ES2149149T3 - Proteinas de union a interleuquina-18, su preparacion y uso. - Google Patents

Abstract

Una proteína de fijación de IL-18 (IL-18BP) que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10, muteínas, proteínas fusionadas, derivados funcionales, fracciones activas, derivados permutados circularmente y sus mezclas.

Description

Proteínas de unión a interleuquina-18, su preparación y uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteína de unión de interleuquina-18 (IL-18), denominada a partir de ahora IL-18BP, capaz de unirse a IL-18. Más particularmente, esta invención se refiere a IL-18BP soluble que puede obtenerse a partir de fluidos corporales, a IL-18BPs solubles que pueden obtenerse mediante expresión de vectores de ADN adecuados en células hospedantes, a homólogos de IL-18BP codificados por virus que pueden obtenerse mediante expresión de vectores de ADN adecuados en células hospedantes, a vectores que expresan las diversas IL-18BPs, a vectores útiles para la expresión de IL-18BP en humanos y en otros mamíferos, a anticuerpos contra IL-18BPs, al uso terapéutico de dichas IL-18BPs para modular y/o bloquear la actividad de IL-18, al uso terapéutico de dichos vectores de expresión para modular y/o bloquear la actividad de IL-18 y al uso de los anticuerpos.

Antecedentes de la invención

En 1989 se describió una actividad en suero inducida por endotoxinas que indujo interferón-\gamma (IFN-\gamma) obtenido a partir de células de bazo de ratón (27). Esta actividad en suero no funcionó como un inductor directo de IFN-\gamma, sino más bien como un coestimulante junto con IL-2 o mitógenos. Un intento por purificar la actividad de suero de ratón post-endotoxina reveló una proteína aparentemente homogénea de 50-55 kDa (26). Puesto que otras citoquinas pueden actuar como coestimulantes para la producción de IFN-\gamma, el fallo en la neutralización de anticuerpos de IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, o de TNF para neutralizar la actividad en suero sugirieron que se trataba de un factor distinto. En 1995, los mismos científicos demostraron que el coestimulante inducido por endotoxina para la producción de IFN-\gamma estaba presente en extracto de hígado de ratones preacondicionados con P. acnes (31). En este modelo, la población hepática de macrófagos (células de Kupffer) se expandió y en estos ratones una dosis baja de lipopolisacárido bacteriano (LPS), que en ratones no preacondicionados no es letal, se vuelve letal. El factor, llamado factor inductor de IFN-\gamma (IGIF) y más tarde designado como interleuquina-18 (IL-18), fue purificado hasta homogeneidad a partir de 1.200 gramos de hígado de ratón tratado con P. acnes. Se usaron oligonucleótidos degenerados derivados de secuencias de aminoácidos de IL-18 purificada para clonar un ADNc murino de IL-18 (31). La IL-18 es una proteína de 18-19 kDa de 157 aminoácidos, que no tienes similitudes obvias con ningún péptido de las bases de datos. Los ARNs mensajeros correspondientes a IL-18 y interleuquina-12 (IL-12) se detectan fácilmente en células de Kuppfer y en macrófagos activados. La IL-18 recombinante induce IFN-gamma de forma más potente que la IL-12, aparentemente a través de un mecanismo separado (31). Similar a la actividad en suero inducida por endotoxina, la IL-18 no induce IFN-\gamma por sí misma, sino que actúa básicamente como coestimulante junto con mitógenos o con IL-2. La IL-18 potencia la proliferación de células T, aparentemente a través de un mecanismo dependiente de IL-2, y potencia la producción de citoquinas Th1 in vitro, y exhibe un sinergismo cuando se combina con IL-12 en términos de una producción potenciada de IFN-\gamma (24).

Se demostró que anticuerpos neutralizantes de IL-18 de ratón previenen la letalidad de LPS en bajas dosis en ratones preacondicionados con P. acnes. Otros autores han publicado la importancia del IFN-\gamma como mediador de letalidad de LPS en ratones preacondicionados. Por ejemplo, anticuerpos neutralizantes anti-IFN-\gamma protegieron ratones frente a shock de tipo Shwartzman (16), y ratones tratados con galactosamina deficiente en el receptor IFN-\gamma se mostraron resistentes frente a la muerte inducida por LPS (7). Por tanto, era de esperar que los anticuerpos neutralizantes de IL-18 murina protegieran a los ratones preacondicionados con P. acnes frente a LPS letal (31). El tratamiento con IL-18 antimurina también protegió a los ratones supervivientes frente a citotoxicidad hepática severa.

Después de que la forma murina fuera clonada, la secuencia de ADNc humano para la IL-18 fue publicada en 1996 (38). La IL-18 humana recombinante exhibe una actividad de IL-18 natural (38). La IL-18 humana recombinante no tiene actividad directa de inducción de IFN-\gamma sobre células T humanas, sino que actúa como un coestimulante para la producción de IFN-\gamma y otras citoquinas de célula colaboradora T-1 (Th1) (38). Hasta la fecha, se concibe la IL-18 básicamente como un coestimulante para la producción de citoquinas Th1 (IFN-\gamma, IL-2 y factor estimulador de colonia granulocito-macrófago) (20), y también como un coestimulante para la citotoxicidad mediada por ligando FAS de clones de células asesinas naturales murinas (37).

Mediante la clonación de IL-18 a partir de tejidos afectados y el estudio de la expresión génica de IL-18, se descubrió una estrecha relación entre esta citoquinas y una enfermedad autoinmune. El ratón diabético no obeso (NOD) desarrolla espontáneamente insulitis y diabetes autoinmunes, lo que puede acelerarse y sincronizarse mediante una única inyección de ciclofosfamida. Se describió el ARNm de IL-18 mediante PCR de transcriptasa inversa en páncreas de ratones NOD durante las primeras etapas de la insulitis. Los niveles de ARNm de IL-18 aumentaron rápidamente después de un tratamiento con ciclofosfamida, precediendo a un aumento del ARNm de IFN-\gamma, y posteriormente a la aparición de diabetes. Cabe destacar que esta cinética se asemeja a la del ARNm de IL-12-p40, dando como resultado una estrecha correlación de niveles de ARNm individuales. La clonación del ADNc de IL-18 a partir de ARN de páncreas seguida de un secuenciamiento reveló una identidad con la secuencia de IL-18 clonada a partir de células de Kupffer y macrófagos pre-activados in vivo. También macrófagos de ratones NOD respondieron a ciclofosfamida con expresión génica de IL-18, mientras que macrófagos procedentes de ratones Balb/c tratados en paralelo no lo hicieron. Por lo tanto, la expresión de IL-18 está regulada de forma anormal en ratones NOD autoinmunes y está estrechamente relacionada con el desarrollo de diabetes (32).

La IL-18 desempeña un papel potencial en la inmunoregulación o en la inflamación aumentando la actividad funcional de ligando Fas en células Th1 (10). La IL-18 también se expresa en el córtex adrenal y por tanto podría ser un neuro-inmunomodulador secretado, que desempeña un papel importante para orquestar el sistema inmune después de una experiencia estresante (9).

In vivo la IL-18 se forma mediante ruptura de pro-IL-18, y su actividad endógena parece ser la responsable de la producción de IFN-\gamma en la letalidad mediada por P. acnes y LPS. Debido a su actividad, el bloqueo de la actividad biológica de IL-18 en enfermedades humanas constituye una estrategia terapéutica para muchas enfermedades. Esto puede lograrse usando receptores dobles o bloqueando anticuerpos del receptor IL-18 ligado a célula.

Las proteínas de unión de citoquinas (receptores de citoquinas solubles) corresponden con los dominios de unión de ligando extracelulares de sus respectivos receptores de citoquinas de la superficie celular. Son derivados bien mediante una división alternativa de un pre-ARNm, común al receptor de la superficie celular, o bien mediante ruptura proteolítica del receptor de la superficie celular. En el pasado se han descrito receptores solubles de ese tipo, e incluyen, entre otros, los receptores solubles de IL-6 e IFN-\gamma (30), TNF (11, 12), IL-1 e IL-4 (21), IFN-\alpha/\beta (28, 29) y otros. Una proteína de unión de citoquinas, denominada osteoprotegerina (OPG, también conocida como factor inhibidor de osteoclasto, OCIF), un miembro de la familia TNFR/Fas, parece ser el primer ejemplo de un receptor soluble que existe únicamente en forma de proteína secretada (1, 34, 39).

Resumen de la invención

La presente invención proporciona proteínas de unión de IL-18 (IL-18BPs) seleccionadas del grupo que consiste en:

(a)

polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 ó 6;

(b)

polipéptidos como los definidos en (a) sin una secuencia líder;

(c)

muteínas que tienen al menos un 80% de homología con la IL-18BP tal como se define en (a) o (b), proteínas fusionadas, derivados modificados químicamente, derivados permutados circularmente, y mezclas de los mismos, de los polipéptidos definidos en (a) o (b); y que se unen a IL-18 y bloquean la producción inducida por IL-18 de IFN-\gamma.

La invención también proporciona un proceso para aislar IL-18BPs a partir de fluidos humanos, y un proceso para obtenerlas por medios recombinantes. La invención también proporciona factores de expresión de IL-18BPs, adecuados para la expresión de IL-18BP en humanos y en otros mamíferos. IL-18BPs específicas, homólogos de IL-18BP codificados víricamente, proteínas fusionadas, muteínas, derivados modificados químicamente, y derivados permutados circularmente de las mismas de la presente invención son útiles para modular y/o bloquear las actividades biológicas de la IL-18.

También se proporcionan vehículos de expresión replicable que contienen ADNs adecuados para la expresión de las diversas IL-18BPs en células hospedantes, células hospedantes transformadas según lo expuesto en la presente memoria y proteínas y polipéptidos producidos mediante expresión de dichos hospedantes.

La invención además proporciona composiciones farmacéuticas que consisten en vehículos adecuados y IL-18BPs, o IL-18BPs víricas, o vectores para expresar las mismas en humanos y otros mamíferos, para el tratamiento de enfermedades y afecciones que requieran la modulación o el bloqueo de la actividad de IL-18.

La invención proporciona además anticuerpos de las IL-18BPs y de las IL-18BPs víricas, adecuados para purificación por afinidad e inmunoensayos de los mismos.

Descripción de las figuras

Figura 1: muestra la SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato sódico) de proteína de unión de IL-18 purificada por afinidad de ligando. Se cargaron proteínas urinarias crudas (concentradas mediante ultrafiltración de 500 L de orina humana normal) en una columna de IL-18-agarosa. La columna fue lavada y las proteínas ligadas fueron eluidas a pH 2,2. Las fracciones eluidas fueron neutralizadas y se analizaron alícuotas mediante SDS-PAGE (10% en acrilamida) en condiciones no reductoras y con tinción de plata. Las bandas son: 1: proteínas urinarias crudas (1,5 \mug, cargadas en el gel); 2-9: eluciones 1-8, respectivamente, de la columna de IL-18-agarosa; 10: marcadores de peso molecular, en kD, indicados en el lateral derecho. Una flecha indica la banda correspondiente a IL-18BP.

Figura 2: muestra un autorradiograma de SDS-PAGE (7,5% en acrilamida) de complejos que consisten en ^{125}I-IL-18 (peso molecular aparente de 19 kD), entrecruzado con las siguientes preparaciones de proteína de unión de IL-18 soluble: Banda 1: Lavado de la columna de afinidad de IL-18. Banda 2: Elución 2 de la columna de afinidad de IL-18. Banda 3: Elución 3 de la columna de afinidad de IL-18. Los marcadores de peso molecular se indican en el lateral derecho (en kD). Una flecha indica el producto entrecruzado (58 kD).

Figura 3: muestra la inhibición de la producción inducida mediante IL-18 de IFN-\gamma por la IL-18BP.

(A) Se estimularon esplenocitos de ratón (24 h, 37ºC) con las combinaciones indicadas de LPS (1 \mug/mL) e IL-18 humana (5 ng/mL), añadidas bien directamente o bien después de un pre-mezclamiento (1 h, 37ºC) con IL-18BP urinaria. El nivel de muIFN-\gamma en el cultivo se determinó después de 24 h.

(B) Se incubaron esplenocitos de ratón (24 h) con LPS (1 \mug/mL) junto con IL-18 murina (10 ng/mL) pre-mezclada (1 h, 37ºC) con concentraciones crecientes de IL-18BP humana.

(C) Se incubaron esplenocitos de ratón (24 h) con LPS (10 \mug/mL) junto con concentraciones crecientes de IL-18BP humana.

(D) Se incubaron esplenocitos de ratón (24 h) con Con A (1 \mug/mL), junto con concentraciones crecientes de IL-18BP humana.

(E) Se estimularon células KG-1 humanas con TNF-\alpha (20 ng/mL) y huIL-18 (25 ng/mL), añadidas por separado o después de un pre-mezclamiento (1 h, 37ºC) con IL-18BP urinaria.

Figura 4: muestra la secuencia de ADNc y de proteína de IL-18BPa humana. El péptido señal está subrayado.

Figura 5: muestra la secuencia de ADNc y de proteína de IL-18BPb humana. El péptido señal está subrayado.

Figura 6: muestra la secuencia de ADNc y de proteína de IL-18BPc humana. El péptido señal está subrayado.

Figura 7: muestra la secuencia de ADNc y de proteína de IL-18BPd humana. El péptido señal está subrayado.

Figura 8: muestra la secuencia del gen de IL-18BP humana. Se determinó la secuencia de un clon genómico humano (7,1 kb) y se comparó con la de varios clones de ADNc aislados a partir de 3 bibliotecas de ADNc. El codón de inicio de la traducción común lo conforman los nucleótidos 683-685. El gen NuMA1 está localizado en la cadena negativa, desde el nucleótido 3578 hasta el final.

