolo^d/l- 1 <7.4,1Q, 10lrjioxatriazacicioheneicos ina--23,25{24h0· diona, 6.7.10.11.12.13.15.16- octahidfo-11-(2-hidróxletil)-23/-/~ 5,26:17,22-dimaieno-5H,9.Hdibenzo[A-.g]pirrolo(3,4n][ 1,7,4,10,19]dioxa.iriazadcloheneicosina-23,25(24H)d lona, e
31 6.7,9,10,12.13.14,15,16,17-d0cahidro-14-metil-24rb 5,27:18,23··0^ο^Γ^-5Η'··ΟΙΟαηζο[ζήρΐΓΓθΙα[3,4·· o]( 1,4,7,11.20]diaxatriazacidadocosina24,26(25H)-diona.
Um exemplo da invenção incíui put composto de fórmula (H em quo o composto ò selecionada a partir do grupo que consiste em:
Composto 1 Composto 2 Composto 5 ii;
q.^.,nx„,..q 'n
Ó. .0·./ '·-'-<y -·
Composto 6
Outros exemplos da invenção incluem um composto selecionado a partir do grupo que consiste em:
Composto Name
1a A ser fornecido
2a 3-|1-(3-{(2-hidrôxieiií}metilamino]pmpil]-1Hindazol-3-iH'4-[1- (3~piddinil)~1 H-indal-3-OJ-l H-pirrol-2.5-díona:
3A 3,5'diolnrO'hH3 -cloro-4-[ (3,4,12,1 2a-tet.rahidro-1H[LdjtiazinolCA-cKl^jbenzodiazepim-l 1(6H)il)carbonil]fenil] benzamida,
4a 3(1 (2-|·κ6ίόχΙ··οΙίΙ)-1Η-ίπείοΙ-3-ίΙ]·4-(1-piridin-S-il-IH-indol-SiQ-pirrol-Z^-diona,
5a 3··{2··Γϊϊθ10χί··ΐοηίΙ)··4···(1··ρίτίόίτ?··3··ίΙ··1Η··ΙηάοΙ··3··ΙΙ)··ρΐΓΓθΙ-·2:5<1Ιοηα.
6a 6'[(2'([4(2<4-dldorofenil)--5-(4-metil-1H irrHdazol-2-il)-2 pinmidinii]amíno}etiljamina]-3-piridinacarbonitrila(
7a 3- (5-olorc 1 -metíl-1 H -índol-3-ii)-4 [1 -(3 - imidazol-1 -4kpropil)1 H-í ndazol-3-ilJ-p irrol-Z, 5-diona,
8a 3-(S~clarO 1 -metil-l H-indcA3-il)'441 -(3-( 1 > 2,3]triazol-1 -IIprcpíl)-1H-indazol3-ii]-pirral-2:5-diona,
Sa 3--(1 ••(3-mdrôxi-pFopii}-1H-pírroÍD(2í3b}piadin-3-il]-4-(1-metil- IH-pirazol-S-iO-pirrol-Z^-diona..
1t)a A ser fornecido
11a 3-( 1 -(3-hsd róxu3-metii-butil}-1 H-indazol-3-ilp4-( 1 -píndin-S-il1H-indoi-3-íl)-pirrol-2,5-diona,
12a 3-[1 -(2-rüdròxi etíl)-1 H-indaz.ob3~ii]-4-(1 ·-pirímidir--5-il-1Hindel-34l)-pifrol-2,5-dk)na,
13a 3-{1 -(2-hidrôxi-eiil.)-1H -indal-3-ii|-4-(1 -pírimidin-5-íl-1 H-indol- S-iO-pifroi-S.S-diona,
Composto Nome
14a (112)-8,8,10,13,14, 15~hexa-hidro~2,6:17,21-di(msteno) pirrolo[3,4-h](1,15,7]dioxazac!dotricosina-22,24(1 H ,23H)diona,
15a 3-(5-cioro-1 -pi rid i π-3-il· 1 H~i ndol- 341)-4-( 1 -{3-hidróxi-prapít}1 H-iadazoOS-nj-pirnsl·:? ,5-dksna.
16a S-^-matPxbfenl )-4-(1 -(3-rnetóXi-propii)-1 H-pirrclo[3,2c]pindín-3-íl]-pkrol-2,5-diona,
17a 3-(1 -(3-hidròxi-propH)-1 H-indazof-3-HH4 -(tetrahldro-pifaso4-11)-1 Η-}ηάοΙ··3··ίΙ|··ρΐΓΓθΙ·2,5··<ϋοηα,
15a SIS-^-CSdoro-l-metil-IHindol-Silf^^-dioxo-^jS-di-hidro·
1H-pírrol-3-íl]-lndazol-14í}-N-(2-hidròxi-etil)-acetamidat
19a 4-(3~cloro-fenü)-€-(3-dímetHamino-pr0pH)-5>6-di-hidn>-4H2,4,6-'triaza-ddopentafe]flúor1,3-diona.
20a 14-etH-6,7,9,10,13,14,15,16-octahídro-12H,23H-5,26:17, 22dimeteaodibenzo(k ,q]pífTolo(3,4 -n]( 1,4,7,10,19] díôxatriazacícloheneícosina-23,25(24H)-diona,
21a 14-benzil-6,7,9,10,13,14,15, W-ooiahidm-12H,2 3H5,26:17,22-di(meteno)díbenzo(k ,qlpifrolu[3,4-nl[1,4,7, 10,19]d ia xatriazac iciohen icos ina-23,2.5(24H )-dion a,
22a 3-(1-{2-|2'(2-hidróxi-etóxi)-etóxÍ]-etil}-1 H-índol-3~ii}-4-(l -(2hidráxí-eii!)-lH-lndol-3-ii)-pirroÈ-2,5-díona,
23a 6.7,8,9.10.11 ,l2,13-odahidro-8,11 -0χηβ1Η-·5,23.14,19dimeteno-20H-dibenzo(k,q]pírroto(3,4~n](1 <4,7,1 Cjtetraazadcioactadedna -20,22(21 H)-diona,
24a 7,8,9,10,12,13,16,17,18,19-decahidroA 17-dímeul15H ,26H-5,29:20,25 -dimeteno-eH-dibenzojk^pkrotoPAn][1,4,7,10,19}22]dioxateüe-azacicloíetracosina-26,28(27H)·· diona,
25a 14-(2-funlmetiU-6,7,9,10; 13,14,15,16-octahidro-12H.23H5,23:17,22-di(metenô)dibenz0[ktq]pirrolo[3,4-n](1,4,7.10.19] dioxatnaz.aciclohenícosína-23:25(24H)~diona,
26a 14-(2-f}emimetH)-6,?& 10,13,14,15,16-octahdro12H,23H5,26:17,22 ·6Ι(Γηαίαηο)615αηζο(Κ,ρ]ρΐΠΌΐο(3,4 -n j( 1,4.7,10,191 dioxatriazacicÍohenícasína-23,25(24H)-dÍ0na.
27a 14-(1 -aaftilmetíl)-6,7,9,10,13,14.15,16-octahidro-12H.23H5,28:17,22 tai(meteno)dibsaxdík,qjpkrota(3,4 - π][ 1,4.7.10,191 dioxatnazadclohenícosína-23.25(24H)-diona,
28a 14-(piddm-4 -ilmetíD-0,7.9.10.13,14,15,16-oct ahidro-12H,
23H-5,26:17.22-di(Fneteno)dibenzo(k<q]pkroio[3<4-nI1,4, 7,10(19]d!oxatnazaciclohenícosina-23,25(24H)'-d'iona;
Composta Nome
29a 341 42424241 ,2!3:4-tetrah;dro-naftaleno-1-{|aminu)-'8tóxi]etóxi}-etií)-1H4ndoi-3-íi]-4-{142-(1.2.3,4 -teírahidro naftaleno- 1 4lamino)-etíl]-l Hindol-3-il}-pirrol-2,5-diona,
30a 3--(1-(3··όΐΓπβϋΐ3Γηίηο··ί8πΙΙ)··1Η··ίη8οΙ·3-ίΠ-441(2-^Ι8Γ0χί~οϋΙ)- 1 H-indazol-e-ín-pirrol-^.S-diona,
31a 3-(5-oloro-146-dimeiilamina-pindín-3~ll)~ 1 H-índol- 3-41)-4-[1 (2h id ròxi-etil) -1H -4 nd azo I- 3 -il]- pirrol 2,5 d ia na, e
32a metil éster do áddo 545-ciorO3{4-ri -(2-hídròxí-etii)-1 Hindazol· 3-il]-2?S--dioxa-2!5-di-h.ídro--1H-pirrol-343-indol-1-40-niuotlnic<5·. Outros exemplos da invenção incluem um composto
selecionado a partir do grupo que consiste em:
Composto 8a
H
Composto 11a
Composto 9a
Composto 16a
Composto 14o
Composto 17a
H
o. >\ ...o
::::<r .............
q n
.....
Composto 2 Ia
H
Cp ,.tp .,.;O
Composto 24s
Composto 23a
Composto 27a
Composto 25a
Composto 26a
v x; JL ...R ÓH
.............
Composto 23a Composto 29a Composto 3íG
4b
Composto 31a Composto 32a
Células adequadas para tratamento, de acordo com os métodos da
P.^.3®.0.te.ínye.nçãp
As células pluripotentes, adequadas para uso na presente Invenção, expressam pele menos um dentre os marcadores de 5 pluripotêncla a seguir, selecionados do grupo consistindo em: ABCG2, cnpto, FoxD3, Connexin43, Connexín45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTE.RT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4. Tra1-60, e Tra1-81.
Em uma modalidade, as células pluripotentes são célulastronco embrionárias. Em urna modalidade alternativa,. as células W pluripotentes são células que expressam marcadores de pluripotência derivados de células-tronco embrionárias. Em uma modalidade, as célulastronco embrionárias são de ser humano.
Isolamento, expansão e cultura de células-tmnco embrionárias humanas
Caracterização das cé/u/asd.mncu embrionárias dê sar humano· as oéluías-tronco embrionárias de ser humano podem expressar um nu mais dentre os antigenos embrionários de estágio especifico (SSEA) 3 e 4, e os marcadores detectavais com o uso de anticorpos chamados de Tra-1-60 e Tra-1-81 (Thomson et al, Science 282:1145, 1998). A diferenciação de células-tronco embrionárias humanas in vitro resulta na perda de expressão 20 de SSEA-4, Tra- 1-60.. e Tra-1-81 (se presente) e aumenta a expressão de
SSEA-1. As células-tronco embrionárias humanas não diferenciadas têm tipicamente atividade de fosfatase alcalina, a qual pode ser detectada através da fixação das células com 4% de paraformaldeído, e. então, através do desenvolvimento com Vector Red como um substrato, conforme descrito polo 25 fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calif.) As células-tronco plunpotentes não diferenciadas também expressam, tipicamente, Oct-4 e TERT, conforme detectado por meio de RT-PCR,
Outro fenòtipo desejável das células-tronco embrionárias de ser humano propagadas è um potencial para diferenciar nas células de todas as 5 très camadas germinais: tecidos do endoderma, mesoderma, e ectodenaa, A pluripotência de oélulas-tronco embrionárias humanas pode ser confirmada, por exemplo, Injetando-se células em camundongos SCiD, fixando-se as teratomas que se formam com o uso de 4% de paraformaldeído, a, então, examinando-as hístologicamerríe quanto à evidência de tipos celulares 10 provenientes de três camadas genninativas, Altemativamente, a pluripotência pode ser determinada criando-se corpos embroides e avaliando-os quanto ã presença marcadores DE associados às três camadas germinais,
A linhagem cie cèlula-tronco embnonána humana propagada pode ser cariotipada com o uso de uma técnica de bandeamento G padrão e 15 comparada aos nariotípus publicados pelas espécies pnrnatas correspondentes E desejável obter oèluias que tem um canõtipo normal, o que significa que as células são eupíoides, em que todos os cromossomos humanos estão presentes e não são alterados de maneira perceptível.
Fontes das cê/u/as-tronco embóonãnãs de ser hurnano: Os tipos 20 de células-tronco embrionárias humanas que podem ser usadas incluem linhagens estabelecidas de células embrionárias humanas derivadas a partir de tecido formado após a gestação, incluindo tecido pré-embrionário (como, por exemplo, a blastocisto), tecido embrionário, ou tecido fetal obtidos a qualquer momento durante gestação, tipicamente, mas não necessariamente, 25 antes de aproximadamente 10 a 12 semanas de gestação. Alguns exemplos não-limitadores são linhagens estabelecidas de células-tronco embrionárias humanas ou células gerrninat.ivss embrionárias humanas, como as linhagens de célula-tronco embrionária humana H1: H7 e H9 (WÍCeil), ê também contemplado o uso das composições desta descrição durante o 30 estabelecimento inicial ou a estabilização dessas células, caso no qual as células-fonte seriam células pluripotentes primárias coletadas direiamente dos tecídos-fonte. Sao adequadas, também, as células coletadas de uma população de cêlulas-tronco pluripoterdes já cultivadas na ausência de células mantenedoras. São adequadas, também, as linhagens de céiula-tronco embrionária humana mutantes, como BGOIv (BresaGen, Athens, GA, EUA).
Em uma modalidade, as células tronco embrionárias da ser 5 humano são preparadas conforme descrito par Thomson ef a/. (Patente n° U.S. patente n* 5.843.780; Science 282.1145, 1998; Curr. Top Dev. Biol. 38:133 ft., 1998; Proc. Natl Acad. Sci. EUA 92:7844, 1995).
Cufem c/as cb/u'/efa-b’orrua embrionárias de ser humano: Em uma modalidade, as cêlulas-tronco embrionárias humanas são cultivadas ern um 10 cisterna de cultura que é essenolalmente livre de células mantenedoras, mas que, entretanto, suporia a proliferação de cêlulas-tronco embrionárias humanas sem que sejam submetidas a uma diferenciação substancial. O crescimento de cêlulas-tronco embrionárias humanas em uma cultura livre de alimentador sem diferenciação é suportado com o uso de um meio condicionado através da 15 cultura anterior com outro tipo de célula. Ariemativamente, o crescimento de céluías-tmnco embrionárias humanas errs uma cultura livre de alimentador sem a diferenciação é suportado com o uso de um meio quimicamente definido.
Em uma modalidade alternativa, as cêlulas-tronco embrionárias humanas são camadas inicialmente cultivadas de células mantenedoras que 20 suportam as cêlulas-tronco embrionárias humanas de diversas maneiras. As células embrionárias humanas são, então, transferidas a um sistema de cultura que é essencialmente livre de células mantenedoras, mas que, entretanto, suporta a proliferação de cêlulas-tronco embrionárias humanas sem que sejam submetidas à diferenciação substancial.
Exemplos de meio condicionado adequado para uso na presente invenção são apresentados em U820020072117, US6642048, W02005014799, e Xu et a/ (Stem Cells 22: 972 a 980, 2004).
Um exemplo de um meio químicamente definido adequado para uso na presente invenção pode ser encontrado em US20070Q10011.
O meio de cultura adequado pode ser produzido a partir dos seguintes componentes., como o me;o Eagle modificado da Duibecco (DMEM), Glbco nfi 11965-092; meio Eagle modificado Knockout da Dulbecco (KG
DMEM), Gíbca ne 10829-018; meio basal DMEM F12/50% da Ham: 200 mM de L-glutamina, Gibco n* 15039-027: solução de arnlnoáaidus não essenciais, Gibco 11140-050, β-rnercapto etanol, Sigma rf' M7522; fator de crescimento de fibroblasios básico recombinants humano (bFGF), Gibcu n 13258-029.
Em uma modalidade, as células tronco embrionárias humanas são plaqueadas sobra um substrato de cultura adequada que é tratado antes do tratamento de acordo com us métodos da presente invenção. Em uma modalidade, o tratamento é um componente de arranjo extraceíular, como, por exemplo, aqueles derivados a partir da membrana basal cu que podem formar parte de acoplamentos de recepior-ligando de molécula de adesão. Em uma modalidade, o substrato adequado para cultura é Matrigel® (Becton Dickenson). Matrigei® é uma preparação solúvel obtida de células tumorais Engelbreth-Holm-Swarm que forma um gel â temperatura ambiente para formar uma membrana basal reconstituída.
Outros componentes e misturas de componentes de arranjo extracelular são adequados como alternativa. Os mesmas podem incluir lamlnina, fibronectins, proteoglícano. entactina, sulfato de heparina e similares, sozinhos ou em diversas combinações.
As células-trcnco embrionárias humanas são plaqueadas sobre o substrato ern uma distribuição adequada e na presença de um meio que promove sobrevivência, propagação e retenção da célula cam as características desejáveis. Todas essas características se beneficiam da cuidadosa atenção à distribuição da semeadara, e podem ser prontamente determinadas pelo versado na técnica.
isolamento, expansão e cultura de células que expressam marcadores de
Em uma modalidade, as células que expressam marcadores de pluripotência são derivadas de células-tronco embrionárias humanas por um método que compreende as etapas de:
a. Cultivar células-tronco embrionárias humanas.
b. Diferenciar as cèlulas-tronco embrionárias humanas em células que expressam marcadores característicos de células do endoderme definitiva, e
c. Remover as céiuias, e, subsequentemente, cultivá-las sub condições hipóxicas, em um substrato de cultura de tecido que não seja pré-tratado com uma proteína ou uma matriz extracelular anteriormenfe à cultura das células.
Ern uma modalidade, as células que expressam marcadores de pluripotêocia são derivadas de células-tronco embrionárias humanas por 10 um método que compreende as etapas de:
a. Cultivar as cèluias-tronco embrionárias humanas, e
b. Remover as células, a subsequentemente cultivá-las sob condições hipòxicas, em um substrato de cultura de tecido que não seja pré-tratado com uma proteína ou uma matriz extracelular.
Cultura celular sob condições hipòxicas em um substrato para cultura de tecidos que não é pré-tratado com uma proteína nu um arranjo extracelular
Em uma modalidade, as células são cultivadas sob condições hipòxicas em um substrato para cultura do tecidos que não é revestida com um arranjo extracelular por cerca de 1 a cerca de 20 dias. Em uma modalidade 20 alternativa, as células são cultivadas sob condições hipòxicas em um substrato para cultura de tecidos que não é revestido com um arranjo extracelular por cerca de 5 a cerca de 20 dias. Em urna modalidade alternativa, as células sao cultivadas sob condições hipóxícas em um substrato para cultura de tecidos que não é revestido com um arranjo extracelular por cerna de 15 dias.
Em uma modalidade, a condição hipòxica é cerca de 1% de
Os a cerca de 20% de Cb. Επί uma modalidade alternativa, a condição hipóxica é cerca de 2% de O? a cerca de 10% de O2.. Em uma modalidade alternativa, a condição hipòxica é cerca de 3% de Oj.
As células podem ser cultivadas sob condições hipòxicas em 30 um substrato para cultura de tecidos que não é pré-tratado corn uma proteína cu um arranjo extracelular, em um meio que contém soro, atívina·· A a ligando Wnt. Aitematlvamenfe, o maio também pode conter IGF-1.
O meio de cultura pede ter uma concentração de soro na faixa de cerca de 2% a cerca de 5%. Em uma modalidade alternativa, a concentração de soro pode ser de cerca de 2%.
A ativinaA pode ser usada a uma. concentração de cerca de 1 pg/mL a cerca de 100 pg/ml. Em uma modalidade alternativa, a concentração pode ser de cerca de 1 pg/ml a cerca de 1 pg/ml. Ern urna outra modalidade alternativa, a concentração pode ser de cerca de 1 pg/ml a cerna de 100 ng/ml. Em uma outra modalidade alternativa, a concentração pode ser de cerca de 50 ng/ml a cerca de 10ü ng/ml,. Em urna outra 10 modalidade alternativa, a concentração pode ser de cerca de 100 ng/ml.
O ligando de Wnt pode ser selecionado do grupo consistindo em Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a e Wnt-7a. Em uma modalidade, o ligando Wnt é Wnt-1. Em uma modalidade alternativa, o ligando Wnt é Wrte3a.
O ligando Wnr pode ser usado a uma concentração de cerna 15 de 1 ng/ml a cerca de 1000 ng/ml, Em uma modalidade alternativa, c ligando Wnt pode ser usado a uma concentração de cerca de 10 ng/ml. a cerca de 100 ng/ml. Em uma modalidade, a concentração do ligando Writ é de cerna de 20 ng/ml..
O IGF-1 pode ser usado a uma concentração de cerca de 20 1 ng/ml. a cerca de 100 ng/ml. Em uma modalidade alternativa, o IGF-1 pude ser usado a uma concentração de cerca de 10 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, Em uma modalidade, a concentração de IGF-1 é cerca de 50 ng/mL
As células que expressam marcadores de pluripotêncla derivados pelos métodos da presente invenção são capazes de expansão 25 na cultura sob condições hipõxicas, em substrato de cultura de tecido que não seja pré-tratado com uma proteína ou urna matriz extracelular.
As células que expressam marcadores de pteripotência denvados através dos métodos, da presente invenção expressam pelo menos um dentre cs marcadores de pluripetência a seguir selecionados do grupe 30 consistindo em: ABCG2, cripta, FaxD3. Gannexin43, Connexin45, Oct4, SOX2, Nanog, nTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, e Tra1-81.
Diferenciação adicional de células que expressam marcadores çaraeterístinps da linhagem de endoderma definitivo
As células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo podem ser diferenciadas em células que 5 expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma panereático através de qualquer método na técnica.
Por exemplo, as células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo podem ser diferenciados em células que expressam marcadores característicos da linhagem 0 endodérmica pancreática. de acordo com cs métodos apresentados ern D'Amour ef aí, Nature Biotechnology 24, 1392 a 1401 (2006).
Por exemplo, as células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo são adicíonalmente diferenciadas ern células que expressam marcadores característicos da 5 linhagem do endoderma pancreátioc, através do tratamento das células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo com um fator de crescimento de fibroblasto e KAADciclopamina, então, através da remoção do meio que contém o fator de crescimento de fibroblasto e KAAD-osciopamina e. subsequentemente, através da cultura 0 das células em meio que contém ácido retinòíco, um fator de crescimento de fibroblasto e KAAD-ciclopamina. Um exemplo desse método é apresentado em D’ Amour et al, Nature Biotechnology, 24: 1392 a 1401, (2006).
Marcadores característicos da linhagem endodè.rmica panureátioa são selecionados a partir do grupo consistindo em Pdxl: HNF5 Ibeta. PTB la. HNF-6, HB9 e F:‘ROX1. Uma célula que expressa pelo -nenos um dos marcadores característicos da linhagem endodèrmica pancreática é adequada pana uso na presente Invenção. Em um aspecto da presente invenção, urna célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma pancreãtico é uma célula do endoderma pancreático.
de células que expressam marcadores característicos ® linhagem do endodenna paucreátia?
As células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma pancreático podem ser diferenciadas em células 5 que expressam marcadores característicos da linhagem endôcrina pancreàtica através de qualquer método na técnica.
Por exemplo, as células que expressam marcadores característicos da linhagem eadodèrmlca pancreàtica podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da 10 linhagem endôcrina pancreàtica, de acordo com os métodos apresentados em D’Amour ef a/, Nature Biotechnology 24, 1392 a1401 {2006).
Os marcadores característicos da linhagem endôcrina pancreàtica são selecionados a partir do grupo consistindo em: NGN-3, NeuroD, ilhota-1, Pdx-1, NKX6..1, Pa.x-4. Ngn-3 e PTF-1 alfa. Em uma 15 modalidade, uma célula pancreàtica endôcrina é capaz de expressar pelo menos um dentre os seguintes hormônios: insulina, glucagon, somatostetína e polipeptídeo pancreãtico. E adequada ao use na presente invenção uma célula que expressa pelo menos um dos marcadores característicos da linhagem enddchna pancreàtica. Em um aspecto da presente invenção, uma célula que 2D expressa marcadores característicos da linhagem endôcrina pancreàtica é uma célula pancreàtica endôcrina. A célula pancreàtica endôcrina pode ser uma célula pancreàtica que expressa de hormônio. Altemativamente, a célula pancreàtica endôcrina pode ser urna célula pancreàtica secretora de hormônio.
Em um aspecto da presente invenção, a célula pancreàtica 23 endôcrina é uma célula quo expressa marcadores característicos da linhagem de células β. Uma célula que expressa marcadores característicos da β linhagem de célula expressa Pdx1 e pelo menos um dentre os segumtes totems de transcrição: NGN-3, Nkx2.2, NkxS.t NeuroD, lsl-1 < HNF-3 beta, MAFA, Pax4, e Pax6, Ern urn aspecto da presente invenção, uma célula que 30 expressa marcadores característicos da p linhagem de célula é uma β célula.
Petoçç.ãQ.de..çélutes.e)qpres&pra.s..de.marçadores cara ctor ístiuqe da ltnhagern..de.engloderme .definitiva
A formação de células expressaras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitiva poda ser determinada 5 testando-se quanto â presença dos marcadores antes e depois de seguir um determinado protocolo. As céiulas-tronco pluripotentes tipicamente não expressam asses marcadores. Portanto., a diferenciação das células pluripotentes é detectada quando as células começam a expressá-los.
A eficiência da diferenciação pode ser determinada expondo-se 10 uma população de células tratadas a um agente (como um anticorpo) que especifícamente reconhece um marcador de proteína expresso por células que expressam marcadores característicos da linhagem de endodérrna definitiva.
Os métodos para avaliar a expressão de marcadores de proteína e de ácido nucléíco em células cultivadas ou isoladas são padrão 15 na técnica. Estes incluem reação em cadeia de polimerase da transcriptase reversa (RT-PCR) quantitativa, Northern blots, hibrídízação to srfu (consulte, par exemplo. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel ef a/., eds. suplemento de 2001)). e irnunoensaios. como a análise imunoistoquímica de material seccionado. Western blotting, e para marcadores que sãa 20 acessíveis em células intactas, análise de citometrfe de fluxo (FACS) (consulte, por exempla, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York, EUAi Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Exemplos de anticorpos úteis para detectar certos marcadores de proteína estão relacionados na tabela IA. Deve-se notar que anticorpos 25 alternativos dirigidos sos mesmos marcadores que são reconhecidos pelos anticorpos mencionados na tabela IA estão disponíveis, ou podem ser prontamente desenvolvidos. Esses anhoorpos alternativos podem também ser usados para avaliar a expressão de marcadores nas células isoladas de acordo com a presente invenção.
Por exemplo, as características de célulastronco pluripotentes são bem conhecidas das versadas na técnica, e características adicionais de células-tronco pluripotentes continuam a ser identificadas. Os marcadores de oélulas-tronco pluripotentes incluem, por exemplo, a expressão de um ou mais dos seguintes: ABCG2. cnpto, FoxD3: conexina 43, conexina 45, Oot4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42. SSEA-3. SSEA-4, Tral-60, Trai-31.
Apôs o tratamento das células-tronoo pluripotentes com os métodos da presente invenção, as células diferenciadas podem ser purificadas mediante exposição de uma população de células tratadas a um agente (como um anticorpo) que especificamente reconhece um marcador de proteína, como CXCR4, expresso per células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo.
Detenção de células exp?~esççras de maroadures característicos da
Os marcadores característicos da hnhagem endodèrmica pancreàtica são bem conhecidos dos versados na técnica, e marcadores adicionais característicos da linhagem endodérmina pancreáticã continuam 15 a ser identificados.. Esses marcadores podam ser usados para confirmar que as células tratadas de acordo com a presente invenção se diferenciaram para adquirir as propriedades características da linhagem endodêrmica pancreàtica. Os marcadores específicos para linhagem endodèrmica pancreàtica incluem a expressão de um ou mais fatores de 2.0 transcrição, como Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6 e HNF~1beta.
A eficiência da diferenciação pode ser determinada expondo-se uma população de células tratadas a um agente (como um anticorpo) que especificamente reconhece um marcador de pmteína expresso por células que expressam marcadores característicos da linhagem endodèrmica pancreàtica.
