BE1000811A4

BE1000811A4 - Anticorps monoclonaux, peptides et compositions les contenant, destinees au diagnostic et au traitement des infections par le virus hiv.

Info

Publication number: BE1000811A4
Application number: BE8700922A
Authority: BE
Original assignee: Genetic Systems Corp
Priority date: 1986-08-20
Filing date: 1987-08-19
Publication date: 1989-04-11
Also published as: IE60671B1; NO300462B1; FI873553A0; FR2603107A1; IT8721678A0; AU7720187A; NO934897D0; FR2603107B1; FI873553A; ZW15487A1; IT1222518B; GR871298B; OA08652A; DK433087A; YU152587A; NO873495D0; NZ221440A; PL267401A1; DE3727703A1; LU86972A1

Abstract

Anticorps monoclonaux, peptides et compositions utiles pour le traitement des infections par le virus HIV. Les compositions selon la présente invention comprennent une dose thérapeutiquement efficace d'au moins un anticorps monoclonal réagissant avec une ou plusieurs régions neutralisantes de HIV, éventuellement un ou plusieurs peptides bloquants capables d'atténuer le pouvoir infectieux de HIV et/ou des anticorps monoclonaux réagissant avec des épitopes de ces peptides, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Description

Anticorps monoclonaux, peptides et compositions les contenant, destinées au diagnostic et au traitement des infections par le virus HIV
La présente invention se rapporte d'une manière generale au diagnostic, au traitement et à la prevention des infections virales.

Elle concerne plus particulièrement des compositions et des procédés pour la production d'anticorps monoclonaux ainsi que des peptides utiles dans le diagnostic, la neutralisation et la vaccination contre les infections par virus d'immunodeficience humaine HIV (Human Immunodeficiency Virus).

L'agent d'infection responsable du syndrome d'immunodéficience acquis (SIDA) et ses phases prodromiques, le complexe correspondant au SIDA ARC ("AIDS-related complex"), et le syndrome de 1ymphadénopathie (LAS), est un nouveau rétrovirus lymphotrophique. Le virus a été diversement appelé LAV, HTLV-III, ARV, et plus récemment HIV.

Etant donné que le virus HIV atteint des proportions pandémiques, le traitement des individus infectes et la préven- tion de la transmission ä des individus exposés et non infectés est d'un intérêt fondamental. Diverses stratégies thérapeutiques ont vise différentes étapes dans le cycle de vie du virus et sont soulignées par Mitsuya et Broder, 1987, Nature 325 : 773.

Une approche consiste à utiliser des anticorps qui se lient au virus et inhibent la réplication virale, soit en interférant avec l'entree du virus dans des cellules hötes, soit par d'autres mécanismes. Une fois que le ou les constituants du virus susceptibles ou sensibles à l'intervention de l'anticorps sont identifiés, on peut espérer que des titres d'anticorps suffisants pour neutraliser le pouvoir infectieux du virus puissent etre engendres par vaccination ou, alternativement,

par l'administration passive d'immunoglobulines ou d'anticorps monoclonaux de specificite désirée.

On pense que les glycoprotéines formant l'enveloppe de la plupart des retrovirus réagissent avec des molecules récep- trices sur la surface des cellules susceptibles, ce qui permet la détermination du pouvoir infectieux du virus pour certains hôtes. Des anticorps qui se lient aux glycoprotéines peuvent bloquer l'interaction du virus avec les recepteurs cellulaires, en neutralisant le pouvoir d'infection du virus. Voir d'une manière générale, The Molecular Biology of Tumor Viruses. 534 (J. Tooze, éd., 1973) et RNA Tumor Viruses, 226, 236 (R. Weiss et autres, eds., 1982) ces deux documents etant cités ici dans leur totalité ä titre de référence. Voir egalement,
Gonzalez-Scarano et autres, 1982, Virology 120 : 42 (La Crosse Virus) ; Matsuno et Inouye, 1983, Infect.

Immun. 39 : 155 (Neonatal Calf Diarrhea Virus) ; et Mathews et autres. 1982, J. Immuno1., 129 : 2763 (Encephalomyelitis Virus).

La structure générale d'un virus HIV est celle d'un noyau de ribonucléoproteine entouré par une enveloppe contenant des lipides que le virus acquiert au cours d'un bourgeonnement ä partir de la membrane de la cellule hotte infectee. Logées ä l'interieur de l'enveloppe et faisant saillie de celle-ci, on trouve les glycoprotéines codées du virus.

Les glycoprotéines de l'enveloppe du HIV sont initialement synthétisées dans la cellule infectée sous la forme d'une molecule précurseur de 150. 000-160. 000 daltons (gpl50 ou
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gp160), qui est ensuite traitee dans la cellule pour former un fragment N-terminal de 110. 000-120. 000 daltons (gpllO ou gpl20) afin d'engendrer la glycoprotéine externe, et un fragment C-terminal de 41.000-46. 000 daltons (gp 41), qui représente la g1ycoprotéine d'enveloppe transmembranaire.

Pour les raisons données ci-dessus, la glycoprotéine
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gpl10 du virus HIV a été l'objet de recherche importantes en tant que cible potentielle pour interrompre le cycle de vie du virus. On a montre que des sérums d'individus infectes

EMI3.1
par HIV neutralisaient HIV in vitro, et que des anticorps qui se lient ä gpl10 purifié sont presents dans les sérums.

Voir Robert-Guroff et autres, 1985, Nature 316 Weiss et autres, 1985, Nature 316 et Mathews et autres, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U. La molécule gap110 recombinante et purifiée peut stimuler la production des anticorps de sérum neutralisant lorsqu'on l'utilise pour immuniser des animaux, voir Robey et autres, 1986, Proc. Natl.

Acad. Sei. U. autres, 1986, Science 233 et pour immuniser un être humain, voir Zagury et autres, 1986, Nature 326 La liaison de la molécule gp110 au récepteur (T4) CD4 a également été décrite, et des anticorps monoclonaux qui reconnaissent certains épitopes du recepteur CD4 ont été decrits comme bloquant la liaison HIV, la formation syncytiale et le pouvoir infectieux. Voir McDougal et autres, 1986, Science 231 Putney et autres (1986, Science 234 ont découvert des anticorps de sérums neutralisants chez des animaux apres immunisation avec une protéine de fusion recombinante contenant la moitié du carboxyle-terminal de la molecule gpl10 et ont en outre demontré que la glycosylation de la proteine d'enveloppe n'est pas nécessaire pour une réponse d'anticorps neutralisante.

Un vaccin en sous-unité pour le SIDA utilisant la molecule gp110 de HIV ou des parties de celle-ci peut ainsi etre désirable. Des vaccins formant sous-unités constituent une alternative à des vaccins préparés à partir de virus attenues ou inactives. Les vaccins inactivés sont préoccupants etant donné le defaut possible qu pour tuer toutes les particules virales, et peuvent posséder un pouvoir de mutation et retrouver leur capacité à provoquer la maladie. Avec des vaccins de sous-unités, seulement les parties du virus qui contiennent les antigènes ou les épitopes qui sont capables de faire apparaltre des réponses immunitaires, c'est-a-dire des anticorps neutralisants, ADCC, et une réponse de cellule T cytoxique, sont utilisées

pour immuniser l'hOte.

Un avantage majeur des vaccins de sous-unites est que le matériau viral non intéressant est exclus
Des sous-unites virales utilisables dans un vaccin peuvent etre produites par plusieurs procédés. A titre d'exem- ple, la glycoprotéine d'enveloppe peut être exprimée et purifiee ä partir d'un höte bactérien, bien que cette molecule puisse etre deficiente au niveau de la plupart des modifications post-translationnelles (telle que la glycosylation), ou ä partir d'autres procédés. Une telle modification peut être obtenue en utilisant un système d'expression eucaryotique, tel que la levure ou des cellules de mammifbre cultivees.

