CN101003812B

CN101003812B - 一种用于制备重组人egf-il18融合蛋白的方法

Info

Publication number: CN101003812B
Application number: CN2006100065745A
Authority: CN
Inventors: 吕建新
Original assignee: Wenzhou Medical College
Current assignee: Wenzhou Medical College
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2006-01-17
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2026-01-17
Also published as: CN101003812A

Abstract

本发明涉及一种用于制备重组人EGF-IL18融合蛋白的方法。本发明还涉及包含所述融合基因的表达重组体、包含所述表达重组体的工程菌、由此工程菌表达和分离纯化的靶向融合蛋白-重组人EGF-IL18融合蛋白以及此融合蛋白用于治疗EGFR高表达肿瘤的用途。

Description

一种用于制备重组人EGF-IL18融合蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种用于制备重组人EGF-IL18融合蛋白的方法。本发明还涉及包含所述融合基因的表达型重组体、包含所述表达型重组体的工程菌、由此工程菌表达和分离纯化的靶向融合蛋白-人EGF-IL18以及此融合蛋白用于治疗EGFR高表达肿瘤的用途。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类的常见病。近年，针对某些受体、基因或关键物质的靶向治疗药物成为药物研制的重要方向。这类药物主要靶向作用于相关的肿瘤细胞上，它在提高对肿瘤细胞的杀伤力同时可减少对正常组织细胞的不良作用，被认为是未来癌症治疗中最具前景的研究方向。

白细胞介素18(Interleukin18，IL18)于1996年由Ushio等克隆，其主要生物学活性是诱导T细胞产生IFNγ，促进T细胞和NK细胞增殖活化以及促进Fas配体表达，抑制血管生成等。动物实验表明，IL18具有明显的抗肿瘤作用，这一作用通过诱导小鼠体内的NK细胞和CD4+细胞毒活性而间接发挥。因此，IL18在肿瘤生物治疗方面具有潜在的应用前景。但由于IL-18的效应细胞-H1和NK细胞广泛分布于人体各部位，容易激发炎症反应，产生副作用。因此，需要一种导向序列来加强IL-18对肿瘤细胞的靶向性，即如何使细胞因子在体内定向地作用于肿瘤细胞。另一方面，表皮生长因子受体(EGFR)在很多肿瘤细胞表面特异性高表达，可达正常细胞的100倍，其配体EGF含有三个保守的环状结构，其中第三环是与EGF受体结合的部位，又称为EGF受体干扰序列。

因此，我们构建了人EGF-loop3-IL18(以下简称：重组人EGF-IL18)融合基因，在大肠杆菌中表达重组人EGF-IL18融合蛋白。此融合蛋白能以EGF受体干扰序列作为导向序列，既可增强细胞因子对肿瘤细胞的亲和性，又可干扰EGF对肿瘤细胞的刺激效应，同时又可用来加强IL18的肿瘤细胞靶向性的序列，更大程度上地发挥了IL18的生物学作用。所以本发明内容为治疗EGFR高表达的肿瘤提供了一种低毒高效的靶向性药物。

我们曾利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞株中成功表达重组人EGF-IL18融合基因，得到纯化后的重组人EGF-IL18融合蛋白，并在体外初步评价了此融合蛋白的生物活性(吕建新，彭颖，孟哲峰《突变型人IL-18的肿瘤靶向性改造及真核表达》遗传，2005，27(4))。但是由于当时使用的是杆状病毒表达系统，存在着表达量不高、操作复杂和生产成本高的缺点，因此不可能用于大规模的生产。而在本发明中我们使用经典的原核表达系统-大肠杆菌作为重组人EGF-IL18融合蛋白的表达宿主，可以非常简便，低成本的，快速大规模的发酵生产，讯速得到大量的目的蛋白，为重组人EGF-IL18融合蛋白规模化生产奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有结合EGF受体，并能干扰EGF对肿瘤细胞的刺激效应，同时又具有IL18活性的双功能融合蛋白，为治疗EGFR高表达的肿瘤提供一种新的低毒高效的靶向性药物。

