KR0150798B1 - 신규 올리고펩티드 및 안지오텐신 변환효소저해제 - Google Patents

Abstract

본원 발명은 옥수수단백질유래의 신규올리고펩티드 및 옥수수단밸질유래의 특정 올리고펩티드(oligopeptide)를 유효성분으로서 함유하는 안지오텐신(angiotensin)변환효소저해제에 관한 것이고, 본제는 고혈압증의 치료 또는 예방에 유용하다고 기대되며, 본원 발명은 L-Leu-L-Ser-L-Pro, L-Leu-L-Gln-L-Pro, L-Val-L-Ser-L-Pro, L-Leu-L-Leu-L-Pro, L-Leu-L-Asn-L-Pro, L-Phe-L-Leu-L-Pro, L-Leu-L-Ala-L-Ala, L-Val-L-Ala-L-Ala, L-Leu-L-Gln-L-Gln, L-Val-L-Ala-L-Tyr, L-Leu-L-Ala-L-Tyr, L-Leu-L-Ser-L-His, 및 그 산부가염, L-Ile-L-Arg-L-Ala 및 그 산부가염, L-Leu-L-Arg-L-Pro 및 그 산부가염, 및 L-Ile-L-Arg-L-Ala-L-Gln-L-Gln 및 그 산부가염을 제공하고, 또한 L-Tyr-L-Val, L-Leu-L-Tyr, L-Leu-L-Phe, L-Phe-L-Tyr, L-Tyr-L-Arg 및 그 산부가염, L-Leu-L-Ser-L-Pro, L-Leu-L-Gln-L-Pro, L-Val-L-Ser-L-Pro, L-Leu-L-Leu-L-Pro, L-Leu-L-Asn-L-Pro, L-Phe-L-Leu-L-Pro, L-Leu-L-Ala-L-Ala, L-Leu-L-Gln-L-Gln, L-Val-L-Ala-L-Tyr, L-Leu-L-Ala-L-Tyr, L-Leu-L-Ser-L-His 및 그 산부가염, L-Leu-L-Arg-L-Pro 및 그 산부가염, 및 L-Ile-L-Arg-L-Ala-L-Gln-L-Gln 및 그 산부가염으로 이루어지는 군에서 선정되는 1종 이상을 유효성분으로서 안지오텐신 변환효소저해제를 제공한다.

Description

신규 올리고펩티드 및 안지오텐신 변환효소저해제

본원 발명은 옥수수단백질 유래의 신규 올리고펩티드(oligopeptide) 및 옥수수단백질 유래의 특정 올리고펩티드를 유효성분으로서 함유하는 안지오텐신(angiotensin)변환효소저해제에 관한 것이다. 본제는 고혈압증의 치료 또는 예방에 유용하다고 기대된다.

고혈압증의 발증에는 레닌-안지오텐신계가 깊은 관련을 가지고 있다는 것이 잘 알려져 있으나, 이 레닌-안지오텐신계에는 안지오텐신변환효소(EC3.4.15.1, 이하 ACE 라고도 함)가 중요한 역할을 수행하고 있다. 이 경우 ACE는 간에서 분비되는 안지오텐시노겐이 신장에서 산생(散生)되는 효소레닌에 의해 분해된 안지오텐신 Ⅰ(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)에 대하여 작용하고, 이것을 안지오텐신 Ⅱ(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)로 변환시킨다. 그리고, 이 안지오텐신 Ⅱ는 혈관벽 평활근을 수축시켜서 혈압을 높이며, 다시 부신피질(副腎皮質)에 작용하여 알도스테론의 분비를 촉진시키는 등의 작용을 가지고 있다. 또, 혈장에 존재하는 효소칼리크레인은 키니노겐이라고 불리우는 단백질을 분해하고, 혈관을 확장시켜 강압(降壓)시키는 브라디키닌을 산생하는데, 이 브라디키닌은 ACE의 작용에 의해 분해되고 불활성화되어 버린다. 이와 같이, ACE는 한편에서는 승압성(昇壓性) 펩티드(안지오텐신 Ⅱ)를 발생시키는 동시에, 다른 한편에서는 강압성 펩티드(브라디키닌)을 분해하여, 결과적으로 혈압을 상승방향으로 진행시킨다. 따라서, 이 효소활성을 억제함으로써 혈압상승을 방지(강압)하는 것이 가능하다.