Os métodos para avaliar a expressão de marcadores de proteína e de ácido nuciéico em células cultivadas ou isoladas são padrão na tennica. Estes incluem reação em cadeia de pohmera.se da transcriptase reversa (RT-PCR) quantitativa. Northern blots, hibrídização te s.d.u (consulte, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel el a/.,, ads.
suplemento de 2001)), e imunoensaics. como análise irnunoistoqufmica de material seoclonado, Western blotting, e para marcadores que são acessíveis em células intactas, análise d.e citometria de fluxo (FACS) (consulte, por exemplo, Harlow and Lane, Using Antibodies: .A Laboratory Manual New York, E,U,A.: Cold Sprir^g Harbor Laboratory Press (1998)),
Exemplos de anticorpos úteis para detectar certos marcadores de proteína estão relacionados na tabela IA, Deve-se notar que anticorpos 5 alternativos dirigidos aos mesmos marcadores que são reconhecidos pelos anticorpos mencionados na tabela IA estão disponíveis, ou podem ser prontamente desenvolvidos. Esses anticorpos alternativos podem também ser usados para avaliar a expressão de marcadores nas células isoladas de acordo com a presente invenção,
Peteoçãp de céluias expressoras de marcadores característicos da iín.h.ageniendóorma.p
OsS marcadores característicos das células da linhagem endócrina pancreática são bem conhecidos dos versados na técnica, e marcadores adicionais característicos da linhagem endócrina pancreática 5 continuam a ser identificados Esses marcadores podem ser usados para confirmar que as células tratadas de acordo com a presente invenção se diferenciaram para adquirir as propriedades características da linhagem endócrina pancreàtca. Os marcadores específicos para linhagem endócrina panoreátíca incluem a expressão de um ou mais fatores de 0 transcrição, como NGN-3, NeuroD e ilhota-1.
Os marcadores característicos das células da linhagem celular β são bem conhecidos dos versados na técnica, e marcadores adicionais característicos da linhagem celular β continuam a ser identificados, Esses marcadores pedem ser usados para confirmar que as células tratadas de 5 acordo cem a presente invenção foram diferenciadas para adquirir as propriedades características da linhagem de célula β. As características especificas da linhagem de célula β incluem a expressão de um ou mais fatores de transcrição cerno, por exemplo, Pdxl (gene homeobox 1 pancreatine e duodenal). Nkx2,2< ΝΙχβ.Ι, Isl1< Pax6< Pax4, NeuroD, Hnflb, 0 HnfaS, Hrfo3beta, e MafA, entre outros, Esses fatores de transcrição são bem estabelecidos na técnica para identificação de células endócrinas. Consulte, por exemplo, Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)),.
A eficiência da diferenciação pode ser determinada expondo-se uma população de células datadas a um agente (como um anticorpo) que especificamente reconhece um marcador de proteína expresso por células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreátíca.
Altemativamente. a eficiência de diferenciação pode ser determinada expondose uma população de células tratadas a um agente (como um anticorpo) que especificamente reconhece um marcador de proteína expresso pelas células expressaras de marcadores característicos da linhagem celular β.
Os métodos para avaliar a expressão de marcadores de proteína e de ácido nucléico em células cultivadas ou isoladas são padrão na técnica. Estes incluem reação em cadeia de polimerase da transcriptase reversa (RT-PCR) quantitativa. Northern blots, hibridização in situ (consulte, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et a/,, eds. suplementa de 2001)), e imunoensaias. como análise imunolstoquimlca de material secoionado, Western blotting, e para marcadores que são acessívers em células intactas, análise de citometria de fluxo (FACE} (consulte, por exemplo, Harlow and Lane, Using Antibodies; A LaboratoryManual. New York, E.U. A., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Exemplos de anticorpos úteis para detectar certos marcadores de proteína estão relacionados na tabela IA, Deve-se notar que anticorpos alternativos dirigidos aos mesmos marcadores que são reconhecidos pelos anticorpos mencionados na tabela IA estão disponíveis, ou podem ser prontemente desenvolvidos, Esses anticorpos alternativos podem também ser usados para avaliar a expressão de marcadores nas células isoladas de acorde com a presente invenção.
A presente invenção é Ilustrada com mais detalhes pelos exemplas a seguir, porém não é limitada pelos mesmos.
Exemfito-T·
Cultura de Cêluía-tronao Embrionária Hunnana
As células-tronco são células não diferenciadas definidas por sua capacidade, em nível unicelular, tanto para autorrenovação como para diferenciação a fim de produzir células prugènis, inclusive progeniteras autonenováveis, progenitoras não-renovéveis e células terminalmente diferenciadas. As céluías-tronco são também caracterizadas por sua capacidade de se diferenciar, rn wfro, em células funcionais de várias linhagens celulares de múltiplas camadas germinativas (endoderms. mesodemia e 5 ectoderma), bem cerno per sua capacidade de originar, após transplante, tecidos de múltiplas camadas germinativas e de contribuir substancialmente para a maioria, senão todos, dos tecidos após a injeção em blastocistos.
As linhagens H1, H7 e H9 de célulastronco embrionárias humanas foram obtidas junto ao WiCeil Research Institute, Inc., (Madison, Wl, 10 EUA) e cultivadas de acordo com as instruções fornecidas pelo instituto de origem. Em suma, as células foram cultivadas sobre células nutrizes de fibroblasto embriônico de camundongo (MEE, ou “ribrobíasto embrionário de camundongo) em um rneio de células ES que consiste em DMEM/F12 (Invitrogen/GtBCO) suplementada com 20% de substituto de soro knockout, 15 100 nM de MEM com aminoàcidcs não essenciais, 0,5 mM de bela-mercapto etanol e 2. mM de L-glutamína cons 4 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básico humano (bFGF) (todos disponíveis junto à Invitrogen/GIBCO). As células MEF, derivadas de embriões de r^mundongo de E13 a 13,5, foram obtidas junto à Charles River. .As células MEF foram 20 expandidas em meio DM EM suplementado com 10% de SFfô (Hyclone), 2 mM de glutamine e 100 mM de MEM com aminoácidos não essenciais.. As culturas de célula MEF sub-confluentes foram tratadas com 10 pg/mL de mitemicina C (Sigma, St. Louis, MO, EUA) durante 3 horas para Interromper a divisão celular, sendo então tripsinizadas e aplicadas a 2x104/om2 sobre 25 placas revestidas com 0,1% da gelatina bovina. As células MEF da passagem dois ate quatro foram usadas como camadas mantenedoras. As célulastronco embrionárias humanas aplicadas sobre as camadas nuirizes de células MEF foram cultivadas a 37ÇC em uma atmosfera de 00^/ a 5%, dentro de uma incubadora umidificada para cultura de tecidos. Quando continentes 30 (aproximadamente 5 a 7 dias apôs a aplicação), as células-tronco embrionárias humanas foram tratadas com 1 mg/mL de coiagenase tipo IV (Invitrogen/GIBCO) durante 5 a 10 minutos e, então, delicadarnente raspadas da superfície earn o use uma pipeía de 5 mL. As células foram giradas a 900 rpm durante 5 minutos, e o pélete foi ressuspenso e re-apllcado a uma razão de 1:3 a 1.4 entre as células ao meio de cultura sem uso prévio.
Em paralelo, céluías-lronco embrionárias humanas H1, H7, e
H9 também foram semeadas em placas revestidas com uma diluição da 1:30 de MATRIGEL™ com reduzido de fator de crescimento (BD Blosciences) e cultivadas em meio condicionado por MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF. As células submetidas à cultura MATRÍGEL™ foram passadas de modo rotineiro cam enzima oolagenase IV 10 (Inviüogen/GIBCO), Dispose (BD Blosciences) eu Líberase (-Source).
Algumas das culturas de células tronco embrionárias de ser humano foram incubadas sob condições hípúxicas (aproximadamente 3% da Q2).
E.xemp.lp.2
Derivação e cultura de células que expressam marcadores de pluripotêncsa que são derivados de células-troncq embrionárias de ser humano
As células provenientes das linhagens de célula-ironcc embrionária humana H1 e H9 de diversas passagens (passagem 30 a 54) foram cultivadas sob condições hípúxicas (aproximadamente 3% de O;<) per pelo menos três passagens. As células foram cultivadas em MEF-CM 20 suplementado com 8 ng/ml.. de bFGF·' e plaqueadas em placas revestidas por MATRIGEL, de acordo com o exemplo 1.
As células foram, então, tratadas com um meio DMEM/F12 suplementado com 0,5% de FBS, 20 ng/mL de WNT-3s (n* de catálogo 1324-WN-0Q2, R&D Systems. MN), e 100 ng/ml.. de aflvina A (R&D
2.5 Systems, MN) durante dois dias seguido do tratamento com um meio DMEM/F12 suplementado earn 2% de FBS e 100 ng/mL de ativina A (AA) durante 3 a 4 dias adicionais Esse protocolo resultou em uma regulação ascendente significativa dos marcadores do endodorma definitivo.
As células foram, então, tratadas corn a solução TrypLEw
Express (invitrogen, GA, EUA) durante 5 minutos. As células liberadas foram ressuspensas em meio DMEM F12 + 2% de FBS, recuperadas por oentnfugação, e contadas com o uso de um hemocitõmetro. As células liberadas foram semeadas a 1000 a 10.000 céluias/cm* ern frascos tratados corn poliestireno de cultura de tecido (TCPS), e foram cultivadas em DMEMF12 * 2% de FBS * 100 ng/ml de atMna-A * 20 ng/ml de WNT-3A sob condições hipóxicas (aproximadamente 3% de O?) a 37 X em uma 5 Incubadora de cultura de tecido padrão. Os frascos de TCPS não eram revestidos cem M.ATRIGEL ou outras proteínas de matriz extracelular. O meio foi trocado diariamente. Em algumas culturas, c male foi adicionalmente suplementado com 10 a 50 ng/ml de IGF-I (fator de crescimento-! de insulina disponível junto à RXD Systems, MN) ou IX ITS (insulina, transfemna e 10 selênio disponível junto à Invitrogen, Ca, EUA). Em algumas das condições de cultura, o meio basal (DM-F12 * 2% de FBS) foi adicionalmente suplantado com 0,1 mM de mercaptoeteno? (hiviirogen, CA,. EUA) e aminoácidos nao essenciais (IX, NEAA disponível junto à Invitrogen, CA, EUA).
Após 5 a 15 dias de cultura, diferentes colônias celulares 15 apareceram circundadas por um grande número de células aumentadas que pareciam estar em senescêncía. Ear aproximadamente 50 a 60% de confluência, as culturas foram submetidas a passagens mersante a exposição á solução TrypLE™ Express durante 5 mir-utos à temperatura ambiente. As células liberadas foram ressuspeasas ern mein de DMEM-F12 * 2% de FBS, 20 recuperadas através de centrifogação e semeadas a 10.000 células/cnri em frascos tratadas corn poliestireno de cultura de tecido (TCPS) em DMEM F12 + 2% de FBS * 100 ng/ml de afivina-A r .20 ng/ml.. de WNT-3A -r/~ 50 ng/mL de IGF L Esse meie será chamado adicionalmente de meio de crescimento! Exempl©3
Derivação do células que exptessam marcadores de pluriputência a partir de uma única suspensão de células de células tronco embrionárias de ser humano
As células provenientes da linhagens de célula-tronco embrionária humana H1 P33 s H9 P45 foram cultivadas sob condições hipóxicas (aproximadamente 3% de O2) por pelo menos três passagens. As 30 células foram cultivadas em MEF-CM suplementado com 8 ng/ml de bFGF e plaqueadas em placas revestidas por MATRIGEL, de acorde com o exemplo 1. A aproximadamente 60% de confluência, as culturas foram expostas á solução
TrypLE™ Express (Invitrogerp GA, EUA) por 5 minutos. As células liberadas forarn ressuspensas em meio DMEMF12 * 2% de FIBS, recuperadas per centrifugate, e contadas com o uso de um hemocitõmetrc, As células liberadas foram semeadas a 1000 a 10.000 oéluiss/cm^ em frascos datados com poliestireno de cultura de tecido (TOPS), e foram cultivadas em DM-F12 *
2% de FBS + 100 ng/mL de ativlna A r- 20 ng/ml de WNT-3A * 50 ng/rnl da
IGF-I -i 0.1 mM de mercapto etanol (Invitmgen. CA, EUA), e aminoácidos não essenciais (IX. NEAA da Invitrcgen, CA, EUA) sob condições hipôxicas (aproximadamente 3% de Cy) a 37 'Ό em uma incubadora de cultura de tecido 10 padrão. Os frascas de TOPS nâo eram revestidos com MATRIGEL ou outras proteínas de matriz extracelular. O meio foi trocado diariamente. As células da primeira passagem são chamadas de PI.
Exemplo 4
Vános metes de crescimento úteis para a expansão de células que expressani marçadpres de plurípctênçía derivados das células-tronco embrionárias de ser humano
As células que expressam marcadores de plurípotênda derivados das células-tronco embrionárias de ser humano foram corretamente submetidas à cultura nas composições de meios a seguir 20 durante pelo menos 2 a 3D passagens:
1. DM-F12 + 235 de FBS * 100 ng/mL de AA ·* 20 ng/mL de
WNT-3A
2. DM-F12 * 2% de FBS * .1.00. ng/ml AA «· 20 ng/ml WNT-3A -r 50 ng/mílGF-l
2.5 3, ÜM-F12 * 2% de FBS * 100 ng/ml. AA * 20 ng/ml WNT--3A f 10 ng/ml.. IGF-I
4. DM-F12 * 2% de FBS + 50 ng/ml AA + 20 ng/ml WNT-3A + 50 ng/ml. IGF-í
5. DM-F12 * .2% de FBS * 50 ng/ml. AA ·> 10 ng/ml WNT-3A + 50 ng/ml IGF-I
6.. DM-F12 < 2% de FBS r 50 ng/ml. AA * 20 ng/ml WNT-3A
-í 10 ng/ml IGF-I
7. D.M-F12 + 2% de F8S - 100 ng/mL AA * 10 ng/ml WNT-3A + 10 ng/mL IQF-I:
8. Meio definida par HESaGRQ (Chemican, CA, EUA)
O componente basal dos meios listados acima pode ser substituído por meios similares como, RPMI, DMEM, CRML, Knockout mDMEM, ό F12.
Exempla 4 £Mos.des.jnibidones da atividade erudmàtica de GSK-3 β com relação à viabilidade de células que expressão? marcadores de pluripotõncia
A derivação e a manutenção de células que expressam marcadores de pluripoténcia foram conduzidas conforme descrito no exemplo 2. A células foram cultivadas em DMEM:F12 suplementado com 2% de FCS (Invítrogen). 100 ng/ml. de ativina A; 20 ng/ml. de Wnt-3a5 e 50 ng/ml de IGF(RW Biosystems). As células foram semeadas com uma densidade de 10.000 céiuias/cryri em frascos de poliestireno do tipo Falcon, e foram cultivadas em uma cultura de camada única a 37*C: com 5% de COÍ; e pouco oxigênio. Apds atingirem 60 a 70% de confluência, as células foram passadas mediante a lavagem da camada única com P8S, e mediante a incubação com TrypLE (Invitrogen) durante 3 a 5 minutes para permitir o desprendimento e a dispersar) de uma úmca célula.
A tnagem foi conduzida cam u usa de compostas de teste de uma biblioteca proprietária de pequenas moléculas selecionadas por sua habilidade de inibir a atividade da enzima GSK-3B. Os compostos desta biblioteca taram disponibilizados corno estoques de 1 mM, em formato de uma 25 placa de 96 cavidades em 50 mM de HEPES. 30% de DMSO. No ensaio, as células que expressam marcadores de pluripoténcia foram lavadas., contadas, e piaqueadas em um melo de cultura normal corn uma densidade de semeamento de 20.000 células por cavidade em placas de cavidade escura, com fundo límpido de 96 cavidades (Gostar). A densidade de semeamento foi 30 anteriormente determinada para render uma formação de camada única ótima em uma cultura de um dia para o outro. Nu dh seguinte, o meia de cultura foi removido, as camadas únicas de célula foram enxaguadas três vezes com
PBS, a os compostos de teste foram adicionados ás cavidades em alíquotas de 80 pL, cada um foi diluído em um meio de ensaio com uma concentração de ensaio finai de 1(,1 ρΜ, No dia 2 do ensaio, o meio foi removido de cada cavidade e substituído por uma alíquota sem uso prévio dos compostos de 5 teste diluídos no meio de ensaio. O meio de ensaio nos dias 1 e 2 de cultivo consistiram de DMEM:F12 suplementado com Q,5% de PCS e 100 ng/mL de ativina A. Nos dias de cultura 3 e 4, o meio fui removido de nada cavidade e substituído por DMEMF12 suplementado com 2% de PCS e 100 ng/ml. de ativina A (sem o composto de teste). No dia de ensaio 4, 15 pl, de MTS 0 (Promega) foram adicionados a cada cavidade e as placas foram incubadas a 3'FC durante 1,5 a 4 heras antes da leitura de densidade óptica a 490 n,m em um instrumento SpectraMax (Molecular Devices). As mediçóes estatísticas que consistem em um desvio padrão e em um coeficiente de variação médias foram calculadas para cada conjunto duplicado. A toxicidade foi calculada 5 para cada cavidade de teste em relação a um controle positivo (cavidades tratadas com ativina A e Wnt3a nos dias de cultura 1 a 2),
A tabela II é uma compilação de todos os resultados de tnagem. As células que expressam marcadores de pluripotência foram plaqueadas iniciaimenfe como uma camada única oonfluente nesse ensaio; I) portanto, os resultados são representativos de uma toxicidade medida em relação ao período de cultura do quarto dia.. Os resultados são expressos como uma viabilidade percentual de controle, o demonstram uma toxicidade variável para alguns compostos na concentração de triagem de 10 μΜ usada. Uma proporção maior dos compostos tem uma toxicidade 5 mínima ou não mensurável nesse ensaio com base em célula,
Um painel pequeno de compostos selecionados foi testado com repetição em relação a uma faixa de titulação de dose estreita, novamente com o uso de células que expressam marcadores de pluripotência em um ensaia similar conforme descrito acima, A tabela III é 0 um resumo desses resultados, demonstrando efeitos de titulação de dose variável para uma faixa de compostos tóxicos e não tóxicos.
Exen^plg 5
Efeitos dos inibidores da atividade enzímática de GSK-3 β com relação à dsferenrnação e proliferação de céluiastronco embrionárias de ser humano determinados com o uap de unieasaio de triagem de alto conteúdo ú A manutenção das células-tronco embrionárias de ser humano
Unha H9) foi conduzida conforme descrito no exemplo 1. As colônias de células foram mantidas em um estado píuripoteate não diferenciado com a passagem em uma media de todos os quatro dias, A passagem foi realizada mediante cí exposição das culturas de célula a uma solução da 10 colagenase (1 mg/ml; Sigma-Aidrich) por 10 a 30 minutas a 37X seguido de raspagern suave com a ponta de uma plpeta para recuperar os aglomerados celulares. Permitiu-se que os aglomerados sedimentassem pela gravidade, seguido de lavagem para remover a colagenase residual. Os agrupamentos celulares foram divididos com uma razão de 1:3 para a 15 manutenção de rotina da cultura, ou com uma razão de 1:1 para o ensaio intermediário. As linhagens de células tronco embrionárias de ser humano usadas foram mantidas com números de passagem menores que a passagem 50. e foram avaliadas rotineiramente quanto ao fenõtipo cariotipíco normal e quanto à ausência de contaminação de micoplasma.
Os aglomerados celulares usados no ensaio foram ressuspensos uniformemente em um meio de cultura normal e foram plaqueados sobre placas do tipo Packard VIEWPLATES (FterklnElmer) com 96 cavidades revestidas com MATRIGEL em volumes de 100 pl /cavidade. O meio condicionado MEE suplementado com 8 ng/mL de bFGF foi usado 25 em um plaqueamento e recuperação iniciais. A alimentação diária foi conduzida por aspiração o meio de cultura gasto de cada cavidade s pela substituição por um volume igual de meio fresco. As placas foram mantidas a 37‘C\ 5% de CO;> em uma caixa umidificada por toda a duração do ensaio.
A triagem foi conduzida com o uso de compostos de teste de uma biblioteca proprietária de pequenas moléculas selecionadas por sua habilidade de inibir a atividade da enzima GSK-3B. Os compostos desta biblioteca foram disponibilizados como estoques de 1 m-M< em formato de uma placa de 96 cavidades em 50 mM de HEPES. 30% da DMSO. Os compostos de triagem foram testados em canjuntos triplicados ou duplicados. Ensaios de triagem primaries foram iniciados per se asprrar o meio de cultura de cada uma das cavidades seguida de três lavagens em
PBS para remover fatores de crescimento e soro residuais. Os volumes de teste da 80 a 100 pl por cavidade foram adicionados de volta contenda um meio de base DMEM.F12 (Invitrcgen) suplementado cam 0,5% de FCS (HyClane) e 100 ng/ml de ativina A (R&D Bicsystems) mais 10 pM dc composto de teste. As cavidades de contrate positivo contenham o mesmo meio de base, com a substituição de 10-20 ng/ml, de Wnt3 a (R&D Biosystems) nu composto de teste. As cavidades de controle negativo continham um meia de base com 0,5% de FCS e ativina A sozinha (AA apenas) uu, alternativamente, 0,5% de FCS sem ativina A cu Wnt3 a (sem tratamento). As cavidades foram .aspiradas e alimentadas novamente com soluções idênticas no dia 2 de ensaio. Nos dias 3 e 4, todas as cavidades de ensaio foram aspiradas e convertidas em DMEMF12 suplementada com 2% de FCS e 100 ng/ml, de ativina A (sem o composto de teste ou WntSa); as cavidades de controle negativo paralelas foram mantidas em um meio de base DMEM-.F12 com 2% de FCS e ativina A (AA apenas) ou, 20 alternativamente, 2% de FCS sem a ativina A (sem tratamento).
Ao final do cultivo, as células nas placas de 80 cavidades foram fixadas com 4% de parafurmaídeidu â temperatura ambiente durante 20 minutas, foram lavadas três vezes com PBS, e, então, foram penneabilizadas cum 0,5% de Triton X-100 durante 20 minutos à temperatura 25 ambiente. .Alternativamente. as células furam fixadas com 70% etanul gelado de um dia para e outra a -20%), foram lavadas três vezes com PBS. e, então, foram permeabilizadas com Triton X-100 durante 5 minutos a 4;C. .Após a fixação e a permeabiiteação, as células foram lavadas nuvamente ires vezes com PBS, e então, furam bloqueadas com 4% de soro de gahnha (Invilrogen) 30 em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos primários (cabra anti-humano Sox17 e cabra anti-humano HNF-3beía; R&D Systems) foram diluídos 1:100 em 4% de saro de galinha, e foram adicionados às células durante uma hora à temperatura ambiente O anticorpo secundário conjugado cum Alexa Fluor 488 (anti-cabra IgG da gahnha: Molecular Probas) foi diluído com uma razão de T.200 em PBS e adicionado apôs a lavagem das células por trés vezes com PBS. Para a oontracoloração dos núcleos, d mM 5 de Draq5 (Alexis Biocheruicais) foram adicionadas por cinco minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas uma vez com PBS e foram deixadas em 100 mLfcavidade de PBS para a formação de imagens.
As células foram submetidas à formação de imagem com o uso de um IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) utilizando o dlcróico 510Q8bs 10 nas células manchadas com Üraq5 e Alexa Fluor 488. Os períodos de tempo de exposição foram otimizados com o uso de cavidades de controle positiva, e cavidades secunda rias apenas para os controles negativos não tratados. Doze campos por cavidade foram obtidos para compensar qualquer perda celular durante as procedimentos de tratamento e de coloração. Os números 15 de célula totais e a intensidade total de célula para o Sox-17 e o HNF-Sbeta foram medidos com o use do software IN Cell Developer Toolbox 1.6 (GE Healthcare), A segmentação para os núcleos foi determinada com base era níveis em escala de cinza (faixa de linha da base da 100 a 300) e no tamanho nuclear. Desvios médios e padrões foram calculados para as 20 réplicas. A expressão de proteína foi relatada como a intensidade total ou intensidade integrada, definida como fluorescência total da célula vezes a área da célula.. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação de faixas de escala de cinza entre 300 a 3000 a fatores de forma maiores que ou iguais a 0:4. Os dados der intensidade total foram normalizados pela 25 divisão das intensidados totais para cada cavidade pela intensidade total média para o controla positivo de Wntãa.rétivína A. Os dados normalizados foram calculados quanta desvio médio e padrão de cada conjunto replicado.
A. tabela IV é um resumo representativo de todos as resultados de triagem. A tabela V è uma liste de ciclos dessa triagem. Ciclos vigorosos 30 são definidos como maiores ou iguais a 120% dos valores de controle; ciclos moderados são definidos corno incluídos no intervalo de 60 a 120% dos valores de controle, inúmeros compostos significativas induzem juntos uma
Mi resposta proliferativa nesse ensaio. Em paralelo, Inúmeros compostos significativas induzem a diferenciação nesse ensaio, conforme medido pela expressão de proteína dos fatores de transcrição Sox17 e Hnf-3b.
Exemplo 6
Efeitos dos Inibidores da atividade enzimática de GSK-3 β quanto à proliferação de.cély|aSt.ronco embrionárias de ser humano determinados com o uso de um ensaio de leitura de placa
A manutenção das células-tronoo embrionárias de ser humano (linhas Ηθ ou H1) foi conduzida conforme descrito no exemplei. As colônias de células foram mantidas em um estado pluripotente não diferenciado com a passagem em uma média de todos os quatro dias. A passagem foi realizada mediante a exposição das culturas de célula a uma solução de colagenase (1 mg/mL; Sigma-Aldrich) por 10 a 30 minutos a 37'C seguido de raspagem suave cem a ponta de uma pipeta para recuperar cs aglomerados celulares. Permitiu-se que os aglomerados fossem sedimentados e lavados para a remoção de colagenase residual. Os aglomeradas celulares foram divididos com uma razão de 1:3 com relação à área da camada única para a cultura de rotina, ou com uma razão de 1 · 1 para um ensaia intermediário. As linhagens de célula-tfonco embrionária de ser humano para esses exemplos foram mantidas com números de passagem menores que 50 e foram avaliadas rotineiramente quanto ao fenótipo cariotipico normal bem como quanta à ausência de contaminação de mícoplasma.
Os aglomerados celulares usados nesse ensaio foram ressuspensos uniformemente em um meio de cultura normal, e foram plaqueados em placas do tipo Packard ViEWPLATES (PerkmElmer) com 96 cavidades revestidas com MATR.IGI:: I.. ern volumes de 100 μι. /cavidade. O meio condicionado MEF suplementado cum 8 ngfmL de bFGF) foi usado em um plaqueamenta e recuperação iniciais. A alimentação diária foi conduzida por aspiração o meio do cultura gasta de nada cavidade e pela substituição por um volume igual de meio fresco. As placas foram mantidas a 37”C em uma caixa umídifícada, 5% de CO2 por toda a duração do ensaio..
Ensaios da triagem primários foram iniciados por se aspirar o me<o de oulrura de cada uma das cavidades seguido de três lavagens em PBS para remover fatores de crescimento e soro residuais. Qs volumes de teste de 80 a. 1D0 pt. por cavidade foram adicionados de volta contendo um meio de base DMEMF12 (Invitrogen) suplementado cem 0,5% de FGS (HyClone) e 100 ng/mL de ativina A (R&D Biosystems) a 10 pM do composto de teste.. As cavidades de controle positivo continham o mesmo meio com a substituição de 10 a 20 ng/mL de VVntSa (R&D Biosystems). As cavidades de controle negativo continham um melo de base com 0,5% de FCS sem aiivina A ou Wnt3a. Os compostos de triagem foram testados em triplicate. As cavidades foram aspiradas o alimentadas novamente com soluções idênticas no dia 2 do ensaio. Nos dias 3 e 4, todas as cavidades de ensaio foram aspiradas e convertidas em 0MEM:F12 suplementado com 2% de FCS e 180 ng/mL de ativírra A com a exceção das cavidades de controle negativo que foram mantidas em um meio de base ÜMEM:F 12 com 2% de FCS.