Figura 9: muestra el efecto de IL-18BP recombinante en la actividad de IL-18 humana y de ratón.

La IL-18BPa marcada con His_{6} fue expresada temporalmente en células COS7 y fue purificada.

(A) Se premezcló IL-18 humana (5 ng/mL) bien con IL-18BPa marcada con His_{6} ó bien con RPMI, y se añadió a células de bazo de ratón junto con LPS (1 \mug/mL). Se midió la producción de IFN-\gamma después de 24 h.

(B) Se premezcló IL-18 de ratón (10 ng/mL) bien con IL-18BPa marcada con His_{6} ó bien con RPMI, y se añadió a células de bazo de ratón junto con LPS (1 \mug/mL). Se midió la producción de IFN-\gamma después de 24 h.

(C) Se premezcló IL-18 humana (25 ng/mL) bien con COS7-IL-18BPa o bien con RPMI, y se añadió a PBMC humanas en presencia de IL-12 (10 ng/mL).

(D) Se premezcló IL-18 humana (25 ng/mL) bien con COS7-IL-18BPa o bien con RPMI, y se añadió a células KG-1 humanas en presencia de TNF-\alpha (20 ng/mL).

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a varias IL-18BPs e IL-18BPs víricas que se unen a IL-18. Dichas IL-18BPs pueden ser capaces de modular y/o bloquear las actividades biológicas de la IL-18. La expresión "IL-18BPs e IL-18BPs víricas" incluye la proteína madura (sin la secuencia señal), la proteína que comprende secuencias señal, muteínas de IL-18BPs e IL-18BPs víricas, derivados de IL-18BPs e IL-18BPs víricas, y formas truncadas de IL-18BPs e IL-18BPs víricas, y sales de las mismas.

La invención se refiere además a vectores replicables, adecuados para la expresión de varias IL-18BPs en células hospedantes y en bacterias hospedantes. La invención se refiere además a vectores de expresión, adecuados para la expresión de varias IL-18PBs en humanos y en otros mamíferos.

La invención se refiere además a ADNs que codifican para varias IL-18BPs, muteínas, proteínas fusionadas, derivados modificados químicamente, y mezclas de los mismos. Dicho ADN puede ser un ADN genómico, un ADNc, un ADN sintético, un producto de PCR o combinaciones de los mismos. Dichos ADNs pueden insertarse en vectores replicables para la expresión de varias IL-18BPs en células hospedantes, de acuerdo con la invención.

Un ADN de este tipo codifica una IL-18BP que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 y proporcionada con un codón de parada en su extremo 3'.

Los vectores de expresión adecuados para la expresión de varias IL-18BPs o IL-18BPs víricas en humanos y en otros mamíferos, es decir para terapia génica, pueden ser vectores víricos u otros tipos de vectores en los que se ha insertado un gen de IL-18BP o un ADNc de IL-18BP de un modo tal que permita una expresión eficaz de una IL-18BP en humanos y en otros mamíferos.

El aislamiento de IL-18BP puede llevarse a cabo de acuerdo con la invención, por ejemplo haciendo pasar un fluido humano, tal como orina o suero, a través de una columna cromatográfica a la que se ha acoplado IL-18, y después de eso eluyendo la IL-18BP ligada.

Las diversas IL-18BPs también pueden prepararse a través de medios recombinantes, es decir, mediante la expresión de IL-18BP en un hospedante adecuado, tras ligar operativamente promotores, potenciadotes de la expresión, secuencias reguladoras, etc., adecuadas para el hospedante concreto empleado, por ejemplo que permitan la expresión en la orientación correcta.

Las diversas IL-18BPs e IL-18BPs víricas, y los vectores para expresar IL-18BP en humanos y otros mamíferos, pueden emplearse en el tratamiento y la paliación de afecciones en las que está implicada la IL-18, o provocadas por un exceso de IL-18 administrada exógenamente o producida endógenamente. Dichas afecciones son, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, diabetes de tipo I, artritis reumatoide, rechazos de injertos, enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, esclerosis múltiple, enfermedades cardiacas isquémicas (que incluyen ataques al corazón), lesiones cerebrales isquémicas, hepatitis crónica, soriasis, pancreatitis crónica, pancreatitis aguda y otros similares.

De acuerdo con la presente invención, se aisló IL-18BP a partir de orina normal humana empleando una única etapa cromatográfica. Se cargó una preparación de proteínas urinarias humanas no purificada concentrada a partir de 500 L de orina humana normal en una columna que consiste en IL-18 humana ligada a agarosa. La columna fue lavada y las proteínas ligadas fueron eluidas a pH bajo. Las fracciones eluidas fueron neutralizadas y se analizaron alícuotas mediante SDS-PAGE (poliacrilamida al 10%) en condiciones no reductoras y con tinción de plata. Se obtuvo específicamente una banda de proteína de aproximadamente 40 kD en las fracciones eluidas (Figura 1).

La proteína de aproximadamente 40 kD obtenida en la primera etapa fue identificada como una proteína de unión de IL-18 por su capacidad para entrelazarse específicamente con ^{125}I-IL-18 (Figura 2). La proteína de aproximadamente 40 kD fue caracterizada también mediante análisis de secuencia proteica N-terminal. Se tomaron alícuotas de la proteína eluida y se las sometió a SDS-PAGE, electrotinción con una membrana de PVDF y a análisis de microsecuencia proteica. De forma similar, se sometieron alícuotas de la proteína eluida a análisis directo de microsecuencia proteica. En ambos casos, se obtuvieron dos secuencias de polipéptidos. Una secuencia principal y una secuencia secundaria, correspondiente esta última a un fragmento de defensina humana (número de acceso p11398), que empiezan en el aminoácido 65. La sustracción de la secuencia de defensina conocida proporcionó la siguiente secuencia:

100

en la que x representa un aminoácido todavía sin determinar.

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Con el fin de obtener una secuencia más larga y más precisa, y con el fin de identificar residuos de cisteína potenciales, se redujo una alícuota de la fracción eluida con DTT en condiciones desnaturalizantes, se hizo reaccionar con 4-vinil piridina, se desaló mediante un dispositivo de micro-ultrafiltración (Ultrafree, límite 10.000 Da, Millipore) y se sometió a análisis de microsecuencia proteica. Tras el ciclo Nº 1 de secuenciamiento, la proteína residual se hizo reaccionar con o-ftalaldehído para bloquear todos los polipéptidos N-terminales que no eran Pro, y a continuación se retomó el secuenciamiento. De este modo se obtuvo la siguiente secuencia proteica sencilla:

101

(T=Thr; P=Pro; V=Val; S=Ser; Q=Gln; X=Desconocido; A=Ala; R=Arg; K=Lys; D=Asp; C=Cys; F=Phe; L=Leu; E=Glu)

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La secuencia resultante es significativamente diferente a la de cualquier otra proteína conocida, según pudo determinarse buscando en las bases de datos de proteínas. Sin embargo, buscando en la base de datos de The Institute of Genomic Research (TIGR) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) mediante el programa de búsqueda tblastn se obtuvo un archivo de ADNc, denominado THC123801, cuyo marco de lectura abierto (218 codones), una vez traducido, contiene una secuencia altamente homóloga a la de la secuencia N-terminal de la IL-18BP. Dicha homología se muestra a continuación:

1

(La secuencia superior (1-40) es la de la IL-18BP aislada según la invención; la secuencia inferior (51-100) se deduce por traducción del ADNc del archivo de TIGR THC123801)

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Sin embargo, la secuencia de ADNc identificada como THC123801 es solo una EST (etiqueta de secuencia expresada, del inglés "expressed sequence tag"), es decir, un clon de ADNc seleccionado aleatoriamente. Nunca se ha analizado si dicha EST contiene un marco de lectura abierto, o si una proteína es expresada a partir del gen correspondiente a la EST o a partir de la propia EST, ni se ha identificado nunca ninguna función de proteína codificada por THC123801. No se disponía de ninguna información de que THC123801 contuviera un marco de lectura abierto que codifica para una IL-18BP.

La IL-18BP urinaria purificada mediante afinidad retuvo la capacidad de unirse a su ligando marcado (^{125}I-IL-18) y, tras reticulado covalente, se obtuvo un complejo de peso molecular 58 kD. El peso molecular de dicho complejo correspondió a una relación 1:1 de la IL-18BP de aproximadamente 40 kD y de la IL-18 de 19 kD (Figura 2).

La IL-18BP urinaria purificada mediante afinidad bloqueó la actividad biológica de IL-18 humana y de ratón. Por tanto, cuando se añadió IL-18BP a IL-18 humana o de ratón bloqueó la actividad de la IL-18 para inducir la producción de interferón-\gamma cuando se añade junto con lipopolisacárido (LPS) a cultivos de células de bazo de ratón (Figura 3).

Para el propósito de la presente descripción la expresión "actividad biológica de IL-18" se refiere, entre otros, a al menos una de las siguientes propiedades biológicas:

(i)

inducción de IFN-\gamma, principalmente como co-estimulante con mitógenos, IL-1, IL-12, TNF-\alpha, LPS en diversos tipos celulares, tales como células mononucleares, esplenocitos, células mononucleares sanguíneas periféricas humanas, línea celular KG-1 humana y células T,

(ii)

potenciación de la proliferación de células T,

(iii)

potenciación de la producción de citoquina Th-1, principalmente como co-estimulante,

(iv)

sinergismo con IL-12 en términos de producción potenciada de IFN-\gamma, acción co-estimuladora para la producción de IFN-\gamma y otras citoquinas T-célula colaboradora-1,

(v)

acción co-estimuladora para citotoxicidad mediada por ligando FAS de clones de células asesinas naturales murinas,

(vi)

inducción de la activación de NF-\kappaB en células KG-1 humanas, probablemente induciendo la formación del homodímero 50 NF-\kappaB y el heterodímero p65/p50 NF-\kappaB,

(vii)

inducción de IL-8.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "unión a IL-18" significa la capacidad de IL-18BP para unirse a IL-18, por ejemplo, tal como queda patente por su unión a IL-18 marcada cuando es purificada por afinidad como en el presente Ejemplo 2.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "modular la actividad de IL-18" significa la capacidad de la IL-18BP para modular cualquier actividad de IL-18 que no sea bloquear, por ejemplo una inhibición parcial, un aumento, o similar.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "bloquear la actividad de IL-18" se refiere a la actividad de la IL-18BP para bloquear al menos una de los anteriores ejemplos de actividad biológica de la IL-18. La actividad de bloqueo de IL-18 de la IL-18BP queda patente por la capacidad de la IL-18BP para bloquear la expresión de IFN-\gamma asociada a IL-18 en esplenocitos murinos. Como se demostrará más adelante con más detalle, la actividad de modulación o de bloqueo de la IL-18BP se debe en parte al hecho de que la IL-18BP inhibe la activación de NF-\kappaB por IL-18. Además, la IL-18BP bloquea al menos una de las siguientes actividades de la IL-18, a saber, la inducción de IFN-\gamma en células humanas y de ratón, la inducción de IL-8 y la activación de NF-\kappaB.

Se preparó una sonda de ADN para escrutar bibliotecas de ADNc mediante PCR de trascripción inversa con cebadores específicos sentido y antisentido y ARN de células T Jurkat con cebadores de la secuencia TIGR. El producto PCR resultante fue confirmado mediante análisis de secuencia de ADN. Dicho producto PCR fue marcado con ^{32}[P] y usado como sonda para escrutar cuatro bibliotecas de ADN humano, derivó de monolitos sanguíneos periféricos, de la línea de células T Jurkat, de PBMC y de bazo humano. Los diversos clones de ADNc independientes correspondieron a cuatro variantes de división de la IL-18BP (SEC ID Nº: 1, 3, 5 y 7). Todas las variantes de división codificaron para proteínas secretadas solubles putativas. La más abundante (IL-18BPa) tenía un marco de lectura abierto de 192 codones, que codifica para un péptido señal y que en la presente memoria se denomina a veces "secuencia líder" de 28 residuos de aminoácido seguidos por una IL-18BPa putativa madura, cuyos primeros 40 residuos coinciden perfectamente con la secuencia proteica N-terminal de la IL-18BP urinaria (SEC ID Nº: 2). La posición de los residuos de cisteína sugirió que este polipéptido pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig). Cabe destacar que cada uno de los cuatro residuos de Gln de la IL-18BPa madura era una posición potencial de N-glicosilación. Las otras tres variantes de la IL-18BP eran menos abundantes que la IL-18BPa. Incluían un ADNc de IL-18PBb más corto, de 1 kb, que codifica para un péptido señal de 28 residuos de aminoácido seguidos de una proteína madura de 85 residuos de aminoácido (SEC ID Nº: 4). Una tercera variante, la IL-18PBc, estaba representada por un ADNc de 2,3 kb, que codifica para un péptido señal de 28 residuos de aminoácido seguidos de una IL-18BP madura de 169 residuos de aminoácido (SEC ID Nº: 6). La cuarta variante, IL-18BPd, codificaba para un péptido señal de 28 residuos de aminoácido seguidos de una IL-18BP madura de 133 residuos de aminoácido (SEC ID Nº: 8).

