JPS62501291A - 精製セリンプロテアーゼインヒビターおよびこれを含有する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 セリンプロテアーゼインヒビターおよびその単雌方法本出願は、１９８４年１２ 月６日に出願された米国特許出願筒６７８，８２３号の部分琳続出願である。

発明の背景 内因性蛋白分解酵素は、浸入する生物、抗原−抗体複合体、および生物にとって もはや必要でないがまたは有用でないある種の組織蛋白質を分解するのに役立っ ている。正常に目脂する生物において、蛋白分解酵素は、限定された母において 導かれ、そしてプロテアーゼインヒビターの合成を通して部分的に調節される。

非常に多数の天然に生成するプロテアーゼインヒビターは、内因性プロテアーゼ を、局所的および１時間にそれらの反応を限定することにより、＄す罪するのに 役立つている。加えて、プロテアーゼインヒビターは、感染剤により身体中に導 かれるプロテアーゼを阻害しうる。特に蛋白分解性攻撃および感染を受けやすい Ｒ１織、たとえば気道のそれはプロテアーゼインヒビターに富んでいる。

プロテアーゼインヒビターは、約１０９６の人血漿蛋白質からなる。少くとも８ 　ＦＪのインヒビターがこの給源がら単口−されており、そして文献中に特徴づ けられている。

それらは、α　−マクログロブリン（α２Ｍ）、Ｃ１−プロテアーゼインヒビタ ー（α１ＰＩ）、α１−アンチキモ１ヘリプシン（α１Ａｃｈｙ）　、β１−ア ンチコラゲナーゼ（β１ΔＣ）およびインターα−トリプシンインヒビター（Ｉ α■）を包含する。

プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター平衡の乱れは、肺気腫、関節炎、糸球 体腎炎、歯周炎、筋萎縮症、腫瘍侵襲、および各種の他の病的状態を包含するプ ロテアーゼ−介在組織破壊を導きつる。

ある種の状況、たとえば敗血症または急性白血病のような重篤な病的過程におい ては、存在する遊雌蛋自分解酵素の母は、分泌細胞からの酵素の放出に起因し増 加する。加えて、あるいは他の状況において別に、生物の減少した調節インヒビ ター容ａはまた、プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター平衡における変更を 生じうる。

そのような減少した調部インヒビター各項の例は、α１−プロテアーゼインヒビ ター欠乏であり、それは肺気腫の発現と高度に関係している。

そのような異常な状態が存在している生物においては、蛋白分解酵素を制御する ための処置を取ることができなければ、生物に対する重篤な損傷が生じうる。従 って、蛋白分解酵素を制御するために、生物に対し投与することのできるプロテ アーゼインヒビターがめられてきた。

特に薬理学的興味をひく１つのプロテアーゼは、白血球エラスターゼである。白 血球エラスターゼは、細胞外に放出されるとき、結合組織および他の価値ある蛋 白質を分解する。正常には能する生物にとって、ある最の結合粗織および他の蛋 白質を分解することが必要であるけれども、過剰量の白血球エラスターゼの存在 は、各種の病的状態、たとえば肺気腫およびリウマチ性関節炎と結び付いてきた 。白血球エラスターゼが正諧より大きな１において存在するとき、その効果と対 抗するために、白血球エラスターゼに特異であるプロテアーゼインヒビターがめ られてきた。そのようなプロテアーゼインヒビターは、もしもそれが精製された 形において、そして医薬的に有用であるのに充分な同において単離されあるいは 製造されることができるならば、特に有用であろう。

過去において、少くとも２種の白血球エラスターゼインヒビターが文献中に同定 されている。ジ−スラー（５ｃｈｉｅｓｓｌｅｒ）等のｌ′アシド−ステーブル ・インヒビターズ・オブ・グラニュロサイト・ニュートラル・プロテエイゼズ・ イン・ヒユーマン・ムコス・セクレツションズニバイオケミストリー争アンド・ ポジプル・バイオロジカル・ファンクション“、イン・ニュートラル・プロテエ イゼズ・オブ・ヒユーマン・ポリモルホニュクレアー・リューコサイテズ（ｌ″ Δｃｉｄ−３ｔａｂ！ｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ 　Ｎｅｕｔｒａｌ　Ｐｒ０ｔｅａＳｅＳ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　ｕｕｃｏｕｓＳｅ ｃｒｅｔｉｏｎｓ　：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｏ５ｓｉｂｌｅ 　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＦｕｎｃｔｉｏｎ”、ｉｎ　Ｎｅｕｔｒａｌ　Ｐｒｏｔ ｅａｓｅｓ　ｏｆ　ＨｕｍａｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｅｕｃｌｅａｒ　Ｌｅｕ ｃｏｃｙｔｅｓ　）　、ハーベマン（Ｈａｖｅｍａｎｎ　）等（編集）、アーバ ン・アンド・シュワルツエン／＜　−す、インク（Ｕｒｂａｎ　ａｎｄ　Ｓｃｈ ｓｖａｒｚｅｎｂｅｒｇ。

Ｉｎｃ、　）　（１９７８）中に２叔されている１つの蛋白質は、人間の漬液血 漿および唾液から単離され、そしてＮ−末端アミノ酸としてチロシンを有する大 きさ約１１Ｋｄａであると特徴づけられた。この蛋白質の文献報告は、部分アミ ン閲配列のみを提供しているが、この部分配列さえもがこの蛋白質は本発明の蛋 白質から著しく異っていることを示している。この蛋白質の配列の報告は、本発 明の蛋白質についての全アミノ酸配列データとの組合せにおいて、本発明者等に 対し、ジ−スラー等により配列された生成物は単一ポリペプチド鎖ではない分解 された１白貿でありえたことを示している。

１例において人間血漿から単離される第２の蛋白質は、α１−プロテアーゼイン ヒビターと命名されている。この蛋白質についての業績は、トラビス（丁ｒａｖ ｉｓ）およびサルベセン（Ｓａ　ｌ　ｖｅｓｅｎ　）によりレビュー［アニュア ル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕａｌ　Ｉｔｅｖｉｅｗｏｒ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＞　５２　：　６５５〜７０９　（１９８３）　 ］中に要約されている。

本発明の単一ポリペプチド鎖蛋白質と先行技術の任意の単一ポリペプチド鎖セリ ンプロテアーゼインヒビターとの間の描造における著しい相違の故に、先行技術 の単一ポリペプチド項セリンプロテア−ぜインヒビターは、本発明の蛋白質と゛ 実質的に同一″（”　ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ”　） ではないロトリブシンは、薬理学的立場から特に興味深い他のプロテアーゼであ る。トリプシンは、各種の急性状態、たとえば膵炎の間に、ある秤の軟器官組織 、たとえば膵臓組織の分解を開始させることが知られている。種々の努力が、ト リプシンの作用を阻害するであろうことが望まれた蛋白質の使用を通して、顕著 な成功なしに、それら状態の治療に向けられてきた。そのような努力の例は、人 間肺炎の治療における外因性牛トリプシンインヒビターを使用する試みである。

そのような技術は欧州において試みられてきたけれども、それらはニー・ニス・ フード・アンド・ドラッグ・アトミニストレージョン（Ｕ。

３　、　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　八ｄｍｉｎｉｓｔｒａｊｔｏｎ）によっ て有効とは承認されなかった。従って、各種の急性および慢性状態において、過 剰のトリプシンの中和に有効なプロテアーゼインヒビターについての要求がある 。上記に論述した白血球エラスターゼインヒビターの場合における如（、トリプ シンインヒビターは、もしもそれが精製された形において、そして医、薬的に有 用であるのに充分な蚤において単離されそして製造されうるならば、特に有用で あろう。

