CZ300818B6 - Interleukin-18-vazebné proteiny, príprava a použití - Google Patents

Abstract

Interleukin-18-vazebné proteiny, které jsou schopné vázat IL-18 a/nebo modulovat a/nebo blokovat aktivitu IL-18. Zpusoby pro jejich izolaci a rekombinantní produkci, molekuly DNA, jež je kódují, DNA vektory, jež je exprimují, vektory použitelné pro jejich expresi v lidech a jiných savcích a protilátky proti nim namírené. Farmaceutické prostredky s jejich obsahem.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká proteinu vázajícího interleukin-18 (IL-18), dále zde označovaného IL-I8BP, který je schopen vázat s IL-18. Tento vynález se zejména týká solubilního IL-18BP, který lze získat z tělesných tekutin, solubilních 1L-18BP, které lze získat expresí vhodných DNA vektorů v hostitelských buňkách, virem kódovaných homologů IL-18BP, které lze získat expresí io vhodných DNA vektorů v hostitelských buňkách, vektorů exprimujících různé IL-18BP, vektorů využitelných k expresi IL-18BP u lidí a jiných savců, protilátek proti proteinům IL-18BP, terapeutického použití řečených 1L-18BP spočívajícího v modulaci a/nebo blokování aktivity IL—18, terapeutického použití řečených expresních vektorů při modulaci a/nebo blokování aktivity IL— 18 a použiti protilátek.

Dosavadní stav techniky

V r. 1989 byla v séru myší popsána aktivita, indukovaná endotoxinem, která byla schopná indu20 kovat interferon-γ (IFN-γ) v kulturách myších slezinných buněk (Nakamura et al., 1989, Infectlmmun. 57:590-595). Tato sérová aktivita působila nikoli jako přímý induktor interferonu IFN-y, ale spíše jako kostimulátor, společně s IL-2 nebo s mitogeny. Purifikací aktivity ze séra myši vystavené šoku endotoxinem byl nalezen zdánlivě homogenní protein o velikosti 50-55 kDa (Nakamura et al., 1993, Infect-lmmun. 61:64-70). Jako kostimulátory tvorby IFN-^y mohou působit i jiné cytokiny, avšak skutečnost, že působením neutralizujících protilátek proti IL-ΐ, 1L4, IL—5, IL-6 nebo TNF nedošlo k neutralizaci této sérové aktivity naznačuje, že se jedná o odlišný faktor. V r. 1995 prokázali stejní badatelé, že endotoxinem indukovaný kostimulátor tvorby IFN-γ je přítomen v extraktech jater myší, které byly předtím inokulovány bakterií P. acnes (31). V tomto modelu dochází k expanzi populace jatemích makrofágů (Kupfferových buněk) a malá dávka bakteriálního lipopolysacharidu (LPS), jež u myší, které neobdrželi injekci P. acnes není letální, se u těchto myší stává letální. Faktor, nazvaný IFN-y-indukující faktor (IGIF) a později označený jako interleukin-18 (IL-18), byl vyčištěn do homogenity z 1200 g jater myší inokulovaných P acnes. Z částečných aminokyselinových sekvencí purifikovaného IL18 byly odvozeny degenerované oligonukleotidy a ty byly použity ke klonování myší IL-18 cDNA (Okamura et al., 1995, Nátuře 378:88-91). IL-18 je 18-19 kDa protein obsahující 157 aminokyselin, který nevykazuje žádnou zjevnou podobnost s žádným proteinem v databázích. Molekuly mRNA kódující IL-18 a interleukin-12 (IL-12) jsou snadno detegovatelné v Kupfferových buňkách a aktivovaných makrofágách. Rekombinantní IL-18 indukuje IFN-γ účinněji než IL-12, zřejmě prostřednictvím samostatné dráhy (Okamura et al., 1995, Nátuře 378:88-91).

IL—18, podobně jako aktivita indukovaná v séru endotoxinem, sám o sobě neindukuje IFN-γ, nýbrž působí primárně jako kostimulátor společně s mitogeny nebo IL-2. IL-18 zvyšuje proliferací buněk T, zřejmě prostřednictvím signalizační dráhy závislé na IL-2, zvyšuje in vitro tvorbu Thl cytokinů a vykazuje synergismus v kombinaci s IL-12 při stimulaci tvorby IFN-7 (Micallef et al., 1996, Eur. J. Immunol. 26:1647-1651).

Neutralizující protilátky proti myšímu IL-18 byly schopné zabránit letálnímu účinku nízkých dávek LPS u myší, jež byly předtím inokulovány P.acnes. Jiní autoři popsali významnou roli IFN-γ ve zprostředkování letálního účinku LPS u takto inokulovaných myší. Například neutralizující anti-IFN-γ protilátky chránily myši proti Šoku podobnému Shwatzmanovu Šoku (Here50 mans et al., 1990, J. Exp. Med. 30 171:1853-1869) a myši postrádající IFN-γ receptor, na které bylo působeno galaktosaminem, byly resistentní vůči smrti indukované účinkem LPS (Car et al.,

1994, J. Exp. Med. 179:1437-1444). Nebylo tudíž neočekávané, že neutralizující protilátky proti myšímu IL-18 chránily myši naočkované P.acnes před letálním účinkem LPS (Okamura et al.,

1995, Nátuře 378:88-91). Zásah proti myšímu IL-18 též chránil přežívající myši před těžkou jatemí cytotoxicitou.

-1 cl ουυοια t»o

Poté, co byla nakloňována myší forma, byla popsána v r. 1996 lidská cDNA sekvence pro íL— 18 (Ushio etal., 1996, J. Immunol. 156:4274-4279). Rekombinantní lidský IL-18 vykazuje stejnou aktivitu jako přirozený (L-18 (Ushio et al., 1996, J. Immunol. 156:4274—4279). Lidský rekombi5 nantní IL-18 nemá přímý IFN-y-indukující účinek na lidské buňky T, působí ale jako kostimulátor tvorby IFN-γ a dalších cytokinů charakteristických pro Thl subpopulaci buněk T (Ushio et al., 1996, J. Immunol. 156:4274-4279). Dosud se má zato, že IL-18 15 primárně působí jako kostimulátor tvorby Thl cytokinů (IFN-γ, IL-2 a faktoru stimulujícího tvorbu kolonií granulocytů a makrofágů) (Kohno et al., 1997, J. Immunol. 158:1541-1550) a rovněž jako kostimulátor io cytotoxicity klonů myších NK buněk (přirozených zabíječů) zprostředkované FAS ligandem.

Nakloňováním IL—18 z postižených tkání a sledováním genové exprese IL-18 byla zjištěna úzká souvislost mezi tímto cytokinem a autoimunitními chorobami, U neobézních diabetických (NOD) myší se spontánně vytváří autoimunitní insulitida a diabetes, které mohou být urychleny a synchronizovány jedinou injekcí cyklofosfamidu. V pankreatu NOD myši byla pomocí RT-PCR prokázána IL-18 mRNA v prvních fázích insulitidy. Hladiny IL-18 mRNA se působením cyklofosfamidu rychle zvyšovaly a předcházely vzestupu hladiny IFN-γ mRNA a následnému diabetů. Je zajímavé, že tyto kinetiky sledují profil IL—12—p40 mRNA, takže dochází k těsné korelaci hladin jednotlivých mRNA. Nakloňování IL-18 cDNA z pankreatické RNA a následné určení sekvence ukazalo, ze tato sekvence je idcnuviu* j u-ι iu SvKv^.iici naKionovanou is^upneiuνγοι buněk a z in vivo aktivovaných makrofágů. Dále, makrofágy NOD myši reagovaly na cyklofosfamid expresí IL-18, zatímco makrofágy Balb/c myší s v paralelním pokuse nikoli. Exprese IL18 je tedy u autoimunních NOD myší regulována abnormálně a úzce souvisí s rozvojem diabetů (Rothe et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:469-474).

IL— 18 může hrát roli v imunoregulaci nebo v procesu zánětu tím, že zesiluje funkční aktivitu Fas ligandu na Thl buňkách (Dao et al., 10 1996, Cell-Immunol. 173:230-235). IL-18 je rovněž exprimován v kůře nadledvin a mohl by proto být secemovaným neuroimunomodulátorem s důležitou funkcí v koordinaci imunitního systému následně po vystavení účinkům stresu (Conti et at., 1997,7. Biol. Chem. 272:2035-2037).

In vivo je IL-18 produkován štěpením prekurzoru pro-IL-18 a jeho endogenní aktivita zřejmě zodpovídá za tvorbu IFN-γ při letalitě zprostředkované P.acnes a LPS. S ohledem na tuto aktivitu, představuje blokování biologické aktivity IL-18 při chorobných stavech terapeutickou stra35 tegii pro mnoho lidských chorob. K tomuto účelu lze použít solubilních receptorů nebo protilátek blokujících IL-18 receptory vázané na buňkách.

Proteiny vázající cytokiny (solubilní receptory cytokinů) odpovídají extracelulámím, ligand vázajícím doménám buněčných povrchových receptorů pro tyto cytokiny. Vznikají buď altema40 tivním sestřihem pre-mRNA, společné pro receptor na buněčném povrchu, nebo proteolytickým štěpením povrchového receptoru. Takovéto solubilní receptory byly již popsány, mezi jinými pro 11. 6 a IFN-γ (Novick et al., 1989,7. Exp. Med. 170:1409-1414), TNF (Engelmann et al., 1989, 7. Biol. Chem. 264:11974-11980; Engelmann etal., 1990,7. Biol. Chem. 265:1531-1536), IL—1 a IL—4 (Maliszewski et al., 1990, 7. Immunol. 144:3028-3033), IFN-α/β (Novick et al., 1994,

Cell 77:391-400; Novick et al., 1992, FEBSLett. 334:445-448) a další. Jeden cytokin-vazebný protein, osteoprotegerin (OPG, též známý jako OCIF, tj. faktor inhibující osteoklasty), který je členem receptorové rodiny TNFR/Fas, je zřejmě prvním příkladem sofubilního receptoru, který existuje pouze ve formě secemovaného proteinu (Anderson et at., 1997, Nátuře 390:175-179; Simonet et al., 1997, Cell 89:309-319; Yasuda etal., 1998, Endocrinology 139:1329-1337).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje IL-18-vazebné proteiny, IL-18BP, vybraný ze skupiny sestávají55 cí z: (a) polypeptidů obsahujících aminokyselinové sekvence ze SEQ ID NO: 2 nebo 6; (b)

-2polypeptidů definovaných v (a) bez zaváděcí sekvence; (c) muteinů s alespoň 80% homologíí s IL-18BP jak definováno v (a) nebo (b), fúzovaných proteinů, chemicky modifikovaných derivátů, církulámě permutovaných derivátů a jejich směsí polypeptidů definovaných v (a) nebo (b); a které se vážou k IL-18 a blokují produkci IFN-γ indukovanou IL-18. Vynález rovněž poskytuje způsob izolace proteinů IL—18BP z lidských tekutin a postup na jejich získání rekombinantními technikami. Vynález také poskytuje expresní vektory pro IL-18BP, vhodné k expresi IL-18BP v lidech a jiných savcích. Specifické IL-18BP, virově kódované homology IL18BP, jejich fúzované proteiny, muteiny, chemicky modifikované deriváty a cirkulámě permutované deriváty podle vynálezu jsou využitelné při modulaci a/nebo blokování i o biologických aktivit IL-18.

Vynález dále poskytuje replikovatelné expresní vektory obsahující DNA úseky vhodné pro expresi různých IL-18BP v hostitelských buňkách, hostitelské buňky takto transformované a proteiny a polypeptidy vytvořené expresí v takovýchto hostitelích.

Dále vynález poskytuje farmaceutické prostředky obsahující vhodná vehikula a proteiny IL18BP, nebo virové IL-18BP, nebo vektory k jejich expresi v lidech a jiných savcích, pro léčbu chorob nebo stavů, jež vyžadují modulaci nebo blokování aktivity IL-18.

Vynález dále poskytuje protilátky namířené proti proteinům IL-18BP a virovým IL-18BP, vhodné pro jejich afinitní purifikací a imunostanovení.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká různých IL-18BP a virových IL-18BP, které se vážou k IL-18. Takovéto IL— 18BP proteiny mohou mít schopnost modulovat a/nebo blokovat biologické aktivity IL-18. Termín „proteiny IL-18BP a virové ÍL-18-BP“ zahrnuje matumí protein (bez signální sekvence), protein obsahující signální sekvence, muteiny IL-18BP a virových IL-18-BP, deri30 váty IL-18BP a virových IL-18-BP, zkrácené formy IL-18BP a virových IL-18-BP, a jejich sole.

Vynález se dále týká replikovatelných vektorů vhodných pro expresi různých IL-18BP v hostitelských buňkách a hostitelských bakteriích. Vynález se dále týká expresních vektorů vhodných

5 pro expresi různých IL-18B P v 1 idech a j iných savcích.

Vynález se dále týká DNA molekul kódujících různé IL-18BP, muteiny, chemicky modifikované proteiny, funkční deriváty a jejich směsi. Tato DNA může být genomovou DNA, cDNA, syntetickou DNA, produktem PCR reakce nebo jejich kombinacemi. Tyto DNA mohou být vneseny do replikovatelných vektorů pro expresi různých IL— 18BP v hostitelských buňkách podle vynálezu.

Jedna takováto DNA kóduje IL-18BP zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10, opatřenou na 3' konci stop kodonem.

Expresní vektory vhodné pro expresi různých IL-18BP a virových IL-18BP v lidech a jiných savcích, tj. pro genovou terapii, mohou být virové vektory nebo jiné typy vektorů, do kterých jsou vneseny IL-18BP gen nebo IL-18BP cDNA takovým způsobem, který v lidech a jiných savcích umožňuje účinnou expresi IL— 18BP.

Izolaci IL-18BP lze podle vynálezu provést např. tak, že lidská tekutina jako moč nebo sérum, se nechá protéci chromatografickým sloupcem, ke kterému je navázán IL-18, a následně se eluuje zachycený IL-18BP,

-3CZ 300818 B6

Různé IL—18BP mohou být rovněž připraveny rekombinantními technikami, tj. exprimováním IL—18BP ve vhodném hostiteli, přičemž se použije funkčního připojení promotorů, enhancerů exprese, regulačních sekvencí atd. vhodných pro konkrétního hostitele, které např. umožní expresi genu ve správné orientaci.

Různé IL-I8BP a virové IL-18BP a vektory pro expresi IL-18BP v lidech a jiných savcích mohou být použity při léčbě nebo zmírňování stavů, při kterých se účastní IL-18 nebo které jsou působeny nadbytkem zevně dodávaného nebo vnitřně vytvářeného IL-18. Mezi takovéto stavy patří např. autoimunitní choroby, diabetes I.typu, revmatoidní artritida, odhojování transplantoio váného štěpu, zánětlivé choroby střeva, sepse, roztroušená sklerosa, ischemická choroba srdeční (včetně srdečních infarktů), ischemické poškození mozku, chronická hepatitida, lupénka, chronická pankreatitida, akutní pankreatitida a podobně.

Podle vynálezu byl IL-18BP izolován z normální lidské moči v jednom chromatografickém 15 kroku. Preparát hrubé frakce lidských proteinů moči, koncentrovaný z 500 litrů normální lidské moči, byl nanesen na sloupec agarózy, k níž byl navázán lidský IL-18. Kolona byla promyta a zachycené proteiny eluovány při nízkém pH. Eluované frakce byly neutralizovány a alikvoty byly analyzovány pomocí SDS-PAGE (10% akrylamid) za neredukujících podmínek a s barvením stříbrem. V eluovaných frakcích byl obsažen specifický proteinový pruh o velikosti ju přibližně 40 kDa (Obr. i).

Tento ~40 kDa protein byl identifikován jako protein vázající IL-18 podle své schopnosti specificky se kovalentně provázat s ^l35I-IL-18 (Obr. 2). Pro další charakterizaci ~40 kDa proteinu byla stanovena N-koncová proteinová sekvence. Alikvoty eluovaného proteinu byly po SDS25 PAGE elektroforeticky přeneseny na PVDF membránu a podrobeny mikrosekvenační analýze.

Alikvoty eluovaného proteinu byly podrobeny i přímé mikrosekvenační analýze. V obou případech byly získány dvě polypeptidové sekvence. Hlavní sekvence a minoritní sekvence, která odpovídala fragmentu lidského defensinu (přírůstkové číslo databáze pl 1398), počínaje aminokyselinovým zbytkem 65. Po odečtení známé sekvence defensinu zůstala následující sekvence:

T-P-V-S-Q-Q-x-x-x-A-A-A . . . 5 .... 10 . .

kde x představuje dosud neurčený aminokyselinový zbytek.

Pro získání delší a přesnější sekvence a pro identifikaci případných cysteinových zbytků bylo postupováno takto: alikvot eluované frakce byl redukován DTT za denaturujících podmínek, poté byl reagován s 4-vinylpyridinem, odsolen na mikroultrafiltračním zařízení (Ultrafree, mezní velikost 10,000 Da, Míllipore) a podroben proteinové mikrosekvenační analýze. Po 1 .sekvenačním cyklu byl zbývající protein reagován s o-ftalaldehydem, aby se blokovaly všechny N-koncové aminokyseliny kromě Pro, a pokračovalo se pak v sekvenaci. Tímto způsobem byla získána následující jediná proteinová sekvence:

TPVSQXXXAA XASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT 1 10 20 30 40 (T=Thr; P=Pro; V=Val; S=Ser; Q=Gln; X=neznámé; A=Ala; R=Arg; K=Lys; D=Asp; C=Cys; F=Phe; L-Leu; E=Glu)

Výsledná sekvence se významně liší od sekvencí všech známých proteinů v proteinových databázích. Avšak prohledání databáze při The Institute of Genomic Research (TIGR)

-4VX- «7VVQ1O DD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) pomocí vyhledávacího programu tblast odhalilo cDNA sekvenci označenou THC123801, jejíž otevřený čtecí rámec (218 kodonů) obsahuje aminokyselinovou sekvenci vysoce homologní s N-koncovou sekvencí IL-18BP, Homologie je zde níže ukázána:

1........TPVSQXXXAAXASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCFALEVT . . .40

VTLLVRATXVXQTTTAATASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVTWPE

51 100 (Horní sekvence (1-40) přísluší IL-18BP izolovanému podle vynálezu; spodní sekvence (51— 100) je odvozená z cDNA uvedené v TIGR souboru THC 123801).

io cDNA sekvence THC 123801 je však pouze tzv. EST (expressed sequence tag), tj. náhodně vybraný cDNA klon. Nikdy nebylo zkoumáno, zda tento EST obsahuje otevřený čtecí rámec, zda z genu odpovídajícímu ESTu nebo z ESTu samotného je exprimován nějaký protein, ani nebyla nikdy určena žádná funkce proteinu kódovaného THC123801. Vůbec nebylo známo nic o tom, že THC 123801 obsahuje otevřený Čtecí rámec kódující IL-18BP.

IL-18BP afínitně purifikovaný z moče si uchoval schopnost vázat svůj značený ligand (^l25I—IL— 18) a po kovalentním provázání se vytvořil komplex o molekulové hmotnosti 58 kDa. Molekulová hmotnost tohoto komplexu odpovídá 1:1 poměru mezi ~40 kDa IL-18BP a 19 kDa IL-18 (Obr. 2).

IL-18BP afínitně purifikovaný z moče blokoval biologickou aktivitu lidského i myšího IL-18. Přidání IL-18BP k lidskému nebo myšímu IL-18 tedy blokovalo schopnost IL-18 indukovat v přítomnosti lipopolysacharidu (LPS) tvorbu Ínterferonu-7 v kulturách myších slezinných buněk (Obr. 3).

Pro účely tohoto popisu se výraz „biologická aktivita IL-18“ týká mezi jiným alespoň jedné z následujících biologických vlastností:

(i) indukce IFN-γ v různých typech buněk jako jsou mononukleámí buňky, myší splenocyty, lidské monunukleámí buňky periferní krve, lidské KG-1 buňky a buňky T, primárně jako kostimulátor s mitogeny IL-1, IL-12, TNF-α, LPS, (ii) zvýšení proliferace buněk T, (iii) zvýšení tvorby Th-1 cytokinů in vitro, primárně jako kostimulátor, (iv) synergismus s IL-12 při zvýšení tvorby IFN-γ, kostimulační účinek na tvorbu IFN-γ a dalších cytokinů Thl buněk, (v) kostimulační účinek na cytotoxicitu klonů myších přirozených zabíjeěů (NK buněk) zprostředovanou FAS ligandem, (vi) indukce aktivace NF-^B v lidských KG-1 buňkách, pravděpodobně indukcí tvorby p50 NF_kB homodimeru a p65/p50 NF-^B heterodimeru, (vii) indukce IL-8.