No dia 4 deí ensaio, de 15 a 2D pL de MTS (Pmmega) foram adicionados a cada cavidade e as placas foram incubadas a 3'ΓΌ durante
1,5 a 4 horas. As leituras densitométncas em OD49D foram determinadas com o uso de um leitor de placa espeotrofotômetro da Molecular Devices. .As leituras médias para conjuntos replicados foram calculadas junto com um desvio padrão e um coeficiente de variação As cavidades experimentais foram comparadas com o controle positivo de ativina A/Wnt3a para calcular um valor de controle percentual como uma medida de proliferação.
A tabela VI é um resumo representativo de todos os resultados de triagem. A tabela VII é urna lista de ciclos dessa triagem. Ciclos vigorosos sao definidos como maiores ou iguais a 12.0% dos valores de controle; ciclos moderados são definidos como Incluídos no intervalo de 60 a 120% dos valores de controle. Inúmeros compostos significativos induzem juntos uma resposta proliferative nesse ensaio.
Exempto 7
Efeitos dps intbjdpres da enzima GSK-3 β na diferenciação e proliferação do células -tronco embrionárias de ser humano; Titulação de dose dos compostos, .lideres
Foi importante a confirmação da atividade de sidos identificada a partir da triagem primária e a análise adicional da faixa de atividade por titulação de dose.. Novas amostras de urn subconjunto seletivo de ciclos de triagem primária furam obtidas cerno pós secos, foram solubilizadas para produzir reagentes de estuque sem uso prévio, e 10 diluídas em ensaios de confirmação secundários para avaliar os efeitos nas cèlulas-tronco embrionárias de ser humano.
A cultura de duas células-tronco embrionárias de ser humano (H1 e H9) foi conduzida conforme descrito no exempla 1. As colônias de células foram mantidas em um estado pluripatente indiferenciado ern urn 15 plástico de poliestireno revestido com Matrlgeln’ (ínvitrogen), com o uso de uma diluição de 1:30 de Matrigel™ em DMEM;F12 para revestir a superfície. As células foram divididas por passagem eazímática em todos os quatro dias em média. A passagem foi realizada mediante a exposição das camadas únicas de célula a urna solução de colagermse (1 mg/mL; Sigma-,Aldrich) par 20 10 a. 60 minutos a 37'C seguido de uma raspagem suave com a ponta do uma pipeta para recuperar os aglomerados celulares. Os aglomerados foram deixados sedimentar por gravidade, e então foram lavados para a remoção da colagenase residual. Os aglomeradas celulares foram divididos coar uma razão de 1:3 para a manutenção da cultura cu com urna razão de 1:1 para 25 um ensaio subsequente As linhagens de células tronco embrionárias de ser humano foram mantidas corn números de passagem menores que a passagem 50, e foram avaliadas rotinelramante quanto ao fenótipc cariotípico normal e quanta à ausência de contaminação de micoplasma.
Preparação das cé/a/as para o errsa/α: Os aglomerados 30 celulares das linhagens de células tronca embrionárias de ser humano H1 ou H9 usados no ensaio foram ressuspensos uniformemente no meio de cultura e foram plaqueadas sabre placas do tipo Packard VIEWPLATES τα (PeddnElmer) com 96 cavidades revestidas com Matrigel™ Em volumes de 100 μΐ/cavidade. Meio condicionado MEF suplementado oom 8 ng/ml bFGF foi usado para o plaqueamento inicial e expansão. A alimentação diária foi conduzida por aspiração o meio de cultura gasto de cada . 5 cavidade e peta substituição por um volume igual de meio fresco. Permitiuse que as culturas expandissem de um a três dias após o plaquearnento anterior à iniciação do ensaio. As placas foram mantidas a 37ftC< 5% de CO2 em uma caixa umidiftcada durante a duração do ensaio.
Preparação rfe campastes e da me/o de ensaio: Um subconjunto 10 de ciclos que resultam da triagem primária foi usada rm estuda de acompanhamento e em ensaios secundários subsequentes. Vinte compostos riisponivms como pês secos foram solubilizados como estoques de 16 mM em DMSO e foram armazenadas ressecados a —20aC até o uso. Imediatamente antes do ensaio, os estoeues de corrrposto foram diluídos 1:1000 para produzir 15 10 pM do composto de teste em um creio de base DMEbT.F'12 (Invitrogen) suplementado com 0,5% de PCS (HyCíone) e 100 ng/ml. de ativina A (R&D Biosysfems). Eles foram adicionalmente diluídos duas vezes em séne para produzir uma curva de diluição do sete pontos para cada composto, também em um meio de base DMEM:F12 corn 0.5% de PCS e 100 ng/mL de ativina A.
Ensafo de friagem seou.np'arfo: O ensaio foi iniciado mediante a aspiração do meio de cultura das camadas únicas de célula em cada cavidade seguido de três lavagens em PBS para a remoção de fatores de crescimento residuais cr som. Os volumes de teste de 100 pl. por cavidade foram adicionados der volta contendo um meio com 0.5% de FCS e diferentes 25 concentrações de compostos inibidores com 100 ng/mb der ativina A, sem Wrri3a. As cavidades de controle positivo continham 0 mesmo meio de base com 0,5% de FCS e com 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Biosystems) na ausência do composto de teste.. As cavidades de controle negativo continham o mesmo meio base com 0,5% de PCS, na ausência da ativina A, Wnt3a. ou composto 30 de teste. Cavidades der ensaie foram aspiradas e alimentadas novamente com concentrações idênticas der composto de teste ou soluções de controle no dia 2 do ensaio, Nos dias 3 e 4, todas as cavidades do ensaio foram aspiradas e alimentadas com DP1EM.F12 suplementada cam 2% de FCS e 100 ng/ml de ativina A na ausência de ambos o composto de teste ou Wnt3a. Cavidades de controle negativo paralelas foram mantidas nas dias 3 e 4 em meio DMEM:F12 com 2% de FQS,
Ava/fação de ensa/o: No fim na cultura, as células em placas de cavidades foram lavadas duas vezes com PBS, e então, foram fixadas som 4% de paraformaldefdo à temperatura ambiente durante 20 minutos, foram lavadas mais três vezes corn PBS, e, então., foram permeabHizadas com 0,3% de Triton X-100 durante 20 minutos á temperatura ambiente. Após 10 a fixação e a permeabilização, as células foram lavadas novamsnte três vezes cam PBS; e então, furam bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen) em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente. Qs anticorpos primários (cabra anti-humano SoxTr: R&D Systems) foram diluídos com uma razão de 1.Ί00 em 4% de soro de galinha e foram adicionados ás células 15 durante uma hora à temperatura ambiente.. Urn anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (anti-cabra IgG da galinha; Molecular Probes) fcl diluído 1:260 em PBS e adicionado a cada cavidade após a lavagem das células por três vezes com PBS. A cuntracoluraçãu dos núcleos, 2 pg/ml Hoechst 3334.2 (ínvitrogen) fui adicionada por dez minutos à temperatura 20 ambiente. As células foram lavadas uma vez com PBS e foram deixadas em 1Q0 pL/cavidade de PBS para a formação de imagem.
As células foram imageadas som o uso de um IN Gall Analyzer 1000 (GE Healthcare) utilizando o dlcróico 51008bs para células manchadas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os períodos de tempo de exposição 2S foram otimizados com o uso das cavidades de controle positivo e das cavidades manchadas com um anticorpo secundário sozinho como um contrate negativo não tratado. As imagens de 15 campos por cavidade foram adquiridas para compensar qualquer perda celular durante o tratamento e os procedimentos de coloração. As mediçêes para o número de célula total e 30 para a intensidade de Sox-17 total foram obtidos para cada cavidade com o uso de um software IN Cali Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare), A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis em escala de cinza (faixa da linha de base de 100 a 300) e no tamanho nuclear. Desvios médias e padrões foram calculados para cada conjunto de dado replicado. A expressão total da proteína Sox17 fui relatada corne a intensidade total ou intensidade integrada, definida cerno a fluorescência total da célula vezes a .. 5 area da célula. O fundo foi eliminado corn base no critério de aceitação de faixas de escala de cinza entre 300 a 3000 e fatures de forma maiores que ou iguais a 0,4. Os dados de intensidade total foram normalizadas pela divisão das intensídades totais para cada cavidade pela intensidade total média para o controle positivo de Wnt3a/ativina A, Dados normalizados foram calculados 10 para desvios padrões e médios para cada conjunto replicado.
Resultados
Os resultados são mostradas para oito inibidores de enzimas GSK-3B onde a atividade foi confirmada e a potência foi determinada pela titulação nesse ensaio secundário. Os dados apresentados mostram os efeitos 15 do composto sobre a intensidade do número de célula e de Sox17, onde a média dos respectivos pontos de dados foi calculada a pedir de um conjunto duplicado, e onde os dados foram explorados para nada parâmetro de campus e cavidades idênticas. Nesse exemplo, a expressão de Soxl7 é indicativa da diferenciação do enduderma definitivo. Qs resultados da intensidade do número 20 de célula e de Suxl 7, respectivamente, oom o uso da estirpe de células tranco embrionárias de ser humano H1 são mostrados nas tabelas VIII e IX. Os resultados quanto à estirpe de nélulas-tmnco embrionárias de ser humano H0 são mostrados nas tabelas X e XI. Os valores de controle positivo foram normalizados para l.fXXI quanta ao número de célula e quanto à intensidade de 25 Sr>x17. Os vaiares de controle negativo foram menores que ü,388 para o número de célula e menores que 0,065 para a intensidade de Sox.17 com ambas as estirpes celulares. Urna descrição gráfica desses dados, em comparação com ambas as estirpes de células-tronco embrionárias de ser humano a induindo uma titulação de dose de cada composto é fornecida nas 30 figuras de 1 a 8. O número de célula é apresentado nu painel A: a intensidade de Sox 17 é mostrada no painel B. Esses dados confirmam que cada composto pode promover uma proliferação celular hES e uma diferenciação da endoderma definitivo, e identificar uma faixa ótima de atividade.
Exempla 8
Efeitos das inibidores da enzima GSK-3 g sobre a expressão de marcadores adicionais associados ao endoderms definitivo
Foi importante demonstrar que os compostas Uderes também poderíam induzir outros marcadores indicativos da diferenciação de endoderma definitivo, em adição ao fator de transcrição Sox17. Um subconjunto selecionado de ciclos fai testado quanto á sua capacidade de promover a expressão de CXCR4, de urna proteína receptora de superfície, de HNF-3 beta, e de um fator de transcrição que também esta associado à diferenciação do endoderma definitiva.
Preparação cfe cé/ufes para ensa/o: Qs aglomerados celulares da estirpe da células-tronco embrionárias H1 usados no ensaio foram ressuspensas uniformemente na melo de cultura e plsqueadas sobre placas de 6 cavidades (diluição de 1:30) revestidas com MATRIGELrM (Corning) em volumes de 2 mt/cavidade. Meio condicionada MEF suplementado com ó ng/ml bFGF foi usado para o plaqueamenta iniciai e expansão. A alimentação diária foi conduzida por aspiração o meie de cultura gasto de cada cavidade e pela substituição por um volume igual de meio fresco. Permitiu-se que as culturas expandissem de um a três dias após o plaqueamento anterior à iniciação do ensaio. As placas foram mantidas a 37*0, 6% de CO2 pela duração do ensaio.
Pmparação de compostos a meio de eosarè: Um subconjunto de sete delas que resulta da triagem primária foi usado no estudo de acompanhamento e nos ensaios secundários subsequentes. Compostos puras foram solubilizados como estoques de 10 mM em DMSO e armazenadas ressecadas a -SOX até o uso. ímediatamente antes do ensaio, os estoques de composto foram diluídos para uma concentração final na faixa de entre 1 pM e 5 μΜ em um meio de base DMEM:F12 (Invitrogen) suplementado com 0.5% de PCS (HyClone) e 100 ng/mL de ativina A (R&D Bíosystems).
Ensaio: O ensaio foi iniciado mediante a aspiração do meio de cultura das camadas únicas de célula em cada cavidade seguido de três lavagens em PBS para a remoção dos fatores de crescimento residuais e do soro. Os volumes de teste de 2 mL por cavidade foram adicionados der . 5 volta contendo um meio com 0,5% de FCS, e diferentes concentrações dos compostos inibidores com 100 ng/ml de ativina A, sem Wnt3a, Cavidades de controle positivo continham o mesmo meio de base e 0,5% de FCS com 100 ng/ml de ativirTa A e 20 ng/rnl de Wnt3a (R&D Ecosystems) na ausência do composto de teste. .As cavidades de controle negativo continham o me;o 10 base corn 0;5% de FCS. na ausência de ativina A, Wnt3a, ou composto de teste. Cavidades de ensaio foram aspiradas e alimentadas novamenie com concentrações idênticas de composta de teste ou soluções de contrate no dia 2 do ensaia. Nos dias 3 e 4. todas as cavidades do ensaio foram aspiradas e alimentadas com DMEM.F12 suplementado com 2% de FCS e 15 100 ng/ml de ativina A na ausência de ambos o composto de teste ou
Wnt3a. Cavidades de controle negativo paralelas foram mantidas nas dias 3 a 4 em meio DMEM:F 12 com 2% de FCS.
Ava&fÇêo do ensaio: No final da cultura, as camadas únicas de célula furam lavadas cam PBS e colhidas a partir das placas de cultura 20 mediante a incubação de 5 minutos com a solução TrypLE™ Express (Invitrogen, CA, EUA). As células foram rassuspensas em um meio condicionado MEF e divididas eni duas amestras iguais. Um conjunto de amostras foi adiclonalmente manchado corn vários anticorpos fluorescentes, e foi submetido à análise do fluxo citoméfrico (FACS). Um 25 segundo conjunto paralelo de amostras fui submetida á PCR quantitativa.
As células para a análise de FACS foram lavadas em P8S e bloqueadas durar4e 15 minutas a 4:>C em 0, 1.25% de garnaglobulina de ser humana (Sigma cat n<: G-4386). diluída em PBS e ern tampão de coloração de BD FACS. Alíquotas das células (aproximadamente 10' células cada) foram 30 manchadas durante 30 minutos a 4yC com anticorpos diretamente conjugadas a uma etiqueta fluorescente e que têm uma especificidade de CD9 PE (BD n* 555372), CD99 PE (Caltag n* MHCD9904), ou CXCR-4 APC (R&D Systems cat ne FABT73A). Apôs uma série de lavagens em um tampão de coloração de BD FACS, as células foram manchadas com 7 AAD (BD# 559925) para avaliar a viabilidade, e foram analisadas cum um instrumento do tipo BD FACS Array (BD Biosciences), coletando pelo menos 15 000 eventos. Qs , 5 anticorpos de controle do isotipico camundongu IgGqk para ambos PE e APC foram usados para delimitar células positivas percentuais.
As células para PCR quantitativa foram processadas para a extração de RNA, purificação, e síntese de cDNA. As amostras de RNA foram purificadas ao ligar a uma membrana de gel de silica (Mini Kit 10 Rneasy, Qiagen, CA, EUA) na presença de um tempão contendo etanol, alta concentração salina seguido de lavagem para remover os contaminantes. O RNA fui adicionalrnenfe purificado com a use de um kit do tipo TURBO DNA'free kit (Ambion, Inn), e o RNA de alta qualidade foi, então, eluido em água. O rendimento e a pureza foram avaliados através 15 das lehuras A260 e A280 em um espectrofotômefro. As cópias de cDNA foram feitas a partir de RNA purificado com o uso de um kit de arquivo cDNA de alta capacidade da Applied Biosystems, Inc.. (ABI, CA, EUA).
Exceto onde especificado em contrário, todos os reagentes para amplificação e quantitação de PCR em tempo real foram adquiridos junto à 20 ABI. As reações de PCR em tempo real foram executadas com o uso do Sistema de Detecção de Sequência ABI PRISM 7900. TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX (ABI, CA, EUA) foi usado com 20 ng de RNA transcrito revemoem um volume de reação total de 20 pL. Cada amostra de cDNA foi analisada em duplicata para correção quanta a erras de pipetagem. 25 Iniciadares e pontas de prova identificadas com FAM TAQMAN foram usadas a concentrações de 200 nM. O nível de expressão para cada gene alvo foi normalizado corn o uso de corhroie endógeno de gliceraldeída-3-fosfatos desidrogenase (GAPDH) humano previamente desenvolvido por ABL Os conjuntos de inídadares e de sondas estão listados da seguinte forma: 30 CXCR4 (Hs00237G52), GAPDH (43 W884E), HNF3P (Hs002.327S4), SOX17 (parte da sona n:1 450925, parte de avanço e de retomo n“ 4304971),
Apôs Lima incubação inicial a 50'C por 2 min. seguida de 95Ί2 por 10 min, as amostras foram submetidas a ciclos 40 vezes em dois estágios, uma etapa de desnaturaçãa a 95X por 15 segundos seguida de uma etapa de recozlmento/extensão a 6CTC durante 1 minuto. A análise de dados foi executada com o uso do software do sistema de detecção de sequência GENEAMP 7000. Para cada conjunto de iníciador/ponía de prova, um valor Ct foi determinado como o número de ciclo no qual a intensidade de fluorescência alcançou um valor específico no meia da região exponencial de amplificação. Os níveis de expressão genética relativos foram calculados com o uso do método Ct comparativo. Brevemente, para cada amostra de cDNA, o valor de Ct do controle endògeno foi subtraído do gene de interesse Ct para render o valor delta Ct (ACt), A quantidade normalizada de alvo foí calculada como 2-ACt presumindo que a amplificação fosse 100% de eficiência. Os dados tinais foram expressos em relação a uma amostra de caíibração, Resultados
A figura 9 exibe a análise de FACS do percentual de células positivas que expressam um receptor de superfície CXCR4 após o tratamento com várias inibidores de GSK3. Duas concentrações da cada composto, na faixa de entre 1 pM e 5 pM, são mostradas em relação a uma população nãotratada de células (controle negativo) ou células tratadas com afivina A e Wnt3 (controle positivo). Qs painéis da figura W:, a} h, e c, mostram dados de PCR em tempo real para CXCR4, Sox17, e HNF3beta. que também sãu considerados como sendo marcadores do enduderma definitivo. As análises tanto de FACS quanto de POR em tempo real demonstram um aumento significativo em cada um desses marcadores observados em células diferenciadas em relação às células de controle nao-tratadas. Os níveis de expressão desses mareadores de andoderma definitivo foram equivalentes em alguns casos com relação ao controle positivo, demonstrando que um inibidor de GSK3 pude substituir o Wnt3a nesse estágio de diferenciação.
fernpto.O
Efeted.os..inbídc.re.s..da enzima GSK-3 β na formação do endoderma pancreMço
Foi importante demonstrar que o tratamento com os inibidores de GSK3 β durante a indução do endoderma definitivo nâo evitou a diferenciação subsequente de outros tipos de célula, cornu o endoderma panoreático, por exemplo. Um subconjunto selecionado de; ciclos foi testado quanto à sus capacidade de promover a expressão de PDX1 e HNF6, fatores de transcrição chave associados ae endoderma panareàtico.
A manutenção das células-tronco embrionárias de ser humano (estirpes H9 ou H1) foi conduzida conforme descrito no exemplai. As colônias de células foram mantidas em um estado pluripotent® não diferenciado com a passagem em uma média de todos os quatro dias. A passagem foi realizada mediante a exposição das culturas de célula a uma solução de culagenase (1 mg/ml.; Sigma-Aldrich) por 10 a 30 minutos a 37CC seguido de raspagem suave com a ponta de uma pipeta para recuperar os aglomerados celulares. Permitiu-se que os aglomerados sedimentassem peta gravidade, seguido de lavagem para remover a colagenase residual. Os agrupamentos celulares foram divididos com uma razão de 1:3 para a manutenção de rotina da cultura, ou com uma razão de 1:1 para o ensaia subsequente. As estirpes de células-tronco embrionárias de ser humano usadas foram mantidas com numeres de passagem menores que a passagem 50: o foram avaliadas rotineiramente quanto ao fenótipo cariotípico normal e quanto â ausência de contaminação de mlcoplasma.
Preparação ce/u/ar do ensa/o: Os aglomerados celulares da estirpe de células-ironco embrionárias da ser humano H1 usados no ensaio foram ressuspensos unifomnemente no meio de cultura; e furam plaqueadcs sobre placas de 24 cavidades (diluição de 1:30) revestidos corn MATRIGEL™ (cavidade negra: Arctic White) em volumes de 1 mi./cavidade. Melo condicionado MET suplementado com 8 ng/rnl bFGF foi usado para o plaqueamento inicial e expansão. Em um segundo experimente, us aglomerados das células hES da estirpe H9 foram plaqueados em placas de cavidades sobro camadas (MEF) mantenedoras embrionárias de camundongo, aníeriorrnente inativadas mediante o tratamento ccm mitomicina C (Sigma Chemical Cu). O mela de cultura para as células hES nas camadas únicas ME.F consistiu em DM EM: F12 com 20% de Knockout Serum Replacer 5 (Invítrogen) suplementado cum um mínimo de aminoácidos essenciais (Invítrogen), L-glutamína, e 2-mercapto etancl A alimentação diária foi conduzida por aspiração o meio de cultura gasto de cada cavidade e pela substituição por em volume igual de melo fresco. Permitiu -se que as culturas expandissem de um a três dias apòs o plaqueamento anterior à iniciação do 10 ensaio. As placas foram mantidas a 37’0, 5% de GO? pela duração do ensaio.
Preparação da compostos e db meto de ensafo: Um subconjunto de oito ciclos resultante da triagem pnmárla for usado no estudo de acompanhamento e nos ensaios secundárias subsequentes. Compostos puras foram solubiílzados como estoques da 10 mM em DMSO 15 e armazenados ressecadas a ™20°G até o uso. Imediatamente antes do ensaio, os estoques de composto foram diluídos ate uma concentração final na faixa da entre 1 pM e 5 pM em um meio de base com aditivas.
Ensaxx Nesse ensaia, us inibidores de GSK3 foram incluídos apenas nos dias 1 e 2 da etapa de diferenciação do endoderma definitivo, 20 substituídos pelo Wnt3a. As culturas de célula-tronco embrionária em MATRIGELW foram iniciadas conforme descrito nos Exemplos 7 e 8 acima mediante a aspiração do meio de cultura a partir das camadas únicas de célula em cada cavidade seguido de três lavagens em PBS para ramover os fatures de crescimento residuais e u soro. Para a diferenciação do endoderma '25 definitivo, os volumes de teste (0,5 ml. por cavidade para placas de 24 cavidades, 100 pL per cavidade para placas de 96 cavidades) foram adicionados contendo um meio DMEM:F12 com) 0,5% de FCS e diferentes concentrações dos compostas inibidores corn 100 ng/ml. de ativina A, sem Wnt.3a. As cavidades de controle positivo continham o mesmo meio de base 30 com 0,591 da FCS e com 100 ng/ml de ativina A e 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) na ausência do composto de teste. As cavidades de controle negativo continham o mesmo meio base com 3,5% de FCS, na ausência de ativina A, Wnt3a: ou composto de festo. Cavidades des ensaia foram aspiradas e alimentadas novamente com concentrações idênticas de composto de teste ou soluções de controle no dia 2 do ensaio. Nos dias 3 e 4, todas as cavidades do ensaio foram aspiradas e alimentadas com DMEM.F12 suplementado com . 5 2% de FOS e 100 ng/ml de ativína A na ausência de ambos o composto de teste ou Wnt3a. Cavidades de controle negativo paralelas foram mantidas nos dias 3 e 4 em meio DMEM:F12 com 2% de FCS. Para a diferenciação de endoderrna pancreático, as células foram tratadas por três dias, alimentando diariamente com meio base DMEMF12 contendo 2% de FCS com 0.25 μΜ 10 KAAD cidopamína (EMD Biosciences) e 20 ng/ml de FGF7 (R&D Btasysterns).
.As células foram, então, tratadas durante quatro dias adicionais, corrí urna alimentação diária com DMEM.F12 contendo 1% de B27 (fnvitrogen), 0,25 pM KAAD de cicíopamina, 2 pM de ácido ratinóico (RA; Sigma-Aldrich) e 20 ng/mL de FGF7. As cavidades de controle negativo paralelas foram mantidas 15 integralmente em um meso base DMEM:F12 com 2% de FCS (estagio 2) ou 1% de B27 (estagio 3) e sem quaisquer outros aditivos.
As culturas paralelas das células embrionárias de ser humano H9 foram cultivadas em camadas mantenedoras MEF, e foram diferenciadas do endoderma pancreático. A diferenciação do endoderma definitivo foi alcançada 20 mediante e cultivo das células em um melo que consiste em RPMM640 (Invitrogen) que não contêm soro no dia 1 e 0,2% de FCS nos dias 2e3 junta com diferentes concentrações de compostos Inibidores e 100 ng/mL de ativina A. As cavidades de controle positivo continham o mesmo meta de base (com ou sem soro) com 100 ng/mL de ativina A e 20 ng/mL de VVnt3a (R&D 25 Biosystems) na ausência do composto de teste. As cavidades de controle negativo continham o mesmo meio de base cem ou sem soro, na ausência de ativina A.. Wnt3a, ou do compesto de teste. Cavidades de ensaio foram aspiradas e alimentadas novamente com concentrações idênticas de composto de teste ou soluções de controle no dia 2 do ensaio. No dia 3, todas as 3D cavidades de ensaio foram aspiradas e alimentadas com RPMI-164D suplementado corn 2% de FCS e 1Q0 ng/mL de ativina A na ausência tanta da composto de teste quanto de Wnt3a. As cavidades de controle negativo paralelas furam mantidas nu dia 3 em um meio de base RPMÍ-1840 com 2% de FGS, As células foram diferenciadas no endoderrna pancreático mediante o tratamento das células durante quatro dias, corrí uma alimentação diária com um main de base RPMI-1840 contendo 2% de FCS com 0,25 mM da KAAD ciciopamina (EMD Biusctences) a 50 ng/rnL de FGF10 (R&D Biosystems), Subsequentemente, as células foram tratadas com uma duração de três dias, com alimentação diária com RPMI-1640 contendo 1% de 827 (Invitrogen), 0,25 mM de KAAD uícíopamíaa, 2 mM de ácido retinóioo (RA; Sígma- Aldrich) e 50 ng/ml de FGF10. As cavidades de controle negativo paralelas foram mantidas integralmente em um meto de bass RPMI-1640 com 2% de FCS (estágio 2) ou 1 % de 827 (estágio 3) e sem quaisquer outros aditivos.
AveZ/sção du emsafo; No final da diferenciação, as células foram examinadas conforme descrito no exemplo 8 quanto à expressão gênios por PCR em tempo real. Para a coloração de fluorescência de alto teor, as células nas placas de 95 cavidades foram lavadas duas vezes com PBS, então fixas com 4% de parafermaldeídu á temperatura ambiente por 20 minutos., lavadas mais três vezes com PBS, e, então, permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 por 2G minutos à temperature ambiente. Após a fixação e a permeabüízação. as células foram lavadas novarnente trés vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen) em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente O anticorpo primário (cabra antihumano Pdx1; Santa Cruz) fol diluído 1:100 em 4% de soro de galinha e foi adicionado às células durante duas horas à temperatura ambiente. Um anticorpo secundário conjugado Alexa Flunr 488 (anti -cabra IgG da galinha; Molecular Probes) foi diluído 1:200 em PBS e adicionado a cada cavidade após a lavagem das células por três vezes com PBS. A contracoíoração dos núcleos, 2 pg/mi Hoechst 33342 (Invitrogen) fui adicionada por dez minutos á temperatura ambiente. As células foram lavadas una vez com PBS e foram deixadas em 100 pl/cavidade de PBS para a formação de imagem.