ACE의 활성저해물질로서는 사독(蛇毒)에 의해 얻어진 수종의 펩티드성 저해제를 비롯하여 캅토프릴(D-2-메틸-3-메르칼토프로파노일-L-프로린)등의 합성물질이 다수 알려져 있으며, 이중 캅토프릴은 경구(經口)강압제로서 이미 실용에 제공되고 있다.

또, 근년 미생물 또는 여러 가지 식품중에도 ACE 저해물질이 발견되어 강압제로서 실용화가 검토되고 있다.(스에아미구니오(末綱邦男), 발효와 공업 46(No. 3), 179 ~ 182(1988)). 또한, 식품단백질, 특히 카제인, 옥수수종자 단백질유래의 ACE 저해물질에 대해 마루야마 스스무(丸山進), 바이오사이엔스와 인더스트리-47(No. 11), 38-42(1989)에 보고되어 있다. 또, 옥수수종자 단백질유래의 ACE 저해물질에 대해서는 마루야마 스스무등의 1988년도 일본발효공학회대회 강연요지집 23페이지(1988), 마루야마 스스무등 1989년도 일본농예화학회 강연요지집 8페이지(1989) 및 미기찌 신스께(三吉新介)등 1989년도 일본영양식량학회 요지집 113페이지에도 보고되어 있다.

또, 옥수수종자 단백질유래의 ACE 저해물질, 혈압강하제에 대해 본원 출원인에 의한 다음의 출원이 있다 : 일본국 특원소 63(1988)-185467, 동 63(1988)-185468, 일본국 특원평 1(1989)-59549, 동 1(1989)-59550.

신규유용한 혈압강하제 나아가서는 안지오텐신 변환효소저해제는 항상 요구되고 있으며, 기술의 풍부화를 초래하는 것이다.

본원 발명은 우수한 안지오텐신 변환효소저해작용을 가진 신규올리고펩티드 및 이러한 올리고펩티드를 유효성분으로 하는 안전성이 매우 높은 안지오텐신 변화효소저해제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본원 발명의 상기 과제는 옥수수단백질의 1종인 α-제인에 유래하는 신규 올리고펩티드, 및 α-제인 유래하는 특정올리고펩티드를 유효성분으로 하는 안지오텐신 변환효소저해제에 관한 다음의 발명에 의해 달성되었다.

상기의 산부가염은 제약상 허용되는 산(무기산 및 유기상)부가염, 예를 들면 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 아세트산염, 벤조산염, 말레인산염, 푸말산염, 호박산염, 주석산염, 구연산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 톨루엔술폰산염, 아스파라긴산염, 글루타민산염등을 포함한다.

본원 발명에서 사용하는 올리고펩티드는 옥수수단백질의 효소가수분해법, 유기화학적인 합성방법에 의해 아미노산을 단계적으로 도입하는 방법, 가수분해효소의 역반응을 이용한 펩티드합성법, 유전자공학적방법등에 의해서 제조할 수 있다.

옥수수단백질의 효소가수분해법에 대해 설명한다. 원료옥수수단백질로서는 글루텐밀을 사용해도 되지만, 그것을 다시 정제한 α-제인을 사용하는 경우에 대해 설명한다. α-제인은 시판상품을 사용해도 되며, 또 글루텐밀로부터 분리한 제인으로부터 공지의 수법에 의해 분리한 것이라도 된다.

효소로서는 엔도형 프로테아제 예를 들면, 파파인, 서모라이신등을 사용할 수 있으며, 특히 서모라이신이 바람직하다. 서모라이신은 고순도의 것이라도 공업용 그레이드의 것(예를 들면 서모아제(야마도 가세이(大和化成)))라도 된다.

다음에, α-제인의 서모라이신처리에 대해 설명한다. 이 처리는 통상 단지 수중 또는 완충액(예를 들면 트리스염산 완충액, 인산완충액)중에서 행한다. 기질농도는 반응시에 교반혼합할 수 있는 범위내이면 어느것이건 되나, 교반이 용이한 단백질농도 2 ~ 20%(w/v)의 범위에서 행하는 것이 바람직하다. 효소서모라이신의 첨가량은 역가(力價)에 의해 다르나 통상은 단백질당 0.01중량% 이상, 바람직하기하기로는 0.1 ~ 10중량%가 적당하다. 서모라이신은 일부를 반응중에 첨가해도 된다. 반응의 pH, 온도는 서모라이신의 가장 적당한 pH, 가장 적당한 온도부근을 사용하면 되며, pH6~10 바람직하기로는 7~8, 온도 30~80℃ 바람직하기로는 60~70℃가 적당하다. 반응중의 pH 조정은 필요에 따라 수산화나트륨수용액, 염산등에 의해 행한다.