Výraz „vazba k IL-18“, jak se zde užívá, znamená schopnost IL-18BP vázat IL-18, o čemž svědčí např. vazba afínitně purifíkovaného IL-I8BP k značenému IL-18 v Příkladu 2 níže zde uvedeném.

Výraz „modulace aktivity IL-18“, jak se zde užívá, znamená schopnost IL-18BP modulovat jakoukoli aktivitu IL-18 jiným způsobem než jejím blokováním, např. částečnou inhibici, zvýšením a podobně.

-5CZ 3110818 B6

Výraz „blokování aktivity IL-18“, jak se zde užívá, se týká schopnosti IL-I8BP blokovat alespoň jednu ze shora uvedených biologických aktivit IL-18. Příkladem této blokující aktivity ILI8BP je schopnost IL-18BP blokovat v myších splenocytech expresi lFN-γ související s IL-18.

Jak bude podrobněji ukázáno níže, modulační nebo blokující aktivita IL—18BP je částečně způsobena tím, že 1L-I8BP inhibuje aktivaci NF-|<B cytokinem IL-18. Dále ještě IL-18BP blokuje alespoň jednu z následujících aktivit IL-18, jmenovitě indukci lFN-γ v lidských a myších buňkách, indukci IL—8 a aktivaci NF-^B.

ío DNA sonda pro screening (prohledávání) cDNA knihoven byla připravena z RNA lidských Jurkat T-buněk pomoci RT-PCR a specifických sense a antisense primerů navržených podle TIGR sekvence. Identita výsledného PCR produktu byla potvrzena sekvenční analýzou DNA. Tento PCR produkt byl označen radioaktivním ³²P a použit jako sonda při screeningu čtyř lidských cDNA knihoven odvozených z monocytů periferní krve, Jurkat T-buněk, PBMC (mono15 nukleárních buněk periferní krve) a lidské sleziny. Různé s nezávislé cDNA klony odpovídaly čtyřem sestřihovým variantám IL-18BP (SEQ ID NO:1, 3, 5 a 7). Všechny sestřihové varianty kódovaly předpokládané solubilní secemované proteiny. Nejhojněji zastoupený protein (IL— 18BPa) měl otevřený čtecí rámec pro 192 kodonu, přičemž kódoval signální peptid, zde někdy též nazývaný „zaváděcí sekvence“, dlouhý 28 aminokyselinových zbytků, následovaný matumím píěupukiádaiiýiii IL-loDra, jeiiuž pivních 40 zbyíků se dokonaie shodovaio s N-koncovou proteinovou sekvencí močového 1L-18BP (SEQ ID NO:2). Umístění cysteinových zbytků naznačovalo, že tento polypeptid patří do imunoglobulinové (Ig) nadrodiny. Je zajímavé, že každý ze čtyř Gin zbytků matumího IL-18BPa představoval potenciální N-glykosylaění místo. Tři další sestrihové varianty IL-18BP byly méně zastoupené než IL-l8BPa. Kratší, 1 kb dlouhá IL-18BPb cDNA kódovala 28 aminokyselinových zbytků signálního peptidu, po kterých následoval matumí protein o 85 aminokyselinových zbytcích (SEQ ID NO:4). Třetí variantu, IL-18BPc, představovala 2,3 kb cDNA, kódující signální peptid 28 aminokyselinových zbytků dlouhý, po kterém následovalo 169 aminokyselinových zbytků matumího 1L-18BP (SEQ ID NO:6). Čtvrtá varianta, IL—18BPd, kódovala 28 aminokyselinových zbytků signálního peptidu, následovaných matumím

IL—18BP o 133 aminokyselinových zbytcích (SEQ ID NO:8).

Pro nalezení případných dalších sestrihových variant IL-18BP byla lidská genomová knihovna screenována sondou odpovídající plné délce IL-18BP cDNA. V knihovně bylo nalezeno pět genomových klonů různé délky. U všech těchto klonů byla provedena sekvenace s použitím vněj35 ších a vnitřních primerů. Dohromady byla z těchto klonů sestavena 7,8 kb dlouhá sekvence (SEQ ID NO:9). V rámci této 7,8 kb genomové sekvence nebyl nalezen žádný exon, který by kódoval transmembránový (TM) receptorový úsek. Všechny varianty sdílejí společný začátek translace, kódují stejný 28 aminokyselinových zbytků dlouhý signální peptid a solubilní matumí proteiny o různých velikostech a s různými C-koncovými sekvencemi. IL-18BP lokus obsahuje na mínus řetězci další gen, jenž kóduje protein 1 jaderného mitotického aparátu (NUMA1, nuclear mitotic apparatus protein 1). Z tohoto zjištění vyplývá lokalizace IL-18BP genu na lidský chromosom 1 lq 13 (Sparks etal., 1993, Genomics 17:222-224).

Pro kompletní proteinovou sekvenci IL-18BPa se hledaly homologie v GenPept databázi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) s použitím Smith Watermannova algoritmu. Bylo zjištěno, že v několika Poxvirech se exprimují homology ÍL-18BP jako secemované proteiny s dosud neznámou funkcí. Dříve již bylo popsáno, že vity kódují různé receptory cytokinů a že takovéto virově kódované molekuly slouží jako „atrapy“ receptorů, které inhibují imunitní odpovědí tím, že neutralizují příslušný cytokin (přehled podává Spriggs, MK, 1994, Curr. Opin. Immunol., 6:52650 529). Vynález se proto dále týká farmaceutických prostředků obsahujících virově kódovaný homolog IL-18BP, který se váže na IL-18 a blokuje produkci lFN-γ indukovanou IL-18. Příklady virově kódovaných homologů IL-18BP jsou uvedeny v Tabulce 1.

Podle vynálezu může být virem kódovaný homolog IL— 18BP exprimován v prokaryotickém nebo eukaryotickém hostiteli. Výraz „virem kódovaný homolog IL-18BP“, jak se zde užívá, se týká

-6JUUOIO DO podobnosti alespoň z 50% u sekvence o délce alespoň 70 aminokyselinových zbytků. Výhodněji, má alespoň 50%, alespoň 60%, alespoň 70%, alespoň 80%, nebo nejvýhodněji, alespoň 90% podobnost v sekvencí o 100 aminokyselinových zbytcích.

Tabulka 1. Virově kódované proteiny vykazující vysokou homologii s lidským 1L-18BP

GenPept sekvence	typ viru
MCU60315_54	U60315 virus Molluscum contagiosum subtyp 1
MCU60315_S3	U60315 Molluscum contagiosum subtyp 1
SWPHLSB_12	L22013 virus prasečích neštovic
CV41KBPL_14	virus kravských neštovic
WCGAA_5	virus černých neštovic
UO1161_3 174	Ectromelia (virus myších neštovic)
VVU18340_6	virus pravých neštovic
WU18338_7	virus pravých neštovic
VVU18337_7	virus pravých neštovic
VARCG_7173	virus pravých neštovic
MCU60315_51	virus Molluscum contagiosum
HNABV_1	nový virus asoc. s virem hepatitidy non-A, non-B

ío IL-18BPa byl exprimován v opičích COS7 buňkách. K tomuto účelu byla IL-18BPa cDNA vnesena do savčího expresního vektoru pEF-BOS. Aby se usnadnila purifíkace rekombinantního produktu, byla na 3’-konec otevřeného čtecího rámce IL-18BP přidána ve stejné fázi kazeta kódující (His)₆ sekvenci. COS7 buňky byly transientně transfekovány expresním vektorem a posléze bylo bezsérové médium těchto buněk (150 ml) zkoncentrováno a puntíkováno chroma15 tografií na nosiči s chelátem kovu. Na SDS-PAGE (barvené stříbrem) migroval IL-18BPa jako jeden pruh za redukujících i nered ukují cích podmínek a měl stejnou zdánlivou molekulovou hmotnost jako IL-18BP z moče. Analýza proteinové sekvence tohoto preparátu přinesla stejnou N-koncovou sekvenci jako v původním močovém 1L-18BP. Westernová analýza IL-18Pba s použitím protilátek získaných proti močovému IL-I8BP prokázala pruh o stejné molekulové hmotnosti jako v případě proteinu z moče. Kromě toho, při analýze imunoprecipttací s následnou SDS-PAGE a autoradiografií byl lL-18-BPa schopen vytěsnit značený I-IL-18BP močového původu z vazby k protilátce. IL-18BPa tedy strukturně odpovídá IL-18BP izolovanému z moče.

U hrubého a purifikovaného IL-18BPa byla testována schopnost inhibovat biologickou aktivitu

IL-18. IL-18BPa inhiboval aktivitu lidského a myšího IL-18 v myších splenocytech, PBMC a lidských KG-1 buňkách (Obr. 9). Tyto výsledky potvrzují identitu IL-18BPa cDNA jakožto cDNA kódující biologicky aktivní IL-18BP.

-7CZ 3UU818 B6

Vynález se dále týká muteinů IL-18BP a virových IL-18BP, a fúzovaných proteinů sestávajících z IL-18BP proteinů standardního typu a virových IL-I8BP, nebo jejich muteinů nebo jejich fragmentů, fúzovaných k jinému polypeptidu nebo proteinu, a schopných vázat IL-18BP a blokovat produkci IFN^y indukovanou IL-18.

Termín „muteiny“, jak se zde užívá, se týká analogů IL—18BP, nebo analogů virových IL-18BP, ve kterých je jeden nebo více aminokyselinových zbytků přirozeného IL-18BP nebo virového IL-18BP nahrazen jinými aminokyselinovými zbytky, neboje deletován, neboje jeden nebo více aminokyselinových zbytků přidán k přirozené sekvenci 1L-18BP nebo virového IL-18BP, aniž ío by se schopnost výsledných produktů vázat IL-18 a blokovat produkci IFN-γ indukovanou IL18 výrazně změnila ve srovnání s IL-18BP standardního typu nebo virového IL-18BP divokého typu. Tyto muteiny se připravují známými technikami syntézy a/nebo místně cílené mutageneze, nebo jakýmikoli jinými známými technikami pro to vhodnými.

Jakýkoli takový mutein má s výhodou sekvenci aminokyselin dostatečně blízkou sekvenci IL18BP nebo virového IL-18BP, aby měl v podstatě podobnou aktivitu jako 1L-18BP. Jednou z aktivit IL-18BP je jeho schopnost vázat IL-18. Pokud má mutein podstatnou vazebnou aktivitu vůči IL-18, může být použit při purifikací IL-18, například prostřednictvím afinitní chromatografie, a lze tedy říci, že má v podstatě podobnou aktivitu jako IL-18BP. Zda má daný mutein v podstatě stejnou aktivitu jako IL-I8BP může tedy být určeno na základě běžných experimentů, při kterých je např. takovýto mutein podroben jednoduchému sendvičovému kompetičnímu testu, jako je radioimunoanalýza nebo ELISA stanovení, aby se zjistilo, zda se váže nebo neváže k vhodně značenému IL-18.

Ve výhodném provedení má jakýkoli takový mutein alespoň 40% identitu nebo homologii se sekvencí IL-I8BP nebo virově kódovaného homologu IL-18BP. Výhodněji má s touto sekvencí alespoň 50%, alespoň 60%, alespoň 70%, alespoň 80%, nebo nejvýhodněji, alespoň 90% identitu nebo homologii.

Muteiny 1L-18BP polypeptidů nebo muteiny virových 1L-18BP, které mohou být použity podle vynálezu, nebo nukleové kyseliny, jež je kódují, zahrnují konečný soubor v podstatě odpovídajících sekvencí jako substitučních peptidů nebo polynukleotidů, jež mohou být normálně získány osobou běžně znalou oboru, bez nepřiměřeného experimentování, na základě poznatků a instrukcí zde prezentovaných. Pro podrobný popis proteinové chemie a struktury viz. Schulz,

G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; a Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co,, San Francisco, 1983, které jsou zde tímto zahrnuty odkazem. Pro pojednání o substitucích v nukleotidových sekvencích, například o preferencích pro kodony, viz Ausubel et al., 1987-1995, Current Protocols in Molecular Biology, kap. A. 1.1-A. 1.24, Greene Publishing Associates, lne. and Wiley & Sons, lne., New York; a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Dodatky C a D, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Výhodné záměny pro muteiny podle vynálezu jsou tzv. „konzervativní“ substituce. Konzervativní aminokyselinové substituce v IL-18BP polypeptidech nebo proteinech nebo virových IL45 18BP mohou zahrnovat synonymní aminokyseliny v rámci skupiny, jejíž členové mají dostatečně podobné íyzikálně-chemické vlastnosti, takže substice mezi členy skupiny zachová biologickou funkci molekuly, Grantham (1974), Science 185:862-864. Je jasné, že inserce a delece aminokyselin mohou být ve shora definovaných sekvencích prováděny bez změny jejich funkce, zejména pokud inserce nebo delece zahrnou pouze několik aminokyselin, např. méně než třicet a s výhodou méně než deset, a neodstraní se nebo se nepřesunou na jiné místo aminokyseliny, jež jsou důležité pro vytvoření funkční konformace, např, cysteinové zbytky (viz. Anfmsen, „Principles That Govem The Folding of Protein Chains“, Science (1973) 181:223-230). Proteiny a muteiny vytvořené takovými delecemi a/nebo insercemi spadají do rozsahu vynálezu.

-8VL·. JUUOIO DD

Avšak cysteinové zbytky, které nejsou nezbytné pro biologickou aktivitu mohou být nahrazeny jinými zbytky, např. ve snaze vyhnout se tvorbě nežádoucích intramolekulámích nebo intermolekulámích disulfidových vazeb, které mohou působit snížení aktivity IL-18BP.

Výhodné skupiny synonymních aminokyselin jsou definovány v Tabulce I. Výhodnější skupiny 5 synonymních aminokyselin jsou definovány v Tabulce II; a nejvýhodnější skupiny synonymních aminokyselin jsou definovány v Tabulce III.

Tabulka I

Výhodné skupiny Aminokyselina

Ser

Arg

Leu

Pro

Thr

Ala

Val

Gly

Ile

Phe

Tyr

Cys

His

Gin

Asn

Lys

Asp

Glu

Met

Trp synonymních aminokyselin Synonymnf skupina

Ser, Thr, Gly, Asn

Arg, Gin, Lys, Glu, His

Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Gly, Ala, Thr, Pro

Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr

Gly, Thr, Pro, Ala

Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Ser, Thr, Cys

Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin Gin, Asp, Ser, Asn Glu, Gin, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp

Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu

Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp

-9Tabulka JI

v.Z, JUUO1O DO

Výhodnější skupiny synonymních aminokyselin

Aminokyselina

Ser

Arg

Leu

Pro

Thr

Ala

Val

Gly lle

Phe

Tyr

Cys

His

Gin

Asn

Lys

Asp

Glu

Met

Trp

Synonymní skupina

Ser

His, Lys, Arg Leu, lle, Phe, Met

Ala, Pro

Thr

Pro, Ala

Val, Met, lle Gly lle, Met, Phe, Val, Leu

Met, Tyr, lle, Leu, Phe

Phe, Tyr

Cys, Ser

His, Gin, Arg

Glu, Gin, His

Asp, Asn

Lys, Arg

Asp, Asn,

Glu, Gin

Met, Phe, lle, Val, Leu Trp

-10Tabulka III

Nejvýhodnější skupiny synonymních aminokyselin Aminokyselina Synonymní skupina

Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Trp

-11 CZ 300818 B6

Příklady postupů pro zavádění aminokyselinových substitucí do proteinů, jež lze použít při přípravě muteinů IL-18BP polypeptidů nebo proteinů, nebo muteinů virových 11. -I8BP, zahrnují všechny známé metodické kroky, například postupy uvedené v patentech US RE 33 653,

US 4 959 314, US 4 588 585 a US 4 737 462 autorů Mark et al.; US 5 116 943 autorů Koths et al., US 4965 195 autorů Namen et al,; US 4 879 111 autorů Chong et al.; US 5 017 691 autorů Lee at al.; a patent US 4 904 584 pojednávající o proteinech substituovaných lysinem (Shaw et al.).

ίο V jiném výhodném provedení vynálezu má jakýkoli mutein IL-18BP nebo virového IL-18BP aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající sekvenci IL-18BP, nebo virovému IL-18BP. Termínem „v podstatě odpovídající“ se rozumí proteiny s drobnými změnami v sekvenci přirozeného proteinu, které nemají vliv na základní vlastnosti přirozených proteinů, zejména co se týká jejich schopnosti vázat IL-18. Typy změn, které obecně vyhovují kategorii „v podstatě odpoví15 dající“ jsou takové, jež jsou výsledkem konvenčních technik mutageneze DNA kódující tyto proteiny, vedoucích k několika drobným modifikacím, a následného vyšetření na požadovanou aktivitu způsobem diskutovaným shora. Vedle vazby k IL-18 mohou muteiny též modulovat a/nebo blokovat aktivitu IL-18.

Muteiny podle vynálezu zahrnují proteiny kódované nukleovou kyselinou, například DNA nebo RNA, která hybridizuje za stringentních podmínek k DNA nebo RNA kódující IL-18BP nebo virový IL-18BP podle vynálezu. Vynález rovněž zahrnuje takovouto nukleovou kyselinu, která je též využitelná jako sonda pri identifikaci a purifikaci žádané nukleové kyseliny. Kromě toho, by taková nukleová kyselina byla prvním kandidátem na stanovení, zda kóduje polypeptid, u nějž je zachována funkční aktivita IL-18BP podle vynálezu. Termín „stringentní podmínky“ se týká podmínek hybridizace a následného promývání, které jsou osobami znalými oboru konvenčně označovány jako „stringentní“. Viz Ausubel et al., Current Protocois in Molecular Biology, supra, kap. 6.3 a 6.4 (1987, 1992), a Sambrook et al., supra. Příklady stringentních podmínek zahrnují, bez omezení, promývání v podmínkách 12 až 20 °C pod vypočtenou T_m studovaného hybridu v např. 2 x SSC a 0,5% SDS po dobu 5 min, 2 x SSC a 0,1% SDS po dobu 15 min; 0,1 x SSC a 0,5% SDS při 37 °C po dobu 30 až 60 min a nakonec 0,1 x SSC a 0,5% SDS pri 68 °C podobu 30 až 60 min. Osoby zběhlé v oboru jsou si vědomi, že podmínky stringence též závisí na délce DNA sekvencí, oligonukleotidových sond (např. 10 až 40 bází) nebo smíšených oligonukleotidových sond. Používají-li se smíšené sondy, je výhodnější použít tetramethylamonium chlo35 rid (TMAC) místo SSC. Viz Ausubel, supra.

Vynález dále zahrnuje nukleové kyseliny, které kódují IL-18BP podle vynálezu, jež však mají vzhledem k degeneraci genetického kódu odlišnou nukleotidovou sekvenci. Takováto DNA, která případně nehybridizuje za stringentních podmínek k DNA sekvencím uvedeným v

Obr. 4 až 7, je však nicméně schopná kódovat IL-18BP podle vynálezu, je rovněž součástí vynálezu.

Termín „fúzovaný protein“ se týká polypeptidu obsahujícího IL-18BP nebo jeho mutein, ve fúzi s jiným proteinem, který má například prodloužený poločas přítomnosti v tělesných tekutinách.

IL-18BP tak může být fúzován k jinému proteinu, polypeptidu ap., např. k imunoglobulinu nebo jeho fragmentu. Může být také fúzován k polyethylenglykolu (PEG), aby se prodloužil jeho poločas.

Termín „soli“ se zde týká solí karboxylových skupin a solí vzniklých adicí protonu na aminosku50 piny IL-18BP, jeho muteiny nebo fúzované proteiny. Soli karboxylové skupiny se mohou tvořit způsoby známými v oboru a zahrnují anorganické soli, např. sodné, vápenaté, amonné, železité nebo zinečnaté soli ap., a soli s organickými bázemi jako např. soli tvořené s aminy, jako je tríethanolamin, s argininem nebo lysinem, piperidinem, prokainem, apod. Soli vzniklé adicí protonu k aminoskupinám zahrnují např. soli s minerálními kyselinami jako je např. kyselina chlorovodí- 12JUUOiO BO ková nebo sírová, a solí s organickými kyselinami jakoje např. kyselina octová nebo šťavelová. Takovéto soli musí samozřejmě mít v podstatě podobnou aktivitu jako IL-18BP.

