EA011923B1

EA011923B1 - Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы

Info

Publication number: EA011923B1
Application number: EA200501096A
Authority: EA
Inventors: Жозеф Краус; Элке Заурбрей; Рейнхард Нэлс; Андреас Лук; Рудольф Янсен
Original assignee: Квс Саат Аг
Priority date: 2003-02-20
Filing date: 2004-02-17
Publication date: 2009-06-30
Also published as: CN102391988A; DK1597373T3; RS53441B; ES2391090T3; RS20050373A; CA2502981A1; SI1597373T1; EP1597373A1; EA200501096A1; JP2006518205A; PT1597373E; PL377934A1; EP1597373B1; PL214713B1; JP5586122B2; CA2502981C; WO2004074492A1

Abstract

Изобретение относится к растениям, растительному материалу и семенам устойчивой к глифосату сахарной свеклы. Сущность настоящего изобретения состоит в получении трансгенной сахарной свеклы, обладающей высокой степенью устойчивости к глифосату и сохраняющей такие важные агротехнические характеристики, как темп роста, урожайность, качество, резистентность к патогенным микроорганизмам и т.п.

Description

Изобретение относится к растениям, растительному материалу и семенам устойчивой к глифосату сахарной свеклы.

Как товарная культура, сахарная свекла (Ве1а уи1даг15) выращивается многими странами. Ее валовый сбор составляет свыше 240 млн метрических тонн.

Ν-Фосфонометилглицин, обычно называемый глифосат, - гербицид широкого спектра действия, широко применяемый вследствие его высокой эффективности, способности к биологическому разложению и малой токсичности для человека и животных. Глифосат ингибирует проводящую систему шикимовой кислоты, которая участвует в биосинтезе ароматических соединений, включая аминокислоты и витамины. В частности, глифосат ингибирует превращение фосфоенолпировиноградной кислоты и 3фосфошикимовой кислоты в 5-енолпирувил-3-фосфошикимовую кислоту путем подавления синтазы 5енолпирувил-3-фосфошикимовой кислоты (ЕР8Р-синтазы или ЕР8Р8). Обработка обычных растений глифосатом приводит к утрате этими растениями способности продуцировать ароматические аминокислоты (например, фенилаланин и тирозин), необходимые для их роста и развития. ЕР8Р8 присутствует во всех растениях, бактериях и грибах. Она отсутствует у животных, которые не синтезируют ароматические аминокислоты. Так как у млекопитающих, птиц и водных жизненных форм проводящая система биосинтеза ароматических аминокислот отсутствует, то глифосат мало или вообще нетоксичен для этих организмов. ЕР8Р8-Фермент естественно присутствует в пищевых продуктах животного и микробного происхождения.

Глифосат является активным ингредиентом таких гербицидов, как Раундап®, производимых компанией Монсанто, США. Обычно его состав определяется как водорастворимая соль, например аммонийная соль, алкиламиновая соль, соль щелочного металла или триметилсульфониевая соль. Одним из наиболее распространенных составов является изопропиламиновая соль глифосата. Именно этот состав применяется в гербициде Раундап^®.

Известно, что устойчивые к глифосату растения можно получать путем встройки в геном растений механизма, способного продуцировать устойчивую к глифосату ЕР8Р8-синтазу, например СР4-ЕР8Р8 на основе культур штамма СР4 АдгоЬас1егшт.

Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы можно получать методом трансформации на основе АдгоЬас1егшт путем интродуцирования в геном растения гена, например СР4-ЕР8Р8, кодирующего устойчивую к глифосату ЕР8Р8. Такое растение сахарной свеклы, экспрессирующее СР4-ЕР8Р8, раскрыто в международной заявке, опубликованной под № ^099/23232. Однако растения сахарной свеклы, выращиваемые из клеток, трансформированных с помощью гена СР4-ЕР8Р8 так, как описано в этой заявке, сильно различаются по своим характеристикам, вследствие того, что этот ген встраивается в геном растения случайным образом. Встройку определенного трансгена в специфичное положение на хромосоме называют «явление рекомбинации». Термин «явление рекомбинации» также применяется для дифференцирования сортов растений, полученных методом генной инженерии. Желаемые явления рекомбинации очень редки. Большинство явлений рекомбинации отбраковываются, потому что встройка трансгена в ген растения, отвечающего за рост, приводит к его прерыванию и прекращению экспрессии, а встройка трансгена в часть хромосомы не обеспечивает экспрессию трансгена, или экспрессия очень слабая. В связи с этим требуется проводить скрининг большого количества явлений рекомбинации с целью идентифицировать явление рекомбинации, отличающееся достаточной экспрессией интродуцируемого гена. Эта процедура требует много времени и является весьма дорогостоящей.

Сущность настоящего изобретения состоит в получении растения сахарной свеклы, обладающего высокой степенью устойчивости к глифосату и лишенного недостатков касательно таких важных агротехнических характеристик, как рост, урожайность, качество, резистентность к патогенным микроорганизмам и т. п.

Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы согласно изобретению отличается тем, что содержит фрагмент ДНК размером от 630 до 700 п.о., предпочтительно 664 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2, и/или фрагмент ДНК размером 3500-3900 п.о., предпочтительно 3706 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 4, и/или фрагмент ДНК размером 270-300 п.о., предпочтительно 288 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 Ш N0: 7, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8, и/или фрагмент ДНК размером 710-790 п.о., предпочтительно 751 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную 8Е0 ΙΌ N0: 9, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 10, и/или фрагмент ДНК размером 990-1100 п.о., предпочтительно 1042 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК расте

- 1 011923 ния сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 14, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 16.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - хорошо известный стандартный метод амплификации молекул нуклеиновой кислоты (см., например, патент США № 4683202).

Растение сахарной свеклы согласно изобретению (далее - явление рекомбинации Н7-1) проявляет высокую устойчивость к гербицидному глифосату. Кроме того, трансформация не влияет на особенности роста Н7-1 и его другие важные агротехнические характеристики. Н7-1 имеет высокую степень экспрессии гена СР4-ЕР8Р8 АдгоЬас1егшт, который стабильно инкорпорируется внутри генома растения и сообщает растению устойчивость к глифосату. Растение продуцировали методом трансформации на основе АдгоЬас1егшт с использованием бинарного вектора РУ-ВУСТ08. Данный вектор содержал между лево- и правосторонним участками следующие последовательности: кодирующую область, включающую последовательность, которая кодирует хлоропластный транзит-пептид из ЕР8Р8 АгаЫборкщ Найала (символ с!р2), связанную с последовательностью, которая кодирует СР4-ЕР8Р8, под контролем промотора на основе вируса мозаики норичника (рРМУ), и Е9-3'-концевую последовательность терминации транскрипции из Р18ит каДуцт.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фрагменты ДНК размером 3706, 664, 288, 751 и 1042 п.о. проявляют по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидными последовательностями 8Е0 ΙΌ N0: 6, 8Е0 ΙΌ N0: 13, 8Ε0ΙΩ N0: 11, 8Е0 ΙΌ N0: 12 или 8Е0 ΙΌ N0: 17, соответственно. Например, 95% сродство означает, что 95% нуклеотидов данной последовательности идентичны со сравниваемой последовательностью. В связи с этим последовательности можно выравнивать и проводить сравнение с помощью программы ВЬА8Т (доступна, например, на сайте: 1Шр:https://\\л\лу.псЬгп11п.шЬ.доу/Ыа51/Ь125ес|/Ы2.1и1п1). Наиболее предпочтителен вариант осуществления изобретения, в котором фрагмент ДНК размером 3706 п.о. имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 6, фрагмент ДНК размером 664 п.о. имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 13, фрагмент ДНК размером 288 п.о. имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 Ш N0: 11, фрагмент ДНК размером 751 п.о. имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 12 и/или фрагмент ДНК размером 1042 п.о. имеет нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 17.

Объектом настоящего изобретения являются также семена вышеуказанного растения. Эти семена могут быть использованы для выращивания устойчивых к глифосату растений сахарной свеклы. Семена можно высевать, и культивируемые растения будут проявлять устойчивость к глифосату.

Объектом изобретения являются также клетка, ткань или часть устойчивого к глифосату растения сахарной свеклы.

Еще одним объектом настоящего изобретения явлется способ идентификации устойчивого к глифосату растения сахарной свеклы, отличающийся тем, что он включает этап(ы):

a) амплификации фрагмента ДНК размером от 630 до 700 п.о., предпочтительно размером 664 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 Ш N0: 2, и/или

b) амплификации фрагмента ДНК размером 3500-3900 п.о., предпочтительно 3706 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 4, и/или

c) амплификации фрагмента ДНК размером 270-300 п.о., предпочтительно 288 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8, и/или

6) амплификации фрагмента ДНК размером 710-790 п.о., предпочтительно 751 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 9, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 10, и/или

е) амплификации фрагмента ДНК размером 990-1100 п.о., предпочтительно 1042 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 14, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 16.

Способ позволяет легко осуществлять детекцию устойчивого к глифосату трансгенного растения сахарной свеклы посредством стандартных методов молекулярной биологии.

Еще одним объектом изобретения является тест-набор для идентификации устойчивого к глифосату трансгенного растения сахарной свеклы, его клеток, ткани или частей. Набор содержит по крайней мере одну пару праймеров, включающую первый праймер и второй праймер для полимеразной цепной реакции, которые обеспечивают специфичную идентификацию Н7-1, его клеток, ткани или частей.

- 2 011923

Первый праймер предпочтительно имеет нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО N0: 1, 8Е0 ГО N0: 7, 8Е0 ГО N0: 9 или 8Е0 ГО N0: 14, а второй праймер - 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 8, 8Е0 ГО N0: 10 или 8ЕО ГО N0: 16.

Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения как первый праймер, так и второй праймер узнают нуклеотидную последовательность, которая является частью нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 5.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.

Фиг. 1 - карта бинарного вектора РУ-ВУСТ08.

Фиг. 2 - идентификация Н7-1 методом ПЦР. Проведен анализ проб ДНК из 18 растений. Негативный контроль ДНК из ^трансформированной сахарной свеклы; позитивный контроль ДНК из исходного трансформанта Н7-1.

Фиг. 3 - идентификация Н7-1 методом многократной ПЦР и дискриминация трансгенного сусп1 Η71 и нетрансгенных растений. Проведен анализ проб ДНК из 54 растений.

Фиг. 4 - рРМУ-с1р2-СР4-ЕР8Р8-Е9-3'-встройка и сайты расщепления рестрикционных ферментов ΗίηάΙΙΙ, ХЬа1, С1а1, РШ и ВатН1.

Фиг. 5 - анализ зависимости системы встройка/количество копий в Н7-1. Для Саузерн-блот-анализа 10 цг геномной ДНК Н7-1 расщепляли с помощью РШ, ΗίηάΙΙΙ, ХЬа1, С1а1 и ВатН1 (дорожка 3-7). Нетрансформированную геномную ДНК в качестве негативного контроля расщепляли с помощью ВатШ (дорожка 8). РУ-ВУСТ08-Плазмиду в качестве позитивного контроля расщепляли с помощью ВатНР Дорожки 2 и 9 являются маркерами размеров. Блот исследовали посредством кодирующей области СР4ЕР8Р8, меченной ³²Р. Зонд представляет собой внутреннюю последовательность гена СР4-ЕР8Р8, положение 447-1555 п.о.