Para estudiar en más detalle la posible existencia de otras variantes de división de la IL-18BP, se escrutó una biblioteca genómica humana con una sonda correspondiente al ADNc de longitud completa de la IL-18BP. En esta biblioteca se identificaron cinco clones genómicos, de distinta longitud. Dichos clones fueron sometidos a análisis de secuencia de ADN con cebadores externos e internos. En conjunto, se montó una secuencia de 7,8 kb a partir de estos clones (SEC ID Nº: 9). No se identificó ningún exón que codificara para un receptor trans-membrana (TM) en la secuencia de 7,8 kb. Todas las variantes compartían una posición de inicio de la traducción común, codificada para el mismo péptido señal de 28 residuos de aminoácido y proteínas maduras solubles de diversos tamaños y secuencias C-terminales. La localización de la IL-18BP contiene un gen adicional, que codifica para la proteína de aparato mitótico nuclear 1 (NUMA1), posicionada en la cadena menos. Este descubrimiento localiza el gen de IL-18BP en el cromosoma humano 11q13 (36).

Se llevó a cabo una búsqueda de homología con la secuencia proteica completa de la IL-18BPa y la base de datos GenPept (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), usando el algoritmo Smith Watermann. Se descubrió que los homólogos de la IL-18BP son expresados en varios virus de la viruela como proteínas secretadas de función previamente desconocida. Se ha publicado previamente que los virus codifican para varios receptores de citoquina y que dichas moléculas codificadas víricamente sirven como receptores de señuelo que inhiben las respuestas inmunes neutralizando sus correspondientes citoquinas (revisado por Spriggs, MK, 1994, Curr. Opin. Immunol., 6, 526-529). Por lo tanto, la invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden un homólogo codificado víricamente de la IL-18BP que se une a IL-18 y que bloquea la producción de IFN-\gamma inducida por IL-18. En la Tabla 1 se proporcionan ejemplos de homólogos codificados víricamente de la IL-18BP.

De acuerdo con la presente invención, el homólogo codificado víricamente de la IL-18BP puede estar expresado en un hospedante procariótico o eucariótico. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "homólogo codificado víricamente de IL-18BP" se refiere a una similitud de al menos el 50% en una secuencia de al menos 70 residuos de aminoácido. Más preferiblemente, tiene una similitud de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o, más preferiblemente, al menos el 90%, en una secuencia de 100 residuos de aminoácido.

TABLA 1 Proteínas codificadas víricamente, que muestran una elevada homología con la IL-18BP humana

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La IL-18BPa fue expresada en células COS7 de mono. Para este propósito, se insertó el ADNc de IL-18BPa en el vector de expresión de mamífero pEF-BOS. Se añadió una casete que codifica para una secuencia (His)_{6} en el extremo 3' del ORF de IL-18BP en el marco, con el objetivo de facilitar la purificación de la proteína recombinante. Se transfectaron de forma temporal células COS7 con el vector de expresión y se concentró el medio libre de suero de dichas células (150 mL) y se purificó mediante cromatografía de quelación de metales. La IL-18BPa apareció como una banda sencilla en el SDS-PAGE con tinción de plata en condiciones reductoras y no reductoras, y presentó la misma masa molecular aparente que la IL-18BP urinaria. El análisis de secuencia proteica de dicha preparación reveló la misma secuencia N-terminal que la IL-18BP urinaria. El análisis de inmunotinción de la IL-18BPa con anticuerpos elevados contra la IL-18BP urinaria reveló la misma banda de masa molecular que la proteína urinaria. Además, usando inmunoprecipitación seguida de SDS-PAGE y autorradiografía, la IL-18BPa fue capaz de desplazar la ^{125}I-IL-18BP urinaria de la unión del anticuerpo. Por lo tanto, la IL-18BPa corresponde estructuralmente a la IL-18BP aislada de la orina.

Se evaluó IL-18BPa purificada y sin purificar para determinar su capacidad para inhibir la actividad biológica de la IL-18. La IL-18BPa inhibió la actividad de IL-18 humana y de ratón en esplenocitos murinos, PBMC y la línea de células humanas KG-1 (Figura 9). Estos resultados confirman la identidad de ADNc de IL-18BPa como la que codifica para una IL-18BP biológicamente activa.

La invención se refiere además a muteínas de IL-18BPs y a IL-18BPs víricas y a proteínas fusionadas que consisten en IL-18BPs naturales e IL-18BPs víricas, o sus muteínas o sus fragmentos, fusionadas a otro polipéptido o proteína, y que son capaces de unirse a IL-18 y de bloquear la producción de IFN-\gamma inducida por IL-18.

Tal como se usa en la presente invención, el término "muteínas" se refiere a análogos de una IL-18BP, o a análogos de una IL-18BP vírica, en los que uno o más residuos de aminoácido de una IL-18BP natural o una IL-18BP vírica son sustituidos por diferentes residuos de aminoácido, o son eliminados, o uno o más residuos de aminoácido son añadidos a la secuencia natural de una IL-18BP, o de una IL-18BP vírica, sin cambiar considerablemente la capacidad de los productos resultantes en comparación con la IL-18BP natural o la IL-18BP vírica para unirse a IL-18 y para bloquear la producción de IFN-\gamma inducida por IL-18. Dichas muteínas se preparan empleando técnicas de síntesis y/o de mutagénesis dirigida a una posición conocidas, o mediante cualquier técnica conocida adecuada para ello.

Cualquier muteína de este tipo presenta preferiblemente una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la de una IL-18BP, o suficientemente duplicativa de la de una IL-18BP vírica, tal como que presente una actividad sustancialmente similar a la de una IL-18BP. Una actividad de la IL-18BP es su capacidad para unirse a IL-18. Siempre que la muteína presente una actividad de unión a IL-18 sustancial, puede usarse en la purificación de IL-18, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad, y por tanto puede considerarse que tiene una actividad sustancialmente similar a la IL-18BP. Por lo tanto, se puede determinar si una muteína dada tiene sustancialmente la misma actividad que la IL-18BP por medio de experimentos rutinarios que comprenden someter dicha muteína, por ejemplo, a un ensayo competitivo de sándwich sencillo para determinar si se une o no a una IL-18 marcada apropiadamente, tal como un radioinmunoensayo o un ensayo ELISA.

En una realización preferida, cualquier muteína de este tipo tiene al menos un 40% de identidad o de homología con respecto a la secuencia de una IL-18BP o de un homólogo de IL-18BP codificado líricamente. Más preferiblemente, tiene una identidad o una homología al menos del 50%, al menos del 60%, al menos del 70%, al menos del 80% o, más preferiblemente, al menos del 90%.

Las muteínas de polipéptidos de IL-18BP o las muteínas de IL-18BPs víricas, que pueden usarse de acuerdo con la presente invención, o el ácido nucleico que codifica para ellas, incluyen un conjunto finito de secuencias sustancialmente correspondientes como péptidos o polinucleótidos de sustitución que pueden ser obtenidas de forma rutinaria por el especialista en la técnica, sin una experimentación innecesaria, en base a las enseñanzas y las guías presentadas en la presente memoria. Para una descripción detallada de la química y la estructura de las proteínas véase Schulz, G.E. y col., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, Nueva York, 1978; y Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, que se incorporan a la presente memoria a modo de referencia. Para una presentación de sustituciones de secuencia de nucleótidos, tal como preferencias de codones, véase Ausubel y col., ver arriba, en \NAK\NAK A.1.1-A.1.24, y Sambrook y col., ver arriba, en Apéndices C y D.

Los cambios preferidos para muteínas de acuerdo con la presente invención son lo que se conoce como sustituciones "conservativas". Las sustituciones conservativas de aminoácidos de polipéptidos o proteínas de IL-18BP o de IL-18BPs víricas pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo que tiene propiedades fisicoquímicas suficientemente similares, de tal modo que la sustitución entre miembros del grupo conservará la función biológica de la molécula, Grantham, Science, Volumen 185, páginas 862-864 (1974). Está claro que también se pueden hacer inserciones y eliminaciones de aminoácidos en las secuencias anteriormente definidas sin alterar su función, particularmente si las inserciones o eliminaciones solamente implican unos pocos aminoácidos, por ejemplo, por debajo de treinta, y preferiblemente por debajo de diez, y no eliminan o desplazan aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, por ejemplo, residuos de cisteína, Anfinsen, "Principles That Govern The Folding of Protein Chains", Science, Volumen 181, páginas 223-230 (1973). Las proteínas y muteínas producidas mediante dichas eliminaciones y/o inserciones entran dentro del ámbito de la presente invención.

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Sin embargo, los residuos de cisteína que no son requeridos para la actividad biológica pueden ser reemplazados por otros residuos, por ejemplo con el fin de evitar la formación de puentes de disulfuro intra o intermoleculares no deseados que puedan provocar una reducción en la actividad de las IL-18BPs.

Preferiblemente, los grupos aminoácido sinónimos son los definidos en la Tabla I. Más preferiblemente, los grupos aminoácido sinónimos son los definidos en la Tabla II; y aún más preferiblemente los grupos aminoácido sinónimos son los definidos en la Tabla III.

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TABLA I Grupos Preferidos de Aminoácidos Sinónimos

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TABLA II Grupos Más Preferidos de Aminoácidos Sinónimos

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TABLA III Grupos Aún Más Preferidos de Aminoácidos Sinónimos

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Los ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que pueden usarse para obtener muteínas de polipéptidos o proteínas de IL-18BP, o muteínas de IL-18BPs víricas, para su uso en la presente invención incluyen cualesquier etapas de método conocidas, tales como las presentadas en las Patentes de EE.UU. RE 33.653, 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462 a nombre de Mark y col.; 5.116.943 a nombre de Koths y col.; 4.965.195 a nombre de Namen y col.; 4.879.111 a nombre de Chong y col.; y las proteínas con lisina sustituida presentadas en la Patente de EE.UU. Nº 4.904.584 (Shaw y col.).

En otra realización preferida de la presente invención, cualquier muteína de una IL-18BP o de una IL-18BP vírica, tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde esencialmente a la de una IL-18BP, o a la de una IL-18BP vírica. La expresión "corresponde esencialmente" pretende comprender proteínas con cambios menores respecto a la secuencia de la proteína natural que no afectan a las características básicas de las proteínas naturales, particularmente en la medida de su capacidad para unirse a IL-18. El tipo de cambios que generalmente se consideran dentro del lenguaje de "corresponde esencialmente" son aquellos que se producirían como resultado de técnicas convencionales de mutagénesis del ADN que codifica dichas proteínas, dando como resultado unas pocas modificaciones menores, y escrutando en busca de la actividad deseada del modo discutido anteriormente. Además de unirse a la IL-18, las muteínas también modulan y/o bloquean la actividad de IL-18.

Las muteínas de acuerdo con la presente invención incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, que se hibrida con ADN o ARN, que codifica una IL-18BP o una IL-18BP vírica, de acuerdo con la presente invención, en condiciones de severidad. La invención también incluye dicho ácido nucleico, que también es útil como sonda para la identificación y la purificación del ácido nucleico deseado. Además, dicho ácido nucleico sería un candidato a cebador para determinar si codifica un polipéptido, que retenga la actividad funcional de una IL-18BP de la presente invención. La expresión "condiciones de severidad" se refiere a condiciones de hibridación y posterior lavado, que los especialistas en la técnica denominan convenientemente "de severidad". Véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, ver arriba, Interscience N.Y., \NAK\NAK6.3 y 6.4 (1987, 1992), y Sambrook y col, ver arriba. Sin limitación, los ejemplos de condiciones de severidad incluyen condiciones de lavado 12-20ºC por debajo de la Tm calculada para el híbrido en estudio, por ejemplo, 2 x SSC y 0,5% SDS durante 5 minutos, 2 x SSC y 0,1% SDS durante 15 minutos; 0,1 x SSC y 0,5% SDS a 37ºC durante 30-60 minutos y a continuación, 0,1 x SSC y 0,5% SDS a 68ºC durante 30-60 minutos. Los especialistas en la técnica comprenderán que las condiciones de severidad también dependen de la longitud de las secuencias de ADN, de las sondas de oligonucleótidos (tal como 10-40 bases) o de las sondas de oligonucleótidos mixtos. Si se usan sondas mixtas, es preferible usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de SSC. Véase Ausubel, ver arriba.

La invención incluye además ácidos nucleicos que codifican para IL-18BP de acuerdo con la presente invención, pero que difieren en la secuencia de codón debido a la degeneración del código genético. Dicho ADN, que posiblemente no se hibrida en condiciones de severidad con las secuencias de ADN mostradas en las Figuras 4 a 7, pero que aún así es capaz de codificar una IL-18BP de acuerdo con la presente invención también es abarcado por la invención.

La expresión "proteína fusionada" se refiere a un polipéptido que comprende una IL-18BP, o una muteína de la misma, fusionada con otra proteína que, por ejemplo, tiene un tiempo de residencia extendido en los fluidos corporales. Por tanto, una muteína puede estar fusionada a otra proteína, polipéptido o similar, por ejemplo, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. También puede estar fusionada a polietilenglicol (PEG) a fin de prolongar el tiempo de residencia.

El término "sales" se refiere en la presente memoria tanto a sales de grupos carboxílicos como a sales ácidas de adición de grupos amino de una IL-18BP, muteínas o proteínas fusionadas de la misma. Las sales de un grupo carboxílico pueden formarse por medios conocidos en la técnica e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, férricas o de zinc, y otras similares, y sales con bases orgánicas como las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales ácidas de adición incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Por supuesto, cualquier sal debe tener una actividad sustancialmente similar a la IL-18BP.

