JP3186781B2

JP3186781B2 - 新規オリゴペプチド

Info

Publication number: JP3186781B2
Application number: JP05374091A
Authority: JP
Inventors: 進丸山; 秀興田中; 英勝前田; 新介三吉; 博巳石川; 史生福井
Original assignee: Showa Sangyo Co Ltd
Current assignee: Showa Sangyo Co Ltd
Priority date: 1990-02-27
Filing date: 1991-02-27
Publication date: 2001-07-11
Anticipated expiration: 2016-07-11
Also published as: JPH0687886A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアンジオテンシン変換酵
素阻害作用を有し、高血圧症の治療または予防に有用で
あると期待される、トウモロコシタンパク質由来の新規
オリゴペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】高血圧症の発症にはレニン−アンジオテ
ンシン系が深いかかわりを有していることがよく知られ
ているが、このレニン−アンジオテンシン系にはアンジ
オテンシン変換酵素(EC3.4.15.1,以下ACE とも言う) が
重要な役割を果たしている。この場合ＡＣＥは、肝で分
泌されるアンジオテンシノーゲンが腎で産生される酵素
レニンにより分解されたアンジオテンシンＩ(Asp-Arg-V
al-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu) に対して作用し、こ
のものをアンジオテンシンII(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His
-Pro-Phe)に変換させる。そして、このアンジオテンシ
ンIIは血管壁平滑筋を収縮させて血圧を高め、さらに副
腎皮質に作用してアルドステロンの分泌を促進させるな
どの作用を有する。また、血漿に存在する酵素カリクレ
インはキニノーゲンと呼ばれる蛋白質を分解し、血管を
拡張させ降圧させるブラジキニンを産生するが、このブ
ラジキニンはACE の作用により分解され、不活性化され
てしまう。このように、ACE は一方で昇圧性ペプチド(
アンジオテンシンII) を生じさせるとともに、他方で降
圧性ペプチド( ブラジキニン) を分解し、結果として、
血圧を上昇の方向に進める。したがってこの酵素活性を
抑制することによって血圧上昇を防ぐこと( 降圧) が可
能である。

【０００３】ＡＣＥの活性阻害物質としては蛇毒より得
られた数種のペプチド性阻害剤を初めとして、カプトプ
リル(D-2- メチル-3- メルカプトプロパノイルーL-プロ
リン) などの合成物質が多数知られており、このうちカ
プトプリルは経口降圧剤として既に実用に供されてい
る。

【０００４】また、近年、微生物あるいは種々の食品中
にもＡＣＥ阻害物質が見い出され、降圧剤としての実用
化が検討されている（末網邦男、発酵と工業46(No.3)、
179〜 182 (1988))。さらに食品タンパク質、特にカゼ
イン、トウモロコシ種子タンパク質由来のＡＣＥ阻害物
質について丸山進、バイオサイエンスとインダストリー
47 (No.11)、38-42(1989) 及び丸山進、化学と生物22
(No.8),485-487(1984)に報告がなされている。またトウ
モロコシ種子タンパク質由来のＡＣＥ阻害物質について
は丸山進ら、昭和63年度日本醗酵工学会大会講演要旨集
23頁(1988)、丸山進ら、平成１年度日本農芸化学会講演
要旨集８頁(1989)、三吉新介ら、平成１年度日本栄養食
糧学会要旨集 113頁(1989)及び三吉新介ら、日本農芸化
学会誌64(3) 、1990年度大会講演要旨集555 頁にも報告
がなされている。また、トウモロコシ種子タンパク質由
来のＡＣＥ阻害物質、血圧降下剤について本出願人によ
る以下の出願がある：特願昭63-185467 、63-185468 、
特願平1-59549 、1-59550 。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】新規有用な血圧降下剤
ひいてはアンジオテンシン変換酵素阻害剤は常に求めら
れており、技術の豊富化をもたらすものである。

【０００６】本発明はアンジオテンシン変換酵素阻害作
用を有し、血圧降下剤として有用な新規オリゴペプチド
を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の上記課題はトウ
モロコシタンパク質の１種であるα−ゼインに由来する
新規オリゴペプチド、及びα−ゼインに由来する特定オ
リゴペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵
素阻害剤に係る以下の発明によって達成された。

【０００８】1. L-Leu-L-Ser-L-Pro、L-Val-L-Ser-L-P
ro、L-Leu-L-Asn-L-Pro、L-Val-L-Ala-L-TyrまたはL-Le
u-L-Ala-L-Tyr。

【０００９】2. L-Tyr-L-Val 、L-Leu-L-Tyr 、L-Leu-
L-Phe 、L-Phe-L-Tyr 、L-Tyr-L-Argまたはその薬理上
許容される酸付加塩、L-Leu-L-Ser-L-Pro 、L-Leu-L-Gl
n-L-Pro 、L-Val-L-Ser-L-Pro 、L-Leu-L-Leu-L-Pro 、
L-Leu-L-Asn-L-Pro 、L-Phe-L-Leu-L-Pro 、L-Leu-L-Al
a-L-Ala 、L-Val-L-Ala-L-Ala 、L-Leu-L-Gln-L-Gln、L
-Val-L-Ala-L-Tyr 、L-Leu-L-Ala-L-Tyr 、L-Leu-L-Ser
-L-His またはその薬理上許容される酸付加塩、L-Ile-L
-Arg-L-Ala またはその薬理上許容される酸付加塩、L-L
eu-L-Arg-L-Pro またはその薬理上許容される酸付加
塩、及びL-Ile-L-Arg-L-Ala-L-Gln-L-Gln またはその薬
理上許容される酸付加塩からなる群から選ばれる１種以
上を有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素
阻害剤。