Фиг. 6 - Саузерн-блот-анализ Н7-1 с целью изучения интактности с!р2-СР4-ЕР8Р8-кодирующей области. 10 цг геномной ДНК Н7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и нетрансгенной контрольной ДНК, смешанной с РУ-ВУСТ08, расщепляли с помощью XЬаI и ΗίηάΙΙΙ/ВатШ. Блот исследовали посредством СР4-ЕР8Р8-ПЦР-фрагмента, меченного ³²Р. Зонд представляет собой последовательность РУ-ВУСТ08, положение 447-1555 п.о.

Фиг. 7 - Саузерн-блот-анализ Н7-1 с целью изучения интактности области промотора. 10 цг геномной ДНК Н7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и нетрансгенной контрольной ДНК, смешанной с РУВУСТ08, расщепляли с помощью ΗίηάΙΙΙ, ХЬа! и ЗасЕХйоЕ Блот исследовали фрагментом промотора, меченного ³²Р (НМШ)(=последовательность РУ-ВУСТ08, положение 7992-8583) или целой промоторс!р2-СР4-ЕР8Р8-Е9-3'-кассетой (РтеЕШюПЦпоследовательность РУ-ВУСТ08, положение 7935-2389 п.о.).

Фиг. 8 - Саузерн-блот-анализ Н7-1 с целью изучения интактности области полиаденилирования. 10 цг геномной ДНК Н7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и нетрансгенной контрольной ДНК, смешанной с РУ-ВУСТ08, расщепляли с помощью ЕсоШ/РШ, ХЬаЕ ΗίηάΙΙΙ и РШ. Блот исследовали фрагментом Е931'-полиаденилирования, меченного ³²Р (ВатШ/ХйоЦ^последовательность РУ-ВУСТ08, положение 1702-2389 п.о.).

Фиг. 9 - фрагменты, использованные в качестве зондов для определения отсутствия основной цепи векторной ДНК в Н7-1.

Фиг. 10 - Саузерн-блот-анализ Н7-1 для определения отсутствия основной цепи векторной ДНК в Н7-1. 10 цг геномной ДНК Н7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и нетрансгенной контрольной ДНК, смешанной с РУ-ВУСТ08, расщепляли с помощью ХЬаР Блоты исследовали ³²Р-меченными зондами, включающими целую основную цепь РУ-ВУСТ08 (зонд 1-4). Один блот исследовали меченным фрагментом СР4-ЕР8Р8.

Фиг. 11 - сравнение фрагментов ПЦР и последовательностей РУ-ВУСТ08 в левосторонней области.

Фиг. 12 - сравнение фрагментов ПЦР и последовательностей РУ-ВУСТ08 в правосторонней области.

фиг. 13 - анализ геномной ДНК снаружи правостороннего места присоединения встройки. Приблизительно 50 нг геномной ДНК Н7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и воды использовали в реакциях ПЦР с комбинацией праймеров Р1, в которой оба праймера локализованы снаружи встройки, и Р3, в которой один праймер локализован внутри встройки, а другой праймер локализован снаружи встройки.

Фиг. 14 - анализ геномной ДНК снаружи левостороннего места присоединения встройки. Приблизительно 50 нг геномной ДНК Н7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и воды использовали в реакциях ПЦР с комбинацией праймеров Р2, в которой оба праймера локализованы снаружи встройки, и Р4, в которой один праймер локализован внутри встройки, а другой праймер локализован снаружи встройки.

Фиг. 15 - карта потомств партии семян Н7-1.

Фиг. 16 - анализ Н7-1 методом блоттинга по Саузерну для выявления стабильности интеграции встраиваемой ДНК в геном. 10 цг геномных ДНК Н7-1 (исходный трансформант Н7-1-1995 и три потомства - Н7-1-1996, Н7-1-1997 и Н7-1-1998) и нетрансгенных контрольных ДНК разного происхождения расщепляли с помощью ВатШ, ХЬа! и ΗίηάΙΙΙ. Блот исследовали ³²Р-меченным зондом СР4-ЕР8Р8 вектора РУ-ВУСТ08 (=447-1555 п.о.).

Описание изобретения иллюстрируется ссылками на нижеследующие примеры.

- 3 011923

Перечень сокращений

- приблизительно °С градус Цельсия

ЬИеЯ стерильная вода двойной дистилляции

п.о. пара(ы) оснований

СТАВ цетилтриметиламмонийбромид

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

Е. соП ЕхскепсШа соН

ΕΠΤΑ этилендиаминтетрауксусная кислота

Рис. рисунок ч час

НС1 соляная кислота кб килобаза кг килограмм

М, мМ моль, милимоль мин минута

ΝαιΗΡΕΜΝπΙΕΡΟ., фосфат натрия №С1 хлористый натрий

ИаОН едкий натрий нк нуклеотид

ПЦР полимеразная цепная реакция пмоль пикомоль

РНК-аза рибонуклеаза об/мин обороты в минуту

РР Раундап Реди® кт комнатная температура

8П8 додецилсульфат натрия сек секунда

8ЕУАС хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1)

88С стандартный солевой раствор

ТЕ трис-ΕϋΤΑ буфер

ΤΚΙ8 трис(гидроксиметил)-аминометан

Пример 1. Идентификация явления рекомбинации Н7-1.

Сахарную свеклу (Вс1а сиЦапЦ. генотип 380057, подвергали генетической модификации для экспрессии СР4-5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазы или СР4-ЕР8Р8, которая придает устойчивость к гербицидному глифосату и которая также используется в качестве маркера. необходимого для селекции. Эту трансгенную линию продуцировали методом трансформации на основе АдгоЬас1епит-1ите1ас1еп8 с использованием бинарного вектора РУ-ВУСТ08. Т-ДНК вектора. использованного для трансформации сахарной свеклы. содержала между лево- и правосторонним участками следующие последовательности: кодирующую область. включающую последовательность. которая кодирует хлоропластный транзит-пептид из ЕР8Р8 АгаЫборЦк ШаПапа (символ с1р2). связанную с последовательностью. которая кодирует СР4-ЕР8Р8, под контролем промотора на основе вируса мозаики норичника 358 (рЕМУ) и 3'-концевую последовательность терминации транскрипции гЬс8-Е9-гена РЦцт кайуцт.

Применяли следующие методы.

I. Экстракция ДНК.

Метод 1.

Брали свежий лист или другую ткань (20-100 мг). помещали в 1.5 мл пробирку и добавляли 400 цг

- 4 011923 экстракционного буфера (см. ниже). Ткань измельчали небольшим пестиком. Смесь взбалтывали 5 с и инкубировали 30-60 мин при комнатной температуре. Затем проводили центрифугирование в течение 1 мин при 13000 об./мин. Супернатант, содержащий ДНК, переливали в другую 1,5 мл пробирку и смешивали с 320 рл изопропанола. Смесь инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре. После добавления этанола образуется преципитат ДНК. Этанол декантировали после центрифугирования в течение 5 мин при 13000 об./мин. Пробу оставляли для просушки на воздухе. Гранулы повторно растворяли в 400 рл Н₂О или ТЕ-буфера (см. ниже).

Экстракционный буфер (100 мл).

мл 1 М трис(рН 7,5) мл 5 М МаС1 мл 0,5 Μ ЕОТА

2.5 мл 20% 805

67.5 мл Н₂О

ТЕ-буфер.

мМ трис-НС1 (рН 8,0)

1мМ ΕΏΤΑ

Метод 2.

Брали свежий растительный материал (20-100 мг), помещали в пробирку объемом 1,5 мл Эппендорфа и добавляли 500 рл СТАВ-буфера (65°С) (см. ниже). Смесь инкубировали в течение 1-1,5 ч при 65°С и затем центрифугировали 5 с. Добавляли 5 мл РНК-азы А (10 мг/мл). Полученную смесь инкубировали 30 с при 37°С и затем центрифугировали в течение 5 с. Добавляли 200 мл 8ЕУАС. После перемешивания и центрифугирования при 13000 об./мин в течение 10 мин супернатант помещали в другую пробирку объемом 1,5 мл. С супернатантом осторожно смешивали 1 объем изопропанола (около 400 мл). После этого проводили центрифугирование при 13000 об./мин в течение 10 мин. Добавляли 600 мл этанола. Гранулы промывали путем переворачивания пробирки несколько раз. Смесь снова центрифугировали при 13000 об./мин в течение 2 мин. Этанол осторожно сливали. Пробирку переворачивали и давали стечь содержимому на чистую бумагу. Пробу высушивали на воздухе в течение 15 мин. Гранулы повторно растворяли в 50 мл воды (см. ниже).

СТАВ-буфер.

1,4 Μ ΝηΟ мМ Εϋ'ΓΑ

100 мМ трис-НС1

2%(в/об) СТАВ

8ЕУАС.

Хлороформ:изоамиловый спирт (24:1).

РНК-азный буфер.

мМ трис, 15 мМ ЫаС1, рН 7,5

РНК-аза А мг РНК-аза/мл РНК-азный буфер (5 мл Ы6е§1+50 мг РНК-аза А, аликвоты в пробирках объемом 1,5 мл, кипячение пробирок в течение 30 мин при 100°С, хранение при - 20°С)

Обычно применяли метод 1. Данный метод позволяет экстрагировать большое количество проб ДНК в день, при этом качество ДНК приемлемое. Метод 2 применяли в случаях, когда листовой материал был старым или когда возникали проблемы с качеством ДНК. Этот метод более сложен, требует больше времени и дает меньший выход ДНК, но более высокого качества.

Количественное определение ДНК не проводили, и в полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали от 0,5 до 1 мл раствора экстрагированной ДНК.

II. Полимеразная цепная реакция.

Для реакций ПЦР приготовляли 10-кратную буферную смесь, состоящую из буфера+άΝΤΡ. Применяли следующую процедуру.

- 5 011923

Основной буфер	Объем	Юхбуфер КОНЦ,	Заключительная реакция ПЦР КОНЦ.
1М трис-НС1,	100 рл	0,1 м	10 мМ трис-НС1.
рН 8,3			рН 8,3
1М КС1	500 рл	0,5 М	50 мМ КС1
ЮОмМ 6АТР	20 рл	2 мМ	0,2 мМ ОАТР
ЮОмМ ОСТР	20 рл	2 мМ	0,2 мМ ОСТР
ЮОмМбТТР	20 рл	2 мМ	0,2 мМ сПТР
ЮОмМ ОСТР	20 рл	2 мМ	0,2 мМ ОСТР
100мММдС1₂	100 рл	15 мМ	1,5 мМ МдСЪ
НРЕС вода	170рл

Всего 1000 рл

Реакция ПЦР (25 цл).