As células foram imageadas cum o uso de um IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) utilizando o dlcróico 51G08bs para células manchadas com Huechst 33342 e Alexa Floor 488. Oss tempos de exposição foram otimizados com o uso de cavidades de controle positivo e cavidades manchadas com anticorpo secundário apenas. .As imagens de 15 campos por cavidade foram adquiridas para compensar qualquer perda celular durante o tratamento e os procedimentos de coloração. Medições quanto ao β 5 número total de células e á intensidade de Pdx1 fatal furam obtidos para cada cavidade com o uso do sofiwate IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare}. A segmentação para os núcleos foi determinada com base ern níveis em escala de cinza (faixa, de linha de base de 100 a 300) e no tamanho nuclear. Desvios médios e padrões foram calculados para cada 10 conjunto de dado replicado. A expressão total da proteína Pdxl toi relatada como a intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula vezes a área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas da escala de cinza entre 300 a 3000. Os dados de intensidade total foram normalizados pela divisão das 15 íntensidades totais para cada envidada pela intensidade total média para o controle positivo da Wnt3a/ativina A. Dadas normalizados foram calculados para desvios padrões e médios para cada conjunto replicado.
As células para PCR quantitativo foram hsadas em tampão RLT (Qiagen) e. então. processadas para a extração de RNA, purificação, e 20 síntese da cDNA. As amostras de RNA foram purificadas ao ligar a urna membrana da gel de silica (Mini Kit Rneasy. Qiagen, GA, EUA) na presença de um tampão contendo etanol. alta concentração salina seguido de lavagem para remover os contaminantes. O RNA foi adicionalmente purificado num o use de urn TURBO DNA-free kit (Ambion, Inc.), e o RNA de alia qualidade foi, 25 então, eluído em água, O rendimento e a pureza foram avaliados através das leituras A260 e A280 em um espectrofotômetro.. As cópias de cDNA foram feitas a partir de RNA purificada com o uso de um kit de arquivo cDNA de alta capacidade da Applied Biosystems, Inc (ΆΙ3Ι, CA, EUA).
Exceto onde especificado em contrário, todos os reagentes 30 para amplificação e quantitação de PCR ern tempo real foram adquiridos junto à ABI. As reações de POR em tempo real foram executadas com o uso do Sistema de Detecção de Sequência. ABI PRISM 7900. TAQMAN
UNIVERSAL PCR MASTER MIX foi usado corn 20 ng de RNA transcrito reverso em um volume de reação total de 20 μΙ... Cada amostra de cDNA foi analisada em duplicata para correção quanto a erros de pipetagem. Iniciadores e pontas de prova identificadas com FAM TAGMAN foram . 5 usadas a concentrações de 200 πΜ. O nivel de expressão para cada gene alvo foi normalizado com o uso de controle endcgeno de gliceraldeldo-3·· fosfatos desidrogenase (GAPDR) humano previamente desenvolvido por ABL Conjuntos de iniciador e de sonda estão listados da seguinte maneira: PDX1 (Hs00236830...mi), GAPDH (4310884E), e HNF6 (HSÔ0413554jm1).
Após uma incubação inicial a 50*C durante 2 minutos seguido de 95TD durante 10 minutos, as amostras foram submetidas a 40 ciclos em dois estágios, uma etapa de desnaturação a 95:'C durante 15 segundos seguido de urna etapa de recozimento/extensão a 60C durante 1 minuto. A análise dos dados foi executada com u uso do software GENEAMP07OOO - 15 Sequence Detection System. Para cada conjunto de iniciadorfpcnta de prova, um valor Ot foi determinado como o número de ciclo no qual a intensidade de fluorescência alcançou um valor especifico no meio da região exponencial de amplificação. Os níveis de expressão genética relativos foram calculados com o uso do método Ct comparativo. Brevemente, para cada amostra de cDNA. o valor da Ct do controle endógeno foi subtraído do gene de interesse Ct para render o valor delia Ct (ACt). A quantidade normalizada de alvo foi calculada como 2 ACt, presumindo que a amplificação fosse 10033 de eficiência. Os dados finais foram expressos em relação a uma amostra de caiibração.
Os resultados são mostrados para oito inibidores de enzimas
GSK-33. Os dados apresentados na figura 11 a partir de uma analise de teor elevado mostram os efeitos sobre o número de célula (painel A) e a intensidade de Pdx1 (painel B) para a estirpe H1 de célula hES, ern que foi calculada uma média para os pontos de dados respectivos a partir de urn conjunto de amestras duplicadas e exploradas com relação a cada parâmetro de cavidades e campos idênticos. Os dados apresentados na figura 12 a partir da PCR. em tempo mal mostram os efedos desses inibidores de pequenas moléculas em uma expressão induzida des dais fatores da transcrição, Pdxl e HNF6, Nesses exemplas, a expressão de Pdxl e HNF6 è indicativa da diferenciação do endodenma pancreático, Os compostos inibidores de Θ8Κ3β nesses ensaios podem substituir o Wnt3a . 5 durante os estágios iniciais do comprometimento com uma linhagem celular;
as células resultantes sustentam uma capacidade para former u endoderrna panoreático durante cs estágios sequenciais posteriores de diferenciação. Exemplo 10
Efeitps dos iabidores da enzipia, θ3Κ~3β na formação das células de
9 endoderrna pancreáticq
Fui importante demonstrar que o tratamento num os inibidores de GSK3 durante a indução do endoderrna definitivo não evitou a diferenciação subsequente de outras tipos de célula, como as células pancreátícas endocrinas, ou as células de produção de insulina, por 15 exempla. Um subconjunto selecionado de ciclos foi testado quanto â sua capacidade de promover a expressão de harmonics pancreátícos.
Preparação da cè/y/a para o ensafor As células do endoderrna panareátioo obtidas de acordo com os métodos descritos no exemplo 9 (cultivadas em placas da 96 cavidades e placas de 24 cavidades) foram 20 subsequentemente submetidas aos agentes que fazem com que as células sejam diferenciadasem células de expressão de hormônio pancreático.
O ensaio para a cultura da estirpe de células tronco embrionárias de ser humano H1 em MATRIGEL™ foi iniciada conforme descrito nus exemplos de 7 a 9 acima mediante a aspiração do meia de 25 cultura a partir das camadas únicas de célula em cada cavidade seguido de três lavagens em PBS para a remoção dos fatures de crescimento residuais e soro. Para a diferenciação da endoderrna definitivo, os volumes de teste (0,5 mL. por cavidade para placas de 24 cavidades, 100 pl por cavidade para placas de 96 cavidades) foram adicionadas contendo um 30 meio com 0,5% de FCS e diferentes concentrações das compostos inibidores com 100 ng/ml, de ativina .A, sem Wnt3a. Cavidades de auntrole positivo continham o mesmu mela de base e 0,5% de FCS com 100 ng/ml de ativina A e 2.0 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) na ausência do composto de teste. As cavidades de controla negativo continham o mesmo meio base com 0,5% de FCS, na ausência de ativina A, Wnt3a, ou composto de teste. Cavidades de ensaio foram aspiradas e alimentadas novanrente oom concentrações idênticas de composto de teste ou soluções de controle no dia 2 do ensaie. Nos dies 3, 4, e 5, todas as cavidades de ensaie foram aspiradas e alimentadas com DMEM:F:12 suplementado com 2% de FCS e 1 CM) ng/ml de ativina A na ausência de ambos o compost© de teste ou Wnt3a. As cavidades de controle negativo paralelas foram 10 mantidas nos dias 3, 4, e 5 em meio base de DMEM;F12 com 2% de FCS.
Para a diferenciação de endoderma pancreático, as células foram tratadas por três dias, alimentando diariamente corn meio base DMEM:F12 contendo 2% de FCS com 0,25 pM KAAD cíclopamina (EM D Binsoienoes) e 20 ng/ml de FGF7 (R&D Biusystems). As células foram tratadas 15 subsequentemente durante quatro dias, earn uma alimentação diária com
DMEM.F12 contendo 1% de B27 (Invitrogen), 0,25 pM de KAAD çiclopamina, 2. pM de ácido retinóico (RA; Sigma-Aldrich) e 20 ng/mL de FGF7. As cavidades de controle negativo paralelas foram mantidas integralmente em um meio base DMEM:F12 durante o 2 e 3 estágios com 20 2% de FCS ou 1% de B27, e sem quaisquer outros aditivos. Após a formaçáo do endoderma pancreático, as células foram tratadas adiciunalmente par uma duração de seis dias, com uma alimentação diária com um meio de base de ÜMEM:F12 contendo 1% de B27 com 1 pM de DART (inibidor de gama-secretase: EMD Bioscíences) e 50 ng/mL de 25 Exendine 4 (Sigma-Aldrich). As células foram, então, tratadas corrí uma duração de outros três dias, com uma alimentação diária com o maio de base DMEM:F12 contendo 1% de B27, 50 ng/mL de Exendlna 4, 50 ng/mL da IGF (R&D Biosystems) e 50 ng/ml de HGF (R&D Binsystems). Cavidades de controle negativo paralelas foram mantidas integralmente em 30 meio base DMEM:F12 corn 1% de B27 e sem nenhum outro aditiva.
Avaliação da ensaio. Ao final do cultivo, as células furam tratadas nemo nos exemplos 7 e 8 acima para a avaliação par análise de teor elevada ou PCR em tempo real,
Para a coloração de fluorescência de alto tear, as células nas placas de 96 cavidades foram lavadas duas vezes com PBS, então fixas com
4% de paraformaldeído à temperatura ambiente por 20 minutos, lavadas mais três vezes com PF3S. e, então, perrneabilizadas com 0,5% de Triton X-100 por minutos à temperatura ambiente. Após a fixação e .a permeabilização, as células furam lavadas novamente três vezes com PBS e foram bloqueadas 10 com 4% de soro de galinha (invitrogem em PSS durante 30 minutos à temperatura ambiente. Q anticorpo primária (antiinsulína shine de cobaia, com reatividade cruzada à insulina de ser humano: DakoGytomation) foi diluído 1.500 ern 4% de soro do cabra a foi adicionado ás células durante uma hora à temperatura ambiente, As células foram lavadas três vezes corn PBS e, 15 então, foram manchadas com um anticorpo secundário conjugado com Alexa
Fluor 488 (cabra anti-cobaia IgG; Molecular Probes) diluído 1:100 em 4% de soro de cabra, A contracoioração dos núdeos, 2 pg/ml .Hoechst 33342 (invitrogen) foi adicionada par dez minutos á temperatura ambiente. As células foram lavadas urna vez corn .PBS e foram deixadas em 20 100 pucavldade de PBS para a formação de imagem.
As células foram imageadas com α uso de um IN Cell Analyzer
1000 (GE Healthcare) utilizando o dicróico 51QQ8bs para células manchadas cam Hoechst 33342 e Alexa fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados com o uso de cavidades de controle positiva e cavidades 25 manchadas com anticorpo secundária apenas. As imagens de 15 campos per cavidade foram adquiridas para compensar qualquer perda celular durante o tratamento e os procedimentos de coloração. As medições para o número de célula total e a intensidade de insulina total foram obtidos para cada cavidade com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1,7 (GE 30 Healthcare). A segmentação para as núcleos foi determinada oom base em níveis em escala de cinza (faixa de linha de base de 100 a 300) e na tamanho nuclear. Desvios médios e padrões foram calculados para cada r: conjunto de dado replicado. A expressão de proteína de insulina total fol relatada como a intensidade total ou intensidade integrada, definida como fluorescência intel da célula, vezes a area da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação <&$ faixas de escala de cinza entre 300 a . 5 3000. Os dados de intensidade total foram normalizadas pela divisão das intensidades totais para cada cavidade pela intensidade total média para o controle positiva de Wnt3a/ativina A. Os dados normalizados foram calculadas para desvios médios e padrões para cada conjunta triplicado.
As células para PGR quantitativo foram Usadas em tarnpãu RLT 10 (Qiagen) e. então, processadas para a extração de RNA, purificação, e síntese de cDNA. .As amostras de RNA foram purificadas ac ligar a urna membrana de gel de silica (Mini Kit Rrvaasy, Qiagen, CA, EUA) na presença de um tampão contendo etanol. alta concentração salina seguido de lavagem para remover os contaminantes. O RNA foi adicionalmsnia purificado com o usu de um kit do 15 tipo TURBO D.NA free kit (Ambion, ING), e o RNA de alta qualidade foi, então, eluidu em água. O rendimento e a pureza foram avaliados através das leituras A260 e A280 em um espectrototõmetro. As copias de cDNA furam fedas a partir de RNA purificado com o uso de um kit de arquivo cDNA de ali.a capacidade da Applied Biosystems, Inc. (ABI. CA, EGA).
Exceto onda especificada em contrário, todos os reagentes para amplificação e quantitação de PCR em tempo real foram adquiridos junto à ABI. As reações da PCR em tempo real foram realizadas usando-se o sistema da detecção de sequências ABI PRISM® 7901) Sequence Detection System. A mistura TAQMAN® UNIVERSAL PQR MASTER MIX® 25 (ABL GA, EUA) foi usada com 20 ng de transcrito reverso do RNA em urn volume total de reação de 20 pl. Cada amostra de cDNA foi analisada am duplicara para correção quanto a erros de pipetagem. Os iniciadores e as sondas TAQMAN® identificadas come FAM foram usadas a concentrações de 200 nM. O nivel de expressão para cada gene alvo foi normalizado cum o uso de controle endógeno de glíeeraldeído-3-fosfatos desidrugenase (GAPDH) humano previamente desenvolvido por ABI. Os conjuntos de r
8/ iniciadcr e sonda estão listados da seguinte forms: PDX1 (Hs()0236830 ml), insulina (Hs-00355773), e GAPDH (43W34E).
Após uma incubação inicial a 50*0 durante 2 minutos seguido de 95:Ό durante 10 minutes., as amestras foram submetidas as 40 ciclos em dois 5 estágios, uma etapa de desnaturaçao a 95*C durante 15 segundos seguido de uma etapa de recozirnento/extensão a 60‘C durante 1 minuto. A análise dos dados foi executada com o uso do software GENEAMRS)7Q0G Sequence Detection System. Para cada conjunto de iniciador/scnda, um valor C, foi determinado como número do ciclo no qual a intensidade da fluorescência 10 atingiu um valor especifico rio meie da região de amplificação exponencial. Os níveis relatives de expressão gênica foram calculados com o uso do método comparativa (% Em suma, para nada amostra de cDNA, a valor de controle endògeno C; foi subtraído do gene de Interesse Ct, para resultar no valor de delta C> (ACg. A quantidade normalizada do alvo foi calculada como presumindo-se que a amplificação feria 109% de eficiência. Qs dados finais furam expressos em relação a uma amostra de calibração.
Resultados
Os resultados são mostrados para oito imbidores de enzima GSK-3B. Os dados apresentados na figura 13 a partir de uma análise de 20 teor elevado mostram que os efeitos do composto quanto ao número de célula (painel A) e á intensidade de insulina (painel B) para a estirpe H1 de célula hES em que foi calculada a média para os pontos de dados respectivos a partir de um conjunto de amestras triplicadas e exploradas com relação a cada parâmetro a partir de cavidades e campos Idênticos.
Qs dados apresentados na figura 14 .a partir da POR em tempo real mostram os efeitos de composto para Pdxl e insulina. Nesses exemplos, a expressão de Pdxl e de insulina é indicativa da diferenciação dc endoderma pancreático e da geração de células hormonais positivas. Os compostos inibidores de GSK3p seletivo nesses ensaios podem substituir
Wnt3a durante estágios Iniciais de comprometimento de linhagem celular e podem induzir e sustentar rí formação da célula beta pancreática durante os estágios sequenciais posteriores de diferenciação, como ê evidente a partir tanto da smunocoloração com insulina quanto da POR em tempo real. Exemplo 11
Efeitos aditivos dos inbidores da enzima GSK-33 na formação das células do endoderma pancreáiico
Foi importante demonstrar que o tratamento com os inibidores de GSK36 poderiam otimizar ai diferenciação da célula beta pancreática caso seja adicionada durante as múltiplas fases de comprometimento do destino celular. Um subconjunto selecionado de cicies foi testado mediante 10 a adição temporizada sequencial para acentuar a expressão de insulina associada às células panoreáticas hormonais positivas.
Preparação da células para o ensafo: Preparação de oé/ula para o ensaio: As células de endoderma pancreático obtidas de acordo com cs métodos descritos no exemplo 9 e 10 (cultivadas em placas de 96 cavidades) 15 foram subsequentemente submetidas a agentes que fazem com que as células seja diferenciadas em células que expressam hormônio pancreátice.
Q ensaio para culturas da estirpe de céiulastronco embrionárias de ser humano H1 em MATRÍGEl.™ foi iniciado conforme descrito nos exemplos de 7 a 9 acima mediante a aspiração do meio de cultura a partir das 20 camadas únicas de célula em cada cavidade seguido de três lavagens em PBS para a remoção dns fatores de crescimento residuais e soro. Para a diferenciação do endoderma definitivo, os volumes de teste (190 pl. por cavidade para placas de 96 cavidades) foram adicionadas contendo um meio com 0,5% de FCS e diferentes concentrações de compostos inibidores com 25 100 ng/mL de ativina A, sem Wnt3a. Cavidades de controle positivo continham o mesmo meio de base e 0,5% de FGS corn 100 ng/ml de ativina A e 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Blosystems) na ausência do composto de teste. As cavidades de controle negativo continham o mesmo meio base com 0,5% de FCS. na ausência de ativina A; Wnf3a, ou composto de teste. Cavidades 30 de ensaio foram aspiradas e alimentadas novamente com concentrações idênticas de composto de teste ou soluções de controle no dia 2 do ensaio. Nos dias 3, 4, e 5, todas as cavidades de ensaio foram aspiradas e •r alimentadas com DMEM:F12 suplementado com 2% de FCS e IGO ng/ml de ativina A na ausência de ambos o composto de teste cu Wnt3a. As cavidades
d.e controle negativo paralelas foram mantidas nos dias 3. 4, e 5 em meio base de QMEM:F12 com 2% de FCS. Para a diferenciação de enduderma 5 pancreãtico, as células foram tratadas por três dias, alimentando diariamente com meio base DMEM:F12 contendo 2% de FCS com 0,25 pM KAAD ciclopamina (EMD Biosciences) e 20 ng/ml de FGF7 (RED Biosystems). As células foram tratadas subsequentemente durante quatro dias, com uma alimentação diária com DMEM:F12 contendo 1% de B27 (luvitrogen), 0,25 pM 10 de KAAD dciopamma. 2 μΜ de ácido retinôico (RA; Sigma-Aid rich) e ng/ml. de FGF7. As cavidades de controle negativo paralelas durante os estágios 2 e 3 foram mantidas integralmente em um meio base DMEM:F12. durante ο 3a e 3a estágios com 2% de FCS ou 1% de 827, e sem quaisquer outros aditivos. Após a formação rio endoderma pancreáfiCO. as células foram 15 tratadas adidorralmente por uma duração de seis dias, com alimentação era dias alternados com um meio de base DMEMíF’12 contendo 1% de B27 cora pM de DAPT (inibidor de gama-secretase: EMD Biosciences) a 50 ng/ml. da Exendirra 4 (Sigma-AIdóch) e 1 uM de inibidor R1 de TGFbeta II (inibidor de AL.K5; EMD Bíoscíences). Durante esse periodo de seis dias, os inibidores de 20 GSK33 foram adicionados de volta para as respectivas cavidades, com o uso da mesma concentração do tratamento anterior no inicio da diferenciação. As células foram, então, tratadas com urna duração de outros três dias, com uma ahmentaçáo em dias alternados corn urn meio de base DMEM.F12 contenda 1% de 827. 50 ng/ml. de Exendina 4. 50 ng/ml de IGF (R&D Biosystems) a 25 50 ng/ml. de HGF (R&D Biosystems), e 1 pM do inibidor RI de TGFbeta II (inibidor de ALK5; EMD Bíosciences). Durante esse periodo de três dias, os inibidores de GSK3p foram adicionados de volta para as respectivas cavidades, com o uso da mesma concentração do tratamento anterior no inicio da diferenciação. Os conjuntos paralelos das cavidades de controle 30 positivo foram tratados na presença ou ausência da 20 ng/ml. de Wnt3a.
Cavidades de controle negativo paralelas foram mantidas infegralmente em meio base OMEMF12 com 1% de B27 e sem nenhum outro aditivo.
Avã/feção de ensaíor Αα final do cuitivo, as células foram tratadas como nos exemplos 10 acima quanto à avaliação par analise de teor elevado.
Para a coloração de fluorescência de alto teor, as células nas placas de 96 cavidades furam lavadas duas vezes com PBS, então fixers cam n 5 4% de paraformaldeída â temperatura ambiente por 20 minutos, lavadas mais três 'vezes com P8S, e, então, permeabilizadas com 0.6% de Tutor? X-100 pur 20 rninuíos à temperatura ambiente, Apàs a fixação e a penneabilização, as células foram lavadas novamente três vezes com PBS e foram bloqueadas com 4% de saro de galinha (Invítrogen) em PBS durante 30 minutos à 1G temperatura ambiente. O anticorpo primário (anthnsulina súina de cobaia, com reatividade cruzada á insulina de ser humano, DakoCytomation) foi diluído 1:500 em 4% de soro de cabra e fui adicionado às células durante uma hora à temperatura ambiente. As células foram lavadas três vezes com PBS e, então, foram manchadas corn um anticorpo secundado conjugado oom Alexa 15 Finar 485 (cabra anti-cobaia IgG: Molecular Probes) diluída 1:106' em 4% de soro de cabra. A contraooloraçào dos núcleos, 2 pg/mf Hoechst 33342 (invitrogen) foi adicionada por dez minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas urna vez com PBS e foram deixadas em 190 pl./cavidade de PBS para a formação de imagem.
As células foram imageadas corn o uso de um IN Cell Analyzer
1900 (GE Healthcare) utilizando o dicièico S1008bs para células manchadas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Qs tempos da exposição forarr? otimizados com o uso de cavidades de controle positivo e cavidades manchadas com anticorpo secundária apenas. As Imagens da 15 campos 25 por cavidade foram adquiridas para compensar qualquer perda celular durante o tratamento e os procedimentos de coloração. As medições para o número de célula total e a intensidade de insulina total furam obtidos para cada cavidade com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1,7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com baser em 30 níveis em escala de cinza (faixa de linha de base de 100 a 300) e no tamanho nuclear. Desvios médios e padrões foram calculados para cada conjunto de dado replicado. A expressão de proteína de insulina total foi relatada camo a intensidade total ou intensidade integrada, definida same fluorescência total da célula vezes a àrea da cèluia. O funde foi ebminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de cinza enfre 300 a 3000. Os dados de intensidade total foram normalizados pela divisão das 5 intensidades totais para cada cavidade pela intensidade total média para o controle positivo de Wnt3a/ativina A. Os dados normalizados foram calculados para desvios médios e padrões para cada conjunto triplicado.
Os resultados são mostrados para oito inibidores de enzima 10 GSK-3B, Os dados apresentados na figura 15 a partir de uma anáfee de teor elevado mostram que os efeitos do composto quanto ao número de célula (painel A) e quanto á intensidade de insulina (painel B) para a estirpe H1 de célula nES em que foi calculada a média para os pontos de dados respectivos a partir de um conjunto de amostras triplicadas e exploradas com relação a 15 cada parâmetro a partir de cavidades s campos Idênticos. Nesse exemplo, a expressão de insulina é indicativa da diferenciação com relação às células pancreátícas positivas hormonais. Os compostos inibidores de GSK3p seletivo nesses ensaios nesses ensaios podem substituir Wnt3a durante estágios iniciais de comprometimento de linhagem celular e. quando adicionados em 20 estágios posteriores diferenciação, parecem promover a expressão acentuada de msuhna em relação a uma amostra de controle positivo.
As publicações citadas ao longo deste documento estão aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade. Embora os vários aspectos da invenção tenham sido ilustrados acima com referência às modalidades e exemplos preferenciais, será verificado que o escopo da invenção é definido não pela descrição acima, mas pelas reivindicações a seguir ocnsfruídas adequadamente sob os princípios de iei de patente.
Tabela IA: Lista de anticorpos primários usados para FACS e análise par teunacolora^O;:
Anticorpo Fornecedor Isotipo .................................... i Clone
SSEA-1 Chemicon (CA, EUA) IgM de camundongo MC-480
SSEA-3 Chemicon (CA, EUA) lgG3 de camundongo MC-631
SSEA-4 Chemicon (CA, EUA) IgM de rato MC-813-70
TRA 1 -60 Chemicon (CA, EUA) IgM de camundongo TRA 1-60 ..... ................ .........................
TRA 1-81 Chemicon (CA, EUA) IgM de camundongo TRA. 1-81
TRA 1-85 Dhemicon (CA. EUA) IgGI de camundongo TRA 1-85
AP R&D Systems IgGl de camundongo B4-78
HNF38 R&D Systems IgG de cabra
PD.X1 Santa Cruz Biotechnology, INC IgG de cabra A-17 J i
GATA4 R&D Systems IgG de cabra
Sox 17 R&D Systems IgG de cabra .....j
CD 9 BD IgGI de camundongo ......
Tabela ib: Lista de anticorpos secundários conjugados usados para FACS
Anticorpo secundário conjugado Fornecedor Diluição
IgG de cabra anlicamundonqo conjuoada corn APC Jackson ImmunoResearch (PA. EUA) 1.200
IgG de cabra a n t icam u n d on g o con jugad a com PE Jackson ImmunoResearch (PA, EUA) i.200
Jumento anticoelho conjugado com PE ou APC Jackson ImmunoResearch (PA, EUA) 1:200
jumento anticabra conjugado com PE ou APC Jackson ImmunoResearch (PA, EUA) 1:200
IgM de cabra anticamundcngo PE SouthernBiotech (AL, EUA) 1:200
IgM de cabra antirrato PE SouthemBiotech (AL, EUA) 1:200
lgG3 de cabra anticamundongo PIE SouthernBioteoh (AL, EUA) liiáoç
j abala II: Efeitos dos inibidores de. atividade de enzima GSK-3B na Viabilidade de Células gue 8 xpressani Marcadores de Pluripotênçia.