【００１０】３．L-Tyr-L-Val 、L-Leu-L-Tyr 、L-Leu-
L-Phe 、L-Phe-L-Tyr 、L-Tyr-L-Argまたはその薬理上
許容される酸付加塩、L-Leu-L-Ser-L-Pro 、L-Leu-L-Gl
n-L-Pro 、L-Val-L-Ser-L-Pro 、L-Leu-L-Leu-L-Pro 、
L-Leu-L-Asn-L-Pro 、L-Phe-L-Leu-L-Pro 、L-Leu-L-Al
a-L-Ala 、L-Val-L-Ala-L-Ala 、L-Leu-L-Gln-L-Gln、L
-Val-L-Ala-L-Tyr 、L-Leu-L-Ala-L-Tyr 、L-Leu-L-Ser
-L-His またはその薬理上許容される酸付加塩、L-Ile-L
-Arg-L-Ala またはその薬理上許容される酸付加塩、L-L
eu-L-Arg-L-Pro またはその薬理上許容される酸付加
塩、及びL-Ile-L-Arg-L-Ala-L-Gln-L-Gln またはその薬
理上許容される酸付加塩からなる群から選ばれる１種以
上を有効成分として含有する血圧降下剤

【００１１】上記で酸付加塩は、製薬上許容される酸
（無機酸及び有機酸）付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素
酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、マレイン
酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸
塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホ
ン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等を包含す
る。

【００１２】本発明で用いるオリゴペプチドはトウモロ
コシタンパク質の酵素加水分解法、有機化学的な合成方
法によりアミノ酸を段階的に導入する方法、加水分解酵
素の逆反応を利用したペプチド合成法、遺伝子工学的方
法等によって製造することができる。

【００１３】トウモロコシタンパク質の酵素加水分解法
について説明する。原料トウモロコシタンパク質として
はグルテンミールを用いてもよいが、それをさらに精製
したα−ゼインを用いる場合について説明する。α−ゼ
インは市販のものを使用してもよく、またグルテンミー
ルから分離したゼインから公知の手法により分離したも
のでよい。

【００１４】酵素としてはエンド型プロテアーゼ、例え
ばパパイン、サーモライシン等を用いることができ、特
にサーモライシンが好ましい。サーモライシンは高純度
のものでも、工業用グレードのもの（例えばサモアーゼ
（大和化成）) でもよい。

【００１５】以下α−ゼインのサーモライシン処理につ
いて説明する。この処理は通常単に水中または緩衝液
（例えばトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液）中で行う。
基質濃度は反応時に攪拌混合ができる範囲内であればい
ずれでもよいが、攪拌が容易なタンパク質濃度２〜20％
(w/v) の範囲で行うのが好ましい。酵素サーモランシン
の添加量は力価により異なるが通常はタンパク質あたり
0.01重量％以上、好ましくは0.1 〜10重量％が適当であ
る。サーモライシンは一部を反応中に添加してもよい。
反応のpH、温度はサーモライシンの至適pH至適温度付近
を用いればよく、pH６〜10好ましくは７〜８、温度30〜
80℃好ましくは60〜70℃が適当である。反応中のpHの調
整は必要に応じ水酸化ナトリウム水溶液、塩酸等により
行う。

【００１６】反応時間は酵素の添加量、反応温度、反応
pHによって異なるため一定ではないが、通常は１〜50時
間程度である。

【００１７】加水分解反応の停止は、加水分解物の加熱
あるいはクエン酸、リンゴ酸等の有機酸または塩酸、リ
ン酸等の無機酸または水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム等のアルカリの添加によるpHの変化などによる酵素の
失活、限外濾過膜等による酵素の濾別など公知の方法に
従って行うことができる。ついで加水分解液を固液分離
( 例えば遠心分離、濾過等) し、分離液を限外濾過、ゲ
ル濾過等により分別して例えば分子量が 10000以下の画
分を含有する液を得る。この液中には本発明の目的オリ
ゴペプチドが含有されており、以下この液またはその濃
縮物( 例えば凍結乾燥物) をさらに分別して個々の目的
オリゴペプチドを得る。

【００１８】上記凍結乾燥物をここではα−ゼイン加水
分解凍結乾燥物と称し、これを用いる場合につきさらに
説明する。

【００１９】α−ゼイン加水分解凍結乾燥物は、一法と
して、最初に陰イオン交換樹脂、例えば弱塩基性陰イオ
ン交換樹脂（例えばＤＥＡＥ−トヨパール（Toyopearl)
650M 、( 東ソー（株) 製) 処理に付すか、または陽イ
オン交換樹脂、例えば弱酸性陽イオン交換樹脂( 例えば
ＳＰ−トヨパール650M (東ソー（株）製 ) 処理に付
す。