반응시간은 효소의 첨가량, 반응온도, 반응 pH에 의해서 다르기 때문에 일정하지는 않지만 통상은 1~50시간 정도이다.

가수분해반응의 정지는 가수분해물의 가열 또는 구연산, 사과산등의 유기산 또는 염산, 인산등의 무기산 또는 수산화나트륨, 수산화칼륨등의 알칼리의 첨가에 의한 pH의 변화등에 의한 효소의 실활(失活), 한외(限外)여과막등에 의한 효소의 여별(濾別)등 공지의 방법에 따라 행할 수 있다.

이어서, 가수분해액을 고액분리(예를 들면 원심분리, 여과등)하고, 분리액을 한외여과, 겔여과등에 의해 분별하여 예를 들면 분자량이 10000 이하의 획분(劃分)을 함유하는 액을 얻는다. 이 액중에는 본원 발명의 목적 올리고펩티드가 함유되어 있으며, 다음에 이 액 또는 그 농축물(예를 들면 동결건조물)을 다시 분별하여 개개의 목적 올리고펩티드를 얻는다.

상기 동결건조물을 여기서는 α-제인가수분해 동결건조물이라 칭하며, 이것을 사용하는 경우에 대해 다시 설명한다.

α-제인가수분해동결건조물은 한 방법으로서, 최초에 음이온교환수지 예를 들면 약염기성 음이온교환수지(예를 들면 DEAE-도요펄(Totopearl) 650M, (히가시소(주) 제)처리하거나, 또는 양이온교환수지 예를 들면 약산성 양이온교환수지(예를 들면 SP-도요펄 650M, (히가시소(주) 제)처리한다.

최초에 음이온교환수지를 통하는 분별법에서는 수지중에 유지된 각 올리고펩티드를 직선농도 구배용출(예를 들면 DEAE-도요펄 650M을 사용한 경우, 적당농도의 트리스버퍼 → 트리스버퍼중 NaCl에의한 용출)에 의해서 분별한다. 용출액을 몇 개로 분획하고, 각각을 겔여과(예를 들면 세파덱스 LH-20 사용), 양이온 교환수지처리(예를 들면 SP-도요펄 650M), 역상 HPLC[예를 들면 캅셀팹(CAPCELL PAK) C₁₈(시세이도)(옥타데실실란의 상품명), 센슈팩(Senshu PAK) 1251-Y(센슈과학)(옥타데실실란의 상품명)등 ] 등에 부쳐서 단일의 올리고펩티드로 분별한다.

또, 유기화학적 합성법으로서는 액상법(液相法), 고상법(固相法)의 2종이 있으며, 전자에서는 Boc(터셔리부틸 옥시카르보닐)기 등으로 보호한 아미노산을 DMF(디메틸포름아미드)에 용해하고, DCC(디시플로헥실 카르보디이미드) 및 HOBt(1-히드록시벤조트리아졸)의 존재하에서 1주야 반응시켜 카르복시말단측부터 순차 결합시킨다. 또, 후자에서는 업라이드·바이오시스템즈사제 펩티드합성장치(430A형)등으로 PAM(페닐아세타미드메틸)수지에 아미노산을 순차 신장시켜서, 불화수소등에 의해 수지 및 각종 보호기를 절단하여 목적하는 올리고펩티드를 얻는다.

본 올리고펩티드의 산부가염은 통상법에 의해 제조할 수 있다.

본 올리고펩티드 및 그 산부가염은 ACE저해작용 나아가서는 혈압강하작용을 가지며, 사람을 비롯하여 포유동물의 고혈압증의 치료, 예방에 유효하다고 기대된다.

본 올리고펩티드 및 그 산부가염은 그대로 또는 통상 최소한 하나의 제약보조제와 제약조성물로서 사용한다.