"Derivados modificados químicamente", tal como se usa en la presente memoria, cubre derivados de IL-18BPs y sus muteínas y proteínas fusionadas, que pueden prepararse por ejemplo a partir de grupos funcionales que se presentan como cadenas laterales en los residuos o los grupos N- ó C-terminales, por medios conocidos en la técnica, y que se incluyen en la invención siempre que sean farmacéuticamente aceptables, es decir que no destruyan la actividad de la proteína que es sustancialmente similar a la actividad de la IL-18BP, y no confieran propiedades tóxicas a las composiciones que las contengan. Estos derivados pueden, por ejemplo, incluir cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden enmascarar sitios antigénicos y prolongar la residencia de una IL-18BP en los fluidos corporales. Otros derivados incluyen ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoníaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino libres de los residuos de aminoácido formados con restos de acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo o aroilo carbocíclicos) o derivados O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo los de residuos de serilo o treonilo) formados con restos acilo.

La expresión "derivados permutados circularmente" tal como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula lineal en la que los extremos han sido unidos, bien directamente o bien a través de un ligando, para producir una molécula circular, y a continuación la molécula circular es abierta en otra localización para producir una nueva molécula lineal con extremos diferentes a los extremos de la molécula original. Las permutaciones circulares incluyen aquellas moléculas cuya estructura es equivalente a una molécula que ha sido ciclada y después abierta. Por tanto, una molécula permutada circularmente puede ser sintetizada desde cero como una molécula lineal y nunca sufrir una etapa de ciclación y apertura. La preparación de derivados permutados circularmente se describe en el documento WO95/27732.

Varias células recombinantes tales como células procarióticas, por ejemplo E. coli, u otras células eucarióticas, tales como levadura o células de insecto pueden producir IL-18BPs. Los métodos para construir vectores apropiados, que porten ADN que codifica para una IL-18BP y adecuados para transformar (por ejemplo, E. coli, células de mamífero y células de levadura); o infectar células de insecto con el objetivo de producir una IL-18BP recombinante son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Ausubel y col., editores, "Current Protocols in Molecular Biology" Current Protocols, 1993; y Sambrook y col., eds. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989.

Para los propósitos de expresión de proteínas de IL-18BP, se inserta ADN que codifica una IL-18BP, muteínas o proteínas fusionadas, y las señales reguladoras de la traducción y la trascripción ligadas operativamente, en vectores que son capaces de integrar las secuencias génicas deseadas en el cromosoma celular hospedante. Con el fin de ser capaz de seleccionar las células que han integrado de forma estable el ADN introducido en sus cromosomas, se usa uno o más marcadores que permiten la selección de células hospedantes que contienen el vector de expresión. El marcador puede proporcionar prototrofia a un hospedante auxotrópico, resistencia biocida, por ejemplo, antibióticos, o resistencia a metales pesados, tal como cobre o similar. El gen marcador seleccionable puede estar ligado directamente a las secuencias génicas de ADN que se van a expresar, o puede introducirse en la misma célula mediante cotransfección. También pueden necesitarse elementos adicionales para una síntesis óptima de ARNm de proteína de unión de cadena sencilla. Dichos elementos pueden incluir señales de división, así como promotores de la trascripción, potenciadores y señales de terminación.

Dicha molécula de ADN que se va a introducir en las células seleccionadas preferiblemente será incorporada en un plásmido o vector vírico capaz de replicación autónoma en el hospedante receptor. Los plásmidos procarióticos preferidos son los derivados de pBr322. Los vectores eucarióticos preferidos incluyen BPV, vaccinia, SV40, círculo de 2 micras, etc., o sus derivados. Dichos plásmidos y vectores son bien conocidos en la técnica (2-5, 22). Una vez que el vector o la secuencia de ADN que contiene la(s) construcción(es) ha sido preparado para expresión, el vector de expresión puede ser introducido en una célula hospedante apropiada mediante cualquiera de una serie de medios adecuados, tales como transformación, transfección, lipofección, conjugación, fusión de protoplasto, electroporación, precipitación de fosfato cálcico, microinyección directa, etc.

Las células hospedantes que se van a usar en la presente invención pueden ser procarióticas o eucarióticas. Los hospedantes procarióticos preferidos incluyen bacterias tales como E coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, etc. El hospedante procariótico más preferido es E. coli. Los hospedantes bacterianos de interés particular incluyen la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F^{-}, lambda^{-}, fototrópico, ATCC 27325). En dichas condiciones, la proteína no será glicosilada. El hospedante procariótico debe ser compatible con la réplica y con las secuencias de control del plásmido de expresión.

Sin embargo, puesto que las IL-18BPs naturales son proteínas glicosiladas, se prefieren los hospedantes eucarióticos sobre los procarióticos. Los hospedantes eucarióticos preferidos son células de mamífero, por ejemplo, células humanas, de mono, de ratón y células de ovario de hámster Chino (CHO), debido a que proporcionan modificaciones post-traducción a las moléculas proteicas que incluyen un correcto plegado, una correcta formación de enlaces de disulfuro, así como una glicosilación en las posiciones correctas. Asimismo, las células de insecto y de levadura pueden llevar a cabo modificaciones de péptido post-traducción que incluyen la glicosilación de manosa superior.

Existe una serie de estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias de promotor fuertes y un elevado número de copias de plásmidos, que pueden utilizarse para la producción de las proteínas deseadas en células de levadura y de insecto. Las células de levadura y de insecto reconocen secuencias líderes en productos génicos de mamíferos clonados y secretan IL-18BP madura. Tras la introducción del vector, las células hospedantes son cultivadas en un medio selectivo, que selecciona en función del crecimiento de células que contienen vector. La expresión de la(s) secuencia(s) génica(s) clonada(s) da como resultado la producción de una IL-18BP, proteínas de fusión o muteínas de la misma. Los procedimientos de clonación, aislamiento de clones, identificación, caracterización y secuenciamiento mencionados anteriormente se describen con más detalle a continuación en los Ejemplos.

Las proteínas expresadas son aisladas y purificadas a continuación mediante cualquier procedimiento convencional que implica extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis, o similar, o mediante cromatografía de afinidad, por ejemplo usando anticuerpos monoclonales anti-IL-18BP inmovilizados sobre una matriz de gel contenida en el interior de una columna. Las preparaciones sin purificar que contienen dicha IL-18BP recombinante se hacen pasar a través de la columna, mediante lo cual la IL-18BP queda ligada a la columna a través del anticuerpo específico a la vez que las impurezas pasan de largo. Después de lavar, la proteína es eluida del gel en las condiciones empleadas habitualmente para este propósito, es decir a un alto o un bajo pH, por ejemplo pH 11 ó pH 2.

La invención se refiere además a vectores útiles para la expresión de una IL-18BP o sus derivados en mamíferos y más específicamente en humanos. Los vectores para la expresión a corto y largo plazo de genes en mamíferos son bien conocidos en la bibliografía. Algunos estudios han demostrado que la administración de genes a, por ejemplo, músculo esquelético, músculo liso vascular e hígado da como resultado niveles sistémicos de proteínas terapéuticas. El músculo esquelético es una diana útil debido a su gran masa, vascularidad y accesibilidad. Sin embargo, otras dianas y particularmente precursores de médula ósea de células inmunes han sido usados con éxito. Los vectores actualmente disponibles para la expresión de proteínas en por ejemplo músculo incluyen ADN plásmido, liposomas, conjugados proteína-ADN y vectores basados en adenovirus, virus adeno-asociados y virus del herpes. Entre ellos, los vectores basados en virus adeno-asociados (AAV) han sido los más útiles con respecto a la duración y a los niveles de expresión génica y
con respecto a las consideraciones de seguridad (Kessler, P.D. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14082-14087).

Los procedimientos para la construcción de un vector basado en AAV han sido descritos con detalle (Snyder y col., 1996, Current Protocols in Human Genetics, Capítulos 12.1.1-12.1.17, John Wiley & Sons) y se incorporan a esta patente. En resumen, el plásmido psub201, que contiene el genoma de AAV natural, es cortado con la enzima de restricción Xba I y ligado con una construcción que consiste en un promotor eucariótico eficiente, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus, una secuencia de consenso de Kozak, una secuencia de ADN que codifica para una IL-18BP o sus muteínas o proteínas de fusión, una región 3' no traducida adecuada y una señal de poliadenilación, por ejemplo la señal de poliadenilación del virus 40 de simio. El plásmido recombinante resultante es cotransfectado con un plásmido de AAV colaborador, por ejemplo pAAV/Ad en células de mamífero, por ejemplo células T293 humanas. A continuación los cultivos son infectados con adenovirus como virus colaborador y los sobrenadantes de los cultivos son recolectados después de 18-60 horas. Los sobrenadantes son fraccionados mediante precipitación de sulfato de amonio, purificados en un gradiente de densidad de CsCl, dializados y a continuación calentados hasta 56ºC para destruir cualquier adenovirus, mientras que el AAV recombinante resultante, capaz de expresar IL-18BP o una IL-18BP vírica, o sus muteínas o proteínas de fusión, permanece estable en esta etapa.

Hasta el momento, no se ha establecido el papel fisiológico de los receptores de citoquinas solubles. Los receptores solubles se unen a sus ligandos específicos y en la mayoría de los casos inhiben su actividad biológica, tal como se demostró, por ejemplo, en el sistema TNF (11, 12). En muy pocos casos, por ejemplo la IL-6, el receptor soluble potencia la actividad biológica. Se descubrió que el receptor TNF soluble recombinante, también conocido como TBP (proteína de unión de TNF), prevenía el choque séptico en modelos de animales, mientras que las formas solubles del receptor IL-1 tenían efectos profundamente inhibidores sobre el desarrollo de aloreactividad in vivo en receptores de aloinjertos de ratón.

De formar similar, las IL-18BPs y las IL-18BPs víricas de la presente invención pueden encontrar un uso como modulares de la actividad de IL-18, por ejemplo en la diabetes de tipo I, en la sepsis, en enfermedades autoinmunes, en rechazos de injertos, en artritis reumatoide, en la enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, esclerosis múltiple, enfermedad cardiaca isquémica que incluye los ataques agudos al corazón, lesiones cerebrales isquémicas, hepatitis crónica, soriasis, hepatitis crónica y hepatitis aguda. Por tanto pueden usarse, por ejemplo, en cualquier enfermedad en la que la producción endógena o la administración exógena de IL-18 induzcan la enfermedad o agrave la situación del paciente.

La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y una IL-18BP o una IL-18BP vírica de la invención, o sus muteínas, proteínas fusionadas y sus sales o sus derivados modificados químicamente, activos.

La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y, por ejemplo, un vector vírico tal como uno cualquiera de los vectores víricos basados en AAV mencionados, u otro vector que exprese una IL-18BP o sus muteínas o proteínas de fusión, y que sea adecuado para la administración a humanos y otros mamíferos para el propósito de alcanzar la expresión in vivo de IL-18BP o sus muteínas o fragmentos o proteína de fusión de la invención, es decir para su uso en terapia génica.

Las composiciones farmacéuticas de la invención están preparadas para administración mediante mezclamiento de una IL-18BP o una IL-18BP vírica, o sus derivados, o vectores para expresar las mismas con vehículos fisiológicamente aceptables, y/o estabilizantes y/o excipientes, y se preparan en formas dosificables, por ejemplo, mediante liofilización en viales de dosificación. El método de administración puede ser mediante cualquiera de los modos aceptados de administración para agentes similares y dependerá de la afección que se vaya a tratar, por ejemplo, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, mediante inyección local o aplicación tópica, o continuamente mediante infusión, etc. La cantidad de compuesto activo a administrar dependerá de la ruta de administración, de la enfermedad que va a ser tratada y de la condición del paciente. La inyección local, por ejemplo, requerirá una menor cantidad de la proteína en relación al peso corporal que la infusión intravenosa.

Por consiguiente, las IL-18BPs, o las IL-18BPs víricas, o los vectores que las expresan in vivo, están indicados para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, diabetes de Tipo I, artritis reumatoide, rechazos de injertos, enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, esclerosis múltiple, enfermedad cardiaca isquémica que incluye ataques agudos al corazón, lesiones cerebrales isquémicas, hepatitis crónica, soriasis, pancreatitis crónica y pancreatitis aguda, y enfermedades similares, en las que se produce una expresión aberrante de IL-18 que conduce a un exceso de IL-18, o en casos de complicaciones debidas a IL-18 administrada exógenamente.

La invención también incluye anticuerpos contra una IL-18BP. El término "anticuerpo" pretende incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (MAbs), anticuerpos quiméricos, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) de anticuerpos que pueden ser marcados en forma soluble o ligada, y anticuerpos humanizados, así como fragmentos de los mismos, proporcionados mediante cualquier técnica conocida tal como ruptura enzimática, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes, aunque sin limitarse a ellas.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de sueros de animales inmunizados con un antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos de antígenos, población que contiene posiciones de unión de epítopos sustancialmente similares. Los MAbs se pueden obtener mediante métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Patente de EE.UU. Nº 4.376.110; Ausubel y col., eds., ver arriba, Harlow y Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan y col., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), cuyos contenidos completos se incorporan a la presente memoria a modo de referencia. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas. Se puede cultivar un hibridoma que produzca un Mab de la presente invención in vitro, in situ o in vivo. La producción de altos títulos de MAbs in vivo o in situ hace de éste el método de producción preferido actualmente.