Des gènes de virus ont été introduits dans des cellules de mammifère en utilisant le virus des vaccins comme vecteur.

Voir par exemple Mackett M. et autres, 1982, Proc. Nat. Acad.
EMI4.1
Sei. USA 79 ; Panicali, 0. et Paoletti, E.,
Nat. Acad. Sci USA 79 : 4927. Un virus de vaccin recombinant peut être construit suivant la méthode de Hu et autres, Nature 320 : 537 (1986) ou Chakrabarti et autres, Nature 320 : 535 (1986), ces deux documents étant donnés ici ä titre de référence. Dans ces systemes, les glycoproteines virales produites par des cellules infectees avec des vaccins recombinants sont glycosylées d'une manière appropriee et peuvent etre transportées jusqu'à 1a surface"de la cellule pour extrusion et isolation ultime.

Une importante phase dans la production d'un vaccin de sous-unite est la purification adequate de la glycoproteine désirée Åa partir du mélange complexe du systeme d'expression.

Plusieurs méthodes peuvent être utilisees pour accomplir la
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purification. Celles-ci comprennent, mais ne sont pas limitées à, l'electrophorese sur gel polyacrylamide preparative, la chromatographie de permeation sur gel et diverses methodes de chromatographie (c'est-a-dire echange d'ions, phase inverse, immunoaffinite, interaction hydrophobe), ainsi que d'autres methodes. La plupart de ces methodes sont utilisées suivant

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diverses combinaisons pour des preparations sensiblement pures (Kleid, O. et autres, 1981, Science 214 Cabradilla, C. et autres, 1986, Biotechnology 4 Dowbenko, D. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82 ces articles étant donnes ici ä titre de reference.

Des methodes qui reduisent le nombre de phases requises pour réaliser la purification maximum d'un viral particulier ä partir d'un melange d'expression complexe, sont necessaires pour fabriquer des vaccins de sous-unites. La séparation efficace des antigènes des composants étrangers pourrait être réalisée en utilisant une chromatographie d'inxnunoaffinite. Cette technique, légalement connue sous l'appellation dans son principe à adsorber sélectivement un antigene sur un support solide sur lequel un anticorps spécifique a ete fixé de façon covalente. L'antigene adsorbe sélectivement est ensuite élué à partir, d'un tel adsorbant ä affinité d'anticorps, en changeant par exemple le pH et/ou la force ionique du tampon.

Des anticorps polyclonaux, obtenus à partir d'animaux immunisés avec l'antigène désiré ou ä partir d'individus naturellement infectés ou contamines (voir par exemple Lasky et autres, supra), ont eté utilisés fréquement comme immunoadsorbants, mais, en généra1, ces réactifs présentant des inconvénients substantiels, tels que (i) les anticorps lies au support insoluble ne sont pas tous spécifiques pour la molecule d'intérêt, ce qui nécessite une purification supelementaire (ii) les rendements de l'antigene desire sont fréquement faibles et (iìi) les affinités pour l'anticorps varient souvent d'une preparation ä l'autre, ce qui exige des modifications dans les processus d'élution.

L'utilisation des anticorps monoclonaux spécifiques pour l'antigene viral desire et destinés à être utilises dans la preparation de vaccin de sous-unites, plutöt que d'anticorps polyclonaux, devrait contourner ces difficultés, Des anticorps monoclonaux murins qui se lient aux

realiserantigènes HIV ont ete décrits. Plusieurs groupes de chercheurs ont décrit des anticorps monoclonaux specifiques pour la proteine de noyau p25 (voir par exemple di Marzo Veronese et autres, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 : 5199 et
Chassagne, J., et autres, 1986, J. Immunol. 136 : 1442). Des anticorps monoclonaux specifiques pour la glycoproteine de membrane gp41 ont également été décrits (voir par exemple di Marzo Veronese et autres, 1985, Science 229 : 1402).

11 demeure qu'il y a une nécessité dans la technique concernée pour des anti corps monoclonaux spécifiques peur des épitopes dans des régions bien definies de la glyco- proteine d'enveloppe importante, gpllO. Des anticorps mono- clonaux qui se lient ä ces régions et provoquent une reduction ou une élimination de la réplication et de la trans- missibilité du virus HIV présenteraient une utilite prophylactique et thérapeutique substantielle. Par ailleurs, les anticorps monoclonaux pourraient également être utilises pour purifier la région désirée de gpl10 ä partir de virus rompus ou brises, ou de systèmes d'expression recombinants pour une utilisation dans les vaccins, par exemple.

En outre, la région contenant l'epitope ou les épitopes reconnus par les anticorps monoclonaux pourrait etre chimiquement synthe- tisee, ce qui permet d'éviter les difficultés inhérentes ä la purification et l'administration des fragments plus gros de la molécule gpl10. La présente invention répond aux besoins ci-dessus ainsi Qu'à d'autres.

La présente invention propose des peptides capables d'imiter ou de mimer immunologiquement des épitopes neutra-
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lisants de proteines HIV, des sondes d'acide codant nuclélquede tels peptides et des anticorps monoclonaux réagissant avec de tels peptides, aussi bien que d'autres peptides interferant avec le pouvoir infectieux de HIV. Ces nouveaux materiaux trouvent une utilite par exemple dans les essais de diagnostic pour la detection des infections par HIV et dans les actions therapeutiques pour le traitement de ou la vaccination contre

de telles infections.

La présente invention a pour objet des nouvelles compositions et des nouveaux procédés pour neutraliser les infections par HIV, c'est-ä-dire pour la prévention ou l'inhibition substantielle de la formation ou de la trans-
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mission cellulaire des infections HIV chez un hotte. Plus particulierement, des peptides imitant une region neutralisan- te du HIV et des anticorps monoclonaux reagissant avec une telle région sont utilises pour diagnostiquer, traiter et vacciner contre les infections HIV.

A cet égard, l'expression "region neutralisante" indique les parties de HIV, particulierement les protéines HIV, contenant des segments d'acides aminés definissant un ou plusieurs epitopes réagissant avec des anticorps qui, soit individuellement ou en combinaison avec d'autres anticorps de la presente invention, sont capables de neutraliser les infections par HIV. Des tests convenables pour la neutralisation sont bien connus et peuvent comprendre la réduction des infections par HIV dans les lignées de cellules T, la reduction d'unités formant des plaques de pseudotypes VSV (HIV) portant les glycoprotéines d'enveloppe de HIV, les essais d'inhibition syncytiale, et les essais de liaison récepteur virion.

Si on le désire, l'activité neutralisante peut etre comparee à la réactivité d'anticorps
EMI7.2
dans les tests immunochimiques tels que l'essai d'immunofluorescence, d'immunoblot de radioimmunoprécipitation.

Suivant un aspect de l'invention, les nouveaux peptides, qui d'une maniere typique possedent moins d'environ 50 acides amines, contiennent cinq ou plus d'acides amines contigus formant des épitopes sensiblement similaires aux épitopes situes sur les regions neutralisantes de gpllO ou p25 de HIV, codées par les régions env et gag respectivement, du génome HIV.

Les régions qui sont d'un intérêt particulier sont celles qui s'étendent depuis environ 301 résidus d'acides aminés jusqu'ä environ 336 de gpl10, et depuis environ 278 jusqu'à environ 319 et depuis environ 315 jusqu'à environ 363 de p25, tous

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provenant de la souche HIV désignée LAV--.. de residus d'acides proviennent de la Banque de Les désignationsDonnées de Los Alamos (Base de données de sequence virus
SIDA. Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division,
Los Alamos, NM 87545).