【００２０】最初に陰イオン交換樹脂を通す分別法では
樹脂中に保持された各オリゴペプチドを直線濃度勾配溶
出( 例えばＤＥＡＥ−トヨパール650Mを使用の場合、適
当濃度の、トリスバッファー→トリスバッファー中NaCl
による溶出) によって分別する。溶出液をいくつかに分
画し、それぞれをゲル濾過( 例えばセファデックスLH-2
0 使用) 、陽イオン交換樹脂処理( 例えばSP- トヨパー
ル650M) 、逆相HPLC〔例えばカプセルパック(CAPCELL P
AK) C₁₈（資生堂）（オクタデシルシランの商品名）、
センシュウパック（Senshu PAK)1251-Y(センシュー科
学）( オクタデシルシランの商品名) 等〕等に付して単
一のオリゴペプチドに分別する。

【００２１】また、有機化学的合成法としては液相法、
固相法の２種があり、いずれも常法、例えば泉屋信夫、
加藤哲夫、青柳東彦及び脇道典著、「ペプチド合成の基
礎と実験」、丸善株式会社、１９８５、に従って行うこ
とができる。液相法では、例えば、本オリゴペプチドの
Ｃ末端に位置すべきアミノ酸であってそのカルボキシル
基をベンジル基（ Bzl )、t-ブチル基( t-Bu )等で保護
したアミノ酸と、該Ｃ末端アミノ酸の隣に位置すべきア
ミノ酸であってそのα−アミノ基をt-ブチルオキシカル
ボニル基 ( Boc )、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）
等で保護したアミノ酸をジメチルホルムアミド（ DMF
)、ジメチルアセトアミド等に溶解し、それらをジシク
ロヘキシルカルボジイミド ( DCC )及び1-ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール( HOBT )の存在下通常室温で一夜反応
させる。ついで生成物のアミノ保護基を常法によって除
去した後のジペプチド誘導体を必要に応じ、アミノ基を
保護した第３のアミノ酸と同様に反応させ、アミノ保護
基を除去し、必要に応じ同じ手順を繰り返して本オリゴ
ペプチド誘導体を得る。反応させるアミノ酸がヒドロキ
シル基、グアニジノ基またはイミダゾリル基を有する場
合には、これらの基は一般に上記反応に先立って保護す
べきである。アルコール性ヒドロキシル基の保護基はBz
l 、t-Bu等、フェノール性ヒドロキシル基の保護基は B
zl等、グアニジノ基の保護基はトシル基 ( Tos )等、イ
ミダゾリル基の保護基は Tos等を包含する。最終反応の
終了後、すべての保護基を除去して本オリゴペプチドを
得る。これらの保護基の導入及び除去は常法により行う
ことができる。

【００２２】他方、固相法に関してはペプチドシンセサ
イザーを用いる方法が近年広く用いられており、例えば
アプライドバイオシステムズ社製の４３０Ａ型ペプチド
シンセサイザーを用いて本オリゴペプチドを製造するこ
とができる。すなわち、基本的には、本オリゴペプチド
のＣ末端に位置するアミノ酸が結合したフェニルアセト
アミドメチル（ PAM )樹脂 L-Xaa-O-CH₂-PAM( Xaa はア
ミノ酸残基) ( アプライドバイオシステムズ社から入手
し得る) のＮ側から、Boc でアミノ基を保護したα−ア
ミノ酸（ Boc- アミノ酸) をペプチド結合と Bocの除去
の繰り返しによって段階的に延長する。Boc-L-Arg( Mts
)( Mts はメシチレン-2- スルホニル)及び Boc-L-Gln
は中間体としてその1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(
HOBT )エステルを経由する延長反応に付し、他の Boc-
アミノ酸は DCCの使用によるその対称的無水物を中間体
として経由する延長反応に付す。上記 Boc- アミノ酸ま
たはL-Xaa-O-CH₂-PAM において、反応に関与すべきでな
い反応性官能基がある場合には一般に適当な保護基によ
って保護すべきである。本発明に関し、保護されたBoc-
アミノ酸及びL-Xaa-O-CH₂-PAM としてBoc-L-Arg( Mts
)、Boc-L-Ser( Bzl )、Boc-L-Tyr( Br-Z )( Br-Z は4-
ブロモベンジルオキシカルボニル) 、L-Tyr(Br-Z )-O-C
H₂-PAM L-His( DNP )-O-CH₂-PAM ( DNPは2,4-ジニトロ
フェニル) 及びL-Arg( Mts )-O-CH₂-PAMが挙げられる。
これらはいずれもアプライドバイオシステムズ社から入
手し得る。４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーを用いる
合成系においてはアミノ酸原料に加え以下の試薬及び溶
媒を用いる：N,N-ジイソプロピルエチルアミン( TFA 中
和剤 )、TFA ( Boc 切断 )、MeOH (生成尿素系化合物の
溶解及び除去) 、HOBT ( 0.5M HOBT/DMF )、DCC( 0.5M
DCC/ジクロロメタン( DCM) 、DCM 及び DMF (溶媒) 、
中和剤( 70% エタノールアミン、29.5% メタノール) (
廃液の中和) 。アミノ酸原料及びこれらの試薬及び溶媒
は所定の場所に装填する。これらの使用はペプチドシン
セサイザーが自動的に行う。反応温度及び時間の調整も
自動的に行われるが、反応温度は通常室温である。上記
手順によってオリゴペプチド中の反応性基が保護された
オリゴペプチド-O-CH₂-PAMが得られる。上記固相ペプチ
ド合成の実際の操作はアプライドバイオシステムズ社に
よる４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーユーザーズマニ
ュアルによって行う。