本发明还提供了包含人EGF-IL18融合基因重组体的构建，以及含该基因的表达型重组体的工程菌发酵培养，更重要的是还提供了重组人EGF-IL18融合蛋白的大规模制备、纯化和复性蛋白的技术路线。

本发明的重组人EGF-IL18融合蛋白可在大肠杆菌中发酵生产，通过用离子交换柱上复性并同时纯化和凝胶过滤二步法，可以非常简便，低成本的，快速大规模的得到目的蛋白，为重组人EGF-IL18融合蛋白规模化生产奠定了基础。

本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现：

1、用RT-PCR扩增突变型IL18编码序列

从健康献血者的外周血单个核细胞(PBMC)中提取mRNA，根据发表的hIL-18cDNA序列设计引物，上游引物P1：′GACCTTCCAGATCGCTTCC 3′；下游引物P2：5′GCTAGTCTTCGTTTTGAACAG 3′，经过PCR反应扩增获得突变型IL18基因片段，并将它克隆到pUC-mT载体(记为pUC-mT18)。

2、构建人EGF-IL18融合基因

设计3条引物，即FUS I、FUS II和P182。采用引物搭桥法和两步PCR法构建融合基因，并将人EGF-IL18融合基因与pMD18-T载体连接构建pFUS-EGF-IL18质粒(记为pFUS)。

3、构建包含人EGF-IL18融合基因的重组体

分别设计上下游引物扩增人EGF-IL18融合基因，经双酶切回收产物片段后插入到经同样两个酶酶切的表达载体中。构建包含人EGF-IL18融合基因的重组体经内切酶谱分析和DNA序列分析证实序列正确。

4、重组体转化大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)，用IPTG诱导重组人EGF-IL18融合蛋白表达。融合蛋白以包含体形式存在于工程菌内，表达水平达30～45％。SDS-PAGE、westernblot，IFN-γ诱导实验，A431细胞表面EGFR竞争结合实验等分析表明，表达产物具有诱导人外周血单个核细胞产生IFN-γ的能力，且能与细胞表面的EGFR特异结合。

5、通过发酵技术扩增工程菌，发酵后破碎细菌，离心收集包涵体、经缓冲溶液冼涤后，用尿素溶解包涵体，离子交换柱上复性并同时纯化融合蛋白，分子筛进一步纯化融合蛋白。

附图说明

图1：pET32a(+)-EGF-IL18表达载体的双酶切鉴定，M：1Kb的DNA分子量Marker；1：重组表达载体pET32a(+)-EGF-IL18以Kpn I和Xho I双酶切的图谱；2：重组表达载体pET32a(+)-EGF-IL18酶切前的图谱

图2：大肠杆菌中表达的重组人EGF-IL18融合蛋白的SDS-PAGE，1：工程菌pET32a(+)-EGF-IL18/Rosetta^TM(DE3)在IPTG诱导前的全菌电泳图谱；2：工程菌pET32a(+)-EGF-IL18/Rosetta^TM(DE3)在IPTG 37℃诱导4小时后的全菌电泳图谱；3：工程菌pET32a(+)-EGF-IL18/Rosetta^TM(DE3)在IPTG 37℃诱导4小时后的超声上清电泳图谱；4：工程菌pET32a(+)-EGF-IL18/Rosetta^TM(DE3)在IPTG 37℃诱导4小时后的超声沉淀电泳图谱；M：蛋白分子量Marker。

图3：大肠杆菌中表达的重组人EGF-IL18融合蛋白的免疫印迹分析；1：工程菌pET32a(+)-EGF-IL18/Rosetta^TM(DE3)在IPTG 37℃诱导4小时后的全菌；2：工程菌pET32a(+)-EGF-IL18/Rosetta^TM(DE3)诱导前的全菌；M：蛋白分子量Marker。

图4：重组EGF-IL-18融合蛋白DEAE-52和Sephadex G-75分子筛纯化后SDS-PAGE；1：Sephadex G-75分子筛纯化后电泳图谱；2：包涵体的反复洗涤后电泳图谱；3，4，5：为DEAE-52柱上复性和同时纯化电泳图谱；M：蛋白分子量Marker。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步描述本发明，而非限制本发明。