본 올리고펩티드 및 그 산부가염은 비경구적(즉 정맥주사, 직장(直腸)투여등) 또는 경구적으로 투여하고, 각 투여방법에 적합한 형태로 제제할 수 있다.

주사제로서의 제제형태는 통상 멸균수수용액을 포함한다. 상기 형태의 제제 또는 완충제 pH 조절제(인산수소나트륨, 구연산등), 등장화제(等張化濟)(염화나트륨, 글루코스등), 보존제(파라옥시 안식향산메틸, P-히드록시 안식향산프로필 등)등의 물 이외에 다른 제약보조제를 함유할 수 있다. 이 제제는 세균유지필터를 통과하는 여과, 조성물에의 살균제의 혼입, 조성물의 조사(照射)나 가열에 의해 멸균할 수 있다. 이 제제는 또 살균고체조성물로서 제조하며, 사용시에 멸균수등에 용해하여 사용할 수도 있다.

경구투여제는 위장기관에 의한 흡수에 적합한 형태로 제제한다. 정제, 캡슐제, 과립제(顆粒劑), 세립제(細粒濟), 분말제는 상용(常用)의 제약보조제, 예를 들면 결합제(시럽, 아라비아고무, 젤라틴, 소르비트, 트라가칸트, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로스 등), 부형제(賦形劑)(락토스, 슈가, 콘스타치, 인산칼슘, 소르비트, 글리신 등), 활택제(滑澤濟)(스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카 등), 붕괴제(코테이토스타치, 카르복시메틸셀룰로스 등), 습윤제(라우릴황산나트륨 등)을 포함할 수 있다. 정제는 통상법에 의해 코팅할 수 있다. 경구액제는 수용액등으로 하거나, 드라이프로덕트로 할 수 있다. 그와 같은 경구액제는 상용의 첨가제 예를 들면 보존제(p-히드록시 안식향산메틸 또는 프로필, 소르빈산 등)을 포함해도 된다.

본 ACE 저해제 나아가서는 혈압강하제중의 본 올리고펩티드 또는 그 산부가염의 양은 여러 가지로 변경할 수 있으나, 통상 5~100%(w/w), 특히 10~605(w/w)가 적당하다. 본 ACE 저해제 나아가서는 혈압강하제의 투여량은 유효성분으로서 10~200mg/kg/day 이 적당하다. 또한, 본 펩티드의 급성독성은 어느것이건 LD₅₀(IC R계 마우스, 경구투여) 3g/kg 이다.

또, 본 올리고펩티드는 다량으로 섭취해도 생체에 악영향을 주지 않는 이점을 가지고 있으므로, 그대로 또는 여러 가지 영양분등을 가해서 또는 음식품중에 함유시켜 혈압강하작용, 고혈압예방의 기능을 부여한 기능성 식품, 건강식품으로서 복용해도 된다. 즉, 예를 들면 각종 비타민류, 미네랄류등의 영양분을 가하여 예를 들면 영양드링크, 두유, 스프등의 액상식품이나 각종 형상의 고형식품, 나아가서는 분말형으로 그대로 또는 각종 식품에 첨가하여 사용할 수도 있다. 이러한 기능성 식품, 건강식품으로서의 본 ACE 저해제 나아가서는 혈압강하제중의 유효성분의 함유량, 섭취량은 각각 상기 제약에 있어서의 함유량, 투여량과 같아도 된다.

다음에, 본원 발명을 실시예에 의해 설명한다.

[실시예 1]

(1) α-제인가수분해동결건조물의 조제

α-제인(와꼬준야꾸(和光純藥))100g을 증류수 100㎖에 가하고, 서모라이신(다이와가세이(大和化成)) 1g을 가하여 교반하에, 실온에서 65℃로 1시간 걸려 승온하고, 65℃에서 17시간 방응시켰다. 이 반응중 5NNaOH를 적절히 적하하여 pH를 8.0으로 유지하였다. 이어서, 서모라이신을 다시 1g 추가하고, 65℃에서 24시간 pH를 8.0으로 유지하여 반응시켰다. 효소를 실활시키기 위해 오토클레이브(autoclave)내에서 105℃로 5분 유지하였다.

얻어진 가수분해액을 5000rpm으로 10분 원심분리하고, 상청(上淸)을 아미콘(Amicon) PM-10 (한외여과막, 분획분자량 10000, 아미콘사)를 사용하여 한외여과하고, 여액을 동결건조하여 α-제인가수분해동결건조물 97.3g을 얻었다.

