JPH05331072A - プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤 - Google Patents
プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤Info
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- JPH05331072A JPH05331072A JP4160354A JP16035492A JPH05331072A JP H05331072 A JPH05331072 A JP H05331072A JP 4160354 A JP4160354 A JP 4160354A JP 16035492 A JP16035492 A JP 16035492A JP H05331072 A JPH05331072 A JP H05331072A
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- JP
- Japan
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- pro
- val
- leu
- peptide
- prolyl endopeptidase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規かつ有用なプロリルエンドペプチダーゼ
阻害剤の提供 【構成】 Ｌ体のアミノ酸から構成される下記のペプチ
ド及びその酸付加塩の少なくとも１種を有効成分として
含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤： Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His,
His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-H
is-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val,Pro-Pr
o-Pro-Val, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His
-Pro, Lys-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile及び Thr-Pro
-Pro-Val。
阻害剤の提供 【構成】 Ｌ体のアミノ酸から構成される下記のペプチ
ド及びその酸付加塩の少なくとも１種を有効成分として
含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤： Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His,
His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-H
is-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val,Pro-Pr
o-Pro-Val, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His
-Pro, Lys-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile及び Thr-Pro
-Pro-Val。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はプロリルエンドペプチダ
ーゼ阻害剤に関し、さらに詳しくは近年増加の傾向にあ
り対策が望まれている痴呆症の予防及び／または治療に
有用な医薬品又は食品に利用できることが期待されてい
るプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関するものであ
る。
ーゼ阻害剤に関し、さらに詳しくは近年増加の傾向にあ
り対策が望まれている痴呆症の予防及び／または治療に
有用な医薬品又は食品に利用できることが期待されてい
るプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】プロリルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.2
1.26) は、最初、オキシトシン不活性化酵素として１９
７１年にWalterらによってヒト子宮中に発見され、その
後、子ヒツジやウシ脳から単一に精製された（Science
173 , 827 (1971),Molecular &Cellular Biochemistry
30, 111 (1980), 日本農芸化学会誌 58，1147(198
4))。また、同様の酵素が Flavobacterium属細菌から
も発見されている(J.Biol.Chem. 255 , 4786 (1980) 。
一方、脳内には、バソプレシン及びバソプレシン誘導体
〔pGlu4, Cyt6 〕AVP-(4-9) の存在が確認されている
が、これらのペプチドはステップスルー型受動的回避学
習法で記憶保持活性があるとされている (Science 221,
1310 (1983),Nature 308, 276 (1984))。
1.26) は、最初、オキシトシン不活性化酵素として１９
７１年にWalterらによってヒト子宮中に発見され、その
後、子ヒツジやウシ脳から単一に精製された（Science
173 , 827 (1971),Molecular &Cellular Biochemistry
30, 111 (1980), 日本農芸化学会誌 58，1147(198
4))。また、同様の酵素が Flavobacterium属細菌から
も発見されている(J.Biol.Chem. 255 , 4786 (1980) 。
一方、脳内には、バソプレシン及びバソプレシン誘導体
〔pGlu4, Cyt6 〕AVP-(4-9) の存在が確認されている
が、これらのペプチドはステップスルー型受動的回避学
習法で記憶保持活性があるとされている (Science 221,
1310 (1983),Nature 308, 276 (1984))。
【０００３】芳本と鶴は、記憶の固定場所とされている
脳の海馬部分にプロリルエンドペプチダーゼの高い活性
が観られたことと、脳のプロリルエンドペプチダーゼが
バソプレシンのような１０アミノ酸程度以下のぺプチド
によく作用する点に注目し、通常は脳でのプロリルエン
ドペプチダーゼが正常に働いているが何らかの理由で調
節機構が外れると、バソプレシンが必要以上に分解さ
れ、記憶保持に障害が現れると考え、Z-Gly-Pro-CH2Cl,
Z-Pro-prolinal, Z-Val-prolinal, Boc-Pro-prolinal
などのプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を合成し、こ
れらが抗健忘作用を示すことを確認した（日本農芸化学
会誌 58 (111), 1147 (1984) 、化学と生物 25 (9),
554 (1987)) 。また最近では、微生物や食品成分に由来
するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤も発見されてい
る（Agric. Biol. Chem. 55, 825(1991)、特開平 3-31
298、1990年薬学会年会講演要旨集 p.119) 。
脳の海馬部分にプロリルエンドペプチダーゼの高い活性
が観られたことと、脳のプロリルエンドペプチダーゼが
バソプレシンのような１０アミノ酸程度以下のぺプチド
によく作用する点に注目し、通常は脳でのプロリルエン
ドペプチダーゼが正常に働いているが何らかの理由で調
節機構が外れると、バソプレシンが必要以上に分解さ
れ、記憶保持に障害が現れると考え、Z-Gly-Pro-CH2Cl,
Z-Pro-prolinal, Z-Val-prolinal, Boc-Pro-prolinal
などのプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を合成し、こ
れらが抗健忘作用を示すことを確認した（日本農芸化学
会誌 58 (111), 1147 (1984) 、化学と生物 25 (9),
554 (1987)) 。また最近では、微生物や食品成分に由来
するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤も発見されてい
る（Agric. Biol. Chem. 55, 825(1991)、特開平 3-31
298、1990年薬学会年会講演要旨集 p.119) 。
【０００４】一方、トウモロコシ、大豆、ニンジンなど
の植物は、プロリンを多く含む蛋白質を生産しており、
それらには Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu, Pro-Pro-Val-Ty
r-Lys, Pro-Pro-Ile-Tyr-Lys, Pro-Pro-Val-Tyr-Thr,
Pro-Pro-Val-His-Lys などアミノ酸５〜６残基のペプチ