【００２３】得られた、反応性官能基が保護されたオリ
ゴペプチド-O-CH₂-PAMを常法、例えば前記「ペプチド合
成の基礎と実験」または４３０Ａ型ペプチドシンセサイ
ザーユーザーズマニュアルに記載された方法、例えば、
保護基の切断によって生成するカチオンを捕獲するスカ
ベンジャーとしてチオアニソール及び／またはエタンジ
チオールの存在下 TFAと共のトリフルオロメタンスルホ
ン酸( TFMSA )( TFAはTFMSA の希釈剤) によって処理し
て、樹脂及び保護基を切断し、それによって目的とする
オリゴペプチドを得る。上記 TFMSA方法において、保護
されたオリゴペプチド-0-CH₂-PAMが L-His( DNP ) 残基
を有する場合には、チオフェノールによる DNPの除去後
上記処理に付す。

【００２４】本オリゴペプチドの酸付加塩は常法により
製造することができる。例えば本オリゴペプチド（塩基
性アミノ酸残基を含むもの）とそれに対し１当量の適当
な酸とを水中で反応させて凍結乾燥することにより得る
ことができる。

【００２５】本オリゴペプチド及びその酸付加塩はＡＣ
Ｅ阻害作用ひいては血圧降下作用を有し、ヒトをはじめ
とする哺乳動物の高血圧症の治療、予防に有効であると
期待される。

【００２６】本オリゴペプチド及びその酸付加塩はその
まま、または通常少なくとも１つの製薬補助剤と製薬組
成物にして使用する。

【００２７】本オリゴペプチド及びその酸付加塩は非経
口的（すなわち、静脈注射、直腸投与等）または経口的
に投与し、各投与方法に適した形態に製剤することがで
きる。

【００２８】注射剤としての製剤形態は、通常滅菌水水
溶液を包含する。上記形態の製剤はまた緩衝剤pH調節剤
( リン酸水素ナトリウム、クエン酸等) 、等張化剤( 塩
化ナトリウム、グルコース等) 、保存剤( パラオキシ安
息香酸メチル、P-ヒドロキシ安息香酸プロピル等）等の
水以外の他の製薬補助剤を含有することができる。該製
剤は細菌保持フィルターを通す濾過、組成物への殺菌剤
の混入、組成物の照射や加熱によって滅菌することがで
きる。該製剤はまた殺菌固体組成物として製造し、用時
滅菌水等に溶解して使用することもできる。

【００２９】経口投与剤は胃腸器官による吸収に適した
形に製剤する。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉
末剤は常用の製薬補助剤、例えば結合剤（シロップ、ア
ラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポ
リビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース
等）、賦形剤（ラクトース、シュガー、コーンスター
チ、リン酸カルシウム、ソルビット、グリシン等）、滑
沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレ
ングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、
カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫
酸ナトリウム等）を包含することができる。錠剤は常法
によりコーティングすることができる。経口液剤は水溶
液等にしたり、ドライプロダクトにすることができる。
そのような経口液剤は常用の添加剤例えば保存剤（ｐ−
ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン
酸等）を包含していてもよい。

【００３０】本ＡＣＥ阻害剤ひいては血圧降下剤中の本
オリゴペプチドまたはその酸付加塩の量は種々かえるこ
とができるが、通常５〜100%(w/w) 、特に10〜60%(w/w)
が適当である。本ＡＣＥ阻害剤ひいては血圧降下剤の投
与量はヒトに対して投与する場合有効成分として10〜20
0mg/kg/dayが適当である。なお、本ペプチドの急性毒性
はいずれもLD₅₀(ICR系マウス、経口投与) ＞ 3g/kgであ
る。

【００３１】また、本オリゴペプチドは多量に摂取して
も生体に悪影響を与えない利点を有することから、その
まま、または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品
中に含有せしめて血圧降下作用、高血圧予防の機能をも
たせた機能性食品、健康食品として食してもよい。すな
わち、例えば各種ビタミン類、ミネラル類等の栄養分を
加えて、例えば栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の
食品や各種形状の固形食品、さらには粉末状としてその
ままあるいは各種食品へ添加して用いることもできる。
かかる機能性食品、健康食品としての本ＡＣＥ阻害剤ひ
いては血圧降下剤中の有効成分の含有量、摂取量はそれ
ぞれ上記製薬における含有量、投与量と同様でよい。