Los anticuerpos quiméricos son moléculas, de los cuales diferentes porciones derivan de diferentes especies animales, tal como las que tienen una región variable derivada de un MAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se usan principalmente para reducir la inmunogenicidad aplicada y para aumentar los rendimientos de producción, por ejemplo, cuando los MAbs murinos tienen rendimientos elevados a partir de hibridomas pero una mayor inmunogenicidad en humanos, de tal modo que se usan MAbs quiméricos humano/murino. Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción son conocidos en la técnica (Cabilly y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne y col., Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly y col., Solicitud de Patente Europea 125023 (publicada el 14 de noviembre de 1984); Neuberger y col., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi y col., Solicitud de Patente Europea 171496 (publicada el 19 de febrero de 1985); Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Neuberger y col., Solicitud PCT WO 8601533 (publicada el 13 de marzo de 1986); Kudo y col., Solicitud de Patente Europea 184187 (publicada el 11 de junio de 1986); Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Sahagan y col., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson y col., Publicación de Patente Internacional WO 9702671 (publicada el 7 de mayo de 1987); Liu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Better y col., Science 240: 1041-1043 (1988); y Harlow y Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, ver arriba. Estas referencias se incorporan por completo a la presente memoria a modo de referencia.

Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce generalmente determinantes únicos, asociados con la posición de unión de antígenos de un anticuerpo. Se puede preparar un anticuerpo Id inmunizando a un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, cepa de ratón) como fuente del MAb con el MAb del que se está preparando un anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo para dichos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id). Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.699.880, que se incorpora al completo a la presente memoria modo de referencia.

El anticuerpo anti-Id también puede usarse como "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en otro animal, produciendo el denominado anticuerpo anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al MAb original que indujo el anti-Id. Por tanto, usando anticuerpos de los determinantes idiotípicos de un MAb, es posible identificar otros clones que expresen anticuerpos de especificidad idéntica.

Por consiguiente, los MAbs generados contra IL-18BP y proteínas relacionadas de la presente invención pueden usarse para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados, tales como ratones BALB/c. Las células de bazo de dichos ratones inmunizados son usadas para producir hibridomas anti-Id que secretan MAbs anti-Id. Además, los MAbs anti-Id pueden acoplarse a un vehículo tal como hemocianina de lapa de ojo de herradura (KLH) y usarse para inmunizar otros ratones BALB/c. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de unión del MAb original específico de un epítopo o epítopos de IL-18BP o de una IL-18BP vírica.

Por tanto, los MAbs anti-Id tienen sus propios epítopos idiotípicos, o "idiótopos" que fueron obtenidos manipulando anticuerpos de ratón mediante métodos de ingeniería genética para ser más compatibles con el cuerpo humano. Dichos anticuerpos humanizados presentan una inmunogenicidad reducida y una farmacocinética mejorada en humanos. Pueden prepararse mediante técnicas conocidas en la técnica, tal como se describe, por ejemplo, para anticuerpos anti-TNF humanizados en Molecular Immunology, Vol. 30, Nº 16, páginas 1443-1453, 1993.

El término "anticuerpo" también pretende incluir tanto moléculas intactas como fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')_{2}, que son capaces de unirse a antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden presentar menos unión a tejido no específico que un anticuerpo intacto (Wahl y col., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). Cabe destacar que el Fab y el F(ab')_{2} y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención pueden usarse para la detección y la cuantificación de una IL-18BP o una IL-18BP vírica, de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria para moléculas de anticuerpos intactas. Dichos fragmentos se producen típicamente mediante ruptura proteolítica, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}).

Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para unir de este modo la molécula al anticuerpo. El término "epítopo" pretende referirse a la porción de cualquier molécula capaz de ser ligada por un anticuerpo que también puede ser reconocida por dicho anticuerpo. Los epítopos o "determinantes antigénicos" normalmente consisten en agrupamientos superficiales de moléculas activas químicamente tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

Un "antígeno" es una molécula o una porción de una molécula capaz de ser ligada por un anticuerpo que adicionalmente es capaz de inducir a un animal a producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de dicho antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo. La reacción específica mencionada antes pretende indicar que el antígeno reaccionará, de un modo altamente selectivo, con su correspondiente anticuerpo y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser suscitados por otros antígenos.

Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención pueden usarse para detectar cuantitativamente o cualitativamente una IL-18BP en una muestra o para detectar la presencia de células que expresan dichas proteínas de la presente invención. Esto puede llevarse a cabo mediante técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo marcado fluorescentemente (véase más adelante) acoplado con detección microscópica de luz, detección citométrica de flujo o detección fluorométrica.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención pueden emplearse histológicamente, como en microscopía de inmunofluorescencia o inmunoelectrónica, para la detección in situ de una IL-18BP. La detección in situ puede llevarse a cabo extrayendo un espécimen histológico de un paciente, y proporcionando un anticuerpo marcado de la presente invención a dicho espécimen. El anticuerpo (o fragmento) se proporciona preferiblemente aplicando o cubriendo con el anticuerpo (o fragmento) marcado una muestra biológica. Mediante el uso de dicho procedimiento, es posible determinar no solo la presencia de una IL-18BP sino también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente invención, los especialistas en la técnica percibirán fácilmente que se puede modificar cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tal como procedimientos de tinción) con el objetivo de lograr dicha detección in situ.

Dichos ensayos para una IL-18BP normalmente comprenden incubar una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de fluido, células recién cosechadas tales como linfocitos o leucocitos, o células que han sido incubadas en cultivo de tejido, en presencia de un anticuerpo marcado de forma detectable capaz de identificar IL-18BP y de detectar el anticuerpo por medio de cualquiera de una serie de técnicas bien conocidas en la técnica.

La muestra biológica puede ser tratada con un soporte o vehículo de fase sólida tal como nitrocelulosa, u otro soporte o vehículo sólido que sea capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. El soporte o vehículo puede ser lavado entonces con tampones adecuados y ser tratado con un anticuerpo marcado de forma detectable de acuerdo con la presente invención. El soporte o vehículo de fase sólida puede ser lavado entonces con el tampón una segunda vez para eliminar los anticuerpos no ligados. La cantidad de marca ligada sobre dicho soporte o vehículo sólido puede ser detectada a continuación empleando medios convencionales.

Por "soporte de fase sólida", "vehículo de fase sólida", "soporte sólido", "vehículo sólido", "soporte" o "vehículo" se entiende cualquier soporte o vehículo capaz de ligar antígeno o anticuerpos. Los soportes o vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, amilasas de nylon, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble en cierta medida o insoluble para los propósitos de la presente invención. El material soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural siempre que la molécula acoplada sea capaz de unirse a un antígeno o anticuerpo. Por tanto, la configuración del soporte o vehículo puede ser esférica, como en una perla, o cilíndrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o en la superficie exterior de una varilla. De forma alternativa, la superficie puede ser plana, tal como una hoja, tira de ensayo, etc. Los soportes o vehículos preferidos incluyen perlas de poliestireno. Los especialistas en la técnica conocerán otros muchos vehículos adecuados para ligar anticuerpos o antígenos, o serán capaces de determinar los mismos mediante el uso de experimentación rutinaria.

La actividad de unión de un lote dado de anticuerpos de acuerdo con la presente invención puede determinarse de acuerdo con métodos bien conocidos. Los especialistas en la técnica serán capaces de determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando experimentación rutinaria.

Se pueden añadir otras etapas tales como lavado, agitación, movimiento, filtración y similares, a los ensayos, según sea habitual o necesario en la situación particular.

Uno de los ensayos en los que un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser marcado de forma detectable es mediante la unión del mismo a una enzima y su uso en un inmunoensayo enzimático (EIA). Dicha enzima, a su vez, cuando se expone después a un sustrato apropiado, reaccionará con el sustrato de tal modo que producirá un resto químico que puede ser detectado, por ejemplo, por medio espectrofotométricos, fluorométicos o visuales. Las enzimas que pueden usarse como marca detectable del anticuerpo incluyen, aunque sin limitación, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilococal, delta-5-esteroide isomerasa, deshidrogenasa de alcohol de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinaestearasa. La detección puede llevarse a cabo mediante métodos colorimétricos, que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también puede llevarse a cabo mediante comparación visual de la extensión de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados de forma similar.

La detección se puede llevar a cabo usando cualquiera de una serie de inmunoensayos adicionales. Por ejemplo, marcando con radiactividad los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo es posible detectar una IL-18BP mediante el uso de un radioinmunoensayo (RIA). Una buena descripción de RIA puede encontrarse en Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, por Work, T.S. y col., North Holland Publishing Company, NY (1978) con referencia particular al capítulo titulado "An Introduction to Radioimmuno Assay and Related Techniques" por Chard, T. incorporado aquí a modo de referencia. El isótopo radioactivo puede ser detectado por medios como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o mediante autorradiografía.

También es posible marcar un anticuerpo de acuerdo con la presente invención con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado fluorescentemente es expuesto a una luz con la longitud de onda apropiada, su presencia puede ser detectada debido a la fluorescencia. Entre los compuestos marcadores fluorescentes usados más habitualmente se encuentran el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, la ficocianina, la aloficocianina, el o-ftalaldehído y la fluorescamina.

El anticuerpo también puede ser marcado de forma detectable usando metales que emiten fluorescencia tal como ^{152}Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo usando grupos quelantes de metales tales como el ácido dietilentriamino pentaacético (ETPA).

El anticuerpo también puede ser marcado de forma detectable acoplándolo a biotina. El anticuerpo biotinilado puede ser detectado mediante avidina o estreptoavidina acopladas a un compuesto fluorescente o a una enzima tal como peroxidasa o a un isótopo radioactivo y similar.

El anticuerpo también puede ser marcado de forma detectable acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado quimioluminiscentemente se determina a continuación detectando la presencia de la luminiscencia producida durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes particularmente útiles son el luminol, el isoluminol, el éster teromático de acridinio, el imidazol, la sal de acridinio y el éster de oxalato.

Igualmente, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se da en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes importantes para los propósitos de marcado son la luciferina, la luciferasa y la aecuorina.

Una molécula de anticuerpo de la presente invención puede ser adaptada para su utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como ensayo "dos-sitios" o "sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, se liga una cantidad de anticuerpo (o de fragmento de anticuerpo) no marcado a un soporte o vehículo sólido y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado de forma detectable para permitir la detección y/o la cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo en fase sólida, el antígeno y el anticuerpo marcado.

Los ensayos inmunométricos típicos, y preferidos, incluyen ensayos "hacia delante" en los que el anticuerpo ligado a la fase sólida se pone en primer lugar en contacto con la muestra que está siendo evaluada para extraer el antígeno de la muestra mediante formación de un complejo binario anticuerpo-antígeno en fase sólida. Tras un periodo de incubación adecuado, el soporte o vehículo sólido es lavado para eliminar el residuo de la muestra de fluido, incluyendo el antígeno no reaccionado, si hay algo, y a continuación se pone en contacto con la disolución que contiene una cantidad desconocida de anticuerpo marcado (que actúa como "molécula informadora"). Tras un segundo periodo de incubación para permitir que el anticuerpo marcado forme un complejo con el antígeno ligado al soporte o vehículo sólido a través de un anticuerpo no marcado, el soporte o vehículo sólido es lavado una segunda vez para eliminar el anticuerpo marcado no reaccionado.

En otro tipo de ensayo "sándwich", que también puede ser útil con los antígenos de la presente invención, se usan los ensayos denominados "simultáneos" e "inversos". Un ensayo "simultáneo" implica una única etapa de incubación ya que el anticuerpo ligado al soporte o vehículo sólido y el anticuerpo marcado se añaden ambos a la muestra que se está evaluando al mismo tiempo. Después de que se haya completado la incubación, el soporte o vehículo sólido se lava para eliminar el residuo de muestra fluida y de anticuerpo marcado no acomplejado. La presencia de anticuerpo marcado asociado al soporte o vehículo sólido se determina entonces como se haría en un ensayo de sándwich "hacia delante" convencional.

En el ensayo "inverso" se utiliza en primer lugar la adición progresiva de una disolución de anticuerpos marcados a la muestra fluida, seguida de la adición de anticuerpo no marcado ligado a un soporte o vehículo sólido después de un periodo de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida es lavada de un modo convencional para liberarla del residuo de la muestra que está siendo evaluada y de la disolución de anticuerpos marcados no reaccionados. La determinación de anticuerpos marcados asociados a un soporte o vehículo sólido se determina entonces como en los ensayos "simultáneos" y "hacia delante".

La presente invención también proporciona moléculas de ADN que codifican IL-18BP tal como se ha definido antes, vectores replicables que comprenden cualquier molécula de ADN de ese tipo, células hospedantes transformadas con dichos vehículos de expresión que incluyen células procarióticas y eucarióticas y hospedantes, preferiblemente células CHO. La invención también incluye un proceso para la producción de vectores de expresión que codifican para IL-18BP de la presente invención para el propósito de su expresión en humanos y otros mamíferos.

La invención también incluye un proceso para la producción de IL-18BP de la presente invención mediante el cultivo de una célula transformada de acuerdo con la presente invención, y la recuperación de la proteína codificada por la molécula de ADN y el vehículo de expresión dentro de dicha célula hospedante transformada.

Además del uso de una IL-18BP o de una IL-18BP vírica para modular la actividad de la IL-18, también se pueden emplear, por supuesto, para la purificación de la propia IL-18. Para este propósito, la IL-18BP o una IL-18BP vírica se acopla a una columna de afinidad y se hace pasar IL-18 sin purificar. Entonces se puede recuperar la IL-18 de la columna mediante, por ejemplo, elusión a pH bajo.