ドが繰り返し配列として存在している（The Journalof
Biological Chemistry 262, 8367 (1987)) 。特に、ト
ウモロコシ蛋白質はプロラミンを50〜60％、グルテリン
を35〜40％含み、主成分であるプロラミンはゼイン(zei
n)と呼ばれる。ゼインはα、β、γの３種に分けられ
（J.Cereal Sci.5, 117 (1987))、γ−ゼイン中には Pr
o-Pro-Pro-Val-His-Leuを基本単位とする６回繰り返し
構造及びプロリンが１つ置きに並んだ配列 Pro-Arg-Pro
-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-Proが含まれている (Nu
cleic Acids Res.13 (5), 1493 (1985))。
の植物は、プロリンを多く含む蛋白質を生産しており、
それらには Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu, Pro-Pro-Val-Ty
r-Lys, Pro-Pro-Ile-Tyr-Lys, Pro-Pro-Val-Tyr-Thr,
Pro-Pro-Val-His-Lys などアミノ酸５〜６残基のペプチ
ドが繰り返し配列として存在している（The Journalof
Biological Chemistry 262, 8367 (1987)) 。特に、ト
ウモロコシ蛋白質はプロラミンを50〜60％、グルテリン
を35〜40％含み、主成分であるプロラミンはゼイン(zei
n)と呼ばれる。ゼインはα、β、γの３種に分けられ
（J.Cereal Sci.5, 117 (1987))、γ−ゼイン中には Pr
o-Pro-Pro-Val-His-Leuを基本単位とする６回繰り返し
構造及びプロリンが１つ置きに並んだ配列 Pro-Arg-Pro
-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-Proが含まれている (Nu
cleic Acids Res.13 (5), 1493 (1985))。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明はプロリルエン
ドペプチダーゼ阻害作用を有し、従って痴呆症治療及び
／または予防薬として、または日常の摂取を通して痴呆
症等の症状の予防を図る機能性食品として有用であるこ
とが期待される特定のペプチド系プロリルエンドペプチ
ダーゼ阻害剤を提供することを目的とする。
ドペプチダーゼ阻害作用を有し、従って痴呆症治療及び
／または予防薬として、または日常の摂取を通して痴呆
症等の症状の予防を図る機能性食品として有用であるこ
とが期待される特定のペプチド系プロリルエンドペプチ
ダーゼ阻害剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】多くのプロリルエンドペ
プチダーゼ阻害剤は分子中にプロリン（Pro)を有し、ま
た幾つかの食用植物は、プロリンを多く含む蛋白質を生
産しており、それらには、Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu, P
ro-Pro-Val-Tyr-Lys, Pro-Pro-Ile-Tyr-Lys,Pro-Pro-Va
l-Tyr-Thr, Pro-Pro-Val-His-Lysなどアミノ酸５〜６残
基のペプチドが繰り返し配列として存在している。本発
明者らはこれらの事実より、植物蛋白質を蛋白質分解酵
素（プロテアーゼ）で処理することにより、プロリルエ
ンドペプチダーゼ阻害剤を安価に大量生産できる可能性
があると考え、上記繰り返し配列に関連した種々のペプ
チドを化学合成し、それらのプロリルエンドペプチダー
ゼに対する作用を調査した。その結果、下記ペプチドが
プロリルエンドペプチダーゼを阻害することを見い出し
た。
プチダーゼ阻害剤は分子中にプロリン（Pro)を有し、ま
た幾つかの食用植物は、プロリンを多く含む蛋白質を生
産しており、それらには、Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu, P
ro-Pro-Val-Tyr-Lys, Pro-Pro-Ile-Tyr-Lys,Pro-Pro-Va
l-Tyr-Thr, Pro-Pro-Val-His-Lysなどアミノ酸５〜６残
基のペプチドが繰り返し配列として存在している。本発
明者らはこれらの事実より、植物蛋白質を蛋白質分解酵
素（プロテアーゼ）で処理することにより、プロリルエ
ンドペプチダーゼ阻害剤を安価に大量生産できる可能性
があると考え、上記繰り返し配列に関連した種々のペプ
チドを化学合成し、それらのプロリルエンドペプチダー
ゼに対する作用を調査した。その結果、下記ペプチドが
プロリルエンドペプチダーゼを阻害することを見い出し
た。
【０００７】すなわち、本発明はＬ体のアミノ酸から構
成される下記ペプチド及びその酸付加塩のすくなくとも
１種を有効成分として含有するプロリルエンドペプチダ
ーゼ阻害剤： Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His,
His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-H
is-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val,Pro-Pr
o-Pro-Val, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His
-Pro, Lys-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile, 及び Thr-P
ro-Pro-Valに関する。
成される下記ペプチド及びその酸付加塩のすくなくとも
１種を有効成分として含有するプロリルエンドペプチダ
ーゼ阻害剤： Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His,
His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-H
is-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val,Pro-Pr
o-Pro-Val, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His
-Pro, Lys-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile, 及び Thr-P
ro-Pro-Valに関する。
【０００８】ここで酸付加塩は、製薬上許容される酸
（無機酸及び有機酸）付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素
酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、マレイン
酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸
塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホ
ン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等を包含す
る。また付加する酸の当量は、０当量より大からペプチ
ド中の塩基性アミノ酸残基、 His 、Arg 、Lys の総数
＋１と等しい当量まで可能である。
（無機酸及び有機酸）付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素
酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、マレイン
酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸
塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホ
ン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等を包含す
る。また付加する酸の当量は、０当量より大からペプチ
ド中の塩基性アミノ酸残基、 His 、Arg 、Lys の総数
＋１と等しい当量まで可能である。
【０００９】本願の特許請求の範囲中のペプチドは既知
の植物蛋白質の配列中に存在するが、そのフラグメント
であってかつ未だ知られていなかった有用性を有する。
かかる観点からアンジオテンシン変換酵素阻害剤等とし
て既知のものを除いた下記ペプチドは本発明者らの知る
限りにおいて新規化合物である： His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, L
eu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gl
n-Pro-His-Pro, Lys-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile 及