【００３２】

【実施例】次に本発明を実施例により説明する。実施例１ (1) α−ゼイン加水分解凍結乾燥物の調製 α−ゼイン（和光純薬）100gを蒸留水2000mlに加え、サ
ーモライシン( 大和化成) 1gを加え、攪拌下、室温から
65℃に１時間かけて昇温し、65℃で17時間反応させた。
この反応中 5NNaOH を適宜滴下してpHを8.0 に保った。
ついでサーモライシンをさらに1g追加し、 65 ℃で24時
間、pHを8.0 に保って反応させた。酵素を失活させるた
めオートクレーブ中 105℃で５分保持した。得られた加
水分解液を5000rpm で10分遠心分離し、上清をアミコン
(Amicon)PM-10 （限外濾過膜、分画分子量10000 、アミ
コン社) を用いる限外濾過に付し、濾液を凍結乾燥して
α−ゼイン加水分解凍結乾燥物97.3g を得た。

【００３３】(2) 上記で得られたα−ゼイン加水分解凍
結乾燥物2gを２l の蒸留水に溶解し、陰イオン交換樹
脂、ＤＥＡＥ−トヨパール650Mのカラム（2.6 ×70cm)
に添加し、1500mlの5mM トリス緩衝液(pH8.3) を流し、
非吸着画分を回収し、Ａ液とした。その後1000mlの5mM
トリス緩衝液(pH8.3) と1000mlの0.3M NaCl を含む5mM
トリス緩衝液(pH8.3) による直線濃度勾配により溶出し
た。直線濃度勾配による溶出を開始してから320 〜520m
l の溶出画分をＢ液、620〜700ml の溶出画分をＣ液と
した。

【００３４】(3) Ａ画分の処理Ａ液は、凍結乾燥後、ファルマシア社製ゲル濾過樹脂セ
ファテックスＬＨ−20カラム(1.6×100cm)に添加し、30
％メタノールで溶出して脱塩した。脱塩後のＡ液をさら
に陽イオン交換樹脂ＳＰ−トヨパール650Mのカラム(2.6
×70cm) に添加し、500 mlの5mM 酢酸ナトリウム緩衝液
(pH4.0) を流した後、1000mlの5mM 酢酸ナトリウム緩衝
液(pH4.0) と0.6M NaCl を含む1000mlの5mM 酢酸ナトリ
ウム緩衝液(pH4.0) による直線濃度勾配により溶出し
た。濃度勾配による溶出を開始してから340 〜600 mlの
溶出画分をＡ１液、 950〜1050mlの溶出画分をＡ２液と
した。

【００３５】Ａ１液をさらに日本ミリポアリミテッド社
製の（以下同様）セミ分取用高速液クロ装置で分画し
た。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％トリフルオロ酢酸( 以下TFA と略す)
存在下、10から60％のアセトニトリルグラジエント（所
用時間３０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で 4.0〜 6.3分の溶出画分をＡ１−１、6.3
〜7.7 分の溶出画分をＡ１−２、9.1 〜9.3 分の溶出画
分をＡ１−３とした。

【００３６】Ａ１−1 をさらにセミ分取用高速液クロ装
置で分画した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、0 から20％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間２０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で14.3〜14.5分の溶出画分をＡ１−１−１と
した。Ａ１−２をさらにセミ分取用高速液クロ装置で分
画した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、0 から20％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間２０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で14.9〜15.1分の溶出画分をＡ１−２−１、
16.9〜17.1分の溶出画分をＡ１−２−２とした。

【００３７】Ａ２液をさらにセミ分取用高速液クロ装置
で分画した。溶出条件は下記による。カラム：カセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、0 から20％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間２０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で14.9〜15.1分の溶出画分をＡ２−１とし
た。

【００３８】(4) Ｂ画分の処理前記Ｂ液は凍結乾燥後セミ分取用高速液クロ装置で分画
した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10から60％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間３０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で6.8 〜7.8 分の溶出画分をＢ１、7.8 〜8.
3 分の溶出画分をＢ２、8.3 〜9.1 の溶出画分をＢ３、
14.2〜14.4分の溶出画分をＢ４とした。

【００３９】Ｂ１をさらにセミ分取用高速液クロ装置で
分画した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10％のアセトニトル流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で6.9 〜7.1 分の溶出画分をＢ１−１とし
た。

【００４０】Ｂ２をさらにセミ分取用高速液クロ装置で
分画した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10％のアセトニトル流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で11.2〜11.4分の溶出画分をＢ２−１とし
た。

【００４１】Ｂ３をさらにセミ分取用高速液クロ装置で
分画した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10％のアセトニトル流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で15.0〜16.0分の溶出画分をＢ３−１とし
た。

【００４２】(5) Ｃ画分の処理前記Ｃ液は凍結乾燥後、ゲル濾過樹脂セファデックスＬ
Ｈ−２０カラム（1.6×100cm)に添加し、30％メタノー
ルで溶出して脱塩した。脱塩後のＣ液をさらにセミ分取
用高速液クロ装置で分画した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10から60％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間３０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で17.6〜17.8分の溶出画分をＣ１とした。

