DE3587806T2 - Tricyclische Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung. - Google Patents

Tricyclische Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung.

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf neue tricyclische Verbindungen, die pharmakologische Aktivitäten aufweisen, auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung, auf eine sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung sowie auf biologisch reine Kulturen.
  • Sie bezieht sich insbesondere auf neue tricyclische Verbindungen, die pharmakologische Aktivitäten, beispielsweise eine immunsuppressive Aktivität, eine antimikrobielle Aktivität und dgl., aufweisen, auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung, auf eine sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung und ihre Verwendung.
  • In "Canadian Journal of Chemistry" 58, 579 (1980), ist Rapamycin der folgenden Formel
  • beschrieben, das aus Kulturen von Streptomyces hygroscopicus isoliert wurde.
  • Die einzige Brauchbarkeit von Rapamycin ist seine "Antifungi-Antibiotikum" -Aktivität.
  • In "Canadian Journal of Chemistry" 60, 2046 (1982), ist Demethoxyrapamycin der Formel
  • beschrieben, das aus Kulturen von Streptomyces hygroscopicus isoliert wurde.
  • Die einzige Brauchbarkeit dieses Demethoxyrapamycins ist seine "Antifungi-Antibiotikum"-Aktivität.
  • Eine als Ascomyin bezeichnete Antifungi-Substanz ist in US-PS 3 244 592 beschrieben, das durch Kultivieren eines Stammes von Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891) hergestellt wird.
  • Ein Ziel dieser Erfindung ist es daher, neue tricyclische Verbindungen bereitzustellen, die geeignet sind für die Behandlung und Prävention der Resistenz durch Transplantation, der Transplantat-gegen-Wirt (Empfänger)- Erkrankungen durch Knochenmarks-Transplantation, der Autoimmun-Erkrankungen und Infektionserkrankungen.
  • Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung der tricyclischen Verbindungen unter Anwendung von Fermentations- und synthetischen Prozessen zur Verfügung zu stellen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine pharmazeutische Zusammensetzung zu schaffen, die als aktive Bestandteile (Wirkstoffe) die tricyclischen Verbindungen enthält.
  • Ein noch weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, die Verwendung der tricyclischen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung und Prävention der Resistenz durch Transplantation, der Transplantat-gegen-Wirt(Empfänger)-Erkrankungen durch Knochenmarks-Transplantation, von Autoimmun-Erkrankungen, Infektionserkrankungen und dgl. zu schaffen.
  • Bezüglich der vorliegenden Erfindung sei bemerkt, daß sie ausgeht von und basiert auf der ersten und neuen Entdeckung von bestimmten neuen spezifischen Verbindungen, den FR-900506-, FR-900520-, FR-900523- und FR-900525-Substanzen. Im einzelnen wurden die FR-900506-, FR-900520-, FR-900523- und FR-900525-Substanzen zum erstenmal und neu in reiner Form aus Kulturbrühen isoliert, die durch Fermentation von neuen Species, die zum Genus Streptomyces gehören, erhalten wurden.
  • Als Ergebnis umfangreicher Untersuchungen zur Aufklärung der chemischen Strukturen der FR-900506-, FR-900520-, FR-900523- und FR-900525-Substanzen ist es den Erfindern dieser Erfindung gelungen, ihre chemischen Strukturen zu bestimmen und die erfindungsgemäßen tricyclischen Verbindungen herzustellen.
  • Die erfindungsgemäßen neuen tricyclischen Verbindungen können durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden
  • worin bedeuten:
  • R¹ Hydroxy oder in üblicher Weise geschütztes Hydroxy,
  • R² Hydroxy oder in üblicher Weise geschütztes Hydroxy und
  • R³ Methyl, Propyl oder Allyl.
  • R³ in der Verbindung 11 steht vorzugsweise für Allyl. Es ist ferner bevorzugt, daß R¹ steht für Tri(C&sub1;- C&sub6;)alkylsilyloxy, C&sub1;-C&sub6;-Alkyl-diphenylsilyloxy, ein pharmazeutisch akzeptables organisches Carbonsäureacyloxy oder ein pharmazeutisch akzeptables organisches Sulfonsäureacyloxy.
  • Es ist besonders bevorzugt, daß in der Verbindung 11 R¹ steht für Hydroxy; C&sub1;-C&sub6;-Alkylthiomethoxy; Tri(C&sub1;- C&sub6;) alkylsilyloxy; C&sub1;-C&sub6;-Alkyl-diphenylsilyloxy; C&sub1;-C&sub6;- Alkanoyloxy, das Carboxy aufweisen kann; Cyclo(C&sub3;- C&sub6;)alkoxy(C&sub1;-C&sub6;)alkanoyloxy, das zwei C&sub1;-C&sub6;-Alkylgruppen an dem Cycloalkyl-Rest aufweisen kann; Kampfersulfonyloxy; Aroyloxy, das ein oder zwei Nitro aufweisen kann, wobei der Aroylrest ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus Benzoyl, Toluoyl, Xyloyl und Naphthoyl; Arensulfonyloxy, das Halogen aufweisen kann, wobei der Arenrest ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus Benzol, Toluol, Xylol und Naphthalin; oder Phenyl(C&sub1;-C&sub4;)alkanoyloxy, das C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy und Trihalogen(C&sub1;-C&sub6;)alkyl aufweisen kann;
  • und
  • R² steht für Hydroxy oder C&sub1;-C&sub6;-Alkanoyloxy. Gemäß einer Ausführungsform steht R¹ für C&sub1;-C&sub6;-Alkanoyloxy und R² steht für Hydroxy oder C&sub1;-C&sub6;-Alkanoyloxy. Andere beispielhafte Verbindungen sind 12-[2-(4-Acetoxy-3- methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-17-allyl-1,14-dihydroxy-23,25-dime-thoxy- 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0&sup4;&sup9;]-octaco-s-18- en-2,3,10,16-tetraon; 14-Acetoxy-12-[2-(4-acetoxy-3-methoxycyclohexyl)-1- methylvinyl]-17-allyl-1-hydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramet-hyl- 11,28-dioxa-4-azatricyclo-[22.3.1.0&sup4;&sup9;]octacos-18-en -2,3,10,16-tetraon; 1,14-Dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]--23,25- dimethoxy-13,19,17,21,27-pentamethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.-1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon; 16-Allyl-1,13-dihydroxy-11-[2-(4- hydroxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-22,24-dimethoxy-12,18,20-,26- tetramethyl-10,27-dioxa-4-azatricyclo-[21.3.1.04,8]heptacos-17-en-2,-3,9,15- tetraon.
  • Am meisten bevorzugt ist
  • 17-Allyl-1,14-dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3- methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetram-ethyl- 11,28-dioxa-4-azatricyclo-[22.3.1.0&sup4;&sup9;]octacos-18-en-2,3,10,16-tetrao-n.
  • Eine andere Gruppe von Verbindungen sind solche der Formel I, worin stehen R¹ für Hydroxy, C&sub1;-C&sub6;-Alkylthiomethoxy, C&sub1;-C&sub6;-Alkanoyloxy oder Arensulfonyloxy, das Halogen aufweisen kann, wobei der Aren-Rest ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus Benzol, Toluol, Xylol und Naphthalin, R² für Wasserstoff oder Hydroxy, n für die ganze Zahl 2 und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie für eine Doppelbindung stehen.
  • Eine andere Gruppe sind Verbindungen der Formel I, worin R¹ steht für Hydroxy, 1-(C&sub1;-C&sub6;-Alkylthio) (C&sub1;- C&sub6;)alkoxy, Tri(C&sub1;-C&sub6;)alkylsilyloxy, C&sub1;-C&sub6;-Alkyl-diphenylsilyloxy oder Acyloxy.
  • Unter den erfindungsgemäßen Verbindungen (I) können, wie gefunden wurde, die folgenden vier spezifischen Verbindungen durch Fermentation hergestellt werden.
  • 1) Die Verbindung (I), worin R¹ und R² jeweils stehen für Hydroxy, R³ steht für Allyl, n steht für die ganze Zahl 2 und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie steht für eine Einfachbindung, die als FR- 900506-Substanz bezeichnet wird;
  • 2) die Verbindung (I), worin R¹ und R² jeweils stehen für Hydroxy, R³ steht für Ethyl, n steht für die ganze Zahl 2 und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie steht für eine Einfachbindung, die als FR- 900520-Substanz bezeichnet wird (ein anderer Name ist: WS 7238 A-Substanz);
  • 3) die Verbindung (I), worin R¹ und R² jeweils stehen für Hydroxy, R³ steht für Methyl, n steht für die ganze Zahl 2 und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie steht für eine Einfachbindung, die als FR- 900523-Substanz bezeichnet wird (ein anderer Name ist: WS 7238 B-Substanz); und
  • 4) die Verbindung (I), worin R¹ und R² jeweils stehen für Hydroxy, R³ steht für Allyl, n steht für die ganze Zahl 1 und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie steht fuhr eine Einfachbindung, die als FR- 900525-Substanz bezeichnet wird.
  • Bezüglich der erfindungsgemäßen tricyclischen Verbindungen (I) gilt, daß wegen des (der) asymmetrischen Kohlenstoffatoms (Kohlenstoffatome) und der Doppelbindung(en) ein oder mehr Konformere(n) oder Stereoisomeren-Paare, wie z. B. optische und geometrische Isomere, vorliegen können und diese Isomeren liegen ebenfalls innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung der tricyclischen Verbindungen (I) nach den folgenden Verfahren: I Fermentationsverfahren Species, die zum Genus Streptomyces gehören
  • Das Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel (I) umfaßt
  • a) das Kultivieren (Züchten) von Streptomycestsukubaensis in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, und das Abtrennen (Gewinnen) der FR-900506-Substanz und/oder FR-900525-Substanz auf konventionelle Weise unter Bildung der FR-900506-Substanz der Formel
  • und/oder der FR-900525-Substanz der Formel
  • b) das Kultivieren (Züchten) von Streptomyces hygroscopicus in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, und das Abtrennen (Gewinnen) der FR-900523-Substanz der folgenden Formel auf konventionelle Weise II) Synthetische Verfahren 1) Verfahren 1 (Einführung einer üblichen Hydroxyschutzgruppe) Einführung einer üblichen Hydroxyschutzgruppe oder ein Salz davon 2) Verfahren 2 (Einführung einer üblichen Hydroxyschutzgruppe) oder ein Salz davon Einführung einer üblichen Hydroxyschutzgruppe 3) Verfahren 3 (Bildung einer Doppelbindung) oder ein Salz davon 4) Verfahren 4 (Oxidation der Hydroxyethylengruppe) oder ein Salz davon Oxidation der Hydroxyethylengruppe 5) Verfahren 5 (Reduktion einer Allylgruppe) oder ein Salz davon Reduktion
  • worin R¹, R², R³, n und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie jeweils wie oben definiert sind, R¹a und R²a jeweils für in üblicher Weise geschütztes Hydroxy und R²b für eine übliche austretende (abspaltbare) Gruppe stehen.
  • Einzelheiten bezüglich der obengenannten Definitionen und ihre bevorzugten Ausführungsformen werden nachstehend im Detail angegeben.
  • Der hier verwendete Ausdruck "niedrig" steht, wenn nichts anderes angegeben ist, für einen Rest, der 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält.
  • Eine geeignete Hydroxyschutzgruppe in dem "in üblicher Weise geschützten Hydroxy" kann umfassen:
  • 1-(C&sub1;-C&sub6;-Alkylthio)-(C&sub1;-C&sub6;)alkyl, wie C&sub1;-C&sub6;-Alkylthiomethyl (z. B. Methylthiomethyl, Ethylthiomethyl, Propylthiomethyl, Isopropylthiomethyl, Butylthiomethyl, Isobutylthiomethyl und Hexylthiomethyl), wobei der bevorzugte Rest sein kann C&sub1;-C&sub4;-Alkylthiomethyl und der am meisten bevorzugte Rest sein kann Methylthiomethyl;
  • trisubstituiertes Silyl, z. B. Tri(C&sub1;-C&sub6;)alkylsilyl (wie Trimethylsilyl, Triethylsilyl, Tributylsilyl, tert-Butyldimethylsilyl und Tri-tert-butylsilyl) oder C&sub1;-C&sub6;-Alkyldiarylsilyl (wie Methyl-diphenylsilyl, Ethyl-diphenylsi- Iyl, Propyl-diphenylsilyl, tert-Butyl-diphenylsilyl), wobei ein bevorzugter Rest sein kann Tri(C&sub1;-C&sub4;)alkylsilyl und C&sub1;-C&sub4;-Alkyl-diphenylsilyl und der am meisten bevorzugte Rest sein kann tert-Butyl-dimethylsilyl und tert-Butyl-diphenylsilyl.
  • Acyl, z. B. aliphatisches Acyl, aromatisches Acyl und aliphatisches Acyl, das durch eine aromatische Gruppe substituiert ist, die von Carbonsäuren und Sulfonsäuren abgeleitet sind.
  • Das aliphatische Acyl kann umfassen C&sub1;-C&sub6;-Alkanoyl, das einen oder mehr geeignete Substituenten aufweisen kann, z. B. Carboxy (wie Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Isobutyryl, Valeryl, Isovaleryl, Pivaloyl, Hexanoyl, Carboxyacetyl, Carboxypropionyl, Carboxybutyryl und Carboxyhexanoyl), Cyclo(C&sub3;-C&sub6;)alkyloxy(C&sub1;-C&sub6;)alkanoyl, das einen oder mehr geeignete Substituenten aufweisen kann, z. B. C&sub1;-C&sub6;-Alkyl (wie Cyclopropyloxyacetyl, Cyclobutyloxypropionyl, Cycloheptyloxybutyryl, Menthyloxyacetyl, Menthyloxypropionyl, Menthyloxybutyryl, Menthyloxyheptanoyl und Menthyloxyhexanoyl) oder Kampfersulfonyl.
  • Das aromatische Acyl kann umfassen Aroyl, das einen oder mehr geeignete Substituenten aufweisen kann, z. B. Nitro (wie Benzoyl, Toluoyl, Xyloyl, Naphthoyl, Nitrophenyl, Dinitrophenyl und Nitronaphthoyl) oder Arensulfonyl, das einen oder mehr geeignete Substituenten aufweisen kann, z. B. Halogen (wie Benzolsulfonyl, Toluolsulfonyl, Xylolsulfonyl, Naphthalinsulfonyl, Fluorobenzolsulfonyl, Chlorobenzolsulfonyl, Bromobenzolsulfonyl und Jodobenzolsulfonyl).
  • Das aliphatische Acyl, das durch eine aromatische Gruppe substituiert ist, kann umfassen Ar(C&sub1;-C&sub6;)alkanoyl, das einen oder mehr geeignete Substituenten aufweisen kann, z. B. C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy und Trihalogen(C&sub1;-C&sub6;)alkyl (wie Phenylacetyl, Phenylpropionyl, Phenylbutyryl, 2-Trifluoromethyl-2-methoxy-2-phenylacetyl, 2-Ethyl-2-trifluoromethyl-2-phenylacetyl und 2-Trifluoromethyl-2-propoxy-2-phenylacetyl).
  • Die so definierte besonders bevorzugte Acylgruppe kann sein C&sub1;-C&sub4;-Alkanoyl, das Carboxy aufweisen kann, cyclo(C&sub5;-C&sub6;)alkyloxy(C&sub1;-C&sub4;)alkanoyl mit zwei (C&sub1;-C&sub4;)Alkylgruppen an dem Cycloalkylrest, Kampfersulfonyl, Benzoyl, das ein oder zwei Nitro aufweisen kann, Benzolsulfonyl, das Halogen aufweist, Phenyl(C&sub1;-C&sub4;)alkanoyl, das C&sub1;-C&sub4;- Alkoxy und Trihalogen(C&sub1;-C&sub4;)alkyl aufweist, und die am meisten bevorzugte Acylgruppe kann sein Acetyl, Carboxypropionyl, Menthyloxyacetyl, Kampfersulfonyl, Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl, Jodobenzolsulfonyl und 2- Trifluoromethyl-2-methoxy-2-phenylacetyl.
  • Eine geeignete "übliche austretende (abspaltbare) Gruppe" kann umfassen Hydroxy, Acyloxy, worin der Acylrest bin solcher sein kann, wie oben beispielhaft angegeben.
  • Die Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen tricyclischen Verbindungen (I) werden nachstehend im Detail erläutert.
    • I. Fermentationsverfahren
  • Die erfindungsgemäßen FR-900506-, FR-900520-, FR- 900523- und FR-900525-Substanzen können hergestellt werden durch Fermentation der die FR-900506-, FR-900520-, FR- 900523- und/oder FR-900525-Substanzen bildenden Stämme, die zu dem Genus Streptomyces gehören, wie Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 und Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238, in einem Nährmedium.
  • Einzelheiten bezüglich der für die Herstellung der FR-900506-, FR-900520-, FR-900523- und FR-900525-Substanzen verwendeten Mikroorganismen werden nachstehend erläutert.
  • A) Die erfindungsgemäßen FR-900506, FR-900520- und FR- 900525-Substanzen können hergestellt werden durch Fermentation eines die FR-900506, FR-900520- und/oder FR-900525- Substanzen bildenden Stammes, der zu dem Genus Streptomyces gehört, wie z. B. Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993, in einem Nährmedium.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer biologisch reinen Kultur des Mikroorganismus Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993.
    • Der Mikroorganismus
  • Der Mikroorganismus, der zur Herstellung der FR- 900506-, FR-900520- und/oder FR-900525-Substanzen verwendet werden kann, ist der die FR-900506-, FR-900520- und/oder FR-900525-Substanzen bildende Stamm, der zu dem Genus Streptomyces gehört, unter denen Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 kürzlich aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die bei Toyosato-cho, Tsukuba-gun, Ibaraki-Präfektur, Japan, entnommen wurde.