カテプシンＧは、白血球中に大岳に存在する他のプロテアーゼである。カテプシ ンＧは、補充経路のそれらを包含する各種の価値ある蛋白質をインごトロで分解 しうろことが知られている。Ｒｂｌエラスターゼは、膵炎において役割を有しう る他のプロテアーゼである。従って、それらプロテアーゼのインヒビターはまた 、強力な医薬価値のものである。

白血球エラスターゼ、トリプシン、カテプシンＧおよび膵臓エラスターゼはセリ ンプロテアーゼとして知られている１つの種類のプロテアーゼの例であり、それ らは共通の構造および礪溝の要素を有している。異った基質に対するそれらの活 性および異ったインヒビターに対するそれらの感受性は、僅か数個のアミノ酸残 塁における変化からの結果と信じられる。類推により、構造および機構の共通の 要素をまた有する１つの種類のセリンプロテアーゼインヒビターを予想すること が可能であり、それにおいては比較的少ないアミノ酸の変化が異ったプロテアー ゼの阻害を生じえ、そしてこの種類の少くとも１つのものは前者の種類の各セリ ンプロテア−ぜを阻害しうる。そこでこの種類のセリンプロテアーゼインヒビタ ーは実質的な隨ＩＭを有するものであろう。

驚くべきことには、本発明者等は、アミノ酸配列が単一ポリペプチド鎖セリンプ ロテアーゼインヒビターの報告された配列から非常に異っている、耳下腺分泌か ら荀装された形において単離される１２Ｋｄａプロテアーゼインヒビターを見出 した。本発明のプロテアーゼインヒビターは、少くとも２つの活性部位を有する ものと信じられる。１つの部位は白血球エラスターゼ阻害性質を示し、一方策２ の部位はトリプシンに対し活性を示す。本発明者等は、本新規プロテアーゼイン ヒビターの全長を正確に配列づけした。この配列（４、以後により完全に示ず。

Ｒユ立几ｊす 本発明は、　Ｗ２的に：５Ｌプロテアーゼインヒビクー・、そしてより特定的に は、人間の多形核（ＰＭＮ）−顆粒球プロテアーゼを指向するインヒビターに関 する。特に、本発明は、人間白血球エラスターゼおよびトリプシンを包含するセ リンプロテアーゼの阻害剤に関する。加えて、本発明は、それらインヒビターの 生物活性同族体に関する。

本発明の目的は、１つまたは種々のものの組合せのセリンプロテアーゼに対し活 性である精製された形のプロテアーゼインヒビターを提供することにある。

本発明の付加的目的は、そのようなプロテアーゼインヒビターのアミノ酸配列の 決定である。本発明の更に他の目的は、白血球エラスターゼおよび他のセリンプ ロテアーゼに対し活性を発揮する医薬製剤として価値のある精製された形のプロ テアーゼインヒビターを提供することを包含する。更に、高められたあるいは等 価の性質を有するそのようなプロテアーゼインヒビターの生物活性同族体の同定 はまた、本発明の目的の１つである。

目的をｊ１成するため、そして本発明の目的に従い、セリンプロテアーゼ、特に エラスターゼ、たとえば白血球エラスターゼに対し阻害活性を示すプロテアーゼ インヒビターが開示される。好ましいインヒビターは、耳下腺分泌から精製され た形で単離された。本プロテアーゼインヒビターは、完全に変性された後に、ジ スルファイド結合を形成または再形成する能力を有し、そして生化学的ａｊ激の 不存在において所望のセリンプロテアーゼ阻害活性の発現をなしうる活性三次元 構造を（が成または再構成するのに必要である適当な非共有相互反応を受ける。

本発明の好ましいインヒビターは、セリンプロテアーゼインヒビター活性を示す 少くとも１つの活性部位を有する精製された単一ポリペプチド慎蛋白質であり、 そして耳下腺分泌から単離される天然セリンプロテアーゼインとビターと実質的 に一致する。好ましくは、活性部位において示されるセリンプロテアーゼインヒ ビター活性は、耳下腺分泌から単離される天然インヒビターのそれと生物学的に 等価である。

本発明の特に好ましいインヒビターは、次のアミノ酸配列 ｐ＝ｓ−ｍ＝−ｈｒｇ−七ｇ−Ｌｙｓ−Ｐ：ローＧａｙ−乙Ｙｓ−Ｃｙｓ−？： ローＶａ上−τｈｒ−てｙ＝−Ｇｌｙ−ＧＬユニーｙｓ−Ｒａ４２４つ、−Ａｓ ｒ、−’＝ローＰ：ローＡｓｎ−Ｐｈａ−（ｙｓ−Ｇ工ｕ−Ｆｔ　−ｋｓｐ−Ｇ Ｊｔ−Ｇｌ−：ｚ−Ｃｙｓ−乙ｖｓ−人ｒ７−人５ｐ−Ｌａｕ−１：１１／＋！ −Ｃｙｓ−ＣＹ！１−Ｆｔ−＜Ａｙ４−−（ｙｓ−ＧＬｙ−１，７ｓ−５ａｒ− ζｙ５−ＶａＬ−ｓ＋ｓｒ−：ｒｃ−ＶａＬ−ｎｙｉ−Ｆ、−。

［式中、ＲおよびＲ７は、等しいかまたは異ったものであり、そして置換または 未置換のアミノ酸残基またはそれらの話導体からなる詳から選択され；そして、 Ｒ２、Ｒ、Ｒ、Ｒ、Ｒ、Ｒ８およびＲ９は、等しいか３　．４　５．　６ または異ったものであり、そしてメチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラ ニン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシンおよびアルギニンからなる 群から選択される］を有する。

上記略語により示されるアミノ潴は、好ましい態様の記述において示される。

更に、本発明のプロテアーゼインヒビターの他の生物学的に活性な改善された同 族体は、インヒビターアミノ酸配列において各種の他のアミノ酸を置換すること により得ることができる。

付加的に、目的を達成するためおよび本発明の目的に従い、活性成分、本発明に 従うプロテアーゼインヒビターまたはここに示したその生理学的に活性な同族体 の少（とも１つを含有する医薬組成物が開示される。

好ましい態様の記述 引続〈実施例と一緒で、本発明の詳細な説明するのに役立つ論述を、本発明の目 下好ましい態様について、ここで詳細に行う。

上記に示した如く、本発明は、精製された形において単離されたプロテアーゼイ ンヒビターに関する。好ましくは、本発明のセリンプロテアーゼインヒビターは 、人間の耳下腺分泌から単離される天然セリンプロテアーゼインヒビターと実質 的に均一であり、そして最も好ましくは生物学的に等［萌である単一ポリペプチ ド鎖蛋白質である。明ｉｌｌ　３　Ｊよび請求の笥囲を通して使用される゛生物 学的に等（１ｉ　″（”　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　 “）は、本発明の組成物が天然プロテアーゼインヒビターと同じ程度である必要 はないが同じ型のプロテアーゼ誘導組織損（セを阻害しうろことを意味する。引 続く明′ａ凹および請求の筒口を通して使用される゛実質的に均一″（”　５ｕ ｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ″）は、先に報告された単一ポ リペプチド鎖セリンプロテアーゼインヒビター蛋白質により発揮されるそれの過 剰における程度の天然耳下腺インヒビターに対する相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ） を意味する。好ましくは、相同性の程度は、４０％過剰、最も好ましくは５０％ 過剰であって、蛋白質の特に好ましい群は、天然耳下腺インヒビターの６０％過 剰相同性である。