び Thr-Pro-Pro-Val。 なお、本願の特許請求の範囲のペプチド中、Val-His-Le
u-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His及びHis-Leu-
Pro-Pro-Pro-Val は公知である（特開平２−３６１２
７，Agric.Biol. Chem. 53, 1077 (1989))。
の植物蛋白質の配列中に存在するが、そのフラグメント
であってかつ未だ知られていなかった有用性を有する。
かかる観点からアンジオテンシン変換酵素阻害剤等とし
て既知のものを除いた下記ペプチドは本発明者らの知る
限りにおいて新規化合物である： His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, L
eu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gl
n-Pro-His-Pro, Lys-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile 及
び Thr-Pro-Pro-Val。 なお、本願の特許請求の範囲のペプチド中、Val-His-Le
u-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His及びHis-Leu-
Pro-Pro-Pro-Val は公知である（特開平２−３６１２
７，Agric.Biol. Chem. 53, 1077 (1989))。
【００１０】本発明で使用するペプチドは通常有機化学
的な合成方法によりアミノ酸を段階的に導入する方法、
または天然蛋白質の酵素加水分解法により製造される
が、また、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合
成法、遺伝子工学的方法等によって製造することも可能
である。これまで多くのペプチド合成方法が知られてお
り、例えば泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典、
「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株）に詳細に記載
されている。本発明で用いるペプチドはこれらの合成法
のいずれかによって、例えばいわゆる固相ペプチド合成
または液相ペプチド合成によって製造することができ
る。
的な合成方法によりアミノ酸を段階的に導入する方法、
または天然蛋白質の酵素加水分解法により製造される
が、また、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合
成法、遺伝子工学的方法等によって製造することも可能
である。これまで多くのペプチド合成方法が知られてお
り、例えば泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典、
「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株）に詳細に記載
されている。本発明で用いるペプチドはこれらの合成法
のいずれかによって、例えばいわゆる固相ペプチド合成
または液相ペプチド合成によって製造することができ
る。
【００１１】液相ペプチド合成は上述の「ペプチド合成
の基礎と実験」に記載されており、それにしたがって、
たとえば本ペプチドのＣ末端に位置するべきアミノ酸で
あってそのカルボキシル基がベンジル基（Bzl)、ｔ−ブ
チル基（t-Bu) 等で保護されたアミノ酸とＣ末端アミノ
酸に隣接して位置するべきアミノ酸であってそのα−ア
ミノ基がｔ−ブチルオキシカルボニル基(Boc) 、ベンジ
ルオキシカルボニル基(z) 等で保護されたアミノ酸をジ
メチルホルムアミド(DMF) 、ジメチルアセトアミド等に
溶解し、それらをジシクロヘキシルカルボジイミド(DC
C) 及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)の存
在下室温で一夜反応させることによって行うことができ
る。ついで生成物のアミノ保護基の常法による除去の後
に得られるジペプチドをアミノ保護した第３のアミノ酸
と同様に反応してアミノ保護基を除去し、ついで同様な
手順を繰り返して本ペプチドを得る。反応させるアミノ
酸が反応に関与すべきでないα位以外のアミノ基、グア
ニジノ基またはイミダゾリル基を有する場合には、これ
らの基は一般に反応に先立って保護すべきである。アル
コール性ヒドロキシル基の保護基 Bzl等包含し、α位以
外のアミノ基の保護基はα−アミノ基の保護基として述
べたものを包含し、グアニジノ基の保護基はトシル基
(Tos)等を包含し、イミダゾリル基の保護基は Tos等を
包含する。これらの保護基の導入は常法によって、例え
ば上述の「ペプチド合成の基礎と実験」に記載されたよ
うにして行うことができる。最終反応の終了後、これら
の保護基を除去するが、これらの脱保護は常法によっ
て、例えば上述の「ペプチド合成の基礎と実験」に記述
されたようにして行うことができる。例えば、アミノ保
護基については Bocはトリフルオロ酢酸(TFA) またはギ
酸によって、Ｚは接触還元によって、カルボキシル保護
基については、Bzl は、例えば、接触還元によって、ｔ
−Buは TFAまたは HCl／ジオキサンによって除去するこ
とができる。さらに、アルコール性ヒドロキシル基につ
いては、Bzl は、例えば、接触還元またはHFによって、
グアニジノ及びイミダゾリル保護基については TosはNa
/NH3またはHFによって除去することができる。
の基礎と実験」に記載されており、それにしたがって、
たとえば本ペプチドのＣ末端に位置するべきアミノ酸で
あってそのカルボキシル基がベンジル基（Bzl)、ｔ−ブ
チル基（t-Bu) 等で保護されたアミノ酸とＣ末端アミノ
酸に隣接して位置するべきアミノ酸であってそのα−ア
ミノ基がｔ−ブチルオキシカルボニル基(Boc) 、ベンジ
ルオキシカルボニル基(z) 等で保護されたアミノ酸をジ
メチルホルムアミド(DMF) 、ジメチルアセトアミド等に
溶解し、それらをジシクロヘキシルカルボジイミド(DC
C) 及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)の存
在下室温で一夜反応させることによって行うことができ
る。ついで生成物のアミノ保護基の常法による除去の後
に得られるジペプチドをアミノ保護した第３のアミノ酸
と同様に反応してアミノ保護基を除去し、ついで同様な
手順を繰り返して本ペプチドを得る。反応させるアミノ
酸が反応に関与すべきでないα位以外のアミノ基、グア
ニジノ基またはイミダゾリル基を有する場合には、これ
らの基は一般に反応に先立って保護すべきである。アル
コール性ヒドロキシル基の保護基 Bzl等包含し、α位以
外のアミノ基の保護基はα−アミノ基の保護基として述
べたものを包含し、グアニジノ基の保護基はトシル基
(Tos)等を包含し、イミダゾリル基の保護基は Tos等を
包含する。これらの保護基の導入は常法によって、例え
ば上述の「ペプチド合成の基礎と実験」に記載されたよ
うにして行うことができる。最終反応の終了後、これら
の保護基を除去するが、これらの脱保護は常法によっ
て、例えば上述の「ペプチド合成の基礎と実験」に記述
されたようにして行うことができる。例えば、アミノ保
護基については Bocはトリフルオロ酢酸(TFA) またはギ
酸によって、Ｚは接触還元によって、カルボキシル保護
基については、Bzl は、例えば、接触還元によって、ｔ
−Buは TFAまたは HCl／ジオキサンによって除去するこ
とができる。さらに、アルコール性ヒドロキシル基につ
いては、Bzl は、例えば、接触還元またはHFによって、
グアニジノ及びイミダゾリル保護基については TosはNa
/NH3またはHFによって除去することができる。
【００１２】一方、固相ペプチド合成については、ペプ
チドシンセサイザー（例えばアプライドバイオシステム
ズ社によって生産された４３０Ａ型ペプチドシンセサイ
ザー）を用いる合成が最近広く用いられている。すなわ
ち、この方法においては基本的には、アミノ基が Bocで
保護されたα−アミノ酸（Boc −アミノ酸）を、出発物
質としての、例えば、L-Pro が結合したフェニルアセト
アミドメチル（PAM)樹脂、すなわち、L-Pro-O-CH2 -PAM
( アプライドバイオシステムズ社より入手し得る) のＮ
−側からペプチドと Bocの除去の繰り返しによって段階
的に延長する。Boc-Arg(Mts)(Mtsはメシチレン-2- スル
ホニルである）及び Boc-L-Glnは中間体として１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール(HOBT)を経由する延長反応に
付し、他のBoc-アミノ酸は中間体として DCCを使用する
対称無水物を経由する延長反応に付す。上記 Boc- アミ
ノ酸においては、反応性官能基がある場合には、一般に
それを適当な保護基によって保護するべきである。本発
明に関して保護 Boc- アミノ酸の例は Boc-L-Arg(Mts)
、Boc-L-Lys(Cl-Z)(Cl-Zは4 −クロロベンジルオキシ