  • Eine lyophilisierte Probe des vor kurzem isolierten Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 wurde bei dem Fermentation Research Insitute, Agency of Industrial Science and Technology (Nr. 1-3, Higashi 1-chome, Yatabemachi Tsukubagun, Ibaraki-Präfektur, Japan) unter der Hinterlegungs-Nr FERM P-7886 hinterlegt (Hinterlegungsdatum: 5. Oktober 1984) und dann in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag der gleichen Hinterlegungsstelle am 19. Oktober 1985 unter der neuen Hinterlegungs-Nr. FERM BP-927 umgewandelt.
  • Der Mikroorganismus Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 hat die folgenden morphologischen, Kultivierungs-, biologischen und physiologischen Eigenschaften.
    • 1) Morphologische Eigenschaften
  • Für diese taxonomische Untersuchung wurden im Prinzip die Verfahren angewendet, wie sie von Shirling und Gottlieb (E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Methods for characterization of Streptomyces species" in "International Journal of Systematic Bacteriology", 16, 313-340, 1966) beschrieben werden.
  • Die morphologischen Beobachtungen wurden mit Licht- und Elektronenmikroskopen bei Kulturen vorgenommen, die 14 Tage lang auf einem Hafermehl-Agar, Hefe-Malzextrakt-Agar und einem anorganische Salze-Stärke-Agar bei 30ºC kultiviert (gezüchtet) wurden. Die reifen Sporophoren bildeten Rectiflexibiles mit 10 bis 50 oder mehr als 50 Sporen in jeder Kette. Bei der Betrachtung im Elektronenmikroskop waren die Sporen länglich oder zylindrisch und hatten eine Größe von 0,5 bis 0,7 · 0,7 bis 0,8 um. Die Sporenoberflächen waren glatt.
    • 2) Kultivierungseigenschaften
  • Die Kultivierungseigenschaften wurden bei 10 Arten von Medien beobachtet, wie sie von Shirling und Gottlieb, wie oben angegeben, und von Waksman ("S.A. Waksman, "The Actinomycetes", Band 2: "Classification, identification and description of genera and species", The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961), beschrieben sind.
  • Die Inkubation wurde 14 Tage lang bei 30ºC durchgeführt. Die in dieser Studie angewendeten Farbnamen basieren auf dem "Guide to Color Standard" (Manual, publiziert von Nippon Shikisai Kenkyusho Tokyo). Die Kolonien gehörten zu der Reihe mit grauer Farbe, wenn sie auf Hafermehl- Agar, Hefe-Malzextrakt-Agar und anorganische Salze-Stärke- Agar gezüchtet wurden. Ein lösliches Pigment wurde in dem Hefe-Malzextrakt-Agar, nicht jedoch in anderen Medien gebildet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben. Tabelle I Kultivierungseigenschaften des Stammes Nr. 9993 und von Streptomyces misakiensis IFO 12891 Medium Kultivierungseigenschaften Hafermehl-Agar mäßig grau-weiß blaßrosa farblos Hefe-Malzextrakt-Agar hellgrau grau-weiß matt-rötlichorange hellbraun anorganische Salze-Stärke-Agar blaß-gelborange bis hellgrau gräulich-weiß dunkelorange blaß-gelblichbraun Medium Glucose-Asparagin-Agar schlecht mäßig weiß gräulich-weiß blaß-braun blaß-gelblichbraun blaßbraun Glycerin-Asparagin-Agar blaß rosa bis weiß Czapek-Agar reichlich (stark) dunkelorange bis dunkelbraun Nährstoff-Agar farblos Medium Kartoffel-Dextrose-Agar schlecht mäßig gelblichgrau blaß-rosa braun Tyrosin-Agar mäßig weiß gräulich-weiß bis hellgrau matt-rötlichorange dunkelorange bis schwarz Peton-Hefeextrakt-Eisen-Agar farblos Abkürzungen: G = Wachstum A = Farbe der Luftmasse R = Farbe der rückseite S = lösliches Pigment
  • Es wurde eine Zellwandanalyse durchgeführt nach den Verfahren von Becker et al (B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon und H.A. Lechevalier: "Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates" in "Appl. Microbiol,", 12, 421- 423, 1964) und Yamaguchi (T. Yamaguchi: "Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct actinomycetesll in "J. Bacteriol.", 89, 444-453, 1965). Die Analyse der Gesamtzellenhydrolysate des Stammes Nr. 9993 zeigte die Anwesenheit der LL-Diaminopimelinsäure an. Es wird daher angenommen, daß die Zellwand dieses Stammes eine solche vom Typ I ist.
    • 3) Biologische und physiologische Eigenschaften
  • Die physiologischen Eigenschaften des Stammes Nr. 9993 wurden nach den Verfahren von Shirling und Gottlieb, wie oben angegeben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angegeben. Der Temperaturbereich und die optimale Temperatur für das Wachstum wurden auf einem Hefe- Malzextrakt-Agar unter Verwendung eines Temperaturgradienten-Inkubators (hergestellt von der Firma Toyo Kagaku Sangyo Co., Ltd.) bestimmt. Der Temperaturbereich für das Wachstum betrug 18 bis 35ºC bei einer optimalen Temperatur von 28ºC. Die Milch-Peptonisierung und die Gelatine-Verflüssigung waren positiv. Die Melanoid-Pigment-Bildung war negativ. Tabelle 2 Physiologische eigenscahften des Stammes Nr. 9993 und von Streptomyces misakiensis IFO 12891 Physiologische Eigenschaften Temperaturbereich für das Wachstum optimale Temperatur Nitrat-Reduktion Negativ Stärke-Hydrolyse Positiv Milch-Koagulation Milch-Peptonisierung schwach Positiv Melanin-Bildung Gelatine-Verflüssigung H&sub2;S-Bildung NaCl-Toleranz (%)
  • Es wurde die Verwertung der Kohlenstoffquellen nach den Verfahren von Pridham band Gottlieb (T.G. Pridham und D. Gottlieb, "The utilization of Carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination" in "J. Bacteriol.", 56, 107-114, 1948) geprüft. Das Wachstum wurde nach 14-tägiger Inkubation bei 30ºC beobachtet.
  • Die zusammengefaßte Kohlenstoffquellen-Verwertung dieses Stammes ist in der Tabelle 3 angegeben. Glycerin, Maltose und Natriumsuccinat konnten von dem Stamm Nr. 9993 verwertet werden. Außerdem wurde auch eine zweifelhafte Verwertung von D-Gluose, Saccharose, D-Mannose und Salicin beobachtet. Tabelle 3 Kohlenstoffquellen-Verwertung durch den Stamm Nr. 9993 und durch Streptomyces misakiensis IFO 12891 Kohlenstoffquellen D-Glucose Saccharose Glycerin D-Xylose D-Fructose Lactose Maltose Rhamnose Raffinose D-Galactose L-Arabinose D-Mannose D-Trehalose Inositol D-Mannitol Inulin Cellulose Salicin Chitin Natriumcitrat Natriumsuccinat Natriumacetat Symbole: +: Verwertung ±: Zweifelhafte Verwertung -: keine Verwertung
  • Die mikroskopischen Untersuchungen und die Analyse der Zellwandzusammensetzung des Stammes Nr. 9993 zeigen an, daß dieser Stamm zum Genus Streptomyces Waksman and Henrici 1943 gehört.
  • Daher wurde ein Vergleich zwischen diesem Stamm und verschiedenen Streptomyces-Species im Lichte der publizierten Beschreibungen durchgeführt ["International Journal of Systematic Bacteriology", 18, 69-189, 279-392 (1968), und 19, 391-512 (1969), und "Bergy's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage (1974)].
  • Als Ergebnis des Vergleichs wird angenommen, daß der Stamm Nr. 9993 Streptomyces aburaviensis Nishimura et al., Streptomyces avelleneus Baldacci und Grein und Streptomy ces misakiensis Nakamura ähnelt. Deshalb wurden die Kultivierungseigenschaften des Stammes Nr. 9993 verglichen mit denjenigen des entsprechenden Streptomyces aburaviensis IFO 12830, Streptomyces avalleneus IFO 13451 und Streptomyces misakiensis IFO 12891. Als Ergebnis wurde gefunden, daß der Stamm Nr. 9993 am meisten dem Streptomyces misakiensis IFO 12891 ähnelte. Deshalb wurde der Stamm Nr. 9993 weiter verglichen mit Streptomyces misakiensis IFO 12891, wie in den obigen Tabellen 1, 2 und 3 angegeben. Aus dem weiteren Vergleich ergibt sich dann, daß der Stamm Nr. 9993 von Streptomyces misakiensis IFO 12891 in den folgenden Punkten differenziert werden konnte und deshalb wird der Stamm Nr. 9993 als neue Species von Streptomyces angesehen und wird bezeichnet als Streptomyces tsukubaensis sp. nov., unter Bezugnahme auf die Bodenprobe, die bei Tsukuba-gun entnommen wurde, aus der der Organismus isoliert wurde.
    • Unterschied zu Streptomyces misakiensis IFO 12891
  • Die Kultivierungseigenschaften des Stammes Nr. 9993 sind verschieden von denjenigen des Streptomyces misakiensis IFO 12891 auf einem Hafermehl-Agar, Hefe-Malzextrakt-Agar, Glucose-Asparagin-Agar, Czapek-Agar und Kartoffel-Dextrose-Agar.
  • Die Stärkehydrolyse des Stammes Nr. 9993 ist negativ, diejenige von Streptomyces misakiensis IFO 12891 ist jedoch positiv.
  • Die Gelatineverflüssigung des Stammes Nr. 9993 ist positiv, diejenige von Streptomyces misakiensis IFO 12891 ist jedoch negativ.
  • In bezug auf die Kohlenstoffquellen-Verwertung kann der Stamm Nr. 9993 Glycerin, Maltose und Natriumsuccinat verwerten, Streptomyces misakiensis IFO 12891 kann sie jedoch nicht verwerten. Außerdem kann der Stamm Nr. 9993 D- Galactose und Inulin nicht verwerten, Streptomyces misakiensis IFO 12891 kann sie jedoch verwerten.
    • Herstellung der FR-900506-, FR-900520- und FR-900525-Substanzen
  • Die erfindungsgeinäßen neuen FR-900506-, FR-900520- und FR-900525-Substanzen können hergestellt werden durch Kultivieren (Züchten) eines die FR-900506-, FR-900520- und/oder FR-900525-Substanzen bildenden Stammes, der zu dem Genus Streptomyces gehört (z. B. Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993, FERM BP-927) in einem Nährmedium.
  • Im allgemeinen können die FR-900506-, FR-900520- und/oder FR-900525-Substanzen gebildet (hergestellt) werden durch Kultivieren (Züchten) des die FR-900506-, FR- 900520- und/oder FR-900525-Substanzen bildenden Stammes in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen (beispielsweise in einer Schüttelkultur, Submerskultur und dgl.).
  • Die bevorzugten Kohlenstoffquellen in dem Nährmedium sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Xylose, Galactose, Glycerin, Stärke, Dextrin und dgl. Andere Quellen, die ebenfalls verwendet werden können, sind Maltose, Rhamnose, Raffinose, Arabinose, Mannose, Salicin, Natriumsuccinat und dgl.
  • Die bevorzugten Stickstoffquellen sind Hefeextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, getrocknete Hefe, Weizenkeim, Federmehl, Erdnußpulver und dgl. sowie anorganische und organische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und dgl.), Harnstoff, Aminosäuren und dgl.
  • Die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die vorteilhaft in Kombination verwendet werden, brauchen nicht in reiner Form verwendet zu werden, da weniger reine Materialien, die Spuren an Wachstumsfaktoren und beträchtliche Mengen an mineralischen Nährstoffen enthalten, ebenfalls für die Verwendung geeignet sind. Gewünschtenfalls können im Medium Mineralsalze, wie Natrium- oder Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- oder Kaliumchlorid, Natrium- oder Kaliumjodid, Magnesiumsalze, Kupfersalze, Kobaltsalze und dgl., zugesetzt werden. Erforderlichenfalls, insbesondere dann, wenn das Kulturmedium stark schäumt, kann ein Entschäumungsmittel, wie flüssiges Paraffin, ein Fettöl, ein Pflanzenöl, ein Minealöl oder Silicon, zugegeben werden.
  • Als Bedingungen für die Bildung der FR-900506-, FR- 900520- und FR-900525-Substanzen in großen Mengen sind aerobe Submers-Kultivierungsbedingungen deshalb bevorzugt. Für die Bildung in kleinen Mengen wird eine Schüttel- oder Oberflächenkultur in einem Kolben oder in einer Flasche angewendet. Außerdem ist es dann, wenn das Züchten in großen Tanks durchgeführt wird, bevorzugt, die vegetative Form des Organismus für die Inokulierung in die Produktionstanks anzuwenden, um eine Wachstumsverzögerung in dem Verfahren zur Herstellung der FR-900506-, FR-900520- und FR-900525-Substanzen zu vermeiden. Es ist daher erwünscht, zuerst ein vegetatives Inokulum des Organismus herzustellen durch Inokulieren einer verhältnismäßig geringen Menge des Kulturmediums mit Sporen oder Mycel des Organismus und Kultivieren dieses inokulierten Mediums und anschließendes aseptisches Übertragen des kultivierten vegetativen Inokulums in große Tanks. Das Medium, in dem das vegetative Inokulum gebildet wird, ist im wesentlichen das gleiche wie oder verschieden von dem Medium, das für die Herstellung der FR-900506-, FR-900520- und FR-900525-Substanzen verwendet wird.
  • Das Rühren (Bewegen) und Belüften der Kulturmischung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Das Rühren (Bewegen) kann erzielt werden mittels eines Propellers oder einer ähnlichen mechanischen Rühreinrichtung, durch Drehen oder Schütteln des Fermenters durch verschiedene Pumpeinrichtungen oder durch Hindurchleiten von steriler Luft durch das Medium. Die Belüftung kann bewirkt werden durch Hindurchleiten von steriler Luft durch die Fermentationsmischung.
  • Die Fermentation wird in der Regel bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 40ºC, vorzugsweise zwischen 25 und 35ºC, für einen Zeitraum von etwa 50 h bis 150 h durchgeführt, die je nach den Fermentationsbedingungen und dem Produktionsmaßstab variiert werden können.
  • Die auf diese Weise gebildeten FR-900506-, FR-900520- und/oder FR-900525-Substanzen können aus dem Kulturmedium abgetrennt (gewonnen) werden unter Anwendung konventioneller Methoden, wie sie üblicherweise für die Gewinnung (Abtrennung) von anderen bekannten biologisch aktiven Substanzen angewendet werden. Die gebildeten FR-900506-, FR- 900520- und FR-900525-Substanzen sind in dem kultivierten Mycel und in dem Filtrat zu finden und daher können die FR-900506-, FR-900520- und FR-900525-Substanzen aus dem Mycel und dem Filtrat isoliert und gereinigt werden, die erhalten werden durch Filtrieren oder Zentrifugieren der Kulturbrühe unter Anwendung einer konventionellen Methode, beispielsweise durch Einengung unter vermindertem Druck, durch Lyophilisierung, Extraktion mit einem konventionellen Lösungsmittel, pH-Werteinstellung, Behandlung mit einem konventionellen Harz (beispielsweise einem Anionen- oder Kationenaustauscherharz, einem nicht-ionischen Adsorptionsharz und dgl.), durch Behandlung mit einem konventionellen Adsorbens (beispielsweise mit Aktivkohle, Kieselsäure, Silicagel, Cellulose, Aluminiumoxid und dgl.), durch Kristallisation, Umkristallisation und dgl.
    • Physiologische und chemische Eigenschaften der FR-900506- FR-900520- und FR-900525-Substanzen
  • Die nach dem obengenannten Verfahren hergestellten FR-900506-, FR-900520- und FR-900525-Substanzen weisen die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften auf.
    • FR-900506-Substanz
  • 1) Form und Farbe:
  • weißes Pulver
  • 2) Elementaranalyse:
  • C: 64.72%, H: 8.78%, N: 1.59%
  • 64.59% 8.74% 1.62%
  • 3) Farbreaktion:
  • positiv: Cersulfat-Reaktion, Schwefelsäure-Reaktion, Ehrlich-Reaktion, Dragendorff-Reaktion und Joddampf-Reaktion
  • negativ: Eisen(III)chlorid-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion und Molish-Reaktion.
  • 4) Löslichkeit:
  • löslich in: Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform, Diethyläther und Benzol
  • kaum löslich in: Hexan, Petroläther
  • unlöslich in: Wasser
  • 5) Schmelzpunkt
  • 85-90ºC
  • 6) spezifische Drehung:
  • [α]23D : -73º (c = 0.8, CHCl&sub3;)
  • 7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
  • Endabsorption
  • 8) Infrarot-Absorptionsspektrum:
  • : 3680, 3580, 3520, 2930, 2870, 2830, 1745, 1720, 1700, 1645, 1450, 1380, 1350, 1330, 1310, 1285, 1170, 1135, 1090, 1050, 1030, 1000, 990, 960(sh), 918 cm&supmin;¹
  • 9) ¹³C-kernmagnetisches Resonanzspektrum
  • dessen Diagramm in der Fig. 1 dargestellt ist;
  • 10) ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum
  • dessen Diagramm in der Fig. 2 dargestellt ist;
  • 11) Dünnschicht-Chromatographie: stationäre Phase Entwicklungs-Lösungsmittel Rf-Werte Silicagel-Platte Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis 10 : 1) Ethylacetat
  • 12) Eigenschaften der Substanz:
  • neutrale Substanz
  • Im Hinblick auf die FR-900506-Substanz sei bemerkt, daß im Falle der Bestimmungen der ¹³C- und ¹H-kernmagnetischen Resonanzspektren diese Substanz Signal-Paare bei verschiedenen chemischen Verschiebungen aufwies.