Dados em brute (duplicado) média s.a %CV % Controle
JNJ5226780 0,785 0.790 0,788 0,00382: 0,48 94,0
JNJ10179026 0,148 0,152 0,150 0,00247 1,65 4,8
JNJ17154215 0..427 0,462 0,444 0.02496 5,62 46,0
JNJI7205955 0,643 0,838 0,641 0.00368 0,57 73,5
JNJ186125 0,.762 0,762 0.762 0.00007 0,01 90.4
JNJ18157646 0.850 0,824 0,837 0,01824 2.18 101.0
JNJ 19370026 0,911 0,884 0,898 0,01681 2,10 1(8),5
JNJ 19567340 0,723 0,743 0,733 0,01421 1.94 86,4
JNJ7830433 0,161 0,169 0,165 0,00559 3,39 6,9
JNJ10179130 0.767 0,789 0,778 0,01556 2,01) 92,6
JNJ 17154.215 0,512 0,555 0,533 0,03048 i:Í|2:::1 58,4
JNJ17205955 0,282 0,293 0.288 1),00792 2.75 24.1
JNJ18014961 0.764 6,723 0,743 0,02892 3.89 87,9
JNJ18157698 0,853 0,858 0,855 0,00382 0,45 103.5
JNJ19376240 0,832 0,837 0,834 0.00361 0,43 100,6
JNJ19567405 0.726 0,725 9,725 0,00042 0,08 85,3
JNJ8706646 0,132 0,137 0,134 0.00368 2,74 2,6
JNJ10182562. 0,797 0,703 0,795 0,00348 M4 95,1
JNJ17157659 0,776 0,787 0.782 0.00792 1,01 93.2
JNJI7205994 0,164 0,148 0,156 0,01131 7.24 5,6
JNJ18014074 0,475 0,383 0,429 0.06548 15,28 43,8
JNJ18157698 0,823 0,774 0,798 0,03444 4.31 95,6
JNJ19386042 0,781 0,7.29 0,755 0,03649 4,83 89,5
JNJ19573541 0,143 0,149 0,146 0,00396 2.72 4.2
JNJ8710481 0,716 0,716 0,718 0,00014 0,02 84,1
JNJ10182562 0,804 9,892 0,803 0,00148 0,18 96.2
JNJ17163042 0,900 0,877 0,888 0,01626 1,83 108,2
JNJ1722SZ03 0,824 0,799 0.812 0.01725 : 2.13.....; 97,.4
JNJISO18338 0,744 0,819 0,781 0,05261 6.73 93,2
JNJ18157711 0,95.2 0,966 0,959 0,00933 0,97 118.1
JNJ19410833
JNJ19574867
JNJ8710481
JNJ10184655
JNJ10166565
JNJ17982133
JNJ18018351
DMSO
JNJ19410859
I JNJ 19574880
ÍJNJ10148307
I
I JNJ10222784 s J N J1 /1 f 46o4 |JNJ17989049 |JNJ18647991
I DMSO
ÍJNJ19410B72 ÍJN320948798 IJNJ10164830 IJNJ10222927 |JNJ17187027 IJNJ17994873 |JNJ18055726 IJNJ18157711 IJNJ19558929 | JNJ21192.730
JNJ10184895
JNJ10231273
JNJ17187053
JNJ17994899
JNJ18077860
JNJ19383357
Dados em bruts média % CV 1% Contrate;
DMSO
0,649
0,648
JNJ10172858
0.601
NJ 10260847
0,695
JNJ17994912
0,765
694
0,10041
JNJ181570741
0.752
0.760
0,00297
0,487
0,434
0,461
0,686
0.688
690
0.00262
JNJ211962.27
JNJ26130403
JNJ26483310
1NJ24326185
JNJ21194667 (duplicada) '799
0,620
12,87
104,3
0,00198
99,3
JN
062.0
100.6
11-4
9.11427 | 18.90
8,01308
0,00552
0,07446
0.06449
9.94
JNJ24843611
JNJ24843611
JNJ26064U/1
JNJ26178794
JNJ26367991
MNJ25758850
9,00177 | 0,29
0,05869
0,00523
0,00120 j 0.19
Dados sm brute (duplicado) média SO. %CV % Controle
JNJ26714220 0,652 0,642 0,647 0,00721 1,12 79,8
JNJ26483223 0,617 0,633 0,62.5 0.01174 1,88 76.5
JNJ24843572. 0,657 0,655 0,656 0,00134 0,20 81,2
JNJ25758863 0,684 0:809 0,746 0,08803 11,60 95.0
JNJ26067652 0,901 0,735 0,818 0,11731 14.34 106,0
JNJ26150202 0,791 0,768 0.779 0,01591 2.04 100,1
JNJ28170833 0,948 0,764 0,856 0,12982 15,17 111,7
JN326.243204 0,821 0,608 0,714 0.15033 21,05 90,1
JNJ26399906 0,745 0,685 0,715 0,04243 5,94 90,2
JNJ26483236 0,624 0,618 0.621 0.00417 0..67 76,0
3N.J24843585 0,652 0,624 9,838 0,01916 3,00 78,5
0NJ26873419 0,773 0,662 0,718 0.07792. 10.86 90,6
JNJ26069901 0,856 0.834 0,845 0,01570 1.86 110,1
JNJ26153647 0,828 0,800 0.814 0,02008 2,47 105,4
J NJ26177088 0,821 0,841 0,631 0.01421 ' 111' 1 108,0
JNJ26247143 0,816 0.787 0,802 0,02072 2,58 103,5
JNJ26399906 0,744 0,737 0.741 0.00453 0.61 94,1
JNJ26483249 0,890 0.679 0,889 0,01464 2,12 86.3
JN325753520 0,186 0,208 0,197 0.01541 7,83 11,3
3NJ25887537 0,665 0.699 0.882 0,02432 3,57 85,2
3NJ26077883 0,810 0,683 0,746 0,09030 12.10 95,0
JNJ26158015 0.141 0,162 0,151 0,01506 9,95 4,3
DMSO 0,784 0,605 0,895 0,12671 18.25 87,1
JNJ26248729 0.726 0.590 0,658 0,09624 14,83 81.5
JNJ26399945 0,635 0,62.0 0.628 0,01068 1,70 76,9
JNJ26483249 0,697 0,695 0,696 0,00113 0,16 87.3
JNJ25753403 0.154 0,153 0,154 0,00042 0,28 4,5
JNJ25900641 0,616 0,645 0,630 0,02072 3,29 82,1
JNJ22791671 0.009 0,830 0,869 0,05614 6,46 121,0
JNJ28158054 0,150 0,150 0,150 0,00028 0,19 3,9
JNJ26177732 0.981 1,056 1,018 0,05303 5.21 145,3
JNJ262611G5: 0,168 0,189 0,177 0,0162.6 9,19 8.3
I Dados am bruts j j (duplicado) I
JN026399971I 0.718 0,451|
I Is
JNJ26483262| 0,652 0,647[ |JNJ25757173| 0.503 0,529[ [3NJ25900654 0,603 0.609| )jNJ26116922 0,856 0,793| |JNJ26893438 0,8830,848
IJNJ26184457 0,7790,784 |jNJ26361712 0,8920,914 |jNJ26399984 0,5440,537
JNJ26511901 0.532 0,682|
JNJ25757173 0.655 0,545(
JNJ25900705| 0,575 0,677(
JNJ26120601 0,935 0,807|
JNJ2.61580931 0,916 0,859|
JNJ26219050| 0,907 0,.891I
3Ν326361725( 0,909 0,896|
JNJ26399997] 0,682 0,797I
JNJ26511927| 0,679 0,644j
JNJ25757238| 0,300 0,.223|
JNJ26047723| 0,183 0,175|
JNJ26120614( 0,741 0.728|
JNJ26158106^ 0,935 0,906|
JNJ26219063Í 0,131 0.128|
JNJ2.536673(H 0,1380,137
JNJ26400049[ 0,2410,227
JNJ26941226 Í 0.804 0.63$)I iI | JNJ25758707Í 0,247 0,182|
JNJ26054912 | 0,659 0,634|
I JNJ26128726| 0.758 0,575I
JNJ26161343| 0,166 0.170|
JNJ26220454 | 0,651 0,559I
JNJ263679911 0,803 0 694I ϊ *Ϊ.
I RWJ 675260 j
I RVVJ675946 |
I RWJ351958 |
I RVVJ395477 [
I RWJ447228 |
I RWJ666167 |
I RWJ670908 j
I RWJ573830 I
I RWJ675261 | | RWJ675948 |
I RWJ447.228 | | RWJ414342 I
I RWJ553709 I i RWJ666168 I
I RWJ670984 | RWJ674239 | RWJ675430
I RW3676061
I RWJ352190 | RW3414984 I | RWJ659780 | | RWJ666205 I
RWJ671232 |
RWJ6 74240 i
Dados em brute (duplicado)
0,8230,634
0,8240,618
0,6390.603
0,1430,149
0,8170,818
0,7420,752
0,8560,905
0,8500,576
0,7680,724
0,5560,549
0,2270.242
0,6340,663
0.1410,128
0,8470.832
0,8030,845
0.8600,860
0,5280,497
0.6830,688
0,6110,628
0,7190,749
0.9160,838
0,7710,740
0,8200,852
0,9710.913
0,8390,743
0,5620,527
0,8780.661
0,7220,713
0,8020,801
0,8540,857
0,7670,798
0,7890,776
Dados em bruto (duplicado) média s.a %CV % Cuniralfô
RWJ675266 0.720 0,709 0,714 0,00764 1,07 87,4
RWJB76085 0,841 0.618 0,636 0,01819 2,57 74,9
RWJ352244 0,603 0,584 0.593 0,01372 2,31 69,4-
R.WJ425264 0,135 0.158 0,146 0,01633 11,18 3.0
RWJ662440 0,792 9,572 0,682 0.15563 22,83 82,6
RW3666213 0,752 0.593 0,673 0.11292 18,79 81,2
RWJ672667 0,805 0,598 0,702 0,14644 20.87 85,5
RWJ674241 0,599 0.504 0,552 0.06682 12,11 83,2
RWJ675366 0,,714 0,593 0,854 0,08549 13,08 78,4
RWJ878137 0,699 0,698 0,698 0.00099 0,14 85.0
RWJ352628 0,690 0.674 0,682 0,01131 1,66 83,3
RWJ425268 0,616 0,634 0,625 0,01301 2,08 74,8
RWJ663860 0,609 0,817 0,813 0,00552 0.68 103.0
RWJ667045 0,128 0,133 0,131 0,00361 2,76 ' 0,7
RWJ67.2932 0.821 0,811 0,816 0.00721 <88 : 103.4
RWJ874320 0,456 0,474 0,465 0,01.223 2,63 50,8
RWJ675369 0,762 0,766 0,764 0,00304 0,40 95,7
RWJ676139 6,680 0,663 0,671 0,01195 1.78 81,8
RWJ353258 0,615 0,635 0,625 0,01400 2,24 74,8
RW,1355923 0,681 0,698 0,689 0.01266 1,84 84.5
RWJ664S45 0,830 0.807 6,818 0,01584 1,94 103,8
RW3667046 0,869 0,849 0,859 0,01442 1,68 109.9
RW0672934 0,821 6..841 0,831 0,0142.8 1,72 105,7
RWJ674817 0,819 6.840 0,830 0.01485 1,79 105.5
R9VJ67543D 0,795 0,793 0.794 0,08078 0,10 100,1
RWJ676431 0,640 0,636 0,638 0.00283 0,44 76,7
RW355131 0,610 0.,628 9,619 0,01266 2,05 73,9
RWJ425271 0,143 0,144 0,144 6.00035 0,2.5 2,6
RVVJ353709 0,804 0,903 0,853 0,07000 8.20 109,0
RWJ667069 0,918 0,854 0,886 0,04483 5,06 113,9
RWJ673313 0,105 1,080 0,593 0,68971 116,37 70,0
RWJ674855 0,877 0,860 0,868 0,01209 1,39 111,3
Dados, em bruto (duplicado) média S,D, % CM % Controle
RWJ675578 0,808 0,695 0751 0,07941 10,,57 93,8
RW9676482 0720 0,697 0,709 0,01648 2.33 87.3
RWJ355923 0,836 0,621 0,6.29 0,01054 1,68 75,4
RWJ425348 0.640 0,634 0,637 0.00474 074 76,6
RWJ665436 0,833 0.833 0.833 0,00000 0,00 106,0
RWJ669182 0.887 0,846 0,866 0.02934 3.39 111.0
RWJ673515 0,845 0.877 0,861 0,02326 2,70 110,2
RWJ674855 0794 0,784 0,789 0.00686 0.87 99,4
RWJ675605 0,770 0.786 0,778 0,01138 1,46 97.8
RWJ67657 0,629 0,65$) 6,644 0,02128 3,30 77,7
RW3356205 0,584 0,558 0,571 0,01817 3,18 66.8
RWJ445224 0,707 0,679 0.693 0.01987 2..87 85,0
RWJ665588 0.727 0,578 0,652 0,10536 1.6,15 78,9
RWJ669327 0,742 0,629 0.685 0,07969 11.63 83.8
DMSO 0,853 0,507 0,580 0,10310 17,78 68,0
RWJ675104 0722 0,568 0,645 0,10904 16,90 77.9
RWJ675881 0..643 0,581 0,612 0.04384 7.16 72,9
RWJ676639 0,608 0.590 0,599 0,01245 2,08 70,9
JNJ26511966 0,597 0,610 0,603 0,00926 1,54 71,2
JNJ26511979 0,6-87 0,668 0.677 0,01336 1,97 82,4
JNJ26512005 0.840 0,832 0,836 0,00594 0,.71 106,1
JNJ26533065 0,831 0,822 0,826 0,00587 0,71 104,7
JNJ26533091 0.863 0,856 0,860 0,00509 0,59 109,7
JNJ26533104 0,886 0,802 0.844 0,05954 7,05 107,3
JNJ26533156 0.753 0,687 0720 0,04660 6,47 88,8
3NJ26714181 0,455 0,463 0,459 0,00587 1.28 49.6
JNJ26714194 0,668 0,678 0,673 0,00764 1,13 81,7
^Ν326714207 0,181 0,1'71 0.176 0,00658 3,74 7.2
;4NJ28714220 0,832 0,842 0,837 0,00658 0.79 106,3
:JN326875563 0795 0.802 0,798 0,00445 0,56 100,5
JNJ22791671 0,157 0,140 0.148 0,01202 8.11 3.0
JNJ26893438 0.153 0,153 0,153 0,00035 0,23 3,7
Dados em bruto (duplicado) média S.D. % cv % Controle
JNJ26941226 0468 0,154 0,161 010989 6.® 4,9
JNJ28572128 0,670 0,641 0,655 0.02079 34:7 79,1
RWJ67694 0.706 0,679 0,693 0.01888 2,73 84.7
RWJ676940 0,738 0,666 0,727 0,08627 . t:lw· 89,8
RWJ677545 0,.879 0,785 0,832 0.06640 7,98 105,6
RWJ678986 0,168 0,176 0,172 0,00537 3,13 6.6
RWJ680665 0,946 0,848 0,897 0,06972 7,77 115.3
RW3680667 0.187 0,202 9494 0.01089 5.61 9.9
RWJ680668 0,906 0,888 0,797 0,18394 19· 31 160,3
RWJ680669 0,715 0,674 094 0,02850 440 84,9
RWJ680858 0.695 0,700 0,697 6,00339 0.49 85,3
RWJ680858 0,665 0.831 0,848 0,02369 3,86 78,0
RWJ680879 0,590 0,613 0.601 0,01855 ; 2.75 Ι:11ι
RWJ680885 0.681 0,687 0,684 0,00382 0,56 83.3
RW3680991 0,829 0,821 0,825 0,00530 0.64 104,5
RWJ680992 0.822 0,790 0,806 0.02270 i 212' 101,6
RWJ680993 0,671 0,684 0,67'7 0,00912 11:5 82,3
RWJ681140 0.686 0.868 0,677 0,01286 : 1.87 82,3
RWJ681142 0,212 0,197 0,2® 0,01047 : 542 ............ 1
RWJ681146 0,666 0.668 0,666 0,06667 0,01 80,7
RWJ681945 0,736 0.656 0,696 0,05643 8.11 85,1
RWJ68198 0.726 0,610 0.668 0.08217 wa 81,0
J N® 3850601 0,303 0,310 0,306 0,00488 .....1.59..... 26,7
DMSO 0,786 0,659 0,722 i 0,09601 12,46 89.1
DMSO 0.673 0,649 .....Ó>6í 9 0,01676 2,53 79,9
DMSO 0,701 0,686 0,693 0,01011 1,46 84,8
102
Tabela UI: Efeitos dos imbidores de atividade de enzicna GSK-3B na
Viabrbdade de Células que Expressam Marcadores de Pluripotência.
cmpd uone (UM) Dados em bruto (duplicado) yédis S.Ü, % CV % Controla
meio EXPRES 01 0,6370 0,6180 0,6280 0.0141 2,2 74,8
nenhum tratamento 0.7412 0,7038 0,7225 0.0264 3.7 88,7
AA apenas 0,7674 0.8047 0,7861 0,0264 3.4 98,3
AA r Wnt3a 0,7’754 0,8200 0.7977 0,0315 4,0 100,0
JNJ265120Ό5 : io 0,1412 0.1515 0,1464 0.0073 5,0 2,4
JNJ26512065 5 0,1501 0,1444 <1473 0,0040 2,7 2,5
JN326512005 2,5 0,1541 0,4254 0,2898 0,1918 66,2 23,9
JNJ26533065 10 0,1272 0,1282. 0,1277 0.0007 0.6 -0,4
JNJ26533065 Γ 1 0.5862 0.5880 0,5871 0.0013 0,2 68.4
JNJ26533063 2,5 0,7613 0,7803 0,7608 0,0007 0,1 94.5
JN326533156 10 0,1481 0,1592 <1537 0,0078 5,1 3,5
JNJ26533156 : 5 . 0,1479 0,1639 0,1558 0,0113 7,3 3,8
JNJ26533156 2,5 : 0,2861 0,2477 0,2669 0.9272 10,2 20,4
JN326714194 10 0,2092 0,2428 0,2259 0,0236 10,5 14,3
JNJ26714194 5 0,6815 0,7128 0,6972 0,0221 3,2 84,9
JNJ26714194 2,5 0,7389 0,7870 0,7630 0.0340 4.5 94,8
JN326150202 10 0.1381 0,1398 0,1390 0,6012 0.9 1,3
JN326150202 5 0,7826 0,7578 0,7702 0,0175 2,3 95.9
JNJ26150202 2.5...... 0,8231 0,7742 0,7987 9,0346 4,3 100.1
JNJ26158015 10 0,1352 0,1326 0,1339 0,0018 1,4 0.5
JNJ26158015 5 0,2632 0,2604 0,2618 0,6020 0.8 19,7
JNJ26158015 2,5 0.4160 0,5314 0,4737 0,0816 17,2 51.4
RWJ670804 10 0,4447 0,4791 0,4619 0,0243 5,3 49,7
RWJ870804 5 0,8902 0,6884 0.6893 0,0013 0.2 83,8
RWJ670804 2,5 0,7476 0,7483 0.7480 0,0005 0.1 92,5
JNJ26170833 10 0.6796 0,6704 0,6747 0,0061 0.9 81.6
3NJ26170833 5 : 0,7833 0,7924 0,7879 0,0064 0,8 98,5
JNJ26170833 2,5 0,8155 0,8389 0.8272 0.0165 2,0 104,4
JNJ26177086 10 0,6533 0,6884 0,670$) 0.0248 3.7 81.0
103
cmpd cone (uM) Dados em bruto (duplicado) Média S..D, %cv % Controle
JNJ26177086 5 0,7607 0.7738 0,7718 0,0029 0,4 98,. 1
JNJ26177086 2,5 0,8119 0,8219 0.8169 (),()()71 0,9 102.9
JN22.6177762 10 0.1242 0,1323 0.12:83 0,0057 4,5 -0,4
JNJ26177762 5 0,1263 0,1303 0,1283 0,0028 2.2 -0.3
JNJ28177762 i' 2,8 0,8480 0.7725 0,8103 0,0534 6,6 101,9
RWJ673515 10 0,1695 0,1890 0,1793 0,0138 7,7 7,3
RWJ673515 0,7217 0,7435 0,7326 0,0154 2.1 90,2
RWJ673515 2,5 0,7812 0,7221 0,7517 0.9418 5,6 93,1
meio EXPRES 01 0,6294 0,5363 0,6329 0,8 0.5 70,3
nenhum tratamento 0.7156 0,7356 0,7256 1,9 1,9 83,3
AA apenas 0,8732 0,9046 0,8889 2,5 2,5 106,0
AA w Wnt3a 0,8415 0,8458 0,0060 0.7 0.7 : 100,0
JNJ19370026 10 i 0,1403 0,1493 0.1448 9,0064 4.4 2,3
JNJ19370026 agí I 0,4434 0,3378 0,4156 0,0393 9,5 40,1
JNJ19370026 2,5 0,7734 0,8038 0,7886 0,0215 2,7 92,0
JNJ26483197 |i|i| 0,2903 0,3026 0,3010 0,6023 0,8 24,1
JNJ26483197 i|: J 0,7023 0,6299 0,6861 0,0512 7,7 75.0
JNJ26483197 2,5 0,7835 0,8043 0,7939 0,0147 1,9 92,8
RW0675605 10 0,7205 0,7369 0,7287 0,0116 1,8 83,7
RW3675605 5 0,7769 0,8272 0,8021 0,0356 4,4 93,9
RWJ675605 2,5 0,8214 0,8640 0,8427 0,0301 3.6 99,6
RWJ6 75430 10 0,6275 0.5980 0,6128 0,0209 3,4 67,5
RWJ675430 5 0,7159 0.7222 0,7191 0,0045 0,8 82,3
RWJ675430 2,5.....' 0,0245 0,9403 0,9324 0,6112 1,2 112,1
RWJ675948 10 ; 0,7220 0,6670 9,6945 0,0389 5,6 78,9
RWJ8 75948 5 0,7526 0,7488 0,7506 0,0028 0,4 86,7
RWJ675948 2,5 0,7557 0.7390 0,7474 0,0118 1,8 86,3
JNJ26483249 10 : 0,8214 0,8638 0,8425 0,0298 3,5 98,5
JNJ26483249 j l|: | 0,7996 0,7873 0.7935 0,0087 1.1 92,7
8NJ2.S483249 2.5 ' 0,8669 0.8105 0,8432 6,0335 4,0 99,6
RWJ67657 10 0,6195 0,5908 0,8052 0,0203 3.4 66,5
RWJ67657 5 0,8047 0,8319 0,8183 0,0192 2,4 96,2
104
RWJ676630 cmpd cone i % % CViControte
(duphcado)
0,0183
0.0028
105
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to ’.MA* as to
te : O te to O · x«3 te te
S'. 'íí^· ¥x-
to to
te to
χ3ϊ to te
te X'
ίίΆ te te
to to to
to o X
Xfr o os m te
113
114
115
Tabela V: Efetocde inibidcres de atividade de Adzifoe. eSK-3B na diferendaçag e proliferagae da a^ulasTrecça enibdanánas de ser rrarpane.
Resposta Rralíteratrva - Ciclos vigorosos Gxpressâo de SQX17 - C-olos vigofosns Exp/essãn de ΗΝΕ3β -C-ctos vigorosos
Nome do edfhpusfo: ÍO sup-prior ao controle Wnt 3.3/ AA Nome do composto v&ses superior ao conOule Wnt 3a/AA Nome do composto Vezes superior ao cordrole Wnt 3a/AA
RWJ362628 U,„........ .................... 5.8846 RWJ673515 1,7415 RWJ352628 5,4568
hwJ352199 4.8268 •1N.J 10154655 1.2678 7WJ35219Q 3,1115
RVV35537Q9 2.5032 4 7.............isss............. Expressão de SOX17 - Ciclos moderados RWJ553709 2.7880
JNJ1014830? 1.9764. WJ876Í39 1.1359 RWJ673515 1.3818
liilillii· 1 Tllif|sT RWJ675430 JNJ108W 1.3832
i RWJ6 76432. 1,04*9 JN-J18157698 1.2196
RWJ87543Q 1,3754 RWJ3t4‘K78 1,0036 Expressão de HN’F3b - Cicies moderados
JNiWlBW : 1.3681 RWJ676S05 1,0419 RWJ675430 1.1562
UNJ10184655 ILJIilii'™·! RWJ355923 1,0342 JNJ10222784 1.1010
hooida ji ONd18167^98 1 0208 1NJ5226780 1.0087'
Resposta ProhferaWs - Ciclos moderados JNJ10182582 1.0986 RWJ355923 0.9520
JNJ5228780 1.1246 umpd dss refedmosa 8.9708 RWJ353799 0.9515
RWJ676432 1.9870 JNJ1Q148307 0 9708 RWJC76139 0.9499
1,0764 RWJ352190 9,926« JNto 0184655 0,8807
1.073o RWJ353709 0.9914 JNJ10132562 0.3888
JNJ10132562 1.0495 RWJSS4S-65 0.8889 RWJ864545 0.8649
JNJ10134655 1,0269 JNJ1Ü154895 9.3534 RWJ674239 |^g|||||777:
JNJ10164395 1,0092 JNJ10179130 0,8165 RWJ676432 0.7711
RW3353799 9.0928 RWJ676431 0.8113 6 . . Is umpd de referência 0.7576
CWrarâüJO 0.9484 RWJ6637Q9 0RB26 JNJ 10184895 0J428
RWJ664545 0.9440 8NJm-Jr,ra4 1 :1®8Í91tL 0,7104
ytóidWBS: 0.9249 JN48719481 JNJ 10172058 0,8803
jurscrax 0.9023 .’^26533'56 0,7189 JNj8?'to481 0,8412
JNJ10172958 0.3364 JNJ1017372? 0,5866
ÍN>B72» aaw JNJ 10222784 0:,8473:
RWJ445224 0,8514 RWJ07423S 0.6282
116
Re&posta Prpiifenetiva - Cioua.
Expressão de SOX*7 - Círios Expressão de HMr38 ^sprosox Oicioe vsgom&os c?npd de jHbiêrCiià
JNW1O481
JNJ2S533156
RWJ3521Ô0
RWJS83709
RW,1688430
RWJ575G48
RWJ353258
3NJIC178727
Q.8162
JNJ870664S
D.5S8?
0.1S92
JNJ10178727
0.5686
0,7864
0.3842
0.3161 RWJ675443
0.634:
0.8211
0.5025
Tabela Vl·. Efeitos de inibidores de atividade de enzima GSK-3B na diferenciação e proliferação de células-tronco embrionárias de ser Iwnanu.
Número J NJ Dados em bruto Média S,D, % CV % Controle
me io
condicionado 1,1348 1,0099 1.1Ü92 1.0840 0.0660 Sy1 1'16,5
nenhum
tratamento 0,9344 0,3977 0,8454 0,7925 0,1745 22,9 85,2
AA/DMSO 0,3878 0.2434 0.2252 0..2855 0.0891 31:,.2 30.7
AAWnUa/DM
SO 0.61198 1,0804 0.7635 0,8179 0,2403 25,8 100.0
RWJ35WÍ 0.3418 0.4276 0,5751 0,4482 0,1180 26,3 48.2
RWJ3519S8 0.1362 0,1531 5,1532 0,1475 0,0098 6,8 15,8
RWJ35219Q 1,3764 1,2753 1,3268 1,3242 0,0506 3.8 142,3
RWJ3S2244 0,6923 0.5994 0,6134 0..6350 0.0501 III!::: 68,2
RWJ352628 1.7896 1,4721 2.1908 1,8175 0,3662 19,.8 195,3
RWJ353258 1,7591 1,8274 1,6518 1,8794 0,0701 4,2 180,4
RWJ355131 0.3702 0,3193 0,3368 0.. 3421 0,0259 7,6 36,8
RWJ355B23 0,5876 0,6384 0.9154 0,7138 0,1764 24,7 '76.7
RWJ356205 0,3074 0,232.8 0,2920 0,2774 0.0394 14.2 29.8
RWJ382867 0,1311 0,1245 0,1288 0.1281 0.0034 2,6 13,8
RWJ3B5477 0,1270 0,2778 0,1916 0,1988 '0,0757 38..1 21.4
RWJ414342 0,2166 0,3062 0,2915 0,2714 0,0481 17,7 29,2
Número 3N3 Dados em bruto Média S.D. %CV % Controle
RWJ414984 0,4362 0.3728 0,2481 0.3524 0,0957 27,2 37,9
RW3425264 0,1560 0,1481 0.1359 0,1467 0.0101 6.0 15.8
RWJ425288 0,2932 0.3883 0,6253 0,4358 0.1713 39,3 46,8
RWJ425271 0,1362 0,1479 0,1298 0,1380 0,0092 6,7 14,8
RWJ425348 0,2198 0,2159 0.2300 0,2219 0,0073 3,3 23,8
RWJ445224 0.7624 0.2705 0,2473 0,4269 0,2998 68.1 45.9
RWJ447228 0,1239 0,1233 0.1269 0,1247 0,0019 1,5 13,4
RW0S537O9 0,1277 0,1254 0.6980 0,3170 0,3209 104,1 34,1
RW4S59780 0.2665 0.3215 0,2605 0,2828 0,0336 11.9 30.4
RWJ662440 0,2395 0,3235 0.1333 0,2321 0,0953 41.,1 24,$)
RWJ6638SÔ 0,2646 0,1873 0,1293 9.1937 0,0679 35.0 20,8
RWJ664545 0.3500 0,2790 6,1515 0,2632 0.1047 39.3 28,3
RWJ665436 0,4690 0,5805 0.3349 0,4615 0,1.230 26,6 49,6
Número JNJ Dados em bruto Média S..D, % CV % Controla
msw condicionada 1.1525 1,1269 1,1140 1,1311 0,0198 1,7 71,0
nenhum tratamento 1,2057 1,2358 1.3132 1.2516 0.0555 4,4 78,6.