ДНК 0,5 рл

Праймер 1 1 рл (20 пмоль)

Праймер 2	1 рл (20 пмоль)
Тад полимераза 1	0,2 рл (1 Ц, Опсог АрррПдепе 8.А., Гейдельберг, Германия)
Буфер 10 х конц.	2,5 рл
Вода	18,8 рл

III. Идентификация Н7-1 методом ПЦР.

Идентификацию Н7-1 осуществляли методом ПЦР с использованием сайтспецифичных праймеров.

Верхний праймер (БЕЦ ГО N0: 1):

Н7-207030: 5' ТТА АТТ ТТТ ОСА ОСС ОАТ СОТ ОСС ТОТ ТАТ 3'

Нижний праймер (БЕЦ ГО N0: 2):

Н7-841Б30: 5' САТ АСО САТ ТАО ТОА ОТО ООС ТОТ САО ОАС 3'

Верхний праймер локализован снаружи встройки и является частью геномной ДНК сахарной свеклы. Нижний праймер локализован внутри встроенного гена СР4-ЕРБРБ.

Условия проведения ПЦР.

94 °С	4 мин	Этап 1
95 °С	30 сек	Этап 2а
55 °С	30 сек	Этап 26
72 °С	2 мин	Этап 2в
72 °С	5 мин	Этап 3
4°С	в течение ночи	Этап 4

завершение реакции

Этапы 2а-в повторяли 34 раза.

Предполагаемый продукт ПЦР - фрагмент ДНК размером 664 п.о. (БЕЦ ГО N0: 13, см. фиг. 2).

IV. Идентификация Н7-1 методом многократной ПЦР.

Для дифференцировки нетрансгенных и трансгенных растений, как гомозиготных, так и геми/гетерозиготных, проводили многократную ПЦР с тремя различными праймерами. Были использованы следующие праймеры.

- 6 011923

Н72 (8ЕС ΙΌ N0: 14): 5' 6СТСТСАСАСААСС66ТАААТ6САТТ6ССС 3' Н782 (8ЕТ) ΙΌ N0: 15): 5' 6АСССАТАСТТТ6АТТТТАА6САС6АСАТС 3' Н7В2 (8ЕЕ) ΙΌ N0: 16): 5' ССА6АТТСТ6СТААСТТ6С6ССАТС66АС 3' Условия ПЦР.

94 °С	2 мин	Этап 1
94 °С	1 сек	Этап 2а
60 °С	45 сек	Этап 26
72 °С	90 сек	Этап 2в
72 °С	5 мин	Этап 3
4 °С	в течение ночи	Этап 4

завершение реакции

Этапы 2а-в повторяли 34 раза.

Нетрансгенные растения проявляют только один фрагмент ПЦР размером 350 п.о. Гомозиготные трансгенные растения - один фрагмент размером около 1042 кб. Гетерозиготные растения проявляют оба фрагмента (см. фиг. 3).

Пример 2. Характеристика Н7-1.

Для характеристики интегрированной в Н7-1 ДНК проводили молекулярный анализ. В частности, определяли количество встроек (количество сайтов интеграции внутри генома сахарной свеклы), количество копий (количество фрагментов ДНК внутри одного локуса), целостность встроенной кодирующей области и ее регуляторных элементов, последовательность рЕМУ-промотора и последовательность Е9-3'концевой терминации транскрипции, отсутствие последовательностей основной цепи в векторе, который использовали для трансформации, а также стабильность наследования встройки. Кроме того, были идентифицированы последовательности, фланкирующие встройку ДНК.

Определение характеристик встроенной ДНК Н7-1, полученной в результате трансформации сахарной свеклы, осуществляли с применением методов Саузерн-блоттинга, ПЦР и инвертированной ПЦР. Это включало также позитивный и негативный контроль (РУ-ВУСТ08, ДНК нетрансгенного растения), который осуществляли теми же методами, что и определение характеристик исследуемого вещества (Н7-1).

ДНК выделяли из партии № 749034 растений Н7-1, выращенных в 1997г. ДНК выделяли также из исходного трансформанта Н7-1/380057 (=6401 УН), выращенного в 1995г., и из дополнительных потомств, выращенных в 1996, 1997 и 1998гг. (Н7-1/64801Н, Р7-1/74922Н и Н7-1/830028).

Нетрансгенная линия сахарной свеклы 380057 служила в качестве контроля. Кроме того, линии сахарной свеклы 5К7150, 8К1180 и 680085 использовали в качестве негативного контроля. Это обычные нетрансгенные линии, которые используются для выращивания традиционной сахарной свеклы.

Эталонные вещества соответствуют плазмиде РУ-ВУСТ08, использованной для трансформации. Плазмидную ДНК смешивали с ДНК из контрольной линии сахарной свеклы, расщепляли рестрикционным ферментом и разделяли методом электрофореза в агарозном геле параллельно с исследуемыми веществами. Плазмида служила в качестве маркера для определения размера предполагаемого фрагмента, а также в качестве позитивного контроля гибридизации. Для демонстрации чувствительности метода блоттинга по Саузерну плазмидную ДНК смешивали с геномной ДНК растения в концентрации менее 1 копии анализируемого элемента (~10 цг геномной ДНК и ~28 пг РУ-ВУСТ08-ДНК). Устанавливали размеры с использованием маркера для определения молекулярных размеров КАОиЬ™ (фирма 0^0Р/Арр11депе, каталог № 160673).

Выделение ДНК.

Растительную ткань (1-3 г сырого веса) из партии № 74903Н Н7-1 растирали в жидком азоте в мелкий порошок, используя ступку и пестик. Порошок переносили в 50 мл пробирку Оукриджа и добавляли 7,5 мл предварительно нагретого (60°С) СТАВ-буфера (2%-ный СТАВ, 1,4М №1С1 и 0,2%-ный меркаптоэтанол). Пробы инкубировали при 65°С в течение приблизительно 30 мин при непрерывном перемешивании. К пробам добавляли равный объем (8 мл) смеси ВТ хлороформ:изоамиловый спирт (24:1 об./об.). Суспензию перемешивали путем инверсии. Используя центрифугирование (10 мин, 9000 об./мин), отделяли две фазы. Водную фазу переносили в другую пробирку Оукриджа объемом 50 мл и затем осаждали ДНК добавлением 5 мл изопропанола. ДНК раздробляли центрифугированием (2 мин, 9000 об./мин) и удаляли супернатант. Осажденную ДНК инкубировали с промывным раствором, состоящим из 76% этанола и 10 мМ ацетата аммония, в течение около 20 мин. После центрифугирования и декантирования супернатанта ДНК высушивали в вакууме и повторно растворяли в ТЕ (рН 8,0) при 4°С в течение ночи.

В качестве альтернативного метода ДНК выделяли с использованием набора Идеалу Р1ап1 Мах1 фирмы 01а8еп (Дюссельдорф, Германия, каталог № 68163). Выделение ДНК проводили согласно инструкциям производителя.

В качестве дополнительного альтернативного метода ДНК выделяли с использованием набора

- 7 011923

Ипеауу Р1ап1 Мах1 фирмы О1адеп (Дюссельдорф, Германия, каталог № 69103). Выделение ДНК проводили согласно инструкциям производителя.

Количественное определение ДНК и расщепление рестрикционными ферментами.

Количество ДНК определяли с использованием ЬКВ Вюсйгот иУ/уыЫе спектрофотометра (фирма Атегайат РГагташа, Фрейбург, Германия) или, альтернативным путем, определение количества ДНК осуществляли после электрофореза в агарозном геле сканированием ДНК с помощью компьютерной программы КГЬРксап (фирма М\УС-Вю1ес11. Эберсберг, Германия). В качестве калибровочного стандарта использовали Ηφΐι ΌΝΆ Ма§8 Ьаббег фирмы СФсо/ЫГе Тесйпо1од1е8 (Карлсруэ, Германия, каталог № 10496-016). Рестрикционные ферменты приобретали у фирм Воейппдег Маппйе1т (Маннхайм, Германия), 81га1адепе (Амстердам, Нидерланды) и №е\у Епд1апб Вю1аЬ§ (Франкфурт, Германия) и применяли в соответствии с инструкциями изготовителя.

Приготовление зонда ДНК.

ДНК плазмиды РУ-ВУСТ08 выделяли из культур Е. сой. Матрицы зонда, гомологичные кодирующей области СР4-ЕР8Р8, 358-промотору, области Е9-3'-полиаденилирования, ³⁵8-с1р2-СР4-ЕР8Р8-Е9-3'кассете и боковым областям, приготовляли путем расщепления соответствующими рестрикционными ферментами с последующим разделением методом электрофореза в агарозном геле или полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продукты очищали, используя набор Пепе С1еап II фирмы Вю 101 (Ла Джолла, Калифорния). Зонды (25 пг) метили 32Р-6СТР или 32Р-6АТР, используя систему для мечения ДНК Медарпте™ фирмы Атегайат-Рйагташа Вю1есй Еигоре (Фрайбург, Германия).

Саузерн-блот-анализы.

Пробы ДНК, обработанные рестрикционными ферментами, разделяли методом электрофореза в агарозном геле «15 ч при «35 в. После фотографирования геля ДНК очищали посредством замачивания геля в течение 15 мин в растворе 0,25М НС1, денатурировали инкубированием геля в течение 30 мин в денатурационном растворе, содержащем 0,5М №аОН, 1,5М №аС1, при постоянном перемешивании и в конце нейтрализовали посредством замачивания в течение 2 ч в нескольких объемах раствора, содержащего 2М №101 и 1М трис-НС1, рН 5,5. ДНК из агарозных гелей переносили на нейлоновые мембраны НуЬопб™ (Атегайат-Рйагтааа Вю1есй Еигоре, Фрайбург, Германия), используя Ро81В1о1 Ргеккиге блоттер фирмы 81га1адепе в соответствии с протоколом изготовителя. После замачивания фильтров в течение 15 мин в 2-кратном 88РЕ (20-кратный 88РЕ: 3,6М №аС1, 20 мМ ЕОТА, 0,2М №аН₂РО₄/№а₂НРО₄, рН 7,4) ДНК фиксировали на мембране путем облучения ультрафиолетом (ТгапкШитшаФг Рйагтааа, Фрайбург, Германия) в течение 0,1 мин и упаривания под вакуумом 1 ч при 80°С. Блоты предгибридизовали 4 ч в водном растворе 50%-ного формамида, 5-кратного 88С, 0,1%-ного лаурилсаркозина, 0,02%-ного 8Ό8 и 2%-ного блокирующего реагента (Воейппдег Маппйе1т, Германия, каталог № 1096176). Гибридизацию с радиоактивно меченным зондом проводили в свежем предгибридизационном растворе в течение 16-18 ч при 42°С. После гибридизации мембраны промывали 5 мин в 2-кратном 88С, 1%-ном 8Ό8 при 65°С и 2 раза по 15 мин в 0,2-кратном 88С, 0,1%-ном 8Ό8 при 68°С. Авторадиографическое изображение блотов получали путем экспонирования блотов на пленку Кобак Вютах М8Т™ с использованием интенсифицирующих экранов Кобак Вютах М8Т™.