实施例1：编码重组靶向融合蛋白的基因人EGF-IL18的获得

(1)突变型IL18的获得

健康献血者静脉血5mL，等量生理盐水稀释后，用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集单个核细胞。利用异硫氰酸胍-酚氯仿一步法提取细胞总RNA。RT反应体系20μL，取1μg总RNA为模板，用OligdT作引物，按常规方法进行。根据发表的hIL-18cDNA序列，利用Primer5.0软件设计PCR引物。上游引物P1：5′GACCTTCCAGATCGCTTCC 3′下游引物P2：5′GCTAGTCTTCGTTTTGAACAG 3′其扩增片段包含完整hIL-18cDNA的编码区。PCR反应条件为：95℃5min预变性；80℃2min热启动；94℃1min、57℃1min、72℃1min，共25个循环；72℃10min延伸，反应体系为50μL，各成份按常规配置，使用的扩增酶是高保真Pfu。以1.0％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到635bp左右的DNA片段。RT-PCR产物经冻融法回收纯化后，用T4DNA连接酶与PUCmT载体连接，得到包含突变型IL18的质粒pUC-mT18。

(2)融合基因EGF-IL18的获得

设计了3条引物，即FUS I、FUS II和P182。引物均由上海Sangon公司合成。上游引物FUS I为：

5′GGTGGCGGTGGTTCCGGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGCGGATCTTACTTTGGCAAGC 3′

上游引物FUS II为：

5′ATGCGCTGCTCCCATGGCTACACTGGTATTCGTTGCCAAGCAGTAGTTCTCGGTGGCGGTGGTTCC 3′

下游引物P182为：5′GCTAGTCTTCGTTTTGAACAG 3′。采用两步PCR法构建融合基因。首先以pUC-mT18质粒为模板，以FUS I、P182为引物，按常规方法进行PCR扩增520bp基因序列；然后以该基因序列为模板，以FUS II、P182为引物，用Ex Taq PCR试剂盒再次进行PCR扩增，得到571bp的EGF-IL18融合基因(Genebank登录号：AF454397)。将第二次PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，与pMD18-T载体连接构建pFUS-EGF-IL18质粒。

人EGF-IL18融合基因的DNA序列为：

1 atgcgctgct cccatggcta cactggtatt cgttgccaag cagtagttct cggtggcggt

61 ggttccggcg gtggtggctc tggtggcggc ggatcttact ttggcaagct tgaatctaaa

121 ttatcagtca taagaaattt gaataaccaa gttctcttca ttgaccaagg aaatcggcct

181 ctatttgaag atatgactga ttctgactgt agagataatg caccccggac catatttatt

241 ataagtatgt ataaagatag ccagcctaga ggtatggctg taactatctc tgtgaagtgt

301 gagaaaattt caactctctc ctgtgagaac aaaattattt cctttaagga agtgaatcct

361 cctgataaca tcaaggatac aaagagtgac atcatattct ttcagagaag tgtcccagga

421 catgataata agatgcaatt tgaatcttca tcatacgaag gatactttct aacttgtgaa

481 aaagagagag acctttttaa actcattttg aaaaaagagg atgaattggg ggatagatct

541 ataatgttca ctgttcaaaa cgaagactag c

人EGF-IL18融合基因编码的氨基酸序列为：

1 MRCSHGYTGI RCQAVVLGGG GSGGGGSGGG GSYFGKLESK LSVIRNLNNQ VLFIDQGNRP

61 LFEDMTDSDC RDNAPRTIFI ISMYKDSQPR GMAVTISVKC EKISTLSCEN KIISFKEVNP

121 PDNIKDTKSD IIFFQRSVPG HDNKMQFESS SYEGYFLTCE KERDLFKLIL KKEDELGDRS

181 IMFTVQNED

实施例2：融合基因人EGF-IL18表达型重组体pET32a(+)-EGF-IL18的构建

分别设计上下游引物以扩增EGF-IL-18全长基因：p1：5′atggtacc gacgacgacgacaagcgctgctcccatg 3′；p2：5′cgc ctcgag ctagtcttcg ttttgaa cagtga 3′，引物p1在5′端引入Kpn I酶切位点和肠激酶识别位点，引物p2在3′端引入Xho I酶切位点，以pFUS-EGF-IL18为模板，PCR扩增出EGF-IL18片段，经胶回收后克隆入pMD18-T simple，测序正确后，分别以Kpn I和Xho I双酶切，回收产物片段连接到pET32a(+)，构建为重组表达载体pET32a(+)-EGF-IL18，其酶切图谱(见图1)。