カルボニルである）、Boc-L-Thr(Bzl)、Boc-L-His(DNP)
(DNPは２，４−ジニトロフェニルである）等である。
チドシンセサイザー（例えばアプライドバイオシステム
ズ社によって生産された４３０Ａ型ペプチドシンセサイ
ザー）を用いる合成が最近広く用いられている。すなわ
ち、この方法においては基本的には、アミノ基が Bocで
保護されたα−アミノ酸（Boc −アミノ酸）を、出発物
質としての、例えば、L-Pro が結合したフェニルアセト
アミドメチル（PAM)樹脂、すなわち、L-Pro-O-CH2 -PAM
( アプライドバイオシステムズ社より入手し得る) のＮ
−側からペプチドと Bocの除去の繰り返しによって段階
的に延長する。Boc-Arg(Mts)(Mtsはメシチレン-2- スル
ホニルである）及び Boc-L-Glnは中間体として１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール(HOBT)を経由する延長反応に
付し、他のBoc-アミノ酸は中間体として DCCを使用する
対称無水物を経由する延長反応に付す。上記 Boc- アミ
ノ酸においては、反応性官能基がある場合には、一般に
それを適当な保護基によって保護するべきである。本発
明に関して保護 Boc- アミノ酸の例は Boc-L-Arg(Mts)
、Boc-L-Lys(Cl-Z)(Cl-Zは4 −クロロベンジルオキシ
カルボニルである）、Boc-L-Thr(Bzl)、Boc-L-His(DNP)
(DNPは２，４−ジニトロフェニルである）等である。
【００１３】４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーを用い
る合成系においては、アミノ酸物質以外に以下の試薬及
び溶媒を用いる：Ｎ，Ｎ−ジイソプピルエチルアミン
（TFAニュートラライザー), TFA (Boc 切断), MeOH(生
成した尿素化合物の溶解及び除去), HOBT (0.5M HOBT/D
MF), DCC (0.5M DCC/ ジクロロメタン(DCM), DCM 及び
DMF(溶媒, ニュートラライザー (70％ エタノールアミ
ン，29.5％メタノール）（廃液の中和）。アミノ酸物質
及びこれらの試薬及び溶媒を定められた所に装備する。
これらの物質の使用はペプチドシンセサイザーによって
自動的に行われる。反応温度及び時間の設定も自動的に
なされるが、反応温度は通常室温である。上記手段によ
ってペプチド中の反応性官能基が保護されたペプチド -
O-CH2-PAMが得られる。上記固相ペプチド合成の実験の
操作はアプライドバイオシステムズ社による４３０Ａ型
ペプチドシンセサイザーユーザーズマニュアル（Part N
umber 900066, Version 1.3B, July 1, 1988) に従って
行った。
る合成系においては、アミノ酸物質以外に以下の試薬及
び溶媒を用いる：Ｎ，Ｎ−ジイソプピルエチルアミン
（TFAニュートラライザー), TFA (Boc 切断), MeOH(生
成した尿素化合物の溶解及び除去), HOBT (0.5M HOBT/D
MF), DCC (0.5M DCC/ ジクロロメタン(DCM), DCM 及び
DMF(溶媒, ニュートラライザー (70％ エタノールアミ
ン，29.5％メタノール）（廃液の中和）。アミノ酸物質
及びこれらの試薬及び溶媒を定められた所に装備する。
これらの物質の使用はペプチドシンセサイザーによって
自動的に行われる。反応温度及び時間の設定も自動的に
なされるが、反応温度は通常室温である。上記手段によ
ってペプチド中の反応性官能基が保護されたペプチド -
O-CH2-PAMが得られる。上記固相ペプチド合成の実験の
操作はアプライドバイオシステムズ社による４３０Ａ型
ペプチドシンセサイザーユーザーズマニュアル（Part N
umber 900066, Version 1.3B, July 1, 1988) に従って
行った。
【００１４】得られた反応性官能基が保護されたペプチ
ド-O-CH2-PAMを常法に従って、例えば上述の「ペプチド
合成の基礎と実験」または４３０Ａ型ペプチドシンセサ
イザーユーザーズマニュアルに記述されたようにして、
例えば保護基の切断によって生じるカチオンを捕獲する
ためのスカベンジャーとしてのチオアニソール及び／ま
たはエタンジチオールの存在下にトリフルオロメタンス
ルホン酸（TFMSA)をTFMSA の希釈剤としての TFAと共に
用いて処理して樹脂及び保護基を切断しそれによって目
的とするペプチドを得る。上記 TFMSA法において、保護
されたペプチド-O-CH2 -PAMがL-His(DNP)残基を有する
場合には、これをチオフェノールによるDNP の除去の後
上記処理に付す。また、例えば（株）ペプチド研究所製
のフッ化水素装置に反応性官能基が保護されたペプチド
-O-CH2-PAM、アニソール及びフッ化水素を導入し、−２
℃で１時間の反応を行った後、フッ化水素の除去とエー
テルによる洗浄を行うことにより目的とするペプチドを
得ることもできる。
ド-O-CH2-PAMを常法に従って、例えば上述の「ペプチド
合成の基礎と実験」または４３０Ａ型ペプチドシンセサ
イザーユーザーズマニュアルに記述されたようにして、
例えば保護基の切断によって生じるカチオンを捕獲する
ためのスカベンジャーとしてのチオアニソール及び／ま
たはエタンジチオールの存在下にトリフルオロメタンス
ルホン酸（TFMSA)をTFMSA の希釈剤としての TFAと共に
用いて処理して樹脂及び保護基を切断しそれによって目
的とするペプチドを得る。上記 TFMSA法において、保護
されたペプチド-O-CH2 -PAMがL-His(DNP)残基を有する
場合には、これをチオフェノールによるDNP の除去の後
上記処理に付す。また、例えば（株）ペプチド研究所製
のフッ化水素装置に反応性官能基が保護されたペプチド
-O-CH2-PAM、アニソール及びフッ化水素を導入し、−２
℃で１時間の反応を行った後、フッ化水素の除去とエー
テルによる洗浄を行うことにより目的とするペプチドを
得ることもできる。
【００１５】本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害
剤中の有効成分として使用し得るペプチド中、His-Leu-
Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-P
ro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Pro-Pro-V
al, 及び Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-
Proはトウモロコシ蛋白質γ−ゼインをズブチリシン、
ペプシン、パパインまたは類似の基質を有するプロテア
ーゼで酵素的にあるいは酸で加水分解することによって
も得ることができる。本酵素反応は通常単に水中または
緩衝液（例えは、トリス−HCl 緩衝液またはリン酸緩衝
液) 中で行う。
剤中の有効成分として使用し得るペプチド中、His-Leu-
Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-P
ro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Pro-Pro-V
al, 及び Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-
Proはトウモロコシ蛋白質γ−ゼインをズブチリシン、
ペプシン、パパインまたは類似の基質を有するプロテア
ーゼで酵素的にあるいは酸で加水分解することによって
も得ることができる。本酵素反応は通常単に水中または
緩衝液（例えは、トリス−HCl 緩衝液またはリン酸緩衝
液) 中で行う。
【００１６】使用するγ−ゼインはγ−ゼイン単独であ
ってもよいし、γ−ゼインの他にα−ゼイン、β−ゼイ
ンを含む混合物であってもよい。これらのゼインは市販
のものでもよいし、またコーンスターチの製造過程で得
られるとうもろこし蛋白質から分離したゼイン、または
それから公知の手法で分離した（Plant Physiol., 8062
3 (1986))γ−ゼインであってもよい。また特開平２−
３６１２７の参考例１にγ−ゼインの製造例が示されて
いる。使用される酵素はズブチリシン、パパインまたは
ペプンである。
ってもよいし、γ−ゼインの他にα−ゼイン、β−ゼイ
ンを含む混合物であってもよい。これらのゼインは市販
のものでもよいし、またコーンスターチの製造過程で得
られるとうもろこし蛋白質から分離したゼイン、または
それから公知の手法で分離した（Plant Physiol., 8062
3 (1986))γ−ゼインであってもよい。また特開平２−
３６１２７の参考例１にγ−ゼインの製造例が示されて
いる。使用される酵素はズブチリシン、パパインまたは
ペプンである。
【００１７】蛋白質基質の濃度は攪拌及び混合を行うこ
とが可能である限り、特に限定されないが、攪拌を容易
にする、２−２０％（w/v)の範囲にあることが好まし
い。酵素サーモライシンの添加量はその力価によって変
化するが、蛋白質に基づいて通常0.01重量％以上、好ま