Les familiers de la technique apprécieront que des régions analogues supplémentaires ("homologues") à partir d'autres isolats HIV peuvent être identifiées sur la base de leur situation à l'interieur des protéines correspondantes ä partir d'isolats divers. En pratique, de tels homologues peuvent etre identifies par référence aux données de séquence LAVBRU,commesuit : (a) Les séquences d'acides aminés d'isolats HIV et de LAVBRU peuvent etre alignées pour obtenir une homologie maximum entre les deux sequences ; (b) Des peptides comprenant des séquences d'acides amines d'isolats HIV correspondant au site des peptides de
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LAV imitent immunologiquement les protéines LAV oHU DrtU peuvent être identifiés.

Les peptides comprenant des séquen- cas d'acides amines d'isolats HIV ainsi identifies imitent ou miment immunologiquement , etc ce d'une manière typique, les protéines correspondantes d'isolat HIV.

Cette méthode peut être appliquée aux souches HIV qui sont encore ä découvrir. Par exemple, lorsque des nouvelles souches de HIV sont identifiees, leurs sequences d'acides aminés de noyau et d'enveloppe peuvent être alignées avec celle de LAVBRU pour obtenir une homologie maximum. Les methodes gräce auxquelles les séquences sont alignees, sont connues de ceux qui sont familiers de la technique. En alignant les sequences, il est désirable de maintenir autant d'homologie que possible entre les residus de cystéine. La séquence d'acides aminés de la nouvelle espece ou souche HIV, qui correspond ä la situation ou au site des peptides specifiquement decrits présentement, peut etre synthétisée et utilisée suivant la presente invention.

Une autre méthode pour determiner les séquences d'une région homologue dans d'autres souches HIV est decrite par
Scharf et autres, Science (1986) 233 : 1076. Elle utilise deux amorces d'oligonucléotides qui se lient ä des sequences conservées ä l'extérieur da 1a région de séquence d'intérêt et contiennent differents sites restrictifs dans chaque amorce. De l'AON ä partir de souches HIV peut alors être amplifié in vitro par la suite, et les oligonucleotides résultants peuvent être clonés en vecteurs pour une analyse de sequence, et incorporés dans un vaccin sous la forme d'une cassette représentant un épitope particulier de la souche HIV.

11 n'est pas nécessaire pour la présente invention que les épitopes contenus ä l'interieur de telles sequences soient réactifs par reaction croisée avec des anticorps pour toutes les souches ou espèces de HIV. Les peptides englobant des épitopes immunologiques qui distinguent une espèce ou un serogroupe d'un autre, trouvent une utilité dans 1'identification des espèces ou sérogroupes particuliers, et peuvent en fait aider à l'identification des individus infectés par une ou plusieurs especes ou serogroupes de HIV.

Ils peuvent également être utiles en combinaison avec d'autres peptides ä partir de soit une région homologue ou une autre région neutralisante, dans des compositions thérapeutiques.
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Les peptides d'intérêt proviennent tres preferablement de la région g110 du virus. Les peptides presentant un intérêt particulier dans cette région sont les peptides codes dans le cadre de lecture ouvert env s'étendant depuis environ la paire de base (bp) 6667 jusqu'à environ 6774 de
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l'isolat LAV., d'autres o HU o,,. Ainsi, diverses regions homologuesisolats HIV comprennent les séquences homologues obtenues ä partir de la Banque de Données de Los Alamos (sauf LAV2), comme énoncé dans le Tableau I.

TABLEAU 1.
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MXB2 <SEP> TCTACAACACCCAACAACAATACAACAAAAACA............... <SEP> ATCCGTATC <SEP>
<tb> CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysArg...............IleArgIle <SEP> 309
<tb> BH <SEP> 102-Serr---------------309 <SEP>
<tb> BH8 <SEP> ------------------------------Lys----------------------- <SEP> 309
<tb> HSB3 <SEP> ------------------------------Lys----------------------- <SEP> 309
<tb> H9M <SEP> ------------------------------Ser----------------------- <SEP> 309
<tb> BRU <SEP> ------------------------------Ser----------------------- <SEP> 314
<tb> MAL <SEP> -----------Gly-------------ArgGly-----------------HisPhe <SEP> 314
<tb> ELI <SEP> ---Als------TyrGly---------Gly-----------------ThrPro--- <SEP> 310
<tb> ARV2 <SEP> ------------------------------Ser-----------------Try--- <SEP> 312
<tb> WMJ2 <SEP> ------------Tyr------Val---ArgSer--------------LeuSer--- <SEP> 306
<tb> RFENV <SEP>

------------------------------Ser-----------------ThrLys <SEP> 322
<tb> Z6 <SEP> ------------TyrLys---------GlySer----------------------- <SEP> 311
<tb> Z3 <SEP> ------------GlySerAspLysLysIle-----------------GlySer--- <SEP> 306
<tb> NY5 <SEP>
<tb> -----CDC42 <SEP> ------------------His------------ValThrLeu..............

<SEP> 320
<tb> LAV2 <SEP> ------------Gly---Lys---Val---Gln-----------------MetLeu <SEP> 302
<tb> HXB2 <SEP> CAGAGA.........GGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATG
<tb> GlnArg.........GlyProGlyArgAlaPheValThrIleGlyLysIleGlyAsnMet <SEP> 326
<tb> BH102 <SEP> ---------------------------------------------------------- <SEP> 326
<tb> BH8 <SEP> ---------------------------------------------------------- <SEP> 326
<tb> HXB3 <SEP> ---------------------------------------------------------- <SEP> 326
<tb> H9M <SEP> ---------------------------------------------------------- <SEP> 326
<tb> BRU <SEP> ---------------------------------------------------------- <SEP> 331
<tb> MAL <SEP> ......----------------Gln---LeuTyr---Thr---IlaVal---AspIle <SEP> 329
<tb> ELI <SEP> ClyLet----------...GlnSerLeuTyrThr---Arg---IleValSerArgSer <SEP> 323
<tb> ARV2 <SEP>

......-------------------------His---Thr---Arg---IleGlyAsp <SEP> 327
<tb> WMJ2 <SEP> ......-------------------------Arg---ArgGlu...---IleGlyIle <SEP> 320
<tb> RFENV <SEP> ......-------------------ValIleTyrAlaThr---Gln---IleGlyAsp <SEP> 337
<tb> Z6 <SEP> GlyLeu------------...GlnAlaLeuTyrThr---Arg---ArgThrLysIleIle <SEP> 327
<tb> Z3 <SEP> ArgIle------------------LysVal---TyrAlaLys---Gly............. <SEP> 319
<tb> NY5 <SEP> GlyPro------------...------thrLeuTyrAlaArgGlu---------AspIle <SEP> 320
<tb> CDC42 <SEP> ...............------------ValTrpTyr---Thr---Glu---LeuGlyAsn <SEP> 335
<tb> LAV2 <SEP> MetSer------------------HisVal---HisSerHisTyrGlnProIle---Lys <SEP> 323
<tb> HXB2 <SEP> ...AGA...CAAGCACATTGT
<tb> ... <SEP> Arg...

<SEP> GlnAlaHisCys <SEP> 331
<tb> SH102------------331
<tb> BH8 <SEP> ----------------------- <SEP> 331
<tb> HXB3------------33t
<tb> H9M <SEP> ----------------------- <SEP> 331
<tb> BRU-------------330
<tb> ---------Arg---Tyr--33 <SEP>
<tb> Ml <SEP> IlelleGly------- <SEP> 330 <SEP>
<tb> ARV2 <SEP> Ile---Lys...-----333
<tb> WJ2 <SEP> Ile----------326
<tb> RFENV <SEP> Ile---Lys...------33
<tb> Z6 <SEP> Cly...---------334 <SEP>
<tb> Z3 <SEP> IleThrGly--------------- <SEP> 326
<tb> NY5 <SEP> ----------------------- <SEP> 325
<tb> CDC42 <SEP> Ile-------------------- <SEP> 341
<tb> LAV2 <SEP> ArgProArg---Mec--330 <SEP>
<tb>

O'autres peptides convenables pour engendrer ou obtenir per"screening"desanticorpsmonoclonaux,

comprennentceux codes dans le cadre de lecture ouvert env depuis environ bp 7246 jusqu'ä environ 7317 de LAVBRU. De tels anticorps et peptides reactifs sont particulibrement utiles dans les tests d'immunisation.