(2)상기와 같이 얻어진 α-제인가수분해동결건조물 2g을 2ℓ의 증류수에 용해하여, 음이온교환수지, DEAE-도요펄 650M의 콜럼(2.6 × 70cm)에 첨가하고, 1500㎖의 5mM 트리스완충액(pH 8.3)을 흐르게 하고, 비흡착 획분을 회수하여 A 액이라 하였다. 그후 1000㎖의 5mM 트리스완충액(pH 8.3)과 0.3M Nacl를 함유하는 5mM 트리스완충액(pH 8.3)에 의한 직선농도구배에 의해 용출하였다.

직선농도구배에 의한 용출을 개시하고나서 320~520㎖의 용출획분을 B액, 620~700㎖의 용출획분을 C액이라 하였다.

(3)A획분의 처리

A액은 동결건조후, 팔마시아사제 겔여과 수지세파덱스 LH-20 콜럼(1.6 × 100cm)에 첨가하고, 30% 메탄올로 용출하여 탈염하였다. 탈염후의 A액을 다시 양이온교환수지 SP-도요펄 650M의 콜럼(2.6 × 70cm)에 첨가하고, 500㎖의 5mM 아세트산나트륨완충액(pH 4.0)을 흐르게 한 후, 1000㎖의 5mM 아세트산나트륨완충액(pH 4.0)과 0.6M NaCl을 함유하는 1000㎖의 5mM 아세트산나트륨완충액(pH 4.0)에 의한 직선농도구배에 의해 용출하였다. 농도구배에 의한 용출을 개시하고나서 340~600㎖의 용출분을 A1액, 950~1050㎖의 용출획분을 A2액이라 하였다.

A1액을 다시 일본 미리포아리미티드사제의 (이하 같음) 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% 트리플루오로아세트산(이하 TFA라 약칭함) 존재하, 10 내지 60%의 아세토니트릴그라디엔트(소용(所用)시간 30분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 4.0~6.3분의 용출획분을 A1-1, 6.3~7.7분의 용출획분을 A1-2, 9.1~9.3분의 용출획분을 A1-3이라 하였다.

A1-1을 다시 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 0 내지 20%의 아세토니트릴그라디엔트(소용시간 20분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 14.3~14.5분의 용출획분을 A1-1-1이라 하였다.

A1-2를 다시 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 0 내지 20%의 아세토니트릴그라디엔트(소용시간 20분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 14.9~15.1분의 용출획분을 A1-2-1, 16.9~17.1분의 용출획분을 A1-2-2라 하였다.

A2액을 다시 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 0 내지 20%의 아세토니트릴그라디엔트(소용시간 20분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 14.9~15.1분의 용출획분을 A2-1라 하였다.

(4)B획분의 처리

상기 B액은 동결건조후 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10 내지 60%의 아세토니트릴그라디엔트(소용시간 30분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 6.8~7.8분의 용출획분을 B1, 7.8~8.3분의 용출획분을 B2, 8.3~9.1분의 용출획분을 B3, 14.2~14.4분의 용출획분을 B4라고 하였다.

B1을 다시 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10%의 아세토니트릴

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 6.9~7.1분의 용출획분을 B1-1이라 하였다.

B2를 다시 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10%의 아세토니트릴

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 11.2~11.4분의 용출획분을 B2-1이라 하였다.

B3을 다시 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10%의 아세토니트릴

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 15.0~16.0분의 용출획분을 B3-1이라 하였다.

(5) C획분의 처리

상기 C액은 동결처리후, 겔여과수지세파덱스 LH-20 콜럼(1.6 × 100cm)에 첨가하고, 30% 메탄올로 용출하여 탈염하였다. 탈염후의 C액을 다시 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10 내지 60%의 아세토니트릴그라디엔트(소용시간 30분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 17.6~17.8분의 용출획분을 C1이라 하였다.

(6) 펩티드의 동정(同定)

상기 A1-1-1, A1-2-1, A1-3, A2-1, B1-1, B2-1, B3-1, B4 및 C1의 용출획분은 각 상기 고속액 크로마토그래피에 의해 각각 단일 피크를 나타냈다.