【００４３】(6) ペプチドの同定前記Ａ１−１−１、Ａ１−２−１、Ａ１−３、Ａ２−
１、Ｂ１−１、Ｂ２−１、Ｂ３−１、Ｂ４及びＣ１の溶
出画分は各前記高速液クロによってそれぞれ単一ピーク
を示した。次にこれらの溶出画分は乾固した後蒸留水に
溶解し、これらの水溶液を用いて以下の構造解析を行っ
た。表１に６規定塩酸による 110℃24時間の加水分解後
のアミノ酸分析値（日立L-8500形アミノ酸分析計によ
る) 、質量分析値( 日本電子JMX-DX 303による) 、アミ
ノ酸配列分析データ( 島津プロテインシーケンサーPSQ-
1 システムによる) を示す。

【００４４】実施例２ (1) 実施例１(1) と同様にして調製したα−ゼイン加水
分解凍結乾燥物2gを0.02M 酢酸水溶液に溶解し、 500m
l、pH4.0 に調整したものを陽イオン交換樹脂ＳＰ−ト
ヨパール650Mのカラム(2.6×76cm) に添加し、1500mlの
0.02M 酢酸アンモニウム緩衝液(pH4.0) を流し、非吸着
画分を除去した。その後 1000 mlの0.02M 酢酸アンモニ
ウム緩衝液(pH4.0) と1000mlの0.05M 酢酸アンモニウム
緩衝液(pH8.6) とによる直線濃度勾配で溶出し、さらに
0.05M 酢酸アンモニウム緩衝液(pH8.6) で続けて溶出し
た。直線濃度勾配による溶出を開始してから 850〜1000
mlの溶出画分をＤ液、1000〜1100mlの溶出画分をＥ液、
1100〜1200mlの溶出画分をＦ液、1400〜1500mlの溶出画
分をＧ液、1920〜2120mlの溶出画分をＨ液、2200〜2270
mlの溶出画分をＩ液とした。

【００４５】(2) Ｄ画分の処理前記Ｄ液は凍結乾燥後セミ分取用高速液クロ装置で分画
した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10から60％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間３０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で10.5〜11.0分の溶出画分をＤ１とした。

【００４６】(3) Ｅ画分の処理前記Ｅ液は凍結乾燥後セミ分取用高速液クロ置で分画し
た。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10から60％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間３０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で13.0〜13.2分の溶出画分をＥ１とした。

【００４７】(4) Ｆ画分の処理前記Ｆ液は凍結乾燥後セミ分取用高速液クロ装置で分画
した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10から60％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間３０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で10.3〜10.7分の溶出画分をＦ１、12.5〜1
3.2分の溶出画分をＦ２、17.0〜18.0分の溶出画分をＦ
３とした。

【００４８】(5) Ｇ画分の処理前記Ｇ液は凍結乾燥後セミ分取用高速液クロ装置で分画
した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10から60％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間３０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で5.0 〜5.2 分の溶出画分をＧ１、13.8〜1
5.0分の溶出画分をＧ２とした。

【００４９】(6) Ｈ画分の処理前記Ｈ液は凍結乾燥後セミ分取用高速液クロ装置で分画
した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10から60％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間３０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で7.7 〜8.7 分の溶出画分をＨ１とし、9.6
〜9.9 分の溶出画分をＨ２とした。

【００５０】Ｈ２をさらにセミ分取用高速液クロ装置で
分画した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10％のアセトニトリル流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で12.6〜13.2分の溶出画分をＨ２−１とし
た。

【００５１】(7) Ｉ画分の処理前記Ｉ液は凍結乾燥後セミ分取用高速液クロ装置で分画
した。溶出条件は下記による。カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、10から60％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間３０分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm この条件下で6.5 〜7.2 分の溶出画分をＩ１とした。

【００５２】(8) ペプチドの同定上記各溶出画分の構造解析を実施例１（６）と同様にし
て行った。結果を表１に示す。

【００５３】実施例３ L-Leu-L-Arg-L-Pro 酢酸塩の
合成 0.5mmol の Boc-L-Pro-O-CH₂-PAM樹脂及び各2mmol の B
oc-L-Arg( Mts ) 及びBoc-L-Leu-を、N,N-ジイソプロピ
ルアミン、TFA 、MeOH、0.5M HOBT/DMF 、0.5MDCC/DCM
、DCM 、DMF 及び中和剤( 70% エタノールアミン+29.5
%メタノール) を裝填したペプチドシンセサイザー（４
３０Ａ型）（アプライドバイオシステムズ社製）に充填
し、HOBTを用いる活性エステル法に付して Boc-L-Leu-L
-Arg( Mts)-L-Pro-O-CH₂-PAMを合成し、ついでこれを真
空乾燥した。