上記のパーセント相同性は、２つの配列のより大きなもの中にもまた見出されう る２つの配列のより小さなもの中にみいだされる成分のパーセントとして計算さ れ、成分は４つの隣接するアミノ酸の配列として理解される。

本発明のプロテアーゼインヒビターは、熱および酸による変性に著しく抵抗性で あり、そしてキモトリプシン、マウス下顎プロテアーゼおよびクロストリパイン を包含する多くの蛋白分解酵素にさらしたとき、活性の損失に抵抗する。それら インヒビターはまた、必要なジサルファイド結合を形成する能力を有し、そして 生化学的刺激の不存在においてセリンプロテアーゼインヒビター活性を表現しう る活性三次元構造を構成するために適当な非共有相互反応をうけ、あるいはもし もジサルファイド結合が破壊されそして非共有相互反応が崩壊しているならば、 生化学的刺激の不存在においてそのような活性第三次元構造を再Ｍｍするために そのような結合および相互反応を再形成する能力を有する。

本発明の好ましいプロテアーゼインヒビターは耳下腺分泌中に発見され、そして 初めて精製された形で単離された。本出願の目的のために、゛′純粋形″（’　 ｐｕｒｅｒＯｒＩＩｌ″）、あるいは”精製された形“（ｐｕｒＮｉｅｄｆｏｒ ｍ“）は、ここに開示されたプロテアーゼインヒビターに関して使用されるとき 、セリンプロテアーゼインヒビター蛋白質でない他の蛋白質を実質的に含んでい ないことを意味する。好ましくは、本発明のプロテアーゼインヒビターは少くと も９０％純度、そして好ましくは９５％純度である。

本発明の好ましい形においては、耳下腺分泌は、人間から得られる。しかしなが ら、他の哺乳動物給源から１９られる耳下腺分泌が本発明のそれと等価の活性の プロテアーゼインヒビター・の製造において有用であろうことは予測される。

本発明のプロテアーゼインヒビターは、（ａ）哺乳動物の耳下腺を採取し； （ｂ）分泌中の蛋白性物質を分画することにより耳下腺分泌からインヒビターを 単離し； （Ｃ）セリンプロテアーゼインヒビター活性、好ましくは白血球エラスターゼイ ンヒビター活性を有する両分を同定し： （ｄ）セリンプロテアーゼインヒビター活性を示す画分を濃縮することからなる 方法により耳下腺分泌から純粋形で単動しうる。

この方法において、哺乳動物耳下腺分泌は、任意の公知手段により採取しうる。

それらは、インヒビターを実質的に変形させる酵素を含有しうる他の口中液体の 採取される検体中への導入を防止するために耳下腺４管に取り付けられる吸引装 買の使用を通して採取するのが好ましい。

好ましい態様においては、耳下腺分泌中に存在する蛋白性物質は、各８！濃度の 塩溶液の存在においてカチオン交換物質と結合するその能力に従う物質の分離に より分画される。本発明のプロテアーゼインヒビターは、クロマトグラフィカラ ム中に存在する強力チオン交換物質から、０．００５Ｍから１．０ＭまでのＱ度 範囲、そしてより特定的には０．４Ｍから０．８Ｍまでの温度範囲内の塩化ナト リウム溶出の画分により溶出しうる。しかしながら、特定のカチオン交換カラム の性質に依存し、他の塩溶液濃度が、プロテアーゼインヒビターを溶出するため に必要でありうる。

か＜１７られた画分は、セリンプロテアーゼインとビター、好ましくは白血球エ ラスターゼインヒビター活性の存在につきスクリーニングされる。好ましくは、 これは両分を既知１度のプロテアーゼ、好ましくは白血球エラスターゼと混合し 、そして残留活性３１素を分光光度計で観察される如きメトキシサクシニルＡ１ ａ−Ａ１ａ−ｐｒｏ−Ｖａｊ！　ｐ−ニトロアニリドを加水分解するその能力を 検定することにより遂行される。同定された両分の蛋白性物質は、ついで大きさ に従い、好ましくはゲル濾過により分離される。もしもゲル濾過分離が使用され るならば、好ましい溶出液は、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液である。そのような 活性を示す両分は、ついでプロテアーゼインヒビターの精製されそして濃縮され た形を得るためにたとえば限外濾過のような手段により濃縮される。

上記方法により単離されるプロテアーゼインヒビターは、一般的に、セリンプロ テアーゼ、たとえば白血球エラスターゼに関係して理論当ｍ的活性を示す。理論 当量的活性は、プロテアーゼインヒビターの各分子が１分子の白血球エラスター ゼと反応し、そしてそれによって活性を著しく減少させ、ることを意味する。イ ンヒビターおよび白血球エラスターゼが１０−８Ｍもしくはそれより大きな濃度 で存在する本発明の好ましいインヒビターの溶液において、そのようなインヒビ ターは、白血球エラスターゼの等価分子ｍの少くとも９０％と反応しうる。

上記の如く、本発明者等は、セリンプロテアーゼインヒビターを、耳下腺分泌か ら、従来得られていない精製された形で１ｎｆｆｉすることに成功した。この酵 素の精製された１、；に１１３（）る（Ｈ′；、Ｓ＋　（：、−ニービターの正 しい配列決定のため、ならびにブコテニ′−ゼインヒビターおよびその同族体を 含有する医朶祖成物を開発するだめの必須工程であった。

本発明の好ましいプロテアーゼインどビターは、次のアミノ酸配列を有する： ５ｅｒ−ＧＬＹ−ＬＹｓ−５ｅｒ−Ｐ’！、＠−ＬＹｓ−Ａ１ａ−ＧＩ　Ｙ−’ ／ａｌ−Ｃ：４”！−？＋〕−Ｐｒ０−Ｌｙｓ−！、Ｉ＋７＋−５ｅｒ−ＡＬａ −ＧＬｎ−Ｃｙｓ−Ｌａｕ−Ａｒｑ−でγ丁−乙ｙｓ−Ｌｙ’ｓ−’ｒｓ−ＧＬ ｕ−ＣＹｓ−Ｇ１．＝−５ａｒ−人ｓｐ−で＝ｐ−ＧＬニー（７ｓ−？＝０−（ ｉＬｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−八ｒｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−？＝ｏ−Ａ４１Ｐ−１ｒ− ζＨｔｓ−ａｘｙ−＝１＝−Ｌｙｓ−ζｙｓ−Ｌａｕ−Ａｓｐ−：’？０−Ｖａ ミニ−５９−７”ニー？：０−ｋＳｎ−？＝ローＴ＞、ｒ−Ａｒｇ−人ｒｑ−Ｌ ＹＳ−？’：リ−ＧＬＹ−ＬｙＳ−ＣＹＳ−？ｒｏ−Ｖａｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ− ＧＬｙ−ＧＬｉ−Ｃｙｓ−、Ｌａｕ−％、ｅ？−Ｌａｕ−λｓ＊−？＝ローＰ＝ ｃ−Ａ５ｎ−？ｈａ−（ｙ９−ＧＬｕ−Ｈａｅ−ＡＳｐ−ＧＬ　Ｙ−ＧＬｎ−（ ：／９−Ｌ　Ｙｓ−Ａｒｑ−λ５ｐ−Ｌａｕ−（、ｙｉ−ＣＹｓ−ζ７ｓ−Ｍｅ ｔ−ＧＬＹ−Ｍｅｔ−ＣＹｓ−ＧＬｙ−乙ｙｇ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−５ｅ ！ニーＰｒｏ−ＶａＬ−乙ｙｓ−ＡＬａ。