Dans la région g de l'isolat LAV-, les sequences d'acides aminés p25 depuis environ 278 jusqu'ä 319 et depuis 315 jusqu'à 363 sont des régions neutralisantes supplémentaires de HIV. Ceux qui sont familiers de cette technique pourront comprendre que des regions de neutralisation supplementaires de HIV peuvent etre identifiées en se basant sur les enseignements donnés ici ; en particulier, des combinaisons d'anticorps monoclonaux reagissant avec divers epitopes HIV différents presentent une activité de neutralisation.

Le peptide I, également appe1é peptide 29 est codé dans le cadre de lecture ouvert env depuis un nombre de
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dans d'acides et presentera la sequence suivante d'acides amines, où oligopeptides inclus suivante comprendront des des (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-GlyPro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-LysIle-Y' dans chacun Lorsqu'Y aminés d'enviran 308 jusqu'à environ 328.exemple, un ou plusieurs acides aminés à partir de séquences quisontdisposéesàcôtédesrésidusd'acidesaminés308à 328 de la séquence d'enveloppe HIV ou de n'importe quelle partie de ces séquences latérales ou disposées à côté.

A
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titre d'exemple parties de BRU

depuis environ un nombre de residus 301 ä 307 ; et-Y'peut comprendre toute ou des parties de la séquence d'acides aminés d'enveloppe LAV BRU depuis un nombre de residus d'environ 329 ä 336 comme suit :
II (29a)
EMI12.1
Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-IleArg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-ThrIle-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys. Alternativement, des séquences tronquees de peptides selon la présente invention peuvent être préparées.

A cet egard, les séquences suivantes du peptide 29 peuvent être particulièrement utiles :
III (29b)
Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-
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Y' dans laquelle Y et/ou Y', s'ils sont présents, représentent chacun des séquences de jusqu'ä environ vingt résidus d'acides IV (29c) Y-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr- amines.Ile-Gly-Lys-Ile-Y' dans laquelle Y et Y', s'ils sont présents, représentent chacun des séquences de jusqu'a environ vingt residus
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d'acides
Suivant un autre mode de réalisation, des regions homologues de l'isolat ARV-2, d'un interet particulier, sont codees dans le cadre de lecture ouvert env depuis des nombres de residus d'acides aminés d'environ 306 ä environ 323 et présentent d'une manière typique, les séquences d'acides aminés suivantes,

où les oligopeptides inclus dans la sequence d'acides aminés suivante comprennent des epitopes lineaires ä l'intérieur d'une telle sequence :
V (177)
Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-
Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y'

dans laquelle Y et Y', s'ils sont presents, représentent chacun de un jusqu'a environ vingt ou plus de residus d'acides amines. Si Y et/ou Y'sont presents, ils peuvent comprendre un ou plusieurs résidus d'acides amines de sé- quences qui sont disposees ä cöte de résidus d'acides aminés 306 a 323 de la séquence d'enveloppe ARV-2 ou de n'importe quelle partie de ces séquences laterales ou disposees ä cotte.

En particulier, Y peut comprendre toute ou des parties de la séquence d'acides aminés d'enveloppe HIV depuis environ des nombres de residus 299 ä 306 ; Y'peut comprendre toute ou des parties de la séquence d'acides amines d'enveloppe HIV depuis des nombres de résidus 324 à 333.

Alternativement, des séquences tronquées de peptide V peuvent être préparées. A cet égard, les séquences suivantes peuvent etre particulièrement utiles :
VI (177a)
EMI13.1
Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Y' et VII
Y-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-
Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-
Cys-Y' dans lesquelles Y et/ou Y', s'ils sont présents, représentent chacun des séquences de jusqu'à vingt ou plus de residus
EMI13.2
d'acides
Un autre exemple comprend des regions homologues de l'isolat LAV-2, telles que codées dans le cadre de lecture ouvert env depuis environ un nombre de residus d'acides amines 311 il 330. et présentent d'une manière typique la sequence suivante :

VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-
Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y' dans laquelle Y et/ou Y', s'ils sant présents, représentent chacun des séquences de jusqu'a vingt ou plus de résidus d'acides aminés. (Voir article dans Nature 326 : 662 (1987),

qui est donne ici ä titre de référence).

Suivant un autre aspect de la présente invention, des nouvelles lignées cellulaires capables de produire des anticorps monoclonaux et des compositions comprenant de tels
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anticorps sont de reconnaître sélectivement 24 (de 10, ä 10 jusqu'à environ 10 ou plus) des regions neutralisantes contenues dans une séquence prédéterminée de proposées, lesquels anticorps sont capablesglycoproteines d'enveloppe gpllO ou p25, leurs précurseurs de protéine, les protéines de fusion recombinantes bio- logiquement exprimées, et les peptides de synthèse qui contiennent un ou plusieurs épitopes dans la region de sequence prédéterminée de gpllO ou p25.

Les cellules hybrides objet de l'invention presentent un chromosome identifiable dans lequel l'ADN de lignée germinale s'est réarrangé pour coder un anticorps possedant un site de liaison pour un epitope sur gpllO ou p25 commun ä quelques ou tous les isolats cliniques HIV. Ces anticorps monoclonaux peuvent être utilises suivant une grande variéte de manières incluant les diagnostics et la therapie, aussi bien que pour identifier d'autres anticorps réagissant de façon croisee, tels que les anticorps de blocage. Les peptides ou polypeptides contenant l'épitope ou les épitopes avec lesquels ils réagissent peuvent trouver des utilisations séparées comme immunogènes pour les vaccins, ou comme agents therapeutiques.

Peptides de blocage
Suivant un autre mode de realisation de la présente invention, on utilise, pour une utilisation conjointe avec les anticorps monoclonaux de neutralisation ou les peptides precedents, des peptides supplémentaires ou anticorps qui interferent avec la liaison HIV aux récepteurs pour en outre moderer le pouvoir infectieux de HIV. Oe preference. des peptides appelés "peptides bloquants" capables d'inhiber la profilération du virus, aussi bien que des anticorps mono- clonaux spécifiques pour les épitopes contenus dans de tels

peptides bloquants, peuvent être utilisés pour augmenter l'efficacite des traitements contre les infections par HIV.

Les peptides de blocage HIV correspondent d'une maniere typique aux sequences d'acides amines de HIV que l'on estime etre essentielles pour la fixation du virus sur une cellule hote, tel que les residus d'acides amines codés ejiv d'environ 190 ä environ 197 de LAV BRU et d'environ 185 à environ 192 de ARV-2 et HTLV-III (BH-10). Ces peptides comprennent l'octapeptide T (Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr) et ses divers dérivés (voir IX ci-dessous) et les analogues (par
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exemple XI ci-dessous) décrits par Pert et autres (1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 est donnée ici ä titre de référence) situés sur la glycoprotéine d'enveloppe (gp110 ou 120).

Par exemple, les peptides de blocage possedant les sequences suivantes sont d'un intérêt particulier, de préférence avec une acétylation du NH2-terminal et une amidation du COOH-terminal :
IX (173D)
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X (186) Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y' ; XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y' ; XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y' ; XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y' ; XIV (190) Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y' ; XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y' dans lesquelles, pour chaque peptide, Y et Y', s'ils sont présents, comprennent chacun une séquence d'acides aminés de jusqu'à environ 20 acides aminés.