Идентификация геномных 5'- и 3'-фланкирующих последовательностей.

Место сшивки трансген-растение геномной ДНК идентифицировали методом инвертированной ПЦР. Геномную ДНК очищали, как описано выше. Приблизительно 1 цг ДНК расщепляли в отдельных реакциях рестрикционными нуклеазами Тад1, А1и1, №бе111 или ΡδηΙ. Расщепленные ДНК-фрагменты повторно лигировали Т4-лигазой в течение ночи, после чего проводили полимеразную цепную реакцию. Получали различные комбинации инвертированных праймеров, используя пакеты программ для анализа праймеров ОЬЮО® (№аОопа1 Вюкаепсек, 1пс., Плимут, Мичиган).

Фрагменты, полученные в результате этой инвертированной ПЦР-амплификации, разделяли гельэлектрофорезом, вырезали из геля и подвергали очистке с использованием набора Пепе С1еап II™. Очищенные фрагменты клонировали в вектор рСК®2.1 ТОРО™ТА фирмы БчуЦгодеп (Гренинген, Нидерланды). Встройки направляли для секвенирования на фирму М\УС-Вю1ес11 (Эберсберг, Германия). Полученные данные о последовательностях анализировали с использованием пакетов программ для анализа ДНК Мас Мо11у® Те1га (8ой Оепе ОтЬН, Бухольд, Германия).

Анализ методом ПЦР.

Геномную ДНК готовили, используя комплект Р1ап1 П№Аеа§у Р1ап1 М1ш (Р1адеп, Дюссельдорф, Германия) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для ПЦР использовали приблизительно 50 нг геномной ДНК. Реакции проводили 30 с при 95°С, 30 с при 55°С и 35 циклов в течение 2 мин при 72°С. ПЦР выполняли на циклере РТС200 (Вю/уш, Ольдендорф, Германия). Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в агарозном геле.

1. Количество встроек.

Для Н7-1 определяли количество встроек и количество сайтов интеграции трансгенной ДНК в геном сахарной свеклы. Чтобы установить количество встроек, геномную ДНК расщепляли рестрикционными ферментами НшбШ, XЬаI и ВатНГ В качестве негативного контроля ДНК из нетрансформирован

- 8 011923 ного контрольного растения, представляющего собой ту же генетическую линию, расщепляли с помощью ΗίηάΙΙΙ. В качестве позитивного контроля использовали ДНК вектора трансформации (РУВУСТ08).

ХЬа1 и ВатН1 расщеплялись только 1 раз в РУ-ВУСТ08 и не расщеплялись внутри меченого зонда СР4-ЕР8Р8, который использовали (см. фиг. 4). ΗίηάΙΙΙ расщеплялся 3 раза в РУ-ВУСТ08, но все три сайта локализованы снаружи зонда и на том же 5'-конце относительно зонда. Таким образом, каждый фермент предположительно высвобождает один фрагмент ДНК, который гибридизуется с зондом СР4ЕР8Р8, и, по-видимому, содержит часть встроенной ДНК и прилегающей геномной ДНК растения. Число детектированных фрагментов указывает на количество присутствующих в Н7-1 встроек. Результаты приведены на фиг. 5.

После расщепления посредством ΗίηάΙΙΙ, ХЬа1 и ВатН1 обнаруживали только один гибридизационный фрагмент соответственно. Фрагменты размером 5,2 кб, полученные в результате расщепления с помощью ΗίηάΙΙΙ (дорожка 4), 4кб - с помощью ХЬа! (дорожка 5) и приблизительно 11 кб - с помощью ВатШ, показывают, что трансформант Н7-1 является единственным явлением интеграции (фиг. 4). Сильный сигнал на дорожке 1 представляет линеаризованную плазмиду РУ-ВУСТ08. Дополнительные слабые сигналы относятся к небольшим количествам нерасщепленной РУ-ВУСТ08 или являются неспецифичными фоновыми сигналами гибридизации.

2. Количество копий.

Теоретически, один сайт интеграции может содержать более 1 копии встроенной ДНК. Однако, учитывая размер фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикционного анализа, как показано выше, это невозможно. Если бы Н7-1 включал более 1 копии встроенной ДНК, были бы обнаружены дополнительные фрагменты. Это подтверждали также и результаты расщепления рестрикционным ферментом РкЧ. РкЧ расщепляется дважды внутри лево- и правосторонних последовательностей. Один из рестрикционных сайтов находится внутри кодирующей области СР4-ЕР8Р8, поэтому после расщепления можно было бы предполагать наличие двух фрагментов гибридизации с СР4-ЕР8Р8-зондом. Один из фрагментов предположительно соответствует внутреннему фрагменту размером около 1,2 кб. Второй фрагмент предположительно является боковым фрагментом. Итак, в случае более одной копии были бы обнаружены дополнительные фрагменты. Но результаты показывают, что РкЧ разрезает ДНК, как предполагалось. Были обнаружены внутренний фрагмент размером 1,2 кб и только один дополнительный фрагмент размером около 4,9 кб (фиг. 5; дорожка 3, фиг. 4).

В качестве дополнительного внутреннего контроля ДНК расщепляли с помощью С1а! (фиг. 5, дорожка 6, фиг. 4). Как предполагалось, гибридизовался один фрагмент размером 2,4 кб, так как СЫ расщеплялся дважды, но снаружи слева и справа от использованного фрагмента СР4-ЕР8Р8. Это также доказывает интактность интегрированного фрагмента ДНК и согласуется с нижеследующими результатами.

Как предполагалось, гибридизация плазмиды РУ-ВУСТ08 с фрагментом СР4-ЕР8Р8 дает сигнал в 8,6 кб (дорожка 1) (РУ-ВУСТ08=8590 п.о.). Вторая меньшая и очень слабая полоса является результатом неполной рестрикции РУ-ВУСТ08.

Таким образом, результаты экспериментов показывают, что трансформированная линия сахарной свеклы Н7-1 содержит единственную копию интеграции Т-ДНК плазмиды РУ-ВУСТ08 в геном растения.

3. Интактность кодирующей области.

Целостность генной кассеты СР4-ЕР8Р8 относительно отдельных элементов (Р-БМУ-промотора, с1р2-СР4-ЕР8Р8-кодирующей области и Е9 З'-концевого нетранслируемого участка) определяли расщеплением при помощи ферментов ΗίηάΙΙΙ для Р-БМУ, ΗίηάΙΙΙ плюс ВатШ для с1р2-СР4-ЕР8Р8 и ЕсоР! плюс РШ для Е9 З'-концевого нетранслируемого участка. Проводили дополнительные эксперименты с использованием Бай плюс ХМ для Р-БМУ-с1р2-СР4-ЕР8Р8-области и Е9 З'-концевого участка. Плазмидную ДНК, смешанную с ДНК нетрансгенной сахарной свеклы, и отдельно ДНК нетрансгенной сахарной свеклы расщепляли теми же ферментами в качестве позитивного и негативного контроля соответственно.

Эти ферменты расщепляются внутри предполагаемой встройки ДНК, между левой и правой сторонами Т-ДНК (см. плазмидную карту на фиг. 1), поэтому в случае, если соответствующие элементы являются интактными, то размер гибридизующихся фрагментов должен быть идентичным в ДНК Н7-1 и ДНК РУ-ВУСТ08.

В качестве дополнительного контроля ДНК расщепляли посредством ХЬаТ ХЬа[ расщеплялся 1 раз между промотором и сф2-СР4-ЕР8Р8-кодирующей областью. Таким образом, можно сделать предположение, что ДНК РУ-ВУСТ08 дает фрагмент размером 8,6 кб, а в случае с Н7-1 - боковой фрагмент, размер которого отличается от размера фрагмента РУ-ВУСТ08. Результаты показаны на фиг. 6, 7 и 8.

Фиг. 6: расщепление ферментами ΗίηάΙΙΙ и ВатШ высвобождало ген СР4-ЕР8Р8, блот исследовали фрагментом СР4-ЕР8Р8, генерированным методом ПЦР. Негативный контроль (дорожка 6) не обнаруживал полос гибридизации. Геномная ДНК из Н7-1 и плазмида РУ-ВУСТ08, смешанная с нетрансгенной ДНК, давали фрагмент размером приблизительно 1,7 кб, что соответствует предполагаемому размеру. В результате расщепления ферментом XЬаI получали предполагаемый фрагмент размером 8,6 кб линеаризованной РУ-ВУСТ08. Что касается Н7-1, расщепление давало боковой фрагмент размером приблизи

- 9 011923 тельно 4,0 кб (см. также фиг. 4 и 5). Негативный контроль, как и прежде, не выявлял каких-либо сигналов.

Фиг. 7: расщепление ферментом ΗίηάΙΙΙ высвобождало промотор на основе вируса мозаики норичника, блот исследовали фрагментом промотора, генерированного методом ПЦР. Негативный контроль (дорожка 5) не обнаруживал сигналов гибридизации. Геномная ДНК из Н7-1 и плазмида РУ-ВУОТ08, смешанная с нетрансгенной ДНК, давали фрагмент гибридизации размером приблизительно 0,6 кб. Этот размер соответствует предполагаемому размеру промотора (дорожки 4 и 6).

Расщепление ферментом ХЬа1 давало предполагаемый фрагмент размером 8,6 кб линеаризованной РУ-ВУОТ08 и левосторонний фрагмент размером приблизительно 1,3 кб (дорожки 1 и 3) из Н7-1. Этот фрагмент размером 1,3 кб еще раз доказывает, что Н7-1 содержит только одну копию трансгена. Негативный контроль (дорожка 2) не выявлял каких-либо сигналов.

Расщепление с помощью 8ас1/Хйо1 высвобождало область промотора вместе с кодирующей областью СН4-ЕР8Р8 и областью полиаденилирования. Гибридизация с целой кассетой промотор-с!р2-СР4ЕР8Р8-сигнал полиаденилирования (Ртс1/Хйо1-фрагмент) давала предполагаемый промотор-с!р2-СР4ЕР8Р8 размером 2,3 кб и сигнальные фрагменты полиаденилирования размером 0,7 кб как с ДНК РУВУОТ08, смешанной с нетрансгенной ДНК, так и с геномной ДНК Н7-1 (дорожки 9 и 11).

Фиг. 8: расщепление ферментами Р§Н и ЕсоР1 высвобождало Е9-3'-концевой сигнал полиаденилирования, блот исследовали фрагментом сигнала полиаденилирования. Негативный контроль (дорожка 3) не обнаруживал полос гибридизации. Плазмида РУ-ВУСТ08. смешанная с нетрансгенной ДНК, и геномная ДНК из Н7-1 продуцировали фрагмент размером приблизительно 0,6 кб, что соответствует предполагаемому размеру. В результате расщепления ферментом ХЬа1 получали предполагаемый фрагмент размером 8,6 кб линеаризованной плазмиды РУ-ВУОТ08 и боковой фрагмент с Н7-1 размером приблизительно 4,0 кб.