しくは0.1 〜10重量％であるのが適当である。酵素の一
部を反応の途中で加えることも可能である。反応のpH及
び温度は使用酵素の至適温度付近であればよく、ズブチ
リシンはpH６〜９、温度30〜70℃、パパイン及びペプシ
ンではpH５〜８、温度30〜60℃が適当である。反応時間
は酵素の種類、添加量、反応温度、反応pHによって異な
るため一定ではないが、通常は１〜40時間程度である。
加水分解反応の停止は公知の方法によって、例えば、加
水分解物の加熱によるかクエン酸、リンゴ酸等の有機
酸、塩酸、リン酸等の無機酸または水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム等のアルカリの添加によるpH変化による
酵素の不活性化によって、または限外濾過膜等を用いる
濾過による分離によって行うことができる。
とが可能である限り、特に限定されないが、攪拌を容易
にする、２−２０％（w/v)の範囲にあることが好まし
い。酵素サーモライシンの添加量はその力価によって変
化するが、蛋白質に基づいて通常0.01重量％以上、好ま
しくは0.1 〜10重量％であるのが適当である。酵素の一
部を反応の途中で加えることも可能である。反応のpH及
び温度は使用酵素の至適温度付近であればよく、ズブチ
リシンはpH６〜９、温度30〜70℃、パパイン及びペプシ
ンではpH５〜８、温度30〜60℃が適当である。反応時間
は酵素の種類、添加量、反応温度、反応pHによって異な
るため一定ではないが、通常は１〜40時間程度である。
加水分解反応の停止は公知の方法によって、例えば、加
水分解物の加熱によるかクエン酸、リンゴ酸等の有機
酸、塩酸、リン酸等の無機酸または水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム等のアルカリの添加によるpH変化による
酵素の不活性化によって、または限外濾過膜等を用いる
濾過による分離によって行うことができる。
【００１８】得られる加水分解物溶液を次いで固液分離
（例えば、遠心分離または濾過）に付し、得られる液体
を限外濾過、ゲル濾過等によって分画して10000 以下の
分子量を有する液体を得る。この液体は本発明の目的ペ
プチドを含有し、この液体またはその濃縮物( 例えば、
凍結乾燥物) をさらに分画して各目的ペプチドを得る。
本発明においては上記凍結乾燥物をγ−ゼイン凍結乾燥
物と称し、それを用いる場合についてさらに説明する。
γ−ゼイン凍結乾燥物をまずアニオン交換樹脂、例えば
弱塩基性アニオン交換樹脂（例えば、東ソー（株）製 D
EAE トヨパール650M) による処理、またはカチオン交換
樹脂、例えば、弱酸性カチオン交換樹脂( 例えば、東ソ
ー（株）製 SP-トヨパール650M) による処理に付す。
（例えば、遠心分離または濾過）に付し、得られる液体
を限外濾過、ゲル濾過等によって分画して10000 以下の
分子量を有する液体を得る。この液体は本発明の目的ペ
プチドを含有し、この液体またはその濃縮物( 例えば、
凍結乾燥物) をさらに分画して各目的ペプチドを得る。
本発明においては上記凍結乾燥物をγ−ゼイン凍結乾燥
物と称し、それを用いる場合についてさらに説明する。
γ−ゼイン凍結乾燥物をまずアニオン交換樹脂、例えば
弱塩基性アニオン交換樹脂（例えば、東ソー（株）製 D
EAE トヨパール650M) による処理、またはカチオン交換
樹脂、例えば、弱酸性カチオン交換樹脂( 例えば、東ソ
ー（株）製 SP-トヨパール650M) による処理に付す。
【００１９】γ−ゼイン凍結乾燥物を最初にアニオン交
換樹脂に通す分画方法においては、各ペプチドを直線濃
度勾配溶出（例えば、DEAET トヨパール 650M 使用の場
合にはトリス緩衝液→適当な濃度の、トリス緩衝液中の
NaCl) によって分画する。溶出液をいくつかの画分に取
り、各々をゲル濾過( 例えば、セファデックスLH-20使
用) 、カチオン交換樹脂処理( 例えば、SP- トヨパール
650M 使用) 、逆相HPLC( 例えば、資生堂（株）製のオ
クタデシルシランの商品名であるカプセルパックC18 ま
たはセンシュウ化学（株）製のオクタデシルシランの商
品名であるセンシュウパック1251-Y) 等に付して個々の
ペプチドに分画する。また、簡単には、後記実施例２に
例示される如く、上記10000 以下の分子量を有する液体
を濃縮し、HPLCによって化学合成した本ペプチドと同位
置に溶出されてくるペプチドを分取することによって各
ペプチドを得ることもできる。
換樹脂に通す分画方法においては、各ペプチドを直線濃
度勾配溶出（例えば、DEAET トヨパール 650M 使用の場
合にはトリス緩衝液→適当な濃度の、トリス緩衝液中の
NaCl) によって分画する。溶出液をいくつかの画分に取
り、各々をゲル濾過( 例えば、セファデックスLH-20使
用) 、カチオン交換樹脂処理( 例えば、SP- トヨパール
650M 使用) 、逆相HPLC( 例えば、資生堂（株）製のオ
クタデシルシランの商品名であるカプセルパックC18 ま
たはセンシュウ化学（株）製のオクタデシルシランの商
品名であるセンシュウパック1251-Y) 等に付して個々の
ペプチドに分画する。また、簡単には、後記実施例２に
例示される如く、上記10000 以下の分子量を有する液体
を濃縮し、HPLCによって化学合成した本ペプチドと同位
置に溶出されてくるペプチドを分取することによって各
ペプチドを得ることもできる。
【００２０】本ペプチドの酸付加塩は常法によって製造
することができる。例えば、酸付加塩は本ペプチドとそ
れに対し０当量より大からそこに含まれる塩基製アミノ
酸残基の総数＋１当量までの量の酸とを水中で反応さ
せ、ついで生成物を凍結乾燥することによって得ること
ができる。また、本発明における製造過程で酸付加塩と
して得られる場合もある。
することができる。例えば、酸付加塩は本ペプチドとそ
れに対し０当量より大からそこに含まれる塩基製アミノ
酸残基の総数＋１当量までの量の酸とを水中で反応さ
せ、ついで生成物を凍結乾燥することによって得ること
ができる。また、本発明における製造過程で酸付加塩と
して得られる場合もある。
【００２１】本ペプチド及びその酸付加塩はプロリルエ
ンドペプチダーゼ阻害作用を有し、ヒトの痴呆症の治
療、予防に有効であると期待される。本ペプチド及びそ
の酸付加塩はそのまま、または通常少なくとも１つの製
薬補助剤と製薬組成物にして使用する。本ペプチド及び
その酸付加塩は非経口（すなわち、静脈注射、直腸投与
等）または経口的に投与し、各投与方法に適した形態に
製剤することができる。
ンドペプチダーゼ阻害作用を有し、ヒトの痴呆症の治
療、予防に有効であると期待される。本ペプチド及びそ
の酸付加塩はそのまま、または通常少なくとも１つの製
薬補助剤と製薬組成物にして使用する。本ペプチド及び
その酸付加塩は非経口（すなわち、静脈注射、直腸投与
等）または経口的に投与し、各投与方法に適した形態に
製剤することができる。
【００２２】注射剤としての製剤形態は、通常滅菌水水
溶液を包含する。上記形態の製剤はまた緩衝剤pH調節剤
（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤（塩
化ナトリウム、グルコース等）、保存剤（パラオキシ安
息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル等) 等の
水以外の他の製薬補助剤を含有することができる。該製
剤は細菌保持フィルターを通す濾過、組成物への殺菌剤
の混入、組成物の照射や加熱によって滅菌することがで
きる。該製剤はまたは殺菌固体組成物として製造し、用
時滅菌水等に溶解して使用することもできる。
溶液を包含する。上記形態の製剤はまた緩衝剤pH調節剤
（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤（塩
化ナトリウム、グルコース等）、保存剤（パラオキシ安
息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル等) 等の
水以外の他の製薬補助剤を含有することができる。該製
剤は細菌保持フィルターを通す濾過、組成物への殺菌剤
の混入、組成物の照射や加熱によって滅菌することがで
きる。該製剤はまたは殺菌固体組成物として製造し、用
時滅菌水等に溶解して使用することもできる。
【００２３】経口投与剤は胃腸器官による吸収に適した
形に製剤する。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉
末剤は常用の製薬補助剤、例えば結合剤（シロップ、ア
ラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポ
リビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース
等）、賦形剤（ラクトース、スクロース、コーンスター
チ、リン酸カルシウム、ソルビット、グリシン等）、滑
沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレ
ングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、
カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫
酸ナトリウム等）を包含することができる。錠剤は常法
によりコーティングすることができる。経口液剤は水溶
液等にしたり、ドライプロダクトにすることができる。
そのような経口液剤は常用の添加剤例えば保存剤（ｐ−
ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン
酸等）を包含していてもよい。
形に製剤する。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉
末剤は常用の製薬補助剤、例えば結合剤（シロップ、ア
ラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポ
リビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース
等）、賦形剤（ラクトース、スクロース、コーンスター
チ、リン酸カルシウム、ソルビット、グリシン等）、滑
沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレ
ングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、
カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫
酸ナトリウム等）を包含することができる。錠剤は常法
によりコーティングすることができる。経口液剤は水溶
液等にしたり、ドライプロダクトにすることができる。
そのような経口液剤は常用の添加剤例えば保存剤（ｐ−
ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン
酸等）を包含していてもよい。
【００２４】本プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤中の
本ペプチドまたはその酸付加塩の量は種々変えることが
できるが、通常５〜100%(w/w) 、特に10〜60%(w/w)が適
当である。本プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の投与
量は有効成分として10〜200mg/kg/dayが適当である。な
お、本ペプチドの急性毒性はLD50(ICR系マウス、経口投
与）＞3g/kg である。
本ペプチドまたはその酸付加塩の量は種々変えることが
できるが、通常５〜100%(w/w) 、特に10〜60%(w/w)が適
当である。本プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の投与
量は有効成分として10〜200mg/kg/dayが適当である。な
お、本ペプチドの急性毒性はLD50(ICR系マウス、経口投
与）＞3g/kg である。
【００２５】また、本ペプチドは多量に摂取しても生体
に悪影響を与えない利点を有することから、そのまま、
または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品中に含
有せしめて抗痴呆作用、痴呆症予防の機能をもたせた機
能性食品、健康食品として食してもよい。すなわち、例
えば各種ビタミン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、
例えば栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各
種形状の固形食品、さらには粉末状としてそのままある
いは各種食品へ添加して用いることもできる。かかる機
能性食品、健康食品としての本プロリルエンドペプチダ
ーゼ阻害剤中の有効成分の含有量、摂取量はそれぞれ上
記製薬における含有量、投与量と同様でよい。
に悪影響を与えない利点を有することから、そのまま、
または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品中に含
有せしめて抗痴呆作用、痴呆症予防の機能をもたせた機
能性食品、健康食品として食してもよい。すなわち、例
えば各種ビタミン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、
例えば栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各
種形状の固形食品、さらには粉末状としてそのままある
いは各種食品へ添加して用いることもできる。かかる機
能性食品、健康食品としての本プロリルエンドペプチダ
ーゼ阻害剤中の有効成分の含有量、摂取量はそれぞれ上
記製薬における含有量、投与量と同様でよい。
【００２６】
【実施例】次に本発明を実施例により説明する。実施例１ His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val の合成とプロリル
エンドペプチダーゼ阻害活性 a) His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val の合成 アプライド・バイオシステムズ社製ペプチド合成装置
（４３０Ａ型）に0.5 ミリモルの Boc-Val-O-CH2-PAM樹
脂及び各２ミリモルのBoc-His(Tos), Boc-Leu, Boc-Pro
を充填し、DCC による無水対称法により His-(Tos)-Leu
-Pro-Pro-Pro-Val-O-CH2-PAMを合成した。なお、Tos は
トシル基を示す。次に、ペプチド研究所製フッ化水素装
置に上記合成ペプチド樹脂を導入し、アニソール1.5ml
を添加後、フッ化水素10mlを導入した。−２℃、１時間
の反応後、フッ化水素を減圧下に除去し、ペプチドを無
水エーテル、クロロホルムで交互に３回洗浄し、２Ｎ酢
酸60mlにペプチドを溶解させ、凍結乾燥した。この方法
により His-Leu-Pro-Pro-Pro-Valの白色粉末 130mgを得
た。次いで本ペプチドを高速液体クロマトグラフィー(H
PLC)により精製した。
エンドペプチダーゼ阻害活性 a) His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val の合成 アプライド・バイオシステムズ社製ペプチド合成装置
（４３０Ａ型）に0.5 ミリモルの Boc-Val-O-CH2-PAM樹
脂及び各２ミリモルのBoc-His(Tos), Boc-Leu, Boc-Pro
を充填し、DCC による無水対称法により His-(Tos)-Leu
-Pro-Pro-Pro-Val-O-CH2-PAMを合成した。なお、Tos は
トシル基を示す。次に、ペプチド研究所製フッ化水素装
置に上記合成ペプチド樹脂を導入し、アニソール1.5ml
を添加後、フッ化水素10mlを導入した。−２℃、１時間
の反応後、フッ化水素を減圧下に除去し、ペプチドを無
水エーテル、クロロホルムで交互に３回洗浄し、２Ｎ酢
酸60mlにペプチドを溶解させ、凍結乾燥した。この方法
により His-Leu-Pro-Pro-Pro-Valの白色粉末 130mgを得
た。次いで本ペプチドを高速液体クロマトグラフィー(H
PLC)により精製した。
【００２７】HPLCよる精製条件を下記に示す。 カラム : メルク社製 LiChosorb RP-SelectB (250 x
φ25mm) 溶出液 : 0.1%トリフルオロ酢酸を含む3.5 〜67% アセ
トニトリルのグラジエント 流速 : 6ml/min 本ペプチドの各種分析値を後記表１に示す。なお、アミ
ノ酸分析は6N塩酸 110℃,24 時間の加水分解後、日立８
３５型アミノ酸分析装置により行った。また、質量分析
は日本電子製HX-110型質量分析装置によるFAB-MS法で行
った。
φ25mm) 溶出液 : 0.1%トリフルオロ酢酸を含む3.5 〜67% アセ
トニトリルのグラジエント 流速 : 6ml/min 本ペプチドの各種分析値を後記表１に示す。なお、アミ
ノ酸分析は6N塩酸 110℃,24 時間の加水分解後、日立８
３５型アミノ酸分析装置により行った。また、質量分析
は日本電子製HX-110型質量分析装置によるFAB-MS法で行
った。
【００２８】b) Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-P
ro-Pro-Val-His, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-Pr
o-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Pro-Pro-Va
l, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-Pro, Ly
s-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile, Thr-Pro-Pro-Val の
合成 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val の合成と同様にアプライド・
バイオシステムズ社製ペプチド合成装置（４３０Ａ型）