Les epitopes ou déterminants

antigéniques dans ces peptides sont d'une maniere typique définis par au moins environ cinq acides amines contigus, et trouvent une utilisation dans par exemple l'imitation des sites antigenes HIV se produisant naturellement pour produire des anticorps reactifs HIV et des vaccins.

Production des anticorps monoclonaux
La preparation des anticorps monoclonaux peut être réalisée en immortalisant l'expression des séquences d'acides nucléiques qui codent des anticorps spécifiques pour HIV, en introduisant de telles séquences, typiquement ADNc codant pour l'anticorps, dans un höte capable d'être cultivé dans une culture. La lignée cellulaire immortalisée peut etre une lignee cellulaire de mammifère qui a été transformée par oncogénèse, par transfection, mutation ou analogues. De telles cellules comprennent les lignées de myelomes, les lignées de lymphomes ou d'autres 1ignées cellulaires capables de supporter l'expression et la sécrétion de l'anticorps in vitro.

L'anticorps peut etre une immunoglobuline se produissnt naturellement d'un mammifère, produite par transformation d'un lymphocyte, particulierement d'un splenocyte, au moyen d'un virus ou par fusion du lymphocyte avec une cellule néoplasique, par exemple un myélome, pour produire une lignée cellulaire hybride. D'une maniere typique, le splenocyte sera obtenu ä partir d'un animal immunisé contre le virus HIV ou un fragment de celui-ci contenant un site épitopique.

Les protocoles d'immunisation sont bien connus et peuvent varier considérab1ement pour demeurer cependant efficaces. Voir Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Presse, 2e edition (1986), qui est donné ici ä titre de référence. Un virus rompu ou brisé, des peptides de synthèse, et des protéines de fusion bacterienne qui contiennent des fragments antigeniques de la molécule gpl10 ou p25, peuvent etre utilisés comme immunogènes. De preference, l'immunogène du virus brise, des peptides ou des

proteines recombinantes sera enrichi en proteines ou en ses fragments contenant les épitopes pour lesquels les cellules 8 produisant l'anticorps ou les splenocytes sont desires.

Plus particulièrement, des solutions contenant des extraits ou lysats de virus brisé ou rompu, ou des surnageants de proteines recombinantes biologiquement exprimées ou des vecteurs d'expression rompus ou séparés, peuvent etre enrichis en glycoprotéines, si on le désire, en utilisant des methodes de purification, telles que par exemple, l'électrophorèse sur gel polyacrylamide. La purification d'affinité par lectine est une methode pratique et préférée pour purifier gpl10 et d'autres glycoprotéines, par exemple la purification d'affinité utilisant la lectine de lentille.

L'etendue jusqu'à laquelle les glycoproteines sont purifiées ä partir des solutions pour une utilisation comme immunogenes, peut varier d'une manière importante, c'est-à-dire de moins de50%, habituellement ou au moins de 75% à 95%, d'une manière desirable de 95% ä 99% et, plus désirablement , jusqu'à l'homogénéitéabsolue.

Une fois que les proteines ont été purifiées jusqu'au degré desire, elles peuvent être mises en suspension ou diluees dans un support physiologique approprie pour immuni- sation, ou bien peuvent etre couplees à un adjuvant. Une technique préférée, par exemple, consiste en l'adsorption des proteines et de leurs fragments sur de l'agarose de lectine de lentille ou sur un autre support macromoléculaire pour l'injection. Des quantités immunogènes de préparations antigéniques enrichies en protéines HIV, comprenant la glycoproteine gpl10 et la protéine de noyau p25 ou des fractions antigeniques de celles-ci, sont injectées, generalement ä des concentrations comprises dans l'intervalle l ug ä 20 mg/kg d'höte.

L'administration peut se faire par injection, par exemple intramusculaire, péritonéale, sous-cutande, intraveineuse etc. L'administration peut se faire en une ou plusieurs fois, habituellement suivant des intervalles de

une à quatre semaines. Les animaux immunises sont contröles pour la production de l'anticorps en les antigènes désirés, puis les rates sont enlevées et les lymphocytes B spleniques isoles et combinés avec une lignee cellulaire de myélomes ou transformés.

La transformation ou la fusion peut être réalisée suivant des manieres classiques, la technique de fusion ou combinaison étant décrite dans un grand nombre de brevets, par exemple les brevets américains NO 4 172 124 ;
NO 4 350 683 ; NO 4 363 799 ; NO 4 381 292 ; et NO 4 423 147.

Voir encore, Kennett et autres, Monoclonal Antibodies (1980), et les références citees dans cet article qui sont citées à titre de référence, et voir encore Goding, supra.

Les lignées cellulaires immortalisees peuvent etre clonees et triees, suivant les techniques classiques , et on détecte les anticorps dans les produits surnageants qui sont capables de se lier aux proteines virales HIV désirées de gpl10 ou p25, les protéines de fusion recombinantes ou les peptides de synthèse qui contiennent la region épitopique désirée.

Les lignées de cellules immortalisees appropriées peuvent ensuite etre soumises à une croissance in vitro ou injectées dans la cavité péritonéale d'un hôte approprié pour production d'un fluide ascite, En vertu du fait que l'on dispose de certains anticorps de la présente invention qui sont connus comme étant specifiques pour des epitopes contenus par exemple dans les regions codées par la region génomique
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LAV d'environ 6688 bp ä environ 6750 bp (peptide codant D HU 29), ou d'environ 7246 bp ä environ 7317 (peptide codant 36) (numerotage bp selon Wain-Hobson et autres, Cell 44 : 9 1985, qui est donné ici à titre de référence). les surnageants peuvent être selectionnes en competition avec les anticorps monoclonaux objet de l'invention dans un test de compétition.

Ainsi, des lignees cellulaires d'hybridomes immortalisées supplementaires avec les caractérisques de liaison désirées peuvent être produites facilement à partir d'une variété de sources en fonction de la disponibilite des anticorps

presents specifiques pour l'antigene particulier. Alterna- tivement, ces lignées cellulaires peuvent etre combinees avec d'autres cellules 8 neoplasiques, oü de telles autres cellules 8 peuvent servir comme récipients pour l'ADN du génome codant pour l'anticorps.

Bien que des cellules B néoplasiques de rongeur, particulièrement murin soient préférées, d'autres espèces de mammifères peuvent être utilisees telles que lagomorphe, bovin, ovin, équin, porcin, avien ou analogues. L'immunisa- tion de ces animaux peut etre facilement réalisée et leurs lymphocytes, particulièrement les splénocytes, peuvent être obtenus pour des fusions.

L'anticorps monoclonal sécrété par les lignees cellu- laires hybrides ou transformées peut etre l'un quelconque des classes ou sous-classes d'immunoglobulines, belles que
IgM, IgD, IgA, IgG ., ou IgE. Etant donné que IgG est l'isotype le plus commun utilisé dans les tests de diagnostic, il est souvent préféré. Les anticorps monoclonaux peuvent etre utilises intacts, ou sous la forme de fragments, tels que Fv, Fab, F (ab') , mais habituellement intacts.

Pour atténuer l'antigénicité possible dans un hole humain d'un anticorps monoclonal, dérivé d'un animal autre qu'un etre humain, des anticorps chimériques peuvent être construits, dans lesquels le fragment de liaison à l'antigène d'une molécule d'immunoglobuline (region variable), est relie par une liaison peptidique à au moins une partie d'une autre proteine non reconnue comme étrangère par les humains, telle que la partie évacuée d'une molecule d'immunoglobuline humaine. Ceci peut etre realise en fusionnant ou combinant des exons de régior. svariables d'animal avec des exons de regions constantes gamma ou kapa d'un etre humain.