上記略語は、次の如きポリペプチド中のアミノ酸残塁に相当する： フェニルアラニン　Ｐｈｅ トリプトファン　Ｔｒρ メチオニン　Ｍｅｔ グリシン　Ｇ１ｙ アスパラギン酸　ＡＳｐ グルタミンｖＵＱ　Ｉ　ＬＪ リジン　ＬｙＳ アルギニン　Ａｒｇ ヒスチジン　Ｈｉｓ それらプロテアーゼインヒビターは、１つ以上の明確な領域を有することが見出 された。１つ以上の明確な領域は、蛋白質が各ＦＪ’Ｆｉ素に対し機能的である 複数の活性部位を有することを意味する。それら部位の存在および位置は、プロ テアーゼインヒビターの少くとも２つの部分の間に実質的相同性の発見により決 定された。明確な領域の存在は、本プロテアーゼインヒビターに、白血球エラス ターゼおよびトリプシンの両者を包含する各種のセリンプロテアーゼを阻害する 能力を付与するものと信じられる。

それらプロテアーゼインヒビターの明確な領域の複数性に起因して、プロテアー ゼインヒビターは、各種の他の活性部位が付加性質を有するプロテアーゼインヒ ビターをΩ１製するために１苫成されうる骨格として役立ちうろことが更に認め られた。本発明の好ましい態様は、白血球エラスターゼ、カテプシンＧおよびト リプシンを阻害するプロテアーゼインヒビターである。それら酵素はすべて、共 通のは構および多くの溝道特徴を分けあうセリンプロテアーゼとして知られてい るプロテアーゼの１つの種類のものである。本発明のプロテアーゼインヒビター 上の数個のアミノ酸側鎖の改変を通して、インヒビターの多様性がｆＪｌ製され るものと信じられ、各々は全種類のセリンプロテアーゼの少くとも１つのものを 阻害しうる。更に、そのような側鎖変形は、上記のセリン蛋白質の種類の特定の ものに関して改善された阻害性質を有する複数個のインヒビターを生成させるこ とが期待できる。

それら決勝点に到達するために必要とされるアミノ酸側鎖変化は、インヒビター のｍ要な機能部分がＸ線結晶学を通して説明されてきた本発明の好ましいインヒ ビターと他のセリンプロテアーゼインヒビターとの間の構造類似性のある種の要 素により示唆される。構造類似性のそれら要素は、上記の本発明の好ましいセリ ンプロテアーゼインヒビターのアミノ酸１７から２９まで、およびアミノ酸７０ から８３までを包含する。トリプシン様セリンプロテアーゼに向けての、■また は質のいずれかにおけるインヒビター活性を改善することを示唆する変化は、Ａ ｒＱからＬｙＳまでのアミノ酸２０．１−ｅｕからＬｙｓまたはＡｒｇまでのア ミノ酸７２または７４、およびＭｅｔからしｙｓまたはＡｒｇまでのアミノ酸７ ３の１つもしくはそれ以上の変化を包含する。

キモトリプシン様セリンプロテアーゼに向けての、長または質のいずれかにおけ るインヒビター活性を改善することを示唆する変化は、ＡｒＱからｐｈｅ、Ｔｙ ｒまた！、ｔ　Ｔ　ｒ　Ｏまでのアミノ酸２０、ｌｅｕからＰｈｅ。

ＴｙｒまたはＴｒｐまでのアミノ酸７２または７４、およびｆｖｌ　ｅ　ｔから ｐｈｅＳｒｙｒまたはＴｒｐまでのアミノ酸７３の１つもしくはそれ以上の変化 を包含する。

膵臓エラスターゼ様セリンプロテアーゼに向けての、旦または質のいずれかにお けるインヒビター活性を改善することを示唆する変化は、ＡｒＧからＡｌａまで のアミノ酸２０．ＬｅｕからＡｌａまでのアミノ酸７２または７４、およびＭｅ ｔからＡｌａまでのアミノ酸７３の１つもしくはそれ以上の変化を包含する。

本発明の実施において、本蛋白質に対し新しいプロテアーゼ阻害性質を斌与する ためのアミノ酸配列の変更は、白血球エラスターゼに向けて、またはトリプシン に向けてのインヒビター活性を破壊しうることを心に留めなければならない。そ のような効果は、本発明に従い定常的実験により決定しうる。

更に、上記に示した如き別周のアミノ酸、またはアミノ酸の別個の配列の置換は 、本プロテアーゼインヒビターの白血球エラスターゼ阻害性質またはトリプシン 阻害性質のいずれかを高めうろことが意図され、一方高められていない領域の若 干の活性を殺す。実口に、インヒビター蛋白質の任意の領域の活性は適当なアミ ノ酸置換により完全に不活性化しえ、それにより蛋白質が正常に活性である酵素 の１つもしくは若干のサブセットに特異のインヒビター蛋白質を創製する。たと えば、２０位のＡｒｇのＧｌｙへの２換はトリプシン阻害領域を不活性化し、一 方７３位のＭｅｔ、あるいは７２または７４位のｌｅｕのＧｌｙへの置換は、白 血球阻害領域を不活性化する。領域はまた分離蛋白質に分離しえ、その各々は所 望の阻害様能を保持する。本請求の範囲は、それら手段により導かれる他のイン ヒビターに拡張される。

上記アミノ酸配列は好ましいものであり、そして上記に列挙した特徴を有する白 血球エラスターゼインヒビターを生成するけれども、本発明はまた、医薬的立場 からまた望ましいものである白血球エラスターゼ阻害活性を包含する特徴を示す このインヒビターのある種の同族体を提供する。従って、そのような同族体はま た、本発明の好ましい組成物である。特に、もしもアミノ酸メチオニンがアミノ 酸バリンに置換されたならば、生成したインヒビターは、酸化的不活性化に対し 改善された抵抗性を示し、従って改善された白血球エラスターゼおよびカテプシ ンＧインヒビター性質を示す。同様の変化はタバコクールによる不活性化に対す るインヒビターの低抗性を改善するためになされうる。

追加置換は、請求されたプロテアーゼインヒビターの他の各種性質を高めえ、そ して生成蛋白質を蛋白分解酵素インヒビターとしてより有用なものとするのに役 立ちうる、本発明の実施を通して、この技術分野において通常の熟練度の者には 明らかとなるであろうことが可能である。そのような更に他の置換は本発明の範 囲内にあることが意図される。

更に、蛋白質のアミノ酸配列における僅かな変化は、たとえそれらが蛋白質の礪 能を高めないとしても、著しく減少した活性を有しない同族体をＤ１製すること が、こ　。

の技術分野において熟練している者により認識される。

従って、配列が上記に示した好ましい配列のそれから僅かの変化を含有する上記 に論述したプロテアーゼインヒビターの同族体は、本発明の範囲内に包含される ことが意図される。特に、Ｃ−およびＮ−末端におけるアミノ酸配列の僅かな変 更は、開示されたプロテアーゼインヒビターの活性を顕著には変化しないであろ うと信じられる。特に、Ｃ−またはＮ−末端における環化アミノ酸たとえばプロ リンでの置換は、所望のセリンプロテアーゼ阻害活性を有するプロテアーゼイン ヒビターを生成すると信じられる。また、Ｃ−またはＮ−末端における変更を有 し、その変更が同族体のセリンプロテアーゼインヒビター性質を破壊しない開示 されたプロテアーゼインヒビターの同族体は、本発明の範囲内に包含される。