を使用した DCCによる無水対称法により合成し、フッ化
水素により保護基と樹脂を切断した。ペプチドの精製条
件も前述と同一である。これらのペプチドの各種分析値
を後記表１に示す。
ro-Pro-Val-His, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-Pr
o-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Pro-Pro-Va
l, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-Pro, Ly
s-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile, Thr-Pro-Pro-Val の
合成 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val の合成と同様にアプライド・
バイオシステムズ社製ペプチド合成装置（４３０Ａ型）
を使用した DCCによる無水対称法により合成し、フッ化
水素により保護基と樹脂を切断した。ペプチドの精製条
件も前述と同一である。これらのペプチドの各種分析値
を後記表１に示す。
【００２９】c) プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性
の測定 以上のようにして得たペプチドのプロリルエンドペプチ
ダーゼ阻害活性を以下のごとく測定した。 c-1) 微生物由来プロリルエンドペプチダーゼに対する
阻害活性の測定 生化学工業（株）より購入したF.meningosepticum 由来
プロリルエンドペプチダーゼを pH7.0の0.1Mリン酸緩衝
液に溶解し、0.1unit/mlの酵素溶液とした。また、２mM
Z-Gly-Pro-pNA（バッケム社製、Ｚはベンジルオキシカ
ルボニル基、pNA はパラニトロアニリドを示す) を上記
リン酸緩衝液(40%ジオキサンを含む) に溶解し基質溶液
とした。上記の各種ペプチドの水溶液をそれぞれ1.5ml
容量のプラスチックチューブに40μl 入れ、これにリン
酸緩衝液80μl 、基質溶液40μl を添加し、30℃で10分
間保温した後、上記プロリルエンドペプチダーゼ溶液40
μl を加えよく混合して、30℃で10分間の反応を行っ
た。その後、１Ｎ HCl 200μl を添加することにより反
応を停止させた。反応停止後、酵素反応により遊離して
くるパラニトロアニリンをHPLCにより定量した。HPLC測
定条件は以下の通りである。
の測定 以上のようにして得たペプチドのプロリルエンドペプチ
ダーゼ阻害活性を以下のごとく測定した。 c-1) 微生物由来プロリルエンドペプチダーゼに対する
阻害活性の測定 生化学工業（株）より購入したF.meningosepticum 由来
プロリルエンドペプチダーゼを pH7.0の0.1Mリン酸緩衝
液に溶解し、0.1unit/mlの酵素溶液とした。また、２mM
Z-Gly-Pro-pNA（バッケム社製、Ｚはベンジルオキシカ
ルボニル基、pNA はパラニトロアニリドを示す) を上記
リン酸緩衝液(40%ジオキサンを含む) に溶解し基質溶液
とした。上記の各種ペプチドの水溶液をそれぞれ1.5ml
容量のプラスチックチューブに40μl 入れ、これにリン
酸緩衝液80μl 、基質溶液40μl を添加し、30℃で10分
間保温した後、上記プロリルエンドペプチダーゼ溶液40
μl を加えよく混合して、30℃で10分間の反応を行っ
た。その後、１Ｎ HCl 200μl を添加することにより反
応を停止させた。反応停止後、酵素反応により遊離して
くるパラニトロアニリンをHPLCにより定量した。HPLC測
定条件は以下の通りである。
【００３０】ＨＰＬＣ測定条件 カラム : ウオーターズ社製 μBondasphere 5 μ C8-
300A (150 x φ3.9mm) 溶出 : 0.1%トリフルオロ酢酸を含む53% アセトニト
リル 検出 : 410nm の吸収 この様な実験を複数行い、阻害率を次の式より算出し
た。 Ａ：阻害剤を含まない場合のパラニトロアニリンのピー
ク面積 Ｂ：阻害剤添加の場合のパラニトロアニリンのピーク面
積 その結果を後記表２に示す。また、阻害率50％のときの
ペプチドの濃度をIC50値とし、それを後記表３に示す。
300A (150 x φ3.9mm) 溶出 : 0.1%トリフルオロ酢酸を含む53% アセトニト
リル 検出 : 410nm の吸収 この様な実験を複数行い、阻害率を次の式より算出し
た。 Ａ：阻害剤を含まない場合のパラニトロアニリンのピー
ク面積 Ｂ：阻害剤添加の場合のパラニトロアニリンのピーク面
積 その結果を後記表２に示す。また、阻害率50％のときの
ペプチドの濃度をIC50値とし、それを後記表３に示す。
【００３１】c-2) 牛脳由来プロリルエンドペプチダー
ゼに対する阻害活性の測定 牛脳アセトンパウダー( シグマ社製)25gを10mM EDTA 及
び 10mM 2-メルカプトエタノールを含む20mM Tris-HCI
緩衝液(pH7.0)200mlに溶解させ、16,000rpm,20分の遠心
を行い、上清を回収した。次いで、DEAE−トヨパール
（東ソー）によるカラムクロマトグラフィーにてプロリ
ルエンドペプチダーゼを部分精製し、0.1unit/mlの酵素
溶液とした。また、2 mM Z-Gly-Pro-pNAを上記Tris-HCl
緩衝液(40%ジオキサンを含む) に溶解し基質溶液とし
た。上記の各種ペプチドの水溶液をそれぞれ1.5ml 容量
のプラスチックチューブに40μl 入れ、これにリン酸緩
衝液80μl 、基質溶液40μl を添加し、37℃で10分間保
温した後、上記プロリルエンドペプチダーゼ溶液40μl
を加えよく混合して、37℃で10分間の反応させた。以下
の測定条件は微生物由来プロリルエンドペプチダーゼに
対する阻害活性の測定の場合と同一であり、その結果を
後記表４に示す。
ゼに対する阻害活性の測定 牛脳アセトンパウダー( シグマ社製)25gを10mM EDTA 及
び 10mM 2-メルカプトエタノールを含む20mM Tris-HCI
緩衝液(pH7.0)200mlに溶解させ、16,000rpm,20分の遠心
を行い、上清を回収した。次いで、DEAE−トヨパール
（東ソー）によるカラムクロマトグラフィーにてプロリ
ルエンドペプチダーゼを部分精製し、0.1unit/mlの酵素
溶液とした。また、2 mM Z-Gly-Pro-pNAを上記Tris-HCl
緩衝液(40%ジオキサンを含む) に溶解し基質溶液とし
た。上記の各種ペプチドの水溶液をそれぞれ1.5ml 容量
のプラスチックチューブに40μl 入れ、これにリン酸緩
衝液80μl 、基質溶液40μl を添加し、37℃で10分間保
温した後、上記プロリルエンドペプチダーゼ溶液40μl
を加えよく混合して、37℃で10分間の反応させた。以下
の測定条件は微生物由来プロリルエンドペプチダーゼに
対する阻害活性の測定の場合と同一であり、その結果を
後記表４に示す。
【００３２】実施例２ γ−ゼインからのHis-Leu-Pro-
Pro-Pro-Val の生成 γ−ゼイン0.2gを50mM Tris-HCl (pH8.2) 12ml中に分散
させ、これにズブチリシン・カールズベルグ（シグマ社
製）10mgを加えた。37℃18時間の反応後、分子量10,000
の限外濾過膜( ミリポア社製モルカット) に付して通過
する低分子量ペプチドを回収した。これを濃縮して、HP
LCにおいて、化学合成したHis-Leu-Pro-Pro-Pro-Val と
同位置に溶出されてくるペプチドを分取し回収した。HP
LCの条件は以下の通りである。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム : メルク社製 Superspher RP-8 (125 x φ4m
m) 溶出 : 0.1%トリフルオロ酢酸を含む７〜63% アセト
ニトリルグラジエント 検出 : 210nm の紫外部吸収 回収したペプチド溶液は、減圧乾固し最終標品とした。
Pro-Pro-Val の生成 γ−ゼイン0.2gを50mM Tris-HCl (pH8.2) 12ml中に分散
させ、これにズブチリシン・カールズベルグ（シグマ社
製）10mgを加えた。37℃18時間の反応後、分子量10,000
の限外濾過膜( ミリポア社製モルカット) に付して通過
する低分子量ペプチドを回収した。これを濃縮して、HP
LCにおいて、化学合成したHis-Leu-Pro-Pro-Pro-Val と
同位置に溶出されてくるペプチドを分取し回収した。HP
LCの条件は以下の通りである。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム : メルク社製 Superspher RP-8 (125 x φ4m
m) 溶出 : 0.1%トリフルオロ酢酸を含む７〜63% アセト
ニトリルグラジエント 検出 : 210nm の紫外部吸収 回収したペプチド溶液は、減圧乾固し最終標品とした。
【００３３】