Diverses techniques sont connues par ceux familiers de la technique, telles que celles décrites dans la demande de brevet international NO 86/01533, et dans les demandes de brevets européens 171496 et 173494, qui sont données ici à titre

de reference.

Utilisation et formulations pharmaceutiques
Les anticorps monoclonaux de cette invention qui
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presentent une activité de neutralisation, tels que ceux qui reagissent avec un site epitopique sur gpllO ou p25 ou qui reagissent avec un peptide de blocage, peuvent également etre incorpores comme constituants d'une composition pharma- ceutique pour attenuer les infections par HIV. La composition doit contenir une quantite prophylactique ou therapeutique d'au moins l'un des anticorps monoclonaux de cette invention avec un support pharmaceutiquement efficace. Le support pharmaceutique doit être constitue par n'importe quel substance compatible, non toxique et convenable pour permettre l'administration des anticorps monoclonaux au malade.

De l'eau stérile, de l'alcool, des produits gras, des cires et des produits solides inertes peuvent etre utilises comme support. Des adjuvants pharmaceutiquement acceptables (agents tampon, agents de dispersion) peuvent également tre incorporés dans la composition pharmaceutique. De telles compositions peuvent contenir un anticorps monoclonal unique de façon ä etre par exemple spécifiques pour des souches de HIV avec des glycoproteines d'enveloppe contenant un site epitopique dans une region codée par 6688 bp-6750 bp.

Alternativement, la composition pharmaceutique peut contenir un ou plusieurs anticorps monoclonaux pour former un "cocktail". Par exemple, un cocktail contenant des anticorps monoclonaux contre les diverses souches de HIV constituerait
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un produit universel avec une activite prophylactique ou therapeutique contre la grande majorite des isolats cliniques de HIV.

Le cocktail peut contenir des anticorps monoclonaux qui se lient ä des protéines ou des glycoprotéines de HIV autres que gpllO ou p25, telles que, par exemple, ä la glycoproteine gp41 ou ä l'integrase/p34 rapport molaire des divers constituants d'anticorps monoclonaux ne differera habituellement pas de plus d'un facteur 10, plus

habituellement de pas plus d'un facteur 5, et sera habi- tuellement compris entre environ 1 : 1-2 pour chacun des autres constituants d'anticorps.

Les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent etre utilises sous la forme de compositions adminis- trees séparément et données en conjonction avec d'autres agents anti-retroviraux, comprenant des peptides de blocage.

L'état actuel du développement des agents anti-rétroviraux, et des agents anti-HIV en particulier, est décrit dans la publication de Mitsuya et autres, Nature 32b : 773-778, 1987, qui est donnée ici à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux, les peptides et les compositions pharmaceutiques de ceux-ci selon la présente invention sont particulièrement utiles pour une administra- tion par voie orale ou parenterale.

Oe préférence, les compositions pharmaceutiques peuvent etre administrees par voie parentérale, c'est-à-dire par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse.

Ainsi, cette invention propose des compositions pour une administration parenterale, qui comprennent une solution de l'anticorps monoclonal, d'un peptide ou d'un cocktail de ceux-ci, dissous dans un support acceptable, de préférence un support aqueux. Une grande variété de supports aqueux peut etre utilise, par exemple l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline 0, 4%, de glycine 0, 3% ou analogues. Ces solutions sont stériles et generalement dépourvues de particules. Ces compositions peuvent être stérilisées par des techniques classiques et bien connues de stérllisation.

Les compositions peuvent contenir des substances auxiliaires pharmaceutiquement acceptables comme exige pour satisfaire approximativement aux conditions physiologiques, tels que les agents tampon et d'ajustage du pH, les agents d'ajustage de la toxicité ou analogues, par exemple l'acetate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de calcium, le lactate de sodium etc. La concentration de

l'anticorps dans ces formulations peut varier d'une manière importante, c'est-ä-dire de moins environ 0, 5%, habituelle-
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ment à ou au moins environ 1% jusqu'à autant que 15 ou 20ait en poids, et la concentration sera choisie essentiellement en fonction des volumes de fluide, des viscosités, etc., de préférence en fonction du mode particulier d'administration choisi.

Ainsi, une composition pharmaceutique typique pour injection intramusculaire pourra etre confectionnée de façon à contenir 1 ml d'eau tamponnée stérile, at 50 mg d'anticorps monoclonal. Une composition typique pour injection intra- veineuse pourrait être confectionnée de façon a contenir
250 ml de solution de Ringer stérile, et 150 mg d'anticorps monoclonal. Des methodes pour preparer des compositions administrables par voie parentérale sont bien connues de ceux qui sont familiers de la technique et sont décrites en plus de détail dans par exemple la publication Remington's Pharma- ceutical Science, 15è Ed. Mack Publishing Company, Easton,
Pennsylvanie (1980), qui est indiquée ici ä titre de reference.

Les anticorps monoclonaux et les peptides de cette invention peuvent être lyophilisés pour le stockage et reconstitues dans un support ou véhicule convenable avant usage.

Cette technique s'est montrée comme efficace avec des globulines immunes classiques et des techniques de reconstitution et de lyophilisation connues dans la technique peuvent etre utilisees. 11 sera apprécié par ceux familiers de la technique que la lyophilisation et la reconstitution peuvent conduire ä divers degres de perte d'activité de l'anticorps (par exemple avec des immunoglobulines classiques, des anticorps IgM tendent ä avoir une plus grande perte d'activité que les anticorps IgG) et que des niveaux ou proportions d'utilisation peuvent necessiter un ajustement pour compensation.

Les compositions contenant les anticorps monoclonaux

de la présente invention, les peptides ou leurs cocktails peuvent ätre administrés pour le traitement thérapeutique et/ou
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prophylactique des infections par HIV. Dans les applications therapeutiques, les compositions sont administrees à un malade déjà infecté avec le HIV, suivant une quantité suffisante pour ou au moins partiellement arreter l'infection et ses complications. Une proportion adequate pour ac- guerircomplir ceci est définie comme étant une"dose therapeutique- ment efficace".

Des quantités efficaces pour cette utilisation dependent de la sévérité de l'infection et de l'état général du Systeme immunitaire propre du malade, mais sont généralement comprises entre environ 1 et environ 200 mg d'anticorps par kilogramme de poids du corps, des doses comprises entre 5 et
25 mg par kilogramme etant plus communément utilisées. On doit garder à l'esprit que les materiaux de cette invention peuvent être généralement utilisés dans des états de maladie serieux, c'est-a-dire dans des situations ou la vie est menacée ou potentiellement menacee. Dans de tels cas, il est possible et peut etre estime desirable par le médecin trai- tant d'administrer ces anticorps suivant des excès sensibles.

Dans les applications prophylactiques, les compositions contenant les presents peptides, anticorps ou leurs cocktails sont administrees à un malade qui n'est pas déjà infecté par le virus HIV, mais qui a peut-etre été récemment exposé ou qui est estime avoir été expose ä un risque d'infection par le virus ou au virus 1ui-même, de façon ä renforcer la resistance du malade à une telle infection potentielle ou de façon ä le vacciner contre le virus. On définit la quantité administrée par une "dose prophylactiquement efficace".

Dans cette utilisation, les quantités precises dependent de nouveau de l'étant de sante du malade et de son état general immunitaire, mais sont généralement comprisesentre 0, 1 mg et 25 mg par kilogramme, tout particulièrement entre 0, 5 mg et 2,5 mg par kilogramme.

Des administrations uniques ou multiples des

compositions peuvent etre realisees avec des doses et un protocole choisis par le médecin traitant. Dans tous les cas, les formulations pharmaceutiques dolvent fournir une quantité de l'anticorps ou des anticorps de cette invention qui sont suffisantes pour traiter efficacement le malade.