Расщепление ферментом Р§Н высвобождало Е9-3'-концевой сигнал полиаденилирования, связанный с 3'-концом размером 0,5 кб кодирующей области СР4-ЕР8Р8. Получаемый в результате фрагмент размером 1,2 кб обнаруживали, как предполагалось, с геномной ДНК Н7-1, а также с ДНК РУ-ВУОТ08.

В результате расщепления ΗίηάΙΙΙ получали фрагмент размером приблизительно 8,0 кб линеаризованной РУ-ВУОТ08 минус фрагмент промотора (дорожка 13) и боковой фрагмент размером 5,2 кб (дорожка 11) с Н7-1. Единственный фрагмент размером 5,2 кб, полученный в результате расщепления ферментом ΗίηάΙΙΙ, и единственный фрагмент размером 4,0 кб, полученный в результате расщепления ферментом ХЬа!, еще раз подтверждают, что Н7-1 содержал только одну копию встроенной ДНК. Негативный контроль не выявлял каких-либо сигналов.

Таким образом, результаты изучения блотов подтверждают тот факт, что все элементы перенесенной ДНК являются интактными и что Н7-1 содержит единственную интактную кодирующую область с1р2-СР4-ЕР8Р8 с регуляторными элементами, область рЕМУ-промотора и Е9-3'-концевую последовательность терминации транскрипции.

4. Анализ для обнаружения фрагментов основной цепи.

Область основной цепи Т1-плазмиды определяется как область снаружи Т-ДНК, ограниченной левои правосторонними последовательностями, которая состоит из оп-генов и селекционных генов для бактериальной репликации и бактериальной селекции и которая обычно не переносится в геном растения в результате трансформации на основе АдгоЬас1епит. Для подтверждения отсутствия основной цепи векторной ДНК в Н7-1 геномную ДНК из Н7-1 из нетрансформированного контроля и геномную ДНК из Н7-1, смешанную с ДНК РУ-ВУОТ08, расщепляли рестрикционным ферментом ХЬа! и исследовали тремя перекрывающимися ПЦР-генерированными зондами, которые включали целую последовательность основной цепи. Четвертый зонд содержал целую последовательность основной цепи в одном фрагменте.

Использованные зонды представляют собой последовательность основной цепи (см. фиг. 9).

1. 2730-5370 п.о.

2. 5278-6419 п.о.

3. 6302-7851 п.о.

4. 2730-7851 п.о.

На фиг. 10 показаны результаты Саузерн-блот-анализа.

Дорожки 6, 10, 14 и 18: расщепление геномной ДНК Н7-1, исследованной фрагментами основной цепи из целой цепи, не выявило каких-либо полос гибридизации. Только дорожки 4, 8, 12, 16 и 20 (геномная ДНК, смешанная с ДНК РУ-ВУОТ08) давали полосы размером 8,6 кб, как предполагалось. Полосы представляют собой линеаризованную ДНК РУ-ВУОТ08.

Дорожки 2 и 4: геномная ДНК Н7-1 и геномная ДНК Н7-1, смешанная с РУ-ВУОТ08 и гибридизированная с СР4-ЕР8Р8, давали сигналы гибридизации. Полоса 4 кб на дорожке 2 представляет собой правосторонний фрагмент, две полосы на дорожке 4 представляют собой правосторонний фрагмент в 4,0 кб и линеаризованную плазмиду РУ-ВУОТ08 длиной 8,6 кб. Обе полосы имеют одинаковую интенсивность. Это убедительно показывает, что концентрация добавленной ДНК РУ-ВУОТ08 сравнима с концентрацией элемента СР4-ЕР8Р8 в ДНК Н7-1. Концентрация использованной плазмидной ДНК эквивалентна 0,5 копий. Если бы в геном Н7-1 интегрировались последовательности основной цепи, обнаруживались бы четкие сигналы.

- 10 011923

Приведенные результаты доказывают, что Н7-1 не содержит какой-либо детектируемой последовательности основной цепи плазмиды, использованной для трансформации. Эти результаты также подтверждаются данными анализа 5'- и З'-фланкирующих геномных областей (см. ниже).

5. Идентификация 5'- и З'-фланкирующих геномных последовательностей.

Трансформация на основе АдгоЬас1егшт обычно приводит к интеграции всех последовательностей между левой и правой сторонами в геном растения. 5'- и З'-концы интегрированной плазмидной ДНК предположительно должны быть внутри или около лево- или правосторонних последовательностей, соответственно. Идентификацию этих областей осуществляли методом инвертированной ПЦР. Клонированные продукты ПЦР секвенировали и результаты секвенирования сравнивали с последовательностью РУ-ВУСТ08.

На фиг. 11 показано выравнивание последовательности клонированного методом инвертированной ПЦР фрагмента (ИШ.КРТ) (=геном Н7-1, верхняя последовательность), полученного с помощью праймеров для анализа левосторонней области, против последовательности РУ-ВУСТ08 (нижняя последовательность). Сравнение этих двух последовательностей выявило прерывание гомологии как раз внутри боковой последовательности.

На фиг. 12 показано выравнивание последовательности клонированного методом инвертированной ПЦР фрагмента (ВЗИИТКРТ) (=геном Н7-1, верхняя последовательность), полученного с помощью праймеров для анализа правосторонней области, против последовательности РУ-ВУСТ08 (нижняя последовательность).

Сравнение этих двух последовательностей выявило прерывание гомологии уже за 18 нуклеотидов до боковой последовательности.

Таким образом, убедительно показано, что последовательность между левой и правой сторонами Т1-плазмиды РУ-ВУСТ08 интегрирована правильно. Последовательность прерывалась внутри или непосредственно до боковых сторон. Эти данные подтверждают результаты анализа основной цепи, а именно то, что в геном Н7-1 не интегрировались последовательности основной цепи снаружи боковых областей.

Чтобы установить, являются ли фланкирующие последовательности на правой или левой стороне встройки в Н7-1 сахарной свеклы интактными последовательностями генома растения, проводили анализ методом ПЦР с комбинациями праймеров Р1, Р2, Р2 и Р4.

Праймеры Р1 и Р2 из комбинации праймеров локализованы снаружи встройки. Если ДНК встроенного локуса внутри Н7-1 идентична ДНК нетрансформированного контроля, то результатом ПЦР предположительно должны быть два фрагмента ПЦР, являющиеся синтезом обоих праймеров. Праймеры РЗ и Р4 из комбинации праймеров сконструированы таким образом, что один из этих праймеров локализован внутри встройки СР4-ЕР8Р8, а другой - снаружи встройки внутри геномной ДНК растения. Поэтому в результате ПЦР предположительно должны продуцироваться фрагменты только из ДНК Н7-1.

Данные о последовательности, полученные методом инвертированной ПЦР, вместе с данными из вектора РУ-ВУСТ08 дают последовательность, которая включает встройку Н7-1 (РУ-ВУСТ08 последовательность), право- и левосторонние участки присоединения и дополнительную геномную ДНК сахарной свеклы (8ЕО ΙΌ N0: 5).

Для идентификации трансген-растение присоединений геномной ДНК (идентификации сайтспецифичности) и участков геномной ДНК на левой и правой сторонах встройки использовали следующие праймеры.

Комбинация Р1 (праймер для анализа геномной ДНК снаружи правосторонней боковой области).

Верхний праймер: 5' ССС ТАА АТС САТ ТСС СОТ ТТС ТТ

Нижний праймер: 5' САС ССА САТ ССС ААТ ААА АСС СТА АТ

Предполагаемый продукт ПЦР 241 п. о.

Комбинация Р2 (праймер для анализа геномной ДНК снаружи левосторонней боковой области, 8ЕС ГО N0: 20, 8Ер ГО N0: 21).

Верхний праймер: 5' ААА ТСС ТТС ТАС АТА ААТ ААС САА АТС А

Нижний праймер: 5' АСА ТСТ ТТС АСС АСТ СТТ СТТ СТ

Предполагаемый продукт ПЦР 377 п.о.

Комбинация РЗ (праймер для анализа трансген-растение присоединения геномной ДНК, 8ЕС ГО N0: 7, 8ЕС ГО N0: 8).

Верхний праймер: 5' АТС САТ ТСС ССТ ТТС ТТТ ТТС АТ

Нижний праймер: 5' ТСТ ССТ ТТС ССС ССТ ТСА С

Предполагаемый продукт ПЦР 288 п.о. (8ЕС ГО N0: 11).

Комбинация Р4 (праймер для анализа трансген-растение присоединения геномной ДНК, 8ЕС ГО N0: 9, 8ЕС ГО N0: 10).

Верхний праймер: 5' ССС ТСС ССА САТ СТА САТ ТТТ ТСА АТ

Нижний праймер: 5' АСТ ТАА СТТ ТСС АСТ ТАТ ССС ССС АСТ С

Предполагаемый продукт ПЦР 751 п.о. (8ЕС ГО N0: 12).

Эксперименты методом ПЦР с ДНК Н7-1 и ДНК из нетрансгенного контрольного растения с использованием комбинации праймеров РЗ, в которой один из праймеров локализован внутри встройки Н7

- 11 011923

1, давали фрагмент только с ДНК Н7-1. И, наоборот, эксперименты методом ПЦР с использованием комбинации праймеров Р1, гомологичной последовательностям снаружи встройки, давали фрагменты как с ДНК Н7-1, так и с ДНК нетрансгенного контроля. Результаты этих экспериментов представлены на фиг. 13.

Из этих результатов видно, что последовательность, прилежащая к правостороннему месту присоединения встройки, присутствует в ДНК трансгенного Н7-1 и в ДНК из нетрансгенных растений. Из этого можно заключить, что ДНК снаружи встройки Н7-1 является нетрансгенной геномной ДНК.

Эксперименты методом ПЦР с ДНК Н7-1 и ДНК из нетрансгенного контрольного растения с использованием комбинации праймеров Р4, в которой один из праймеров локализован внутри встройки СР4-ЕР8Р8, давали фрагмент только с ДНК Н7-1. Наоборот, эксперименты методом ПЦР с использованием комбинации праймеров Р2, гомологичной последовательностям снаружи встройки, давали фрагменты как с ДНК Н7-1, так и с нетрансгенной контрольной ДНК. См. эти результаты на фиг. 13.

Результаты показывают, что последовательность, прилежащая к левостороннему месту присоединения встройки, присутствует в ДНК трансгенного Н7-1 и в ДНК из нетрансгенных растений. Из этого можно заключить, что ДНК снаружи левостороннего места присоединения является нетрансгенной геномной ДНК.

Таким образом, можно сказать, что последовательности снаружи встройки Н7-1 сахарной свеклы идентичны последовательностям, присутствующим в нетрансгенных растениях. Из этого можно сделать вывод, что эти последовательности являются последовательностями генома растения, присутствующими в родительской линии, использованной для трансформации, и в других традиционных линиях сахарной свеклы.

6. Стабильность через поколения.

Для демонстрации стабильности интегрированной ДНК исходный трансформируемый Н7-1 сравнивали с тремя потомствами (64801Н, 74922Н и 830028; см. фиг. 15) этой линии, полученной в результате самоопыления нетрансгенными линиями сахарной свеклы. Исходная трансформированная линия и потомства были получены в 1995, 1996, 1997 и 1998гг.