  • Die so charakterisierte FR-900506-Substanz hat ferner die folgenden Eigenschaften:
  • i) Die Messung der ¹³C-kernmagnetischen Resonanzspektren bei 25ºC und 60ºC zeigte, daß sich die Intensitäten jedes Paares der verschiedenen Signale darin geändert hatten.
  • ii) Die Messungen der Dünnschichtchromatographie und der Hochleistungs-Flüssigchromatographie zeigten, daß die FR- 900506-Substanz als einzelner Fleck in der Dünnschicht- Chromatographie bzw. als einzelner Peak in der Hochleistungs-Flüssigchromatographie auftritt.
  • Dieses weiße Pulver aus der FR-900506-Substanz konnte durch Umkristallisation aus Acetonitril in Kristalle überführt werden, welche die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften haben:
  • 1) Form und Farbe:
  • farblose Prismen
  • 2) Elementaranalyse:
  • C: 64.30%, H: 8.92%, N: 1.77% 64.20%, 8.86%, 1.72%,
  • 3) Schmelzpunkt:
  • 127-129ºC
  • 4) Spezifische Drehung:
  • [α]23D : -84.4º (c = 1.02, CHCl&sub3;)
  • 5) ¹³C-kernmagnetisches Resonanzspektrum:
  • dessen Diagramm in der Fig. 3 dargestellt ist,
  • 6) ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum:
  • dessen Diagramm in der Fig. 4 dargestellt ist.
  • Die übrigen physikalischen und chemischen Eigenschaften, d. h. die Farbreaktion, die Löslichkeit, das Ultraviolett-Absorptionsspektrum, das Infrarot-Absorptionsspektrum, die Dünnschichtchromatographie und die Substanzeigenschaften der farblosen Prismen aus der FR-900506-Substanz waren die gleichen wie diejenigen für das weiße Pulver aus der gleichen Substanz unter identischen Bedingungen.
  • Aus den obengenannten physikalischen und chemischen Eigenschaften und der Analyse der Röntgenstrahlbeugung konnte ermittelt werden, daß die FR-900506-Substanz die folgende chemische Struktur hat:
  • 17-Allyl-1,14-dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3- methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25- dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa- 4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en- 2,3,10,16-tetraon
    • FR-900520-Substanz
  • Die physikalischen und chemischen Eigenschaften sind nachstehend angegeben.
    • FR-900525-Substanz
  • 1) Form und Farbe:
  • weißes Pulver
  • 2) Elementaranalyse:
  • C: 65.17%, H: 8.53%, N: 1.76%
  • 3) Farbreaktion:
  • positiv: Cersulfat-Reaktion, Schwefelsäure-Reaktion, Ehrlich-Reaktion, Dragendorff-Reaktion und Joddampf-Reaktion
  • negativ: Eisen(III)chlorid-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion und Molish-Reaktion
  • 4) Löslichkeit:
  • löslich in: Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform, Diethyläther und Benzol
  • kaum löslich in: Hexan, Petroläther
  • unlöslich in: Wasser
  • 5) Schmelzpunkt:
  • 85-89ºC
  • 6) Spezifische Drehung:
  • [α]23D : -88º (c = 1.0, CHCl&sub3;)
  • 7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
  • End-Abjsorption
  • 8) Infrarot-Absorptionsspektrum:
  • : 3680, 3580, 3475, 3340, 2940, 2880, 2830, 1755, 1705, 1635, 1455, 1382, 1370, 1330, 1310, 1273, 1170, 1135, 1093, 1050, 1020, 995, 970, 920, 867 cm&supmin;¹
  • 9) ¹³C-kernmagnetisches Resonanzspektrum:
  • dessen Diagramm in der Fig. 5 dargestellt ist,
  • 10) ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum:
  • dessen Diagramm in der Fig. 6 dargestellt ist,
  • 11) Dünnschichtchromatographie: stationäre Phase Entwicklungs-Lösungsmittel Rf-Werte Silicagel-Platte Ethylacetat
  • 12) Eigenschaften der Substanz:
  • neutrale Substanz
  • Bezüglich der FR-900525-Substanz sei bemerkt, daß im Falle der Messung der ¹³C- und ¹H-kernmagnetischen Resonanzspektren diese Substanz Signal-Paare bei verschiedenen chemischen Verschiebungen aufwies, daß jedoch im Falle der Messung der Dünnschichtchromatographie und der Hochleistungs-Flüssigchromatographie die FR-900525-Substanz einen einzelnen Fleck bei der Dünnschichtchromatographie bzw.
  • einen einzelnen Peak bei der Hochleistungs-Flüssigchromatographie aufwies.
  • Aus den obengenannten physikalischen und chemischen Eigenschaften und aus der erfolgreichen Bestimmung der chemischen Struktur der FR-900506-Substanz konnte ermittelt werden, daß die FR-900525-Substanz die folgende chemische Struktur hat:
  • 16-Allyl-1,13-dihydroxy-11-[2-(4-hydroxy-3- methoxycyclohexyl)-1-methylvinyll-22,24-dimethoxy- 12,18,20,26-tetramethyl-10,27-dioxa-4-azatricyclo- [21.3.1.04,8]heptacos-17-en-2,3,9,15-tetraon
  • B) Die erfindungsgemäßen FR-900520- und FR-900523-Substanzen können hergestellt werden durch Fermentation des die FR-900520- und/oder FR-900523-Substanzen bildenden Stammes, der zu dem Genus Streptomyces gehört, wie z. B. Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238 in einem Nährmedium.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238 zur Verfügung zu stellen.
    • Der Mikroorganismus
  • Der Mikroorganismus, der zur Herstellung (Bildung) der FR-900520- und/oder FR-900523-Substanzen verwendet werden kann, ist der die FR-900520- und/oder FR-900523- Substanzen bildende Stamm, der zum Genus Streptomyces gehört, unter denen der Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensjs Nr. 7238 kürzlich aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die bei Yakushima in der Kagoshima-Präfektur, Japan, gesammelt wurde.
  • Eine lyophilisierte Probe des vor kurzem isolierten Streptomyces hygroscopjcus subsp. yakushimaensis Nr. 7238 wurde bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Nr.1-3, Higashi 1- chome, Yatabemachi, Tsukuba-gun- Ibaraki-Präfektur, Japan) unter der Nr. FERM P-8043 hinterlegt (Hinterlegungsdatum: 12. Januar 1985) und dann in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag umgewandelt bei der gleichen Hinterlegungsstelle am 19. Oktober 1985 unter der neuen Hinterlegungsnummer FERM BP-928.
  • Es ist klar, daß die Herstellung der neuen FR-900520- und FR-900523-Substanzen nicht beschränkt ist auf die Verwendung des hier beschriebenen speziellen Organismus, der nur zu Erläuterungszwecken angegeben ist. Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung beliebiger Mutanten, die in der Lage sind, die FR-900520- und/oder FR-900523-Substanzen zu bilden einschließlich der natürlichen Mutanten sowie der künstlichen Mutanten, die aus dem beschriebenen Organismus auf konventionelle Weise hergestellt werden können, beispielsweise durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, durch Ultraviolett-Bestrahlung, durch Behandlung mit N-Methyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidin, 2-Aminopurin und dgl.
  • Der Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238 hat die folgenden morphologischen, Kultivierungs-, biologischen und physiologischen Eigenchaften.
    • 1) Morphologische Eigenschaften
  • Für die taxonomische Untersuchung wurden im Prinzip die von Shirling und Gottlieb beschriebenen Verfahren angewendet (E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Methods for characterization of Streptomyces species" in "International Journal of Systematic Baceteriology", 16, 313-340, 1966).
  • Morphologische Beobachtungen wurden mit Licht- und Elektronenmikroskopen durchgeführt bei Kulturen, die 14 Tage lang bei 30ºC gezüchtet worden waren auf Hafermehl- Agar, Hefe-Malzextrakt-Agar und anorganische Salze-Stärke- Agar. Die reifen Sporophoren waren mäßig kurz und bildeten Retinaculiaperti und Spiralen mit etwa 20 Sporen in jeder Kette. Eine hygroskopische Sporenmasse war in den Luftmycelen auf Hafermehl-Agar und einem anorganischen Salze- Stärke-Agar zu erkennen. Die Oberflächen-Unregelmäßigkeiten auf den Sporen waren Mittelwerte zwischen sehr kurzen dicken Spines (Graten) und Warzen.
    • 2) Kultivierungseigenschaften
  • Die Kultivierungseigenschaften wurden beobachtet bei 10 Arten von Medien, wie sie beschrieben werden von Shirling und Gottlieb, wie oben angegeben, und von Waksman (S.A. Waksman, "The Actinomycetes", Band 2; "Classification, identification and description of genera and species", The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961).
  • Die Inkubation wurde 14 Tage lang bei 30ºC durchgeführt. Die bei dieser Untersuchung verwendeten Farbnamen basieren auf dem Guide to Color Standard" (Manual, publiziert von Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokyo). Die Kolonien gehörten zu den grau gefärbten Reihen, wenn sie auf Hafermehl-Agar, Hefe-Malzextrakt-Agar und anorganische Salze- Stärke-Agar gezüchtet wurden. In den untersuchten Medien wurde kein lösliches Pigment gebildet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Kultivierungseigenscahften des Stammes Nr. 7238, von Streptomyces antimycoticus IFO 12839 und Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 Medium Kultivierungseigenschaften Hafermehl-Agar schlecht gräulich-gelbbraun blaßgelb Hefe-Malzextrakt-Agar mäßig reich (stark) gräulich-weiß grau blaß-gelblichbraun dunkelorange Anorganische Salze-Stärke-Agar grau bis schwarz hellgrau blaß-gelborange gelblich-grau blaß-gelborange Medium Glucose-Asparagin-Agar mäßig gräulich-weiß grau weiß blaß-gelborange Glycerin-Asparagin-Agar hellgrau gelblich-grau gräulich-gelbbraun Czapek-Agar gräulich-weiß blaß-gelblichbraun Nährstoff-Agar blaßgelb Medium Kartoffel-Dextrose-Agar mäßig weiß, schlecht blaß-rötlich-braun blaß-rosa bis weiß blaß-gelborange blaß-gelblichbraun Tyrosin-Agar weiß gräulich-weiß grau bis schwarz blaß-gelblichbraun braun Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar blaßgelb Abkürzungen: G = Wachstum R = Farbe der Rückseite A = Farbe der Luftmasse S = lösliches Pigment
  • Die Analyse der Zellwand wurde durchgeführt unter Anwendung der Verfahren von Becker et al. (B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon und H.A. Lechevalier: "Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates" in "Appl. Microbiol.", 12, 421-423, 1964) und Yamaguchi (T. Yamaguchi, "Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct actinomycetes" in "J. Bacteriol.", 89 444-453, 1965). Die Analyse der Gesamtzellen-Hydrolysate des Stammes Nr. 7238 zeigte die Anwesenheit von LL-Diaminopimelinsäure. Die Zellwand dieses Stammes ist daher, wie angenommen wird, eine solche vom Typ I.
    • 3) Bioloische und physiologische Eigenschaften
  • Die physiologischen Eigenschaften des Stammes Nr. 7238 wurden bestimmt nach den Verfahren, wie sie von Shirling und Gottlieb, wie oben angegeben, beschrieben sind. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 angegeben. Der Temperaturbereich und die optimale Temperatur für das Wachstum wurden bestimmt auf einem Hefe-Malzextrakt-Agar unter Verwendung eines Temperaturgradienten-Inkubators (hergestellt von der Firma Toyo Kagaku Sangyo Co., Ltd.). Der Temperaturbereich für das Wachstum betrug 18 bis 36ºC bei einer optimalen Temperatur von 28ºC. Die Stärke-Hydrolyse und die Gelatine-Verflüssigung waren positiv. Es wurde kein Melanoid-Pigment gebildet. Tabelle 5 Physiologische Eigenschaften des Stammes Nr. 7238, von Streptomyces antimycoticus IFO 12839 und Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 Physiologische Eigenschaften Temperaturbereich für das Wachstum optimale Temperatur Nitrat-Reduktion Negativ Stärke-Hydrolyse Positiv Milch-Koagulation Milch-Peptonisierung Melanin-Bildung Gelatine-Verflüssigung H&sub2;S-Bildung Urease-Aktivität NaCl-Toleranz (%)
  • Es wurde die Verwertung von Kohlenstoffquellen untersucht nach dem Verfahren von Pridham und Gottlieb (T.G. Pridham und D. Gottlieb, "The utilization of carbon compounds by some Actinoilqcetales as an aid for species determination" in "J. Bacteriol.", 56, 107-114, 1948). Das Wachstum wurde nach 14-tägiger Inkubation bei 30ºC beobachtet.
  • Die zusammengefaßte Verwertung der Kohlenstoffquellen dieses Stammes ist in der Tabelle 6 angegeben. D-Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, D-Trehalose, Inosit, Inulin und Salicin konnten durch den Stamm Nr. 7238 verwertet werden. Tabelle 6 Kohlenstoffquellen-Verwertung des Stammes Nr. 7238, von Streptomyces antimycoticus IFO 12839 und Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 Kohlenstoffquellen D-Glucose Saccharose Glycerin D-Xylose D-Fructose Lactose Maltose Rhamnose Raffinose D-Galactose L-Arabinose D-Mannose D-Trehalose Inositol D-Mannitol Inulin Cellulose Salicin Chitin Natriumcitrat Natriumsuccinat Natriumacetat Symbole: +: Verwertung ±: zweifelhafte Verwertung -: keine Verwertung
  • Die mikroskopischen Untersuchungen und die Analyse der Zellwandzusammensetzung des Stammes Nr. 7238 zeigen an, daß dieser Stamm zum Genus Streptomyces Waksman and Henrici 1943 gehört.
  • Es wurde daher ein Vergleich zwischen diesem Stamm und verschiedenen Streptomyces-Species im Lichte der publizierten Beschreibungen vorgenommen ("International Journal of Systematic Bacteriology", 18, 69-189, 279-392 (1968), und 19, 391-512 (1969) und "Bergy's Manual of Determinative Bacteriologyll, 8. Auflage (1974)).
  • Als Ergebnis des Vergleichs wurde gefunden, daß der Stamm Nr. 7238 angesehen wird als ähnlich dem Streptomyces antimycoticus Waksman 1957 und Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus Ohmori et al. 1962. Deshalb wurden die Kultivierungseigenschaften des Stammes Nr. 7238 weiter verglichen mit den entsprechenden Mikroorganismen Streptomyces antimycoticus IFO 12839 und Streptomyces hygroscopicus subsp. clebosus IFO 13786, wie in den Tabellen 4, 5 und 6 angegeben. Aufgrund des weiteren Vergleichs konnte der Stamm Nr. 7238 in den folgenden Punkten differenziert werden von Streptomyces antimycoticus IFO 12839 und Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786.
    • i) Differenzierung von Streptomyces antimycoticus IFO 12839
  • Die Kultivierungseigenschaften des Stammes Nr. 7238 sind verschieden von Streptomyces antimycoticus IFO 12839 auf einem Hefe-Malzextrakt-Agar, Glucose-Asparagin-Agar, Glycerin-Asparagin-Agar, Kartoffel-Dextrose-Agar und Tyrosin-Agar.
  • Bezüglich der Kohlenstoffquellen-Verwertung kann der Stamm Nr. 7238 Maltose verwerten, Streptomyces antimycoticus IFO 12839 kann es jedoch nicht verwerten. Außerdem kann der Stamm Nr. 7238 Glycerin, D-Fructose, Rhamnose, Raffinose, D-Galactose, D-Mannose, Mannit und Natriumsuccinat nicht verwerten, Streptomyces antimycoticus IFO 12839 kann sie jedoch verwerten.
    • ii) Unterschied gegenüber Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786
  • Die Kultivierungseigenschaften des Stammes Nr. 7238 sind verschieden von dem Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 auf einem Hefe-Malzextrakt-Agar, Kartoffel-Dextrose-Agar und Thyrosin-Agar.
  • Die Milch-Peptonisierung des Stammes Nr. 7238 ist negativ, diejenige des Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 ist jedoch positiv. Der Stamm Nr. 7238 kann in Gegenwart von 7% NaCl wachsen, Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 kann jedoch unter den gleichen Bedingungen nicht wachsen.
  • In bezug auf die Kohlenstoffquellen-Verwertung kann der Stamm Nr. 7238 Lactose, Inulin und Salicin verwerten, Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 kann sie jedoch nicht verwerten. Der Stamm Nr. 7238 kann Glycerin, D-Xylose, D-Fructose, Raffinose, D-Galactose, D-Mannose, Mannit und Natriumsuccinat nicht verwerten, Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 kann sie jedoch verwerten.
  • Der Stamm Nr. 7238 bildet eine hygroskopische Sporenmasse in den Luftmycelen auf Hafermehl-Agar und anorganische Salze-Stärke-Agar und die weiteren morphologischen und Kultivierungseigenschaften des Stammes Nr. 7238 sind ähnlich denjenigen von Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786. Deshalb wird angenommen, daß der Stamm Nr. 7238 zu Streptomyces hygroscopicus gehört, der Stamm Nr. 7238 ist jedoch verschieden von Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786, obgleich dieser bekannte Stamm derjenige ist, der dem Stamm Nr. 7238 bei den Strep- Lomyces hygroscopicus subspecies am ähnlichsten ist. Aufkund der obengenannten Fakten wird angenommen, daß der Stamm Nr. 7238 eine neue Species von Streptomyces hygrosopicus ist und er wurde als Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis subsp. nov. bezeichnet, unter Bezugnahme auf die bei Yakushima entnommene Bodenprobe, aus welcher der Organismus isoliert wurde.