本プロテアーゼインヒビターのＣ−またはＮ−末端に対するポリペプチド鎖の付 加は、本発明の範囲内にあることがまた意図される。特に、ポリペプチド鎖は、 蛋白融合技術を通していずれかの末端に結合しうる。それらの追加ポリペプチド は、本プロテアーゼインヒビターの薬学的有効性を高めるのに役立ちうる。たと えば、ポリペプチドは、他の蛋白質との融合により、粘膜に固定されうるように なって、プロテアーゼインヒビターが特定部位、たとえば肺に留ることを生じる ようになしうる。

それら同族体において、アミノ酸配列の変化は、プロテアーゼインヒビターが投 与される生物において悪い免疫応答を生じさせるようなものであってはならない 。生物学的分子が悪い免疫応答を生じさせるかどうかを決定する方法は、この技 術分野において通常の熟練度の者には知られている。

上記の置換は、各種方法により行いうる。たとえば、リコンビナントＤＮＡ法に よりインヒビターを尋くために使用される一般的指示は、宿主微生物が所望の同 族体の合成を生じるように変更されうる。そのようなりコンビナンド法は、１９ ８４年１２月６日に出願された゛リコンビナント・メソオズ・フォア・アイシレ ージョン・オブ・セリン・プロチェイス・インヒビターズ・アンド・ディ・エヌ ・エイ・セキュエンセズ・ユースフル・フォア・セーム″（”　Ｒｅｃｏｍｂｉ ｎａｎｔ　Ｈｅｔｂｏｄｓ　ｆｏｒＩｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｅｒｉｎｅ　 Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ａｎｄ　ＤＮＡへｅｑｕｅｎｃｅｓ 　Ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　Ｓａｍｅ　″）と題するブラデツブ・ケイ・パンジオ パブアイ（Ｐｒａｄｉｐに、Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ）　Ｗの米国特許出願 第６７８．８２２号、およびそれと同日に出願された゛１リコンごナンド・メソ オズ・フォア・アイシレージョン・オブ・セリン・プロチェイス・インヒビター ズ・アンド・ディ・エヌ・エイ・セキュエンセズー１−スフ／１ｚ−７オ７−セ ーム”　（’　ＲｅｃｏＩＩｌｂｉｎａｎｔＨｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　１５ｏｌ ａ口ｏｎ　ｏｆ　５ｅｒｉｎｅ　ＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ａｎ ｄ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　Ｓａｍｅ　″）と題 するブラデツブ・ケイ・パンジオパブアイ等の米国特許出願第　・　号中に示さ れている。蛋白質同族体を生化学的に合成する他の方法は、この技術分野におい て通常の熟練度の者には知られており、そしてそれらおよび他の同族体のｆｊＩ 　ｆｆＪのために、本発明の範囲内に包含することが意図されている。

本発明のプロテアーゼインヒビターおよびその同族体は、セリンプロテアーゼイ ンヒビター活性、特に白血球エラスターゼインヒビター活性を一所有する医薬製 品の形において、人間および動物用途を意図される。活性成分少くとも１つ、本 セリンプロテアーゼインヒビター１つを含有する医薬製剤はまた、意図される投 薬形に依存し、適当な医薬的に受容・しうる担体、希釈剤、充項剤、結合剤およ び他の試形薬を含有することが期待される。経口投与のためには、工程は、消化 管中における活性蛋白質の分解を防止するようになされなければならない。腸訂 被で投薬形が、経口投与に適当な１つの形として意図される。もしも非経口投与 が選択されるならば、製剤は、水、または塩溶液、また（よ他の９認的に受容し ろる懸濁化剤を含有しうる。一般的に、非軽口投与が意図される製剤は、全製剤 な体液と等張にするのに充分な１度にｊ３ける塩化ナトリウムを含有するのが好 ましい。本発明のセリンプロテアーゼインヒビター、特に白血球エラスターゼイ ンヒビター蛋白質を含有づる医薬製剤は、局所化酵素不均衡の治療のために、注 射または局所適用により局所的に投与されうろことがまた意図される。本インヒ ビター、特に白血球エラスターゼインヒビターはまた、特に肺気腫の治療におけ る如く肺に適用するとき、エアロゾルとして投与しうる。それらの場合、適当な 担体、希釈剤およびプロペラントが使用される。

投与されるプロテアーゼインヒビターの塁は、各投薬状態において、生物中に存 在する過剰の蛋白分解酵素の量に依存する。適当な用Ｍを決定するためには、存 在する蛋白分解酵素の過剰１を定足し、そして投与される特定の種のプロテアー ゼインヒビターまたはそれらの混合物の活性に基き、過剰の蛋白分解酵素を中和 するのに必要なプロテアーゼインヒビターの総量を決定しつる。そのような決定 は免疫学的障害の治療における治療用量の決定において、この技術分野において 通常の熟練度の者により定常的になされ、そして特に標準検定およびここに開示 された検定の知識の下に、彼等により過度の実、験なしに定常的に遂行される０ ！業の範囲内にある。しかしながら、本発明のプロテアーゼインヒビターの大過 剰１は、過剰の蛋白分解酵；；モをイｊ８ｒろ生物に投与するとき、毒性でなく または悪い反応を生じないと信じられることは認識されるべぎである。最適量に 比し少ないｆｌｌよりはむしろプロテアーゼインヒビターの最適［迂の過剰にお ける母を使用するのが好ましい。

特定の問題またはｌｉ境に対する本発明の教示の通用は、ここに含まれる教示の 知識の下に、この技術分野において通常の知識を有する者の能力の・頂囲内にあ ることは理解されるべきである。本発明の生成物の例、ならびにそれらの単離お よび製造のための例示の方法は、以下の実施例中に現れる。

例１ 耳下腺分泌からの人間白血球エラスターゼインヒビターの精製 耳下腺分泌を、志願者から、耳下腺導管の出口に付した吸引器具で採取した。分 泌は、酢っぽいキャンデーをしゃぶることにより刺激した。２対３１　（Ｔｗｏ 　ｔ＊　ｔｈｒｅｅｌｉｔｅｒｓ　）の貯蔵した耳下腺分泌を、水酸化す１〜リ ウムでｐＨ６、ｏにもっていき、そして遠心分離して、沈澱を除去した。上澄液 を０．０５Ｍ酢酸す１・・リウム、ｐＨ６，０および０．００５ＭＩ化す［−リ ウムで平衡化したＳＰセファデックスＣ５０の２．５Ｘ４０．０ｍカラムに適用 した。カラムを０．００５から１Ｍまでの塩化ナトリウムの線状グラジエン１〜 で溶出した。得られた画分を、インヒビターの存在につき免疫検定により試験し た。

活性のピークに相当でる両分は、０．６Ｍ付近で得られたものであった。それら 画分をアミコンＩＪＭ２フィルターに通す限％濾過により３ｍに濃縮し、そして 濃縮物を０．０５Ｍトリス、Ｉ］Ｈ７，４および０．５Ｍ塩化ナトリウムで平衡 化したセファデックスＧ５０の１．６×１００　ｃｍカラムに適用した。カラム をついでこのバッファーで溶出し、そして両分を免疫検定により試験した。

活性画分を貯蔵し、そして上記の如く限外濾過により濃縮した。２から４■まで の間のインヒビターが回収され、それは基本的に１００％活性であった。

例２ 化刃性気管支粘摸から人間白血球エラスターゼインヒビターの精製 気管支粘液を、小吸気疾患の病院患者から採取し、そして貯蔵した。貯蔵物を凍 結し、そして凍結乾燥した。