В качестве контроля анализировали четыре различные линии нетрансгенной сахарной свеклы (380057, 5В7150, 8К1180, 680085). Все ДНК расщепляли ХЬа1, ΗίηάΙΙΙ и ВатН1 соответственно и гибридизовали с меченым фрагментом СР4-ЕР8Р8. Чтобы показать, что Т-ДНК стабильно интегрировалась в геном растения, все дорожки потомств Н7-1, расщепляемые теми же рестрикционными ферментами, предположительно должны давать полосу точно такого же размера.

Все ДНК из потомств Н7-1 на дорожках 3-6 дают предполагаемые фрагменты: ДНК, расщепленная с помощью ВатН1, давала полосы размером около 11 кб, расщепления посредством ХЬа1 продуцировали фрагменты размером 4,0 кб и посредством ΗίηάΙΙΙ - полосы размером 5,2 кб. Все полосы, полученные с помощью одинаковых рестрикционных ферментов, но в разные годы, были идентичными по размеру. Никакие нетрансгенные линии не давали каких-либо сигналов (фиг. 16).

Эти результаты показывают, что интродуцированная последовательность стабильно интегрируется в геномную ДНК и стабильно наследуется.

Протокол последовательностей - свободный текст.

8ЕОΙΡ: 5 <223>: Встроенная ДНК с фланкирующими 3'- и 5'-последовательностями

8ЕО ΙΡ: 6 <223>: ПЦР-продукт

5ЕО ΙΡ: И <223>: ПЦР-продукт

8ЕОΙΡ: 12 <223>: ПЦР-продукт

8ЕОΙΡ: 13 <223>: ПЦР-продукт

8ЕО ΙΡ: 17 <223>: ПЦР-продукт

- 12 011923

Перечень последовательностей <110> КВССААТАГ <120> Устойчивая к глифосату сахарная свекла <130> РСТ0079 <150> ЕР 03003866.5 <151> 2003-02-20 <150> и8 10/376763 <151> 2003-02-28 <160> 21 <170> Ра1епПп νβΓδίοη 3.1 <210> 1 <211> 30 <212> ϋΝΑ <213> Аг11йс1а1 Зедиепсе <220>

<223> Ргппег <400>1

ОааГс1Щ£ са§£С£а1£§ 1££С1£Па130 <210> 2 <211>30 <212> ΟΝΛ <213> АгН Г1С1а1 δβςιιεικχ <220>

<223> Ргппег <400> 2 са1ас£саи а§1§а§1§££ с^са^ас 30 <210> 3 <211> 20 <212> ΠΝΑ <213> Аг11Пс1а1 Зециепсе <220>

<223> Рптег <400> 3 а1£11а1с111ассаса§0 20

- 13 011923 <210> 4 <211> 24 <212> ΟΝΑ <213> Ατίίίιάβΐ δεςιιβικ® <220>

<223> Рптег <400> 4 £(ссс(ааа1 §а;а1ас£(а ааас <210> 5 <211> 3778 <212> ϋΝΑ <213> Аг11йс1а1 Зециспсс <220>

<223> 1п8ейе(1 ϋΝΑ χνΐίϊι 3' апс] 5' Папкт§ кеяиепсез <400> 5 с1с£а§с§§с с«сса§1§(§ а1§§а1а1с1 §са§аа11сц сссиа1§н а(сО1асса сэдицОД с(с1§асаса асс£§1ааа1 £са11§£сс1 п§1Ш1§а 1§£са1саас (((£§а£са( с(&а1Ш£С а1аиса^сс Ш1сса1ё§ 1ааисК11 асаа§ааШ (саисшс иаа£1а1аа асасиа§с11§§§асааас пс^аюп ашспаа! 1Ш£са££1 £[1а(§а£са §а(§Шс111сис1саП ас§§1Ша( 1££$’а1с1££ £1££с(с1аа с!аШаса1 §а£сс1сс£с аа££с§§&аа ас§асаа(с1 §а!сссса!с аа§с11§а§с (са§§аШа §са§саисс а£аП££&11 сааЮаасаа £§1ас§а§сс аШсасШ аИсаааКд §1а1с§ссаа аассаа§аа§ §аас1ссса( сс1сааа§§( Н§1аа§§аа §аайс1са§ 1ссааа§сс1 саасаа§£1с а£@£(аса§а §1с1ссааас саПадссаа аа£с1аса§£ а§а1саа1£а а^ааСсНса агсааац(аа ас!ас1§Пс са§саса1£с а(са1§§1са у1аацШса £ааааа£аса (ссасс§аа§ асКааадП а§1§§§са1с Шуааа£1а а1с(Ь§(саа са1с§а£са§ с1£§сП£1с§ £§§асса§ас аааааа§§аа 1£§1§са£аа Й£11а§£С£ сасс1ассаа аадса(сШ §ссШаи§ сааа§а1ааа §са£аИсс( с1а§1асаа£ (§чаасаа аа1аас£1§§ аааа§аес1§ 1сс1£аса§с ссас1сас1а а(§с£(а(§а с§аас§са£1 §ас§ассаса ааэ^ааисс с1с(а(а(аа §аа§£са(1с аПсссаШ §аа§§а1са1 са£а1ас1са ассаа(ссТ11 с1а£аа§а1с 1аа§сиа1с §а(аа§сП§ а1§1ааН£§ а&£аа£а1са аааППсаа 1сссса11с11с§аЙ§с(( сааН^аа®! 11с(сс§а!§ §с£,саа£Па §са§аа1с!§ саа1§£1§1§ са§аассса! с1с11а1с1с саа1с1с(с£ ааа 1сса®1с аас§сааа1с 1сссИа1с£ ц(Кс(с(уа а§ас£са£са

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

- 14 011923

1260 §са1ссас§а §сОа1сс§а Шс§1с§1с 81Щ)86^а((8 аа£аара£Г£ §§а1^асеМ ааК§£с1с1 £а£СПС£1с с1сИаа®£1 са1£1с11с1, §шссас§§ С£1£са1§с1 (сас£§1£са а§са£сс£1с са§саас1§с (с£(аар(сс СсЦ^сШ с^аасс^г сс£1аисса £§1&асаа£( с1а1с1ссса са§§1ссОс а1$Ш££а£ §1с1с§с1а§ с§§(£ааасс с£(а1сасс§ £1с1Ш£§а ад£(§аада( §иа1сааса с1££1аа£&с (а(£саа£с1 а(£££1§сса §аа1сс§1аа §§ааё§1§а( асИ^аЮа 11£а1££(§1 1£ё(аас£§1 £§ас(ссН§ с1сс!§ау§с 1сс(с1с£а( 11сдр1аасд с1§саас1§§ 11§сс£111§ ас(а1££§1с ίί£ίίβ£ί§1 Пас^аШс £а!ацсас1Л 1саи§§(§а

1320

1380

1440

1500

1560

1520

1680 с£сПс(с(с ас1аа§с§1с саа(£££1сд 1§1§11§аас ссасКсрсд ааа1§££1£1 §са§§1§аа§ 1с1е,аадас» §1§а1с§1с1 (ссадКасс (1§с£1§§ас сааацаскх аас§ссаа1с асс(аса§§§ 1асс1а1ц£с Нсс§с1саа §1£аа£1сс£ с1§ис(£С1

1740

1800

1860 аасасссса® £ίа(сассас (еЦакрац ссаа1са1ра с1ср1£асса

1920 сас1£аааа!; а(§сисаа§ 1аассИасс §П£а§ас1£ а(§с1£ас§£

1980

1§1ёс£1асс акс£(с(1£ (аа£с1сасс §^1саа§(§а 11§а1§исс

2040 а§£(£а1сса 1сс1с(ас(д сШсссаИ идсоднс садсДссца

2100 с§[сасса!с спаас^Ш 1§а(§аассс аассс£(ас( ££1ссса1с( 1£ас1с1£са

2160

Й>ааа1ооц( £сс£аса(с£ аа§1§а1саа сссас^сО §с1е§1е§а§ аа^асу^с

2220

1£ас((£С£1 §ис§йсИ с(асШ§аа §§§1§Пас1 ^Пссараас, асс£(£с1сс

2280

Нс1а1§а1с §ас§а§1а(с саа11с1с§с (§и§са§с1 §саНс§с(£ аа£§(§с1ас с£((а(§аас §§Ш££аа£ аас1ссд1§1 Ьаа£§ааа§с §асс§1ссШ с1§с(§1с£с

2340

2400 ааас§§1с1с аа§с1саас§ £(£И£а11£ сра(оаа§д( £а£ас11с1с ίε§ίε§ί§ε§ 1§§ΐε§ίεεί раср£(аард §(с(с£§1аа с§с11с1§£а §са§сЬ§Ес§ сСасссассС с£а1сасс§1 а1с£с1а(£а £с((сс(с£11а1§§§1с1с §шс1§ааа ассс!§Иас

2460

2520

2580 ί£ί 1@аί<2Д1 §с(ас1а1ра (срс(ас1ар с11ссса§а§ Пса1здаи 1§а1££С1§£ 1сП§£адс1 аа^акдаас 1с1сс§асас 1аа£§с1£с11§а1§а§с1с аарааПсуа §с(с§§1асс ре.а 1сс1с1а рс1аа§с111С£Пе§(а( са1с§§1Пс ^асаас^Нс а|саа£Пса а1дса(сае( ИсаН^с^с асасасса^а а(сс(ас1§а §ш§а§1а1 1а1дцсаП£ £§аааас1§1 Ш1сП£1а ссаШ£Н§ 1£с((§1аа1 иас1§1§И 1таКс££ Ш1С£С(а1 с§аас1£1£а аа1§§ааа1§ £а1£§а§аа£ а§Паа1§аа 1§а1а1§§1с сШ1£Кса МсЮаааП аа1а11аШ §ШШс1с 11аШ£Ц£ 1£1§П£аа1 ндаааПа! аа£а§а1а(£ сааасаии §пп§а§1а аааа1£1£1с ааа(с§1£§с с1е1аа1§ас С£аа§Иаа1 а(§аддад!а ааасас(1£| а§0§1асса ί(а(§сиа1 Гсас1а§§са асааа1а1а1 Шсарасс! а§аааа§с(§ сааа1дкас

2840

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180 (уаа(асаад 1а(£1сс1с11§1£Ш1а§ аеаШакщ асШссШ а1£(ааШ1 сса§аа1сс11д1са§аПс 1аа(са((£с Ша1ааПа 1а§Иа1ас1 са1§§а1(1£

3240

3300

- 15 011923

1а§11£а£1а 1£аааа1аН (Шаа^са 1Ша1§ас1 (^ссааПда ИдасаасаГ

3360 £са1саа1с§ асс!§садсс асю^аадсд §сс§ссас1с §а§1 £§с сдса1с§а1с §1§аа§1Нс 1са1с1аа§с ссссаШ§§ асОДааДО адасасд(сд аааГааада!