La invención se ilustrará ahora a través de los siguientes ejemplos:

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Ejemplo 1 Aislamiento de una proteína de unión de IL-18

Se acopló IL-18 de E. coli (2,5 mg, Peprotech, NJ) a Affigel-10 (0,5 mL, BioRad), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se empaquetó en una columna. Se cargaron proteínas urinarias sin purificar (concentradas por un factor de 1000, 500 mL) en la columna con un caudal de 0,25 mL/min. La columna fue lavada con 250 mL de NaCl 0,5 M en disolución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación las proteínas ligadas fueron eluidas con ácido cítrico 25 mM, pH 2,2 y benzamidina (1 mM), y fueron neutralizadas inmediatamente con Na_{2}CO_{3} 1 M. Se recogieron fracciones de 1 mL. Las fracciones fueron analizadas mediante SDS-PAGE y tinción de plata. La proteína de unión de IL-18 eluyó en las fracciones 2-8 en forma de proteína de \sim40.000 Dalton (Figura 1). La banda de \sim40 kD, correspondiente a la IL-18BP, exhibió un color amarillo distintivo al someterse a tinción de plata. Las diversas fracciones fueron analizadas por reticulado con ^{125}I-IL-18, SDS-PAGE y autorradiografía como se describe en el Ejemplo 2. Se descubrió una proteína de unión de IL-18 en las fracciones 2-8, eluida de la columna de IL-18-agarosa (Figura 2).

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Ejemplo 2 Reticulado de IL-18BP purificada por afinidad con IL-18 marcada

Se incubaron (70 minutos a 4ºC) muestras (40 \muL) de IL-18BP de la etapa de purificación por afinidad con ^{125}I-IL-18 (5.000.000 cpm). A continuación se añadió suberato de disuccinimidilo (DSS), disuelto en dimetil sulfóxido (Me_{2}SO, 20 mM), hasta una concentración final de 2 mM y se dejó reposar la mezcla durante 20 minutos a 4ºC. Se detuvo la reacción mediante la adición de Tris-HCl 1 M pH 7,5, y NaCl 1 M hasta una concentración final de 100 mM. Se añadió una muestra de tampón que contenía Ditiotreitol (DTT, 25 mM final) y se analizaron las mezclas mediante SDS-PAGE (acrilamida al 7,5%) seguida de autorradiografía (Figura 2).

Se observó una banda específica con un peso molecular de 58 kD, que consistía probablemente en una proteína de \sim40 kD reticulada con la ^{125}I-IL-18 de \sim20 kD en fracciones eluidas de la columna de afinidad de IL-18 (bandas 2 y 3) pero no de la columna de lavado (banda 1), que contenían todas las demás proteínas urinarias no purificadas.

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Ejemplo 3 Análisis de secuencia de proteínas

Las fracciones eluidas de la columna de afinidad del Ejemplo 1 fueron resueltas mediante SDS-PAGE (acrilamida al 10%) en condiciones no reductoras, fueron electropunteadas en una membrana de PVDF (Pro-Blot, Applied biosystems, EE.UU.). La membrana fue teñida con azul de coomassie, se escindió la banda de \sim40 kD y fue sometida a análisis de secuencia de proteínas mediante un microsecuenciador Procise (Applied Biosystems, EE.UU.). Se obtuvo la siguiente secuencia principal:

102

en donde x representa y aminoácido todavía sin determinar.

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Además, se obtuvo una secuencia secundaria:

103

Debido a esta doble secuencia no fue posible obtener datos de secuencia de mayor longitud. La secuencia secundaria fue identificada como un fragmento de defensina humana (Nº de acceso p11398) que comienza en el aminoácido número 65 de la defensina. La secuencia principal no pudo asociarse a ninguna proteína conocida, según el resultado de la búsqueda en todas las bases de datos disponibles en NCBI y TIGR mediante los programas de búsqueda blastp y tblastn.

Con el fin de obtener una secuencia más larga y precisa y con el fin de identificar residuos de cisteína potenciales, se redujo otra alícuota de la fracción eluida de la columna de IL-18-agarosa con DTT en guanidina HCl 6 M, se hizo reaccionar con 4-vinil piridina, se desaló mediante un dispositivo de micro-ultrafiltración (Ultrafree, corte en 10.000 Daltons, Millipore) y se sometió a análisis de microsecuencia de proteínas. Después del ciclo Nº 1 de secuenciamiento, el filtro se hizo reaccionar con o-ftalaldehído para bloquear todos los polipéptidos N-terminales que no eran Pro. De este modo sólo se obtuvo la secuencia principal, y fue la siguiente:

7

(T=Thr; P=Pro; V=Val; S=Ser; Q=Gln; X=Desconocido; A=Ala; R=Arg; K=Lys; D=Asp; C=Cys; F=Phe; L=Leu; E=Glu)

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En los ciclos 6, 7, 8 y 11 se obtuvo un bajo nivel de señal de Thr. Debido a este bajo nivel consideramos más prudente no asignar un residuo de aminoácido específico a dichos ciclos.

La secuencia resultante es significativamente diferente a la de cualquier proteína conocida, según se puede determinar buscando en las bases de datos de proteínas. Sin embargo, buscando en la base de datos TIGR con el programa de búsqueda tblastn se obtuvo un archivo de ADNc, designado como THC123801, cuyo marco de lectura abierto (218 codones), cuando se traduce contiene una secuencia altamente homóloga a la de la secuencia N-terminal de la IL-18BP. La homología se muestra a continuación:

8

(La secuencia superior (1-40) es la de la IL-18BP aislada de acuerdo con la invención; la secuencia inferior (51-100) se deduce mediante traducción del ADNc del archivo TIGR de ADNc THC123801).

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La secuencia de proteína putativa, obtenida traduciendo el archivo TIGR de ADNc TCH123801, era ambigua en los residuos 2 y 4 de la IL-18BP. Confirma la identidad de los residuos 6, 7 y 8 de la IL-18BP como Thr y parece que también es así para el residuo 11.

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Ejemplo 4 La IL-18BP es una glicoproteína

Alícuotas (0,3 mL) de fracciones eluidas del Ejemplo 1 fueron purificadas aún más mediante cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Superose 12 (1X30 cm, Pharmacia, Suecia). La columna fue pre-equilibrada y eluida con disolución salina tamponada con fosfato y azide de sodio (0,02%) con un caudal de 0,5 mL/min, y se recogieron fracciones de 1 minuto. La proteína de unión de IL-18 eluyó en las fracciones 20-25 como una proteína de \sim40.000 Dalton, según pudo determinarse mediante SDS-PAGE y tinción de plata. Se hizo reaccionar una muestra que contenía la proteína de \sim40.000 Dalton (fracción 23, 50 \muL, \sim50 ng de proteína) con N-glicosidasa F (PNGase F, Biolab) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, la alícuota fue desnaturalizada por ebullición en presencia de SDS al 5% durante 10 minutos, 10x tampón G7 (2,5 \muL), NP-40 al 10% (2,5 \muL) y PNGase F (1 \muL), 1 h a 37ºC. La muestra fue analizada mediante SDS-PAGE (acrilamida al 10%) en condiciones no reductoras y se comparó con IL-18BP no digerida de la misma fracción de Superose 12. Se descubrió que la banda de \sim40 kD de la IL-18BP desaparecía de la fracción tratada con PNGase. Se obtuvieron nuevas bandas, correspondientes a 30 kD (justo por encima de la banda de PNGase) y a 20 kD. La eliminación de la banda de \sim40 kD indica que dicha banda es una proteína N-glicosilada.

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Ejemplo 5 Bloqueo de la actividad biológica de la IL-18 mediante IL-18BP

La capacidad de la IL-18BP aislada a partir de orina para bloquear la actividad de IL-18 fue determinada midiendo la producción inducida por IL-18 de IFN-\gamma en células mononucleares. La IL-18 induce IFN-\gamma cuando se añade junto con una baja concentración de LPS, IL-12, IL-2 u otros estimulantes. La actividad de IL-18 fue evaluada en esplenocitos murinos, en células mononucleares sanguíneas periféricas humanas (PBMC) y en la línea de células KG-1 humanas. Se prepararon células de bazo a partir de ratones sanos, fueron lavadas y suspendidas en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% a 5x10^{6} células/mL. Se estimularon cultivos de 1,0 mL con LPS (bien con 0,5 ó con 1 \mug/mL) junto con IL-18 recombinante humana o murina (0,5 ó 5 ng/mL). La proteína de unión de IL-18 humana (0,5 ó 50 ng/mL) fue añadida a la IL-18 recombinante antes de ser añadida a células de bazo. Después de cultivar durante 24 h, las células de bazo fueron sometidas a tres ciclos de congelación (-70ºC) y descongelación (temperatura ambiente), los desechos celulares fueron eliminados mediante centrifugación y los sobrenadantes fueron evaluados para determinar IFN-\gamma usando los kits ELISA para IFN-\gamma de ratón (Endogen). Tal como se muestra en la Figura 3A, la IL-18BP bloqueó la actividad de huIL-18 en esplenocitos murinos de un modo dependiente de la dosis. Por el contrario, a modo de control, el receptor soluble de interferón-\alpha/\beta no tuvo ningún efecto. La actividad de IL-18 murina recombinante se vio inhibida de una forma similar por la IL-18BP, lo que sugiere que la IL-18BP reconoce IL-18 murina (Figura 3B). En esplenocitos murinos se induce IL-18 endógena por efecto de altas concentraciones de LPS, lo que conduce a la producción de IFN-\gamma. De hecho, la inducción de IFN-\gamma por LPS (10 \mug/mL) también se vio inhibida por la IL-18BP urinaria (Figura 3C). La concanavalina A (con A) activa células T para producir IFN-\gamma en ausencia de IL-18 (13). De hecho, la inducción de IFN-\gamma por Con A no se vio inhibida por IL-18BP incluso a altas concentraciones (Figura 3D). Esta observación demostró que la IL-18BP era un inhibidor específico de la bioactividad de la IL-18 más que un inhibidor no específico de la producción de IFN-\gamma. La IL-18BP también inhibió la actividad de la IL-18 humana en células KG-1 humanas inducida por una combinación de IL-18 y TNF-\alpha (Figura 3E).

Los datos anteriores demuestran que la IL-18BP urinaria inhibe la actividad de IL-18 tanto humana como murina, según se ha determinado mediante co-inducción de IFN-\gamma en células mononucleares humanas y murinas. La concentración de IL-18BP que redujo la actividad de IL-18 en >90% fue comparable a la de la propia IL-18, lo que sugiere una elevada interacción de afinidad entre estas dos proteínas.

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Ejemplo 6 Aislamiento de clones de ADNc que codifican para IL-18BP

Se trascribió inversamente el ARN total de células T de Jurkat (CRL 8163, American Type Culture Collection) con trascriptasa inversa SuperScript RNase H^{-} (Gibco-BRL) y cebadores aleatorios (Promega, Madison WI). Los fragmentos de ADNc resultantes fueron amplificados a continuación mediante PCR, usando polimerasa de ADN Taq (Sigma) y cebadores correspondientes al clon TIGR THC123801, nucleótidos 24-44 (sentido) y 500-481 (inversos). La amplificación se llevó a cabo en 30 ciclos de maduración (55ºC, 2 minutos) y extensión (70ºC, 1 minuto). Los productos PCR resultantes fueron resueltos mediante electroforesis de gel de agarosa (1%), fueron eluidos y clonados en vector de clonación pGEM-Teasy TA (Promega). El ADN de los clones individuales fue secuenciado con cebadores T7 y SP6.

El fragmento de 477 pb resultante fue marcado con ^{32}P mediante una imprimación aleatoria. Esta sonda se usó para escrutar varias bibliotecas genómicas y de ADNc humano. Los filtros de nitrocelulosa duplicados fueron levantados y se hibridó con la sonda a 60ºC en un tampón que consistía en 6xSSC, 10x disolución de Denhardt, SDS al 0,1% y 100 \mug/mL de ADN de esperma de salmón. Los filtros fueron lavados y expuestos toda la noche a -80ºC a película Kodak XAR. Los clones doble-positivos fueron purificados en placa. Los plásmidos fueron escindidos de los clones \lambdapCEV9 y autoligados. Se aislaron clones de ADNc de otras bibliotecas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de secuencia de ADN automatizado de los clones aislados fue llevado a cabo con secuenciadores de modelo 373A y 377 (Applied Biosystems) usando cebadores sentido y antisentido. Se usaron los protocolos estándares para estos procedimientos de clonación (33).

Se escrutaron las siguientes bibliotecas: una biblioteca de ADNc de monocitos humanos, construida en vector de clonación \lambdapCEV9 (15), suministrada amablemente por T. Miki; una biblioteca de ADNc de células T leucémicas de Jurkat humanas, una biblioteca de ADNc de leucocitos sanguíneos periféricos humanos y una biblioteca de ADNc de bazo humano, todos de Clontech (Palo Alto, CA). Una biblioteca genómica de placenta humana en vector lambda FIX II fue suministrada por Stratagene (La Jolla, CA).

Todos los clones de ADNc obtenidos correspondieron a cuatro variantes de división de IL-18BP diferentes, y fueron caracterizados. Todas las variantes de división codificaban para proteínas secretadas solubles putativas. La más abundante (IL-18BP) tenía un marco de lectura abierto de 192 codones, que codifican para un péptido señal de 28 residuos de aminoácido seguidos de una IL-18BPa putativa madura, cuyos primeros 40 residuos (SEC ID Nº: 10) coincidieron perfectamente con la secuencia de proteína N-terminal de la IL-18BP urinaria (SEC ID Nº: 2). La posición de los residuos de cisteína sugirió que este polipéptido pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig). Cada uno de los cuatro residuos Gln dentro de la IL-18BPa madura constituía una posición de N-glicosilación potencial. Las otras tres variantes de división de la IL-18BP fueron significativamente menos abundantes.