Termín „chemicky modifikované deriváty“, jak se zde užívá, zahrnuje deriváty IL-18BP a jeho muteinů a fúzovaných proteinů, které lze připravit např. derivatizací funkčních skupin postranních řetězců aminokyselinových zbytků nebo N- nebo C-koncových skupin s použitím metod známých v oboru; tyto deriváty jsou zahrnuty do vynálezu, je-li zachována jejich farmaceutická přijatelnost, tj., nedochází k zničení aktivity proteinu, která je v podstatě podobná aktivitě ILI8BP a deriváty nedodávají toxické vlastnosti prostředkům, které je obsahují. Tyto deriváty mohou například zahrnovat polyethylenglykolové postranní řetězce, jež mohou maskovat antigenní místa a prodlužovat poločas IL-18BP v tělesných tekutinách. Další deriváty zahrnují alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxylových skupin vzniklé reakcí s amoniakem nebo s primárními nebo sekundárními aminy, N-acyl deriváty volných aminoskupin aminokyselinových zbytků vytvořené s acylovými zbytky (např. alkanoylovými nebo karbocyklickými aroylovými skupinami) nebo O-acyl deriváty volných hydroxylových skupin (např. serinových nebo threoninových zbytků) vytvořené s acylovými zbytky.

Termín „cirkulámě permutované deriváty“, jak se zde užívá, se týká lineami molekuly, jejíž konce byly navzájem spojeny, buď přímo, nebo prostřednictvím linkeru, za vzniku kruhové molekuly, která je potom otevřena na jiném místě za vzniku nové lineární molekuly s jinými konci než má původní molekula. Cirkulámí permutace zahrnují molekuly, jejichž struktura je shodná s molekulou, jež byla církularizována a poté otevřena. Cirkulámě permutovanou molekulu tedy lze syntetizovat de novo jako lineární molekulu, aniž by se uplatnil cirkularizační a štěpící krok. Příprava cirkulámě permutovaných derivátů je popsána v WO 95/27732.

Proteiny IL-18BP mohou být produkovány různými rekombinantními buňkami, prokaryotickými jako např. E. coli, nebo eukaryotickými jako kvasinkami nebo hmyzími buňkami. Způsoby konstrukce vhodných vektorů nesoucích DNA, jež kóduje IL-18BP, a vhodných k transformaci např. E. coli, savčích buněk a kvasinek, nebo k infekci hmyzích buněk, s cílem produkovat rekombi30 nantní IL-18BP jsou v oboru dobře známy. Viz například Ausubel et al., „Current Protocois in Molecular Biology“ Current Protocois. 1993; Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, 2. vydání, Cold Spring Harbor Press, 1989.

Pro potřeby exprese proteinů IL-18BP je DNA kódující IL-18BP, jejich fragmenty, muteíny nebo fúzované proteiny, s funkčně připojenými transkripčními a translačními regulačními sekvencemi, vnesena do vektorů, jež jsou schopné integrovat požadované genové sekvence do chromosomu hostitelské buňky. K selekci buněk, jež do svých chromosomu stabilně integrovaly vnesenou DNA, se používá jeden nebo více markérů, které umožňují selekci hostitelských buněk obsahujících expresní vektor. Markér může udělovat prototrofii auxotrofhímu hostiteli, resistenci vůči biocidním látkám, např. antibiotikům, nebo resistenci vůči těžkým kovům jako např. mědi apod. Gen selektovatelného markérů může být připojen přímo k DNA sekvencím, jež mají být exprimovány, nebo může být vnesen do stejné buňky pomocí kotransfekce. Pro optimalizaci syntézy mohou být potřebné í další regulační elementy; ty zahrnují signály pro sestřih, transkripční promotory, enhancery a terminační signály.

DNA molekula, jež má být vpravena do zvolených buněk je s výhodou součástí plasmidového nebo virového vektoru, schopného autonomní replikace v hostitelské buňce. Výhodné prokaryotické plasmidy jsou deriváty plasmidu pBR322. Výhodné eukaryotické vektory zahrnují BPV, vakcínii, SV40,2-pm plasmid atd., nebo jejich deriváty. Takovéto plasmidy a vektory jsou dobře známy v oboru (Bollon et al., 1980, J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48; Botstein et al., 1982, Miami Wínt. Symp. 19:265-274; Broach. J.R., v The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Lite Cycle and Inheritance“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, str. 445-470 (1981); Broach, 1982, Cell 28:203-204; Maniatis, T„ v „Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol.3: Gene Expression“, Academie Press, NY, str, 563-608 (1980)).

Po konstrukci vektoru obsahujícího DNA sekvenci pro expresi, může být expresní vektor vnesen

- 13CZ 300818 B6 do buňky vhodného hostitele s použitím kterékoli z rady vhodných metod, jako je transformace, transfekce, lipofekce, konjugace, fúze protoplastů, elektroporace, použití kalcium fosfátového koprecipitátu, přímá mikroinjikace atd,

Hostitelské buňky používané ve vynálezu mohou být s prokaryotické nebo eukaryotické. Výhodní prokaryotičtí hostitelé zahrnují bakterie jako jsou E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia atd. Nej výhodnějším prokaryotickým hostitelem je E. coli. Mezi zvláště zajímavé bakteriální hostitele patří E. coli KI2 kmen 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 10 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F , lambda', prototrofní) (ATCC 27325). V těchto hostitelích ío nebude protein glykosylovaný. Prokaryotický hostitel musí být kompatibilní s replikonem a s regulačními sekvencemi v expresním plasmidu.

Jelikož však jsou přirozené IL-18BP glykosylovaný, dává se přednost eukaryotickým hostitelům před prokaryotickými. Výhodnými eukaryotickými hostiteli jsou savčí buňky, například lidské, opičí, myší, a CHO (Chinese hamster ovary tj. ovariámí buňky čínského křečka) buňky, neboť zajišťují posttranslační modifikace proteinů, včetně složení do správné konformace, správné tvorby disulfídových vazeb, jakož i glykosylaci ve správných místech proteinové molekuly. K posttranslační modifikaci peptidů, včetně glykosylace s vysokým zastoupením mannosy, dochází rovněž v kvasinkách a hmyzích buňkách.

Při produkci heterolognich proteinů v kvasinkách a hmyzích buňkách se uplatňují různé strategie rekombinantní DNA využívající silné promotory a plasmidy o vysokém počtu kopií. Kvasinky a hmyzí buňky rozeznávají zaváděcí sekvence na produktech klonovaných savčích genů a secemují matumí 1L-18BP. Po zavedení vektoru se hostitelské buňky pěstují na selektivním médiu, ve kterém rostou pouze buňky obsahující vektor. Exprese klonovaných genů vede k tvorbě IL-18BP fúzovaných proteinů, nebo jejich muteinů. Shora zmíněné klonování, izolace a identifikace klonu, charakterizace a postupy při sekvenaci jsou podrobněji popsány níže v textu v Příkladech.

Exprimované proteiny se pak izolují a purifikují konvenčními postupy zahrnujícími extrakci, srážení, chromatografii, elektroforesu apod., nebo afinitní chromatografii například s použitím anti-IL-18BP monoklonálních protilátek imobilizovaných na gelovém nosiči v chromatografické koloně. Hrubé preparáty obsahující rekombinantní IL-18BP se nanesou na kolonu, přičemž IL18BP se naváže k specifické protilátce na sloupci, zatímco nečistoty projdou kolonou. Po promytí se protein z gelu eluuje za podmínek obvykle užívaných k tomuto účelu, tj. při vysokém nebo nízkém pH, například pH 11 nebo pH 2.

Vynález se dáte týká vektorů využitelných pro expresi IL-18BP nebo jeho derivátů v savcích a konkrétně v lidech. Vektory pro krátkodobou a dlouhodobou expresi genů v savcích jsou dobře známy z literatury. Z různých studií vyplynulo, že vnesení genu např. do kosterního svalu, hlad40 kého svalu cévní stěny a do jater má za následek systémové hladiny terapeutických proteinů. Kosterní sval je výhodný terč, protože má velkou masu, je vaskularizován a je snadno přístupný. S úspěchem se však použily i jiné cílové buňky, zejména prekurzory imunitních buněk z kostní dřeně. V současnosti dostupné vektory pro expresi proteinů, například ve svalu, zahrnují pláštidovou DNA, liposomy, konjugáty DNA s proteiny, a vektory na bázi adenoviru, adeno-asocio45 váného viru a herpesviru. Nejúspěšnější z nich, co se týká délky působení a hladiny genové exprese, jakož i bezpečnostního hlediska, byly vektory na bázi adeno-asociováného viru (AAV) (Kessier, P.D. 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:14082- 14087).

Postupy pro konstrukci AAV-odvozeného vektoru byly podrobně popsány (Snyder et al., 1996,

Current Protocols in Human Genetics, 6 kapitoly 12.1.1-12.1,17, John Wiley & Sons) a jsou zahrnuty do vynálezu. Ve stručnosti, plasmid psub201, obsahující genom AAV divokého typu, se štěpí restrikčním enzymem Xbal a liguje s DNA fragmentem obsahujícím účinný eukaryotický promotor, např. promotor cytotnegaloviru, konsensní sekvenci Kozákové, DNA sekvenci kódující IL-18BP, nebo jejich muteiny nebo fúzované proteiny, dále vhodnou 3' nepřekládanou oblast a polyadenylační signál, například polyadenylační signál z opičího viru SV40. Výsledným

- 14 VL· JUUO10 DD rekombinantním plasmidem, spolu s pomocným AAV plasmidem, např. pAAV/Ad, se kotransfekují savčí buňky, např. lidské T293 buňky. Kultury se pak infikují adenovirem jakožto pomocným virem, a po 48 až 60 hodinách se sklidí supematanty kultur. Supematanty se frakcionují srážením síranem amonným, purifikují se centrifugací v CsCl hustotním gradientu, dialyzují se, a poté se zahřejí na 56 °C, aby se zničily všechny adenoviry, zatímco výsledný rekombinantní AAV, který je schopný exprimovat IL-18BP nebo virový IL-18BP, nebo jejich muteiny nebo fúzované proteiny, zůstává při tomto kroku neporušený.

Fyziologická funkce solubilních cytokinových receptorů nebyla dosud objasněna. Solubilní io receptory vážou své specifické ligandy a ve většině případů inhibují jejich biologickou aktivitu, jak bylo například ukázáno v systému TNF (Engelmann et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:11974 11980; Engelmann et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:1531-1536). Jen ve velmi málo případech, například u IL-6, solubilní receptor zvyšuje biologickou aktivitu. Experimenty ukázaly, že rekombinantní solubilní TNF receptor, též známý jako TBP (TNF binding protein, TNF-vazebný protein), zabraňoval ve zvířecích modelech septickému šoku, a že solubilní formy IL-I receptoru měly výrazné inhibiční účinky na rozvoj in vivo alloreaktivity u myších příjemců alloštěpu.

Podobně mohou IL-18BP a virové IL-18BP podle vynálezu nalézt použití jako modulátory aktivity IL-18, např. v případech diabetů I. typu, sepse, autoimunitních chorob, odhojování trans20 plantátu, revmatoidní artritidy, zánětlivých chorob střeva, roztroušené sklerosy, ischemické choroby srdeční včetně akutních srdečních infarktů, ischemického poškození mozku, lupénky, chronické hepatitidy a akutní hepatitidy. Mohou tedy být použity např. při jakékoli chorobě, při níž endogenní tvorba nebo exogenní podávání IL-18 indukuje chorobu nebo zhoršuje stav pacienta.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků obsahujících farmaceuticky přijatelný nosič a IL-18BP nebo virový IL-18BP podle vynálezu, nebo jejich aktivní muteiny, fúzované proteiny a jejich soli nebo chemicky modifikované deriváty.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků obsahujících farmaceuticky přijatelný nosič a např. vírový vektor jako je kterýkoli z řečených AAV-odvozených virových vektorů nebo jiný vektor exprimující IL-18BP nebo jejich muteiny nebo fúzované proteiny, který je vhodný pro podání lidem a jiným savcům s cílem dosáhnout in vivo exprese IL-18BP, nebo jeho muteinů nebo fragmentů nebo fúzovaných proteinů podle vynálezu, tj. pro použití v genové terapii.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se připravují smícháním IL-18BP nebo virového IL18BP nebo jejich derivátů nebo vektorů pro jejich expresi s fyziologicky přijatelnými nosiči a/nebo stabilizátory a/nebo excipienty a směs se upraví do formy pro dávkování, např. lyofilizací do dávkových lahviček. Aplikace může být podle kteréhokoli z uznávaných způsobů používa40 ných při aplikaci podobných prostředků a bude záviset na stavu, který se léčí, tedy například nitrožilně, nitrosvalově, podkožně, místní injekční nebo zevní aplikací, nebo kontinuální infuzí atd. Množství aktivní látky, které se bude aplikovat, závisí na způsobu aplikace, léčené chorobě a stavu pacienta. Místní injekce bude například vyžadovat menší množství proteinu, v závislosti na tělesné hmotnosti, než nitrožilní infúze.

Proteiny ÍL18BP nebo virové IL-18BP nebo vektory, které je exprimují in v/vo, jsou tedy indikovány pro léčbu autoimunitních chorob, diabetů I. typu, revmatoidní artritidy, odhojování transplantátu, zánětlivých chorob střeva, sepse, roztroušené sklerosy, ischemické choroby srdeční včetně akutních srdečních infarktů, ischemického poškození mozku, chronické hepatitidy, lupén50 ky, chronické pankreatitidy a akutní pankreatitidy a podobných chorob, při kterých dochází k nenormální expresi IL-18 vedoucí k nadbytku IL-18, nebo v případech komplikací vyvolaných exogenně dodaným íL-18.

Vynález zahrnuje také protilátky proti IL-18BP. Termín „protilátka“ zahrnuje polyklonální pro55 tilátky, monoklonální protilátky (mAb), chimémí protilátky, anti-idiotypové (anti-Id) protilátky

- 15CZ 3U0818 B6 namířené proti protilátkám, které mohou být značené, v solubilní nebo vázané formě, humanizované protilátky, jakož i jejich fragmenty získané jakoukoli známou technikou, jako je, ale bez omezení, enzymatické štěpení, peptidová syntéza nebo rekombinantní technologie.

Polyktonální protilátky jsou heterogenní populace molekul protilátek získaných ze séra zvířat imunizovaných antigenem,

Monoklonální protilátka obsahuje v podstatě homogenní populaci protilátek specifických pro antigen, přičemž tato populace obsahuje v podstatě podobná vazebná místa pro epitop. Monoklo10 nální protilátky mohou být získány metodami dobře známými v oboru. Viz například Kohler a Milstein, Nátuře 256:495-497 (1975); Patent US 4 376 110; Ausubel et al. supra, Harlow a Lané, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y, (1992, 1993), v nichž obsažené odkazy jsou zde v úplnosti zahrnuty odkazem.

Takovéto protilátky mohou příslušet do kterékoli třídy imunoglobulinů, včetně IgG, IgM, IgE, IgA, GILD ajejich podtříd. Hybridem produkující mAb podle vynálezu může být kultivován in vitro, in šitu nebo in vivo. Vzhledem k produkci vysokých titrů monoklonálních protilátek in vivo nebo in sítu se tomuto způsobu produkce v současnosti dává přednost.

Chimémí protilátky jsou molekuly, jejichž různé části jsou odvozené z různých živočišných druhů, jako např. u chimémích protilátek, které mají variabilní oblast odvozenou z myší monoklonální protilátky a konstantní část z lidského imunoglobulinů. Chimémí protilátky se zejména používají pro snížení imunogenity při klinické aplikaci a pro vyšší výtěžky. Například v situaci, kdy myší mAb poskytují vyšší výtěžky z hybridomů, ale u lidí vyvolávají imunitní odpověď, používají se takovéto lidské/myší chimémí monoklonální protilátky. Chimémí protilátky a způsoby jejich produkce jsou dobře známé v oboru (Cabilly et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al. Nátuře 312:643-646 (1984); Cabilly et al. Evropská patentová přihláška 125023 (publikovaná 14.listopadu 1984); Neuberger et al. Nátuře 314:268-270 (1985);

Taniguchi et al. Evropská patentová přihláška 171496 (publikovaná 19.února 1985); Morisson et al. Evropská patentová přihláška 173494 (publikovaná 5.března 1986); Neuberger et al, PCT přihláška WO 86 01533 (publikovaná 13.března 1986); Kudo et al. Evropská patentová přihláška 184187 (publikovaná ll.června 1986); Sahagan et al, J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al. Mezinárodní patentová přihláška No. WO 97 02671 (publikovaná 7,května

1987); Liu et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al. Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 84:214-218 (1987); Better et al. Science 240:1041-1043 (1988); a Harlow a Lané, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra. Tyto odkazy jsou zde v úplnosti zahrnuty odkazem.

Anti-ídiotypová (anti-Id) protilátka je protilátka, která rozpoznává unikátní determinanty na molekule protilátky, zpravidla spojené s vazebným místem pro antigen, Anti-Id protilátka může být připravena imunizací zvířete stejného druhu a genetického typu (např. kmene myši) ze kterého pochází mAb, vůči které se anti-Id připravuje. Imunizované zvíře rozpozná a bude reagovat na idiotypové determinanty imunizující protilátky tím, že začne vytvářet protilátku proti těmto idiotypovým determinantám (anti-Id protilátku). Viz např. Patent US 4 699 880, který je zde v úplnosti zahrnut odkazem.

Anti-Id protilátka může být rovněž použita jako „imunogen“ na vyvolání imunitní odpovědi v ještě dalším zvířeti, za vzniku tzv. anti-anti-Id protilátky. Anti anti ld může být epitopově iden50 tická s původní mAb, která vyvolala anti-Id. Takto je možné s použitím protilátek namířených proti idiotypovým determinantám mAb identifikovat další klony exprimující protilátky s identickou spéci fítou.

Monoklonální protilátky vytvořené proti IL-18BP a příbuzným proteinům podle vynálezu, mohou tedy být použity k navození anti-Id protilátek ve vhodných zvířatech, jako jsou myši

-16VZ- JUDOΙΟ DD kmene BALB/c. Slezinné buňky z takto imunizovaných myší se použijí ke konstrukci s anti-Id hybridomů, jež budou produkovat anti-Id monoklonální protilátky. Dále, anti-Id monoklonální protilátky mohou být navázány na nosič jako je hemocyanin měkkýše šášně lodní (KLH) a použity k imunizaci dalších myší kmeneBALB/c. Sérum těchto myší bude obsahovat anti-anti-Id protilátky s vazebnými vlastnostmi původní mAb specifické pro ÍL-18BP epitop nebo epitopy virového IL-18BP.

Anti-Id monoklonální protilátky tedy mají své vlastní idiotypové epitopy, neboli „idiotovy“, strukturně podobné hodnocenému epitopu, jako například IL-18BP nebo virový 1L-18BP.

Termínem ..humanizovaná protilátka“ se rozumí např. protilátky získané manipulací myších protilátek metodami genového inženýrství tak, aby byly slučitelnější s lidským tělem. Takovéto humanizované protilátky mají u lidí sníženou imunogenitu a lepší farmakokinetiku. Mohou být připraveny technikami známými v oboru, jak je popsáno například pro humanizované anti-TNF protilátky v Molecular Immunology, 30( 16): 1443-1453 (1993).

Termínem „protilátka“ se rovněž rozumí, že zahrnuje jak celé molekuly, tak jejich fragmenty, jako například Fab a F(ab')í, které jsou schopné vázat antigen, Fab a F(ab')2 fragmenty nemají Fc fragment protilátky, rychleji vymizí z cirkulace a mohou mít nižši nespecifickou tkáňovou vazbu než celá protilátka (Wahl et al., J. Nucl Med. 24:316-325 (1983)). Je zřejmé, že Fab a F(ab')2 a další fragmenty protilátek využitelných podle vynálezu mohou být použity k detekci a kvantifikaci IL-18BP nebo virového 1L-18BP s použitím metod zde uvedených pro celé molekuly protilátek. Takovéto fragmenty se zpravidla získávají proteolytíckým štěpením, přičemž se užívají enzymy jako papain (na získání Fab fragmentů) nebo pepsin (na získání F(ab')2 fragmentů).

O protilátce lze říci, že je „schopná vázat“ molekulu, pokud je schopná specificky interagovat s molekulou a tím molekulu vázat k protilátce. Termínem „epitop“ se míní ta část jakékoli molekuly, která může být vázána protilátkou a která může být také rozpoznána touto protilátkou. Epitopy nebo „antigenní determinanty“ zpravidla sestávají z chemicky aktivních povrchových ses30 kupení molekul, jako jsou aminokyseliny nebo cukerné postranní řetězce, se specifickou trojrozměrnou strukturou a specifickými nábojovými vlastnostmi.