3420

3480

Осс§ааНа §аа1ааШ§ шодсИ (сцсскпаа аис^ас^а 1с§(аа1((£

1С£ППа1е аааардасч исаШ1а( аа1аас§с1§ с§§аса1с1а саШИдаа

Прааааааа (1ц21ааПа с1с111с1Н Нс1сса(а11уасса1са( ас1са11§с£с

3540

3600

3560 £а1сса1§(а §аШссс££ аса!§аа§сс аШасааО §аа1а1а1сс 1аа§(аааас с!са1а§§и йас£1аК1 саШа£§§а саа££§с§аа Пссадсаса

3720

3778 <210> 6 <211> 3706 <212> ϋΝΑ <213> АгОйс1а1 8е§иепсе <220>

<223> РСК ргобисг <400> 6 а1§На(сИ 1ассаса§0 асаса'асс§§ 1ааа1§са11 §£ССШ§Н60

Ш£а(£§са 1саасШ£§ а£са1с1§а1 Ш£са(а(1 са£се1Шс са1££1аа11120 с1Шасаа£ ааШ1са11 сШсПаа» 1а1ааасас11а§сП§§§а сааасис1§180 а1сс(аШс ОааПШе са££1£а(£й 1§ёс1§иа1 §а§саПН§ 1§Ш§а1§1240 йсШсйс 1са11ас§§1111а11§§§а 1с1аас1а(( (аса(§а§сс300

1сс§с§с§и 1§с1§аа£ёс д^дааасдас аа(с1§а1сс сса1саа§с1 (§а£С1са££360 аШа§са§с аПсса^аИ §§§(1саа(с аасаа£§1ас §а§сса(а(с асШаИса420 ааПдцДак §ссаааасса ауааддаас! ссса(сс1са аа§^Ш§1а аддаадааи480 с(сад1ссаа а§сс1сааса аий1сайди1 аса§а§1с1с сааассаПа цссаааадсг540 аса£§а§а1с аа1§аа§аа1 сисаа!саа а§1ааас!ас 1§Псса§са са1дса!са1600 ££1са£1аа§ К1са§аааа а§аса!ссас сдаа^асПа аа§11а§1§§ дсагсШ^а660 аа§1аа1с(( §1сааса1с§ а§са§с(§§с I(§1£&£§ас са§асааааа ац£аа(§£1§720 са§ааН§Н а££с§сасс( ассаааа^са 1с1(1§ссп (аПцсааао а1ааа§са§а780

Псс1с1а£1 асаа.£1§§£§ аасаааа1аа сд1§даааад; а£с1§1сс1§ аса§сссас!840 сас1аа1§с§ 1а1г.асдаас §са§1§ас§а ссасаааада а(1ссс1с(а 1а1аа§аа§§900 саИсаИсс саШ£аа£& аЬса!са§а1 ас1саассаа 1сс11с1а§а а§а1с1аа§с960

Пагс£а1аа §с11§а1§1а аи§§а§§аа §а!сааааи 11саа(сссс аНс11с§а11020

1§с11саа0 ^аа^ШсСс с§а1££с§са а£11а£сада а1с1§саа1§ §1§£с§са§аа1080 ссса(с(сП а1с1ссаа(с 1с1сдааа1с са§1саас§с ааа(с(ссс! кИсддШс1140

1с1§аа§ас£ са£са£са1с сас§а§сПа 1сс§аШс§ 1сй1сй1йДй ^аИдаа^аа1200

- 16 011923

8^а8¹§ё£^а1ё ас§ПааПё £сгс1§а§с11сс§1сс1сП аа§§1са1§1 сМс1§Шс сас§§с§1£с а(сспсас§ §1дсааусад ссдксацса ас1§с1с§(а а§1сс1с1§§ 1сШс(££а асс;Дссд1а пссазОДа саац1с1а(с (сссасад§1 ссИса^О 1£ёа§£1с1с §с1а§с§§1§ ааассс£(а( сассд£1с(( аа§а(§1(а1

1260

1320

1380

1440 саасас(§£1 ааадс1а(.£с аа§с1а1§££ 1§сса§аа1с с§1аа^аа§ £1£а1ас11§ §а!саИ£а1 ££(£П££(а ас^ёЬ§§ас1 ссН£с1сс1 §а§£С1сс1с (с£аШс£§ (аасдс)цса асОДОДсс §Ш§ас(а1 ££§1с11§П ££(£Шасд аШс§а!а§

1500

1560

1620 сасШсаИ §ё^;ас§сП с(с1сас1аа £с§1ссаа(£ 1§аасссас1

1с£С£ааа(£ ££1£1&са§£ 1§аа§1с1^а а§ас§§1§а( с£1с11сса§ Пасс11§с§

1680

1740 [ддассааац ас1ссаас£с саа1сасс1а са§£§1асс1 а1§§с11сс§ с1саад(даа

1800 §1сс§с1£И с(£С((£С1§ £1с1саасас ссеа££Шс ассас(£((а 1с§а§ссаа1

1860 са!§ас1с§1 дассасас1£ аааа£а1£С( 1саа££ИЙ ё§1§с!аасс 11асс§О§а

1920 §ас!§а1§с1 £аС£§1£1£С £1асса(сс£ 1с1(£аа££1 с£1£§1аа£с (сассдцДса а§1§аИ§а1 §11сса£§1£ а1сса1сс(с 1ас1£сшс ссаП££(Г£ с(£сск£с1

1980

2040

1£11сса§£11сс§ас£(са сса1ссОаа аасссаассс §1ас1§§1с1

2100 са(с11§ас1 с1§са§§ааа 1§§§1§сс§а са(с§аа§1£ а!саасссас §1с11£С1£§

1§§а§аа%ас §1&§с1§ас( (£С£(£11С£ исПс1ас( Пдаа£££(£ нас^Исс

2160

2220 а§аа§асс§1 §<:1ссПс1а 11>а1с§асца §1а1ссаай с(сдс1£11§ са£с(£са11

2280 с§с!§аа§§1 §с!асс§Иа 1§аас§§Ш §§аа§аас1с с§1§Иаа§§ ааа§с§асс§

2340 (сК1с1с;с( £1с£сааас£ £1с(саадс! саас§§1§н §а11§с£а1& аа^^а^ас

2400

11с1с1сд1с §1&с£1££1с §1сс1§ас§§ 1аа£££(с(с £1Даас£сП с!§§а§са^с

2460

1§1с£с1асс сасс1сда1с асс§1а(с§с 1а1§адс11с с1с§Иа!§§ §1с1С£Шс

2520 (^аааассс! дПасЦОД аЦОДсШс 1а(£а1с£с( асОДсНсс са§а§пса1

2580 £§аШ£а(£ §с1 §а£С(аа£а1 с§аас1с!сс 1?асас1аад<1 с(£СПда1£ а§с1саа§аа 11ср,а§с1с£ §(асс££а(с с!с1а§с1а§ а§сШс§И с§(а1сагсд

2640

2700 §П1с§асаа с§Ис§1саа §Нсаа1§са 1еаШса11§сдсасаса сса§аа!сс!

2760 ас(£а§Ш§ а£1аПа1§§ саНдд^ааа ас1§11111с М£1асса11 £1ааШас( £1£И1Ша Кс^ОНс §с!а1с§аас 1£1§аа аΙββ ааа1££а1££

2820

2880 а£аа§а£11а а(р,аа1§а1а (§д(сс(1Н £|(саПс1с аааНаагаг ГаШеДП

2940 ис1сНаК £(§( 1даа(((даа а11а(аа§а§ а1а)£сааас аШ1&ШI

3000 §а§1ааааа1 £Ц;к'ааа1с £(§дсс1с(а а!§асс£аа£ 11аа1а(да§ §а§1ааааса

3060 с1(£1а§11§ 1ассаиа1£ сйаисас! а§£саасааа 1а1аШ1са §асс!а§ааа

3120 а§с(£сааа1 §Иас1§аа1 асаа§1а1§1 сс(с((с;1§1 ШадасаИ ШдаасШ

3180 ссШа1«(а аШ1сса§а а1ссП§1са §аИс1аа!с аП§сШа1 аа11а1а§11

3240 а(ас(са(££ а(((§1а£11 £а£1а(£ааа аСатша а1£саШ1а 1£ас(1£сса

3300

- 17 011923

3360 аИ^аи^ас ааса1§са1с аа!с§асс1§ са£ссас1с§ аадсЕЩссцс сас1сщщ(§ £(ч”ссцса1 С£а(с£(§аа §шс1са1с 1аа§ссссса Ш§^ас§1§ аа(»(адаса с§(с£ааа1а аа^аШсс^ ааПадаага аШДОа! 1£сшсдсс Шааа1асд асдда1с§1а а!с11§1с§1( (Шсаааа! §1асШса1 Ша(аа1аа с§с!с§с§§ас а(с(аса!с(( ((дааКуаа ааааа11§§1 ааПасОД 1с11Шс1с са1аП§асс а1са!ас1са 11§<:1§а1сс а^а^аШ ссс§§аса1§ аадссаШа саа11даа(а

3420

3480

3540

3600

3660

1а1сс1аа£1 аааасска) а££Щ1ас$ 1аШсаШ а§§§ас

3706 <210> 7 <211> 23 <212> ΟΝΑ <213> АпШс1а1 Зедиепсе <220>

<223> Рптег <400> 7 а(§са«£§с сШ£1Ш1 §а( 23 <210> 8 <211> 19

ΓΥΝΤΑ <213> АгбНсга! Зедиепсе <22О>

<223> Рптег <400>8 (£1С£Шсс сдссПсад 19 <210> 9 <211> 26 <212> ϋΝΑ <213> ΑΗίΐίτίαΙ Зециепсе <220>

<223> Рптег <400> 9 с£с1§с§§ас а1сгасащ и§аа( 26 <210> 10 <211> 28 <212> ϋΝΑ <213> АгННаа! Зециепсе

- 18 011923 <220>

<223> Рптег <400> 10 а§ПаасН1 ссас(1а1с§ £££сас1§ <210> И <211> 288 <212> ϋΝΑ <213> Аг(Шс1а1 Зециепсе <220>

<223> РСК рго<1ис( <400> 11 а1§саН§£С сШ^ШК £а1§£са1са асШ§§а§с а(с1цаШ1 £са(аИса§ сс1Шсса( ££1ааПсП Пасаа^аа! ШсаИсП 1сНаа§(а( ааасас11а§ с(1§£§асаа ас:(с1£а(с с1аШс11а а((Шцса§ §с§а(§£(££ С1£(1а1£а£ са(т£1£1 К£а|£тс юсисгса иасздии аг^^авч аас1аШас а1§а£сс1сс §с£С£Ш«с 1§аа£§с§§£ ааас§аса

<210>	12
1	*7С1
’ч.^Л 1Х	/ил
<212>	ϋΝΑ
<213>	АгН!\|С1а1 Зедиепсе
<220>

<223> РСК ргодис!