凍結乾燥粉末を５％過過塩耐酸冷溶液に懸濁し、そして混合物を２時間激しく攪 拝し、そして４Ｍ水酸化カリウムの添加により中和した。混合物を、０℃におい て１２．０００ｇで３０分間遠心分列して、不溶物を除去した。

蛋白質の粗溶液を、ＩＣ）０．０００ダル１〜ンより大きい、そしてｉｏ、ｏｏ ｏダルトンより小さい分子用のすべての物質を除去するように設計された摸に通 を限外幻過により分画した。第１工程において、溶液は、薄チャンネル限外濾過 装買中のアミコンＸ〜Ｉ　１００ＡＩに再循環した。膜を通過した物τ運な、つ いでＸＭ　１００Ａ膜をＹＭ　１０に置換した同じ装置に通した。物質は、ミニ タン装ｕ中におけるミリボア１００に、１にの最初の再循環により分画すること がまた可能であった。この場合、フィルターを通過する吻買は、ついで１０に力 を有する同じ装置に通した。両方の場合において、膜により保持された物質は、 引続く処理のために回収された。

限外濾液を、逆雁高圧兼体クロマ（−グラフィ（１１ｐｆｃ）カラム上、す０マ ドグラフイした。蛋白質総１約２０ｎｙｉおよびインヒビター約０．６ηを含有 する約１ｄを、ＲＰａカラム［ジンクロム・インク７（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ　Ｉｎ ｃ、　）　、リンデン（＋−１ｎｄｅｎ＞　、インデアナ（Ｉｎｄｉａｎａ　） 　ｌ上に、１分当り１．屁の流速でのぜだ。蛋白質を、水中のトリフルオロ酢酸 の０．０５％溶液、ついでアセトニトリル中の０．０５％トリフルオロ酢酸（Ｔ ＦＡ）のＯから５０％溶液までの線状グラジェントで溶出した。両分を採取し、 そして既知量のキモトリプシンと混合し、引続いて上記標準方法を使用して残留 活性キモトリプシンを決定することにより、プロテアーゼインヒビター活性につ き検定した。活性ｖＩＪ質は、２５％および３０？６アセトニトリル溶液の間で 溶出した。それら画分を、更に処理するために貯蔵した。

ＲＰａカラムからの貯蔵した画分を凍結乾燥し、そして、０．０５Ｍリン酸ナト リウム、ｐｌ＋６．０に♂かし、そして同じバッファーで平衡化したブラウンリ ー　ＣＸ３００カチオン交換カラムに）各月した。カラムをＯから１００％まで の０．５Ｍリン酸す１〜リウム、ＤＨ６，０の線状グラジェントで溶出した。活 性画分を、それらのキモ１〜リブシンを阻害する能力につき、再び検出した。

０．２４Ｍ、０．２６Ｍおよび０．２８Ｍホスフェートで溶出する３つの活性ピ ークを検出した。活性物質の３つの貯蔵物を作り、そしてそれらを凍結して貯蔵 するのに先立ち、ＹｌｖｌｌＯ膜を存するアミコン装置中で脱塩および濃縮した 。

各両分の活性をキモトリプシンに対する検定により決定し、そして蛋白質濃度は ブラッドフォード検′定（ｆｌｒａｄｒｏｒｄ　ａｓｓａｙ）　［アナリチカＪ し・バイオケム（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、７２　：　２ ４８　（１９７６）　］により決定した。各画分は、例）１の耳下腺分泌から精 製されたインヒビターにつき観察されたそれの約８０％であるキモトリプシンに 対する活性を有した。

例３ 耳下腺分泌から単離された白血球エラスターゼインヒビターのアミノ酸配列の決 定 天然インヒビターを、標準方法により還元およびカルボキシメチル化した。

インヒビター１．０η（８Ｑｎｍｏｌ）を、ジチオスレイトール１．３２Ｉｌｌ ｏｌおよびトリスバッファー、ｐＨ８，０を含有する０、１ＭトリスＨＣ１、ｐ Ｈ８，０中の６Ｍグアニジウム塩酸塩溶液６００ｅ中に溶かした。

３７℃で１時間後に、（２−”Ｈ）ヨウド酢酸３．３２０ｍｏｌを加え、そして インキュベーションを３７℃で更そして３７℃で１＠間インキュベート後に、別 の（２−３）−１）］ウド酢酸１．３６ｎｍｏｌを加えた。３７℃で１時間イン キュベートの後、反応混合物を、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含有するトリスバッ ファー、ｐｌ（８，○に対し広範に透析した。生成した溶液をジンクロムＲＰＳ ｈｐＪｃカラムに通用し、そして生成物を水中の０．０５％ＴＦＡ、ついで７セ トニトリル中の０．０５％ＴＦＡの線状グラジェントで、カラムから溶出した。

還元されたカルボキシメチル化蛋白質は、２１５および２８０　ｎＪにおける吸 収、ならびにそれら画分の（３日）金遣により決定される如く、２２％アセトニ トリル溶液において溶出した。この物質な、次の使用のために真空下に乾燥した 。

還元されたカルボキシメチル化蛋白質は、アミノ酸配列の残基１から４１までの 同定を生じる自助エドマン分解により配列づけした。それらは次の如くである： 還元されたカルボキシメチル化蛋白質を、マウス下顎プロテアーゼでの消化に付 し、そして生成したペプチドをジンクロムＲＰａカラム上、上記と同じ溶液およ びグラジェントを使用する逆ＰＪｈｐＩＣにより分列した。２０％アセトニトリ ル溶液で溶出するそれらペプチドの１つを自動化エドマン分解により配列づけし 、そして次の結果を得た： この同じペプチドを、キモトリプシンでの消化に付して２つの新しいペプチドを 得、それを再び上記に示した如くジンクロムＲＰＳカラム上の逆５ｈｐｚｃによ り分離した。１７％Ｍ　ｅ　ＣＮアセトニトリルで溶出するそれらの１つを自動 化エドマン分解により配列づけし、そして次の配列を（Ｓた： 還元されたカルボキシメチル化蛋白質を、ｌｊ／Ｓ　−Ｃプロテアーゼで間化し 、そして生成したペプチドをジンクロムＲＰＳカラム上の逆５ｈｐＪＣにより分 子４ｔ　ｂた。

１３％および１５％アセトニトリルの間で溶出する（３Ｈ）含有物質のピークを エドマン分解に付し、それは次の配列を与えた。

還元されたカルボキシメチル化インヒビターのマウス下顎プロテアーゼ間化から 得られ、そして２６％および２８％アセトニトリルの間で溶出するペプチドを自 動化エドマン分解により配列づけし、そして次の配列を得た：還元されたカルボ キシメチル化インヒビターを■８プロテアーゼでの間化に付し、そしてペプチド をジンクロムＲＰＢカラム上の逆ｆｆ１ｈｐｉＣにより分離した。１９％アセト ニトリルで溶出するペプチドを自動化エドマン分解により配列づけし、そして次 の配列を得た：還元されたカルボキシメチル化インヒビターの下顎プロテアーゼ 消化から生成し、そしてジンクロムＲＰａカラムから２６％および２８％アセト ニトリルの間で溶出するペプチドを、更にトリプシンで消化した。生成したペプ チドを同じカラム上の逆Δｈｐ１ｃにより分離し、９％アセトニトリル゛で溶出 するペプチドを手操作エドマン分解により配列づけして、次の配列を得た。