,Antigen“ je molekula nebo část molekuly, která může být vázána protilátkou, a která dále může vyvolat u zvířete tvorbu protilátky schopné vázat se k epitopu tohoto antigenů. Antigen může mít jeden nebo více epitopů. Specifickou reakcí, o níž byla řeč shora, se rozumí, že antigen reaguje vysoce selektivně se svojí odpovídající protilátkou a nikoli s velkým množstvím jiných protilátek, které mohly být vyvolány jinými antigeny.

Protilátky, včetně fragmentů protilátek, využitelné podle vynálezu, mohou být použity ke kvan40 titativní nebo kvalitativní detekci IL-18BP ve vzorcích nebo k detekci buněk, které exprimují takovéto proteiny podle vynálezu. Toho může být dosaženo imunofluorescenčními technikami, jež využívají fluorescenčně značené protilátky (viz níže) v kombinaci s detekcí mikroskopií, průtokovou cytometrií nebo fluorometrií.

Protilátky (nebo jejich fragmenty) využitelné podle vynálezu se mohou použít v histologii k in silu detekci IL-18BP podle vynálezu s použitím imunofluorescenční nebo imunoelektronové mikroskopie. In šitu detekce může být provedena po odebrání histologického vzorku s od pacienta přidáním značené protilátky podle vynálezu k takovémuto vzorku. Protilátka (nebo fragment) je s výhodou použita tak, že značená protilátka (nebo fragment) je aplikována nebo přiložena k biologickému vzorku. Použitím takového postupuje možné stanovit nejen přítomnost IL-18BP, ale také jeho distribuci ve vyšetřované tkáni. Osoby běžně zběhlé v oboru si při použití vynálezu ihned uvědomí, že kterákoli z celé řady histologických metod (jako například barvicí postupy) může být modifikována, aby bylo dosaženo takovéto in sítu detekce.

- 17CZ 3(10818 B6

Takovéto testy na IL-18BP podle vynálezu typicky zahrnují inkubaci biologického vzorku, jako například biologické tekutiny, extraktu tkáně, čerstvě odebraných buněk jako lymfocytů nebo leukocytů, nebo buněk, které byly inkubovány v tkáňové kultuře, v přítomnosti značené protilátky schopné identifikovat 1L-18BP, a detekci protilátky pomocí kterékoli z celé řady technik dobře známých v oboru.

Biologický vzorek může být zachycen na pevnou fázi nebo nosič jako nitrocelulosu, nebo na jinou pevnou fázi nebo nosič, který umožňuje imobilizaci buněk, buněčných částí nebo rozpustných proteinů. Pevná fáze nebo nosič mohou pak být promyty vhodnými pufry a následně inku10 bovány s detegovatelně značenou protilátkou v souladu s vynálezem, jak bylo uvedeno shora. Pevná fáze nebo nosič mohou pak být promyty pufrem podruhé, aby se odstranila nenavázaná protilátka. Množství vázané značky na pevné fázi nebo nosiči může potom být detekováno obvyklými prostředky.

Termíny „pevná fáze“, „nosič pevné fáze“, „pevný nosič“, nebo „nosič“ se rozumí jakákoli pevná fáze nebo nosič schopné vázat antigen nebo protilátky. Dobře známé pevné fáze nebo nosiče zahrnují sklo, polystyren, polypropylen, polyethylen, dextran, nylon, amylasy, přírodní a modifikované celulosy, polyakrylamidy, gabro a magnetit. Pro účely vynálezu může být nosič buď do určité míry rozpustný, nebo nerozpustný. Pevná fáze může mít prakticky libovolnou konfiguraci, nutné je pouze, aby navázaná molekula byla schopná se vázat k antigenu nebo protilátce. Pevná fáze nebo nosič tedy mohou být sférické jako u kuliček, válcovité jako u vnitřního povrchu zkumavky nebo vnějšího povrchu tyčinky. Povrch může také být plochý jako u listu nebo proužku, atd. Výhodné pevné fáze nebo nosiče zahrnují polystyrénové kuličky. Osoby znalé oboru budou znát mnoho dalších vhodných nosičů pro vazbu protilátek nebo antigenu, anebo budou schopny tyto zjistit pomocí rutinního experimentování.

Vazebná aktivita dané šarže protilátky podle vynálezu může být stanovena pomocí dobře známých metod. Osoby znalé oboru budou schopné určit běžným experimentováním funkční a optimální podmínky pro každé stanovení.

Další kroky jako promývání, míchání, třepání, filtrování a podobně, mohou být zařazeny do procedury jak je obvyklé nebo nutné v konkrétní situaci.

Jeden ze způsobů jak může být protilátka podle vynálezu detegovatelně označená je navázat protilátku k enzymu a použít ji v enzymoimunoanalýze (EIA). Tento enzym pak následně bude v přítomnosti vhodného substrátu reagovat se substrátem za vzniku chemického produktu, detegovatelného například spektrofotometricky, fluorometricky nebo vizuálně. Enzymy, jež mohou být použity k značeni protilátek zahrnují, ale bez omezeni, malátdehydrogenázu, stafylokokovou nukleázu, delta-5-steroidisomerázu, kvasinkovou alkoholdehydrogenázu, alfa-glycerofosfátde40 hydrogenázu, triosofosfátisomerázu, křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu, asparaginázu, glukosaoxidázu, beta-galaktosidázu, ribonukleázu, ureázu, katafázu, glukóza-6-fosfátdehydrogenázu, glukoamylázu a acetylcholinesterázu. Detekce může být provedena kolorimetrickými metodami, jež využívají chromogenních substrátů enzymů. Detekce může být provedena též vizuálním porovnáním rozsahu enzymatické reakce substrátu se standardy připravenými za podobných podmínek.

Detekce může být dosaženo s použitím kterékoli z řady dalších imunostanovení. Po radioaktivním označení protilátek nebo jejich fragmentů je například možné delegovat IL-18BP pomocí rádio imunoanalýzy (RJA). Dobrý popis RIA metody lze najít v Laboratory Techniques and Bio50 chemistry in Molecular Biology, autorů Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) se zvláštním poukazem na kapitolu, kterou napsal Chard, T„ „Úvod do radioimunoanalýzy a příbuzných technik“, která je zde zahrnuta odkazem. Radioaktivní izotop je delegován pomocí gama-počitače nebo kapalinového scintilačního počítače nebo autoradiografií.

- 18JWUO1O DO

Dále je možné protilátku podle vynálezu označit fluorescenční sloučeninou. Po vystavení fluorescenčně značené protilátky světlu o vhodné vlnové délce, může být přítomnost protilátky delegována díky fluorescenci. Mezi nejběžněji užívané sloučeniny k fluorescenčnímu značení patří fluorescein isothiokyanát, rhodamin, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-ftalalde5 hyd, a fluoreskamin.

Protilátka může být též značena kovy vydávajícími fluorescenci jako jsou např, ¹⁵²Eu nebo další lanthanidy. Tyto kovy mohou být navázány k protilátce prostřednictvím skupin chelatujících kovy, jako např. kyselina diethylentriaminpentaoctová (ETPA).

Protilátka může být též značena navázáním biotinu. Biotinylovaná protilátka pak může být delegována avidinem nebo streptavidinem navázaným k fluorescenční sloučenině nebo k enzymu jako peroxidáza nebo k radioaktivnímu izotopu a podobně.

Protilátka může být též značena navázáním chemiluminiscenční sloučeniny. Přítomnost chemiluminiscenčně označené protilátky je pak stanovena podle luminiscence vycházející v průběhu chemické reakce. Příkladem obzvláště užitečných sloučenin pro chemiluminiscenční značení jsou luminol, isoluminol, theromatický akridiniový ester, imidazol, akridiniová sůl a ester oxalátu.

Podobně mohou být k značení protilátky podle vynálezu použity bio luminiscenční sloučeniny. Bioluminiscence je typ chemiluminiscence, vyskytující se v biologických systémech, ve kterých je účinnost chemiluminiscenční reakce zvyšována katalytickým proteinem. Přítomnost bioluminiscenčního proteinu se stanovuje detekcí luminiscence. Důležité bioluminiscenční sloučeniny pro účely značení jsou luciferin, luciferasa a aequorin.

Molekula protilátky podle vynálezu může být použita v imunostanovení, známém též jako „dvojstranná“ nebo „sendvičová“ analýza. V typickém imunometrickém stanovení se určité množství neznačené protilátky (nebo fragmentu protilátky) naváže k pevné fázi nebo nosiči a přidává se určité množství solubilní značené protilátky, které umožňuje detekci a/nebo kvantifikaci temár30 ního komplexu mezi protilátkou na pevné fázi, antigenem a značenou protilátkou.

Typická a výhodná imunostanovení zahrnují „forvard“ analýzy, při kterých je protilátka navázaná na pevné fázi nejprve inkubována s testovaným vzorkem, aby se antigen ze vzorku navázal do binárního komplexu protilátka na pevné fází - antigen. Po vhodné době inkubace se pevná fáze nebo nosič promyje, aby se odstranily zbytky kapalného vzorku, včetně nenavázaného antigenu, je-li takový, a potom se přidá roztok obsahující neznámé množství značené protilátky (která slouží jako „reportérova molekula“). V průběhu druhé inkubace se značená protilátka komplexuje s antigenem, který je navázaný k pevné fázi to nebo nosiči prostřednictvím neznačené protilátky, a poté se pevná fáze nebo nosič podruhé promyje, aby se odstranila nenavázaná značená proti40 látka.

V jiném typu „sendvičového“ stanovení, které může být použitelné pro antigeny podle vynálezu, se provádějí tzv. „simultánní“ a „reverzní“ analýzy. Simultánní stanoveni spočívá v jediném inkubačním kroku, ve kterém se protilátka vázaná k pevné fázi nebo nosiči a značená protilátka současně přidávají k testovanému vzorku. Po ukončení inkubace se pevná fáze nebo nosič promyje, aby se odstranily zbytky kapalného vzorku a nenavázaná značená protilátka. Přítomnost značené protilátky spojené s pevnou fází nebo nosičem se pak stanoví stejně jako v případě konvenčního „forvard“ sendvičového stanovení.

Při „reverzním“ stanovení se nejprve přidá roztok značené protilátky ke kapalnému vzorku a po vhodné inkubační době následuje přídavek neznačené protilátky vázané na pevné fází nebo nosiči. Po druhé inkubaci je pevná fáze konvenčním způsobem promyta, aby se odstranily zbytky testovaného vzorku a nenavázané značené protilátky. Stanovení značené protilátky spojené s pevnou fází nebo nosičem se provede stejně jako v „simultánní“ a „forvard“ analýze.

- 19CZ J0U818 B6

Vynález též poskytuje DNA molekuly kódující IL-18BP jak shora definováno, replikovatelné vektory obsahující takovéto DNA molekuly, hostitelské buňky, jež jsou transformované těmito expresními vektory a zahrnující prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky, s výhodou CHO buňky. Vynález rovněž zahrnuje způsob přípravy expresních vektorů, kódujících 1L-18BP podle vynálezu, za účelem jejich exprese v lidech ajiných savcích,

Vynález též zahrnuje způsob přípravy IL-18BP podle vynálezu spočívající v kultivaci transformované buňky v souladu s vynálezem a izolaci proteinu kódovaného DNA molekulou v expresním vektoru uvnitř takovéto transformované hostitelské buňky.

io

IL-18BP nebo virový IL-18BP se mohou, vedle použití na modulaci aktivity IL-18, samozřejmě použít i pro purifikaci samotného IL-18. Pro tento účel se IL-Í 8BP nebo virový 1L-18BP naváže k afinitní koloně a hrubá frakce IL-18 se nanese na kolonu. Zachycený IL-18 se pak získá z kolony např. elucí při nízkém pH.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje SDS-PAGE (elektroforesu v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným) IL-18-vazebného proteinu purifíkovaného afinitní chromatografií. Na kolonu agarózy s navázaným IL-18 byla nanesena hrubá směs močových proteinů (zahuštěných ultrafiItrací z 500 1 normální lidské moče). Kolona byla promyta a zachycené proteiny eluovány při pH 2,2. Eluované frakce byly neutralizovány a alikvoty analyzovány pomocí SDS-PAGE (10% akrylamid) za neredukujících podmínek, gel byl barven stříbrem. Jednotlivé dráhy obsahovaly: 1: hrubá směs močových proteinů (nanáška 1,5 pg); 2-9: eluáty 1-8 z kolony IL-18-agarózy; 10: markéry molekulové hmotnosti, velikosti v kDa uvedeny vpravo. Šipkou je označen pruh odpovídající IL18BP.

Obrázek 2 ukazuje autoradiogram SDS-PAGE (7,5% akrylamid) komplexů obsahujících ¹²⁵I—IL—

18 (zdánlivá molekulová hmotnost 19 kDa) kovalentně provázaný s následujícími preparáty solubilního IL-18-vazebného proteinu: dráha 1: roztok po promytí IL—18 afinitní kolony; dráha 2: eluát 2 z IL-18 afinitní kolony; dráha 3: eluát 3 z IL-18 afinitní kolony. Markéry molekulové hmotnosti jsou vyznačeny vpravo (v kDa). Šipka označuje kovalentně provázaný produkt (58 kDa).

Obrázek 3 ukazuje inhibiční účinek 1L-18BP na tvorbu IFN-γ indukovanou IL-18, (A) Myší splenocyty byly stimulovány (24 h. 37 °C) vyznačenými kombinacemi LPS (1 pg/ml) a lidského (hu) IL—18 (5 ng/ml), přidaným buď přímo, nebo po preinkubaci (I hod, 37 °C) s močovým IL-18BP a po 24 h byla stanovena hladina myšího muIFN-γ v kultuře.

(B) Myší splenocyty byly inkubovány (24 h s LPS (1 pg/ml), spolu s myším IL-18 (10 ng/ml), který byl preinkubován (í h, 37 °C) s rostoucími koncentracemi lidského IL-18BP.

(C) Myší splenocyty byly inkubovány (24 h s LPS (1 pg/ml), spolu s rostoucími koncentracemi lidského IL-18BP.

(D) Myší splenocyty byly inkubovány (24 h) s ConA (1 pg/ml), spolu s rostoucími koncentrace45 mi lidského 1L-18BP.

(E) Lidské KG-1 buňky byly stimulovány faktorem TNF-a (20 ng/ml) a lidským huIL-18 (25 ng/ml), přidaným buď samotným, nebo po preinkubaci (1 h, 37 °C) s močovým IL-18BP.

Obrázek 4 ukazuje sekvence cDNA a proteinu lidského IL-18BPa. Signální peptid je podtržen.

Obrázek 5 ukazuje sekvence cDNA a proteinu lidského IL-I8BPb. Signální peptid je podtržen. Obrázek 6 ukazuje sekvence cDNA a proteinu lidského IL-18BPc. Signální peptid je podtržen.

-20CZ, JVU019 ΒΟ

Obrázek 7 ukazuje sekvence cDNA a proteinu lidského IL-18BPd, Signální peptid je podtržen.

Obrázek 8 ukazuje sekvenci lidského 1L-18BP genu. Lidský genomový klon (7,1 kb) byl sekvenován a sekvence byla porovnána se sekvencemi tří různých cDNA klonů izolovaných ze tří cDNA knihoven. Společný iniciační kodon je dán nukleotidy 683-685. NuMAl gen se nachází na negativním řetězci, od nukleotidu 3578 do konce.

Obrázek 9 ukazuje účinek rekombinantního IL-18BP na aktivitu lidského a myšího IL-18.

ío Rekombinantní IL-18BPa s navázaným hexapeptidem His6. Hís₆-IL-l8BPa, byl transientně exprimován v buňkách COS7 a puntíkován (rIL-18BP).

(A) Lidský IL—18 (5 ng/ml) byl po preinkubaci s HiSt-IL-ISBPa nebo s RPMI přidán k myším slezinným buňkám společně s LPS (1 pg/ml). Tvorba myšího muIFN-γ byla stanovena po 24 hodinách.

(B) Myší IL-18 (10 ng/ml) byl po preinkubaci s HiS$-IL-ISBPa nebo s RPMI přidán k myším slezinným buňkám společně s LPS (1 pg/ml). Tvorba myšího muIFN-γ byla stanovena po 24 hodinách.

(C) Lidský IL—18 (25 ng/ml) byl po preinkubaci s COS7-IL-18BPa nebo s RPMI přidán k lidským buňkám PBMC v přítomnosti IL—12 (10 ng/ml).

(D) Lidský IL-18 (25 ng/ml) byl po preinkubaci s COS7-IL-18BPa nebo s RPMI přidán k lidským KG-1 buňkám v přítomnosti TNF-a (20 ng/ml) a byla stanovena tvorba lidského huIFN-γ. Vynález bude nyní podrobněji popsán v následujících, nijak omezujících příkladech:

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Izolace IL-18-vazebného proteinu

Rekombinantní (E.colí) IL-18 (2,5 mg, Peprotech, NJ) byl navázán k nosiči Affigel-10 (0,5 ml, BioRad) podle pokynů výrobce a gelem byla naplněna chromatografická kolonka. Hrubá frakce močových proteinů (1000 x koncentrovaná, 500 ml) byla nanesena na kolonku při průtoku 0,25 ml/min. Sloupec byl promyt 250 ml 0,5 M NaCl v PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok). Vázané proteiny pak byly eluovány roztokem 25 mM kyseliny citrónové pH 2,2 a benzamidinu (1 mM) a ihned neutralizovány roztokem 1M Na₂CO₅. Objem sbíraných frakcí byl 1 ml. Frakce byly analyzovány SDS-PAGE s barvením stříbrem. lL-18-vazebný protein byl eluován ve frakcích č. 2-8 jako protein o molekulové hmotnosti -40,000 Da (Obr. 1). Zhruba -40 kDa pruh odpovídající IL-18BP poskytoval při barvení stříbrem výrazné žluté zabarvení. Různé frakce byly analyzovány pomocí kovalentního provázání s ^l25I-IL-18, SDS-PAGE a autoradiografie, jak je popsáno v Příkladu 2. Ve frakcích 2-8, eluovaných z kolony IL-18-agarózy (Obr. 2), tak byl potvrzen IL-18-vazebný protein.

Příklad 2: Kovalentní provázání afinitně purifikovaného IL—18BP se značeným 1 L-l 8.

Vzorky (40 μί) 1L-18BP z předchozího afinitně purifikaěního kroku byly inkubovány (70 min při 4 °C) s ¹²⁵I-IL-18 (5,000,000 cpm). Poté byl přidán disukcinimidylsuberát (DSS) rozpuštěný v dimethylsulfoxidu (DMSO, 20 mM) do výsledné koncentrace 2mM a směs byla ponechána 20 min při 4 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 1 M Tris-HCl pH 7,5 a 1 M NaCl do výsledné koncentrace 100 mM. Po přidání vzorkového pufru s obsahem dithiothreitolu (DTT, 25 mM výsledná koncentrace) byly směsi analyzovány pomocí SDS-PAGE (7,5% akrylamid) s následnou autoradiografií (Obr. 2).

-21 CZ 300818 B6

Specifický pruh o molekulové hmotnosti 58 kDa, patrně obsahující ~40 kDa protein kovalentně provázaný s ~20 kDa ^,25I—IL—18, byl pozorován ve frakcích eluovaných z IL-18 afinitní kolony (dráhy 2 a 3), ale nikoli v promývacím roztoku (dráha 1), který obsahoval všechny zbývající močové proteiny.

Příklad 3: Analýza proteinové sekvence.

Eluované frakce z afinitní kolony podle Příkladu 1 byly rozděleny pomocí SDS-PAGE (10% ío akrylamid) za neredukujících podmínek a přeneseny z gelu elektroforeticky na PVDF membránu (Pro-Blot, Applied Biosystems, USA). Membrána byla obarvena Coomassie modří, ~40 kDa pruh byl vystřihnut a podroben sekvenační analýze v Procise mikrosekvenátoru (Applied Biosystems, USA). Takto byla získána následující hlavní sekvence:

T-P-V-S-Q-Q-X-X-X-A-A-A . . . 5 .... 10. .

I5 kde x představuje dosud neurčený aminokyselinový zbytek.

Kromě ní byla získána i minoritní sekvence:

A-x-Y-x-R-l-P-A-x-A-l-A . . . 5. . . . 10. .