AA/DMSQ 0,2622 0,2073 0,2830 0,2508 0,0391 15,8 15,8
AA/WmSa/DM SO 1,3943 1,7976 1,8000 1.5922 0.2136 13,4 100.0
RWJ665588 0.1930 0,2223 0,2167 0,2107 0,0156 7,4 13,2
RWJ665862 0,1757 0.1813 0.1835 0,1802 D.Ü040 2.2 11,3
RWJ66S167 0,1473 0,1880 0,1732 0.1695 0.0206 12,2 10.6
RWJ866168 0,1330 0,1382 0.1867 0,1520 0,0301 19.8 9,5
RWJ886205 0.8191 0.5493 0.6526 0.6737 0.1361 20,2 42.3
RWJ86S213 0.4008 0,2779 0,3869 0,3552 0,0673 18.9 .22,3
RWJ687Ú45 0,1220 0.1248 0.1251 6,1240 0,0017 1.4 7,8
RW3S8704S 0,2883 0,3308 0,5503 0,3898 0,1406 36,1 24,5
RWJ687ÔS9 0.2835 0,4024 9,5698 0,4186 0,1438 34.4 26,3
RWJ689182 0,3704 0,6073 0.5280 0,5019 0,1206 24,0 31.5
RW0669327 0.2266 0,1815 0,2289 0,2123 0,0267 12,6 13,3
118
Numera JNJ
Dados em bruto | í %
Média j S.D. % CV i Controle
RWJ6708O4
0828
4,8
RWJ67O903
0,5457
RWJ670934
0,3202
RWJ671232
0,2928
0,2920
RWJ672667
0,3507
RWJ672932
0,1852
RWJ672934
RWJS73313
0,1881
RWJ673515
RWJ673820
RWJ673830
RWJ874320
1,8452 1,7710 1.5591 | 17251 0,1485
0.7305 0,7087 0.82501 0,6874 0,0553
0,2113 0,1800 0,18471 0,1826 0.0284
1,5225 1,5912 0,1081 | 1,0/39 0,8371
0.4006 1,2807 0,1162( 0,5992 O,bOz 1
0,1972 0,1839 0,1162 | 6.1658 6,0434
0,1351 0,1318 0,11691 0.1279 0,0097
15,6 :b
Número JNJ Dados em bruto
I Média
S.D, % cv
0/ /B
Controlo meío condicionado 1,0568
1,0604
1,0586
Nenhum tratamento | 1.1544
AA apenas 4- j
OMSO 0.6329
382.1 0,1488
AA 4- Wnt3a *
DMSO 1,2704
RWJ074817 0.5617
0.2098
0,6352! 0,0705
100.0
RWJ675104 0.2320
0.222210.0139
R.WJ67526G I 0,8079
39.7
RWJ675291 | 0,8310
RWJ6752S6
0646
1,1384 ,7f.
RWJ675368 nenhuma
3,6344
3,1335
54,8
0,1703; 0,0520
I NOmeru JNJ lüadas em brut»
célula
RWJ675369 0,8643 0.,4060
RWJ675430 1.7922 1,8533
RWJS75578 0,1914 0 2371
RWJ675S0S 1,8401 1,7563
RWJ675881 1,0301 1,0356
RWJ675946 0,1306 0,1338
RW3675948 1,7143 1,6506
RWJ67BO61 0,4170 0,4956
RWJ67608S 0,1772 0,2348
RW3576137 1,0231 1,2392.
RW3676139 1,9718 2.0997
RWWS431 1.5168 1,6872
RWJ676432 1,6936 1,9710
RWJ67657 1,2655 1,1829
RW357SB39 1,3431 1,3168
9Ν32β5119Ββ| 0,6444 0.7239
JNJ28511S70 0,2046 0.3076
JN J26S120051 1,3627 1; 0693
JNJ26S33065I 0.8722 0.9060 }
JNJ2B5330911 1,9332 0,4554 JN325S33104I 0,8775 0.7347 JN J2S5331561 1,7865 1,2008 9NJ267141611 0,2396 0.1584
............... J ‘ ·
JNJ20714194I 0,8122 1,6827 JNJ267142071 0,1342 0,1363 JN32S714220| 1,0462 0,5838 JNJ26875SS3| 0.4586 0,2903 0Nd2279167l| 0,1277 0,1402 JNJ25893438I 6,1258 0,1324
JNJ26941226 0,1219 0,1216
JNJ28572128 0,4223 0,4721
Número JNJ Dados em bruto Média S.IX %CV % Centrais
JNJ2885G601 0,1514 0,1396 0,1455 0,0083 5,7 1,4
Número JNJ Dados em bruto média S.IX %cv % Controle
maio condicionada 0,7423 07081 0,7252 0,0242 3,3 87,7
Nenhum tratamento 0,4936 0,5089 6,5313 0,0532 10.0 59,8
AA apenas * DMsa 0,1433 0,1939 0,1686 0,0358 21,2 7,6
AA * Wnt3a * DIVISO 0,5808 0,9406 0,8'107 0.,1837 22,7 100,0
JN317994873 0,2447 0,1331 0,1889 0,0789 41,8 10.6
JNM17094899 0,1537 0,1302 0,1420 0.0166 11,7 3,8
nenhuma célula 0,1163 0,114? 0,1155 0,0011 : 1,0 0,0
JNJ17994912 0,2994 0.2592 0,2793 0,0284 10,2. 23,6
JNJ17994925 0.1353 0,2121 0,1737 0,0543 31.3 8,4
JNJ18Ô125 0,1267 0,1419 0,1343 0,0107 8,0 2,7
JN319914991 : ..................................... 0,1376 0,1676 0,1526 0,0212 13,9 5,3
JNJ18014974 ..... .3 0,1134 0,1103 0.1119 0,0022 2.0 -0.5
JNJ18018338 0,1318 0,1478 0,1398 0,0113 8,1 3,5
JNJ180183S1 0,2569 0,2124 0,2347 0,0315 13,4 17,1
JNJ189479911 0,2674 0,2636 0.2655 0,0027 1.0 21,5
JNJ18055725 0,4357 0,3467 0,3912 0,0629 16,1 39.7
JNJ18977890i 0,1265 0,1588 0.1427 0.0228 16,0 3,9
JNJ18157974Í 0,1662 0,2521 0,2092 0,0607 29,0 '13,5
JNÚ181579871 0,1596 0,1566 0,1581 0,0021 1,3 6,1
JNJ1815764S 0,2725 0,1636 0.2181 0,0770 35,3 14,8
JNJ18157711 1,2256 1,0036 1,1446 0,1146 10,0 148,0
JNJ18157711 0.1134 0,1076 0,1102 0,0045 4,1 0,8
JNJ19383357 0,1469 0,1495 0.1482 0,0018 1,2 4,7
JNJ19359233 0,1169 0,1122 0,1146 0,0033 2,9 -0,1
JNJ19389245 0,1595 0,1422 0.1509 0,0122 6,1 5.1
JNJ19370028 1,0484 1.0749 1,0617 0,0187 1,8 136,1
121
Número J Nd Dados em bruto Média S.D. %CV % Controle
JN319376240 0,3012 0,2347 0.2580 0,0470 17,5 21.9
JNJ19386042 0,1267 0,1510 0,1389 0,0172 12.4 3,4
JNJ194WS33 1,1902 1,1487 1,1695 0,0293 2,5 151,6
JNJ19410859 0,6400 0,7070 0.6738 0.0478 7,1 80,3
JNJ19410872 0,1701 0,1752 0,1727 0,0036 2.1 8,2
JNJ195S8929 0,3435 0,3488 0.3462 8.0037 33,2
JNJ195673'14 0,4032 0,3548 0,3790 0,0342 9.9 37,9
JNJ19567327 0,1602 0,1502 0,1552 0,0071 4,6 1 1
JNJ19567340 0.1604 0.2079 0,1842 0,0336 18,2 9,9
JNJ19567405 0,1646 0.1592 9,1819 0,0'038 2.4 6.7
JNJ19573541 0,1779 0,2273 6,2026 0,034$) 17.2 12,5
JNJ19574867 0,1225 0,1443 0,1334 0,0154 11,6 2.6
3N019574880 0,1300 0,1291 0,1296 0,0006 9,5 2,0
3NJ2G948798 0,1263 0.1336 0,1» 0,0052 4.0 2,1
JNJ21192730 0,2778 0,1326 0,2052 0,1027 50,0 12,9
JNJ21194667 0,2569 0,1219 0,1894 0,0955 50,4 10,6
JNJ21196227 0,164 0 0.1158 0,1399 0,0341 24.4 3.5
3NJ24843611 1,1486 0.8970 1,0223 0,1779 17.4 130,5
JNJ24843S11 0,1358 0,1201 0,1280 0,0111 8.7 1,8
JN324326185 0,1257 0,1257 0,1257 0,0000 0,0 1,5
3NJ24843572 0.4676 0,4803 0.4740 0,0090 1,9 51,6
Número JN3 Dados em bruto Média S.D. %cv % Controle
meio condicionado 0,6935 0.7803 0.7369 0,0614 8.3 104.8
Nenhum tratamento 0.4735 0,6069 0,5402 0,0943 17,5 71,5
AA apenas * DMSO 0,1428 0,1656 0,1542 0,0161 10,5 6,3
AA * Wnt3a * DMSO 0,5702 0,8468 0,7085 0,1956 27,6 100.0
3NÚ24843S85 0,1599 0,2380 0,1990 0,0552 27.8 13,8
JNJ25753520 0,1287 0,1244 0.1266 0,0030 2,4 1,6
nenhuma 0,1241 0.1100 i :i;|iii 0,0100 8.5 0.0
Nümsro JNJ padas em bruto céiuía L
3N925753403 0.1235
9N925757173 (
0,1278
9N92S7S7173 0.1174
0.1162
JN925757238 1.1100
9N325758707 0.1247
0,1115
9N925758883
0.9218
UN325873418
0.1809
0.30
0,1892
JNJ25909854
0.2492
3N925900706
314928047723 ),1106
9MJ26054O12
0.1445
JM926064571
3N926067626
9N326G67652
0.1467
3N926069901
0,2754
3M328077883
9N926116922
0.4319
JN926120801
0.1469
JNJ26120614
314928128726
0,6887
1.5860
JN326130403
0,1141
0.1094
314926134771
0,2774
JN928180202
JN326153647
0,6804
9M92G158015
0,7125
9N9281S8054
0.1446
3N326158083 ,0966
123
Número JNJ Dados em bruto Média SJX % CV % Controle
JNJ26158106 0,3167 0,3415 0,3291 0,0175 5,3 35,8
JNJ26161343 0,1261 0,1144 0.1203 0,0083 6,9 0,5
JNJ261707B4 0,2223 (),25)30 0,2577 0,0500 19,4 23,8
;JNJ26170820 0,1265 0,1236 0,1251 0,0021 1,8 1,3
JNJ26170833 1,1940 0.9431 1,0686 0,1774 16,6 160,9
JNJ26177086 1,0689 0,6879 0,8784 0,2694 30,7 1.28,7
JNJ26177762 1,0444 0,7603 0,9024 0.2009 22,3 132.8
JNJ26184467 0,1443 0,1209 0,1326 0,0185 12,5 2.6
JNJ26219050 0,1152 0,1309 0.1231 0,0111 9,0 1,0
Número JNJ Dados em bruto Média : Aa %cv % Controle
mó condicionado 0,7590 0.7451 0,7521 0,0098 1,3 98,0
nenhum
tratamento 0,5687 0,4490 0,5089 0,0846 18,6 60.4
AA apenas * DMSO 0,1988 0,1522 0,1755 0.0330 18,8 8,9
AA * Wnt3a * DMSQ 0,683? 0,8460 0,7649 0,1148 15.0 100,0
JNJ26219063 0,1911 0,1101 0,1506 0,0573 38,0 5,0
JNJ26220454 0,2772 0,1'151 0,1962 0,1146 58,4 12.1
nenhuma
célula 0,1278 0,1084 0,1181 0.0137 11.6 0,0
JNJ26241774 0,1443 0,2120 0,1782 0,0479 26,9 9,3
JNJ26241917 0,441'3 0,2238 0,3326 0,1538 46,2 33,2
JNJ26243204 0.1098 0,1085 0,1092 0,0009 0,8 1,4
JNJ26247143 0,1389 0.2147 0,1788 0,0536 30,3 9.1
JNJ2624872S 0.1852 0,1342 0,1597 0,0361 2.2.6 63
JNJ26261105 0,1114 0.1295 0,1205 0,0128 10,6 0.4
JNJ26361712 0,5375 0,6158 0,5787 0,0554 9,6 70,9
JNJ26361725 0.1259 0,1441 0,1350 0.0129 9,5 2,6
JNJ263GS730 0,1206 0,1312 0,1259 0,0075 8.0 '1.2
JNJ26367S91 0,2269 0,2857 0,2563 0,0418 16,2 .21,4
JNJ26367991 0,1140 0,1079 0.1110 0,0043 31 ·: -1.1
124
Número JNJ Dados em bruto Média S.D. % CV % Controle
JNJ26399S06 0.9589 9,8868 0.9229 0.0510 5,5 124,4
JNJ263S99Õ8 1,0442 0.9622 1,0032 0,0580 5.8 136,8
JNJ2639994S 0,1961 0.1735 0,1848 0,0160 8,6 10,3
JNJ28399971 0,5732 0.5216 6,5474 0.0365 6,7 66,4
JNJ26399984 0,1273 0.1217 0,1245 0,0040 3.2 1.0
JNJ28399997 0.5932 0,6671 0,6362 0,952.3 8,3 79,2
JNJ28400049 0,1444 0.1356 6.1406 0,0054 3,8 3.5
JNJ28483197 1,0786 1.0891 1,0839 8,0074 |,||( 149,3
JNJ26483310 0,5418 0,2338 0,3878 0.2178 56.2 41,7
JNJ26483223 0,1268 0.2052 6.1660 0,0554 33,4 7.4
JNJ2S48323S 0.1169 0,1184 9,1177 0,0011 0.9 -0,1
JNJ26483249 0,8618 1,0400 0,9509 0.1260 13,3 128.8
JNJ2S483249 0,8430 1,0187 0,9309 0.1242 13,3 125,7
JNJ26483262 0.3859 0,3188 0.3414 0,0347 10,2 34.5
JNJ28511991 0,9184 0,8118 0,8850 0,0755 8.7 115,5
JNJ25511927 0,2384 0,3156 0.2770 9,0546 19,7 24,6
JNJ265119S3 0.2297 0,1489 0.1883 0,9585 31,1 10,9
RWJ87694 0,1955 0.1258 0.1606 0,0494 30.8 6,6
RWJ676940 0,1658 0,1704 0,1681 0.0033 1,9 7.7
RWJ677545 0,1399 0,1303 0,1351 0,0068 5.0 2,6
RWJ878986 0,1234 0.1236 0,1235 0,0001 0,1 0.8
RWJ6BOS65 0.1397 0,2147 0.1772 0.0530 29,9 9,1
RWJ880SS7 0,1218 0,1310 0,12.64 0,0065 5.1 1,3
RWJ88GS68 0,1458 0,1981 0.1‘719 0.0371 21,6 8.3
RWJ980669 0.5412 0,1898 0,3655 0,2465 88.0 38,2
RWJ6308S8 0,1996 0.1245 0,1621 0,0531 32,8 8.8
RWJ68G858 0.1418 0,2014 0.1716 0.0421 24,6 8.3
RWJ680879 0,1198 0,1197 0,1152 0,0064 5.8 -0,5
RWJ680885 9,1159 0.1272 0,1216 0,0089 8,6 0.5
S E Dadas em bruto Média S.D. %CV % Controla
meio condicionado 0,8077 0,7210 0,7644 9,0613 8,0 74,7
Número JNú
Dados em bruto
Média | S,D, I%CV %
Controle sem | tratamento 4- l
DMSO
0,4073
0,4356 0,0400
AA7Wnt3a
0.9935
JN3102.227841 0.3095
0,9055
5
JNJ10.222927 0.3519
JNJ10231273 0,1609
JNJ10259847 0,5020
0,4114 0,0841 20,4
0.1442^0.0236 16,4
0,387?! 0,1617 41.7
0NJ10259847 0.3413
0,4146
JNJ17154.215| 0,1176
3NJ17154215 0,1148
1,1410
JNJ17157659 0.2394
0,2450
IJNJ17163042 0,3672
0.3098
JNJ101665651 0
JN317174664
0,47141 0.0516
JNJ17187027
0,1076
0,1168
JNJ17187063
9,2569
JNJ17193774
JNJ17200976
JNJ17205955
JNJ17205955
JNJ17205994
JNJ17226703
JNJ17982133
JNJ17969049
0,2151
0.2846
0,1168 ),1168
0.1137
0,1154
0,4588
0,3081
0.4376 | 0.3611| 0,1082 30.0 | 28.. 1
0,1136 | 0,1152! 0,0023 2.0 I •0,3
0,1152 ! 0,116θ! 0.0011 1.0 I 0,2
0.1195 I 0,116β| 0.0041 3.5 1 0,1
0,1152 ! 0„1153| 0,0001 0.1 I -0,3
0,2353 0.2521 I 0,227110.0117 1 ..................1..... | 0,3555| 0.1462. £? ·* Í Μ Λ /χ Λ*Χ 27,5
0,1961 | 0.2521 0,0792 31,4 | 15.5
I média S.D. %CVlCootrule
Número JNJ iDades em bruto
meie | 1 1 í
con dí cia na d si 0.7914 1,1189 I 0.9552| 0.2316 24,2 I 93,3
nenhum | I tratamento j 6.4215 3.5259 j 0,4/3/10,0738 | 15,6 | 39,8
i nenhuma | I s I
i célula 00,1152 0,1160 | 0.115610,0006 0,5 ! O.Q
[ A.A/Wnt3a | 0,7168 0.8836 1 1,015l! 0,2016 19,9 I 100,1
Número JNJ Dados em bruto Média S,D, % CV % Contrate
RWdS80991 0,2882 0,2308 0.2844 0.0409 17,6 18.8
RWJ680092 0,3049 0,2845 0.3127 0,0282 9.0 21,9
RWJ880993 0,5403 0,2570 0.3855 0.1332 34.6 30,0
RW368T14Ô 0.7323 0.3034 0,4388 0,2041 46,5 35,9
RW3881142 0,1185 0,1218 8,1199 0,0018 : 17 0.5
RWJ681146 0,2496 0,2683 0,2302 0,0376 16.3 12.7
RWJ681945 0,1548 0.1356 0,1513 0,0134 8.8 4.0
RWJ88198 0,1555 0,1450 0/1581 0,0161 10,2 47
RWJ682205 0,2347 0.1920 0,3785 0,2589 68.4 29.2
RW4447228 0,1542 0,2093 0,3793 0,2585 68,2 29,3
RWJ675430 0.7223 0.8707 0,4291 0.2452 57,2 34,8
RW355923 0,6258 0.3192 0,3354 0,1667 49.7 24.4
Tabela Vil·. Efeitos de inibidores de atividade de enzima GSK-3B na diferenciação e proliferação de cêlulas-tronco embrionárias de ser humano
Lista de ciclos fartes Lista de ciclos moderados
>-'120% de contrate 80 a 12039 de contrate
Número JNJ % de vaiar de controle Número JNJ % de valer de contrate
RWJ352628 195,3 JNJ26511901 ................................................
JNJ2S188093 183.8 RWJ676431 113,3
RWJ353258 180,4 RW3673515 108,3
JNJ2S170833 160,9 JNJ26533156 105.5
JN926150202 154.6 JNJ26153647 102,7
JNJ25757238 154,1 RWJ676639 93,0
JNJ19410833 151.6 JNJ26128726 88.0
JNJ264831S7 149.3 JNJ10222784 85,5
JNJ18187711 148,0 RWJ87857 84,7
RWJS76139 147.3 JNJ26512005 64.0
JNJ20077883 146,2 JNJ19410859 80.3
RWJ35219Q 142.3 JNJ26399997 79.2
JN02639990S 136.8 RWJ676137 77.5
Lista de cicias fortes
>“1203« da controla
Número ÚNd % da valer da i controle í
JNJ19370026 136,1
JNJ20177762 132,8 |
RWJ676432 131.6 |
4NJ25758S83 131,2 1
RW3675430 130.9 1
JNJ24843611 130.5 I
RWJ675605 129,0 |
JN926483240 128,8 1
4NJ26177086 128,7 I
3NJ20483240 125,7 |
3NJ28399906 124,4 1
RWU678948 120,0 I
Lista de cicies moderados a 120%: de controle
Número JNJ j
RWJ675260 |
RWJ355923 |
RWJ675266 | JNJ26116922 [ JNJ26361712 I
RWJ670804 I l
RWJ675881 |
JNJ26158015
RWJ352.244
RWJ674239
JNJ26399971
JNJ28714194
JNJ20533065 % de valer de contraio
76.9
76.7
75.2
71.4
70.9
70.7
69.9
88.7
2
67.4
66.4
63.3
61.1
130

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para expandir e diferenciar células pluripotentes, que compreende as etapas de:
    а. . Cultivar células pluripoterdes. e
    5 b, Tratar as células pluripotentes com um imbiber de atividade da enzima GSK-3B,
  2. 2. Método, de acordo cem a reivindicação 1, em que as células pluripotentes são çélulas-tronco embrionárias.
  3. 3.. Método, de acordo com a reivindicação 1( em que as 10 células pluripetentes são células que expressam marcadores de pluripotência derivadas de células-tronco embrionárias.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que as células que expressam marcadores de pkmpoténcla expressam pelo menus um dos seguintes marcadores de pluripotência selecionados do grupo que consiste 15 em: ABCG2, cripto, FoxDS, Connexín43< Connexin45. Octd, SOX-2, Nanog., hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4. Trai-60, e Trai-81.
    б. Método, de acordo corn a reivindicação 1, em que as células pluripotentes são diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo.
    20 6. Método, de acordo com a reivindioação 1, em que as células pluripetentes são tratadas com o inibidor da atividade da enzima GSK-3B por cerca de uma a cerca de 72 horas.
    7, Método, de acordo com a. reivindicação 1, em que as células pluripotentes são tratadas com o inibidor da atividade da enzima
    2.5 GSK-3B por cerna de 12, a cerca, de 48 horas.
    8, Método, de acordo cem a reivindicação 1, em que as células pluripotentes são tratadas com o inibidor da atividade da enzima GSK-3B por cerca de 48 horas.
    9, Método, de acurdo com a reivindicação 1, em que o inibidor 3U da atividade da enzrma GSK-38 è usado a uma concentração de cerca de
    100 nM a cerca de 100 pM.
    10. Método, de acordo com nibidor da atividade da enzima GSK-3B é a reivindicação 1, em que o usado a uma concentração de cerca de 1 pM a cerca de 10 pM,
    11. Método, de acordo com nibidor da atividade da enzima GSK-3B é a reivindicação 1, em que < usado a uma concentração d£ a de 10 qM.
    12. Método., de aoordo oom a reivindicação 1. em que o inibidor da atividade da enzima GSK-3B é um composto da fórmula (l):
    Formula (l)
    3 Mètodc a reivindicação 12., em que Fl· é ferula, feniía substituída em qua os substituintes de temia são selecionados do grupo que consiste em alquila C<.3> halogênio, nitre, trifluurornetila e nitrilo, ou pirimidinila.
    14 Método, de acordo i reivindicação 12, em que Fl· é feniía, feniía substituída, em que os substitutntes de feniía sãu selecionados do grupo que consiste em alquila C<,3> halogênio, nit.ro, trifluorornetih e nitrilo, ou pirimidinila que é opcionalmente alquila CM substituída, e pelo menos um dentre Fl· e R2 é pirimidinila.
    15 Método, de acordo com a reivindicação 12, em que R* é hidrogênio, Z-CtrimefilsiliOetoximetila, alcóxicarbonila Cu, arilóxi carboniia, aril G-j-selquiloxicarbonila, ariiCMalquila, arila C?.5alquila substituída em que u uni ou mais substitulntes de arila são independentemente selecionados do grupo consistindo em alquila (>..«, alcô.xi Chalogênio, amino, alquitamino Cu, e diCs.-i-alquilamino, ftalirnido Cj^alqulía, amíno C<.saíquM diamine C<,-feíquiia, succinimide ü-í.^alquila, alquiicarnuniia Cm, ariicarbonila, alquilcarbonil Q<.saíquiía Cm e anioxiuarbonil Ci.-jaíouila.
    Al· (CH .ção 16. em que A viaileno, etindeno ou
    18.. Método. de acordo corn a reivindicação 17, ern que Rg ê selecionado do grupo que consista em hidrogênio, alquila C-s.g. fenila e fenil 5 Cp.^alquiia
    19. Método, de acorde corn a reivindicação 16. em que q é 0-9.
    26. .Método, de acordo com a reivindicação 16, em que X é selecionado do grupa consistindo em hidrogênio, hidròxí. vinda, víníla substituída em que um ou mais substituintes de vinila sao, cada um, 10 selecionados do grupo consistindo em flúor, bromo, cloro e iodo, etinila, etinila substituído ern que os substituintes de etinila são selecionados do grupo consistindo em flúor, bromo cloro e iodo, alquila C-;.», alquila. C?.s substituída em que o um ou mais substituinte de alquila sao, cada um, selecionados do grupo consistindo em alcóxi Ch.g. trihaioaiquiia. ftfaümidoe 15 amino, cicloalquila C%?< sluúxi alcóxi Ch,·» substituído ern que os susbtituintes de alquila sao selecionados do grupo consistindo ern ftaiimído e arnino, ftfalimidooxi, fenóxí, fenóxi substituído am que o um ou mais substituintes de fenila são. cada um, selecionado do grupo consistindo em alquila C?>;( halogênio e alcóxi Ch.g, fenila, fenila substituída em que o um 20 ou mais substituintes de fenila são. cada um, selecionados do grupo consistindo em alquila Ομ«, halogênio e alcóxi arila Ch.$alqmla, aria Cí.saíquila substituída ern que o um ou mais substituintes de arila são. cada um, selecionados do grupo consistindo em alquila Ch.$.. halogênio e alcóxi C<,s, arilóxi Cugalquifemino, aiquílamino C<.$. diCv«alquilamino{ nitrilo, 25 eximas, benxiloxiímino, alquiloxiimino Ch.su ftalimido, succinimide, alquilcarôonilóxi Crg, feniicarboníloxi, fenilcarbonilóxi substituído em que o um ou mais substituintes de fenila são, cada, um, selecionados do grupo consistindo em alquda C1.5, balogémo e alcóxi Ch.5, tenílC-.^alquilcârbonilcxi em que o um ou mais substituintes de fenila são, cada um, selecionados do 30 gmpo consistindo em alquila G^.g. halogênio e alcóxi (X.S; aminocarboniloxí. alquílaminocarboniloxi diC^alquilaminocarbomloxí, alcoxicarboniloxi C-.-s, aícóxicarbonilóxi C1.5 substituído em que o um ou mais substituintes de alquila são, cada um, selecionados do grupo consistindo em media, atila, isopropíla e hexüa, fenoxicarboniloxi, fenoxicarboniloxi substituída em
  5. 5 que o um cu mais substituintes de fenila são, cada um, selecionados do grupo que consiste em alquila CA.»,, alcóxi Cus e halogênio, alquiltio C5.?„ alquiltio C 1.5 substituído era que os substituintes de aquila são selecionados do grupo que consiste em nidróxi e ftalimido, alquilsuífcniía femísulfomla, femlsulfónila substituída em que 0 um ou mais substituintes
    10 de fenila são, cada um, selecionados do grupo que consiste am bromo, flúor, cloro, alcóxi 0ν<, e trifuorometila; corn a condição de que se A for q for 0 e X for H, então Rj pode não ser 2-(tnmetílsilil)etoximetiÍa; e sais farmacesticamente aceitáveis dos mesmos.
    21. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que R; è
    15 fenila substituída e R;> á pirlmidin-3-iís.
    22. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que R< é 4fíuoro fenila.
    23. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que R-s é hidrogênio, ariia Casalquiía, ou arila C alquila substituída.