５ｅ＝−Ｃ７ｉ−ＱＴＩｈ上−５ａ＝−Ｐ＝ｓ−ＶａニーＬｙｓ−Ａｌａ同じ組 成および配列のペプチドは、蛋白質のＬｙｓ　−Ｃプロテアーゼ消化から噺離し つる。このペプチドは、ジンクロムＲＰＳカラムから８および１００６アセ：− ニトリルの間で溶出する。

還元されたカルボキシメチル化蛋白質を６Ｍ塩酸中で加熱することにより加水分 解し、そしてＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動からの分子」約１４．０ ００に基くその構成アミノ酸は次のものであると決定された：Ａ１ａ　３．５　 Ａｒｑ　５．８　Ａｓｐ　８．５Ｃｙｓ　１５．７　Ｇｆｆｌｕ　５．２　Ｇｌ ｙ　１０．６Ｈｉｓ　ｏ、ｏ　１１ｅ　１．ＯＬｅｕ　５．０しＶＳ　１６．２ 　Ｍｅｔ　４．Ｏｐｈｅ　２．１Ｐｒｏ　１４．８　Ｓｅｒ　、３．７　Ｔｈｒ 　２．４Ｔｙｒ　２．１　Ｖａｊ！　４．７ 上記データは、還元されたカルボキシメチル化インヒビターから得られる１組の 重なり合うペプチドを限定することが決定された６従って、本インヒビターの全 配列は次の如くである： ５ｉｒ−Ｇｌｙ−ＬＹ＋１−５ａｒニー？！−、ｅ−Ｆ：＋ｙｓ−−−ＬＹ−Ｖ ａＬ−ζＹｑ−？＝＝−Ｅ”：：−Ｃ−’ｆ　５−’＋Ｙ！！−５６ｒ−人工ｈ −Ｇ１．ニーζ：１５−ＬａＵ−Ａ：ｑ−で７ｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−９＝ｖ−’ ｓＬ＊−ζＨｔｓ−ＧＬｗ−５ａｒ−λコローで＝ｐ−コ１ニーζＹ５−ｐＨロ ーＧＬＹ−乙Ｙ＋４−乙１／！！−Ａｒｇ−ＣＹｓ−（ｙｓ−？＝ニーＡｓｐ− τｉ；−（：／Ｓ−；１７−：ｊ−Ｉ＋Ｙツーζｙｓ−Ｌａｕ−ｋｓｐ−９＝ｓ −Ｖａ上−ｋｓｐ−で５２社ローＡｓｍ−：’”：Ｏ−″コｒ−入ｒｑ−＾ｒ； 　−−ＹＭ−？＝＝−ＧＬ　Ｙ−乙Ｙ３−ζｙｓ−；ｒ＝−Ｖａニーτ５ｚ−で ７＝−ＧＬｙ−ＧＬ　ニーζｙｓ−乙ａｕ−＝＠セーＬａｕ−Ａ＋ｎ−社ロー２ ＝ローＡｓｎ−Ｐｈ＠−ζ７３−Ｇユ１−相ｅ−Ａｓｐ−ＧＬｙ＜Ｌｓ−ζＹ５ −Ｌ’／’１−Ａｒｑ−人Ｓ９−乙ａｕ−ｔ＋Ｙｓ−−：ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ ＜１７−嗣ａｔ−ζＹｓ−ＧＬ　Ｙ−乙Ｙト５ＩＩｒニーこＹｓ−Ｖａ上−５ａ ｔ−ｐ＝ローＶａ上−乙Ｙ５−人上４この蛋白質の塩酸加水分解物から予珂され たアミノ酸組成は、次の如くである： Ａｆａ　３　ＡｒＣ１５Ａｓｐ　９　Ｃｙｓ　１６ｃ＋ｉｙ　９　Ｇ！！ｕ　７ 　Ｈｉｓ　Ｏ１ｆｆ１ｅ　１１ｅｕ　５　Ｌ￥Ｓ　１５　Ｍｅｔ　４　Ｐｈｅ　 ２Ｐｒｏ　１３　Ｓｅｒ　６　Ｔｈｒ　４　Ｔｙｒ　２Ｔｒｐ　１　Ｖａｌ　５ 更に、ＣｙＳ残基のずべてはお互いに詰合してジスルファイド結合を形成するも のと信じられる。

例４ 気管支粘膜からのエラスターゼインヒビターの、耳下腺からのそれとの同定 ブラウンソーＣＸ３００カラムから０．２８Ｍホスフェートで溶出するインヒビ ターは、次の如く特徴づけられた： ｆａ）インヒビターの検体を、標準条件下に、６〜１塩酸中で加熱することによ り加水分解した。本インヒビターのアミノ酸組成は、 Ａ１８３．８　Ａｒｇ　５．０　ＡＳ＋）　８．８ＧＡＶ　１１．３　Ｇｌｕ　 ６．３　Ｈｉｓ　０ＩＪｅ　１．３　Ｌｅｕ　５．ＯＬｙｓ　１３．８Ｍｅｔ　 ３．８　Ｐｈｅ　２．５　Ｐｒｏ　１２．５Ｓｅｒ　６．３　Ｔｈｒ　３．８　 Ｔｙｒ　１．３これは、耳下腺からのインヒビターのアミノＭ組成、あるいは上 記配列から計算されるそれと著しくは泪近しでいない。

（ｂ）本、インヒビターを、耳下腺からのインヒビターにつき旧に記した条件下 に還元し、そしてカルボキシメチル化した。この蛋白質をついでマウス下顎プロ テアーゼで消化し、そして生成物をジンクロムＲＰＳカラム土の逆ｍ　ｈ　ｐＩ 　Ｃにより分析した。消化パターンは、ピークが耳下腺インヒビターの異った険 木間でさえも溶出立コにおいて異っている３１および３５％アセトニトリルの間 で溶出するピークの形状を除いて、同時に操作した耳下腺からの還元されたカル ボキシメチル化インヒビターのそれと区別できないようにみえる。これは多分、 単一ペプチドの化学的変形から生じる。

［ｃ１本インヒビターを自助化エドマン分解に付し、そして第１の１４アミノ酸 について次のアミノ酸配列を得た：：＜−ｎｙ−ＬＹｓ−’！−？Ｓ、ｅ−ＬＹ ｓ−へ上ａ−Ｇｌｙ−Ｖａ１−Ｚ−Ｐτロー？？ローｔ、ｙｉ−ＬｙｉそのＸ、 Ｙおよび２は、同定するには低すぎる水準で回収されるアミノ酸である。

気管支粘液から単離されたインヒビターと耳下腺分泌から単離されたそれとの間 の強い類似性は、それら２つの蛋白質の間の相違についてどのような証随も不存 在であることと一緒で、それらが同一かほぼ同一であることを指示する。

例５ それを白血球エラスターゼのインヒビターとして臨床使用に適当なものとするイ ンヒビターの特徴の同定（ａ）例１の耳下腺インヒビターの溶液をＤＨ８，０バ ツフアーおよび人間血清アルブミンの存在において白血球エラスターゼの溶液に 加え、そして残留旧１ツ素を、メトキシサクシニル−Ａｆａ−Ａｆａ−Ｐｒｏ− ＶａＪｐ−ニトロアニリドを加水分解するその能力を検定することにより決定し た。データー１よ、１インヒビターが１酵素を不活性化し、そして酵素−インご ビター複合体のｗ１列定数が５Ｘ１０−”Ｍである酵素−インヒごター相互反応 の標Ｑ−［ｌ−デルに適合する。