Kvůli této druhé sekvenci nebylo možné získat delší sekvenční data. Minoritní sekvence byla identifikována jako lidský defensin (přírůstkové č. p 11398), počínaje aminokyselinovým zbyt25 kem 65. Prohledání všech dostupných databází v NCBI a TIGR vyhledávacími programy blastp a tblastn nevedlo k nalezení žádného známého proteinu, který by odpovídal hlavní sekvenci.

Pro získání delší a přesnější sekvence a pro identifikaci případných cysteinových zbytků byl jiný alikvot frakce eluované z IL-18-agarózy redukován DTT v 6 M guanidin HCI, poté byl reagován s 4-vinylpyridinem, odsolen na mikroultrafiltračním zařízení (Ultrafree mezní velikost 10,000 Da, Millipore) a podroben proteinové mikrosekvenační analýze. Po 1 .sekvenačním cyklu byl filtr reagován s o-ftal aldehydem, aby se blokovaly všechny N-koncové aminokyseliny kromě Pro. Tímto způsobem byla získána pouze hlavní proteinová sekvence:

TPVSQXXXAA XASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT 1 10 20 30 40 (T^Thr; P=Pro; V=Val; S-Ser; Q=Gln; X=neznámé; A=Ala; R=Arg; K=Lys; D=Asp; C=Cys; F=Phe; L“Leu; E=Glu).

V cyklech 6,7,8 a 11 byl zaznamenán slabý signál pro Thr, avšak vzhledem k nízké hodnotě signálu jsme považovali za rozumnější nepřidělovat pro tyto cykly specifický aminokyselinový zbytek.

Výsledná sekvence se významně liší od sekvencí všech známých proteinů v proteinových databá45 zích. Avšak prohledání databáze TIGR pomocí vyhledávacího programu tblast odhalilo cDNA sekvenci označenou THC123801, jejíž otevřený Čtecí rámec (218 15 kodonů) obsahuje amino-22LZ. DUUO1O DO kyselinovou sekvenci vysoce homologní s N-koncovou sekvencí IL—18BP. Homologie je zde níže ukázána:

1........TPVSQXXXAAXASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVT . . .40

VTLLVRATXVXQTTTAATASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVTWPE

100 (Horní sekvence (1-40) přísluší IL-18BP izolovanému podle vynálezu; spodní sekvence (51— 100) je odvozená z cDNA uvedené v TIGR souboru THC123801).

Předpokládaná proteinová sekvence, získaná translací cDNA THC123801, byla v pozicích 2 a 4 io molekuly IL-18BP nejednoznačná. Potvrdila však pro pozice 6,7 a 8 a zřejmě i 11 v IL-18BP

Thr zbytek.

Příklad 4: IL— 18BP je glykoprotein.

Alikvoty (0,3 ml) eluovaných frakcí podle Příkladu 1 byly dále puntíkovány gelovou filtrací na sloupci Superosy 12(1 x 30 cm, Pharmacia, Švédsko). Kolona byla ekvilibrována a promývána roztokem PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) a azidu sodného (0,02%) při průtoku 0,5 ml/min a frakce byly sbírány po 1 min. IL-18-vazebný protein byl identifikován pomocí

SDS-PAGE a barvení stříbrem jako ~40 kDa protein ve frakcích 20-25. Na vzorek obsahující -40 kDa protein (frakce 23, 50 μΙ, ~50 ng bílkoviny) bylo působeno enzymem N-glykosídázou F (PNGasa F, Biolab) podle návodu výrobce. Ve stručnosti, alikvot byl denaturován varem v přítomnosti 5% SDS po dobu 10 min a pak inkubován v 10 xG7 pufru (2,5 μΙ), 10% NP-40 (2,5 μΐ) s PNGasou F (1 μΐ) 1 h při 37 °C. Vzorek byl analyzován pomocí SDS-PAGE (10% akrylamid) za neredukujících podmínek a porovnán s neštěpeným vzorkem IL-18BP ze stejné frakce po Superose 12. Bylo zjištěno, že působením PNGasy pruh IL-18BP zmizel a byly získány nové pruhy odpovídající 30 kDa (těsně nad pruhem PNGasy) a 20 kDa. Odstranění -40 kDa pruhu naznačuje, že se jedná o N-glykosylovaný protein.

Příklad 5: IL—18BP blokuje biologickou aktivitu IL-18.

Schopnost IL-18BP izolovaného z moči blokovat aktivitu IL-18 byla stanovena měřením tvorby IFN-γ v mononukleámích buňkách po indukci cytokinem IL-18. IL-18 indukuje IFN-γ je-li přidán k buňkám buď s malým množstvím LPS, IL-12, IL-2, nebo jiných stimulátorů. Aktivita IL-18 byla testována s myšími splenocyty, lidskými PBMC (mononukleámími buňkami periferní krve) a s lidskou buněčnou linií KG-1. Slezinné buňky, připravené ze zdravé myši, byly promyty a suspendovány v koncentraci 5xl0⁶ buněk/ml do RPMI 1640 média doplněného 10% totálním bovinním sérem. Kultury o objemu 1 ml byly stimulovány LPS (buď 0,5, nebo 1 pg/ml) spolu s rekombinantním lidským nebo myším IL-18 (buď 0,5, nebo 5 ng/ml). Lidský IL-18-vazebný protein (0,5 nebo 50 ng/ml) byl přidán k rekombinantnímu IL-18 před jeho přidáním k slezinným buňkám. Po 24 h kultivaci byly slezinné buňky podrobeny třem cyklům zmrazení (-70 °C) a roztáni (pokojová teplota), centrifugací byly odstraněny buněčné zlomky a supematanty byly testovány na obsah IFN-γ s použitím ELISA souprav pro myší IFN-γ (Endogen). Jak je ukázáno na Obr. 3A, IL-18BP blokuje aktivitu (lidského) huIL-18 v myších splenocytech v závislosti na dávce. Naopak, kontrolní solubilní interferon-α/β receptor neměl žádný účinek. Aktivita rekombinantního myšího IL-18 byla lidským IL-18BP podobně ínhibována, což naznačuje, že lidský IL-18BP rozpoznává myší IL-18 (Obr. 3B). Vysoké koncentrace LPS indukují v myších splenocytech endogenní IL-18, což má za následek tvorbu IFN—γ. Tato tvorba IFN-γ indukovaná LPS

-23CZ 300818 B6 (10 pg/ml) byla rovněž inhibována močovým IL-18BP (Obr. 3C). Concanavalin A (noc A) aktivuje buňky T k tvorbě IFN-γ v nepřítomnosti IL-18 (Fantuzzi et al., 1998, Blood 91 ;2118-2125), a skutečně, tato indukce IFN-γ concanavalinem A nebyla inhibována ani vysokou koncentrací IL-18BP (Obr. 3D), Tento výsledek prokázal, že IL-18BP působí jako specifický inhibitor bio5 logické aktivity IL-18 a nikoli jako nespecifický inhibitor tvorby IFN-γ. IL-18BP také inhiboval aktivitu lidského IL-18 indukovanou v lidských KG-1 buňkách kombinací IL—18 a TNF-a (Obr. 3E),

Shora uvedená data ukazují, že močový IL-18BP inhibuje aktivitu lidského i myšího IL-18 ío měřeno koíndukcí tvorby IFN-γ v lidských a myších mononukleámích buňkách. Koncentrace

IL-18BP, která snížila aktivitu IL-18 o více než 90 %, byla srovnatelná s vlastní s koncentrací IL-18, což svědčí o vysoké afinitě mezi oběma těmito proteiny.

Příklad 6: Izolace cDNA klonů kódujících IL-18BP.

Celková RNA z Jurkat buněk T (CRL 8163, sbírka ATCC) byla reversně transkribována SuperScript RNasa H reversní transkriptasou (Gibco-BRL) s použitím randomních primerů (Promega, Madison Wl). Výsledné cDNA fragmenty byly pak amplifikovány pomocí PCR s Taq

DNA polymerasou (Sigma) a primery odpovídajícími nukleotidům 24—44 (sense) a 500-481 (reversní) v klonu TIGR THC 123801. Bylo použito 30 cyklů hybridizace (55 °C, 2 min) a extenze (70 °C, 1 min). Výsledné PCR produkty byly rozděleny elektroforézou v agarózovém gelu (1%) a po eluci z gelu klonovány do vektoru pGEM-Teasy TA (Promega). DNA z jednotlivých klonů byla sekvenována s použitím T7 a SP6 primerů.

Výsledný fragment o velikosti 477 bp (párů bází) byl radioaktivně označen ³²P metodou náhodných primerů. Značená sonda bylo použita ke screeningu různých lidských cDNA a genomových knihoven, Z knihoven byly dvojmo pořízeny otisky na nitrocelulosových filtrech, které byly hybridizovány se sondou při 60 °C v pufru 6xSSC, lOx Denhardtův roztok, 0,1% SDS a 100 ng/ml

DNA z lososích spermií. Filtry byly promyty a exponovány přes noc při -80 °C na Kodak XAR film. Plaky příslušející klonům, jež vyšly pozitivně na obou filtrech, byly přečištěny. Z ÁpCEV9 klonů byly vyštěpeny plasmidové DNA a ligací cirkularizovány. cDNA klony z ostatních knihoven byly izolovány podle instrukcí výrobce. DNA sekvenace izolovaných klonů byla provedena na automatizovaných sekvenátorech Model 373A a 377 (Applied Biosystems) s použitím sense a antisense primerů. Všechny klonovací postupy se prováděly podle standardních protokolů (Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, 2. vydání, Cold Spring Harbor Press, 1989).

Screenovány byly následující knihovny: lidská cDNA knihovna z monocytů připravená v

LpCEV9 klonovacím vektoru (Gutkind et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11:1500-1507), laskavě poskytnutá T Mikim; lidská cDNA knihovna z leukemických Jurkat T buněk, lidská cDNA knihovna z leukocytů periferní krve a lidská cDNA knihovna ze sleziny, všechny z firmy Clontech (Palo Alto, CA). Lidská genomová knihovna z placenty ve vektoru lambda FIX II byla z firmy Stratagene (La Jolla, CA).

Byly získány a charakterizovány cDNA klony odpovídající čtyřem odlišným IL-18BP sestřihovým variantám. Všechny sestřihové varianty kódovaly pro předpokládané solubilní secemované proteiny, Nejhojněji zastoupený klon (IL-18BPa) měl otevřený čtecí rámec 192 kodonů dlouhý a kódoval signální peptid o délce 28 aminokyselin, po kterých následoval matumí předpokládaný

IL-18BPa, jehož prvních 40 zbytků (SEQ ID NO: 10) se perfektně shodovalo s N-koncovou proteinovou sekvencí močového IL-18BP (SEQ ID NO:2). Poloha cysteinových zbytků naznačovala, že tento polypeptid patří do imunoglobulinové (Ig) nadrodiny. Každý ze čtyř Gin zbytků matumího IL-18BPa by mohl být N-glykosylaěním místem. Ostatní tři sestřihové varianty IL18BP byly podstatně méně zastoupené.

-?4LZ JUVO1O »0

Jiná 1 kb IL-18BPb cDNA kódovala matumí protein o 85 aminokyselinových zbytcích (SEQ ID N0:4). Třetí variantu, IL-18BPc, představovala 2,3 kb cDNA, jež kódovala matumí IL-18BP o 169 aminokyselinových zbytcích (SEQ ID N0:6). Čtvrtá varianta, IL-18BPd, kódovala matumí IL-18BP o 133 aminokyselinách (SEQ ID N0:8). V pro-mRNA byla zjištěna dvě místa intron5 exon sestřihu. Sestřih v těchto dvou místech spolu s dalším 5' exonem v IL-18BPd umožňuje v různých cDNA klonech vznik 3 odlišných 5'm UTR (nepřekládaných oblastí). Je proto docela možné, že různé varianty IL-18BP mohou vznikat jako odpověď na specifické transkripčně regulační signály.

i o Doposud nebyla zj ištěna žádná cDNA, jež by kódovala receptor s transmembránovou doménou.

Příklad 7: Konstrukce savčího expresního vektoru, produkce rekombinantního IL-18BP, hodnocení biologické aktivity rekombinantního IL-18BP.

Kódující oblast IL-18BPa cDNA byla amplifikována pomocí PCR s těmito primery:

sense primer

5'TATATCTAGAGCCACCATGAGACACAACTGGACACCA a reversní primer

5' ATATCTAGATTAATGATGATGATGATGATGACCCTGCTGCTGTGGA

CTGC.

PCR produkty byly štěpeny restrikčním enzymem Xbal a klonovány do Xbal místa expresního vektoru pEF-BOS (Mizushima a Nagata, 1990, Nucl. Acid Res. 18:5322-5328) za vzniku pEFBOS-IL-18BPa. Konstrukce rekombinantních plasmidů byla ověřena sekvenováním DNA.

K transfekci bylo inkubováno 6x10⁷ COS7 buněk v 1,4 ml TD pufru obsahujícím DNA plasmidů pEF-BOS-IL-18BPa (10 pg) a DEAE-dextran (120 pg) po dobu 30 min při pokojové teplotě, jak bylo popsáno (Sompayrac a Danna, 1981, Proč. Nati Acad. Sci. USA 78:7575-7578). Buňky pak byly promyty médiem DMEM-10%FBS, nasazeny na 4 h v DMEM-10, promyty a inkubovány 3 až 5 dnů v bezsérovém DMEM. Kultivační médium bylo sebráno, zahuštěno 6x ultrafíltrací (membrána s mezní velikostí 10 kDa) a produkt, IL-18BP-HÍS6, byl zachycen na kolonce

Talon (Clontech) a eluován imidazolem podle návodu výrobce.

Imunologická křížová reaktivita močového a rekombinantního COS7-exprimovaného 1L-18BP byla stanovena následovně: močový IL-18BP (5 pg) byl označen radioaktivním ^I25I postupem s chloraminem T. Supematanty COS7 buněk (250 pl) byly smíchány (1 h, pokojová teplota, výs35 ledný objem 500 pl) s protilátkou proti močovému IL-18BP zředěnou 1:1000 v PBS, 0,05% Tween 20 a 0,5% hovězí serumalbumin (promývací pufr). Poté byl přidán ^l25I-značený močový IL-18BP (10⁶ cpm) a po 1 hodině byla přidána protein G-Sepharosa (20 pl). Suspense byla ponechána 1,5 h při 4 °C, kuličky Sepharosy pak byly izolovány a promyty 3x promývacím pufrem a lx roztokem PBS. Materiál zachycený na kuličkách byl eluován vzorkovým pufrem, elek40 troforeticky rozdělen v SDS-PAGE (10% akrylamid) za redukujících podmínek a následně autoradiografován.

IL-18BPa migroval v SDS-PAGE (barvení stříbrem) jako jeden pruh za redukujících i neredukujících podmínek a měl stejnou zdánlivou molekulovou hmotnost jako močový IL-18BP (data neukázána). Stanovená proteinová sekvence tohoto preparátu vykázala stejnou N-koncovou sekvenci jako u močového IL-18BP, což dokazuje, že IL-18BP izolovaný z močí nebyl degradovaný na N-konci.

-25CZ 300818 B6

Westernová analýza IL-18BPa pomocí protilátek namířených proti močovému IL— 18BP identifikovala pruh o stejné molekulové hmotnosti jakou měl protein z moči. Kromě toho bylo imunoprecipitací a následnou SDS-PAGE a autoradiografií prokázáno, že lL-18BPa je schopen vytěsnit močový ^l25I—IL—18BP z vazby na protilátku. IL-I8BPa proto strukturně odpovídá močovému

IL-18BP.

U hrubého a purifikovaného IL-18BPa byla testována schopnost inhibovat biologickou aktivitu IL—18. Bylo zjištěno, že lL-18BPa inhiboval IFN-y-indukující aktivitu lidského a myšího IL-18 v myších splenocytech, PBMC a lidských KG-1 buňkách, přičemž míra této inhibice závisela na ío dávce (Obr. 9).

Výsledky různých biologických stanovení jakož i test změny elektroforetické pohyblivosti (Příklad 8) prokázaly, že inhibice IL—18 aktivity je skutečnou vlastností klonovaného 1L-18BP a nikoli nějakých nečistot doprovázejících IL-18BP izolovaný z moči, jako například kopurifikují15 čího fragmentu defensinu.

Příklad 8; Stanovení posunu elektroforetické pohyblivosti

Byl rovněž studován účinek močového a rekombinantního IL-18BP na IL-18-indukovanou aktivaci NF-uB v lidských KG-1 buňkách. Lidské KG-1 buňky (4xl0⁶ buněk v 1 ml RMPI) byly stimulovány buď huIL-18 (10 ng/ml), nebo huIL-18 preinkubovaným s IL-18BP (20 min, pokojová teplota). Po 20 min při 37 °C byly buňky třikrát promyty předchlazeným roztokem PBS a ihned zamrazeny v kapalném dusíku. Buněčné pelety byly resusupendovány v trojnásobném objemu pufru A (20 mM Tris pH 7,6, 0,4 M NaCl, 0,2 mM EDTA, glycerol (20% obj.), 1,5 mM MgCI₂, 2 mM dithiothreitol (DTT), 0,4 mM PMSF, 1 mM Na₃VO.,, 2 pg/ml leupeptin, 2 pg/ml pepstatin a 2 ng/ml aprotinin). Buněčné zlomky byly odstraněny centrifugací (15,000 x g, 15 min) a alikvoty supematantu byly zmraženy v kapalném dusíku a skladovány při -80 °C. Koncentrace proteinu byla určena stanovením podle Bradfordové (BíaRad), jako standard byl použit hovězí sérový albumin. Dvouřetězcový oligonukleotid odpovídající vazebnému elementu pro NF-|(B (10 pmol, Promega) byl radioaktivně označen [³²P]dCTP (300 Ci/mmol) T4 polynukleotidkinasou (New England Biolabs). Volné nukleotidy byly odstraněny centrifugací na mikrokolonkách. Extrakty (10 pg proteinu) připravené z buněk, na něž bylo působeno IL-18 nebo 1L18 plus 1L-18BP, byly inkubovány (15 min při pokojové teplotě) se značenou sondou (3x10⁴ cpm), póly dl.dC (500 ng, Pharmacia) a denaturovanou DNA z lososích spermií (100 ng, Sigma) v 20 pl pufru obsahujícího HEPES (pH 7,5, 10 mM), 60 mM KC1, 1 mM MgCI₂, 2 mM EDTA, 1 mM DTT a glycerol (5% obj.) Směsi pak byly naneseny na 5% nedenaturující polyakrylamidový gel a byla provedena elektroforéza při 185V v 0,5 χ TBE (40 mM Tris HCI, 45 mM kyselina boritá, 2,5 mM EDTA). Gely byly vysušeny pod vakuem a přes noc autoradiografovány při 40 80 °C. Výsledek ukázal, že IL-18 indukoval vytvoření p50 NF-^B homodimeru a p65/p5O heterodimeru. Močový i rekombinantní IL-18BP inhibovaly aktivaci NF-tB cytokinem IL-18, měřeno posuvem elektroforetické pohyblivosti s extrakty KG-1 buněk a radioaktivně značeným oligonukleotidem odpovídajícím NF-^B konsensní sekvenci.

-2(5CL JUUfllO BO

Příklad 9: Exprese IL— 18BP v E.coli, kvasinkách a hmyzích buňkách.

IL-18BP může být produkován také jinými rekombinantními buňkami jako jsou prokaryotické buňky, např. E. coli, nebo jiné eukaryotické buňky, například kvasinky a hmyzí buňky. Pro konstrukci vhodných vektorů, jež nesou DNA kódující IL-18BP a jsou vhodné pro transformaci E. coli a kvasinkových buněk nebo pro infekci hmyzích buněk za účelem produkce rekombinantního IL-18BP, lze použít dobře známé postupy. V případě exprese v kvasinkách se vyštěpený inzert DNA kódující IL-18BP (Příklad 6) zaklonuje do expresních vektorů vhodných k transfekci io kvasinkových buněk. Pro expresi v hmyzích buňkách se DNA kódující IL-18BP zaklonuje do bakuloviru a hmyzí buňky se infikují tímto rekombinantním bakulovirem. Pro expresi v E.coli se DNA kódující IL-18BP upraví místně cílenou mutagenezou s vhodnými oligonukleotidy tak, aby se těsně před první kodon matumího IL-18BP dostal iniciační ATG kodon. Jinou možností jak připravit takovouto DNA je použití PCR a vhodných sense a antisense primerů. Takto modifiko15 vaně molekuly cDNA se pak postupy dobře známými v oboru vnesou do vhodně konstruovaných prokaryotických expresních vektorů (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Příklad 10: Konstrukce adeno-asociovaného expresního vektoru pro in vivo expresi IL—18—

BPa.