    • Herstellung der FR-900520- und FR-900523-Substanzen
  • Die neuen FR-900520- und/oder FR-900523-Substanzen können hergestellt werden durch Kultivieren (Züchten) des die FR-900520- und/oder FR-900523-Substanzen bildenden Stammes, der zu dem Genus Streptomyces gehört (wie z. B. Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238, FERM BP-928) in einem Nährmedium.
  • Im allgemeinen können die FR-900520- und/oder FR- 90052 3-Substanzen hergestellt werden durch Kultivieren (Züchten) des die FR-900520- und/oder FR-900523-Substanzen bildenden Stammes in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen (beispielsweise in einer Schüttelkultur, Submerskultur und dgl.).
  • Die bevorzugten Kohlenstoffquellen in dem Nährmedium sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Glycerin, Stärke, Dextrin und dgl. Andere Quellen, die verwendet werden können, sind Maltose, D-Trehalose, Inosit, Inulin, Salicin und dgl.
  • Die bevorzugten Stickstoff-Quellen sind Hefeextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, getrocknete Hefe, Weizenkeim, Federmehl, Erdnußpulver und dgl. sowie anorganische und organische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und dgl.), Harnstoff, Aminosäure und dgl.
  • Die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die zweckmäßig in Kombination verwendet werden, brauchen nicht in ihrer reinen Form verwendet zu werden, weil auch weniger reine Materialien, die Spuren an Wachstumsfaktoren und beträchtliche Menge an mineralischen Nährstoffen enthalten, für die Verwendung geeignet sind. Gewünschtenfalls können dem Medium Mineralsalze, wie Natrium- oder Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- oder Kaliumchlorid, Natrium- oder Kaliumjodid, Magnesiumsalze, Kupfersalze, Kobaltsalze und dgl. zugegeben werden. Erforderlichenfalls kann, insbesondere wenn das Kulturmedium stark schäumt, ein Entschäumungsmittel, wie flüssiges Paraffin, ein Fettöl, ein Pflanzenöl, ein Mineralöl oder Silicon, zugegeben werden.
  • Als Bedingungen für die Bildung (Herstellung) der FR- 900520- und FR-900523-Substanzen in großen Mengen sind die aeroben Submers-Kultivierungsbedingungen bevorzugt. Für die Bildung in kleinen Mengen wird eine Schüttel- oder Oberflächenkultur in einem Kolben oder in einer Flasche verwendet. Außerdem ist es bevorzugt, wenn das Wachstum in großen Tanks durchgeführt wird, die vegetative Form des Organismus für die Inokulierung in die Produktionstanks zu verwenden, um eine Wachstumsverzögerung in dem Verfahren zur Herstellung der FR-900520- und FR-900523-Substanzen zu vermeiden. Es ist daher erwünscht, zuerst ein vegetatives Inokulum des Organismus herzustellen durch Inokulieren einer verhältnismäßig geringen Menge des Kulturmediums mit Sporen oder Mycelen des Organismus und Kultivieren dieses inokulierten Mediums und anschließend das kultivierte vegetative Inokulum aseptisch in große Tanks zu überführen. Das Medium, in dem das vegetative Inokulum gebildet wird, ist im wesentlichen das gleiche wie oder verschieden von dem Medium, das für die Herstellung der FR-900520- und FR- 900523-Substanzen verwendet wird.
  • Das Rühren (Bewegen) und Belüften der Kulturmischung kann auf die verschiedenste Weise erfolgen. Das Rühren (Bewegen) kann mittels eines Propellers oder mittels einer ähnlichen mechanischen Rührvorrichtung durchgeführt werden, durch Drehen oder Schütteln des Fermenters, unter Anwendung verschiedener Pumpeinrichtungen oder durch Hindurchleiten von steriler Luft durch das Medium. Das Belüften kann bewirkt werden durch Hindurchleiten von steriler Luft durch die Fermentationsmischung.
  • Die Fermentation wird in der Regel bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 40ºC, vorzugsweise 25 bis 35ºC, für eine Zeitspanne von etwa 50 bis 150 h durchgeführt, die je nach Fermentationsbedingungen und Produktionsmaßstab variiert werden können.
  • Die so hergestellten FR-900520- und/oder FR-900523- Substanzen können aus dem Kulturmedium abgetrennt werden unter Anwendung konventioneller Methoden, wie sie üblicherweise für die Abtrennung anderer bekannter biologisch aktiver Substanzen angewendet werden. Die gebildeten FR- 900520- und FR-900523-Substanzen sind hauptsächlich in dem kultivierten Mycel zu finden und daher können die FR- 900520- und FR-900523-Substanzen aus dem Mycel isoliert und gereinigt werden, das durch Filtrieren oder Zentrifugieren der Kulturbrühe erhalten wird, unter Anwendung einer konventionellen Methode, beispielsweise durch Einengen unter vermindertem Druck, durch Lyophilisieren, durch Extraktion mit einem konventionellen Lösungsmittel, durch pH-Werteinstellung, durch Behandlung mit einem konventionellen Harz (beispielsweise einem Anionen- oder Kationenaustauscherharz, einem nicht-ionischen Adsorptionsharz und dgl.), durch Behandlung mit einem konventionellen Adsorbens (z. B. mit Aktivkohle, Kieselsäure, Silicagel, Cellulose, Aluminiumoxid und dgl.), durch Kristallisation, Umkristallisation und dgl.
  • Insbesondere können die FR-900520-Substanz und die FR-900523-Substanz abgetrennt werden durch Auflösen der Materialien, die beide Produkte enthalten, die durch Fermentation in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. in Ethylacetat, n-Hexan und dgl., gebildet werden und anschließende Durchführung einer Chromatographie mit der genannten Lösung, beispielsweise an Silicagel in einer Säule mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat und n-Hexan oder einer Mischung davon. Die jeweils so abgetrennte FR-900520-Substanz und FR-900523-Substanz kann nach einer konventionellen Methode weiter gereinigt werden, beispielsweise durch Umkristallisation, erneute Chromatographie, Hochleistungs-Flüssigchromatographie und dgl.
    • Physiologische und chemische Eigenschaften der FR-900520- und FR-900523-Substanzen FR-900520-Substanz
  • 1) Form und Farbe:
  • farblose Platten
  • 2) Elementaranalyse:
  • C: 64.81%, H: 8.82%, N: 1.55%
  • 3) Farbreaktion:
  • positiv: Cersulfat-Reaktion, Schwefelsäure-Reaktion, Ehrlich-Reaktion, Dragendorff-Reaktion und Joddampf-Reaktion
  • negativ: Eisen(III)chlorid-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion und Molish-Reaktion.
  • 4) Löslichkeit:
  • löslich: in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform, Diethyläther und Benzol
  • kaum löslich: in n-Hexan, Petroläther
  • unlöslich: in Wasser
  • 5) Schmelzpunkt:
  • 163-165ºC
  • 6) spezifische Drehung:
  • [α]23D: -84.1º (c = 1.0, CHCl&sub3;)
  • 7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
  • Endabsorption
  • 8) Infrarot-Absorptionsspektrum:
  • : 3680, 3575, 3520, 2940, 2875, 2825, 1745, 1725, 1700, 1647, 1610(sh), 1452, 1380, 1350, 1330, 1285, 1170, 1135, 1090, 1030, 1005, 990, 980(sh) 960(sh), 913, 908(sh) cm&supmin;¹
  • 9) ¹³C-kernmagnetisches Resonanzspektrum:
  • dessen Diagramm in der Fig. 7 dargestellt ist;
  • 10) ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum dessen Diagramm in der Fig. 8 dargestellt ist;
  • 11) Dünnschicht-Chromatographie: stationäre Phase Entwicklungs-Lösungsmittel Rf-Werte Silicagel-Platte Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis 20 : 1) Ethylacetat
  • 12) Eigenschaften der Substanz:
  • neutrale Substanz
  • Hinsichtlich der FR-900520-Substanz sei bemerkt, daß im Falle der Messung der ¹³C- und ¹H-kernmagnetischen Resonanzspektren diese Substanz Signal-Paare bei verschiedenen chemischen Verschiebungen aufweist, daß jedoch im Falle der Messung der Dünnschichtchromatographie und der Hochleistungs-Flüssigchromatographie die FR-900520-Substanz in der Dünnschichtchromatographie einen einzelnen Fleck bzw. einen einzelnen Peak in der Hochleistungs-Flüssigchromatographie aufweist.
  • Aus den oben angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften und der erfolgreichen Bestimmung der chemischen Struktur der FR-900506-Substanz konnte ermittelt werden, daß die FR-900520-Substanz die folgende chemische Struktur hat:
  • 17-Ethyl-1,14-dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3- methoxycyclohexyl)-1-methylvinyli-23,25-dimethoxy- 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo- [22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon
    • FR-900523-Substanz
  • 1) Form und Farbe:
  • farblose Nadeln
  • 2) Elementaranalyse:
  • C: 64.57%, H: 8.84%, N: 1.81%
  • 3) Farbreaktion:
  • positiv: Cersulfat-Reaktion, Schwefelsäure-Reaktion, Ehrlich-Reaktion, Dragendorff-Reaktion und Joddampf-Reaktion
  • negativ: Eisen(III)chlorid-Reaktion und Ninhydrin- Reaktion.
  • 4) Löslichkeit:
  • löslich: in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform, Diethyläther und Benzol
  • kaum löslich: in n-Hexan und Petroläther
  • unlöslich: in Wasser
  • 5) Schmelzpunkt:
  • 152-154ºC
  • 6) spezifische Drehung:
  • [α]23D: -73.0º (C=0.65, CHCl&sub3;)
  • 7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
  • Endabsorption
  • 8) Infrarot-Absorptionsspektrum:
  • : 3670, 3580, 3510, 2930, 2875, 2825, 1745, 1722, 1700, 1647, 1450, 1380, 1350, 1330, 1307, 1285, 1170, 1135, 1090, 1050, 1030, 1000, 990, 978, 960, 930, 915, 888, 870, 850 cm&supmin;¹
  • 9) ¹³C-kernmagnetisches Resonanz-spektrum:
  • dessen Diagramm in der Fig. 9 dargestellt ist;
  • 10) ¹H-kernmagnetisches Resonanz-spektrum dessen Diagramm in der Fig. 10 dargestellt ist;
  • 11) Dünnschicht-Chromatographie: stationäre Phase Entwicklungs-Lösungsmittel Rf-Werte Silicagel-Platte Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis 20 : 1) Ethylacetat
  • 12) Eigenschaften der Substanz:
  • neutrale Substanz
  • Hinsichtlich der FR-900523-Substanz sei bemerkt, daß im Falle der Messungen der ¹³C- und ¹H-kernmagnetischen Resonanzspektren diese Substanz Signal-Paare bei verschiedenen chemischen Verschiebungen aufwies, daß jedoch im Falle der Messung der Dünnschichtchromatographie und der Hochleistungs-Flüssigchromatographie die FR-900523-Substanz in der Dünnschichtchromatographie nur einen einzelnen Fleck bzw. einen einzelnen Peak in der Hochleistungs- Flüssigchromatographie aufwies.
  • Aus den oben angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften und der erfolgreichen Bestimmung der chemischen Struktur der FR-900506-Substanz konnte ermittelt werden, daß die FR-900523-Substanz die folgende chemische Struktur hat:
  • 1,14-Dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)- 1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,17,21,27- pentamethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9)octacos-18-en -2,3,10,16-tetraon
    • II) Syntheseverfahren 1) Verfahren 1: Einführung einer Hydroxyschutzgruppe
  • Die Verbindung (Ib) kann hergestellt werden durch Einführung einer Hydroxyschutzgruppe in die Verbindung (Ia)
  • Ein geeignetes Agens zur Einführung der Hydroxyschutzgruppe, das bei dieser Reaktion verwendet wird, kann ein konventionelles Agens sein, wie z. B. ein Di(C&sub1;- C&sub6;)-alkylsulfoxid, beispielsweise C&sub1;-C&sub6;-Alkylmethylsulfoxid (wie Dimethylsulfoxid, Ethylmethylsulfoxid, Propylmethylsulfoxid, Isopropylmethylsulfoxid, Butylmethylsulfoxid, Isobutylmethylsulfoxid und Hexylmethylsulfoxid) eine trisubstituierte Silylverbindung, wie z. B. ein Tri(C&sub1;-C&sub6;) alkylsilylhalogenid (wie Trimethylsilylchlorid, Triethylsilylbromid, Tributylsilylchlorid und tert-Butyldimethylsilylchlorid), ein C&sub1;-C&sub6;-Alkyl-diarylsilylhalogenid (wie Methyldiphenylsilylchlorid, Ethyldiphenylsilylbromid, Propylditolylsilylchlorid und tert-Butyldiphenylsilylchlorid) und ein Acylierungsmittel, das in der Lage ist, eine Acylgruppe wie oben angegeben einzuführen, wie z. B. eine Carbonsäure, Sulfonsäure und ihr reaktionsfähiges Derivat, beispielsweise ein Säurehalogenid, ein Säureanhydrid, ein aktiviertes Amid und ein aktivierter Ester. Zu bevorzugten Beispielen für ein solches reaktionsfähiges Derivat können gehören ein Säurechlorid, Säurebromid, ein gemischtes Säureanhydrid mit einer Säure, wie substituierter Phosphorsäure (z. B. Dialkylphosphorsäure, Phenylphosphorsäure, Diphenylphosphorsäure, Dibenzylphosphorsäure und halogenierter Phosphorsäure), Dialkylphosphoriger Säure, Schwefeliger Säure, Thioschwefelsäure, Schwefelsäure, Alkylcarbonat (wie Methylcarbonat, Ethylcarbonat und Propylcarbonat), einer aliphatischen Carbonsäure (wie Pivalinsäure, Pentansäure, Isopentansäure, 2-Ethylbuttersäure, Trichloressigsäure und Trifluoressigsäure), einer aromatischen Carbonsäure (wie Benzoesäure), ein symmetrisches Säureanhydrid, ein aktiviertes Säureamid mit einer heterocyclischen Verbindung, die eine Iminfunktion enthält, wie z. B. Imidazol, 4-substituiertes Imidazol, Dimethylpyrazol, Triazol und Tetrazol, oder ein aktivierter Ester (wie ein p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, Trichlorophenylester, Pentachlorophenylester, Mesylphenylester, Phenylazophenylester, Phenylthioester, p-Nitrophenylthioester, p-Kresylthioester, Carboxymethylthioester, Pyridylester, Piperidinylester, 8-Chinolylthioester oder ein Ester mit einer N-Hydroxyverbindung, wie N,N-Dimethylhydroxylamin, 1-Hydroxy-2-(1H)-pyridon, N-Hydroxysuccinimid, N-hydroxyphthalimid, 1-Hydroxybenzotriazol und 1-Hydroxy-6-chlorobenzotriazol.
  • Bei dieser Reaktion wird für den Fall, daß das Di(C&sub1;- C&sub6;)alkylsulfoxid als Agens zur Einführung der Hydroxyschutzgruppe verwendet wird, die Reaktion in der Regel in Gegenwart eines niederen Alkansäureanhydrids, wie Essigsäureanhydrid, durchgeführt.
  • Ferner wird für den Fall, daß die trisubstituierte Silylverbindung als Agens zur Einführung der Hydroxyschutzgruppe verwendet wird, die Reaktion vorzugsweise in Gegenwart eines konventionellen Kondensationsmittels, wie Imidazol, durchgeführt.
  • Ferner wird für den Fall, daß das Acylierungsmittel als Agens zur Einführung der Hydroxyschutzgruppe verwendet wird, die Reaktion vorzugsweise in Gegenwart einer organischen oder anorganischen Base, wie z. B. eines Alkalimetalls (wie Lithium, Natrium und Kalium), eines Erdalkalimetalls (wie Calcium), eines Alkalimetallhydrids (wie Natriumhydrid), eines Erdalkalimetallhydrids (wie Calciumhydrid), eines Alkalimetallhydroxids (wie Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid), eines Alkalimetallcarbonats (wie Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat), eines Alkalimetallhydrogencarbonats (wie Natriumhydrogencarbonat und Kaliumhydrogencarbonat), eines Alkalimetallalkylats (wie Natriummethylat, Natriumethylat und Kalium-tert-butylat), einer Alkalimetallalkansäure (wie Natriumacetat), eines Trialkylamins (wie Triethylamin und dgl.), einer Pyridinverbindung (wie Pyridin, Lutidin, Picolin und 4-N,N-Dimethylaminopyridin) und Chinolin.
  • Für den Fall, daß das Acylierungsmittel in freier Form oder in Form seines Salzes bei dieser Reaktion verwendet wird, wird die Reaktion vorzugsweise durchgeführt in Gegenwart eines Kondensationsmittels, z. B. einer Carbodiimidverbindung (wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-Cyclohexyl-N'-(4-diethylaminocyclohexyl)carbodiimid, N,N'- Diethylcarbodiimid, N,N'-Diisopropylcarbodiimid und N- Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid), einer Keteniminverbindung (wie N,N'-Carbonylbis (2-methylimidazol), Pentamethylenketen-N-cyclohexylimin und Diphenylketen-N-cyclohexylimin); einer olefinischen oder acetylenischen Ätherverbindung (wie Ethoxyacetylen, β-Cyclovinylethyläther) oder eines Sulfonsäureesters eines N-Hydroxybenzotriazolderivats (wie 1-(4-Chlorobenzolsulfonyloxy)- 6-chloro-1H-benzotriazol).