同様の実験において、いくつかの他の人間プロテアーゼを■害する本インとビタ ーの能力を決定した。それらの解離定数を下記表に示す。

２５°Ｃおよびｐｌ＋７．８における 例１のインヒビターとの複 セリンプロテアーゼ　合体の解列定数 人間白血球エラスターゼ　５ｘ１０−１０Ｍ人間カテプシンＧ　１．５Ｘ１０− ８ｔｖ１人間トリプシン　１．５Ｘ１０’Ｍ 人間キモトリプシン　１．５Ｘ１０”１０Ｍ人間膵臓エラスターゼ　２Ｘ１０” ”Ｍ（ｂ）０．２Ｍｔ−リスＨＣ１，ａ１１７．８中の耳下腺の溶液を栓つきチ ューブ中で７０℃に加熱し、そして検体を各時間に検定のために採取した。結果 は、インヒビクーが大略第１次カイネチツクスで活性を失い、そして約１０時間 の半減期を有することを示した。この安定性の程度は、溶液中の蛋白質につき例 外的であり、そしてエラスターゼインヒビターとしての臨床使用のための蛋白質 の製剤において、顕苔な利点を購成する。

（ｃ）７０％ギ酸中の本インヒビターの溶液を３７℃で４０時間維持し、そして 検定したとき、そのもとの活性の少くとも８０％を維持することが認められた。

（ｄ）本インヒビターの溶液を、マウス下顎プロテアーゼ、クロストリパインお よびサーモリシンで処理した。後者酵素のみが、３７℃において３時間で、阻害 活性の著しい損失を生じた。この酵素による分解に対する抵抗性は、それが化膿 性気管支粘液中に存在しうる型の敗の酵素に対するインとビターの一般的抵抗性 を支持するので、インビボにおける白血球エラスターゼインヒビターとしてのこ の蛋白質の使用において著しい利点を宿成する。

（ｅ）すべての限定された構造を失った池の蛋白質との類似性により予測して、 ６Ｍグアニジニウム塩酸塩および３ＱｍＨジチオスレイトール中の本インヒビタ ーの溶液は、酸化グルタチオンを使用したジチオスレイトールの１０倍過剰にお いて加え、そして溶液を２５ｍ）Ｈ−リスＨＣ１、ｐＨ９，０で１０倍希釈した とき、その天然の阻害活性の少くとも９０％が回収された。この結果は、本蛋白 質の活性構造がポリペプチド鎖の安定な構造であることを示す。結果は更に、本 蛋白質が各種の苛酷な処理下に活性を保ち、そして活性を破壊する若干の条件下 においてさえも、それら条件が逆転されたとき活性を回復する能力を保持しうろ ことを意味する。

この技術分野において熟練している者に゛は、各種の変形および変化が本発明の 方法および生成物に対しなしうろことは明らかであろう。従って、本発明は、そ れらが−添付された請求の範囲およびそれらの均等内に入るという条件で、本発 明の変形および変化を包含する。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．セリンプロテアーゼインヒビター活性を所有する少くとも１つの活性部位を 有する精製された単一ポリペプチド鎖蛋白質からなり、該蛋白質が耳下腺分泌か ら単離される天然セリンプロテアーゼインヒビターと実質的な相同性を示す、セ リンプロテアーゼインヒビター蛋白質。
2. ２．該少くとも１つの活性部位が、耳下腺分泌から単離される天然セリンプロテ アーゼインヒビターのそれと生物学的に均等な様式で機能する、請求の範囲第１ 項に従うセリンプロテアーゼインヒビター。
3. ３．該セリンプロテアーゼインヒビター活性が、白血球エラスターゼインヒビタ ー活性、カテプシンＧインヒビター活性、トリプシンインヒビター活性、膵臓エ ラスターゼインヒビター活性およびそれらの組合せからなる群から選択される、 請求の範囲第２項に従うセリンプロテアーゼインヒビター。
4. ４．該セリンプロテアーゼ活性が、白血球エラスターゼインヒビター活性である 、請求の範囲第３項に従うセリンプロテアーゼインヒビター。
5. ５．該少くとも１つの活性部位が、耳下腺分泌から単離される天然白血球エラス ターゼインヒビターの白血球エラスターゼインヒビター活性部位と実質的に相同 性である、請求の範囲第４項に従うセリンプロテアーゼインヒビター。
6. ６．該単一ポリペプチド鎖蛋白質が、少くとも２つの活性部位を所有する、請求 の範囲第１項に従うセリンプロテアーゼインヒビター。
7. ７．該単一ポリペプチド鎖蛋白質が、トリプシンインヒビター活性および白血球 エラスターゼインヒビター活性を示しうる活性部位を所有する、請求の範囲第６ 項に従うセリンプロテアーゼインヒビター。
8. ８．該単一鎖ポリペプチド鎖蛋白質の該少くとも１つの活性部位が、高められた プロテアーゼインヒビター活性を有する蛋白組成物を形成させるために、耳下腺 分泌から単離される天然セリンプロテアーゼインヒビター上の対応の部位から変 化された、請求の範囲第１項に従うセリンプロテアーゼインヒビター。
9. ９．該インヒビターのＮ−末端アミノ酸がセリンである、請求の範囲第１項に従 うセリンプロテアーゼインヒビター。
10. １０．セリンプロテアーゼインヒビター活性を所有する少くとも１つの活性部位 を有する精製された単一ポリペプチド鎖蛋白質からなり、該蛋白質が次のアミノ 酸配列 【配列があります】 〔式中、 Ｒ１およびＲ７は、等しいかまたは異つたものであり、そして置換または未置換 のアミノ酸残基またはそれらの誘導体からなる詳から選択され；そして、Ｒ２、 Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８およびＲ９は、等しいかまたは異つたものであり 、そしてメチオニン、バリン、アラニン、フエニルアラニン、チロシン、トリプ トフアン、リジン、グリシンおよびアルギニンからなる詳から選択される〕から なるものである、セリンプロテアーゼインヒビター蛋白質。
11. １１．Ｒ１がセリンであり、そしてＲ７がアラニンである、請求の範囲第１０項 に従うセリンプロテアーゼインヒビター。
12. １２．Ｒ２およびＲ３がメチオニンである、請求の範囲第１０項に従うセリンプ ロテアーゼインヒビター。
13. １３．Ｒ２およびＲ３がアルギニンである、請求の範囲第１０項に従うセリンプ ロテアーゼインヒビター。
14. １４．Ｒ２がアルギニンであり、そしてＲ３がメチオニンである、請求の範囲第 １０項に従うセリンプロテアーゼインヒビター。
15. １５．Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６がメチオニンであり、そしてＲ８およ ひＲ９がロイシンである、請求の範囲第１０項に従うセリンプロテアーゼインヒ ビター。
16. １６．Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８またはＲ９の１つもしくはそれ以上 がバリンであり、該インヒビターが酸化的不活性化に対し改善された抵抗性を有 するものである、請求の範囲第１０項に従うセリンプロテアーゼインヒビター。
17. １７．Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８またはＲ９の１つもしくはそれ以上 がアラニンであり、該インヒビターが膵臓エラスターゼを阻害する改善された能 力を有するものである、請求の範囲第１０項に従うセリンプロテアーゼインヒビ ター。
18. １８．Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８またはＲ９の１つもしくはそれ以上 がフエニルアラニン、チロシンおよびトリプロフアンからなる群から選択され、 該インヒビターがカテプシンＧを阻害する改善された能力を有するものである、 請求の範囲第１０項に従うセリンプロテアーゼインヒビター。
19. １９．Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８またはＲ９の１つもしくはそれ以上 がリジンまたはアルギニンからなる群から選択され、該インヒビターがトリプシ ンを阻害する改善された能力を有するものである、請求の範囲第１０項に従うセ リンプロテアーゼインヒビター。