【表１】 合成ペプチドの分析値 ──────────────────────────────────── 〔α〕D 25( °) アミノ酸分析値 質量分析値 ペプチド (H2O) ( 組成比) FAB-MS (m/z) ──────────────────────────────────── Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro -192 Val 1.00, His 0.98, 659 (M+H)+ (C=0.4) Leu 1.04, Pro 3.11 Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His -228 Leu 1.00, Pro 3.05, 659 (M+H)+ (C=0.2) Val 1.00, His 1.03 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val -218 His 1.00, Leu 1.08, 659 (M+H)+ (C=0.3) Pro 2.92, Val 1.00 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val- -242 His 0.81, Leu 1.09, 1299 (M+H)+ His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val (C=0.1) Pro 3.09, Val 1.00 Leu-Pro-Pro-Pro-Val -238 Leu 1.00, Pro 3.08, 522 (M+H)+ (C=0.3) Val 1.04 Pro-Pro-Pro-Val -242 Pro 2.94, Val 1.00 409 (M+H)+ (C=0.4) Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His- -203 Pro 6.3 , Arg 0.8 , 1287 (M+H)+ Pro-Gln-Pro-His-Pro (C=0.3) Glu 2.0 , His 1.7 Lys-Pro-Pro-Val -169 Lys 0.89, Pro 2.06 440 (M+H)+ (C=0.4) Val 1.00 Lys-Pro-Pro-Ile -167 Lys 1.00, Pro 1.94 454 (M+H)+ (C=0.3) Ile 1.12 Thr-Pro-Pro-Val -192 Thr 1.00, Pro 2.07 413 (M+H)+ (C=0.5) Val 1.00 ────────────────────────────────────
【００３４】
【表２】 F.meningosepticum 由来プロリルエンドペプチダーゼに対する阻害活性 ──────────────────────────────────── ペ プ チ ド 濃度（μM) 阻害率（％） ──────────────────────────────────── Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro 800 31 Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His 800 12 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 80 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val- His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 88 Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 39 Pro-Pro-Pro-Val 400 26 Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His- Pro-Gln-Pro-His-Pro 400 14 Lys-Pro-Pro-Val 400 65 Lys-Pro-Pro-Ile 400 52 Thr-Pro-Pro-Val 400 12 ────────────────────────────────────
【００３５】
【表３】
【００３６】
【表４】 牛脳由来プロリルエンドペプチダーゼに対する阻害活性 ──────────────────────────────────── ペ プ チ ド 濃度（μM) 阻害率（％） ──────────────────────────────────── Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro 400 65 Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His 400 68 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 28 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val- His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 64 Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His- Pro-Gln-Pro-His-Pro 400 71 ────────────────────────────────────
【００３７】
【発明の効果】本発明によって新規かつ有用なプロリル
エンドペプチダーゼ阻害剤が提供される。
エンドペプチダーゼ阻害剤が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 田中 秀興 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業技 術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 前田 英勝 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業技 術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 三吉 新介 千葉県船橋市日の出２丁目20番２号 昭和 産業株式会社総合研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 Ｌ体のアミノ酸から構成される下記ペプ
チド及びその酸付加塩の少なくとも１種を有効成分とし
て含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤： Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His,
His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-H
is-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val,Pro-Pr
o-Pro-Val, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His
-Pro, Lys-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile及び Thr-Pro
-Pro-Val.
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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| JP (1) | JP3318622B2 (ja) |
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| WO2004098591A2 (en) | 2003-05-05 | 2004-11-18 | Probiodrug Ag | Inhibitors of glutaminyl cyclase and their use in the treatment of neurological diseases |
| WO2005075436A2 (en) | 2004-02-05 | 2005-08-18 | Probiodrug Ag | Novel inhibitors of glutaminyl cyclase |
| CN100352833C (zh) * | 2005-12-30 | 2007-12-05 | 深圳职业技术学院 | 抑制杂草种子萌发生根多肽与分离方法及其应用 |
| CN100352835C (zh) * | 2005-12-30 | 2007-12-05 | 深圳职业技术学院 | 玉米蛋白粉多肽与分离方法及其应用 |
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-
1992
- 1992-05-27 JP JP16035492A patent/JP3318622B2/ja not_active Expired - Lifetime
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