  • Die Reaktion wird in der Regel in einem konventionellen Lösungsmittel durchgeführt, das die Reaktion nicht nachteilig beeinflußt, z. B. in Wasser, Aceton, Dichlormethan, einem Alkohol (wie Methanol und Ethanol), Tetrahydrofuran, Pyridin oder N,N-Dimethylformamid oder einer Mischung davon, und für den Fall, daß die Base oder das Agens zur Einführung der Hydroxyschutzgruppe flüssig ist, kann dieses auch als Lösungsmittel verwendet werden.
  • Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch und die Reaktion wird in der Regel unter Kühlen bis Erhitzen durchgeführt.
  • Dieses Verfahren umfaßt innerhalb seines Rahmens auch den Fall, daß während der Reaktion die Hydroxygruppe für R² der Verbindung (Ia) gelegentlich in die entsprechende geschützte Hydroxygruppe in der erfindungsgemäßen Verbindung (Ib) überführt sein kann.
  • Außerdem umfaßt dieses Verfahren innerhalb seines Rahmens auch den Fall, daß dann, wenn das Di(C&sub1;-C&sub6;)alkylsulfoxid als Agens zur Einführung der Hydroxyschutzgruppe in Gegenwart eines C&sub1;-C&sub6;-Alkansäureanhydrids verwendet wird, die Verbindung (Ia), welche die Partialstruktur der Formel hat
  • worin R² für Hydroxy steht, gelegentlich oxidiert werden kann während der Reaktion unter Bildung der Verbindung (Ib), die eine Partialstruktur der Formel hat
  • worin R² für Hydroxy steht.
    • 2) Verfahren 2: Einführung einer Hydroxyschutzgruppe
  • Die Verbindung (Id) kann hergestellt werden durch Einführung einer Hydroxyschutzgruppe in die Verbindung (Ic).
  • Die Reaktion kann im wesentlichen nach der gleichen Methode wie das Verfahren 1 durchgeführt werden und deshalb wird bezüglich der Reaktionsbedingungen (z. B. der Base, des Kondensationsmittels, des Lösungsmittels und der Reaktionstemperatur) auf diejenigen des Verfahrens 1 Bezug genommen.
  • Dieses Verfahren umfaßt innerhalb seines Rahmens den Fall, daß während der Reaktion die Hydroxygruppe für R¹ der Verbindung (Ic) häufig in die entsprechende geschützte Hydroxygruppe in der erfindungsgemäßen Verbindung (Id) überführt werden kann.
    • 3) Verfahren 3: Bildung einer Doppelbindung
  • Die Verbindung (If) kann hergestellt werden durch Umsetzung der Verbindung (Ie) mit einer Base.
  • Geeignete Basen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen solche, wie sie beispielhaft in dem Verfahren 1 angegeben worden sind.
  • Diese Reaktion kann auch durchgeführt werden durch Umsetzung der Verbindung (Ie), worin R² für Hydroxy steht, mit einem Acylierungsmittel in Gegenwart einer Base.
  • Die Reaktion wird in der Regel in einem konventionellen Lösungsmittel durchgeführt, das die Reaktion nicht nachteilig beeinflußt, z. B. in Wasser, Aceton, Dichlormethan, einem Alkohol (wie Methanol, Ethanol und Propanol), Tetrahydrofuran, Pyridin oder N,N-Dimethylformamid oder einer Mischung davon und für den Fall, daß die Base eine Flüssigkeit ist, kann sie auch als Lösungsmittel verwendet werden.
  • Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch und die Reaktion wird in der Regel unter Kühlen bis Erhitzen durchgeführt.
    • 4) Verfahren 4: Oxidation der Hydroxyethylengruppe
  • Die Verbindung (Ih) kann hergestellt werden durch Oxidieren der Verbindung (Ig).
  • Das Oxidationsmittel, das erfindungsgemäß verwendet werden soll, kann umfassen ein Di(C&sub1;-C&sub6;)alkylsulfoxid, z. B. ein solches, wie es in dem Verfahren 1 angegeben worden ist.
  • Diese Reaktion wird in der Regel in Gegenwart eines niederen Alkansäureanhydrids, wie Essigsäureanhydrid, in einem konventionellen Lösungsmittel, das die Reaktion nicht nachteilig beeinflußt, z. B. in Aceton, Dichlormethan, Ethylacetat, Tetrahydrofuran, Pyridin, N, N-Dimethylformamid oder in einer Mischung davon durchgeführt und außerdem kann für den Fall, daß das niedere Alkansäureanhydrid flüssig ist, dieses auch als Lösungsmittel verwendet werden.
  • Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch und die Reaktion wird in der Regel unter Kühlen bis Erhitzen durchgeführt.
  • Dieses Verfahren umfaßt innerhalb seines Rahmens auch den Fall, daß während der Reaktion die Hydroxygruppe für R¹ der Ausgangsverbindung (Ig) gelegentlich in eine 1-(C&sub1;- C&sub6;-Alkylthio) (C&sub1;-C&sub6;)alkoxygruppe in der erfindungsgemäßen Verbindung (Ih) umgewandelt werden kann.
    • 5) Verfahren 5: Reduktion der Allylgruppe
  • Die Verbindung (Ij) kann erhalten werden durch Reduktion der Verbindung (Ii).
  • Die Reduktion kann in diesem Verfahren unter Anwendung einer konventionellen Methode durchgeführt werden, die in der Lage ist, eine Allylgruppe zu einer Propylgruppe zu reduzieren, beispielsweise eine katalytische Reduktion.
  • Geeignete Katalysatoren, wie sie bei der katalytischen Reduktion verwendet werden, sind konventionelle Katalysatoren, z. B. Platin-Katalysatoren (wie eine Platinplatte, Platinschwamm, Platinmohr, kolloidales Platin, Platinoxid und Platindraht), Palladium-Katalysatoren (wie Palladiumschwamm, Palladiummohr, Palladiumoxid, Palladium auf Kohlenstoff, kolloidales Palladium, Palladium auf Bariumsulfat und Palladium auf Bariumcarbonat), Nickel- Katalysatoren (wie reduziertes Nickel, Nickeloxid, Raney- Nickel), Kobalt-Katalysatoren (wie reduziertes Kobalt und Raney-Kobalt), Eisen-Katalysatoren (wie reduziertes Eisen und Raney-Eisen) oder Kupfer-Katalysatoren (wie reduziertes Kupfer, Raney-Kupfer und Ullmann-Kupfer).
  • Die Reaktion wird in der Regel in einem konventionellen Lösungsmittel durchgeführt, das die Reaktion nicht nachteilig beeinflußt, z. B. in Wasser, Methanol, Ethanol, Propanol, Pyridin, Ethylacetat, N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan oder einer Mischung davon.
  • Die Reaktionstemperatur ist bei dieser Reaktion nicht kritisch und die Reaktion wird in der Regel unter Kühlen bis Erwärmen durchgeführt.
  • Die nach den oben erläuterten Syntheseverfahren 1 bis 5 erhaltenen erfindungsgemäßen tricyclischen Verbindungen (I) können auf konventionelle Weise isoliert und gereinigt werden, beispielsweise durch Extraktion, Ausfällung, fraktionierte Kristallisation, Umkristallisation oder Chromatographie.
  • Geeignete Salze für die Verbindungen (I) und (Ib) bis (Ij) können umfassen pharmazeutisch akzeptable Salze, z. B. Basensalze, beispielsweise ein Alkalimetallsalz (wie ein Natriumsalz und Kaliumsalz), ein Erdalkalimetallsalz (wie ein Calciumsalz und Magnesiumsalz), ein Ammoniumsalz, ein Aminsalz (wie ein Triethylaminsalz und N-Benzyl-N-methylaminsalz) und andere konventionelle organische Salze.
  • Es sei darauf hingewiesen, daß bei den obengenannten Reaktionen in den Syntheseverfahren 1 bis 5 oder bei der Nachbehandlung der Reaktionsmischung bei diesen Verfahren die Konformeren und/oder Stereoisomeren, die als Folge des (der) asymmetrischen Kohlenstoffatoms (Kohlenstoffatome) oder Doppelbindung(en) in der Ausgangsverbindung und in der Zielverbindung auftreten, gelegentlich in das andere Konformere und/oder Stereoisomere umgewandelt werden können und daß diese Fälle ebenfalls innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegen.
  • Die erfindungsgemäßen tricyclischen Verbindungen (I) weisen pharmakologische Aktivitäten auf, beispielsweise eine Immunsuppressionsaktivität und eine antimikrobielle Aktivität und sie sind daher verwendbar für die Behandlung und Prävention der Resistenz durch Transplantation von Organen oder Geweben, wie Herz, Niere, Leber, Knochenmark oder Haut, von Transplantat-gegen-Wirts(Empfänger)-Erkrankungen durch Knochenmarks-Transplantation, Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus- Erythematose, Hashimoto-Thyroiditis, Multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Diabetes vom Typ I oder Uveitis oder Infektionserkrankungen, die durch pathogene Mikroorganismen hervorgerufen werden.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche die tricyclischen Verbindungen (I) als aktive Bestandteile (Wirkstoffe) in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen, im wesentlichen nicht-toxischen Träger oder Exzipienten enthält.
  • Als Beispiele welche die pharmakologischen Aktivitäten zeigen, werden nachstehend einige pharmakologische Testdaten der tricyclischen Verbindungen erläutert.
    • Test 1 In vitro-Suppression der gemischen Lymphozytenreaktion (MLR) durch die tricyclischen Verbindungen (I)
  • Der MLR-Test wurde in Mikrotiter-Platten durchgeführt, wobei jede Vertiefung 5 · 10&sup5; CS7BL/6 Responder- Zellen (H-2b), 5 · 10&sup5; mit Mitomycin C behandelte (25 4g/ml Mitomycin C bei 37ºC für 30 min und dreimal gewaschen mit einem RPMI 1640-Medium) BALB/C Stimulator-Zellen (H-2d) in 0,2 ml RPMI 1640-Medium, ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum, 2 mM Natriumhydrogencarbonat, Penicillin (50 Einheiten/ml) und Streptomycin (50 ug/ml) enthielt. Die Zellen wurden 68 h lang bei 37ºC in einer angefeuche- Len Atmosphäre aus 5% Kohlendioxid und 95% Luft inkubiert und 4 h, bevor die Zellen gesammelt wurden, pulsiert mit ³H-Thymidin (0,5 uCi) versetzt. Die erfindungsgemäße Zielverbindung wurde in Ethanol gelöst und in RPMI 1640- Medium weiter verdünnt und zu Kulturen zugegeben zur Erzielung von Endkonzentrationen von 0,1 ug/ml oder weniger.
  • Die Ergebnisse sind in den Tabellen 7 bis 10 angegeben. Die erfindungsgemäßen tricyclischen Verbindungen unterdrückten die Maus-MLR. Tabelle 7 Wirkung der FR-900506-Substanz auf die MLR Konzentration der FR-900506-Substanz (ng/ml) Radioaktivitäten (Mittelwert) Suppression Tabelle 8 Wirkung der FR-900520-Substanz auf die MLR Konzentration der FR-900520-Substanz (ng/ml) Radioaktivitäten (Mittelwert) Suppression Tabelle 9 Wirkung der FR-900523-Substanz auf die MLR Konzentration der FR-900523-Substanz (ng/ml) Radioaktivitäten (Mittelwert) Suppression Tabelle 10 Wirkung der FR-900525-Substanz auf die MLR Konzentration der FR-900525-Substanz (ng/ml) Radioaktivitäten (Mittelwert) Suppression
    • Test 2 Antimikrobielle Aktivitäten der tricyclischen Verbindungen (I)
  • Die antimikrobiellen Aktivitäten der tricyclischen Verbindungen (I) gegenüber verschiedenen Fungi wurden bestimmt unter Anwendung einer Agar-Reihenverdünnungsmethode in einem Sabouraud-Agar. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) wurden nach 24-stündiger Inkubation bei 30ºC bestimmt, ausgedrückt in ug/ml.
  • Die erfindungsgemäßen tricyclischen Verbindungen wiesen antimikrobielle Aktivitäten gegenüber Fungi, wie z. B. Aspergillus fumigatus IFO 5840 und Fusarium oxysporum IFO 5942 auf, wie in den folgenden Tabellen 11 und 12 beschrieben.
    • Tabelle 11: MIC-Werte (ug/ml) der tricyclischen Verbindungen (I) gegenüber Aspergillus fumigatus IFO 5840
  • Substanzen MIC (u/ml)
  • FR-900506 0.025
  • FR-900520 0.1
  • FR-900523 0.3
  • FR-900525 0.5
    • Tabelle 12: MIC-Werte (ug/ml) der tricyclischen Verbindungen (I) gegenüber Fusarium oxysporum
  • Substanzen MIC (ug/ml)
  • FR-900506 0.05
  • FR-900525 1
    • Test 3 Wirkung der tricyclischen Verbindungen (I) auf die Überlebensrate von Hauttransplantationen bei Ratten
  • Vental-Transplantate von Donor-Ratten (Fischer) wurden auf den seitlichen Thoraxbereich von Empfänger-Ratten (WKA) transplantiert. Die Verbände wurde am 5. Tage entfernt. Die Transplantate wurden täglich inspiziert, bis eine Abstoßung auftrat, die definiert wurde als eine Negrosis des Transplantat-Epithels von mehr als 90%.
  • Die FR-900506-Substanz wurde in Olivenöl gelöst und an 14 aufeinanderfolgenden Tagen intramuskulär verabreicht, beginnend mit dem Tag der Transplantation.
  • Wie in der Tabelle 13 angegeben, wurden alle Haut- Transplantate innerhalb von 8 Tagen bei Ratten abgestoßen, die an 14 aufeinanderfolgenden Tagen mit Olivenöl intramuskulär behandelt worden waren, eine tägliche Behandlung mit der FR-900506-Substanz verlängerte jedoch die Überlebensrate des Hauttransplantats. Tabelle 13 Wirkung der FR-900506-Substanz auf die Überlebensrate eines Hauttransplantats Dosis (mg/kg) Anzahl der Tiere Überlebensrate des Haut-Transplantats in Tagen Kontrolle (Olivenöl) Substanz
    • Test 4 Wirkung der tricyclischen Verbindungen (I) auf eine durch Kollagen induzierte Arthritits vom Typ II bei Ratten
  • Kollagen wurde in kalter 0,01 M Essigsäure in einer Konzentration von 2 mg/ml gelöst. Die Lösung wurde in einem gleichen Volumen eines unvollständigen Freund-Adjuvans emulgiert. Ein Gesamtvolumen von 0,5 ml der kalten Emulsion wurde intradermal an mehreren Stellen auf dem Rücken und auf einer oder zwei Seiten in den Schwanz von weiblichen Lewis-Ratten injiziert. Die FR-900506-Substanz wurde in Olivenöl gelöst und oral verabreicht. Die Kontroll-Ratten, die mit der gleichen Menge Kollagen vom Typ II immunisiert worden waren, erhielten nur orale Verabreichungen von Olivenöl. Es wurden die Fälle von Arthritis beobachtet.
  • Die Testergebnisse sind in der Tabelle 14 angegeben. Eine inflammatorische Polyarthritits wurde bei allen Ratten induziert, die 14 Tage lang mit Olivenöl behandelt worden waren, beginnend an dem gleichen Tag wie die Immunisierung mit Kollagen vom Typ II.
  • Die tägliche Behandlung mit der FR-900506-Substanz für 14 Tage ergab eine vollständige Unterdrückung der Arthritis-Induktion während eines Beobachtungszeitraums von 3 Wochen. Tabelle 14 Wirkung der FR-900506-Substanz auf die durch Kollagen vom Typ II induzierte Arthritis bei Ratten Dosis (mg/kg pro Tag) Auftreten von Arthritits Kontrolle (Olivenöl) Substanz
    • Test 5 Wirkung der tricyclischen Verbindungen (I) auf eine experimentelle allergische Ecephalomyelitis (EAE) bei SJL/J- Mäusen
  • Es wurde ein Rückenmarks-Homogenat von SJL/J-Mäusen hergestellt. Das Rückenmark wurde durch Insufflation entfernt, mit einem etwa gleichen Volumen Wasser gemischt und bei 4ºC homogenisiert. Ein gleiches Volumen dieses kalten Homogenats (10 mg/ml) wurde mit dem vollständigen Freund- Adjuvans (CFA) emulgiert, das 0,6 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37RA enthielt.
  • Die EAE wurde durch zwei Injektionen von 0,2 ml Rückenmarks-CFA-Emulsion in SJL/J-Mäuse am Tage 0 und am Tage 13 induziert. Alle in diesen Tests verwendeten Mäuse wurden täglich beurteilt und bewertet im Hinblick auf klinische Anzeichen der EAE.
  • Die Schwere der EAE wurde unter Anwendung der folgenden Kriterien bewertet: Stufe 1 - gesenkte Schwanz-Haltung; Stufe 2 - schwerfälliger Gang; Stufe 3 - Schwäche eines oder mehrerer Glieder; Stufe 4 - Paraplegie oder Hemiplegie.
  • Die FR-900506-Substanz wurde in Olivenöl gelöst und 19 Tage lang oral verabreicht, beginnend mit dem Tag 0 (dem Tag der ersten Immunisierung). Wie in Tabelle 15 angegeben, verhinderte die FR-900506-Substanz eindeutig die Entwicklung der klinischen Anzeichen der EAE. Tabelle 15 Wirkung der FR-900506-Substanz auf die experimentelle allergische Encephalomyelitis bei SJL/J-Mäusen Dosis (mg/kg) Anzahl der erkrankten Tiere am Tage 24 Kontrolle (Olivenöl) Substanz
    • Test 6 Wirkung der tricyclischen Verbindungen (I) auf die lokale Transplantat-gegen-Wirt-(Empfänger)-Reaktion (GvHR) bei Mäusen
  • Lebensfähige Milz-Zellen (1 · 10&sup7; Zellen) von C57BL/6-Donoren wurden subcutan in die rechte Hinterpfote Von BDF&sub1;-Mäusen injiziert, um eine lokale GvHR zu induzieren. Die Mäuse wurden 7 Tage später getötet und sowohl der rechte (injizierte Pfote) als auch der linke (nicht-injizierte Pfote) Popliteal-Lymphknoten (PLN) wurden gewogen. Die GvHR wurde ausgedrückt als Gewichtsdifferenz zwischen dem rechten und linken PLN.