다음에, 이들 용출획분은 건고(乾固)된 후 증류수에 용해시키고, 이들 수용액을 사용하여 다음의 구조해석을 행하였다.

표1에 6규정염산에 의한 110℃ 24시간의 가수분해후의 아미노산 분석치(히다찌(日立) L-8500 형 아미노산 분석계에 의함), 질량 분석치(니혼덴시(日本電子) JMX-DX303에 의함), 아미노산 배열분석 데이터(시마즈(島律)프로테인시퀀서 PS Q -1시스템에 의함)을 나타낸다.

[실시예 2]

(1) 실시예1(1)과 마찬가지로 하여 조제한 α-제인 가수분해동결건조물 2g을 0.02M 아세트산수용액에 용해하고, 500㎖, pH 4.0으로 조정한 것을 양이온교환수지 SP-도요펄 650M의 콜럼 (2.6 × 76cm)에 첨가하고, 1500㎖의 0.2M 아세트산암모늄완충액(pH 4.0)을 흐르게 하여, 비흡착획분을 제거하였다. 그후 1000㎖의 0.02M 아세트산암모늄완충액(pH4.0)과 1000㎖의 0.05M 아세트산암모늄완충액(pH8.6)에 의한 직선농도구배로 용출하고, 다시 0.05M 아세트산암모늄완충액(pH8.6)으로 계속해서 용출하였다.

직선농도구배에 의한 용출을 개시하고나서 850~1000㎖의 용출획분을 D액, 1000~1100㎖의 용출획분을 E액, 1100~1200㎖의 용출획분을 F액, 1400~1500㎖의 용출획분을 G액, 1920~2120㎖의 용출획분을 H액, 2200~2270㎖의 용출획분을 I액이라 하였다.

(2) D획분의 처리

상기 D액은 동결건조후 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10 내지 60%의 아세토니트릴그라디엔트(소용시간 30분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 10.5~11.0분의 용출획분을 D1이라 하였다.

(2) E획분의 처리

상기 E액은 동결건조후 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10 내지 60%의 아세토니트릴그라디엔트(소용시간 30분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 13.0~13.2분의 용출획분을 E1이라 하였다.

(2) F획분의 처리

상기 F액은 동결건조후 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10 내지 60%의 아세토니트릴그라디엔트(소용시간 30분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 10.3~10.7분의 용출획분을 F1, 12.5~13.2분의 용출획분을 F2, 17.0~18.0분의 용출획분을 F3이라 하였다.

(2) G획분의 처리

상기 G액은 동결건조후 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10 내지 60%의 아세토니트릴그라디엔트(소용시간 30분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 5.0~5.2분의 용출획분을 G1, 13.8~15.0분의 용출획분을 G2라 하였다.

(2) H획분의 처리

상기 H액은 동결건조후 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10 내지 60%의 아세토니트릴그라디엔트(소용시간 30분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 7.7~8.7분의 용출획분을 H1, 9.6~9.9분의 용출획분을 H2라 하였다.

H2를 다시 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10의 아세토니트릴

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 12.6~13.2분의 용출획분을 H2-1이라 하였다.

(2) I획분의 처리

상기 I액은 동결건조후 세미분취용 고속액 크로마토그래피장치로 분획하였다. 용출조건은 하기에 의한다.

콜 럼 : 캅셀팩 C18

(1.5 × 25cm)

용출액 : 0.1% TFA 존재하, 10 내지 60%의 아세토니트릴그라디엔트(소용시간 30분)

유 속 : 8㎖/min

검 출 : UV 210nm

이 조건하에서 6.2~7.2분의 용출획분을 I1이라 하였다.

(8) 펩티드의 동정(同定)

상기 각 용출획분의 구조해석을 실시예1(6)과 마찬가지로 행하였다.

결과를 표 1에 나타낸다.

[실시예 3]

ACE저해활성

이상과 같이해서 얻은 본 올리고펩티드의 ACE저해활성을 다음과 같이 측정하였다. 즉 먼저, 5g의 래비트렁 아세톤파우더를 50㎖의 0.1M 붕산나트륨완충액(pH8.3)에 용해시키고, 40,000G, 40분의 조건하에서 원심처리하며, 그 상징액(上澄液)을 다시 하이드록시아파타이트로 정제하여, 1unit/mg 단백질의 안지오텐신 변환효소액을 얻었다.