Funkční gen kódující IL-18BPa se konstruoval na základě plasmidů pcDNA3 (Invitrogen, San Diego CA). IL-18BP cDNA obsahující na 5'konci konsensní sekvenci Kozákové byla ligována do Xbal místa plasmidů pcDNA3 způsobem, kteiým se zrušilo toto restrikční místo. Nová Xbal místa se vnesla pomocí místně cílené mutageneze před neomycinovou kazetu (báze 2151 původní pcDNA3 sekvence) a za SV40 polyadenylační signál (báze 3372 původní pcDNA3 sekvence). Tento meziprodukt byl potom štěpen Xbal a výsledný 4,7 kb minigen byl vnesen do Xbal místa plasmidů psub201 jak bylo popsáno (Snyder et al., 1996, Current Protocols in Human Genetics, kapitoly 12.1.1-12.1.17, John Wiley & Sons). Výsledný rekombinantní plasmid byl kotransfekován s pomocným AAV plasmidem pAAV/Ad do lidských buněk T293. Kultury pak byly infikovány adenovirem v roli pomocného viru a po 48 až 60 hodinách inkubace byly buňky sklizeny. Po třech cyklech zamrazení - roztátí a centrifugačním odstranění buněčných zlomků byl k supernatantu přidán síran amonný do 33% nasycení. Směs pak byla centrifugována a ze supematantu byl vysrážen rAAV přidáním síranu amonného do 50% nasycení. Virus pak byl dále purifikován centrifugací v CsCl, dialyzován a nakonec 15 min zahřát na 56 °C, aby se zničil jakýkoli adenovirus.

Příklad 11: Konstrukce rekombinantních fúzovaných proteinů IL— 18BP.

Proteiny obsahující IL-18BP fúzovaný ke konstantní oblasti IgG2 těžkého řetězce lze získat následujícím způsobem: do DNA kódující IL-18BP se místně cílenou mutagenezí s vhodnými oligonukleotidy zavede unikátní restrikční místo těsně před a za kódující sekvencí. Do plasmidů nesoucího konstantní oblast lgG2 těžkého řetězce, např. pRKCO42Fcl (Bym et al., 1990, Nátuře 344:667-670) se podobnou místně cílenou mutagenezí zavede stejné unikátní restrikční místo co možná nejblíže k Asp 216 v IgG l těžkém řetězci takovým způsobem, aby se ve fúzovaném proteinu zachoval čtecí rámec. Fragment dsDNA obsahující 5' nepřekládanou sekvenci a kódující IL-18BP se připraví štěpením v unikátních restrikčních místech nebo pomocí PCR s vhodně so navrženými primery. Mutovaný pRKCD42Fcl je podobně Štěpen za vzniku velkého fragmentu obsahujícího plasmid a IgG 1 sekvence. Ligací obou fragmentů pak vznikne nový plasmid kódující polypeptidový prekurzor, který obsahuje IL-18BP a asi 227 C-koncových aminokyselin IgGl těžkého řetězce (oblast „pantu“ a domény CH2 a CH3). DNA kódující fúzované proteiny se z plasmidů mohou izolovat digescí příslušnými restrikčními enzymy a poté vnést do účinných pro55 karyotických nebo eukaryotických expresních vektorů.

-27CZ 300818 B6

Příklad 12: Příprava chemicky modifikovaných IL-18BP.

Zvýšení poločasu 1L-I8BP v plasmě lze dosáhnout chemickou modifikací IL-18BP polyethylen5 glykolem (PEG). Modifikaci lze provést s kovalentním navázáním PEG k cysteinovému zbytku v molekulách IL—18BP. Konstruují se i mutantní IL-18BP, které mají cysteinový zbytek navíc na amino-konci, v glykosylačních místech a na karboxy-konci každé molekuly IL-18BP. Mutagenezi lze provést pomocí PCR s použitím oligonukleotidů obsahujících požadovanou mutaci. Tyto mutantní proteiny se exprimují obvyklým způsobem, dobře známým v oboru. Proteiny se io pak modifikují navázáním molekul PEG a vyhodnotí se jejich aktivita.

Příklad 13: Příprava polyklonálních protilátek proti IL-18BP.

Králíkům bylo nejprve podkožně injikováno 5 pg čistého preparátu močového IL-18BP v emulzi s kompletním Freundovým adjuvans. O tři týdny později bylo opět podkožně injikováno 5 pg preparátu IL-18BP v nekompletním Freundově adjuvans. V 10 denních intervalech byly pak dány dvě další injekce IL-18BP ve formě roztoku v PBS. Po 10 dnech od poslední imunizace byli králíci vykrváceni. Tvorba protilátek byla sledována radioimunoanalýzou. K různým ředě20 ním (1:50, 1:500,1:5,000 a 1:50,000) králičího séra byly přidány ^l25I-značený IL-18BP (166,000 cpm) a suspenze kuliček protein G-agarózy (20 pl, Pharmacia) v celkovém objemu 200 pl. Směs byla ponechána 1 h pří pokojové teplotě, kuličky byly pak 3x promyty a vázaná radioaktivita byla změřena. Jako negativní kontrola bylo použito králičí antisérum proti lidskému leptinu. Titr antiséra proti IL-18BP byl mezi 1:500 a 1:5000, přičemž titr negativní kontroly byl nižší než 1:50.

Příklad 14: Příprava monoklonálních protilátek proti IL-18BP.

Samicím myší Balb/C (3 měsíce starým) byly nejprve injikovány 2 bg purifikovaného IL-18BP v emulzi s kompletním Freundovým adjuvans a o tři týdny později podkožně v nekompletním Freundově adjuvans. Tři další injekce antigenu v roztoku PBS byly dány podkožně v 10 denních intervalech. Poslední posilovači dávky byly podány intraperitoneálně 4 a 3 dny před fúzí myši, která vykazovala nejvyšší titr pro vazbu ve stanovení pomocí IRIA (viz níže). K fúzi se použily buňky NSO/1 myelomové linie a lymfocyty připravené ze sleziny a mízních uzlin imunizované myši. Suspenze fúzovaných buněk byla rozpipetována do mikrokultivačních destiček a hybridomy selektovány v DMEM doplněném HAT a 15% koňským sérem. Hybridomy, které produkovaly protilátky proti IL-18BP, byly dále klonovány metodou limitního ředění a injikovány do myší kmene Balb/C, které byly senzibilízované přistáném pro tvorbu ascitů. Izotypy protilátek byly stanoveny s použitím komerčně dostupné ELISA soupravy (Amersham, UK).

Screening hybridomů produkujících anti-ÍL-18BP monoklonální protilátky se prováděl takto: Supematanty hybridomů se testovaly na přítomnost anti-IL-18BP protilátek obrácenou radioimunoanalýzou na pevné fázi (IRIA). Jamky ELISA destiček (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) byly potaženy (10 pg/ml, 100 μΐ/jamka) IL-18BPa-His₆ purifikovaným na Talon kolonce. Po inkubaci přes noc při 4 °C byly destičky 2x promyty roztokem PBS obsahujícím BSA (0,5%) a Tween 20 (0,05%) a poté blokovány v promývacím roztoku nejméně 2 h při 37 °C. Na destičky pak byly přidány supematanty z kultur hybridomů (100 pl/jamka) a destičky byly inkubovány 4 h při 37 °C. Destičky byly 3x promyty a do jamek byl přidán na 2 h při pokojové teplotě kozí anti-myší imunoglobulin konjugovaný s křenovou peroxidázou (HRP, Jackson Labs,

1:10,000, 100 pl/jamka). Destičky byly 4x promyty a do jamek byl přidán ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina), Sigma) a H2O2 jako substrát. Vzniklé zabarvení bylo měřeno v automatické ELISA čtečce. Vzorky poskytující OD alespoň 5x vyšší než hodnota negativní kontroly byly považovány za pozitivní.

-7Xlá juuoia tso

Příklad 15: Afinitní chromatografie IL-18BP s monoklonálními protilátkami.

Protilátky proti IL-I8BP lze použít při purifikaci IL-18BP afinitní chromatografií. Ascitická tekutina obsahující monoklonální protilátku secernovanou hybridomem byla purifikována sráže5 ním síranem amonným pří 50% nasycení s následnou důkladnou dialýzou proti PBS. Asi 10 mg imunoglobulinú bylo pak navázáno k 1 ml suspenze Affigel 10 (BioRad USA) podle návodu výrobce.

Na 0,5 ml kolonku Affigelu nesoucího anti-lD-lSBP protilátku bylo naneseno při 4 °C a průtoku ío 0,25 ml/min 250 ml lidských močových proteinů (ekvivalent 2501 surové moče). Kolonka byla promývána PBS dokud nebyl protekly roztok prostý proteinů. IL-18BP byl eluován 25 mM cítrátovým pufrem pH 2,2 (8 frakcí o objemu kolonky) a ihned neutralizován 1M Na₂CO₃. Další purifikace tohoto preparátu lze docílit chromatografií na základě gelové filtrace.

Příklad 16: ELISA test.

K povrchu jamek mikrotitračních destiček (Dynatech, nebo Maxisorb firmy Nunc) se naváže anti-IL-18BP monoklonální protilátka (bezsérový hybridomový supemantant nebo imunoglobu20 liny ascitické tekutiny) inkubací přes noc při 4 °C. Destičky se promyjí roztokem PBS obsahujícím BSA (0,5%) a Tween 20 (0,05%) a dále jsou blokovány stejným roztokem nejméně 2 h při 37 °C. Zkoumané vzorky se naředí s blokovacím roztokem a přidají se do jamek (100 μΙ/jamka) na 4 h při 37 °C. Destičky se pak 3x promyjí roztokem PBS obsahujícím Tween 20 (0,05%) a přidá se králičí anti-IL-lŠBP sérum (1:1000, 100 μΙ/jamka) na další inkubaci pres noc při 4 °C.

Destičky se poté 3x promyjí a na 2 h při pokojové teplotě se přidá kozí anti-králičí imunoglubulin konjugovaný s křenovou peroxidázou (HRP, Jackson Labs, 1:10,000,100 μΙ/jamka). Destičky se 4x promyjí a přidá se ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazolin-ó-sulfonová kyselina), Sigma) a N₂O₂ jako substrát. Vzniklé zabarvení se měří v automatické ELISA čtečce.

Příklad 17: Neglykosylovaný lidský IL-18BP je biologicky aktivní.

U purifikovaného rekombinantního IL-18BPa se zkoušela schopnost inhibovat biologickou aktivitu IL-18. IL-18BPa inhiboval IFN-γ-indukující aktivitu lidského a myšího IL-18 v myších splenocytech, PBMC a lidských KG-1 buňkách, přičemž míra této inhibice závisela na dávce (Obr. 9).

Purifikovaný IL-18BPa obsahující His₆ přívěsek na C-konci (1,5 pg, 50 μΐ) byl upraven na pH 7,5 a smíchán s N-glykosidázou F (3 μΐ, 500,000 U ml, PNGasa F, New England Biolabs). Směs byla inkubována 24 h při 37 °C za nedenaturujících podmínek. Alikvoty ze vzorku a z kontrolního neštěpeného 1L-18BP-HÍS6 byly analyzovány pomocí SDS-PAGE za neredukuj ících podmínek a následně imunoblotovány s protilátkami proti IL-18BP. Bylo zjištěno, že ve frakci podrobené účinku PNGasy zmizel -40 kDa pruh odpovídající IL-18BP-His_& a objevil se nový -20 kDa pruh. Molekulová hmotnost produktu a specifita štěpení PNGasou nasvědčují, že 1L-18BP45 His$ byl plně deglykosylován.

Frakce podrobená účinku PNGasy, neštěpený IL-18BP-HÍS6 a kontrolní vzorek obsahující pouze PNGasu v pufru byly samostatně adsorbovány na kuličky Talonu, promyty fosfátovým pufrem a eluovány imidazolem (100 mM). S eluovanými frakcemi bylo provedeno stanovení biologické aktivity s použitím lidského IL-18 (20 ng/ml), LPS (2 pg/ml) a myších splenocytů. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

-29CZ 300818 B6

Vzorek	IFN-γ ína/ml)
Kontrola	7,5
Neštěpený IL-18BP-Hise	0
PNGasou štěpený IL-18BP-His6	0

Z pokusu lze tedy vyvodit, že deglykosylovaný IL-18BP je biologicky aktivní modulátor aktivity IL-18.

Předcházející popis konkrétních provedení osvětluje obecnou povahu vynálezu, takže při aplikaci současných vědomostí mohou jiní tato konkrétní provedení snadno modifikovat a/nebo adaptovat pro různá využití, aniž by se odchýlili od obecného principu, a proto takovéto adaptace a modifikace budou spadat smyslem a rozsahem mezi ekvivalenty zde zveřejněných provedení. Rozumí se, že zde použitá frazeologie a terminologie je pro účely popisu a nijak neomezuje.

PŘEHLED SEKVENCÍ <110> Novick, Daniela

Dinareilo, Charles Rubinstein, Menachem Kim, Soo Hyun

Yeda Research and Development Co. Ltd.

<120> Interleukin-18 Binding Proteins, their Preparation and Use <130> IL-18 Rubinstein <140>

<14I>

<150> 125463 <151> 1998-07-22 <150> 122134 <151> 1957-11-06 <150> 121869 <151> 1997-09-29 <150> 121639 <I51> 1997-08-27 <150> 121554 <151> 1997-08-14 <160> 10 <170> Patentln Ver. 2.0

CZ JUU919 »0 <2I0> 1 <211> 1348 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagaagagga cgttgtcaca gataaagagc tgaccatgag acacaactgg acaccagacc cccacgtcgt cactctcctg gtcagagcca ctgcctcagt tagaagcaca aaggacccct ctaagcagtg tccagcattg gaagtgaccc cgctgagcct atcctgtgcg gcctgcagcc tgggcaacgg ccccttcatc gagcaccccc gggaacgtgg gagcacaggt acgcagctgt ctgccctgca cagcaccaac ttctcctgtg gtcacgtcgt cctggcccag ctctggcctg aagccccgcc ctccagccac agcagtccac agcagcagca caaccttgac cagagczcgg cctgaccgcc tgtaggctgc gtggacgcgc ccttctctca ccaaattcaa actccattcc aatgccccct cctcctgcca ttctctcccc tcctcacact gctctactgc tcagaaacca ccagggccct acctgcattt cccacacgac ttcccagaca gctcccactc ccatgtccct cagcagggga acgctcaagc ctggttgaaa cagctc-ggc cgcattctgc agacttceta ttcac.ctaa tggactgctc cagggaaggg tgtatctgtg tcatccccac atgggtcctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa <210>2 io <211>192 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNÁL <222> (1)..(28) <400>2 caggctcacc agctcctgac gcatgcatca 60 tcagcccttt gtgggtcctg ctcctgtgtg 120 cacctgtctc gcagaccacc acagctgcca 13C gcccctccca gcccccagtg ttcccagcag 240 ggccagaggt ggaagtgcca ctgaatggaa 300 gcttccccaa cttcagcatc ctctactggc 360 caggccgacc gtgggagggg agcaccagcc 420 gcaaggcctt ggtgctggag cagctgaccc 4Θ0 tgctcgcgga ccctgaacag gttgtccagc 540 ggctgagggc aaccttgccc cccacccaag 600 agcagcaggg ttaagactca geacagggcc 660 gtcctacctg tctacctgga gcgaacagtc 720 aacacacccc ctccttctct gctttgggtc 780 cacctaccta gaaaatcaca gcctccttat 840 acctatccat tagccttcct aacgtcctac 900 ccaagactgt tgatgcctta gccttgcact 960 tttctggaag cctcccaact attcttgctt 1020 gctcatttag tcccgtcttc ctcaccgccc 1080 tgctgcctct tcagtgaagt catcctcttt 1140 tcttcgtgct gtatgttttt tttttccccc 1200 atgggggcac cagctgcttc ggatccacac 1260 ataaaggatt attcaatgga aaaaaaaaaa 1320

1348

-31 CZ 300818 B6

Mer

Ar 5

His

Asn

Trp

Thr

Pro Asp

Leu

Ser

Pro

Leu

Trp

Val

Leu

Leu

1

5

10

15

Leu

Cys

Ala

His

Val

Val

Thr Leu

Leu

Val

Arg

Ala

Thr

Pro

Val

Ser

20

25

30

Gin

Thr

Thr

Thr

Ala

Ala

Thr Ala

Ser

Val

Arg

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro

35

40

45

Cys

Ser

Gin

Pro

Pro

Val Phe

Pro

Ala

Ala

Lys

Gin

Cys

Pro

Ala

C Λ· — u

55

60

Leu

Glu

Val

Thr

Trp

Pro

Glu Val

Glu

Val

Pro

Leu

Asn

Gly

Thr

Leu

65

70

75

80

Ser

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Cys Ser

Arg

Phe

Pro

Asn

Phe

Ser

Ile

Leu

85

90

95

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Gly

Ser Phe

Ile

Glu

His

Leu

Pro

Gly

Arg

Leu

100

105

110

Trp

Glu

Gly

Ser

Thr

Ser

Arg Glu

Arg

Gly

Ser

Thr

Gly

Thr

Gin

Leu

115

120

125

Cys

Lys

Ala

Leu

Val

Leu

Glu Gin

Leu

Thr

Pro

Ala

Leu

His

Ser

Thr

130

135

140

Asn

Phe

Ser

Cys

Val

Leu

Val Asp

Pro

Glu

Gin

Val

Val

Gin

Arg

His

145

150

155

160

Val

Val

Leu

Ala

Gin

Leu

Trp Ala

Gly

Leu

Arg

Ala

Thr

Leu

Pro

Pro

165

170

175

Thr '

Gin

Glu

Ala

Leu

Pro

Ser Ser

His

Ser

Ser

Pro

Gin

Gin

Gin

Gly

180

185

190

<210>3 <211> 1038 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gagaagagga cgttgtcaca gataaagagc caggctcacc agctcctgac gcatgcatca 60 tgaccatgag acacaactgg acaccagacc tcagcccttc gtgggtcctg ctcctgtgtg 120 cccacgtcgt cactctcctg gtcagagcca caccrgtctc gcagaccacc acagctgcca 180 ctgcctcagt tagaagcaca aaggacccc“ gcccctccca gcccccagtg ttcccagcag 240 ctaagcagrg tccagcattg gaagtgacct ggccagaggt ggaagtgcca ctgagctggg 300 ctgagggcaa ccttgccccc cacccaagaa gccctgccct ccagccacag cagtccacag 360 cagcagggtt aagactcagc acagggccag cagcagcaca accttgacca gagcttgggt 420 cctacctgtc tacctggagt gaacagtccc tgactgcctg taggctgcgt ggatgcgcaa 480 cacaccccct ccttctctgc tttgggtccc ttctctcacc aaattcaaac tccattccca 540 cctacctaga aaatcacagc ctccttataa tgcctcctcc tcctgccatt ctctctccac 600 ctatccatta gccttcctaa cgtcctaccc ctcacactgc tctactgctc agaaaccacc 660 aagactgttg atgcctcagc cttgcactcc agggccctac ctgcatttcc cacatgactt 720 tctggaagcc tcccaactat tcttgczttt cccagacagc tcccactccc atgtctctgc 780 tcatttagtc ccgtcttcct caccgcccca gcaggggaac gctcaagcct ggttgaaatg 840 ctgcctcttc agtgaagtca tcctctttca gctctggccg cattctgcag acttcctatc 900 ttcgtgctgt atgttttttt tttccccctt cactctaatg gactgttcca gggaagggat 960 gggggcacca gctgcttcgg atccacactg tatctgtgtc atccccacat gggtcctcat 1020 aaaggatcat tcaatgga 1038 <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNÁL io <222>(1 )..(28) <400> 4

Met

Arg

His

Asn

Trp

Thr

Pro

Asp

Leu

Ser

Pro

Leu

Trp

Val

Leu

Leu

1

5

10

15

Leu

Cys

Ala

His

Val

Val

Thr

Leu

Leu

Val

Arg

Ala

Thr

Pro

Val

Ser

20

25

30

Gin

Thr

Thr

Thr

Ala

Ala

Thr

Ala

Ser

Val

Arg

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro

35

40

45

Cys

Pro

Ser

Gin

Pro

Pro

Val

Phe

Pro

Ala

Ala

Lys

Gin

Cys

Pro

Ala

50

55

60

Leu

Glu

Val

Thr

Trp

Pro

Glu

Val

Glu

Val

Pro

Leu

Ser

Trp

Ala

Glu

65

70

75

30

Gly

Asr.