  • Die FR-900506-Substanz wurde in Olivenöl gelöst und 5 Tage lang oral verabreicht, beginnend mit dem gleichen Tag, an dem die Sensibilisierung erfolgte.
  • Der ED&sub5;&sub0;-Wert der FR-900506-Substanz für die Verhinderung der lokalen Transplantat-gegen-Wirt(Empfänger)-Reaktion betrug 19 mg/kg.
    • Test 7 Akute Toxizitäten der tricyclischen Verbindung (I)
  • Es wurde ein Test in bezug auf die akuten Toxizitäten der FR-900506-, FR-900520-, FR-900523- und FR-900525-Substanzen bei ddY-Mäusen durch intraperitoneale Injektion durchgeführt und in keinem Falle wurden Todesfälle bei einer Dosis von 100 mg/kg festgestellt.
  • Die erfindungsgemäß pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form eines pharmazeutischen Präparats verwendet werden, beispielsweise in fester, halbfester oder flüssiger Form, das die erfindungsgemäßen tricyclischen Verbindungen (I) als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) im Gemisch mit einem organischen oder anorganischen Träger oder Exzipienten enthält, der für externale, enterale oder parenterale Applikationen geeignet ist. Der aktive Bestandteil (Wirkstoff) kann beispielsweise gemischt werden mit üblichen nicht-toxischen, pharmazeutisch akzeptablen Trägern für Tabletten, Pellets, Kapseln, Suppositorien, Lösungen, Emulsionen, Suspensionen und jede andere für die Verwendung geeignete Form. Die Träger, die verwendet werden können, sind Wasser, Glucose, Lactose, Akaziengummi, Gelatine, Mannit, Stärkepaste, Magnesiumtrisilicat, Talk, Maisstärke, Keratin, kolloidales Siliciumdioxid, Kartoffelstärke, Harnstoff und andere Träger, die für die Verwendung bei der Herstellung von Präparaten in fester, halbfester oder flüssiger Form geeignet sind, und außerdem können Hilfsstoffe, wie Stabilisierungsmittel, Eindickungsmittel und Färbemittel sowie Geschmacksstoffe (Parfüms) verwendet werden. Die erfindungsgemäße aktive Verbindung ist in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer Menge enthalten, die ausreicht für die Erzielung der gewünschten Wirkung auf den Verlauf oder den Zustand der Erkrankungen.
  • Für die Anwendung dieser Zusammensetzung auf Menschen ist es bevorzugt, sie parenteral oder enteral zu verabreichen. Obgleich die Dosierung der therapeutisch wirksamen Menge der tricyclischen Verbindung (I) variiert in Abhängigkeit vom Alter und Zustand jedes einzelnen Patienten, der behandelt werden soll, wird im allgemeinen eine tägliche Dosis von etwa 0,1 bis 1000 mg, vorzugsweise von 0,1 bis 500 mg und insbesondere von 0,5 bis 100 mg des aktiven Bestandteils (Wirkstoffes) für die Behandlung von Erkrankungen verabreicht und im allgemeinen wird eine durchschnittliche Einzeldosis von etwa 0,5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg und 500 mg verabreicht.
  • Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern.
    • Beispiel 1 Isolierung von Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993
  • Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 wurde wie nachstehend angegebenen isoliert unter Anwendung von Verdünnungs- Platten-Methoden.
  • Etwa 1 g Erdboden, der in Toyosato-cho, Tsukuba gun, in der Ibaraki-Präfektur, Japan, entnommen wurde, wurde in ein steriles Teströhrchen eingeführt und das Volumen wurde mit sterilem Wasser auf 5 ml aufgefüllt. Dann wurde die Mischung 10 s lang mit einer Rohr-Zentrifuge durchmischt und 10 min lang stehen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit sterilem Wasser anschließend auf das 100- fache verdünnt. Die verdünnte Lösung (0,1 ml) wurde in einer Petrischale auf Czapek-Agar ausgestrichen, der ergänzt worden war durch Thiaminhydrochlorid (30 g Saccharose, 3 g Natriumnitrat, 1 g Dikaliumphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,01 g Eisen(II)sulfat, 0,1 g Thiaminhydrochlorid, 20 g Agar, 1000 ml Leitungswasser; pH 7,2). Die wachsenden Kolonien, die sich auf den Platten nach 21-tägiger Inkubation bei 30ºC entwickelten, wurden in Schrägkulturen [Hefe-Malzextrakt-Agar (ISP-Medium 2)] überführt und 10 Tage lang bei 30ºC kultiviert. Unter den isolierten Kolonien konnte das Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 gefunden werden.
    • Fermentation
  • Ein Kulturmedium (160 ml), das Glycerin (1%), lösliche Stärke (1%) , Glucose (0,5%), Baumwollsamenmehl (0,5 %), getrocknete Hefe (0,5%), Maisquellwasser (0,5%) und Calciumcarbonat (0,2%) enthielt (eingestellt auf pH 6,5) wurde in jeden von zwanzig 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und 30 min lang bei 120ºC sterilisiert. Eine Ösenfüllung der Schrägkultur von Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993, FERM BP-927, wurde in jedes der Medien inokuliert und 4 Tage lang auf einem Rotationsschüttler bei 30ºC kultiviert. Die resultierende Kultur wurde in ein Medium, das lösliche Stärke (4,5%), Maisquellwasser (1%), getrocknete Hefe (1%), Calciumcarbonat (0,1%) und Adecanol (Entschäumungsmittel, Warenzeichen der Firma Asahi Denka Co.) (0,1%) enthielt, (150 l) in einen 200 l-Kolben-Fermenter inokuliert, der vorher 20 min lang bei 120ºC sterilisiert worden war, und 4 Tage lang bei 30ºC unter Belüftung mit 150 1/min und unter Rühren mit 250 UpM kultiviert.
    • Isolierung und Reinigung
  • Die so erhaltene Kulturbrühe wurde mit Hilfe von Diatomeenerde (5 kg) filtriert. Der Mycelkuchen wurde mit Methanol (50 l) extrahiert, wobei man 50 l Extrakt erhielt. Der Methanolextrakt aus dem Mycel und das Filtrat wurden miteinander vereinigt und durch eine Säule eines nicht-ionischen Adsorptionsharzes "Diaion HP-20" (Warenzeichen für ein Produkt der Firma Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) (10 l) laufen gelassen. Nach dem Waschen mit Wasser (30 l) und wäßrigem Methanol (30 l) wurde mit Methanol eluiert.
  • Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeimpft, wobei Wasser zurückblieb (2 l). Dieser Rückstand wurde mit Ethylacetat (2 l) extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man einen öligen Rückstand erhielt. Der ölige Rückstand wurde mit dem doppelten Gewicht eines sauren Silicagels (ein spezielles Silicagel der Sorte 12, hergestellt von der Firma Fuji Devison Co.) gemischt und diese Mischung wurde in Ethylacetat aufgeschlämmt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das resultierende trockene Pulver einer Säulenchromatographie an dem gleichen sauren Silicagel (800 ml), das mit n-Hexan gefüllt war, unterworfen. Die Säule wurde mit n-Hexan (3 l), einem n-Hexan/Ethylacetat-Gemisch (Volumenverhältnis 9 : 1, 3 l, und Volumenverhältnis 4 : 1, 3 l) sowie mit Ethylacetat (3 l) entwickelt. Die die Zielverbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man einen öligen Rückstand erhielt. Der ölige Rückstand wurde in einem Gemisch von n-Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 1 : 1, 30 ml) gelöst und einer Säulenchromatographie an Silicagel (Hersteller Merck Co., Ltd., 230-400 mesh) (500 ml), gefüllt mit dem gleichen Lösungsmittelsystem, unterworfen.
  • Das Eluieren wurde mit einem n-Hexan/Ethylacetat (Volumenverhältnis 1 : 1, 2 l, und Volumenverhältnis 1 : 2, 1,5 l) durchgeführt. Die die erste Zielverbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man ein gelbliches Öl erhielt. Der ölige Rückstand wurde mit dem doppelten Gewicht saurem Silicagel gemischt und diese Mischung wurde in Ethylacetat aufgeschlämmt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das resultierende trockene Pulver an saurem Silicagel chromatographiert, das mit n-Hexan gepackt und entwickelt wurde. Die die Zielverbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man die rohe FR-900506-Substanz (1054 mg) in Form eines weißen Pulvers erhielt.
  • 100 mg dieses Rohprodukts wurden einer Hochleistungs- Flüssigchromatographie unterworfen. Das Eluieren wurde unter Verwendung einer Säule (8 · 500 mm) mit Lichrosorb SI 60 (Warenzeichen für ein Produkt der Firma Merck & Co.) als Träger durchgeführt. Diese Chromatographie wurde durch einen UV-Detektor bei 230 nm überwacht und die mobile Phase war ein Gemisch aus Methylenchlorid und Dioxan (Volumenverhältnis 85 : 15) mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min und die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und eingedampft. Diese Hochleistungs-Flüssigchromatographie wurde wiederholt und 14 mg der gereinigten FR-900506- Substanz wurden in Form eines weißen Pulvers erhalten.
  • Außerdem wurde eine kontinuierliche Elution mit Ethylacetat (1,5 l) durchgeführt und die die zweite Zielverbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man die rohe FR- 900525-Substanz (30 mg) in Form eines gelblichen Öls erhielt.
    • Beispiel 2 Fermentation
  • Ein Vorkulturmedium (100 ml), das Glycerin (1%), Maisstärke (1%), Glucose (0,5%), Baumwollsamenmehl (1 %), Maisquellwasser (0,5%), getrocknete Hefe (0,5%) und Calciumcarbonat (0,2%) bei einem pH-Wert von 6,5 enthielt, wurde in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und 30 min lang bei 120ºC sterilisiert. Eine Ösenfüllung der Schrägkultur von Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 wurde in das Medium inokuliert und 4 Tage lang bei 30ºC kultiviert. Die resultierende Kultur wurde in das gleiche Vorkultur-Medium (20 l) in einem 30 l-Kolben-Fermenter überführt, der vorher 30 min lang bei 120ºC sterilisiert worden war. Nachdem die Kultur 2 Tage lang bei 30ºC inkubiert worden war, wurden 16 l der Vorkultur in ein Fermentationsmedium (1600 l), das lösliche Stärke (4,5%), Maisquellwasser (1%), getrocknete Hefe (1%), Calciumcarbonat (0,1%) und Adecanol (Entschäumungsmittel, Warenzeichen für ein Produkt der Firma Asahi Denka Co.) (0,1%) enthielt, bei einem pH-Wert von 6,8 in einen 2 Tonnen-Tank überführt, der vorher 30 min lang bei 120ºC sterilisiert worden war, und 4 Tage lang bei 30ºC kultiviert.
    • Isolierung und Reinigung
  • Die so erhaltene Kulturbrühe wurde mit Hilfe von Diatomeenerde (25 kg) filtriert. Der Mycel-Kuchen wurde mit Aceton (500 l) extrahiert, wobei man 500 l Extrakt erhielt. Der Acetonextrakt aus dem Mycel und das Filtrat (1350 l) wurden miteinander vereinigt und über eine Säule eines nicht-ionischen Adsorptionsharzes "Diaion HP-20" (Warenzeichen für ein Produkt der Firma Misubishi Chemical Industries Ltd.) (100 l) laufen gelassen. Nach dem Waschen mit Wasser (300 l) und 50%igem wäßrigem Aceton (300 l) wurde die Elution mit 75%igem wäßrigem Aceton durchgeführt. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man Rückstandswasser (300 l) erhielt. Dieser Rückstand wurde mit Ethylacetat (20 l) 3 mal extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man einen öligen Rückstand erhielt. Der ölige Rückstand wurde mit dem doppelten Gewicht saurem Silicagel (ein spezielles Silicagel der Sorte 12, hergestellt von der Firma Fuji Devison Co.) gemischt und diese Mischung wurde in Ethylacetat aufgeschlämmt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das resultierende trockene Pulver einer Säulenchromatographie an dem gleichen sauren Silicagel (8 l) unterworfen, das mit n-Hexan gefüllt war. Die Säule wurde mit n-Hexan (30 l), einem Gemisch aus n-Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 4 : 1, 30 l) und Ethylacetat (30 l) entwickelt.
  • Die die Zielverbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man einen öligen Rückstand erhielt. Der ölige Rückstand wurde mit dem doppelten Gewicht saurem Silicagel gemischt und diese Mischung wurde in Ethylacetat aufgeschlämmt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das resultierende trockene Pulver erneut an saurem Silicagel (3,5 l), gefüllt mit n-Hexan, chromatographiert. Die Säule wurde mit n-Hexan (10 l), einem Gemisch aus n-Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 4 : 1, 10 l) und Ethylacetat (10 l) entwickelt. Die die Zielverbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man ein gelbliches Öl erhielt. Der ölige Rückstand wurde in einem Gemisch aus n-Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 1 : 1, 300 ml) gelöst und einer Säulenchromatographie an Silicagel (Hersteller Merck Co., Ltd., 230-400 mesh) (2 l) unterworfen, die mit dem gleichen Lösungsmittelsystem gefüllt war. Das Eluieren wurde mit einem Gemisch aus n-Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 1 : 1, 10 l, und Volumenverhältnis 1 : 2, 6 l) sowie mit Ethylacetat (6 l) durchgeführt.
  • Die die erste Zielverbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man die FR-900506-Substanz in Form eines weißen Pulvers (34 g) erhielt. Dieses weiße Pulver wurde in Acetonitril gelöst und unter vermindertem Druck eingeengt. Dieses Konzentrat wurde über Nacht bei 5ºC gehalten und man erhielt Prismen (22,7 g). Die Umkristallisation aus dem gleichen Lösungsmittel ergab die gereinigte FR-900506-Substanz (13,6 g) in Form von farblosen Prismen.
  • Außerdem wurden Fraktionen, welche die zweite Zielverbindung enthielten, gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man die rohe FR-900525-Substanz (314 mg) in Form eines gelblichen Pulvers erhielt.
    • Beispiel 3 Fermentation
  • Ein Kulturmedium (160 ml), das Glycerin (1%), Maisstärke (1%), Glucose (0,5%), Baumwollsamenmehl (1%), getrocknete Hefe (0,5%), Maisquellwasser (0,5%) und Calciumcarbonat (0,2%) (eingestellt auf pH 6,5) enthielt, wurde in jeden von zehn 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und 30 min lang bei 120ºC sterilisiert. Eine Ösenfüllung einer Schrägkultur von Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 wurde in jedes der Medien inokuliert und 4 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 30ºC kultiviert. Die resultierende Kultur wurde in ein Medium, das lösliche Stärke (5%), Erdnuß-Pulver (0,5%), getrocknete Hefe (0,5%), Glutenmehl (0,5%), Calciumcarbonat (0,1%) und Adecanol (Entschäumungsmittel, Warenzeichen für ein Produkt der Firma Asahi Denka Co.) (0,1%) (150 l) enthielt, in einem 200 l-Kolben-Fermenter inokuliert, der vorher 20 min lang bei 120ºC sterilisiert worden war, und unter Belüften mit 150 l/min und unter Rühren mit 250 UpM 4 Tage lang bei 30ºC kultiviert.
    • Isolierung und Reinigung
  • Die so erhaltene Kulturbrühe wurde mit Hilfe von Diatomeenerde (5 kg) filtriert. Der Mycel-Kuchen wurde mit Aceton (50 l) extrahiert, wobei man 50 l Extrakt erhielt. Der Aceton-Extrakt aus dem Mycel und das Filtrat (135 l) wurden miteinander vereinigt und über eine Säule eines nicht-ionischen Adsorptionsharzes "Diaion HP-20" (Warenzeichen für ein Produkt der Firma Misubishi Chemical Industries Ltd.) (10 l) laufen gelassen. Nach dem Waschen mit Wasser (30 l) und 50%igem wäßrigem Aceton (30 l) wurde das Eluieren mit 75%igem wäßrigem Aceton durchgeführt. Das Eluat (30 l) wurde unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man Rückstandswasser (2 l) erhielt. Dieser Rückstand wurde mit Ethylacetat (2 l) 3 mal extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man einen öligen Rückstand erhielt. Der ölige Rückstand wurde mit dem doppelten Gewicht saurem Silicagel (spezielles Silicagel der Sorte 12, Hersteller Fuji Devison Co.) gemischt und diese Mischung wurde in Ethylacetat aufgeschlämmt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das resultierende trockene Pulver einer Säulenchromatographie an dem gleichen sauren Silicagel (800 ml), das mit n-Hexan gefüllt worden war, unterworfen. Die Säule wurde mit n-Hexan (3 l), einem Gemisch aus n- Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 4 : 1, 3 l) und Ethylacetat (3 l) entwickelt.
  • Die die Zielverbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man einen öligen Rückstand erhielt. Der ölige Rückstand wurde in einem Gemisch aus n-Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 1 : 1, 30 ml) gelöst und einer Säulenchromatographie an Silicagel (Hersteller Merck Co., Ltd., 230 bis 400 mesh) (500 ml), das mit dem gleichen Lösungsmittel-System gefüllt worden war, unterworfen. Das Eluieren wurde mit einem Gemisch von n-Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 1 : 1, 2 l, und Volumenverhältnis 1 : 2, 1,5 l) sowie Ethylacetat (1,5 l) durchgeführt Die die erste Zielverbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man die rohe FR-900506-Substanz (3 g) in Form eines gelblichen Pulvers erhielt.