본 올리고펩티드의 여러 가지 농도의 수용액을 각각 시험관에 0.03㎖ 넣고, 이것에 기질로서 0.25㎖의 히푸릴히스티딜로이신(최종 농도 5mM, NaCl 300mM을 포함)을 첨가하고, 이어서 상기 안지오텐신 변환효소액 0.1㎖를 가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 그후, 1N 염산 0.25㎖를 첨가하여 반응을 정지시킨후, 1.5㎖의 아세트산 에틸을 가하여, 아세트산에틸중에 추출된 히푸릴산의 228nm에서의 흡수치를 측정하고, 이것을 효소활성으로 하였다. 또한, 이 조건에서 본 올리고펩티드를 함유하지 않은 경우의 228nm의 흡수치는 0.35였다.

이와 같은 실험을 복수 행하고, 저해율을 다음의 식으로부터 산출하였다.

A : 저해제를 함유하지 않은 경우의 228nm 흡수치

B : 저해제 첨가의 경우의 228nm 흡수치

또, 저해율 50%일 때의 본 올리고 펩티드의 농도를 IC₅₀치로 하였다.

결과를 표1에 나타낸다.

[실시예 4]

정맥주사제

본 올리고펩티드를 20~100 배(용적/중량)의 멸균생리식염수에 용해시키고, 무균적으로 필터(공경 0.45㎛)로 여과한 여과액을 주사제로 한다.

[실시예 5]

정제

본 올리고펩티드 7부

히드록시프로필셀룰로스 1부

락토스 10.9부

포테이토스타치 1부

스테아린산마그네슘 0.1부

히드록시프로필셀룰로스 1부를 함유하는 60% 에탄올수용액 20부를 조제하고, 본 올리고 펩티드 7부 및 락토스 10.9부를 가하여 충분히 혼련한 후, 감압하에 건조하고, 얻어진 건조물에 포테이토스타치 1부 및 스테아린산마그네슘 0.1부를 혼합시켜 타정기(打정機)에 의해 제정(製鉦)한다.

옥수수단백질 α-제인유래의 ACE저해작용을 가진 신규 올리고펩티드 및 특정올리고펩티드를 함유하는 ACE저해제가 제공된다.

Claims (2)

1. L-Leu-L-Ser-L-Pro,L-Leu-L-Gln-L-Pro, L-Val-L-Ser-L-Pro, L-Leu-L-Leu-L-Pro, L-Leu-L-Asn-L-Pro, L-Phe-L-Leu-L-Pro, L-Leu-L-Ala-L-Ala, L-Val-L-Ala-L-Ala, L-Leu-L-Gln-L-Gln, L-Val-L-Ala-L-Tyr, L-Leu-L-Ala-L-Tyr, L-Leu-L-Ser-L-His, 및 그 산부가염, L-Ile-L-Arg-L-Ala 및 그 산부가염, L-Leu-L-Arg-L-Pro 및 그 산부가염, 및 L-Ile-L-Arg-L-Ala-L-Gln-L-Gln 및 그 산부가염.
2. L-Tyr-L-Val, L-Leu-L-Tyr, L-Leu-L-Phe, L-Phe-L-Tyr, L-Tyr-L-Arg 및 그 산부가염, L-Leu-L-Ser-L-Pro, L-Leu-L-Gln-L-Pro, L-Val-L-Ser-L-Pro, L-Leu-L-Leu-L-Pro, L-Leu-L-Asn-L-Pro, L-Phe-L-Leu-L-Pro, L-Leu-L-Ala-L-Ala, L-Val-L-Ala-L-Ala, L-Leu-L-Gln-L-Gln, L-Val-L-Ala-L-Tyr, L-Leu-L-Ala-L-Tyr, L-Leu-L-Ser-L-His 및 그 산부가염, L-Ile-L-Arg-L-Ala 및 그 산부가염, L-Leu-L-Arg-L-Pro 및 그 산부가염, L-Ile-L-Arg-L-Ala 및 그 산부가염, L-Leu-L-Arg-L-Pro 및 그 산부가염, 및 L-Ile-L-Arg-L-Ala-L-Lln-L-Lln 및 그 산부가염으로 이루어지는 군에서 선정되는 1종 이상을 유효성분으로서 안지오텐신 변환효소저해제.