<400> 12 с§с1§с§§ас аичасаШ Ц^ааН^аа ааааааи§§ 1аа11ас1с1 ОсИШс! сса1аи§ас са( са1ас1с а((£С1§а(с са1£1а§аП 1ссс££аса( оаа^ссаШ асааи^аа! аии:с1аа£ (аааасс1са 1а£§1ОЪас ДОШсаИ 1а§££ас1аа аа1£§Ша§ §аПаПас( (1а§с(ааса 1аа§а1аа1а аа(ааа(ааа 1ааа(ааааа 1аааа1££(1 §1а£а1ааа( аа£§ааа1са а(аа!£аа(а 1£а§1£1§а§ (£а1ад§ас§ 2£аа1£££аа асШ1асас (асШаас§ с(аи§аас« а£1а(§а§и 1£Ца(ааас §1аааа1§11 Иа1§1£((а £асаа(££сс 1саа§(§ааа §1^ассс1а11аа1§§а§£а аа1£сааасс ас§а§1с1§а' §§1сас§с1с §аа£ааа!§а §§§саа£§а1 с§ас§саИ£ с£1а§с£асс с1£ШП££ а§а(£ссас£ §с(а §1§а1аасс£ аа1£§аШа а1§а§£К£а 1£а1§а1§§а ^сИНасаа §£ааа1с£ас ааа^§сс1а§ аас1§аасаа §аа§а£1§с1 саааса1§1с1 саа§а§£М11с§£с1са1а а^сссссаас 11а(£а(££а аа§сса§асс ссас1£а£111£аа§аа(£§ с1саас§§са 1§§ааааа11 §11с§а1^сс

120

180

240

288

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

- 19 011923 ассса§(§сс ссца[аа£1о §ааа§Иаас I751 <210>13 <211>664 <212> ϋΝΑ <213> АгННс1а1 Зедиепсе <220>

<223> РСК ргоОис!

<400> 13 иааШП£ са£§с§а1§£ 1§§с1§Па( £а§саШ1£ 1§Ш§а1§1 НсГсГсНс

1саиас§£1111аи§§§а 1с1§£§1ё§с 1с1аас(а111аса1§а§сс 1сс§с§С£Н (§с1£,аа£ос £§£ааас§ас аа(с(^а(сс сса(саа£с( 1§а§с1са§£ аШа§еа£С аИсса^аИ £§£Исаа1с аасаа§§1ас £а§сса(а1с асШаНса ааП££1а1с §ссаааасса ауаа^аас! ссса1сс(са аа££111£1а а££аа§аа11 с1са£(ссаа а§сс1сааса а§§1са§£§1 аса§а£(с(с сааассаИа £ссаааа£С1 аса^а^аСс

120

180

240

300

360 аа(£аа£аа( сПсаа1саа а£1ааас1ас 1§Псса§са са1§са1са( §£1са§1аа£

420

Шса§аааа адасаГссас с§аа§асиа аа£На£1££ £са1сШ£а аа§1аа1сН £1сааса1с£ а§са§с1§§с, са§асааааа а£§аа1£§1§ са£аа11£11 а§£С£сасс( ассаааа§са (сий^ссн йа11£сааа£ а1ааа§са§а 11сс1с1а§1

480

540

600 асаа§1§£§£ аасаааа(аа с£1§§аааа§ адс1§1сс(£ аса^сссас! сас(аа1£с§

660

1а1ё <210>

<211>

<212>

ϋΝΑ <213>

АгШкаа! Зедиепсе

664 <220>

<223>

Рптег <400>

£С1с1цасае аасе§§1ааа 1§саи§£сс30 <210>15 <211>30 <212> ΌΝΑ <213> Аг11йс1а1 !&]иепсе <220>

<223> Рптег <400> 15

- 20 011923 цассса1а£( и&аШ1аа £сасдаса1£ <210> 16 <211> 29 <212> ΌΝΑ <213> АгНйаа! Зедиепсе <220>

<223> Рптег <400> 16 дозаНОД с1ааси§с£ сса1с§§а£ <210> 17 <211> 1042 <212> ΠΝΛ <213> Аг611С1а1 Зециепсе <220>

<223> РСК ргос1ис( <220>

<221 >( гш8С_1еа1иге <223> РСК рго<1ис( <400> 17 рс1с1рясяс яяссао^яяя !рся!!ррсс ΗΙοΙΗΝσ я!ррсягсяя сШррярся е>----с»--------со----Ό----ОС”---о-----О------σσ’Ό'

1с1да1т&. са1аПсадс с1Шсса!§ §1ааПс1П 1асаа§ааИ ОсаПсШ с11аа«1а1а аасасИа§с И^одасааа с1Ю1да1сс (аШсОаа 1(Ш£са§£ С£а(§£|р£С (оОаГцадс 1§а(£Шс1 с!сПс1са11ас§§ННа

Ч§ц§а1с1§ Ц£с1с1а ас1а11(аса 1§а§сс1сс§ с§сдШцс1 §аа§§с§£§а аас§асаа(с 1§а!сссса1 саадсИцад с1са§§а111 а§са§са11с са§а0§^ё1 (саа!сааса апр(асдадс са1а1сас11 (аОсаааО ццшсдсса ааассаадаа §§аас1ссса 1сс!сааа§§ Шд1аац«а а§ааПс(са §1ссааа£сс 1саасаа§§1 са£££1аса§ ац!с1ссааа ссаИаусса ааа§с1аса§ §а§а1саа(§ аа§аа1спс аа1сааа£(а аасгас1§(( ссадсаса!^ са1са[££1с а£1аа§Шс ауааааауас а1ссасс§аа £асПааа£| 1а£1§££са1 сШдааад! аа1с11§1са аса!с§а§са £<гсассаоа саааааад^а а1§§1§са§а аП§Иа§§с §сасс!асса ааа^саЮП1§ссШаИ §сааа£а1аа а§са§аОсс 1с(а§1асаа р1ц2ицааса ааа1аас«1д, §аааа§а§с1 §1сс(£аса£ сссас(сас1 аа!§с§1а1§ ас§аас§са§ 1£ас£ассас аааа^ааНс сс1с!а1а1а а§аа££са11 сайсссаи (£аао£а!са 1са§а1ас1§ аассаа1сс! 1с1а§аа&а1 с1аа§с11а1 с§а!аа§сй §а!&1аа111£ §а££аа&а1с ааааПКса а(ссссаПс Пс§а11с§с11сааИ§аа§ 1((с(ссда1 §£С£саа§И а§са§аа1с! §с

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1042

- 21 011923

<210>	18
<211>	23
<212>	ΟΝΑ
<213>	АгНГ1С1а1 Зециепсе
<220>
<223>	Рптег
<400>	18
С££1ааа1£с аНздссШ
<210>	19
<211>	26
<212>	ϋΝΑ
<213>	АпИкаа! Зедиспсе
<220>
<223>	Рптег
<400 >	19
сассса§а!с ссаа1аааас с£(аа(
<210>	20
<211>	28
<212>	ΟΝΑ
<213>	Аг1И1С1а1 $ециепсе
<220>
<223>	Рптег
<400>	20
а£а1ааа(аа §§ааа!са
<210>	21
<211>	23
<212>	ΏΝΑ
<213>	АгНСкла! Бсдиспсс
<220>
<223> Рптег
<400>	21
аса(£Ш£а £сас1с((с( Ιβί

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы, отличающееся тем, что содержит фрагмент

ДНК размером от 630 до 700 п.о., предпочтительно 664 п.о., который может быть амплифицирован из

- 22 011923 геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8 Ер ΙΌ N0: 1, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 2, и/или фрагмент ДНК размером 3500-3900 п.о., предпочтительно 3706 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 3, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 4, и/или фрагмент ДНК размером 270-300 п.о., предпочтительно 288 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 7, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 8, и/или фрагмент ДНК размером 710-790 п.о., предпочтительно 751 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную 8Ер ΙΌ N0: 9, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 10, и/или фрагмент ДНК размером 990-1100 п.о., предпочтительно 1042 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 14, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 16.

2. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы по п.1, отличающееся тем, что фрагмент ДНК размером 3706 п.о. имеет нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 6 или проявляет по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидной последовательностью 8Ер ΙΌ N0: 6.

3. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы по п.1, отличающееся тем, что фрагмент ДНК размером 664 п.о. имеет нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 13 или проявляет по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидной последовательностью 8Ер ΙΌ N0: 13.

4. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы по п.1, отличающееся тем, что фрагмент ДНК размером 288 п.о. имеет нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 11 или проявляет по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидной последовательностью 8Ер ΙΌ N0: 11.

5. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы по п.1, отличающееся тем, что фрагмент ДНК размером 751 п.о. имеет нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 12 или проявляет по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидной последовательностью 8Ер ΙΌ N0: 12.

6. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы по п.1, отличающееся тем, что фрагмент ДНК размером 1042 п.о. имеет нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 17 или проявляет по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидной последовательностью 8Ер ΙΌ N0: 17.

7. Семена растения по одному из пп.1-6.

8. Клетки, ткань или части растения по одному из пп.1-6.

9. Растение или части растения, полученные из семян по п.7.

10. Способ идентификации устойчивого к глифосату растения сахарной свеклы, отличающийся тем, что он включает этап(ы) амплификации фрагмента ДНК размером от 630 до 700 п.о., предпочтительно размером 664 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 1, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 2, и/или амплификации фрагмента ДНК размером 3500-3900 п.о., предпочтительно 3706 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 3, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 4, и/или амплификации фрагмента ДНК размером 270-300 п.о., предпочтительно 288 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 7, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 8, и/или амплификации фрагмента ДНК размером 710-790 п.о., предпочтительно 751 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 9, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 10, и/или амплификации фрагмента ДНК размером 990-1100 п.о., предпочтительно 1042 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 14, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 8Ер ΙΌ N0: 16.

11. Тест-набор для идентификации устойчивого к глифосату трансгенного растения сахарной свек

- 23 011923 лы, его клеток, ткани или частей, отличающийся тем, что он содержит по крайней мере одну пару праймеров, включающую первый праймер и второй праймер для полимеразной цепной реакции, при этом первый праймер узнает последовательность внутри чужеродной ДНК, инкорпорированной в геном растения, а второй праймер узнает последовательность внутри 3'- или 5'-фланкирующих областей ДНК так, что растение является растением по одному из пп.1-6 или п.9.

12. Тест-набор для идентификации устойчивого к глифосату трансгенного растения сахарной свеклы, его клеток, ткани или частей, содержащий по крайней мере одну пару праймеров, включающую первый праймер и второй праймер для полимеразной цепной реакции, при этом первый праймер узнает последовательность внутри чужеродной ДНК, инкорпорированной в геном растения, а второй праймер узнает последовательность внутри 3'- или 5'-фланкирующих областей ДНК, отличающийся тем, что первый праймер имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1, а второй праймер имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2, и/или первый праймер имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7, а второй праймер имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8, и/или первый праймер имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 9, а второй праймер имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 10, и/или первый праймер имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 14, а второй праймер имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 16.

13. Тест-набор по п.11 или 12, отличающийся тем, что первый праймер и второй праймер узнают нуклеотидную последовательность, которая является частью нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 5.