  • Außerdem wurden Fraktionen, welche die zweite Zielverbindung enthielten, gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man einen öligen Rückstand erhielt. Dieser ölige Rückstand wurde erneut mit Silicagel chromatographiert, wobei man ein gelbliches Öl erhielt. Der ölige Rückstand wurde mit dem doppelten Gewicht saurem Silicagel gemischt und diese Mischung wurde in Ethylacetat aufgeschlämmt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das resultierende trockene Pulver an saurem Silicagel (100 ml) chromatographiert, das gefüllt und entwickelt wurde mit n-Hexan.
  • Die die Zielverbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man die FR-900525-Substanz in Form eines blassen gelblichen Pulvers (380 mg) erhielt. Dieses Pulver wurde in einem Gemisch von n-Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 1 : 2, 5 ml) gelöst und einer Chromatographie an saurem Silicagel (spezielles Silicagel der Sorte 922, Hersteller Fuji Devison Co.) (100 ml), unterworfen, das gefüllt und gewaschen wurde mit dem gleichen Lösungsmittelsystem. Das Eluieren wurde mit Ethylacetat durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man die gereinigte FR-900525-Substanz (230 mg) in Form eines weißen Pulvers erhielt.
    • Beispiel 4 Isolierung von Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238
  • Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238 wurde isoliert unter Anwendung der Verdünnungs-Platten-Methoden, wie sie nachstehend beschrieben werden.
  • Etwa 1 g Erdboden, der bei Yakushima in der Kagoshima-Präfektor, Japan, entnommen worden war, wurde in ein steriles Teströhrchen (Reagensglas) gegeben und das Volumen wurde mit sterilem Wasser auf 5 ml aufgefüllt. Die Mischung wurde dann 10 s lang mittels einer Rohr-Zentrifuge gemischt und 10 min lang stehen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit wurde anschließend mit sterilem Wasser auf das 100-fache verdünnt. Die verdünnte Lösung (0,1 ml) wurde in einem mit Thiaminhydrochlorid ergänzten Czapek-Agar (30 g Saccharose, 3 g Natriumnitrat, 1 g Dikaliumphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,01 g Eisen(II)sulfat, 0,1 g Thiaminhydrochlorid, 20 g Agar, 1000 ml Leitungswasser; pH 7,2) in einer Petrischale ausgestrichen. Die wachsenden Kolonien, die sich auf den Platten nach 20-tägiger Inkubation bei 30ºC entwickelt hatten, wurden in Schrägkulturen [Hefe-Malzextakt-Agar (ISP-Medium 2)] überführt und 10 Tage lang bei 30ºC kultiviert. Unter den isolierten Kolonien konnte das Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238 gefunden werden.
    • Fermentation
  • Ein Kulturmedium (160 ml), das Glycerin (1%), lösliche Stärke (1%), Glucose (0,5%), Baumwollsamenmehl (0,5 %), getrocknete Hefe (0,5%), Maisquellwasser (0,5%) und Calciumcarbonat (0,2%) enthielt (eingestellt auf pH 6,5), wurde in jeden von zwanzig 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und 30 min lang bei 120ºC sterilisiert. Eine Ösenfüllung einer Schrägkulture von Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238, FERM BP-928, wurde in jedes der Medien inokuliert und 4 Tage lang auf einem Rotationsschüttler bei 30ºC kultiviert. Die resultierende Kultur wurde in ein Medium, das Glucose (4,5%), Maisquellwasser (1%), getrocknete Hefe (1%), Glutenmehl (1 %), Weizenkeime (0,5%), Calciumcarbonat (0,1%) und Adecanol (Entschäumungsmittel, Warenzeichen für ein Produkt der Firma Sahi Denka Co.) (1%) enthielt (150 l), in einem 200 l-Kolben-Fermenter inokuliert, der vorher 20 min lang bei 120ºC sterilisiert worden war, und 4 Tage lang unter Belüften mit 150 l/min und unter Rühren mit 250 UpM bei 30ºC kultiviert.
    • Isolierung und Reinigung
  • Die so erhaltene Kulturbrühe wurde mit Hilfe von Diatomeenerde (5 kg) filtriert. Der Mycel-Kuchen wurde mit Aceton (50 l) extrahiert, wobei man 50 l Extrakt erhielt. Der Aceton-Extrakt aus dem Mycel und das Filtrat (135 l) wurden miteinander vereinigt und über eine Säule eines nicht-ionischen Adsorptionsharzes ("Diaion HP-20" Warenzeichen für ein Produkt der Firma Misubishi Chemical Industries Ltd.) (10 ml) laufen gelassen. Nach dem Waschen mit Wasser (30 l) und wäßrigem Aceton (30 l) wurde das Eluieren mit Aceton durchgeführt. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man Rückstandswasser (2 l) erhielt. Dieser Rückstand wurde mit Ethylacetat (4 l) extrahiert. Der Ethylacetat-Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man einen öligen Rückstand erhielt. Der ölige Rückstand wurde mit dem doppelten Gewicht saurem Silicagel (spezielles Silicagel der Sorte 12, Hersteller Fuji Devison Co.) gemischt und diese Mischung wurde in Ethylacetat aufgeschlämmt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das resultierende trockene Pulver einer Säulenchromatographie an dem gleichen sauren Silicagel (800 ml) unterworfen, das mit n-Hexan gefüllt war. Die Säule wurde mit n-Hexan (3 l), einem Gemisch aus n-Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 4 : 1, 3 l) und Ethylacetat (3 l) entwickelt.
  • Die die FR-900520- und FR-900523-Substanzen enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man einen öligen Rückstand erhielt.
  • Der ölige Rückstand wurde in einem Gemisch aus n-Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 1 : 1, 50 ml) gelöst und einer Säulenchromatographie an Silicagel (Hersteller Merck Co., Ltd., 70-230 mesh) (1000 ml) unterworfen, das mit dem gleichen Lösungsmittelsystem gepackt war. Das Eluieren wurde mit einem Gemisch von n-Hexan und Ethylacetat (Volumenverhältnis 1 : 1, 3 l, und Volumenverhältnis 1 : 2, 3 l) sowie mit Ethylacetat (3 l) durchgeführt. Die die Zielverbindungen enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man ein gelbliches Pulver (4,5 g) erhielt. Dieses Pulver in Methanol (20 ml) gelöst und mit Wasser (10 ml) gemischt. Die Mischung wurde chromatographiert an einem Umkehrphasen-Silicagel "YMC" (60-200 mesh) (500 ml) (Warenzeichen für ein Produkt der Firma Yamamura Chemical Institute), das gefüllt und entwickelt wurde mit einem Gemisch von Methanol und Wasser (Volumenverhältnis 4 : 1).
  • Die die FR-900520-Substanz enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man ein Rohprodukt der FR-900520-Substanz (1,8 g) in Form eines blassen gelblichen Pulvers erhielt. Dieses Pulver wurde in einer geringen Menge Diethyläther gelöst. Nach dem Stehenlassen über Nacht wurden die ausgefällten Kristalle durch Filtrieren gesammelt, mit Diethyläther gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Die Umkristallisation aus Diethyläther ergab 600 mg der gereinigten FR-900520-Substanz in Form von farblosen Platten.
  • Die Chromatographie an dem Umkehrphasen-Silicagel wurde mit dem gleichen Lösungsmittelsystem durchgeführt und die dabei erhaltenen Fraktionen, welche die FR-900523- Substanz enthielten, wurden gesammelt und dann unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man ein Rohprodukt der FR-900523-Substanz (0,51 g) in Form eines blassen gelblichen Pulvers erhielt. Dieses Rohprodukt wurde in Acetonitril (3 ml) gelöst und einer Chromatographie an einem Umkehrphasen-Silicagel "YMC" (70 ml), gefüllt und entwickelt mit einem Gemisch von Acetonitril, Tetrahydrofuran und einer 50 mM Phosphatpuffer-Lösung (pH 2,0) (Volumenverhältnis 3 : 2 : 5) unterworfen.
  • Die die Zielverbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und mit Ethylacetat extrahiert. Dieser Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man ein gelblich-weißes Pulver (190 mg) erhielt. Das gelblichweiße Pulver wurde erneut chromatographiert an einem Umkehrphasen-Silicagel "YMC" unter Bildung eines weißen Pulvers (80 mg). Dieses weiße Pulver wurde in einer geringen Menge Diethyläther gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei man 56 mg Kristalle erhielt. Die Umkristallisation aus Diethyläther ergab 34 mg der FR- 900523-Substanz in Form von farblosen Nadeln.
    • Beispiel 5
  • Zu einer Lösung der FR-900506-Substanz (10,4 mg) in Dichlormethan (0,2 ml) wurden Pyridin (0,1 ml) und Essigsäureanhydrid (0,05 ml) bei Raumtemperatur zugegeben und die Mischung wurde 5 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde aus dem Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Silicagel-Dünnschicht- Chromatographie unterworfen (Entwicklungslösungsmittel : Diethyläther und Dichlormethan (Volumenverhältnis 1 : 2), wobei man erhielt 12-[2-(4-A.cetoxy-3- inethoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-17-allyl-1,14-dihydroxy- 23,25-a-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4- azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16- tetraon (6.0 mg).
  • IR ν(CHCl&sub3;): 3520, 1728, 1705(sh), 1640, 1095 cm&supmin;¹
    • Beispiel 6
  • Zu einer Lösung der FR-900506-Substanz (52,5 mg) in Dichlormethan (1 l) wurden Pyridin (0,5 ml) und Essigsäureanhydrid (0,3 ml) bei Raumtemperatur zugegeben und die Mischung wurde 9 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde aus der Reaktionsmischung unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Silicagel-Dünnschicht-Chromatographie unterworfen (Entwicklungslösungsmittel:Diethyläther und Hexan, Volumenverhältnis 3 : 1), wobei man erhielt
  • 14-Acetoxy-12-[2-(4-acetoxy-3- methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-17-allyl-1-hydroxy-23,25- dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4- azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16- tetraon (48.0 mg) bzw. 12-[2-(4-Acetoxy-3-methoxycyclohexyl)- 1-methylvinyl]-17-allyl-1-hydroxy-23,25-dimethoxy- 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo- [22.3.1.04,9]octacosa-14,18-diene-2,3,10,16-tetraon (5.4 mg).
    • Erstgenannte Verbindung
  • IR ν(CHCl&sub3;): 1730, 1720(sh), 1640 cm&supmin;¹
    • Letztgenannte Verbindung
  • IR ν(CFCl&sub3;): 1730, 1690, 1640, 1627 cm&supmin;¹
    • Beispiel 7
  • Zu einer Lösung der FR-900506-Substanz (9,7 mg) in Dichlormethan (0,2 ml) und Pyridin (0,1 ml) wurde Benzoylclorid (50 ul) bei Raumtemperatur zugegeben und die Mischung wurde 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde aus der Reaktionsmischung unter vermindertem Druck entfernt, wobei man ein Rohöl erhielt. Dieses Öl wurde durch Silicagel-Dünnschicht-Chromatographie gereinigt (Entwicklungslösungsmittel::Diethyläther und Hexan, Volumenverhältnis 2 : 1), wobei man erhielt
  • 17-Allyl-12-[2-(4-benzoyloxy- 3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25-di- methoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4- azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon (8.0 mg).
  • IR ν(CHCl&sub3;) : 3500, 1735(sh), 1710, 1640, 1600 cm&supmin;¹
    • Beispiel 8
  • Zu einer Lösung der FR-900506-Substanz (30,5 mg mg) in Pyridin (1 ml) wurde p-Nitrobenzoylchlorid (etwa 100 mg) zugegeben und die Mischung wurde 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit einer gesättigten wäßrigen Natiumhydrogencarbonatlösung, Wasser, 1 N Chlorwasserstoffsäure, Wasser, einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonnatlösung, Wasser und einer wäßrigen Natriumchloridlösung nacheinander gewaschen und dann getrocknet. Die resultierende Lösung wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt, wobei man erhielt
    • Beispiel 9
  • 17-Allyl-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27- tetramethyl-12-[2[4-(3,5-dinitrobenzoyloxy)-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon (36,0 mg) wurde erhalten durch Umsetzung der FR-900506-Substanz (30,6 mg) mit 3,5-Dinitrobenzoylchlorid (33 mg) in Pyridin (0,5 ml) auf ähnliche Weise wie in Beispiel 8.
  • IR ν(CHCl&sub3;) : 1730, 1640, 1610, 1530-1520 cm&supmin;¹
    • Beispiel 10
  • 17-Allyl-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-12-[2-[4-(2- l-menthyloxyacetoxy)-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl)- 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon (50,9 mg) wurde erhalten durch Umsetzung der FR-900506-Substanz (48 mg) mit 2-l-Menthyloxyacetylchlorid (0,08 ml) in Pyridin (0,5 ml) auf ähnliche Weise wie in Beispiel 8.
  • IR ν(rein) : 3520, 1760, 1740(sh), 1720(sh) 1652 cm&supmin;¹
    • Beispiel 11
  • Zu einer Lösung der (-)-2-Trifluoromethyl-2-methoxy- 2-phenylessigsäure (51 mg) in Ethylacetat (10 ml) wurde bei Raumtemperatur N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (47 mg) zugegeben. Nach 1,5-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurden dann die FR-900506-Substanz (25,0 mg) und 4-(N,N- Dimethylamino)pyridin (11 mg) zugegeben, danach wurde 3,5 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde eingeengt, wobei man einen Rückstand erhielt, der in Diethyläther aufgenommen und dann nacheinander mit Chlorwasserstoffsäure, einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung und einer wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt, wobei man einen Rückstand erhielt, der an Silicagel chromatographiert wurde (Emtwicklungslösungsmittel : Dichlormethan und Diethyläther, Volumenverhältnis 10 : 1), wobei man erhielt
  • 17-Allyl-12-[2-[4-[(-)-2-trifluoromethyl-2-methoxy-2- phenylacetoxy]-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]- 1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl- 11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en- 2,3,10,16-tetraon (6.5 mg) und 17-Allyl-14-[(-)-2- trifluoromethyl-2-methoxy-2-phenylacetoxy]-12-[2-[4- [(-)-2-trifluormethyl-2-methoxy-2-phenylacetoxy-3- methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-1-hydroxy-23,25- dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo- [22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon (20.2 mg).
    • Erstgenannte Verbindung
  • IR ν(rein) : 3510, 1750, 1730(sh), 1710, 1652, 1500 cm&supmin;¹
    • Letztgenannte Verbindung
  • IR ν(rein) : 1750, 1720, 1652, 1500 cm&supmin;¹
    • Beispiel 12
  • Zu einer gerührten Lösung der FR-900506-Substanz (248 mg) in Pyridin (7 ml) wurden Bernsteinsäureanhydrid (145 mg) und 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin (7 mg) zugegeben und die resultierende Mischung wurde 18 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand wurde einer Chromatographie an Silicagel (20 g) mit Ethylacetat unterworfen, wobei man erhielt
  • [4-(3-carboxypropionyloxy)-3-methoxycyclohexyl]-1- methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27- tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos- 18-en-2,3,10,16-tetraon (90 mg).
  • IR ν(CHCl&sub3;) : 3500, 3100-2300, 1720, 1705(sh), 1635 cm&supmin;¹
    • Beispiel 13
  • Zu einer Lösung der FR-900506-Substanz (100,7 mg) in Pyridin (3 ml) wurde p-Jodobenzolsulfonylchlorid (500 mg) zugegeben und die Mischung wurde 36 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung mit Ethylacetat verdünnt und mit einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung, mit Wasser und einer wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde an Silicagel chromatographiert (Entwicklunglslösungsmittel:Diethyläther und Hexan, Volumenverhältnis 3 : 1), wobei man erhielt 17-Allyl-1,14-dihydroxy-12-[2-[4-(p-jodobenzol-sulfonyloxy)-3-methoxycyclohexyl]-1- methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28- dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en -2,3,10,16- tetraon (61 mg) bzw. 17-Allyl-1-hydroxy-12-[2-[4-(4- jodobenzol-sulfonyloxy)-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4- azatricyclo[22.3.1.04,9]octacosa-14,18-dien -2,3,10,16- tetran (12 mg).
    • Erstgenannte Verbindung
  • IR ν(CHCl&sub3;) : 3470, 1730, 1717, 1692, 1635, 1568 cm&supmin;¹ Letztgenannte Verbindung
    • Beispiel 14
  • 17-Allyl-12-[2-[4-d-kampfersulfonyloxy-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy- 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo- [22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon (34 mg) wurde erhalten durch Umsetzung der FR-9000506-Substanz (27 mg) mit d-Kampfersulfonylchlorid (97 mg) in Pyridin (0,6 ml) auf ähnliche Weise wie in Beispiel 13.
  • IR ν(rein) : 3500, 1747, 1720(sh), 1710(sh) 1655 cm&supmin;¹
    • Beispiel 15
  • Zu einer gerührten Lösung der FR-900506-Substanz (89,7 mg) in Dichlormethan (3 ml) wurden Imidazol (118 mg) und tert-Butyl-diphenylsilylchlorid (52,2 mg) zugegeben nachdem die Mischung 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt werden war, wurde die Reaktionsmischung mit gesätigtem wäßrigem Ammoniumchlorid verdünnt und 3 mal mit Diethyläther extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser und mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt (Entwicklunglslösungsmittel-:Ethylacetat und n-Hexan, Volumenverhältnis 1 : 3), wobei man erhielt
  • 17-Allyl-12-[2-(4-tert-butyl-diphenylsilyloxy-3- methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25- dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4- azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon (107 mg).