    20 24. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que Rs é hidrogênio nu fenila ('Aralquila.
    25. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que A ê ebnileno e q é 0-5.
    26. Método, de acordo corn a reivindicação 16, em que X é
    25 succinimide, hidróxi, rnetiía, fenila, alquilsulfonila C<.$, cicloalquila C^·, alquilcamcnilúxi Ον-?, alcóxi C<.&. fonilcarbonilóxi, alquiíamino (A.s. diCv f,a Iq u í I amino ou n it rí Io.
    27. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que o composto da fórmula I è 4-(4-tluoro fenil)-2-í4-hidroxibutin-1'd)-143-feníl
    30 propii )-5-(4 -pirld üa)imíd azol,
    28. Mètodu, de acordo cam a reivindicação 1, em que ό inibidor da atividade da enzima GSK-3B è um composto da fórmula (li):
    R'
    Fórmula (II)
    29.. Método, de acordo oom a reivindicação 2.8, em que R è selecionado de um grupo que consiste em Ra, -Cbgalquiía-Rs, -C-. galquenila-Rg, -C^^alquínila-Rs e ciano,
    30. Método, de acordo com a reivindicação 29, em que Rs ê selecionado do grupo que consiste em cicloalquila, heterociclila, arila e heteroarila>
    '31. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que R5 ê selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, -C^alqulla-R^, -¾. galqueníia-R'\ •C^alquinila-R·'; -C(O)-(Gvg)alqu}la-Rô. O(O)-arila'RÃ, --0(0)-0(CvS)alquila-R'\ -C(O)-aaríla-Rs t ••C(O)-NH(Ci.«alquila-Rs)„ -G(O)-NH(arilaRá), -C(O)-N(G<.galquila-R^a, -SOHCi.s®quiia-R* -SOj-adla-R8, -cicloalquila·· Rb, -neterociciíla-R^ -arila-R* e -heteroarila-R*; em que a heterocícilla e a heteroanla são fixadas ao átomo de nitrogênio do azaindol na uma posição através de um átomo de carbono de anel de heterociclila ou heteroania,
    32, Método, de acordo com a reivindicação 31, em que R5 é 1 a 2 substituirdes independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, □·{€·>.^síquila, -CHCí..f;)aíquilaON, -O-(C<^)alquila-O-(Ct^)alquilaf -Q-(C i ,s)alqulla-N H>. -O-(G < .g)alquiía-NH(C < .saiquiia), -O-(C i..si)alquila-N(C &alquila< -OdCi.ajalqr.iiia-S-iCsí.çalquíla, -OdC^ialqulia-SOsdCA^alquila, -0(C j ,8)alquila-SOrNH2, -O-(G ? .g)alquilâ-SOr NH(C i -s.alquüa), -O-(C s.<j)alquila··
    SO.?~N(Cí .&alquita)s, -0-0(0)1-I, -O-CÍOl-ÇC-.^alquila, ·0··0(0)-ΝΗ£, -O-G(O)NH(Cí,®quila), -O~C(O)-N(G?,saiquiiaL, -O-tC^galquiia-C(O}H, 0-(0 i.^lalquila
  6. 6
    G(Uj·{(Aígaiqusla, O-Kc-s/alquila-COjH, Ad-tCi.gjalquíla-CfQl-O-CU-i.spaíquila, O(Vb$)aíquiia~G{G)NH2) OqG-j.g)&sqU:la-G(O)-NH(G-!.8aiquila), O(Gí.g)aiquiíaC(O)-N(C5«alquilah, Ό(Ο)Η, -C(O)-(C<.s)alquha. -GO«H, -C(O)-O-(C:«)alquila, C(O)-NH;;, C(NH)NH?; CfOj-NHfGvs^qaila). -C{O)-N(Ci.galquila)2, -SH, -S5 iC««)alqusla, -S-(C^)alquila-S-(Cvs)alquila. -S-(C,«)alquila-O-(C^)alquíta, -S(C^s)aíquilaO-{C^8)aiqüíla-OH, -S4C<.8)alquíla<O-(Ci.s)alquila-NH3, ·8··(0ν gjaiquila-O-CCvgjalqqila-NHCC^alquila), -S-(C?«)alquila-O-(C5.8)alquila-N(Ci. 8alquiía)2, -S-{Gí,e)alquila-NH(Cí «alquila), -SC^C^yjaiquHa, -SOs-NH^, -30?NHCC^galquila), -S02--N(Cb«8lquil3h, -N-FV, ciano. (hafo);.«, hidróxi, nitro, oxo. 1Q ddaalquiia-FT; -heteraciolila-R5, anla-FG e -heteroarila~R$.
    33. Método, de acordo com a reivindicação 31, em que Rf' é de 1 a 4 substituirdes fixados a um átomo de carbono ou nitrogênio índependentemente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio, -C-... «alquila, C2.8aiquenila, 'Cs.galquinila, -C(O)H. -Q(O)-(CS.sialquíla, -CQ^H. -
    15 C{O)-O--(C ^alquila, G(O)-NH.S, -C(NH)-NH3. -C(0)-NH(C^alquila), -C(0)NfC^alquílah, -S024CM)aiqu!la} -SO^NH2, -S0rNK(C ^alquila), -SO?N(C í «alquila)?, -(C<,8)alquila- N-R\ RÜ<.8)alquiia-(halo)i.3, -(Ci.Qalquila-OH, anla -FA -(Cv^alquil-arila-R3* e -(CusIalquil-heterosala-R^ com a condição de que, quando Rb estiver fixado a um átomo de carbono, Rb é, ainda,
    20 selecionado a partir do grupo que consiste em ~C<.8alcóxit ~(C^)alcóxi-(haloH
    - SH, -S -(C^)alquila, N-R/, ciano, halo, hidróxi, nitro, oxo e -heteroarila-Rs.
    34. Método, de acordo corn a reivindicação 33, em que R:? ê 2 substituirdes, independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, -(^.«alquila, -C2«alquenüa, -C?yalquiníla, -(Cv
    25 Uaiquila-OH, ••(Cr.gtai.quila-QMGi.glalquiia, -(ÍT,g)alquila-NHSr -(C;..s)alquila· NH(C(«alquila), -(C^«)alquila-N(Crôaíquila)2, -(Ct.$)alquila-S-(C5«)alquila, G(0}H, .gjalqu iia, -G* Üg-O-(C i .«lalquila, ~G(O)~Nh2j -G( 0 )· N H(C <.
    «alquila), -0(0)-N(0?.«alquila)?, -SO?-(G ;..s)alquíla, -SOs-NH?, SOs-NH(C<. «alquila), SO^-NCC^alquda)?, -G(N)-NI-I;;:, -uicloaiquila-Rt;. -(C<.«ialquil30 heterocicliia-R3. -arila-R5, -({:R.«)alquil-arila-R$ e -(Qj.gjaiquii -heteroarila-R5·.
    35. Método, de acordo com a reivindicação 31, em que FV é de 1 a 4 substituintes fixados a um átomo de carbono ou nitrogênio ndependenternente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio, -C<. ^alquila, -(Cí«)alquiía4haio;h..3 e -(Cr$)alquila-OH; com a condição de que, quando R8 estiver fixado a um átomo de carbono, R* è, ainda, selecionado do grupo consistindo em -«δalcóxi, -NH?, -NHCC-s^alquile), N(C^alquíla)2, 5 ciano, halo, -(C^lalcaxi-fhaloHm hidróxi e nif.ro.
    36. Método, de acordo com a reivindicação 31, em que R é 1 a 2 substituirdes independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, -C^alcóxi, NH^. -NH(C<ealquHa). -N(G^alqulla'h, ciano, (halo);.,>: hidróxi e nitro,
    IQ 37. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que R:’ é um substituinle fixado a um átomo de carbono ou nitrogênio selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, -C^alquila-R*, -C2.3alqueníla-R^, -C^alquiniía-R&, -C(O)H, -0(0)-(0,.^aiquila-R3, -C(O)-NH2< -C(O)-NH(C,. Salquila-Rh. -CíO)- N(G.;..salquila-Ry)2, -C(G)-NH(ama-Rs)< -G(0)-cicloalquila15 R°. -G(O)heíerociclila-Rfe} -CfQVarito-R*, -C(O)-heteroarila-Rs, CO2H, 0(0)-0-(C i,s)alquila-Rô, -C(O)-0-arila-R*, -SOj-(Ci .s)aIquila-R* SO?·ariiaRG ddoaíquila-R8, -arila-Ra a -(Ci.^alquila-N-RE com a condição de que. quando R* estiver fixado a um átomo de carbono. R2 é, ainda, selecionado do grupo que consiste em G^alcoxi -Rf\ -N-R\ ciano, halogênío, hidróxi, 20 nitro, oxo, - heterocidila- P? e -heferoarila-R8.
    38. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que R' é de 1 a 3 substituirdes fixados a um átomo de carbono índependentemente selecionadas de um grupo consistindo em hidrogênio, -Gt.^aiquila-R·0, 0^ Salqueni!a-R% Cs^alquinila-R10, -Cbsaloóxi-R^', -C(O)H, -C(0)-(0v 25 s)alquila-R5v -G(O)-NH2, -C(O)-NH(Cveaiquila-R*), -C(O)-N(CMalquíla-R9h, CíOVcidoalqulia-R'; -C(O)-heterociclila-Rs, -C(Q)-arila-Rs, -G(O)·· heteroarila -RA -C(NH)-NH2. -C(<H, -G(Q}-Q-(G< ,5)aIquila-R*, -C(O)-O-adia· RG -SOríCv^alquila-RG •SOjmdla-R’3, -N-Rc ciano, halogênio, hidróxi, miro, -cicloalquila-R8, -heterocicHla-R&, -arila-Re e ~heteroarila-Re
    30 39. Método, de acordo cam a reivindicação 38, em que RL ê 1 a 2 substifuintes independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, -NR?, -NH(C-;..gaiquila), '•NíC^alquilah, ciano, (haío)<.3, hidróxi, nitre e oxe.
    40. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que R4 é de 1 a 4 substiluintes fixados a um átomo de carbono mdependentemente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio, -(%.§aiquila-R;0, -(%.. ^alquenila-R5'3. •Cz.salquinilaR11 C;..§alcóxi-R31S. C{O)H. -0(0)--((%..
    S)alquila-R\ --0((3) NH2, 0(0) NH(0;..§alquila-R?), -0(0) -N((%.^alqu:la--R)2: -0(0)cidoaiquiiaRá, O(O)--heterociulilaRÃ, -C(Q) ania-R®, -0(0)heferoarila-Ró, -C(NH)-NH2, CO2H. 0(0) Q-(C-;..s)alquila-R, -C(0)-O--adlaRs, -SH, -S-(Q-,..g)ai.qu.üa-R';j, -SO^-(Cf.^)alquiía-R;i, SCb-arda R'··, -SO.2-NH2, -SCq-NHfCvsaiquila-R'b, -SCb-NíC?^alquiia-Rv)2> -NR', ciano, halogènio, hidróxi. nitro, ••cicloalqulfa-R^, -heteroeiclíla-Rl -arila-R^e -heteroariÍa-R?í.
    41. Método, de acordo com a reivindicação 40, em que Riü é 1 a 2 substituirdes independentemanie selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, -NHs, -NH((%.^alquila), -N(C,..galQuila)2, ciano, (halo)^3, hidróxi. nitre e oxo.
    42. Método, de acordo corn a reivindicação 28, eru que Y a 2 são independenfemeute selecionados do grupo formado por O, S, (H,OH) e (H.H); com a condição de que um dentre YeZéOe o outro é selecionado do grupe consistindo em O, S, (H,OH) e (H,H): e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
    43. Método, de acordo corn a reivindicação 28, em que R é selecionado do grupo consistindo ern Rs. -C^alquiia-R;s, -C2..<alqusníla--Ra. C^alquinila·-R3 e ciano.
    44. Método, de acordo com a reivindicação 29, em que Rs é selecionado do grupo que consiste em heterociclila. arila e heteroarila.
    45. Método, de acordo com a reivindicação 29, Rs é selecionado do grupo consistindo em di -hidro- piranila, fenila, natbla, tierala, pirrolila, Imidazoüia, pirazolila, piridinila, axaindolila, indazaliia, benzefurlla, benzotienila, dibenzofurila e díbenzotienila.
    46. Método, de acordo com a reivindicação 28. em que R? é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, -O^^niquila-R'', -¾.. ralquenite-Rq -C^alquimia-R^ -C(O)-íC<foalqmla-R^ -'Q(O)-arila-R\ -0(0)-0(C-M^lquila-R* -C(0)-0-anla-Rfi, -C(O)-NH(Cwalquila-R$). -C(O)-NH(ariíaR*), -C(0) N(C í ^alquila-R^h, -SOnO-aDalquila-RT -SOrarila-R”, -cicloalquilaRE -heterociclila-R*. -aril -R e -hoteroariía-R55; em que a heterociclila e
    5 heteroarila são fixados ao átomo de nitrogênio de azaíndol na urna posição através de um átomo de carbono de anel de heteroadla ou heterocíclila.
    47. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que R1 è selecionado do grupo consistindo ern hidrogênio. -C^aíquila-R, -aríh-R8 e heteroariia-R’i em que heteroarila ê fixada ao átomo de nitrogênio de azaíndol
    W na uma posição através de um átomo de carbono de anel de heteroarila.
    48. Método, de acordo com a reivindicação 28. em que R': é selecionado do grupo consistindo ear hidrogênio, -C^glquila-R* e -naftila-RE
    49. Método, de acordo corn a reivindicação 31, em que R~ è de 1 a 2 substituintes independentemente selecionados do grupo consistindo em
    15 hidrogênio, -Q-(Cb^)a?quiia, -O-(C^)alquila-OH< -Q-(Cbfoalquil -Q-(C^)alquila<
    -0-(C μ )a Iqui la-N H;>. -0-(0 < foaiquil- NH(C i^alquila). -0-(0 < >alq u i l-N(C <.
    ralquila);?, -0-(C<^)alquíhS-(C-.foalqura, -0-(C; ^alquil-SOs-CCt^a^uila. -O(C^ialquila-SOs-NH?, •O-(Cw)alquil-SOá-NH(Ci^atquila), -0-(CbXlalquil-SOaN(C:^alquilafe. -O-G(O)H, -0-C(0)-(Cw)alquiIa. -O-C(O)-NHz> -0-C(G)-NH(C
    20 «aigu-ia), -ivOtOi-NfOb^alquíia);. -Q-(C$.,<)a>quil-C(O)H. -Ο-(G-j.^ralquíl-CrO.?(Ci vájalquüa, -0-(L·b^alquila-GO^H< -0-(Ç .^jalqui·-0(0)-0-(0^.i/alqmla. -Q-(G <. ^)alquila-C(O/*-f*H2, O-'iOi.^iasquiia.^^Of-NHti.ib^aiquila), ~O~(G -,.4,ralquií~C(O)~ N(Cc4alquiía).?., -G(O)H, -G(0)-(£h.4)a.íquila, -C(0)-0-(Ci.4)alquila. C(O)-NH2. -C(NH)-NH2. -C(O)-NH(Gb4alquíla}, -C(O)-N(Ci.4alquHa)2. -SH: -S25 (Chfoaíquila, -S-(CM)alquH-S-(Ci.4)aiquila, ~S-(C;..4)alquil-O-(Gb4)alquite: -S(C< ,4)oíquil-O-(C bfoaíquila-OH, -S-(C < ^)aíquil-O-(C i^)alquila-N H?, -S-(G <, .•í)alquil-0-(Cb4)alqüil-NH(CMaíquii3), -S-(C<^alquil~O-(CM)aIquil-N(C<. «alquilah, -S-(CM)slqul-NH(Cí .«alquíla), -SO^-iC,.fooíquiia, -SOrNH^. -SOgNH(C^alquila), -SOj-NCCí^alqulla)?, -N-Rq ciano, (halo)<hidròxí, nitro, oxo,
    30 -cicloatquila-Ff', -heterocícfíía-Rv, -arila-R0 e -heteroarila-R·',
    50. Método, de acordo com a reivindicação 31. em que R5 é de 1 a 2 substituirdes independentemente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio, -O--(Cj-^alquila, -NR'. hidróxi e -heteraania-Rf>,
    51. Método, de acorde com a reivindicação 31, em que R' é de 1 a 2 substituintes independentemente selecionadas da grupo consistindo em hidrogênio. -O-(Gw)alquila. -N-R'\ hidróxi. -imidazaíHa-R6, tuazoiila-R” e detrazuüa-R0
    52. Método. de acordo cera a reivindicação 31, em que R* é de 1 a 4 substituintes fixados a um átomo de carbono ou nitrogênio independentemeníe selecionados do grupo consistindo em hidrogênio, -0-,. ^alquila. -C^aíquenila, -C;?.4alquíníla. -C(O)H. --0(0)--(0 w)alquHa, -COdi, C(O)-O-(C<>.Áalquila, -C(O)-NHa, -C(NH)-Nl-R, -C(O)-NH(Cs..raiquda), -0(0)N(CMMquilah; -SO2 -(Ore)alquiia, -SOrNH?, -SCb-NHíC^aiquüa), -SO3N(Cí^alquila}a< --(C<.4)alquita-N R;, -(C<.4)alquila~(halo);..a. 4C<.<jslquiía-OH, -adla-R'i -(C}^)alquila-arila-Rs e -(Ci^jaiquila-heteroarha-R^; com a condição de que, quando for fixada a um átomo de carbono, R é. ainda, selecionado do grupo que consiste em -Oí.íalcáxi. -(C<^)aícóxi-(haio)5.:5, SH, -S-(Cr4)aiquiia< -N-Rr ciano, halo, hidróxi. nitro, oxo e -heterosrila-R'*
    53. Método, de acordo com a reivindicação 31, em que RC1 è hidrogênio.
    54. Método, de acordo com a reivindicação 33, em que R,? é 2 substituintes independentemente selecionados da grupa consistindo ern hidrogênio. -CMalquila, -C^alqueniia. -C^aíquinila. -(Ci..<)aíquiía OH. -(C;. 4)alquü-O-(C^.^)alquíla, -(Ci.4}alquila-NHs, ACi.^alqud-NHCCMalquila), -(Cv 4)alquil-N(C-í...-íalquiiah, (Cj.,?,}alquii--S--(Cí ..-;}alquila, -Ü(O)H, -CfO'HCR. 4)alquila, -C(Q)-O-(Cv4aÍquiia, -C(O)-NHX. -C(O)-NH(C;^alquila). -C(O)N(Q-;..<alquilah, ••SO^--(Ci.<)alquitei -SOrNH?, -SOrNHCCwalquila), --SO2N(Cr^alquilajs. -C(N) NH?. -cscloalquila-R2. -(Cj.^alquila-heteroclclila-R^, arila--Ra, --(CV4jalquil-anla-R* e -(C <.4)alquii-heteroarila*Rs.
    55. Métodc-, de acordo com a reivindicação 33, em que Rz é 2 substituintes independentemente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio, -C^alquila, -C(O)H, -C(O)-(Ct.4)aiquila. -C(O)-O-(Cv4)alquila. SOrNHz. -SOz-NHfC«^alquiia) e -SOa-NfCi^alquila^.
    56. Método, de acordo com a reivindicação 31, em que FF ei de 1 a 4 substítuintes fixados a um átomo de carbono ou nitrogênio
    5 indepeudentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio.. C^ãlquíla, (C1^}alquüa-(ha!u)-;.3 e -(C^)alqoiía-OH; com a condição de que, quando Ra estiver fixado a um átomo de carbono. Re é, ainda, selecionado do grupo que consiste em -Ci^aloõxi, -NH2, -NH(C<.^alquiia), N(Ci^álquiíah, ciano, halo, -((%.4)alcóxi -(haio)í.;, hidróxi e mtro.
    10 57. Método, de acordo oom a reivindicação 31. em que Rs é hidrogênio..
    58. Método, de acordo com a reivindicação 31. em que R!í é de 1 a 2 subsíituintes independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, C^alcòxi, -NH?: -NH(Cr.AalquHa): -NCC^alquda)?,
    15 ciano, (halo)<3, hidróxi e nitro.
    59. Método, de acordo com a reivindicação 31. em que R9 é hidrogênio.
    60. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que R2 é um substituirdes fixado a um átomo de carbono ou nitrogênio selecionados
    26 du grupo consistindo em hidrogênio, -C^eíquila-R', O^alquemla-R5. -Cs.
    .íSÍquinila-R\ -C(O)H, -0(0)-((%.4)alquila-R\ -CUOTNHs. -Ο(Ο)··ΝΗ((%. ^alquíla-R8), -O(G)-N(C^4aÍquii?s-R'J)a. -CíGi-NHfaríla-R®), -C(O)-cicloalquilaR';, -C(0)-hetefocicHla-R^, -CCOJ-anla-R^ “C(O)-heteroarila-Râ s -CO^H, 0-(0)-0-(0^.4)alquila-R''', -CO-G-arlía-R*. -SO?-(CM)aíquila-R:\ -SO^-arila25 R°, -oiclosiquila-R^, -arila-R' e -(G^jalquila-N-R'; corn a condição de que, quando R2 é fixado a um átomo de carbono, ÍV seja, ainda, selecionado do grupo consistindo em ~G^aícõxi-R\ -N~R\ ciano, halogênias, hidróxi. nitro, oxo, -heferooichia-R0 e -hetercaríla-R5,
    61. Método, de acordo com a reivindicação 2.8, em que Rí; é
    30 um substituirdes fixado a um átomo de carbono ou nitrogênio selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, -C?.4aiquila-Rfí, -CjMalquenila-R5, -C2.. .utoquinila-RG -0(0)-0-(0r^jalquila-R, -cioioalquila-R'·, -anla-R5 e (Cu.palquila-N-R'; com a condição de que. quando R':' estiver fixado a um átomo do mirogênio, um sal quatêrnlo não seja formado; e, com a condição de que, quando R? estiver fixado a um átomo de carbono, R? é, ainda, selecionado do grupo consistindo em -Cí^alcòxi-R3, -N-R', dano,
    5 halogénios. hidróxi nitro, oxo, -hoteruoiclils-R* e -heteroarila-R§
    62. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que R:; é um substituinte fixado a um átomo de carbono ou .nitrogênio selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, -C^alquíla-R* e aula--R's; oom a condição de que, quando R* estiver fixado a um átomo de nitrogênio, um
    10 sal quaiêrnio não seja formado; e, com a condição de que quando R2 è fixado a um átomo de carbono, R2 seja, ainda, selecionado do grupo que consiste em -N-R’, halogêoios, hidróxi e -heteroarila-RI
    63. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que R3 è de
    1 a 3 substituintes fixados a um átomo de carbono independentemente 15 seledonado do grupo consistindo em hidrogênio, -C^alquila-R-CG.
    iaiqueniia-R''1 C?.ia!qumi!a-R'°, -C<.toloòxi-R ’-·Ο(Ο)H, ··C(O)-(C·<,4)aIquilaR'\ -C(O)-NH2, -C(Õ)-NH(CV4alquiia-R§). -C-(O)-N'(C^alquila-R'*h: -C(O)ciolc-alquila-RÃ, -CXOj-hetemcicíila-R3, -ÜÇQj-aríla-R3. --ClOJ-heteroanla-R^, CtNHj-NHy. CO;>H, -C(O)-O-(C < .<< )alq ui Ia- R§, -0(0)0- arila - Rs, - SO?-(CG. 2G S)alquila-R'\ -SO^-arila-R^, -N~.R;, -(Ct^jàlquila-N-R^ ciano, halogênios, hidróxi, nitro, eidoalquila-Ríí, -heterociolila-R3, -arlia-R'* e -hoteroarila-R3,
    64. Método, de acordo oc-m a reivindicação 28, em que R3 é um substituinte fixado a um átomo de carbono selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, -Cu^alquila-R'0 -C^alquenila-R’^, -Cs.
    25 ^alquiniia-R’^ -C-i.,.iaic.óx.i-R',I't, -C(C))H, -C02H, -NHS. -NH(C^alquila), -N(Cí..
    .^alquila)?., ciano, halogénio. hidróxi e nitro.
    65. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que RJ é um substituinte fixada a um átomo de oaibono selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, -Cí.4alquila--R’y, NH?, -NH(Ci.4aiquils), -N(Ch.
    30 ^alquila)?, haiogênios a hidróxi.
    66. Método, de acordo som a reivindicação .28, em que R* é de 1 a 4 substituintes fixados a um átomo de carbono independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio. -C-Malquila-R'0, ·(%. 4alquenila-R\ -C^alquinila-R'0, -G^olcóxi-R10, -C'{O)H: -C(Q)-(C<. A)alquila-Rs, -C(O)-NHj, -C(O)-NH(C<.4aIqulia-R§). -C(O)-N(C <.4alquiía-R V -C(CJ) -cidoalquiia -R*, -C(O) -heterocíchla-R8. -CtOJ-arila-R6. -C (O)* heteroante-R*. -G(NH)-NH-b -C(ü)-G-(Ci.4)alquíla-R$( -C(Q)-O-arila·· R'Ç -GR, -S-(CM)aíquila-R·0, -SOHC^alquila-R0, -Sas~anía-R8, -SOz-NHz, -SOz-NHCCt-salquila-R^ -SOrNCC^alquila-R^h, -N-Rh ciano, halogènio., hidróxi, nstro, -cicloalquiia-RT -heterociclila-R8. -arila-R® e heteroarila-R5,
    67. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que R4 é de 1 a 4 substituintes fixados a um átomo de carbono independentemente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio, -Ci.4elquila-'RU;, -C?. «alquenila-R™, -C^alquinlia-R*', ΧΤ^βΙοόχί-ΓΡί -C(O)H, -CQ;?H. -NH>, NH^^^alquila), -N(G<4alquila)?;. ciano, halogênio, hidfòxi. nitro, oicloaíquiía, '-noterocio!iIa, -ariía e -hetercanla.
    68. Método, de acorda com a reivindicação 28, em que R* é de 1 a 4 substituintes fixados a um átomo de carbono independentemente selecionadas do grupo consistindo em hidrogênio, C^.alquila-R'7 C2.. 4a!cóxí-R5í\ NH2, -hiH(C-;...<alquila), -N(Cr4aiquila)2, halogênio e hidròxi.
    69. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que R* é de 1 a 4 substituirdes fixados a um átomo de carbono independentemente selecionados do grupo consistindo am hidrogênio, Cv^alquha-R’0. 0$.. ^alcoxi-R5, NhG, NH(C·,.^.alquila). NtCv^aiquilaJs, cloro, flúor o hidróxi.
  7. 7Q. Método, de acorda com as reivindicações 38 e 41, em que R;ü é 1 a 2 substituirdes independentemente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio, -NH^, -NH(C^alquila), -N(G^aiquíiah< ciano, (hain)vj. hidráxl, nitre- e oxn.
    71. Método, de acordo com as reivindicações 38 e 41, em que R5'·' é de 1 a 2 substítuintes independentemente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio e (halop;..3.
    72. Método, de acordo com as reivindicações 38 e 41, em que R!<í é de 1 a 2. substítuintes independentemente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio e (íiuoroh
    73. Método, de acorda com a reivindicação 28. em que Y e Z são independentemente selecionados da grupo formada par O, S. (H,OH) e (H,H); com a condição de que um de Y e .2 seja Q e o outro seja selecionada da grupo consistindo em O, S, (H,QH) e (H.H).
    74. Método, de acorda cam a reivindicação 28. em que Y e 2 são independentemente selecionadas do grupo formada por O e (H.H); com a condição de que urn dentre Y e Z seja O, e o outro saia selecionado do grupo consistindo em Q e (HSH),
    75. Método, de acordo corn a reivindicação 28, em que Y e Z são independentemente selecionadas de O,
    76. Método, de acorda com a reivindicação 28, onde o composta da fórmula li ê 3-(1 -(3-hidróxi prop! 1))-1 H-pirroio[2,3-ójpiddiu-3-ii]442-(trifluorometil)feníl]-1H-pírrot-2,5-diona,
    77. Método, de acorda com a reivindicação 28, onde a composta da fórmula li é 3-(1-(3-hidróxi propil))-1H-pirro?of2,3-b]plridiU3-ii]·' 4-(1 -metíl-1 rf-plrazol-3-il)-1 Hpírrul-2,5-dicna.