Otro ADNc de IL-18BPb de 1 kb codificaba para una proteína madura de 85 residuos de aminoácido (SEC ID Nº: 4). Una tercera variante, IL-18BPc, fue representada por un ADNc de 2,3 kb, que codifica para una IL-18BP madura de 169 residuos de aminoácido (SEC ID Nº: 6). La cuarta variante, IL18BPd, codificó para una IL-18BP madura de 133 residuos de aminoácido (SEC ID Nº: 8). Se produjo una división en exón en dos posiciones a lo largo del pro-ARNm. Estos eventos y un exón 5' adicional en la IL-18BPd dieron lugar a 3 UTRs 5' diferentes en los diversos clones de ADNc. Por tanto, es bastante posible que las diferentes variantes de IL-18BP puedan ser generadas en respuesta a distintas señales de regulación de la trascripción.

Hasta el momento no se ha encontrado ningún ADNc que codifique para un receptor con un dominio transmembrana.

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Ejemplo 7 Construcción de un vector de expresión de mamífero, producción de IL-18BP recombinante, y evaluación de las actividades biológicas de IL-18BP recombinante

La región codificadora del ADNc de IL-18BPa fue amplificada mediante PCR con el cebador sentido 5' TATATC
TAGAGCCACCATGAGACACAACTGGACACCA.

y el cebador inverso:

5' ATATCTAGATTAATGATGATGATGATGATGACCCTGCTGCTGTGGACTGC.

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Los productos PCR fueron cortados con Xba I y clonados en la posición Xba I del vector de expresión pEF-BOS (25), para dar lugar a pEF-BOS-IL-18BPa. Las construcciones fueron confirmadas mediante secuenciamiento de ADN.

Se incubaron cargas de 6x10^{7} células COS7 en 1,4 mL de tampón TD, que contiene ADN de plásmido de pEF-BOS-IL-18BPa (10 \mug) y DEAE-dextrano (120 \mug) durante 30 minutos a temperatura ambiente, como se ha descrito previamente (35). A continuación las células fueron lavadas con DMEM -FBS al 10%, colocadas en placa durante 4 horas en DMEM-10, lavadas e incubadas durante 3-5 días en DMEM libre de suero. El medio de cultivo fue cosechado, concentrado en factor de 6 mediante ultrafiltración (corte en 10 kD) y se aisló la IL-18BP-His_{6} en una columna Talon (Clontech) con imidazol como eluyente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La reactividad inmunológica cruzada de la IL-18BP urinaria y de la expresada en COS7 fue determinada como se indica a continuación: la IL-18BP urinaria (5 \mug) fue marcada con ^{125}I mediante el procedimiento de cloramina T. Se mezclaron los sobrenadantes de células COS7 (250 \muL) (1 h, temperatura ambiente, volumen final 500 \muL) con el anticuerpo de IL-18BP urinaria, se diluyó 1:1000 en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), Tween 20 al 0,05% y albúmina de suero bovino al 0,5% (Tampón de Lavado). A continuación se añadió IL-18BP marcada con ^{125}I (10^{6} cpm) y después de 1 h se añadió proteína G-sepharose (20 \muL). La mezcla fue suspendida (1,5 h, 4ºC), a continuación las perlas fueron aisladas y lavadas 3x con Tampón de Lavado y una vez con PBS. Entonces las perlas fueron eluidas con un tampón de Muestra, resueltas mediante SDS-PAGE (acrilamida al 10%) en condiciones reductoras, seguido de autorradiografía.

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La IL-18BPa apareció como una única banda en SDS-PAGE con tinción de plata en condiciones reductoras y no reductoras, y presentó la misma masa molecular aparente que la IL-18BP urinaria (datos no mostrados). El análisis de secuencia proteica de esta preparación reveló la misma secuencia N-terminal que la IL-18BP urinaria, lo que indica que esta última no fue degradada en su extremo N.

El análisis de inmunotinción de la IL-18BPa con anticuerpos elevados contra la IL-18BP urinaria reveló la misma banda de masa molecular que la de la proteína urinaria. Además, usando inmunoprecipitación seguida de SDS-PAGE y autorradiografía, la IL-18BPa fue capaz de desplazar a la ^{125}I-IL-18BP urinaria de su unión con el anticuerpo. Por tanto, la IL-18BPa corresponde estructuralmente con la IL-18BP urinaria.

La IL-18BPa sin purificar y purificada fue evaluada para determinar su capacidad para inhibir la actividad biológica de la IL-18. La IL-18BPa inhibió de un modo dependiente de la dosis la actividad de inducir IFN-\gamma de la IL-18 humana y de ratón en esplenocitos murinos, PBMC y en la línea celular humana KG-1 (Figura 9).

Los resultados de los diversos bioensayos, así como del ensayo de desplazamiento de movilidad (Ejemplo 8), demostraron que la inhibición de la actividad de IL-18 es una propiedad intrínseca de la IL-18BP clonada y no de alguna impureza acompañante de la IL-18BP urinaria, tal como el fragmento co-eluyente de la defensina.

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Ejemplo 8 Ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforética

También se estudió el efecto de la IL-18BP urinaria y recombinante sobre la activación inducida por IL-18 de NF-\kappaB en células humanas KG-1. Se estimularon células humanas KG-1 (4x10^{6} en 1 mL de RPMI) con huIL-18 (10 ng/mL) o con huIL-18 premezclada con una IL-18BP (20 minutos, temperatura ambiente). Después de 20 minutos a 37ºC, las células fueron lavadas tres veces con PBS enfriado en hielo y fueron congeladas inmediatamente en nitrógeno líquido. Las partículas de células fueron resuspendidas en tres veces el volumen de células empaquetadas de tampón A (Tris 20 mM pH 7,6, NaCl 0,4 M, EDTA 0,2 mM, glicerol (20% en volumen), MgCl_{2} 1,5 mM, ditiotreitol 2 mM (DDT), PMSF 0,4 mM, Na_{3}VO_{4}, 2 \mug/mL de leupeptina, pepstatina y aprotinina). Los restos celulares fueron eliminados mediante centrifugación (15.000 x g, 15 minutos), se congelaron alícuotas del sobrenadante en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. Se determinó la concentración de proteínas mediante un ensayo de Bradford (Bio-Rad) usando albúmina de suero bovino como patrón. Se marcó un oligonucleótido de doble cadena correspondiente al elemento de unión NF-\kappaB (10 pmol, Promega) con [^{32}P]dCTP (300 Ci/mmol) y T4 polinucleótido quinasa (New England Biolabs). Los nucleótidos libres fueron eliminados mediante una columna de giro. Los extractos (10 \mug de proteína) de las células tratadas con IL-18 o con IL-18 más IL-18BP fueron incubados (15 minutos, temperatura ambiente) con la sonda marcada (3x10^{4} cpm) junto con polydI.dC (500 ng, Pharmacia) y ADN de esperma de salmón desnaturalizado (100 ng, Sigma) en 20 \muL de un tampón que consistía en HEPES (pH 7,5, 10 mM), KCl 60 mM, MgCl_{2} 1 mM, EDTA 2 mM, DTT 1 mM y glicerol (5% en volumen). A continuación las mezclas fueron cargadas en geles de poliacrilamida no desnaturalizante al 5%. Se llevó a cabo la electroforesis a 185 V en 0,5xTBE (Tris HCl 40 mM, ácido bórico 45 mM y EDTA 2,5 mM). Los geles fueron secados a vacío y autorradiografiados durante una noche a -80ºC. Se descubrió que la IL-18 induce la formación del homodímero p50 de NF-\kappaB y del heterodímero p65/p50 de NF-\kappaB. La IL-18BP, tanto urinaria como recombinante, inhibió la activación de NF-\kappaB por la IL-18, según se determinó mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad eletroforética con extractos de células KG-1 ligadas a un oligonucleótido radiomarcado que corresponde con la secuencia de consenso de NF-\kappaB.

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Ejemplo 9 Expresión de IL-18BP en células de E. coli, levadura e insecto

La IL-18BP también puede ser producida por otras células recombinantes tales como células procarióticas, por ejemplo, E. coli, u otras células eucarióticas, tales como células de levadura e insecto. Se dispone de métodos bien conocidos para construir vectores apropiados, que portan ADN que codifica para IL-18BP y adecuados para transformar células de E. coli y de levadura, o infectar células de insecto con el fin de producir IL-18BP recombinante. Para la expresión en células de levadura, el ADN que codifica para IL-18BP (Ejemplo 6) se corta y se inserta en los vectores de expresión adecuados para la transfección de células de levadura. Para la expresión en células de insecto, se inserta un ADN que codifica para IL-18BP en baculovirus y las células de insecto son infectadas con dicho baculovirus recombinante. Para la expresión en E. coli, el ADN que codifica para IL-18BP es sometido a mutagénesis dirigida a posición con los oligonucleótidos apropiados, de tal modo que se inserta un codón ATG justo antes del primer codón de la IL-18BP madura. Alternativamente, dicho ADN puede prepararse mediante PCR con cebadores sentido y antisentido adecuados. Las construcciones de ADNc resultantes son insertadas a continuación en vectores de expresión procarióticos construidos de forma apropiada empleando técnicas bien conocidas en la técnica (23).

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Ejemplo 10 Construcción de vector de expresión adeno-asociado para la expresión in vivo de IL-18BPa

Se construye un gen funcional que codifica para IL-18BPa en base al plásmido pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). El ADNc de IL-18BP con una secuencia de consenso Kodak en el extremo 5' es ligado en la posición Xba I de pcDNA3 de un modo que destruye la posición de restricción. Se insertan nuevas posiciones Xba I mediante mutagénesis dirigida a posición antes de la casete de neomicina (base 2151 de la secuencia pcDNA3 original). A continuación esta construcción es cortada con Xba I y el minigen de 4,7 kb resultante es insertado en la posición Xba I del plásmido psub201 tal como se ha descrito previamente (Snyder y col., 1996, Current Protocols in Human Genetics, Capítulos 12.1.1-12.1.17, John Wiley & Sons). El plásmido recombinante resultante es cotransfectado con el plásmido AAV colaborador pAAV/Ad en células T293 humanas. A continuación los cultivos son infectados con adenovirus como virus colaborador y las células son cosechadas después de 48-60 horas de incubación. Las células son sometidas a 3 ciclos de congelación-descongelación, los residuos celulares son eliminados por centrifugación y el sobrenadante se lleva a una saturación del 33% con sulfato de amonio. La mezcla es centrifugada a continuación y se precipita rAVV del sobrenadante llevando el sulfato de amonio al 50% de saturación. El virus es purificado con CsCl, dializado y finalmente calentado durante 15 minutos a 56ºC para destruir cualquier adenovirus.

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Ejemplo 11 Construcción de proteínas de fusión recombinantes de IL-18BP

La producción de proteínas que comprende IL-18BP fusionada a la región constante de cadena pesada de IgG2 puede llevarse a cabo como se indica a continuación: el ADN de IL-18BP es sometido a mutagénesis dirigida a posición con los oligonucleótidos apropiados de tal modo que se introduce una posición de restricción única inmediatamente antes y después de las secuencias codificadoras. Se somete a un plásmido que porta la región constante de cadena pesada de IgG2, por ejemplo pRKCO42Fc1(6), a una mutagénesis dirigida a posición similar para introducir la misma posición de restricción única tan cerca como sea posible de la Asp 216 de la cadena pesada de IgG1 de un modo que permita la traducción en fase de la proteína fusionada. Se prepara un fragmento de ADNds, que consiste en secuencias 5' no traducidas y que codifica para IL-18BP, mediante digestión en las posiciones de restricción únicas o alternativamente mediante PCR con los cebadores diseñados apropiadamente. El pRKCD42Fc1 es digerido de forma similar para generar un fragmento grande que contenga el plásmido y las secuencias de IgG1. Los dos fragmentos son ligados a continuación para generar un nuevo plásmido, que codifica para un precursor de polipéptido que consiste en IL-18BP y aproximadamente 227 aminoácidos C-terminales de la cadena pesada de IgG1 (región bisagra y dominios CH2 y CH3). El ADN que codifica las proteínas fusionadas puede ser aislado del plásmido mediante digestión con enzimas de restricción apropiadas y a continuación ser insertado en vectores de expresión procarióticos o eucarióticos eficaces.

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Ejemplo 12 Producción de IL-18BPs modificadas químicamente

Con el fin de aumentar la vida media de las IL-18BPs en plasma, se pueden fabricar IL-18BPs modificadas químicamente con polietilenglicol (PEG). La modificación puede hacerse por reticulado del PEG con un residuo de cisteína de las moléculas de IL-18BP. Se pueden construir IL-18BPs mutantes que contengan un residuo de cisteína extra en el extremo amino, posiciones de glicosilación y el extremo carboxilo de cada IL-18BP. La mutagénesis puede llevarse a cabo mediante PCR usando oligonucleótidos que contengan la mutación deseada. Estas proteínas mutantes son expresadas del modo habitual conocido en la técnica. Se llevará a cabo la PEG-lación de estas proteínas y se determinará la actividad.

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Ejemplo 13 Preparación de anticuerpos policlonales de IL-18BP

Se inyectó inicialmente a conejos subcutáneamente con 5 \mug de una preparación pura de la IL-18BP urinaria, emulsificada en adyuvante completo de Freund. Tres semanas después, fueron inyectados de nuevo subcutáneamente con 5 \mug de la preparación de IL-18BP en adyuvante de Freund incompleto. Se administraron otras dos inyecciones adicionales de IL-18BP como disolución en PBS en intervalos de 10 días. Los conejos fueron desangrados 10 días después de la última inmunización. Se siguió el desarrollo del nivel de anticuerpos mediante un radioinmunoensayo. Se mezcló IL-18BP marcada con ^{125}I (166.000 cpm) con varias disoluciones (1:50, 1:500, 1:5.000 y 1:50.000) del suero de conejo. Se añadió una suspensión de perlas de proteína-G agarosa (20 \muL, Pharmacia) en un volumen total de 200 \muL. Se dejó la mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente, a continuación las perlas fueron lavadas 3 veces y se contabilizó la radioactividad ligada. Se usó anticuerpo de conejo para leptina humana como control negativo. El título del antisuero de IL-18R estaba entre 1:500 y 1:5.000, mientras que el del control negativo era inferior a 1:50.