En outre, les anticorps monoclonaux de la presente invention peuvent trouver une utilisation en tant que molécu- le support ou véhicule spécifique pour une cible. Un anti- corps peut être lie à une toxine pour former une immunotoxine ou un materiau radioactif ou un médicament pour former un produit pharmaceutique ou radiopharmaceutique. Des procedes pour produire des immunotoxines et des produits radio- pharmaceutiques sont bien connus (voir par exemple, Cancer
Treatment Reports 68 : 317 (1984)).

11 est également possible que des hétéroagregats d'anticorps monoclonaux de la presente invention et d'activa- teurs de cellules T humaines, tels que des anticorps mono- clonaux pour l'antiène CD3 ou le recepteur gamma F sur des cellules T, puissent permettre ä des cellules T humaines ou à des cellules portant Fc-gama (telles que des cellules K ou neutrophiles) de tuer des cellules infectées par HIV via une cytolyse par l'intermédiaire de cellules dependant d'anticorps (antibody dependent cell-mediated cytolysis" : 'ADCC"). De tels heteroagregats peuvent etre assemblés, par exemple, par liaison covalente des anticorps anti-HIV aux anticorps anti-CD3 en utilisant le reactif hetero-bifonctionnel N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate, comme decrit par Karpowsky et autres, J. Exp.

Med. 160 : 1686 (1984), cette publication etant donnée ici ä titre de reference.

Les compositions peptidiques elles-mêmes objet de cette invention peuvent egalement trouver une utilisation therapeu- tique, lorsque l'administration produit la réduction ou l'élimination du virus HIV dans un hôte infecté. Ces composi- tions. telles que le peptide 29, les peptides de blocage et le peptide 126 peuvent être administrées dans des supports

ou véhicules physiologiques appropriés, par voie intra- veineuse, sous-cutanee, intramusculaire, intraperitoneale etc. Divers véhicules comprennent une solution saline tam- ponnee au phosphate, une solution saline, de l'eau, du chlorure de potassium, du lactate de sodium ou analogues.

La concentration des peptides varie largement en fonction de son usage ultime, de l'activite et du mode d'administration.

De préférence, les peptides comportent une amidation du COOH- terminal, une formylation du NH2-terminal ou d'autres derives pharmaceutiquement acceptables. L'addition de peptides blo- quants aux peptides imitant une région du HIV neutralisante et/ou les anticorps specifiquement reactifs de la présente invention procurera une efficacité thérapeutique accrue de manière significative. D'autres agents anti-HIV peuvent également être inclus dans les formulations (autres que les anticorps monoclonaux qui lient les peptides) tels que la 3'-azido-3'-déoxythymidine, la 2', 3'-didéoxycytidine, la 2', 3'-didéoxy-2',3'-didéhydrocytidine , etc.

Utilisation des anticorps monoclonaux dans la purification d'immunoaffinité
Des anticorps monoclonaux spécifiques pour les polypeptides contenant gpllO ou d'autres determinants antigéniques, particulierement les déterminants antigéniques obtenus à partir des protéines de fusion recombinantes biologiquement exprimées ou des lysats ou extraits d'HIV cultive, sont particulièrement avantageux pour une utilisation dans les protocoles de purification.

Generalement les anticorps possèdent des constantes d'association par affinite de l'ordre
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8 12 de à De tels anticorps peuvent entre utilisés pour purifier les protéines recombinantes à partir du milieu de culture du systeme d'expression recombinant si la protéine exprimee est sécrétée ou ä partir des constituants du système d'expression biologique rompu si elle n'est sécrétée. Genera- lement, les anticorps monoclonaux qui sont capables de réagir avec gpl10 ou d'autres déterminants antigeniques sont attachés

ou immobilisés sur un substrat ou support.

La solution conte- nant les déterminants antigeniques HIV est ensuite mise en contact avec l'anticorps immobilise dans des conditions convenables pour la formation de complexes immuns entre l'anticorps et les polypeptides contenant les determinants antigéniques gpllO. Le matériau non lie est séparé des complexes immuns lies, lesquels complexes ou fragments anti- géniques de gpl10 sont ensuite séparés du support.

O'une manière typique, les anticorps monoclonaux sont purifiés bruts à partir d'un fluide ascite ou de surnageants de culture de cellules avant fixation sur un support. De tels processus sont bien connus de ceux familiers de la technique, et peuvent inclure un fractionnement avec des sels neutres ä concentration élevée. D'autres methodes. telles que la chromatographie DEAE, la chromatographie de filtration sur gel, l'électrophorèse sur gel preparatie, ou la chromat- graphie d'affinité protéine A, peuvent également être utilisées pour purifier l'anticorps monoclonal avant son utilisation comme un immunoadsorbant.

Le support sur lequel les anticorps monoclonaux sont immobilisés doit avoir les caracteristiques générales suivantes : (a) interactions faibles avec les protéines en généra1 pour minimiser les liaisons non specifiques, (b) bonnes caracteristiques d'écoulement Qui permettent 1'coule- ment au travers de matériaux de poids moléculaire élevé, (c) possession de groupes chimiques qui peuvent être actives ou modifies pour permettre la liaison chimique de l'anticorps monoclonal, (d) stabilité physique et chimique dans les conditions utilisées pour lier l'anticorps monoclonal et (e) stabilité aux conditions et constituants des tampons exiges pour l'adsorption et 1'elution de l'antigene.

Certains supports communément utilises sont l'agarose, les polystyrenes dérivés. les polysaccharides, les grains de polyacrylamide, la cellulose activee, le verre et analogues. Diverses méthodes chimiques existent pour la fixation des anticorps sur les

supports formant substrats. Voir généralement Cuatrecasas, P.,
Advances in Enzymology 36 : 29 (1972). Les anticorps de la presente invention peuvent etre fixés directement sur le support ou, alternativement, par l'intermediaire d'un bras de liaison ou d'entretoise.

Les conditions générales requises pour l'immobilisation des anticorps monoclonaux sur les supports chromatographiques sont bien connues dans la technique. Voir par exemple
Tijssen, P. 1985, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, cette publication etant donnée ici ä titre de reference. Les processus actuels de couplage dependent légèrement des caracteristiques et du type de l'anticorps à coupler. Les anticorps monoclonaux possedent des caractéristiques qui sont habituellement constantes d'un melange ä l'autre, ce qui permet ä de telles conditions ou caracteristiques d'être' optimisées La fixation se produit typiquement par l'intermediaire de liaisons covalentes.

Une suspension d'extraits ou lysats de virus HIV, le surnageant d'un systeme d'expression biologique cultivé, ou une suspension des cellules rompues ou brisees est ensuite ajoutee ä la matrice de séparation. Le mélange est incubé sous des conditions et pendant un temps suffisant pour que se produise la formation du complexe immun, habituellement pendant au moins 30 minutes, plus habituellement pendant un temps de 2 ä 24 heures. Les complexes immuns contenant des
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polypeptides avec des parties antigeniques de gpllO sont ensuite séparés du melange. D'une manière typique, le mélange est enlevé, par exemple par elution, et les complexes immuns lies sont laves d'une manière exhaustive avec du tampon d'adsorption.

Les complexes immuns peuvent être ensuite flués à partir de la matrice de Separation en utilisant un éluant compatible avec le support particulier qui est utilise, les-
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quels eluants sont bien connus par ceux qui sont familiers de la technique. Egalement, les polypeptides contenant le gpllO ou d'autres fractions antigeniques peuvent etre elimines

sélectivement. Par exemple, les peptides qui contiennent un épitope reconnu par les anticorps peuvent etre utilisés pour entrer en compétition avec le site de liaison de l'anticorps, ce qui constitue une technique d'elution alternative qui peut etre realisee dans des conditions d'elution douces.