【００５４】乾燥ペプチド樹脂１g 、チオアニソール１
ml及びエタンジチオール 500mlを100ml 丸底フラスコに
入れ、混合物を10分攪拌した。フラスコを氷水で冷却し
ながら、TFA10ml を混合物に徐々に加え、ついで10分攪
拌した。TFMSA １mlを徐々に加え、フラスコを氷水から
取り出し、室温で攪拌下30分反応を続けた。冷ジエチル
エーテルをペプチドの沈澱が新たに生じなくなるまで加
え( 約50ml )、ついで１分攪拌した。フラスコの全内容
物をガラスフィルター( ミディアム孔) 上に移し、冷ジ
エチルエーテルで洗浄した。冷ジエチルエーテル約200m
l を含有するビーカーをガラスフィルターの下に置き、
攪拌した。ガラスフィルターに TFAを加えてペプチドを
溶解し、エーテル中に移行させた( エーテル中でペプチ
ドの沈澱が生じた) 。新たな沈澱が生じなくなるまで
TFA を加えた。エーテル中のペプチド沈澱物をガラスフ
ィルター( ミディアム孔) 上に移し、濾過し、ジエチル
エーテルで数回洗浄した。ついでガラスフィルター上の
沈澱を2N酢酸に溶解し、ナス型フラスコ中に回収した。
溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、セ
ミ分取用高速液クロ装置で精製した。溶出条件は以下の
通りであった：カラム：カプセルパックＣ１８（1.5 ×25cm) 溶出液： 0.1 ％TFA 存在下、５から80％のアセトニト
リルグラジエント（所用時間４５分）流速： 8 ml／min 検出：ＵＶ 210nm 検出によって主ピークを含有する溶出液画分を減圧下に
濃縮乾固し、残渣を2N酢酸水溶液に再溶解し、溶液を凍
結乾燥した。この手順によって粉末として L-Leu-L-Arg
-L-Pro酢酸塩 100mgを得た。

【００５５】実施例４ＡＣＥ阻害活性以上のようにして得た本オリゴペプチドのＡＣＥ阻害活
性を以下のごとく測定した。すなわちまず、5gのラビッ
トラングアセトンパウダーを50mlの0.1Mホウ酸ナトリウ
ム緩衝液(pH 8.3 ) に溶かし、40,000G 、40分の条件下
で遠心処理し、その上澄液をさらにハイドロキシアパタ
イトで精製し、1 unit/mg タンパク質のアンジオテンシ
ン変換酵素液を得た。

【００５６】本オリゴペプチドの種々の濃度の水溶液を
それぞれ試験管に0.03ml入れ、これに基質として、0.25
mlのヒプリルヒスチジルロイシン( 最終濃度5mM 、NaCl
300mM を含む) を添加し、ついで上記アンジオテンシン
変換酵素液 0.1mlを加え、37℃で30分間反応させた。そ
の後、IN塩酸0.25mlを添加して反応を停止させた後、1.
5 mlの酢酸エチルを加え、酢酸エチル中に抽出されたヒ
プリル酸の228nmでの吸収値を測定し、これを酵素活性
とした。なお、この条件で本オリゴペプチドを含まない
場合の 228nmの吸収値は0.35であった。

【００５７】このような実験を複数行い、阻害率を次の
式より算出した。Ａ：阻害剤を含まない場合の 228nm吸収値Ｂ：阻害剤添加の場合の 228nm吸収値また阻害率50％のときの本オリゴペプチドの濃度をIC₅₀
値とした。結果を表１に示す。

【００５８】表１トウモロコシ由来オリゴペプチドの分析値（その１）溶出画分アミノ酸配列アミノ酸分析値質量分析値 A1-1-1 L-Leu-L-Gln-L-Gln Leu(1.00) 388(M+H)⁺ Glu(1.92) A1-2-1 L-Val-L-Ala-L-Ala Val(1.00) 260(M+H)⁺ Ala(2.11) A1-2-2 L-Val-L-Ser-L-Pro Val(1.02) 302(M+H)⁺ Ser(1.06) Pro(1.00) A1-3 L-Leu-L-Asn-L-Pro Leu(1.02) 343(M+H)⁺ Asp(1.05) Pro(1.00) A2-1 L-Ile-L-Arg-L-Ala- Ile(1.00) 615(M+H)⁺ L-Gln-L-Gln Arg(0.93) Ala(1.06) Glu(2.04) B1-1 L-Leu-L-Ala-L-Ala Leu(1.00) 274(M+H)⁺ Ala(1.80) B2-1 L-Leu-L-Gln-L-Pro Leu(1.09) 357(M+H)⁺ Glu(0.93) Pro(1.00) B3-1 L-Leu-L-Ser-L-Pro Leu(1.06) 316(M+H)⁺ Ser(0.91) Pro(1.00) B4 L-Leu-L-Leu-L-Pro Leu(1.93) 342(M+H)⁺ Pro(1.00) C1 L-Phe-L-Leu-L-Pro Phe(1.00) 376(M+H)⁺ Leu(1.10) Pro(0.99) D1 L-Val-L-Ala-L-Tyr Ala(1.00) 352(M+H)⁺ Val(1.13) Tyr(0.94) E1 L-Leu-L-Ala-L-Tyr Ala(1.00) 366(M+H)⁺ Leu(1.07) Tyr(0.88) F1 L-Tyr-L-Val Val(1.03) 281(M+H)⁺ Tyr(1.00) F2 L-Leu-L-Tyr Tyr(1.00) 295(M+H)⁺ Leu(1.01) F3 L-Leu-L-Phe Leu(1.10) 279(M+H)⁺ Phe(1.00) G1 L-Leu-L-Ser-L-His Ser(0.86) 356(M+H)⁺ Leu(1.00) His(1.06) G2 L-Phe-L-Tyr Phe(1.03) 329(M+H)⁺ Tyr(1.00) H1 L-Ile-L-Arg-L-Ala Ala(1.04) 359(M+H)⁺ Ile(1.00) Arg(0.94) H2-1 L-Leu-L-Arg-L-Pro Leu(1.10) 385(M+H)⁺ Arg(1.00) Pro(1.00) I1 L-Tyr-L-Arg Tyr(1.00) 338(M+H)⁺ Arg(1.03)