实施例3：重组人EGF-IL18融合蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

将pET32a(+)-EGF-IL18转化Rosetta^TM(DE3)，然后接种于5ml LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素)，37℃振摇培养过夜，按1％接种量重新接种一管5ml同样培养液。在37℃下振摇培养至OD₆₀₀约为0.6时，取出一毫升放入试管1，其余加入终浓度为0.4mmol/L IPTG于37℃诱导4h后，各取出一毫升放入试管2和3，12000g，离心5min后，弃上清，每管加入200μL的20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，混匀。试管3的菌体进行超声破碎(超声时间3秒，间隔时间5秒，功率为400W，共5-10次，视菌体浓度而定)，至菌体清亮为止，然后12000g×5分钟离心收集上清和沉淀，沉淀加入200μL的20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，混匀。以上各管提取的全菌、上清和沉淀，分别加入上样缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，100mmol/L DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，混匀，置于100℃沸水浴保持5min，10000g，离心3min，取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。目的蛋白质表达量通过考马斯亮蓝R-250染色后，扫描后用Bandscand软件计算表达量。重组人EGF-IL18融合蛋白在大肠杆菌中的表达情况，其SDS-PAGE电泳(见图2)。

免疫印迹分析：样品以12％SDS-PAGE进行电泳，然后以380毫安转移30分钟，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，膜以封闭液(PBS，pH 7.5，含5％脱脂奶粉和0.5％Tween-20)于4℃封闭过夜后，加入以封闭液稀释(1∶1000)的鼠抗人IL-18单抗，于室温温育2h，洗膜后加稀释(1∶1000)的HRP-羊抗鼠IgG于室温温育2h，洗去二抗后以ECL发光试剂盒进行显色，X光片曝光后进行显影、定影，其westernblot结果(见图3)。

实施例4：工程菌的发酵试验与重组人EGF-IL18融合蛋白的纯化

(1)发酵试验

工程菌pET32a(+)-EGF-IL18/Rosetta^TM(DE3)接种于5.0ml LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素)，37℃振摇培养过夜，按2％接种量重新接种于同样培养液的500ml三角瓶中，在37℃下振摇培养至OD₆₀₀约为1.0～3.0时，按3～5％接种量再接种于同样培养液的10升发酵罐进行发酵。发酵参数为：温度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝6.86，搅拌速度与D0连动。

(2)包涵体的制备

洗涤细菌：8000g×15分钟离心收集细菌，称重湿菌体。用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)洗涤菌体，搅拌器上搅匀30分钟，8000g，离心15分钟收集菌体。缓冲液用量比例为10ml～50ml缓冲液/g湿菌体。

破碎细菌：以20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0，含1.0mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF及10mmol/L NaCl)重悬菌体，混匀后加入溶菌酶至终浓度为0.2mg/ml，室温搅拌30分钟后加入Triton X-100至终浓度为0.5％，冰浴放置15分钟至溶液变得粘稠。

超声处理：超声破碎菌体(超声时间3秒，间隔时间5秒，功率为400W，共30分钟，视菌体浓度而定)，至菌体不再粘稠为止。然后8000g×15分钟离心收集沉淀。上述操作应在冰水中进行，为防止炭化，超声功率不宜过大，在玻璃烧杯中进行较好，超声波探头深入液面大于3厘米，距杯底2厘米位好。

(3)包涵体的初步纯化

将(2)步骤中的超声沉淀以10倍体积的20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0，含1％Triton X-100、2mol/L尿素和0.5mol/L NaCl)洗涤，室温搅动15min后，2000g，离心10min，沉淀再以相同方法洗涤1次，最后用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗涤1次。