    78. Método, de acordo com a reivindicação 28, onde o composta da fórmula II é 3 (1 -(3-hidróxi·pmpil])·-1 H-pírraio(2,3-b]piridin-3-iip 4 -pifaxin-Z-il-pirr pi-2.5-diona,
    79. Método, de acordo com a reivindicação 28, ande o composto da fórmula II é 3{2.4-dimetóxi-pidmidin-5 ií)-4 (1 (3-hidróxipropil)~1 H-pirroioR^-blpiridin-S-ill-pirrol-Z.ó-díona.
    80. Método, de acordo com a reivindicação 28, ande o composto da fórmula II é 4-{3-(4-(2,4-dimeíóxí-pirimídín-5-il)-2<5-dioxo-2,5di-hidro-IK-pirroí-3-il}-pirfula[2( 3-blpirldln· l-ill-butíronitrila.
    81.. Método, de acordo com a reivindicação 28, onde -a composto da fórmula H é 4-{3-(4(1-me(ii-1H-pirazul-3-il)-2,S-dioxo-2,5-dihidro-1 Η··ρΙι·ι·οί··3-ί]Ι··ρ1υοΙη(2,3·όιρί>Ί0ίπ-1-ilj-butironitrita.
    82. Método, de acorda com a reivindicação 28, onde o composto da fórmula II é 3-(2,4-dimetóxi-pirimidin-5'il)-4'( 1 -fenetiMHp i rroiof2.3- b|p i dd i n- 3- it ) pi rr ο I -2,5-dion a;
    83. Método, de acordo corn a reivindicação 1, em que ο inibidor da atividade da enzima GSK-3B é um composto da fórmula (HI):
    Fórmula (III)
    84. Método, de acordo com a reivindicação 33, em qua A e E sao independentemente selecionados do grupo formado por um átomo de carbono e um átomo de nitrogênio subshuídos com hidrogênio; em que
    è independentemente selecionado do grupo consistindo em 1/éindol, 1/4pirrolo[2,3-ôjpiridirra, 1/'épirazo:o[3:4d)lpíridir\s s 1/4-indazol.
    85. Método, de acordo corn a reivindicação 83, em que Z é
  8. 10 selecionado de O; aiternativamente. Z é selecionado a partir de di-hidro; em que cada átomo de hidrogênio é fixado por urna ligação simples.
    86. Método, de acordo com a reivindicação 83, ern que Ft* e R$ são independentemente selecionados a partir de Cv^alquila, 0?.. salquenila e C;<..s.alquinila opcionalmente substituída por oxo.
  9. 15 87. Método, de acordo com a reivindicação 83, ern que 1% é selecionado do grupo consistindo em Ct.$alquHa··. Casalquemla-, -Cs. ^alquimia··< Q-(C<.g)alquiia O-, O-(C>.§)alquenilaO··, -O-(C^)alqu?niia-O-, C(O)-(Cv3)alquíla-O(O)- (em que qualquer urn dos grupos de ligação das alquilas, aiquenila, e alqmniia supracitados, são cadeias lineares de
  10. 20 carbono opclonalmente substituídas por um a quatro substituintes independentemente selecionados do grupo que consiste em C^eaiquila, Cã.. §alcóxí, C-i^alcoxiCCi^lalquíla, carboxila, carboxila(C5.%)alquila, -0(0)0-(0^,.
    è.)a!qui!a, ••Cr«alqu!ta--C(0)0-(Cr8)slquHa, arnino (substituído por um substitute independentemente selecionado dc grupe- consistindo em hidrogênio e Cv^alquiia), amino(Cr.s)alquila (em que arnino é substituído por um substituta independentemente selecionado do grupo consistindo 5 ern hidrogênio e C^alquila), halogênio, (haleji.sfC^alquiia, (halo)i.^(Cr.
    §)alcóxi, hidróxi., hídróxí(G;.^)Glquiía e oxo; e, em que qualquer um dos grupos da ligação da alquda, alquenila e alquinila supraoriados são opuionalmente substituídos por um ou dois substitutes independentemente selecionadas do grupe consistindo ern heterccicXa, 10 arila, heteroarila, hetefociciiia(Cr^)aiqulia, arila(C^)ãlquila, beteroartia(C<.
    laiquíla, espírocicloalquila e espiroheterpciçlila (em que qualquer um dos substitutas de cicloalquila, heteroniclüa. arila e heteroarila supracitados é opcionalrnente subsfctuído por um a quatro substitutas independentemente selecionaria do grupo consistindo am Calquila, Ci, 15 §alcóxi, C^^sicóxi(Cí .^alquila. oarboxila, carbcxílafC-, ..^alquila, amlno (substituído por um substitutas independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e C^alquila}, amteo(Ci.s)a?quila (em que amino é substituído por urn substitute independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e Cv4alquila), halogênio, (halo) .^alquila, 20 (haio)^s(Cvg)alcôxi, hidróxi e hídrõxi(C^)aiquíla: e, em que qualquer um dos substitutes da hetercciclila supracitados é opcionalrnente substituído por oxo))< cicloalquila, heterocidila. arila, heteroarila (em que cicloalquila, heterociclila, arila e heteroarila são opcionalmente substituídas por um a quatro substitutes independentemente selecionados do grupo consistindo 25 em Cv^lquila, Cí.§alcóxi, Cb..Galcóxí(Cvfí)alquila( carboxila, carboxila(Cr.
    e,)alquila, amine (substituído por um substitute independenfemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e C^alquila), amino(í%.. .«Jaiquila (em que arnino é substituído por um substitute independentemente selecionado de grupo consistindo em hidrogênio e C-„ 30 -alquila), halogênio. (haloWCi^alquiia, (haloh.3(Cr.g)alcòxi( hidróxi a hidrõxi((%..&)alquiia; e, ern que heterociclila ê opcionalmente substituída por 0X0), -(O-(CHâ);&-Ό -, -a-(CH2)vs-O-(CHs).«-O-, -O-(CHS)^-O-(CHs),.?·CMCH^ δΌ-( -(O-(CH2), .g)o.s-NR«-. •O-CCI-Va^-NR^-ÍCH^vg-O^ -0-(OH;>),. £.-0-(0Hsh -6--NR«-, -((>(CH.?h .0ΰ..-S-, -0-(CH2)<4rS-(CHa) < .^-0-, -0-(CH2) >.gO-(CH5)m-sS-.. -NR§-. -NR.s~NR?-. -NRg-CCH^i^-NR?-. -NR0-(CH2)r«-NRy(C H,?h.s NRg-: -NRe-C(O)-, -C{0) -NRs-< - 0(0) -(CH2)^-NR&-(CH2)0.6-C(OFt □ NRg(CHg)g.g'-C(Q)-( 0 H?) ^#:-0(0)-( Crb}$. e- NR?-, - NR$C (O) --N R·,--, ~NR^~
    C(NR?)-- NR$-, -O-(CH;T.^NRç-(CH?) ,..6-S-. -S-(GH2),,S-NRg-(CH2)< -8(ΟΗ;?)·;..5·-ΝΚ>;-(θυ2}·5..£~0, “NRf;~(CH2)<4rS4CH2)5.A?NR? 0 -St.),? (em que R?,;. R? a R$ são independentemente selecionados do grupe formado por hidrogênio, G^aiqmía, C^alcòxífCvgjalquHa, oarboxilaíCr^alquila, 10 amino(C;.a)aíquiia (em que amine è substituído por um substituinte independentemeate selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e G<. ^alquila), h:dróxi(O,.«)alquila. heterocialilaíC ^alquila, arila(C .^alquila e heteraaniatG^laiquiia (em que os substituímos de heterociciiia, arila e heteroanla anteriormente mencionadoss são ogeionalmente substituídos 15 por um a quatro substituintes Independentemente selecionados do grupo cunsistmou em CA..8alquila. C^ale-õzl, C<.8alcéxi(Cj.g)aiquila. carboxila, carboxila(Ci..§)alquiia, amino (substituído por um substituintes independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e ÍA. ..^.alquila), amino(C;..g)aiquila (em que amino é substituído per um 20 substituinte independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e C-i^aiquiia),. halogênio, (rialo)?.?(Gí.8)alquila, (halo),..5(6-5. gjalcdxi, hidróxi e nidróxi(C,.^alquila; e< em que heterocíclila é opcionalmenfe substituída por oxo)); com a condição de que., se A e Ei forem selecionados de um átomo de carbono substituído por hidrogênio.
  11. 25 então R? é selecionada do grupo consistindo em C^aiquinlla-, -O-(Ci. .«jalquiia-O-, -OdCa.giaiquenila-O-, -OuCí^Jalquinila-O-·, -C(0)~(C5..íí)alquiíaC(0)- (em que qualquer um dos grupos de ligação de alquila.. alqueniía e aiqumla anteriormente mencionados são cadeias de carbono lineares opcíonalmente substituídas por um a quatro substituirdes 30 independentemente selecionadas do grupo consistindo em C,^alquila, C< çalcòxí, Ov.saicóxÍ(C,.s)aiquiia, carboxila, carboxiia(C,..g)alquila. -0(0)0-(0-:.. gjalqulia, C’,^aíquila>C(O)O“(Cn«)alquila, amino (substituído por um substítuinte independentemente selecionada dc grupo consistindo ern hidrogênio o Q?.,.<alquíla), ammo(C;..$)alquila (ern que amino ê substituído por um substituirrte independentemente selecionado do grupo consistindo ern rridrogèniu e Cr^lquila), halogênio, (haiai^ÇCí.^alqmla, (halo) ,.3((4.
    5 §)alcôxí, hidróxi, hidrôxí(Ci,s)alquíla e oxa; e} em que qualquer um dos grupos de ligação de alquila, alquenila, alquinila antenormente mencionados é opcionalmente substituído por um a dois substituintes independentemente selecionados do grupo consistindo em heterccioMu, arila, heteroarila, heterociclila(Cí..§)alquila, arila(C<.g)alquila, heteroahla(G <.
    1G .«ialquila, espirocicloatquila e espiroheterocicüla (em que qualquer um dos substituintes de cicloalquila, heterooisliia, arila e heteroraila anteriormente mencionados é opcíonalmente substituído por urn a quatro substituintes indepsndontemente selecionados do grupo consistindo em 0^.alquila, Gi. «aínòxí, 0 .«aicó.xi(G s..g)aiqulla, carboxila, carboxna(G < ..^alquila, amino
    15 (substituída por um substituinte independeniemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e C-i^alquíla), amina(Cvs)alquÜa (em que amino ê substituído por um substituinte independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e (^..«.alquila), halogênio, (haio)«.3(C;..§)alquiia, (haloh.3(C-t.â)aícóXL hidróxi e hidróxi(C«.§)alquila; e, em que qualquer um 2Q dos substituintes de hetemciclila anteriormente mencionados é opcionaimente substituído por oxo)), cicloalquila (ern que a cicloalquila é opcionaimente substituída por um a quatro substituintes independenfemente selecionadas da grupa consistindo em C<^alquila, C;.. §aicò.xí, Ci..ísaluãx.i(G;..§)alquila, oarboxila, cafboxila.(G«..g)a.lquíla. amino 25 (substituído por um substituinte independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e C^alquiia). amino(Ci.^alquila (em que amino è substduído par um substituinte índependenternente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e Ch..«alquila), haiogênios, (halojb-XCrs/alquila, (halc)v3(C'S,s)alcáxl· hidróxi e hidróxi(C^)alquila), (OuCHsh sh -5--0-, -O30 “O-CCHxJi.g-O-CCHaji^-O-CGH^rô-O-, -(□RDHsh.eh..
    «“NR#:“t -O -(CHS) < ,§-N Re-(C ,.SQ ·. Q·· (C H2)« ..S-O-(C H2) ^~ΝΗβ~. -(Q-O-(CH2)^-S-(CH2h,60·: ••O-CCH^h.e-O^CH^vs-S-, -NRír
    NR-,-, -NRg-tCH?)< ,<5’NR?··, -NRg-í CH7h s-NRy-CGH^)<..§-ΝRg-, -NR.yC(0)-, C(0)-NR^ -CiOHCHzWNRg-CCHii^-CCO)-, -NR&-(CH2)Q ^C(O)-(CH2)Ur· G(O)-(CH?)0.?rNR;--t -NRe-C(O)-NRr< -NRg-O(NR7)-NRs-. -Q-(CH7)5.s-NRg{0Η;>}μ''5> ~S|CH,/<i.$· NRo-(CH7i,^-0-, -3-(0H7)m-NR&~(CHs)?.g-S- e-NRg· 5 (CH2)i.^-S(CH2)t^-NR?- (am que Rg, R? e R$ são índependentemente selecionados do grupo formado por hidrogênio, Ct^aiqulia, Ci.$alcôxi(Cv sjaiquila, carboxite(C<.$)alquíla; amino(C|^)alquila (em que amíno é substituída por um substituinte índependentemente selecionado da grupo consistindo em hidrogênio e Cu ^alquila), hidrôxi(C^g}alquila;
    10 hetefosichia(Ct 8)alquila. aula(CM)alquila e heteraanla(Gí-;.s)alquila (em que os substituirdes de heterocicliia, arila e heteroarila supracitados são opcionalmente substituídos por um a quatro substituirdes índependentemente selecionados do grupa que consiste em C<.salquiia, C5.. ealcóxi, C<^aícóxi(Ci..8)alqulía, oarboxila, carboxila(Cug)afquila, amíno 15 (substituído por um substituinte índependentemente selecionada da grupa consistindo em hidrogênio e C-,..-,alquila). aminofGí.Gaíquila (ern que amíno é substituído por um substituinte índependentemente selecionada do grupa consistindo em hidrogênio e C^.vilquils), halogênio, (halo)q7(C-j.ô)alqmla; (halu);,.7(C;..s)alcôxís hldróxl e hidróxi(C-;..s)aiqmla; e, em que heterocidila è
    20 upciunalrnente substituída por axo); e, em que ó selecionada do grupo consistindo em Ci^alquila, CvealcàxKC;..^alquila, carbuxilaRX^alqmla, aminu(Cv8)afquila (em que amíno é substituído por um substituinte índependentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e C5. áalquiia), hidróxi(Ccs)alquila( heterocíclíla(Ci.8)aiquilat anla(Ci..&)alquiia e 25 heteroarita(Cv^jalquila (em que os substituíntes de heterociciiia, arila e heteroarila supracitadas são upcionalmenta substituídos por um a quatro substítuintes índependentemente selecionadas a partir do grupo consistindo em (G.^alquila, C^.salcóxi, C;^alaóxi(Cq«)aíquila, earboxlla, c?arbaxila{C^e)alquílat amíno (substituída par um substituinte
  12. 30 Índependentemente selecionada do grupa consistindo em hidrogênio e «alquila). amina(Ci.{.;)alquila (ern que amina é substituído par um substituinte índependentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e Cwalquila), halogênio. (haloM(C^)alquila. (hato);.;}(Gr paicóxi, hidróxi e hidróxí(Cv$)alquila; e, em que heterociclifa é opmonahTWte substituído por oxo)).
    88.. Método, de acordo com a raivindicação 83, em que FT e Rs
    5 sâo independentemente selecionados do grupo formado por hidrogênio, C;. ^alquila, C^alquenila, C^alquínila (em que alquila, alquenila e alquinila são opoionalmente substituídas por um subsilfulnte selecionado do grupo consistindo em C5«altóxl, alcoxi(Cv$)aiquiia, carboxíla, carboxila(C{«)aíquíia, amino (substituído por um substituinte inoependentemente selecionado do 10 grupo consistindo em hidrogênio e C^^alquila), amino(C3«)alquila (em que amina é substituído por um substituinle radepeodentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e Cv4alquila), (halo)s.3, (halo)v3(Ci«)alqoila, (halo)<.3(C^)alcôXi, hidróxi, hidróxirCt^alquila e oxo), C-f.§alcóxi, C;. ealcúxícarbonila, (halo)v3(C^)alcôxi, C<.$alqullaho, arila, heteroarila (em que 15 arila e heteroarila são opcionalmente substituídas por ura substituinle selecionado do grupo consistindo em Ct.salquila. G< «alcóxi, alcóxi(C^)alquik carboxih, carboxila(C5«)alquila, amino (substituído por um substituinle independentemente selecionada do grupa consistindo em hidrogênio e G<. ralquilsi, amino(C:.palquila (em que amina é substituído par um substituinle 20 independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e Cu.
    ^alquila), halogênio, (haluh.jíC.^alqüih, (haio)í.s(C^)alcóxi. hidróxi e hidróxi(íTe)«iguilai, amíno (substituído por um substituínte independentemente selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e Cv^alquíla), ciano, halogênio, hidróxi e nitro; e sais famnamdiuamente aceitáveis dos mesmas.
    25 89. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da fórmuía(lll) é 6,7,9,10,12,13,15.16-oota-hidro -2313-5,28:17,22dimetenu-Si-í-dipirida^.O-kefTèqjpirro.lofBxl· n ][1:4,7,10,19)tr ioxadlazacicloenicosina-23,25(24H)-diona.
    90. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o
    30 composto da fórmula(lll) é 10.11,13,14,16,17,19,20,22.23-deca-hídro·· 9,4:24,29-dímetenO'1H -d i piddo(2; 3- n:3' ;2'~ tfpírrotof 3,4 q][1,4,7,10,13,22]tetraDxadiazacic!otetracosína»1,3(2H)-diona.
    91. Método, de acordo corn n reivindicação 83, em que ο composto da fármulaCIll) é 10,11,13,14/16,17,19,20,22,23.25,.26-daGa· hidrododeca-hidro •9.4.27,32-dlmeteno-1H--dipirido[2,3-q:3f.2<-\A?]pirroIo[3,4 t][1.4,7,10.13.16,25]peritaoxadiazacicloeptacosina-1,3(2H)-dlona.
    92. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da fórmula(lH) é 6,719,10,12t13-hexa“hidro-20H-5,23:14,19·· dirnetenu-SH 7lbenzo[h. n]pirrolo[3.4-kK 1.4,7.1 ôldioxadiazaciclooctadecina20.22(21 H)-d iona.
    93. Método, de acordo com a reivindicação 83. em que o composto da fórmuía(llí) é 6,7.9,10,12.13,15,16-octa-hidro -23115:26:17,22-dimetenO'-5Hdibenzo(k,qlpirrolGf3!4·· n]i1,4.7,10,19]trioxadiazacicloeneicosina-23,25(24H)diona.
    94. Método, de acordo com a reivindicação 83, ern que o composto da fôrmula(lll) é 10,11,13,14.16,17,19,20,22,23-deca-hidro·· 9,4?24,29~dimetenO1H*dibenzo[n.t]pirro!op,4·· ql(1,4.7.10,13.2.2]tetraoxadiazaciclDtetrecosina-1,3(2H )-d iona.
    95. Método, de acordo sorri a reivindicação 83, em queo composto da fórmula (HI) é o composto 1a,
    96. Método, de acordo com a reivindicação 83,, em que o composto da fòrmulaÇI It) é 3-[1 [3-[(2-hidroxietil)metilamino]propil)~ 1Hindazol-3-ilj-4--{l -(3-p indinil)-1 H-mdel-S-ilT-1 H-pinol^S-diorm.
    97. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (III) é 3,5-dkJoro--N-{3-ctora--4-{(3;4il2,12a--tet.ra-bidro·· 1 H-[1 <4]tiazino>3.4-c)[1,4]benzodiazepin -11(6H) il)carbonila]fenila]benzamida................................
    98. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da formula (III) é 341-(2-hidraxi-eiirrlH-indpl-3-iH~4-(1“piridir}a -3· ii-i H~indol-3-il)'pirrol -2.5 -diona.
    99. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (UI) é 3--(2--metôx! fanií)44l-pindin-3--ii-1 H-indol--3-ii)· plrroi-2.5-diona.
    100. Método, de acordo com a reivindicação 83. em que o composto da fórmula (III) é 6-((24(4-(2,4-dimuru fenil)-5--(4-metíl-1Hírnídazol-2 ii) 2 p inmidinil]amino|etil]aminc]-3-pirid mecarbonitríla.
    101. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da formula (!!!) é 3-(3-cloro~ 1-metl 81 H-indol-3-ií)-4[1 -(3-imidazal1-ílprapiÍ))-1H-irMaza83-il]-pirrul-2..5-diona.
    102. Método, de acorde com a reivindicação 83, em que o composto da formula (III) é 3-(5«οΙθΓθΜ-Γη«1Ι81Η·'ΐηόο!-3··ϋ-4-(1-(3Π ,2,3jtriazoi-1 -ίΙ-ρ^)ρίΐ])-1Η-Ιηό3Ζ0ΐ-3-Ιΐ]-ρ)^82,5-όΙΰΠ3.
    103. Métódo, de acorda oom a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (Ui) é 3-(l-(3-h!droxi-propiN)-1H-pirrolp(2,3-bjpiridin-3ilj-4-(1-mMíl~1H-pirazo83-i()-plfro82,5-dÍQna.
    104. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (Ul) é o composto 10a.
    105 Método, de acordo com a reivindicação -83, em que o composto da formula (ill) é 3-(1-(3-hidróxi-3-meül-butil)-1H-indaza83-ilj-4(1 -pírid in- 3-i 81H andai- 341) -pirrcl-Z.S-diona.
    186. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (III) è 3-(1 -(2·-6ΙόΓθχΙ···οΝί)··1Η-ΙηόοζοΙ-3-ίΙ]-4-(1pírim ldin-54 M Ha ndοI-3-ii) -pirrol-2,5-diuna.
    107. Método, de acordo oom a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (NI) é 3-i'1-(2-hidroxi-etil)-1 H-indol-3-Nj~4-(1-pirimidin5-181 H-indol-3al)-pírroi-2.5dionm
    108. Método, de acordo corn a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (ill) è (112)-8,9,10,13,14,15-60.^3-616^-2,6:17,21d í(meteno)pirroío(3,4- 6]í 1,15.7]dioxazaciclatricosina-22.24( 1H ,23H)-diona.
    109. Método, de acordo com a reivindicação 83, ern que o composto da fórmula (NI) é 34.5-cloro-1-pkidin-3-ii-1li-indO;-34i)-4-(1 -(3hid roxi -propil)-1H- indazo I-3-il]-p i rrol -2,5-diona
    110. Método, de acordo corn a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (IN) é 3-(2-metóxi-fenil)-4-(1 (3--metóxi-propil)-1Hpirroío[3,2-c)piridín-3-i!l-pirrol-2,5“diona.
    111. Método, de acordo com a reivindicação 83, em qua c composto da formula (HI) é 3--(1-(3-hidroxi-propll}-1H-indazoi--3-iO-4--(1(tetrahidra-piran~4-il)-1H-inaol-3-il]-pkrol-2:5-diona.
    112. Método, de acordo oom a reivindicação 83, em que o
    5 composto da fórmula (ill) è a-fB-K-fS-Gloro-l-metil-IH-indol-S-iO^.ô-dioxo·· 2,5-di-hidro-1 H-pirroi-3“il}-indazol-1 - il) -N - (2- hidroxi-etB)-acetam Ida,
    113. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (III) é 4-(3'Cloro-fenil)-6-(3-dimetilamino-propn)S.6-dihidro-4H-2!4l6-tdaz.a-cicÍ0penta(c]flÚGr-1,3-diona.
    10 114 Método, de acordo com a reivindicação S3, em que o composto da fórmula (Hi) é 14-etii-6,7.9J0,13J4J5,16-octa-hidro 12H ,23H-5,26:17,22.-oimetenodibenzo[k ,q)pirro!o[3,4 .4,7.10,19]dioxatnaz8cicloeneicosina-23,25(24H)“diona.
    115. Método, de acorde com a reivindicação 83. em que o
    15 composto da fórmula (Hl) é 14-benziM5!7,9,ID, 13,14,15,16-octa-hidro12H ,23H -5,26:17,22-di(rneleno)dibenzo[k,q )p$rrolo[3,4 n](1,4,7,10,19]diaxafuazaoieloenicosma-23,25(24H)-diona,
    118. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (UI) é 3-(1-{2-[2-(2-hidroxi-etáxi)-etàxi]~etil}-1 H-inctal-
    20 3- 4)-4-(1- (2-hidraxi-ef.il)- iH-indol-O-il]-ρΙηΌΐ·2γ5-όΙοπο.
    117. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (HI) é 6,7,8,9,10,11,12,13--octa-hidro -8.11-dirnetil5,23; 14,19-dimateno-2D H-dibenzo[k,q]pirrulo(3,4-n)(1,4,7,1 Cjietraaxacinkmnfadecina-20,22(21H)-diona.
    25 118. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que ο composto da fórmula (ill) é 7,8.9,10,12,13,18.17.18,19-0000-510^-8,17dimetil-16HK26H-5>29:20>25-dimeteno-6H-d!benzo[k.q]pirroio[3,4nlíl ,4,7,10.19.22ldioxatetra-azacicloteiracosina~26<28(27H)-dicna.
    119. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o
    30 composto da fórmula (HI) é 14-(2-furiimetil)~6,7,9,10,13,14,15,16-octa-hidro12H,2.3 H-5,26.17,22-dkmeteno)dibenzo[k.qjpirrolo[3:4nlí 1,4,7,1 D. 19)dioxatriazacíduenicosina -23,2 5(24 H )-d íona.
    120. Método. de acordo com a reivindicação 83. ern que ο composto da formula (HI) é 14-(2-tienilrrietil)45,7,9.10.13.14,15,16-aotahidro - 12H.23H-5.26:17 ,22-di(meterm)dibenzo[k.q]pirrofo[3,4·· η][1;4,7,1Ο.; 19]diaxatriazacialoenmosina-23,25(24H)-diona,
    121. Método, da acordo com s reivindicação 83, em qua o oom posto da fórmula (III) è l4-(1-nsfWmetH)-5.7,9,fQ,13,14,15,16-nctahidro-12H. 23H-5,26:17 f22-di(meteno)dibenzo[k.q]pirrolo[3,4-
    n](1,4..7,10,19|dsoxatriazaaicloenicosina~23,25(24H)-diona.
    122. Método, de acordo corn a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (IH) é 14{piridina-4-iimeUI)6,7,9,10,13,14,15.16-octahidra-12H.23H -5,26:17.22-di(rnetenujdib6nzo(k,q]pirrolG(3,4- nll 1,4,7,10,19]dioxatriazaaiolaanicosina~23,23(2-4H;>-d iona.
    123. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que o composto da fórmula (HI) é 3-(1-(2-(2-(2-(1,2,3,4-tetra-hidromaftalen-1i ia rn i nof-etóxi] -etòx-'}-ati I)-1H-iindol-3-1)-4 -{1 -(2 -(1,2,3,4 -terra-hidro-naHa len1-ilam:no)-etil]-1 H-indol-3-ii}-pirrol-2,5-diuna,
    124. Método, de acordo com a reivindicação S3, em que o composto da fórmula (HI) é 3-(1-(3-dimetilamino)fenil])-1H-indol-3-in-4-(1-(2h < d roxi-etil)-1 H-indazol-3-il j-pirrol-2,5-d kma.
    125. Método, de acordo com a reivindicação 83, em que c oamposto da fórmula (HI) é 3-[5-ciore-l-(6-dimetilamino-piridina-3-il)-1Hindol--3-4)-4-(1 -(2-hidroxi-etil)-1 Η-ίΓ^·.1ο.ζοΙ-3-ϋ]-ρΐΓίθΙ-2,5 -diuna.
    126. Método, de acordo cum a reivindicação 83, em que a composto da fórmula (HI) é metil éster de ácido 5-(5 -clorG-3 -{4-(1-(2-hidraxietil)-1H-indazoi-3-1)-2,5-0Ιοχο-2,5^ί-Ηΐ0^-1Η-ρίΓΓοΙ-3-ίΙ}-ΙπαοΙ··1 -d)niootmico.
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