Leu

Ala

Pro

His

Pro

Arg

Ser

Pro

Ala

Leu

Gin

Pro

Gin

Gin

85

90

95

Ser

Thr

Ala

Ala

Gly

Leu

Arg

Leu

Ser

Thr

Gly

Pro

Ala

Ala

Ala

Gin

100 105 110

Pro

-33 CZ 300818 B6 <210> 5 <211> 7063 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gaattcgcgg ccgcgtcgac gccagagggg ctaggiatgag agacagaggg tgtgatggtg 60 ggtgctggga aacgtacccg accttggggc tggtggctgg gggagtgggt agcctgggaa 120 aggccaggat gtggacggac tggtatggca ttgagcctga agtggtccaa cttggggttc 180 cccagtgcct aggaaagttg tccccttgaa tgtcagtgtg aaggtgaagg aggaagcaga 240 tgcccgttca tatggaaaca aagacctggc tgtgaagagg ggaggcggac accaaagtcc 300 tgacacttgg gcgggacaga attgatctgt gagagactca tctagttcat accctaggtg 360 accccggggg tggcatgggg gtagattaga gatcccagtc tggtatcctc cggagagtag 420 gagtcccagg agctgaaggt ttctggccac tgaactttgg ctaaagcaga ggtgtcacag 490 ctgctcaaga ttccctggtt aaaaagtgaa agtgaaatag agggtcgggg cagtgctttc 540 ccagaaggat tgctcggcat cctgcccttc ccagaagcag ctctggtgct gaagagagca 600 ctgcctccct gtgtgactgg gtgagtccat attctctctt tgggtctcaa ttttgccttc 660

CZ 3UU81B B6 cctaatgaag gggtaagatt ggactaggta gctggggtgg ggaaggattg tcacttgacc gctccaggcc atgctacggg aggaaaagcc aaagcgggag tggtttacca ttctcctccc acacataaag agccaggctc accagctcct tggacaccag acctcagccc tttgtgggcc ccggtcagag ccacacctgt ctcgcagacc acaaaggacc cctgcccctc ccagccccca ttggaagtga cctggccaga ggtggaagtg gtggcctgca gccgcttccc caacttcagc attgagcacc tcccaggccg actgtgggag ggtacgcagc tgtgcaaggc cttggtgctg aacttctcct gtgtgctcgt ggaccctgaa cagctctggg tgaggagccc aaggagaggc atgtggggag gaaagggtgg gccctgccag tcaaggtcag ccagacaaaa aggaacttag aaagtgatga gatgtccctc ctttccttgg gctgggctga gggcaacctt gccccccacc ccacagcagc agggttaaga ctcagcacag ttgggcccta cctgtctacc tggagtgaac gcgcaacaca ccccctcctt ctctgctttg ttcccaccta cctagaaaat cacagcctcc ctccacctat ccattagcct tcccaacgtc accaccaaga ctgttgatgc cttagccttg tgactttctg gaagcctccc aactattctt ctctgctcat ttagtcccgt cttcctcacc gaaatgctgc ctcttcagtg aagtcatcct cctatcttcg tgctgtatgt tttttttttc agggatgggg gcagcagetg cttcggatcc cctcataaag gattattcaa tggaggcatc actcccagga actttgcctg tcccacgagg agctgaagac aacacctgct tcaggggaac gcccataatg ctccccggga gcagaggcca tgtggcctca ggaaaaggga tgagagaaag ggtaggcttc aaagagccta tattcctctt tcacgggaga aaaatagact ttatttacaa gcccttaaaa accttcccat cactccaaat ggtgtgagct gctgctgaag gctgtccccc gtcctgggaa agagcatcct ctggcaggtg tcaagagtga gggcccctgc tgggcccagc ctcttatggt cccttctaga tccagaggct agccatcaaa accagcctca aatctggttg aaggaggcaa ggtagggaga gcgcccacac ccgagaaggc gccagtgaag gaccagggac tctaggcgtt tggctactgt tggcctggga gcggaggacc aggtgacggc agcaccgggg cctttaatgc tttgcctgaa agagacacag agcctgcacc cactggctgg gaaaatctct agcatcttac aaccatttgt ggtcatgaga 720 cccccagctc tgtctctaag tgctgaaaga 780 agctactgag gaaaagccag etaetgagaa 840 ccacctttca ccagagaaga ggacgttgtc 900 gacgcatgca tcatgaccat gagacacaac 960 ctgctcctgt gtgcccacgt cgtcactctc 1020 accacagctg ccactgcctc agttagaagc 1080 gtgttcccag cagctaagca gtgtccagca 1140 ccactgaatg gaacgctgag cttatcctgt 1200 atcctctact ggctgggcaa tggttccttc 1260 gggagcacca gccgggaacg tgggagcaca 1320 gagcagctga cccctgccct gcacagcacc 1380 caggctgtcc agcgtcacgt cgtcctggcc 1440 ctccaggaac aggaggagct ctgcttccat 1500 agcagcctgt gaactaatgc ccagcattcc 1560 gtcttgggca gaggaggtgt agcctggggc 1620 cctgatcctt gtctgccttc acttccctag 1680 eaagaagccc tgccctecag ccacagcagt 1740 ggccagcagc agcacaacct tgaccagagc 1900 agtccctgac tgcctgtagg ctgcgtggat 1860 ggtcccttct ctcaccaaat tcaaaetcca 1920 ttataatgcc tcctcctcct gccattctct 1980 ctactcctca cactgctcta ctgctcagaa 2040 cactccaggg ccctacctcc atttcccaca 2100 gcttttccca gacagctccc actcccatgt 2160 gccccagcag gggaacgctc aagcctggtt 2220 ctttcagctc tggccgcatt ctgcagactt 2280 ccccttcact ctaacggact gttccaggga 2340 acactgtatc tgtgtcatcc ccacatgggt 2400 ctgacatctg ttcatttagg cttcagttcc 2460 gagtatggga gagacggact gccacacaga 2520 acaggcgcct gaaaaagaaa agagagaaca 2S80 ctaatggaga gtgggaagag cctggaaaga 2640 gaggtggtat ggaagactca gcaggaacaa 2700 tCtcccacac cgatcaagtc aactcagtac 2760 gtaataacat ttagaaaaga tecatccccg 2820 cccaccccag tgcaagtctg gggaaggtag 2880 aaccccactc ctgagacaca gggcccatcc 2940 ctcccaccag gtcagaccca gtcctggact 3000 caccaggaca gcaggaacca gggcctactc 3060 aagaggaaga ctggccaggc ccaaggaccc 3120 tgatggagaa gtgactttgc tttaagaaaa 3180 tgtccatgct ccaggccccc tgggccagct 3240 caggccaggg tgcgggcagg catcactgtc 3300 gctgagagaa ggcactgaga gggacagtag 3360 acacaggtgg ggccactcac tggtaetggc 3420 tcacatggcc agatgagaac ttgcgatact 3480 tcctgctccc acgcccctgt ctggatcccc 3540

-35CZ 300818 B6 tcccttgtga gccccagggt catcagc.gc ccatgagaat ggggccatct gtcttctctc ctcttacccc acaccctcca gcagcctggc gcggtctggg gggtgcccat gctctcatcg caccttgccc ctggctcgag gggcggcacc ggtagtggca atgcgcggag aacggcgggc cagggccttc cccgaggctc cccgccgcag gaggacgctg aaggccatcg accggcgccg ggaaacccaa tgctgccttc ccaggccagc cgccagggcg tcgcttcacc ccccttcage gctgctttcc tctgggcctc agtagtgctc gccatggggc gcgggaaaca gctggtggcc gcagacagta gcaagaggag tcacatctga tggaccttgt aagtcaacgt gcaacctgct cttcccaaca gtrcccacce atgggtcagg tgagggaagg agagagaagg ctccctttag agtgctggag taacacccag gagccaccgc gggctctagg gagacccgtt tgcgctgctg ctggattggc tgcatgctgg cccggcgcag cccatctgtg atggtgccca ggctcaggga gaccatagct gtatggagat ggaggaggac cgacacttat ggtcgggacc cttcctgcct tgctctgctc cctacctaag ccctgggcaa tcctctctga gctcctgcct acccccaggg gtcccacctg gaacatgaga aggtcacccc gccctagtgc tcaggctaga tcagcaggtg cctgcacagt gaccccaggc ctcaccccgg ggggcacact cgattgcgct gctgcagctc aggctcatcc tggcaagtgc ccatgtagaa gggaacaaat gagcccggag ccggcaggtc cgctgccacc taccccataa acttgaagcc tgcaggagta cggcacacag accatttcta ggsgagggca gaagaggtca cacgcagaga cttggtggcc aacacccaga ggaacaaatt ctggtgccca aaggacaaga gcttccaaga cccatcaccg cctgagaagg gcatggagga gggaatcccg gacccttaac Cctggctaag ggcaggtaag gaagaccctg aggctgcagg aaggaggcca gccttggatt ttcaaaaagc ttccsgtcta atctcggggt atagtaagtc ctggacaccc cggcctggga acgacgagca aagctgagca gggctgagtt gccataatcg gaggaggtgg ctcgcaggct agcctgggaa gagttggcgc cgtctggctc tcccacatct agtatacagt ccctggcact gtacagaagc cacggcacat ccatgtattc ccaactgctt gaaataggcc ttgtcgacag aagcccccac tacgcacttt tttcacggag tctattcata tggctgtgcc tgagcagctc tgggtgccct 3600 cttggagagg agctaccagg acagggacac 3660 gtggccccat cttggatgct acttggtggg 3720 ggcttccccc ccccaccctg ccagtgcctc 3780 aatggcggca gcagtggcgg cgctggctgt 3840 tccactgcga gcgctggggg aagcctcgga 3900 aaggctgttc cctagcttct tgggtgtgtt 3960 gtcagcctgc aaggaagggc tgtcagaccg 4020 gtgctgtgcc acgctgtacc agcaaggtcc 4080 cccagcccca cctgtttagt agaagctgga 4140 tgtttgcgcc cttcatgtcg gtctcgggga 4200 ttcttagacc atggagaaga ggacagttag 4260 agccaggtgc cttgtcctct cagagctgag 4320 ccccttccca actctgggcc agatccttcc 4380 cccttggaga gagggaaaga gagggggaag 4440 tccttggtga gctgggcctg acctgagcac 4500 gcctacctca ggagttccag ggccctggťg 4560 ccgggtggtg atgccagtgc cctcggctat 4620 ggtctcttgc gggtctccag ttttcatctc 4680 aggctgcatg ggtggaagag gtggtcagtg 4740 ctggggctgL tccagaactc tacactcgcc 4800 acgagataga aagacacaag cctcctttcc 4360 atggcacaag cagtgcagtc ctgaccagat 4920 acttcacccc tgagtgccct ccagctgtct 4980 ttcccctcc: cggccagtca gtgatccagg 5040 ggattccaac gaagggcagg gatgggaggc 5100 actccaggga tagcaggtct tcagatgtgg 5160 tgcaatgcgg ttccagtcat ccagctgctc 5220 gctgtccctc cctgtggaag gcagggaagt 5280 acctcctggc cctggcatct tgccagcctt 5340 cggcacacca gtctgattca gtgccgcagg 5400 tcctaggggc ttgctcacca ccttctccct 5460 ctgctactac atcttattca cctgccaagg 5520 aaggaccggg aattaattcc caggggctcc 5580 agagtctggc cagcctggcc tttccagcag 5640 ctccccacag ctaagtgtca caattgtgct 5700 agtgccccca acacagccag cccctagatg 5760 aaggaggggc aggtggagct ggatggtagc 5820 tttcctctct tccctgtgcc acgatccacc 5880 cctgtagtcc cctcacctgg aggggcccca 5940 gaactgcg&c tggtggggcg gtagccaggc 6000 ggagaaccca ggcgagctag agactgagta 6060 gcaggagcag accgcgtgct gtagaacgat 6120 agcctctgga agacagagtg aatctgttgc 6180 ttcccattcc cttccgaagc cctcagatcc 6240 tgcaaaggcc cttaaagtgt gtgtctgcaa 6300 aaggtggtgc tgatgttgtc aagactcttc 6360 atgctttgac gtagggaatg cagagtgttt 6420

LZ JUUOie «0 atcggcccat ctaggaagta cagcetctgc ccaacttctt ccccccctcc cagcctgtca ggaggcacag gtgctacgca gcctttttct tcccactgta aaagatgccc cttggagatg aagcgcaaag aaataaagtg actagcccca aatcacactg 6480 tcagagctgg ggctaggccc catgtctcct gactagteag gctcatccca 6540 tgtccctcag tccaaacttc cagggccctt accatgtccc agaacttccc 6600 ggtagcaggg ggcaccctaa acacacaggt cccccctgct gtaccagggg 6660 cctcctccca aacctcccct tcaagatgtg gaaacaaagg caagggcctg 6720 ggcagtccac tgggcagcaa caatgcctct cagctgcacg gggcatgctg 6780 gatgggctgc agcttcgcca cgttctctcc cttcaccctg cacaggctca 6840 tggagagaat gctagcctta gtcaggaggc agggatctaa tcctagccct 6900 tcagaagtgc ccttaaccaa gtcactgccc tttttaagac ctctcagctt 6960 acatggactg gctgctcatc cctccctgct cctgactgag tgcccagtgc 7020 ttgagaggaa gtgggaatcg ctgacctgtc gac 7063 <2I0> 6 <211> 197 <212>PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNÁL ío <222> (1)..(28) <400> 6

Met 1

Arg

His

Asn

Trp Thr Pro Asp Leu Ser Pro Leu Trp Val Leu

Leu

5

10

15

Leu

Cys

Ala

His

Val

Val

Thr

Leu

Leu

Val

Arg

Ala

Thr

Pro

Val

Ser

20

25

30

Gin

Thr

Thr

Thr

Ala

Ala

Thr

Ala

Ser

Val

Arg

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro

35

40

45

Cys

Pro

Ser

Gin

Pro

Pro

Val

Phe

Pro

Ala

Ala

Lys

Gin

Cys

Pro

Ala

50

55

60

Leu

Glu

Val

Thr

Trp

Pro

Glu

Val

Glu

Val

Pro

Leu

Asn

Gly

Thr

Leu

65

70

75

80

Ser

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Cys

Sar

Arg

Phe

Pro

Asn

Phe

Ser

Ile

Leu

85

90

95

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Gly

Ser

Phe

Ile

Glu

His

Leu

Pro

Gly

Arg

Leu

100

105

110

Trp

Glu

Gly

Ser

Thr

Ser

Arg

Glu

Arg

Gly

Ser

Thr

Gly

Thr

Gin

Leu

115

120

125

Cys

Lys

Ala

Leu

Val

Leu

Glu

Gin

Leu

Thr

Pro

Ala

Leu

HiS

Ser

Thr

130 135 140

-37CZ 3UU818 B6

Asn

Phe

Ser

Cys

Val

Leu

Val

Asp

Pro

Glu

Gin

Val

val

Gin

Arg

His

145

150

155

160

Val

Val

Leu

Ala

Gin

Leu

Trp

Val

Arg

Ser

Pro

Arg

Arg

Gly

Leu

Gin

165

170

175

Glu

Gin

Glu

Glu

Leu

Cys

Phe

His

Met

Trp

Gly

Gly

Lys

Gly

Gly

Leu

180

185

190

Cys

Gin

Ser

Ser

Leu

195 <2107 <211> 1360 <212>DNA <213> Homo sapiens <400 7 gcggccgcgt cgaccacgca gctaaacaca gctaacttga gccttggagc tcctaaaggg 60 aagcttctgg aaaggaaggc tcctcaggac cccttaggag ccaaagaaga ggacgttgtc 120 acagacaaag agccaggctc accagctcct gacgcatgca tcatgaccat gagacacaac 180 tggacaccag acctcagccc tttgtgggtc ctgctcctgc gcgcccacgt cgccactctc 240 ctggtcagag ccacacctgt ctcgcagacc accacagctg ccac-gcctc agttagaagc 300 acaaaggacc cctgcccctc ccagccccca gtgttcccag cagctaagca gtgtccagca 360 ttggaagtga cctggccaga ggtggaagtg ccactgaatg gaacgctgag cttatcctgt 420 gtggcctgca gccgcttccc caacttcagc atcctctact ggctgggcaa tggttccttc 480 attgagcacc tcccaggccg actgtgggag gggagcacca gccgggaacg tgggagcaca 540 ggctgcgctg agggcaacct tgccccccac ccaagaagcc ctgccctcca gccacagcag 600 tccacagcag cagggttaag actcagcaca gggccagcag cagcacaacc ttgaccagaa 660 cttgggtcct acctgtctac ctggagtgaa cagtccctga ctgcctgtag gctgcgtgga 720 tgcgcaacac accccctcct tctctgcttt gggtcccttc tctcaccaaa ttcaaactcc 780 attcccacct acctagaaaa tcacagcctc cctataatgc ctcctcctcc tgccattctc 840 tctccaccta tccattagcc ttcctaacgt cctactcctc acactgccct actgctcaga 900 aaccaccaag actgttgatg ccttagcctt gcactccagg gccctacctg catttcccac 960 atgactttct ggaagcctcc caactattcc tgcttctccc agacagctcc cactcccatg 1020 tctctgctca tttagtcccg tcttcctcac cgccccagca ggggaacgct caagcctggt 1080 tgaaatgctg cctcttcagt gaagtcatec tctttcagct ctggccgcat tctgcagact 1140 tcctatcttc gtgctgtatg ttcttttttt cccccttcac tctaatggac tgttccaggg 1200 aagggatggg ggcagcagct gcttcggatc cacactgtat ctgtgtcatc cccacatggg 1260 tcctcataaa ggattattca atggaggcat cctgacatct gtccatttag gcttcagttc 1320 cactcccagg aactttgcct gtcccacgag ggagtatggg 1360 <210> 8 <211> 161 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNÁL <222> (1)..(28) <400> 8