(4)包涵体的溶解：

将(3)步骤中所得沉淀以20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0，含1.0mmol/L PMSF、8mol/L尿素、10mmol/Lβ-巯基乙醇和10mmol/L NaCl)室温搅拌溶解2h，离心收集上清，得到初步纯化的包涵体人EGF-IL-18。

(5)目的蛋白的柱上复性和同时纯化

目的蛋白DEAE-52柱上复性和同时纯化：将初步纯化的包涵体人EGF-IL-18经0.45μm滤器过滤后，样品上经20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0，含8mol/L尿素和10mmol/L NaCl)缓冲液平衡的DEAE-52柱(2.6*60mm)，洗涤5个柱床体积，然后以5个柱床体积的20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.0含8mol/L尿素、10mmol/L NaCl、0.1mmol/L PMSF、1mM GSH、0.2mM GSSH)按线性梯度降低尿素浓度2M(流速0.5mL/min，总体积300mL)使人EGF-IL-18在柱上复性，最后以10mmol/L～1.0mmol/L NaCl线性梯度洗脱已复性的蛋白。分部收集洗脱峰，SDS-PAGE分析复性产物，收集目的蛋白。

Sephadex G-75进一步纯化目的蛋白：将DEAE-52柱上复性纯化所得的目的蛋白上经20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0，含150mmol/L NaCl)缓冲液平衡的Sephadex G-75，分部收集洗脱峰，得到目的蛋白。

重组人EGF-IL18融合蛋白经过包涵体的反复洗涤、DEAE-52柱上复性和同时纯化、Sephadex G-75分子筛三步法纯化，其SDS-PAGE电泳(见图4)。

(6)酶切标签蛋白

将(5)步骤中所得的目的蛋白加入Enterokinase，使之切割硫氧还蛋白和组氨酸标签。酶切产物上样用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0，含150mmol/L NaCl)缓冲液平衡的Sephadex G-75柱，流速0.5mL/min洗脱目的蛋白，分部收集得到有活性的重组人EGF-IL18融合蛋白。

Claims

1.一种用于制备重组人EGF-IL18融合蛋白的方法，其特征在于采用下列步骤：

(1)用PCR扩增EGF第三环片段和IL18成熟肽突变体基因片段，并利用15个接肽GGGGSGGGGSGGGGS的编码基因将其连接成融合蛋白编码基因；

(2)在原核表达载体pET32a中克隆步骤(1)中所述的融合蛋白编码基因；

(3)用重组载体转化大肠杆菌Rosetta^TMDE3；

(4)发酵培养工程菌，制备与纯化融合蛋白，其中所述的纯化重组融合蛋白是工程菌发酵后经离子交换柱上复性并同时纯化、凝胶过滤二步法，其特征为：将初步纯化的重组人EGF-IL18融合蛋白上经20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡的DEAE-52柱，洗涤3-5个柱床体积，所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.0，含8mol/L尿素和10mmol/L NaCl；然后以3-5个柱床体积的20mmol/L Tris-HCl缓冲液按线性梯度降低尿素浓度2M使重组人EGF-IL18融合蛋白在柱上复性，所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.0，含8mol/L尿素、10mmol/L NaCl、0.1mmol/LPMSF、1mM GSH、0.2mM GSSH；最后以NaCl线性梯度洗脱已复性的蛋白，分部收集得到的目的蛋白；进一步将离子交换柱上复性并同时纯化得到的重组人EGF-IL18融合蛋白上样于用20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex G-75柱，所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.0，含150mmol/L NaCl；分部收集得到重组人EGF-IL18融合蛋白；所述的重组人EGF-IL18融合蛋白的氨基酸序列为MRCSHGYTGI RCQAVVLGGG GSGGGGSGGG GSYFGKLESK LSVIRNLNNQ VLFIDQGNRP LFEDMTDSDC RDNAPRTIFI ISMYKDSQPR GMAVTISVKC EKISTLSCEN KIISFKEVNP PDNIKDTKSD IIFFQRSVPG HDNKMQFESS SYEGYFLTCE KERDLFKLIL KKEDELGDRS IMFTVQNED。