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Ejemplo 14 Preparación de anticuerpos monoclonales de IL-18BP

Se inyecta en primer lugar a ratones Balb/C femeninos (de 3 meses de edad) 2 \mug de IL-18BP purificada en una emulsión de adyuvante completo de Freund, y tres semanas después, subcutáneamente en adyuvante incompleto de Freund. Se administran tres inyecciones adicionales en intervalos de 10 días, subcutáneamente en PBS. Las últimas inyecciones se administran intraperitonealmente 4 y 3 días antes de la fusión al ratón que muestra el mayor título de unión determinado mediante IRIA (véase más adelante). La fusión se lleva a cabo usando la línea celular de mieloma NSO/1 y linfocitos preparados a partir de nodos de bazo y linfáticos del animal como parejas de fusión. Las células fusionadas se distribuyen en placas de microcultivo y los hibridomas son seleccionados en DMEM suplementado con HAT y un suero de caballo al 15%. Los hibridomas que producen anticuerpos de IL-18BP son subclonados mediante el método de dilución limitante y son inyectados en ratones Balb/C que habían sido imprimados con pristano para la producción de ascites. Los isótopos de los anticuerpos son definidos con el uso de un kit ELISA comercialmente disponible (Amersham, R.U.).

El escrutinio de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales anti-IL-18BP se lleva a cabo como se indica a continuación: se evalúan sobrenadantes de hibridoma para determinar la presencia de anticuerpos anti-IL-18BP mediante un radioinmunoensayo en fase sólida invertido (IRIA). Se recubren las placas ELISA (Dynatech Laboratorios, Alexandria, VA) con IL-18BPa-His_{6} purificada con Talon (10 \mug/mL, 100 \muL/pocillo). Después de una incubación durante una noche a 4ºC, las placas fueron lavadas dos veces con PBS que contenía BSA (0,5%) y Tween 20 (0,05%) y bloqueadas en disolución de lavado durante al menos 2 horas a 37ºC. Se añaden los sobrenadantes de cultivo de hibridoma (100 \muL/pocillo) y las placas se incuban durante 4 horas a 37ºC. Las placas son lavadas 3 veces y se añade un conjugado de peroxidasa de rábano de cabra-anti-ratón (HRP, Jackson Labs, 1:10.000, 100 \muL/pocillo) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas son lavadas 4 veces y el color es desarrollado mediante ABTS (2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenztiazolin-6-sulfónico), Sigma) con H_{2}O_{2} como sustrato. Las placas son leídas mediante un lector de ELISA automático. Las muestras que proporcionan una DO que es al menos 5 veces superior al valor del control negativo son consideradas positivas.

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Ejemplo 15 Cromatografía de afinidad de IL-18BP con anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos contra IL-18BP son utilizados para la purificación de IL-18BP mediante cromatografía de afinidad. El fluido ascítico que contiene el anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma se purifica mediante precipitación en sulfato amónico al 50% seguido de una diálisis intensiva contra PBS. Se ligan aproximadamente 10 mg de inmunoglobulinas a 1 mL de Affigel 10 (BioRad USA), tal como ha especificado el fabricante. Se cargan 250 mL de proteínas urinarias humanas (equivalentes a 250 L de orina sin purificar) en 0,5 mL de la columna de anticuerpos IL-18BP a 4ºC con un caudal de 0,25 mL/minuto. La columna se lava con PBS hasta que no se detecta proteína en las aguas de lavado. La IL-18BP es eluida con tampón de ácido cítrico 25 mM, pH 2,2 (8 x 1 fracciones de volumen de columna) y es neutralizada inmediatamente mediante Na_{2}CO_{3} 1 M. Se consigue una mayor purificación de esta preparación mediante cromatografía de exclusión de tamaño.

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Ejemplo 16 Ensayo ELISA

Se recubren placas de microtitulación (Dynatech o Maxisorb, de Nunc) con anticuerpo monoclonal anti-IL-18BP (sobrenadante de hibridoma libre de suero o inmunoglobulinas de fluido ascítico) durante una noche a 4ºC. Las placas son lavadas con PBS que contiene BSA (0,5%) y Tween 20 (0,05%) y se bloquean con la misma disolución durante al menos 2 horas a 37ºC. Las muestras evaluadas son diluidas en la disolución de bloqueo y añadidas a los pocillos (100 \muL/pocillo) durante 4 horas a 37ºC. A continuación las placas son lavadas 3 veces con PBS que contiene Tween 20 (0,05%) seguido de la adición de suero de conejo anti-IL-18BP (1:1000, 100 \muL/pocillo) para continuar con la incubación durante la noche a 4ºC. Las placas son lavadas 3 veces y se añade un conjugado de peroxidasa de rábano de cabra-anti-conejo (HRP, Jackson Labs, 1:10.000, 100 \muL/pocillo) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas 4 veces y el color se desarrolla mediante ABTS (2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenztiazolina-6-sulfónico), Sigma) con H_{2}O_{2} como sustrato. Las placas son leídas mediante un lector ELISA automático.

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Ejemplo 17 La IL-18BP humana no glicosilada es biológicamente activa

Se evaluó la IL-18BPa recombinante purificada para determinar su capacidad para inhibir la actividad biológica de la IL-18. La IL-18BPa inhibió de un modo dependiente de la dosis la actividad inductora de IFN-\gamma de la IL-18 humana y de ratón en esplenocitos humanos, PBMC y la línea celular KG-1 humana (Figura 9).

La IL-18BPa que tiene un etiqueta de His_{6} en el extremo C (1,5 \mug, 50 \muL) fue ajustada a pH 7,5 y mezclada con N-glicosidasa F (3 \muL, 500.000 U/mL, PNGase F, New England Biolabs). La mezcla se incubó durante 24 horas a 37ºC en condiciones no desnaturalizantes. Se analizaron alícuotas de la muestra y de IL-18BP-His_{6} mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras seguido de inmunotinción con anticuerpos de IL-18PB. Se descubrió que la banda de \sim40 kD de la IL-18BP-His_{6} desapareció en la fracción tratada con PNGase y se obtuvo una nueva banda de \sim20 kD. La masa molecular del producto y la especificidad de la PNGase F indicó que la IL-18BP-His_{6} quedó completamente desglicosilada.

La fracción tratada con PNGase, la IL-18BP-His_{6} no digerida y la muestra de control que contenía PNGase en tampón fueron absorbidas por separado en perlas de Talon, fueron lavadas con tampón de fosfato y eluidas con imidazol (100 mM). Las fracciones eluidas fueron sometidas a bioensayo usando IL-18 humana (20 ng/mL), LPS (2 \mug/mL) y esplenocitos murinos. Los resultados se muestran en la siguiente tabla:

9

Por lo tanto, se concluye que la IL-18BP desglicosilada es biológicamente activa como modulador de la actividad de IL-18.

La anterior descripción de las realizaciones específicas revela la naturaleza general de la invención de tal modo que otros pueden, aplicando el conocimiento actual, modificar y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones de dichas realizaciones específicas sin alejarse del concepto genérico, y, por tanto, dichas adaptaciones y modificaciones deberían, y así se pretende, englobarse dentro del significado y del alcance de equivalente de las realizaciones descritas. Debe entenderse que las expresiones y la terminología empleadas en la presente memoria se usan con propósitos descriptivos, y no limitativos.

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<110> Novick, Daniela

\hskip1cm

Dinarello, Charles

\hskip1cm

Rubinstein, Menachem

\hskip1cm

Kim, Soo Hyun

\hskip1cm

Yeda Research and Development Co. Ltd.

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<120> Proteínas de union a Interieuquin-18, su preparación y uso

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<130> Rubinsteína IL-18

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<140>

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<141>

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<150> 125463

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<151> 1998-07-22

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<150> 122134

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<151> 1997-11-06

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<150> 121869

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<151> 1997-09-29

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<150> 121639

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<151> 1997-08-27

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<150> 121554

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<151> 1997-08-14

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<160> 10

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1348

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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10

11

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<210> 2

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<211> 192

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> SEÑAL

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<222> (1)..(28)

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<400> 2

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12

13

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<210> 3

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<211> 1038

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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14

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<210> 4

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> SEÑAL

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<222> (1)..(28)

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<400> 4

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15

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<210> 5

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<211> 7063

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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16

17

18

19

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<210> 6

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<211> 197

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> SEÑAL

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<222> (1)..(28)

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<400> 6

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20

21

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<211> 1360

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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22

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<210> 8

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<211> 161

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> SEÑAL

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<222> (1)..(28)

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<400> 8

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23

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<210> 9

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<211> 7812

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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24

26

27

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<210> 10

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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28

Claims (50)

1. Una proteína de unión a IL-18 (IL-18BP) seleccionada del grupo que consiste en:

(a) polipéptidos que comprenden las secuencias aminoacídicas de SEQ ID NO:2 o 6;

(b) polipéptidos tal como se definen en (a) sin una secuencia líder;

(c) muteínas que tienen al menos 80% de homología con IL-18BP tal como se define en (a) o (b), proteínas fusionadas, derivados químicamente modificados, derivados permutados de forma circular y mezclas de los mismos de los polipéptidos definidos en (a) o (b); y que se unen a IL-18 y bloquean la producción de IFN-\gamma inducida por IL-18.

2. IL-18BP según la reivindicación 1, siendo una proteína no viral.

3. IL-18BP según la reivindicación 2, siendo una proteína humana.

4. IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kD.

5. IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la proteína fusionada comprende una inmunoglobulina o fragmento de la misma.

6. IL-18BP según la reivindicación 5, siendo una proteína fusionada seleccionada de IL-18 fusionada a la región constante de la cadena pesada de IgG2.

7. IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde los derivados funcionales incluyen cadenas laterales de polietilenglicol.

8. IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en forma soluble.

9. IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que está glicosilada.

10. IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que no está glicosilada.

11. Una molécula de ADN que codifica una IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Una molécula de ADN según la reivindicación 11, provista de un codón de parada en su extremo 3'.

13. Una molécula de ADN que comprende la secuencia de ADN en SEQ ID NO: 1 o 5, dicho ADN codifica una IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

14. Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 unida operativamente a otras secuencias de ADN que facilitan la expresión, tal como promotores o potenciadores.

15. Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, siendo un ADN genómico.

16. Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, siendo un ADNc.

17. Una molécula de ADNc según la reivindicación 16, que comprende una secuencia de ADNc seleccionada del grupo de secuencias de ADN de SEQ ID NO:1 y 5.

18. Una molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, que está adaptada para la expresión en un hospedador bacteriano.

19. Un vector replicable que comprende una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18.

20. Una célula hospedadora transformada que comprende un vector según la reivindicación 19.

21. Una célula hospedadora transformada según la reivindicación 20, siendo una célula eucariótica.

22. Una célula hospedadora transformada según la reivindicación 21, siendo una célula de mamífero.

23. Una célula hospedadora transformada según la reivindicación 22 siendo seleccionada de células de ser humano, de mono, de ratón y de Ovario de Hámster Chino (CHO).

24. Una célula hospedadora transformada según la reivindicación 20, siendo una célula procariótica.

25. Un proceso para la producción de IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende cultivar una célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha IL-18BP.

26. Un proceso para la producción de IL-18BP según la reivindicación 25, que además comprende aislar dicha IL-18BP.

27. Un anticuerpo que reacciona específicamente con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2 o 6.

28. Un anticuerpo según la reivindicación 27, siendo un anticuerpo policlonal.

29. Un anticuerpo según la reivindicación 28, siendo un anticuerpo monoclonal.

30. Un anticuerpo según la reivindicación 29, siendo un anticuerpo quimérico.

31. Un anticuerpo según la reivindicación 30, siendo un anticuerpo humanizado.

32. Un anticuerpo anti-idiotípico al anticuerpo según la reivindicación 27.

33. Un proceso para aislar IL-18BP según la reivindicación 1, que comprende:

(a) hacer pasar un fluido humano a través de una columna cromatográfica a la que está acoplada IL-18,

(b) eluir la unión proteica a IL-18, y

(c) purificar dicha proteína.

34. Una composición para uso farmacéutico que comprende IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o homólogo de IL-18BP codificado por un virus que se une a IL-18 y bloquea la producción de IFN-\gamma inducida por IL-18.

35. Una composición para uso farmacéutico que comprende un ADN que codifica IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

36. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

37. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de diabetes tipo I.

38. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de sepsis.

39. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de rechazo de injertos.

40. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de artritis reumatoide.

41. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino.

42. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de esclerosis múltiple

43. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad isquémica del corazón incluyendo ataques cardiacos.

44. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de daño por isquemia cerebral.

45. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de psoriasis.

46. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de hepatitis aguda o crónica.

47. Uso de IL-18BP según una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo del mismo codificado por un virus tal como se define en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de pancreatitis aguda o crónica.

48. Unos de IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la purificación de IL-18.

49. Uso de los anticuerpos según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 en un ensayo para la detección de IL-18BP.

50. Uso de una molécula de ADN que codifica IL-18BP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un homólogo de la misma codificada por un virus tal como se defina en la reivindicación 34 en la preparación de una composición farmacéutica para terapia génica.