- 38 JUVO1O DO

Met Arg 1

His Asn

Trp Thr Pro Asp Leu Ser Pro Leu Trp Val Leu Leu

5

10

15

Leu

Cys

Ala

His

Val

Val

Thr

Leu

Leu

Val

Arg

Ala

Thr

Pro

Val

Ser

20

25

30

Gin

Thr

Thr

Thr

Ala

Ala

Thr

Ala

Ser

Val

Arg

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro

35

40

45

Cys

Pro

Ser

Gin

Pro

Pro

Val

Phe

Pro

Ala

Ala

Lys

Gin

Cys

Pro

Ala

50

55

60

Leu

Glu

Val

Thr

Trp

Pro

Glu

Val

Glu

Val

Pro

Leu

Asn

Gly

Thr

Leu

65

70

75

80

Ser

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Cys

Ser

Arg

Phe

Pro

Asn

Phe

Ser

Ile

Leu

85

90

95

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Gly

Ser

Phe

Ile

Glu

His

Leu

Pro

Gly

Arg

Leu

100

105

110

Trp

Glu

Gly

Ser

Thr

Ser

Arg

Glu

Arg

Gly

Ser

Thr

Gly

Trp

Ala

Glu

115

120

125

Gly

Asn

Leu

Ala

Pro

His

Pro

Arg

Ser

Pro

Ala

Leu

Gin

Pro

Gin

Gin

130

135

140

Ser

Thr

Ala

Ala

Gly

Leu

Arg

Leu

Ser

Thr

Gly

Pro

Ala

Ala

Ala

Gin

145

150

155

160

Pro <210> 9 <211> 7812 <212>DNA <213> Homo sapiens

-39CZ JtlUUl» Bó <400> 9

gtcgacggca	cccccgggaa	agatttaata	cgactcacta	tagggcggga	. cagaattgat	60
ccgcgagaga	ctcatctagt	tcatacccta	ggtgaccctg	ggggtggcat	gggggtagat	120
tagagatccc	agtctggtat	cctctggaga	gtaggagtcc	caggagctga	aggtttctgg	130
ccactgaact	ttggctaaag	cagaggtgtc	acagctgctc	aagattccct	ggttaaaaag	240
tgaaagtgaa	atagagggtc	ggggcagtgc	tttcccagaa	ggattgctcg	gcatcctgcc	300
cttcccagaa	gcagctctgg	tgctgaagag	agcactgcct	ccctgtgtga	ctgggtgagt	360
ccatattctc	tctttgggtc	tcaattttgc	cttccctaat	gaaggggtaa	gattggacta	420
ggtaagcatc	ttacaaccat	ttgtggtcat	gagagctggg	gtggggaagg	attgtcactt	480
gaccccccca	gctctgtttc	taagtgctga	aagagctcca	ggctatgcta	cgggaggaga	540
agccagccac	tgaggaaaag	ccagctactg	agaaaaagcg	ggagtggttt	accattctcc	600
tcccccacct	*ttcaccagag	aagaggacgt	tgtcacacat	aaagagccag	gctcaccagc	660
tcctgacgca	tgcatcatga	ccatgagaca	caactggaca	ccaggtaggc	cttggggcta	720
cgcatgcgca	ggcggggtag	ggtgaggtct	atgaacagaa	tggagcaatg	ggctaacccg	780
gagccttcac	tccaaggcaa	accacccagc	gcacctggtg	ctgttgcttt	aagaacctgg	840
gcagatattg	tagccccggc	tccagtctaa	agcttctctg	taccctgtcc	aataaagggc	900
taagggocgg	gtgctgaggg	gtccctcttc	ccgctctgat	tccctggcta	gaacccagac	960
atctctgggc	tggagttaca	tccttacccg	ggcagcccac	tctgtctcca	gagccgctga	1020
cctgtaactg	tcctttcctc	agacctcagc	cctttgtggg	tcctgctcct	gtgtgcccac	1080
gtcgccactc	tcctggtcag	agccacacct	gtctcgcaga	ccaccacagc	tgccactgcc	1140
tcagttagaa	gcacaaagga	cccctgcccc	tcccagcccc	cagtgttccc	agcagctaag	1200
cagtgtccag	cattggaagt	gacctggcca	gaggtggaag	tgccactgag	taagaagcac	1260
agtggtggag	ggtgggctat	gggcacagag	gttcccaggg	tcgggttgac	tcctgagcgc	1320
cagtcccctt	ctgcccatgt	accaccagct	gagccagctg	ggctaagcac	gcaccattct	1380
ccctccccaa	cccagtgtca	tgggtgcagg	cttggcgcag	ctcccaagat	gctccctatc	1440
aaacagcaca	gagaactcaa	gacataagta	atggtcacag	gacctcccag	agccttggtt	1500
gcagtggacc	ccaaggccag	cccctccacc	cagagcctgc	tggcctctgg	ccatctcaga	1560
ggagcagcag	ccatccagca	ctgcctctgt	cacctgggct	cccaagtcac	cgaggctggg	1620
caccagaaaa	ggtcaccctg	aggagacagg	ttcagaagag	gattcatcac	gcgaaccaag	1680
gaccatccct	cacactcccc	gcgtttaggg	ctagggcctc	tcggagacaa	ctgcacttct	1740
gtaacggacg	ttcccaccta	ggtggtgtgc	agagcagttc	tctaggttcc	agatgcatgg	1800
ggactggggg	gagctggcag	agagggcaca	gcagagcagg	gcaggggaag	ggcctgccct	1860
tctgaagagc	taactgctgc	ccgtgtccct	agatggaacg	ctgagcttat	cccgtgtggc	1920
ctgcagccgc	ttccccaact	tcagcatcct	ctactggctg	ggcaatggtt	ccttcattga	1980
gcacccccca	ggccgactgt	gggaggggag	caccaggtga	gggtcgcagc	agccaggtgg	2040
g-gggaagga	agccttccgc	ggccttctea	tgacctttcc	ttcccttccg	ctccagccgg	2100
gaacgtggga	gcacaggcac	gcagctgtgc	aaggccttgg	tgctggagca	gctgacccct	2160
gccctgcaca	gcaccaactt	ctcctgtgtg	ctcgtggacc	ctgaacaggt	tgtccagcgt	2220
cacgtcgtcc	tggcccagct	ctgggtgagg	agcccaagga	gaggcctcca	ggaacaggag	2280
gagctczgct	tccatatgtg	gggaggaaag	ggtgggctct	gccagagcag	cctgtgaact	2340
aatacccagc	attcctcaag	gtcagccaga	caaaaaggaa	cttaggtctt	gggcagagga	2400
ggtgtagcct	ggggcaaagt	gatgagatgt	ccctcctttc	cttggcetga	tccttgtctg	2460
ccttcacttc	cctaggctgg	gctgagggca	accttgcccc	ccacccaaga	agccctgccc	2520
tccagccaca	gcagtccaca	gcagcagggt	taagactcag	cacagggcca	gcagcagcac	2580
aaccttgacc	agagcttggg	tcctacctgt	ctacctggag	tgaacagtcc	ctgactgcct	2640
gtaggctgcg	tggatgcgca	acacaccccc	tccttctctg	ctttgggtcc	cttctctcac	2700
caaatccaaa	ctccattccc	acctacctag	aaaatcacag	cctccttata	atgcctcctc	2760
ctcctgccat	tctctctcca	cctatccatt	agccttccta	acgtcctact	cctcacactg	2820
ctctactgct	cagaaaccac	caagactgtt	gatgccttag	ccttgcactc	cagggcccta	2880
cctacatttc	ccacatgact	ttctggaagc	ctcccaacta	ttcttgcttt	tcccagacag	2940
ctcccactcc	eatgtctctg	ctcatttagt	cccgtcttcc	tcaccgcccc	agcaggggaa	3000

-40V.Z, JUUO1O DD

cgctcaagcc	tggttgaaat	gctgcctctt	cagtgaagtc	atectctttc	agctctggcc	3060
gcattctgca	gacttcctat	cttcgtgctg	tatgtttttt	ttttccccct	tcactctaat	3120
ggactgttcc	agggaaggga	tgggggcage	agctgcttcg	gatccacact	gtatctgtgt	3180
catccccaca	tgggtcctca	taaaggatta	ttcaatggag	gcatcctgac	atctgttcat	3240
ttaggcttca	gttccactcc	caggaacttt	gcctgtccca	cgagggagta	tgggagagat	3300
ggaccgccac	acagaagctg	aagacaacac	ctgcttcagg	ggaacacagg	cgcttgaaaa	3360
agaaaagaga	gaacagccca	taatgctccc	cgggagcaga	ggccactaat	ggagagtggg	3420
aagagcctgg	aaagatgtgg	cctcaggaaa	agggatgaga	gaaaggaggt	ggtatggaag	3430
actcagcagg	aacaaggtag	gcttcaaaga	gcctatattc	CtCtttttCC	cacaccgatc	3540
aagccaactc	agtactcacg	ggagaaaaat	agactttatt	tacaagtaat	aacatttaga	3600
aaagatccat	ccccggccct	taaaaacctt	cccatcactc	caaatcccac	cccagtgcaa	3660
gtctggggaa	ggtagggtgt	gagctgctgc	tgaaggctgt	cccccaaccc	cactcctgag	3720
acacagggcc	cacccgtcct	gggaaagagc	atcctctggc	aggtgctccc	accaggtcag	3790
acccagtcct.	ggacttcaag	agtgagggcc	cctgctgggc	ccagccacca	ggacagcagg	3840
aaccagggcc	tactcctctt	atggtccctt	ctagatccag	aggctaagag	gaagactggc	3900
caggcccaag	gacccagcca	tcaaaaccag	cctcaaatct	ggttgtgatg	gagaagtgac	3960
tttgctttaa	gaaaaaagga	ggcaaggtag	ggagagcgcc	cacactgtcc	atgctccagg	4020
ccccctgggc	cagctccgag	aaggcgccag	tgaaggacca	gggaccaggc	cagggtgcgg	4080
gcaggcatca	ctgtctctag	gggtttggcc	actgttggcc	tgggagctga	gagaaggcac	4140
tgagagggac	agtaggcgga	ggaccaggtg	acggcagcat	cggggacaca	ggtggggcca	4200
ctcactggta	ctggcccttt	agtgctttgc	ctgaaagaga	cacagtcaca	tggccagatg	4260
agaacttgcg	atactagcct	gcacccactg	gctgggaaga	tctcttcctg	cccccacgcc	4320
cctgtctgga	tcccctccct	tgtgagcccc	agggttatca	gttgctggct	gtgcctgagc	4380
agctctgggt	gctctccatg	agaatggggc	catctgtctt	ctctccttgg	agaggagcta	4440
ccaggacagg	gacacctctt	accccacacc	ctccagcagc	ctggcgtggc	cccatcttgg	4500
atgctacttg	gtggggcggt	ctggggggtg	cccatgctct	catcgggttt	ccctccccca	4560
tcctgccagt	gcctctacct	tgcccttggc	tcgaggggtg	gcaccaatgg	cggcagcagt	4620
ggcggcgctg	gctgcggtgg	tggcaatgcg	cggagaacgg	cgggttccac	tgcgagtgtt	4680
gggggaagcc	ttggacaggg	ccttctttca	ggctccccgc	cgcagaaggc	tgttccctag	4740
cttcttgggt	gtgttgagga	tgctgaaggc	catcgactgg	cgccggtcag	cctgcaagga	4800
agggctgtca	gaccgggaga	cccaatgctg	ccttcccagg	ccagcgtgct	gtgccacgct	4860
gtaccagcaa	ggtcccgcca	gggcgtcgct	tcatccccct	tcagccccag	cctcacctgt	4920
ttagtagaag	ctggagctgc	cttcttctgg	gcctcagtag	tgctctgttt	gcgcccttca	4980
tgtcggtctc	ggggagtcat	ggggcgtggg	aaacagctgg	tggccttctt	agactatgga	5040
gaagaggaca	gttaggcaga	cagtagcaag	aggagtcaca	tctgaagcca	ggtgtcttgt	5100
cctctcagag	ctgagcggac	cttgtaagtc	aacgtgcaac	ctgctcccct	tcccaactct	5160
gggccagatc	cttcccttcc	caacagttcc	catccatggg	tcaggccctt	ggagagaggg	5220
aaagagaggg	ggaagtgagg	gaaggagaga	gaaggctccc	tttagtcctt	ggtgagctgg	5280
gcctgacctg	agcacagtgc	tggagtaaca	cccaggagcc	accgcgccta	cctcaggagt	5340
tccagggccc	tggtggggct	ctagggagac	ccgtttgcgc	tgctgccggg	tggtgatgcc	5400
agtgccctcg	gctatctgga	ttggctgcat	gctggctcgg	cgcagggtct	cttgggggtc	5460
tccagttttc	atctcctcat	ctgtgatgat	gcccaggctc	agggaaggct	gcatgggtgg	5520
aagaggtggt	cagtggacca	tagctgtatg	gagatggagg	aggacctggg	gctgttccag	5580
aactctacac	tcgcccgaca	cttatggtcg	ggacccttcc	tgcctacgag	gtagsaagac	5640
acaaacctcc	tttcctgttc	tgctttctac	ctaagccctg	ggcaaatggc	acaageagtg	5700
cagtcctgac	cagattcctc	tctgagctcc	tgcctacccc	cagggacttc	acccctgagt	5760
gccctccagc	tgtctgttcc	acctggaaca	tgagaaggtc	accccttccc	ctcttcggcc	5820
agccagtgat	ccagggccct	agtgetcagg	ctagatcagc	aggtgggatt	ccaaggaagg	5880

-41 JUD318 00 gcagggatgg gaggccccgc acagcgaccc caggcctcac cctggactcc agggatagca 5940 ggtcctcaga tgtgggcggc acactcgatt gcgctgctgc agctctgcaa tgcggttcca 6000 gtcatccagc tgctcaggct catcctggca agtgcccacg cagaagctgt tccttcctgt 6060 ggaaggcagg gaagtgggaa caaatgagcc tggagtcggc aggtcacctc ctggccctgg 6120 caccttgcca gcccttgctg ccacctaccc cacaaacttg aagcccggca caccagtctg 6180 atrcagtgcc gcaggtgcag gagtaeggea cacagactat ctctatccca ggggcttgct 6240 caccacctcc tccctggaga gggcagaaga ggtcacacgc agagactgct actacatctt 6300 attcacccgc caaggcttgg tggccaacac ccagaggaac aaattaagga ccgggaatta 6360 attcccaggg gctccctggt gcccaaagga caagagcttc caagaagagt ccggccagcc 6420 tggcctttcc agcageccat caccgcctga gaagggcatg gaggaccccc cacagctaag 6480 tgtcacaatt gtgctgggaa tcccgggccc ttaactctgg ctaagagtgc ccccaacaca 6540 gccagccccc agatgggcag gtaaggaagg ccctgaggct gcaggaagga ggggcaggtg 6600 gagctggatg gcagcaagga ggccagcctt ggatttttaa aaagctttcc tcttttceet 6660 gtgccaegat ccaccttcca gtctaatttt ggggtatagt aagtccctgt agtcccctca 6720 cctggagggg ccccactgga caccccggcc tgggaacgac gagcagaact gcgagtggtg 6780 gggcggtagc caggcaagct gagcagggct gagttgccat aatcgggaga acccaggcga 6840 gctagagact gagtagagga ggtggctcgc aggctagcct gggaagcagg agcagaccgc 6900 gtgctctaga acgatgagtt ggcgctgtct ggctcttcca catctagctt ctggaagaca 6960 gagtgaatct gttgcagtgt acagtccctg gcactgtaca gaagcctccc attcccttcc 7020 gaagccctca gatcccacgg cacatccatq tattcccaac tgctttgcaa aggtccttaa 7080 aatgtgtgtc tgcaagaaat gggccttgtc gacagaagcc ctcacaaggt ggtgctgatg 7140 ttgtcsagac tcttccacgc acttttttca tggagtctat tcataatgct ttgaggtagg 7200 caatgcagag tgtttatcgg cccattttgg agatgaagtg caaagaaaca aagcgactag 7260 ccccaaatca cactgctagg aagtaccaga gctggggcta ggccccatgt ctcctgacca 7320 gtcaggctca tcccacagcc tctgctgtcc ctcagtccaa acttccaggg cccttaccat 7380 gttccagaac ttcccccaac ttcttggtag cagggggcac cctaaacaca caggtccccc 7440 ctgctgtacc aggggccccc tctcccctcc tcccaaacct ccccttcaag atgtggaaac 7500 aaaggcaagg gcctgcagcc tatcaggcag tccactgggc agcaacaatg cctctcagct 7560 gcatggggca tgctgggagg cacaggatgg gctgcagctt cgccacgttc tctcccttca 7620 ccccgcacag gctcagcgct acgcatggag agaatgccag ccttagtcag gaggcaggga 7680 tctaacccta gccccgcctt tctcttcaga agtgccctta accaagtcac tgccettttt 7740 aagacerctc agctttccca ctgtaacatg gactggctgc tcatccctcc ctgctcctga 7300 ctgagtgccc ag 7912 <210> 10 <211> 40 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Thr Pro Val Ser Gin Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ser Val Arg Ser 15 10 15

Thr Lys Asp Pro Cys Pro Ser Gin Pro Prc Val Phe Pro Ala Ala Lys 20 25 30

Gin Cys Pro Ala Leu Glu Val Thr

Claims (25)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. IL—18-vazebný protein, IL—18BP, vybraný ze skupiny sestávající z:

   (a) polypeptidů obsahujících aminokyselinové sekvence ze SEQ ID NO: 2 nebo 6;

   (b) polypeptidů definovaných v (a) bez vedoucí sekvence;

   (c) muteinů s alespoň 80% homologií s IL-18BP jak definováno v (a) nebo (b), fúzovaných proio teinů, chemicky modifikovaných derivátů, cirkulámě permutovaných derivátů a jejich směsí polypeptidů definovaných v (a) nebo (b); a které se vážou k IL-18 a blokují produkci IFN-v indukovanou IL-18.
2. 2. 1L-18BP podle nároku 1, přičemž tento IL-18BP je nevirový protein.
3. 3. IL— 18BP podle nároku 2, přičemž tento IL— 18BP je lidský protein.
4. 4. IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, přičemž jeho molekulová hmotnost je přibližně 40 kDa.
5. 5. IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, přičemž fúzovaný protein obsahuje imunogtobulin nebo jeho fragment.
6. 6. IL-18BP podle nároku 5, kterým je fúzovaný protein zvolený z IL-18BP fúzovaného ke 25 konstantní oblasti těžkého řetězce IgG2.
7. 7. IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, přičemž chemicky modifikované deriváty obsahují postranní řetězce polyethylenglykolu.

   30
8. 8. 1L-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 v solubilní formě.
9. 9. IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, který je glykosylovaný.
10. 10. IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, který je neglykosylovaný.
11. 11. Molekula DNA kódující IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10.
12. 12. Molekula DNA podle nároku 11 opatřená na 3' konci stop kodonem.

    40
13. 13. Molekula DNA obsahující sekvenci DNA v SEQ ID NO: 1 nebo 5, kde tato sekvence DNA kóduje IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10.
14. 14. Molekula DNA podle kteréhokoli z nároků 11 až 13 funkčně připojená k jiným DNA sekvencím umožňujícím expresi, jako promotorům nebo enhancerům.
15. 15. Molekula DNA podle kteréhokoli z nároků 11 až 14, přičemž tato DNA je genomová.
16. 16. Molekula DNA podle kteréhokoli z nároků 11 až 15, kterou je cDNA.

    50
17. 17, Molekula cDNA podle nároku 16 obsahující sekvenci cDNA vybranou ze skupiny DNA sekvencí SEQ ID NO: 1 a 5.
18. 18. Molekula cDNA podle kteréhokoli z nároků 16 a 17, která je přizpůsobena pro expresi v bakteriálním hostiteli.

    -43CZ 300818 B6
19. 19. Repiikovatelný vektor obsahující molekulu DNA podle kteréhokoli z nároků II až 18.
20. 20. Transformovaná hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 19.
21. 21. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 20, přičemž tato buňka je eukaryotická,
22. 22. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 21, přičemž tato buňka je savčí.

    ío
23. 23. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 22, přičemž tato buňka je zvolená z buněk lidských, opicích, myších a buněk vaječníků čínského křečka, CHO.
24. 24. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 20, přičemž tato buňka je prokaryotická.

    15 25. Způsob produkce IL-I8BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, vyznačující se t í m, že zahrnuje pěstování hostitelské buňky podle kteréhokoli z nároků 20 až 24, za podmínek vhodných pro expresi IL-18BP.

    26. Způsob produkce IL-18BP podle nároku25, vy zn ačuj ící se t í m , že dále zahrnuje

    20 izolaci IL-18BP.

    27. Protilátka specificky reagující se sekvencí ukázanou v SEQ ID NO: 2 nebo 6.

    28. Protilátka podle nároku 27, přičemž tato protilátka je polyklonální.

    29. Protilátka podle nároku 27, přičemž tato protilátka je monoklonální.

    30. Protilátka podle nároku 29, přičemž tato protilátka je chimémí.

    30 31. Protilátka podle nároku 30, přičemž tato protilátka je humanizovaná.

    32. Anti-idiotypová protilátka proti protilátce podle nároku 27.

    33. Způsob izolace IL-18BP podle nároku 1,vyznačující se tím, že zahrnuje:

    35 (a) průchod lidské tekutiny chromatografickou kolonou, na které je navázán IL-18, (b) eluci proteinu schopného vazby k IL-18, a (c) purifikací tohoto proteinu.

    34. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje virem kódovaný

    40 homolog IL-18BP, který se váže k IL-18 a blokuje produkci IFN-γ indukovanou IL-18.

    35. Farmaceutický prostředek, vyznač u j í cí se t í m, že obsahuje DNA kódující IL18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo DNA kódující virem kódovaný homolog IL18BP, který se váže k IL-18 a blokuje produkci IFN-γ indukovanou IL-18.

    36. Použití IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologu jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku, pro léčbu autoimunitních onemocnění.

    50 37. Použití IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologu jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu diabetů typu I.

    38. Použití IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologu jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu sepse.

    -44CZ. JUU018 BO

    39. Použití IL—18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologů jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu odmítnutí štěpu.

    5 40. Použití IL—18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologů jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu revmatoidní artritidy.

    41. Použití IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologů ío jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu zánětlivého onemocnění střev.

    42. Použití IL— 18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologů jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu roztroušené skle15 rózy.

    43. Použití IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologů jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu ischemického onemocnění srdce včetně infarktů.

    44. Použití IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologů jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu ischemického poškození mozku.
25. 25 45. Použití IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologů jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu lupénky.

    46. Použití IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologů jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu akutní nebo chro30 nické hepatitídy.

    47. Použití IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaného homologů jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu akutní nebo chronické pankreatitidy.

    48. Použití IL— 18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 pro purifikaci IL-18.

    49. Použití protilátek podle kteréhokoli z nároků 27 až 31 v testu pro detekci IL-18BP.

    40 50. Použití molekuly DNA kódující IL-18BP podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo jeho virem kódovaný homolog jak definován v nároku 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro genovou terapii.