  • IR ν(rein) : 3520, 1742, 1705, 1650 cm&supmin;¹
    • Beispiel 16
  • 17-Allyl-12-[2-(4-tert-butyl-dimethylsilyloxy-3-metoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo- [22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon (85 mg) wurde erhalten durch Umsetzung der FR-900506-Substanz (80 mg) mit tert-Butyl-dimethylsilylchlorid (17 mg) in Gegenwart von Imidazol (15 mg) in N,N-Dimethylformamid (1 ml) auf ähnliche Weise wie in Beispiel 15.
  • IR ν(ChCl&sub3;) : 1735, 1720(sh), 1700, 1640 cm&supmin;¹
    • Beispiel 17
  • Zu einer Lösung der FR-900506-Substanz (100 mg) in Dimethylsulfoxid (1,5 ml) wurde Essigsäureanhydrid (1,5 ml) zugegeben und die Mischung wurde 14 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung, mit Wasser und einer wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde einer Dünnschicht-Chromatographie an Silicagel unterworfen (Entwicklunglslösungsmittel:Diethyläther), wobei man erhielt 17-Allyl-1,14- dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-12- [2-(4-methylthiomethoxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]- 11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacosa-14,18-dien- 2,3,10,16-tetraon (51 mg), 17-Allyl-1-hydroxy-12- [2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25- dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4- azatricyclo[22.3.1.04,9]octacosa-14,18-dien-2,3,10,16- tetraon (18 mg) bzw. 17-Allyl-1,14-dihydroxy-23,25- dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-12-[2-(4- methylthiomethoxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]- 11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en- 2,3,10,16-tetraon (10 mg).
    • Erstgenannte Verbindung
  • IR ν(CHCl&sub3;) : 3470, 1730, 1635, 1630(sh) 1580 (sh) cm&supmin;¹
    • Zweitgenannte Verbindung
  • IR ν(CHCl&sub3;) : 1723, 1640, 1090 cm&supmin;¹
    • Drittgenannte Verbindung
  • IR ν(CHCl&sub3;) : 3480, 1735, 1710, 1640 cm&supmin;¹
    • Beispiel 18
  • Zu einer Lösung von 17-Allyl-12-[2-[4-tert-butyl-dimethylsilyloxy-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-1,14- dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28- dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9)octacos-18-en-2,3,10,16- tetraon (39,9 mg) in Pyridin (1,5 ml) wurde Essigsäureanhydrid (0,5 ml) zugegeben und dann wurde die Mischung 6 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck aus der Reaktionsmischung entfernt, wobei man ein rohes Öl erhielt, das durch Silicagel-Dünnschichtchromatographie gereinigt wurde (Entwicklunglslösungsmittel : Diethyläther und Hexan, Volumenverhältnis 1 : 1), unter Bildung von 14-Acetoxy-17-allyl-12-[2-(4- tert-butyl-dimethylsilyloxy-3-methoxycyclohexyl)-1- methylvinyl]-1-hydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27- tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos- 18-en-2,3,10,16-tetraon (26.5 mg).
  • IR ν(CHCl&sub3;) : 1728, 1715(sh), 1635 cm&supmin;¹
    • Beispiel 19
  • 14-Acetoxy-17-allyl-12-[2-(4-tert-butyldiphenylsilyloxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl)-1- hydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28- dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16- tetraon (10 mg) wurde erhalten durch Umsetzung von 17-Allyl-12-[2- (4-tert-butyl-diphenylsilyloxy-3-methoxycyclohexyl)-1- methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27- tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos- 18-en-2,3,10,16-tetraon (10.6 mg) mit Essigsäureanhydrid (0,1 mg) in Pyridin (0,2 ml) auf ähnliche Weise wie in Beispiel 18.
  • IR ν(CHCl&sub3;) : 3500, 1730, 1720(sh), 1660(sh), 1640, 1620(sh), 1100 cm&supmin;¹
    • Beispiel 20
  • Zu einer Lösung von 14-Acetoxy-17-allyl-12-[2-(4- tert-butyl-diphenylsilyloxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-1-hydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl- 11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en- 2,3,10,16-tetraon (43,8 mg) in Tetrahydrofuran (1,5 ml) wurde Kaliumcarbonat (etwa 100 mg) bei Raumtemperatur zugegeben und die Mischung wurde 3 h lang bei der gleichen Temperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Diethyläther verdünnt und die resultierende Lösung wurde nacheinander mit einer gesättigten wäßrigen Ammoniumchloridlösung, mit Wasser und einer wäßrigen Ntriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die resultierende Lösung wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand wurde durch Silicagel-Dünnschichtchromatographie gereinigt (Entwicklunglslösungsmittel:Diethyläther und Hexan, Volumenverhältnis 3 : 2), wobei man erhielt 17-Allyl-12-[2-(4-tert-butyl-diphenylsilyloxy-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-1-hydroxy- 23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacosa-14,18-dien-2,3,10,16-tetraon (30 mg) erhielt
  • IR ν(CHCl&sub3;) : 1733, 1720(sh), 1685, 1640(sh), 1620 cm&supmin;¹
    • Beispiel 21
  • Eine Lösung der FR-900506-Substanz (50 mg) in Ethylacetat (2 ml) wurde einer katalytischen Reduktion unterworfen unter Verwendung von 10% Palladium auf Kohlenstoff (10 mg) unter Atmosphärendruck bei Raumtemperatur für 20 min. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft, dann wurde es durch Dünnschichtchromatographie gereinigt. Nach dem Entwickeln mit einem Gemisch von Chloroform und Aceton (Volumenverhältnis 5 : 1) erhielt man 1,14-Dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27- tetramethyl-17-propyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo- [22.3.1.04,9)octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon (50,0 mg).
  • IR ν(CHCl&sub3;) : 3480, 1735(sh), 1717, 1700, 1650(sh) 1625 cm&supmin;¹
    • Beispiel 22
  • Ein weißes Pulver der rohen FR-900506-Substanz (1 g), das nach einem ähnlichen Fermentationsverfahren wie in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in Acetonitril (5 ml) gelöst und einer Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) unterworfen unter Verwendung von Shimazu LC4A (Warenzei chen für ein Produkt der Firma Shimazu Seisaku-sho). Es wurde eine Stahlsäule (Innendurchmesser 25 mm, Länge 250 mm), die mit YMC-S343 (ODS) (Warenzeichen für ein Produkt der Firma Shimakyu Co., Ltd.) gefüllt war, bei einer Fließgeschwindigkeit von 12 ml/min verwendet. Die mobile Phase war ein wäßriges Gemisch von 28% Acetonitril, 10% n-Butanol, 0,075% Phosphorsäure, 3,75 mmol Natriumdodecylsulfat (SDS) und der Nachweis wurde durchgeführt unter Verwendung eines Hitachi UV-Rekorders bei 210 nm.
  • Es wurden jeweils 100 ul der Probe injiziert und die HPLC wurde 50 mal wiederholt, so daß die gesamte Probe der Säulenchromatographie unterworfen wurde. Jedes Eluat mit einer Retentionszeit von 85 bis 90 min wurde gesammelt und mit einem gleichen Volumen Ethylacetat (3,6 l) extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde abgetrennt und mit einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung (1%, 2 l) gewaschen und im Vakuum auf ein geringes Volumen eingeengt. Das beim Einengen auskristallisierende SDS wurde durch Filtrieren entfernt. Das erhaltene rohe Pulver wurde in Acetonitril in einer Konzentration von 100 mg/ml gelöst und erneut der HPLC unterworfen. Die mobile Phase war ein Wäßriges Gemisch von 12,5% Acetonitril, 9,75% n-Butanol, 0,075% Phosphorsäure, 3,75 mM SDS. Die Säule wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min eluiert. Die Eluate mit einer Retentionszeit von 131 bis 143 min wurden gesammelt und mit dem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt und mit einer 1 %igen wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und im Vakuum auf ein geringes Volumen eingeengt. Das beim einengen auskristallisierende SDS wurde durch Filtrieren entfernt.
  • Das so erhaltene rohe Pulver wurde in einer geringen Menge Ethylacetat gelöst und einer Säulenchromatographie unterworfen unter Verwendung von Silicagel (10 ml) (Kiesel-Gel, 230 bis 400 mesh, Hersteller Merck Co., Ltd.). Die Säule wurde mit einem Gemisch von n-Hexan und Ethylacetat (30 ml) (Volumenverhältnis 1 : 1) und einem Gemisch von n-Hexan und Ethylacetat (60 ml) (Volumenverhältnis 1 : 2) gewaschen. Das Eluieren wurde durchgeführt unter Verwendung von Ethylacetat und es wurde fraktioniert (jede Fraktion 3 ml). Die Fraktionen 18 bis 24 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei man die FR- 900520-Substanz (24 mg) erhielt.

Claims (26)

1. Verbindung der Formel
worin bedeuten:
R¹ Hydroxy oder in konventioneller Weise geschütztes Hydroxy,
R² Wasserstoff, Hydroxy oder in konventioneller Weise geschütztes Hydroxy,
R³ Methyl, Ethyl, Propyl oder Allyl,
n die ganze Zahl 1 oder 2 und
das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung,
mit der Maßgabe, daß dann, wenn R¹ und R² jeweils für Hydroxy stehen, n für die ganze Zahl 2 steht und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie für eine Einfachbindung steht, R³ Methyl, Propyl oder Allyl darstellt,
und ein Salz derselben.
2. Verbindung nach Anspruch 1, die durch die folgende Formel dargestellt werden kann
worin bedeuten:
R¹ Hydroxy oder in konventioneller Weise geschütztes Hydroxy,
R² Hydroxy oder in konventioneller Weise geschütztes Hydroxy und
R³ Methyl, Propyl oder Allyl.
3. Verbindung nach Anspruch 2, worin R³ für Allyl steht.
4. Verbindung nach Anspruch 3, worin R¹ für Hydroxy, 1-(C&sub1;-C&sub6;-Alkylthio) (C&sub1;-C&sub6;)alkoxy, Tri(C&sub1;-C&sub6;)alkylsilyloxy, C&sub1;-C&sub6;-Alkyl-diphenylsilyoxy oder Acyloxy steht.
5. Verbindung nach Anspruch 4, worin stehen:
R¹ für Hydroxy; C&sub1;-C&sub6;-Allkylthiomethoxy; Tri(C&sub1;- C&sub6;)alkylsilyloxy; C&sub1;-C&sub6;-Alkyl-diphenylsilyloxy; C&sub1;- C&sub6;-Alkanoyloxy, das Carboxy aufweisen kann; Cyclo(C&sub3;- C&sub6;)alkoxy(C&sub1;-C&sub6;)alkanoyloxy, das zwei C&sub1;-C&sub6;-Alkylgruppen an dem Cycloalkylrest aufweisen kann; Campfersulfonyloxy; Aroyloxy, das ein oder zwei Nitro aufweisen kann, wobei der Aroylrest ausgewählt wird aus der Gruppe, die beeht aus Benzoyl, Toluoyl, Xyloyl und Naphthoyl; Arensulfonyloxy, das Halogen aufweisen kann, wobei der Arenrest ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus Benzol, toluol, Xylol und Naphthalin; oder Phenyl(C&sub1;-C&sub4;)alkanoyloxy, das C&sub1;-C&sub6;- Alkoxy und Trihalogen(C&sub1;-C&sub6;)alkyl aufweisen kann, und
R² für Hydroxy oder C&sub1;-C&sub6;-Alkanoyloxy.
6. Verbindung nach Anspruch 5, bei der es sich handelt um 17-Allyl-1,14-dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3- methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy- 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo [22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
7. Verbindung nach anspruch 5, worin stehen:
R¹ für C&sub1;-C&sub6;-Alkanoyloxy und
R² für Hydroxy oder C&sub1;-C&sub6;-Alkanoyloxy.
8. Verbindung nach Anspruch 7, bei der es sich handelt um 12-[2-(4-Acetoxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]- 17-allyl-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27- tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]- octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
9. Verbindung nahc Anspruch 7, bei der es sich handelt um 14-Acetoxy-12-[2-(4-acetoxy-3-methoxycyclohexyl)-1- methylvinyl]-17-allyl-1-hydroxy-23,25-dimethoxy- 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo- [22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
10. Verbindung nach Anspruch 2, bei der es sich handelt um 1,14-Dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)- 1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,17,21,27- pentamethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]- octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
11. Verbindung nach Anspruch 1, worin stehen:
R¹ für Hydroxy, C&sub1;-C&sub6;-Alkylthiomethoxy, C&sub1;-C&sub6;-Alkanoyloxy oder Arensulfonyloxy, das Halogen aufweisen kann, wobei der Arenrest ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus Benzol, Toluol, Xylol und Naphthalin,
R² für Wasserstoff oder Hydroxy,
n für die ganze Zahl 2 und
das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie für eine Doppelbindung.
12. Verbindung nach Anspruch 1, bei der es sich handelt um 16-Allyl-1,13.dihydroxy-11-[2-(4-hydroxy-3- methoxycclohexyl)-1-methylvinyl]-22,24-dimethoxy- 12,18,20,26-tetramethyl-10,27-dioxa-4-azatricyclo- [21.3.1.04,8]heptacos-17-en-2,3,9,15-tetraon.
13. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel
worin bedeuten:
R¹ Hydroxy oder in konventioneller Weise geschütztes Hydroxy,
R² Wasserstoff, Hydroxy oder in konventioneller Weise geschütztes Hydroxy,
R³ Methyl, Ethyl, Propyl oder Allyl,
n die ganze Zahl 1 oder 2 und
das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung,
mit der Maßgabe, daß dann, wenn R¹ und R² jeweils für Hydroxy stehen, n für die ganze Zahl 2 steht und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie für eine Einfachbindung steht, R³ Methyl, Propyl oder Allyl darstellt,
und eines Salzes derselben, das umfaßt
a) das Kultivieren von Streptomyces tsukubaensis in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält,
und das Gewinnen (Abtrennen) der FR-900506- und/oder FR-900525-Substanz(en) auf konventionelle Weise unter Bildung der FR-900506-Substanz der Formel
und/oder der FR-900525-Substanz der Formel
b) das Kultivieren von Streptomyces hygroscopicus in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, und das Gewinnen (Abtrennen) der FR-900523-Substanz der nachstehend angegebenen Formel auf konventionelle Weise
c) das Einführen einer konventionellen Hydroxyschutzgruppe in eine Verbindung der Formel
worin R², R³, n und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie jeweils wie oben definiert sind,
unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin R², R³, n und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie jeweils wie oben definiert sind, und worin R¹a für in konventioneller Weise geschütztes Hydroxy steht,
oder eines Salzes derselben auf an sich bekannte Weise;
d) die Einführung einer konventionellen Hydroxyschutzgruppe in eine Verbindung der Formel
worin R¹, R³, n und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie jeweils wie oben definiert sind,
oder eines Salzes derselben unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin R¹, R³, n und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie jeweils wie oben definiert sind, und worin R²a für in konventioneller Weise geschütztes Hydroxy steht,
oder eines Salzes derselben auf an sich bekannte Weise;
e) die Umsetzung einer Verbindung der Formel
worin R¹, R³ und n jeweils wie oben definiert sind, und worin R²b für eine austretende Gruppe steht, oder eines Salzes derselben mit einer Base unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin R¹, R³ und n jeweils wie oben definiert sind,
oder eines Salzes derselben auf an sich bekannte Weise;
f) das Oxidieren einer Verbindung der Formel
worin R¹, R³ und n jeweils wie oben definiert sind, oder eines Salzes derselben unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin R¹, R³ und n jeweils wie oben definiert sind, oder eines Salzes derselben auf an sich bekannte Weise; und
g) das Reduzieren einer Verbindung der Formel
worin R¹, R², n und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie jeweils wie oben definiert sind,
oder eines Salzes derselben unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin R¹, R², n und das Symbol aus einer Linie und einer gestrichelten Linie jeweils wie oben definiert sind,
oder eines Salzes derselben auf an sich bekannte Weise.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Bestandteile (Wirkstoffe) Tricyclo-Verbindungen nach Anspruch 1 in Assoziation mit einem Pharmazeutisch akzeptablen, im Wesentlichen nicht-toxischen Träger oder Exzipienten enthält.
15. Verwendung der Tricyclo-Verbindungen nach Anspruch 1 und nach Anspruch 20 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Verhinderung der Resistenz durch Transplantation, der Transplantat-gegen-Wirt- Erkrankungen durch Knochenmarks-Transplantation und von Autoimmunerkrankungen.
16. Verwendung der Tricyclo-Verbindungen nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels.
17. Verwendung der Tricycloverbindungen nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Immununterdrückungsmittels oder eines antimikrobiellen Agens.
18. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993.
19. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238.
20. Verfahren zur Herstellung der FR-900520-Substanz der Formel
das umfaßt das Kultivieren von Streptomyces tsukubaensis oder Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238 in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, zur Bildung der FR-900520-Substanz.
21. Tricyclo-Verbindung nach Anspruch 1 für die Verwendung als Arzneimittel.
22. Tricyclo-Verbindung nach Anspruch 1 für die Verwendung als Immunuterdrückungsmittel.
23. Tricyclo-Verbindung nach Anspruch 1 für die, Verwendung als Immunuterdrückungsmittel nach Anspruch 22, wobei es sich bei der Tricyclo-Verbindung um die FR- 900506-Substanz der folgenden Formel handelt
24. Verfahren nach Anspruch 13 und nach Anspruch 20, wobei das Kultivieren unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird.
25. Verwendung des Mikroorganismus Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 zur Herstellung der FR-900506-Substanz der Formel
der FR-900525-Substanz der Formel
und/oder der FR-900520-Substanz der Formel
26. Verwendung des Mikroorganismus Streptonyoes hygrcscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238 zur Herstellung der FR-900523-Substanz der folgenden Formel
und/oder der FR-900520-Substanz der Formel
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