【００５９】表１トウモロコシ由来オリゴペプチドの分析値（その２）溶出画分 IC₅₀また IC₅₀または阻害率をは阻害率与える濃度( μM) A1-1-1 IC₅₀ 100 A1-2-1 IC₅₀ 13 A1-2-2 IC₅₀ 10 A1-3 IC₅₀ 35 A2-1 IC₅₀ 160 B1-1 IC₅₀ 13 B2-1 IC₅₀ 1.9 B3-1 IC₅₀ 1.7 B4 IC₅₀ 57 C1 IC₅₀ 210 D1 IC₅₀ 16 E1 IC₅₀ 3.9 F1 40% 32 F2 58% 150 F3 48% 600 G1 51% 79 G2 IC₅₀ 25 H1 IC₅₀ 6.4 H2-1 IC₅₀ 0.27 I1 58% 290

【００６０】実施例５血圧降下作用動物は１０週令高血圧自然発症ラット( SHR )(日本ラッ
ト（株) 、♂、体重240 〜280g、１群４〜６匹）を用い
た。試料を生理食塩水に溶解し、有効成分オリゴペプチ
ド（フリー）として100mg/kgを腹腔内に投与した。対照
として生理食塩水を投与した。血圧はラット・マウス用
非観血血圧計TK-350( ユニコム社製)を用い、投与前及
び投与後経時的にTail-Cuff 法で測定した。結果を( 投
与前最高血圧値−投与後最高血圧値）±S.E.で表２に示
した。

【００６１】表２試料血圧降下（mmHg) ５時間後生理食塩水 −１±３ L-Leu-L-Arg-L-Pro 酢酸塩１４±５* * P < 0.01 で対照区に対して有意差あり

【００６２】実施例６静脈注射剤本オリゴペプチドを20〜 100倍( 容積／重量）の滅菌生
理食塩水に溶解し、無菌的にフィルター（孔径0.45μm)
で濾過した濾液を注射剤とする。

【００６３】実施例７錠剤本オリゴペプチド 7 部ヒドロキシプロピルセルロース 1 部ラクトース 10.9部ポテトスターチ 1 部ステアリン酸マグネシウム 0.1部ヒドロキシプロピルセルロース１部を含む60％エタノー
ル水溶液20部を調製し、本オリゴペプチド７部およびラ
クトース10.9部を加えて十分に混練した後、減圧下で乾
燥し、得られた乾燥物にポテトスターチ１部及びステア
リン酸マグネシウム0.1 部を加えて混和して、打錠機に
より製錠する。

【００６４】

【発明の効果】トウモロコシタンパク質α−ゼイン由来
のＡＣＥ阻害作用を有する新規オリゴペプチド、及び特
定オリゴペプチドを含有するＡＣＥ阻害剤及び血圧降下
剤が提供される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者前田英勝茨城県つくば市東１丁目１番３号工業技術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者三吉新介千葉県船橋市日の出２丁目20番２号 (72)発明者石川博巳千葉県船橋市日の出２丁目20番２号 (72)発明者福井史生千葉県成田市中台１丁目２番117号審査官高堀栄二 (56)参考文献特開平２−36127（ＪＰ，Ａ) 特開平３−31298（ＪＰ，Ａ) 特開平３−5499（ＪＰ，Ａ) 日本化学雑誌，Ｖｏｌ．88，Ｎｏ．４（1967）ｐ．455−459 Ｑｕａｎｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．−Ａｃｔ．Ｒｅｌａｔ．，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ. ３（1989）ｐ．195−203 ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｖｏｌ．101，Ｎｏ．９（1984）ｐ. 286，Ａｂｓ．Ｎｏ．68390 Ｂｉｏｐｏｌｕｍｅｒｓ，Ｖｏｌ. ９，Ｎｏ．12（1970）ｐ．1419−1427 Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．45，Ｎｏ．１（1983）ｐ．117− 138 第43回日本栄養・食料学会総会講演要旨集（1989）ｐ．113 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 5/083 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】 L-Leu-L-Ser-L-Pro、L-Val-L-Ser-L-Pr
o、L-Leu-L-Asn-L-Pro、L-Val-L-Ala-L-TyrまたはL-Leu
-L-Ala-L-Tyr。