Le poly- peptide selectivement adsorbe contenant l'antigene gpllO peut etre elue à partir d'un adsorbant d'affinite d'anticorps en alterant le pH et/ou la force ionique du tampon. Des agents chaotropiques peuvent également trouver une utilisation dans l'élimination de l'antigene lie. La sélection de l'agent chaotropique, sa concentration et d'autres conditions d'élu- tion dependent des caracteristiques de l'interaction anticorps- antigène, mais une fois qu'elles sont déterminées, elles ne doivent pas etre soumises ä des changements habituellement necessaires dans les systèmes de séparation par affinité polyclonale.

Le matériau elue peut exiger un ajustage à un pH physiologique si des tampons de force ionique ou pH faibles ou élevés sont utilises pour séparer les antigenes gpl10 liés de la matrice de Separation. Une dialyse ou une chromatographie de filtration sur gel peuvent également être exigées pour éliminer les sels en excès utilisés dans l'éluant de façon ä permettre la reconstitution de gpl10 ou des polypeptides contenant des fractions antigeniques de gpl10 sur des conformations naissantes.

Les procédés de cette invention procurent, par exemple, du gpl10 sensiblement purifié ou des polypeptides contenant des fragments antigéniques de celui-ci, soit produits naturellement par des cultures de cellules infectées ou par des
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systemes d'expression de bactéries, levures, ou des cellules de mammifere ou d'insectes cultivees. Le recombinantsgpl10 et les fragments ou d'autres protéines purifiées seront d'une maniere typique d'une pureté superieure à 50%, plus usuellement d'au moins 75% et frequemment plus grande que 95 ä 99%. Ces molecules peuvent ensuite trouver un usage

ultérieur dans une grande variete d'applications.

Les proteines de gpl10 HIV, les polypeptides contenant des fragments antigeniques de celles-ci, ou d'autres proteines sensiblement purifiees selon les procédés de la presente invention, peuvent trouver une utilisation dans une grande variété d'applications, comprenant les formulations de sousunites de vaccin SIDA, dans lesquelles l'immunogène comprend une dose efficace de déterminants antigeniques de, par exemple, gp110 ou d'une région neutralisante de gpllO.

D'autres constituants de la formulation peuvent inclure les
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fractions antigeniques des proteines HIV ou des g1ycoprotéines qui stimulent la production d'anticorps (de preference anti- corps neutralisants) dans un hole immunisé, lesquels anticorps sont capables de constituer une protection contre une infection subsequente par HIV.

Utilisationspour diagnostic des anticorps monoclonaux
Les anticorps monoclonaux de la presente invention sont egalement utiles dans des buts de diagnostic. Ils peuvent etre sait marques ou non marques dans ce but. Typiquement, des tests de diagnostic permettent la detection de la forma- tion d'un complexe par l'intermédiaire de la liaison de l'anticorps monoclonal sur un antigène HIV. S'ils sont non marques, les anticorps trouvent l'utilisation par exemple dans les tests d'agglutination. En outre, des anticorps non marqués peuvent être utilisés en combinaison avec d'autres anticorps marqués (seconds anticorps) qui reagissent avec l'anticorps monoclonal, tels que des anticorps spécifiques pour l'immunoglobuline. Alternativement, les anticorps monoclonaux peuvent etre marques directement.

Une grande variété de marqueurs peut etre utilisee, tels que des radionucléides, des agents fluorescents, des enzymes, des substrats d'enzyme, des cofacteurs d'enzyme, des inhibiteurs d'enzyme, des ligands (particulièrement hapten5) etc. Divers types d'immuno-essais sont disponibles, et, ä titre d'exemple, ceux decrits dans
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les brevets americains N s 3 817 827 3 850 752 3 901 654

;3935074 ; 3984533 ; 3996345 ; 4034074 ; et 4 098 876 qui sont donnes ici ä titre de reference.

De manière habituelle, les anticorps monoclonaux et les peptides de la présente invention sont utilisés dans des immuno-essais d'enzyme où, par exemple, les anticorps objet de l'invention, ou les seconds anticorps d'une espèce diffe- rente, sont conjugues ä un enzyme. Lorsqu'un echantillon biologique contenant des antigènes HIV, tels que le serum sanguin humain, la salive, le sperme, les sécrétions vaginales ou une suspension de culture de cellules infectéespar virus, est combiné avec les anticorps, une liaison se produit entre les anticorps et les molecules presentant l'epitope desire.

De telles protéines OU particules virales peuvent ensuite etre séparées des réactifs non liés, et un second anticorps (marqué avec un enzyme) ajouté. Par la suite, la présence du conjugat anticorps-enzyme spécifiquement lié à l'antigene est déterminée. D'autres techniques classiques bien connues des familiers de la technique peuvent légalement être utilisées.

Des kits peuvent également être réalisés pour être utilisés avec les anticorps dans la détection de 1'infection HIV ou pour la presence de l'antigene HIV. Ainsi, les compositions d'anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent etre proposées, habituellement sous forme lyophilisée, soit seules ou conjointement avec des anticorps supplementaires specifiques pour d'autres epitopes de HIV.

Les anticorps, qui peuvent etre conjugués à un marqueur ou non conjugués, sont inclus dans les kits avec des tampons, tels que Tris, phosphate, carbonate etc..., des stabiliseurs, des biocides, des proteines inertes, par exemple de 1'albumine de serum bovin, ou analogues. O'une maniere générale, ces matériaux seront présents suivant une proportion de moins d'environ 5K en poids basée sur la quantité d'anticorps actifs, et seront habituellement présents suivant une quantite totale d'au moins environ 0, 001% en poids basée sur la concentration d'anticorps.

Fréquemment, il est desirable

d'inclure un agent de dilution inerte ou un excipient pour diluer les ingrédients actifs, où l'excipient peut être présent suivant une quantité d'environ 1% Åa 99% en poids de la composition totale. Si un second anticorps capable de se lier ä l'anticorps monoclonal est utilisé, celui-ci sera habituellement présent dans un récipient séparé. Le second anticorps est d'une maniere typique conjugué à un marqueur et formulé d'une maniere analogue aux formulations d'anticorps décrites ci-dessus.

La detection des antigènes p25 ou de gpl10, ou du virus entier, dans des echantillons biologiques variés peut trouver une utilisation dans le diagnostic d'une infection courante par le virus HIV. Les échantillons biologiques peuvent comprendre, mais ne sont pas 1imités à, le sérum sanguin, la salive, le sperme, les échantillons de tissus obtenus par biopsie (cerveau, peau, nodosités lymphatiques, rate, etc..), des surnageants de culture de cellules, des systèmes d'expression bactériens et eucaryotiques rompus ou brises, et analogues. La présence du virus est testée par incubation de l'anticorps monoclonal avec l'échantillon biologique dans des conditions contribuant à la formation
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d'un complexe immun, ce aprbs quoi on détecte la formation du complexe.

Suivant une réalisation, la formation de complexe est détectée par l'utilisation d'un second anticorps capable de se lier a l'anticorps monoclonal qui est typiquement conjugue Åa un marqueur et formulé d'une manière analogue aux formulations d'anticorps décrites ci-dessus. Dans une autre realisation, l'anticorps monoclonal est fixé sur un support ä phase solide qui est ensuite mis en contact avec un echan- tillon biologique. Après une phase d'incubation, l'anticorps monoclonal marqué est ajoute pour detecter l'antigene lie.

Préparation et utilisation des peptides de synthese
La presente invention a pour objet des nouveaux peptides qui, entre autres, imitent immunologiquement des epitopes de protdine codes par le rétrovirus HIV,

particulierement des épitopes codes dans les regions gag ou env du génome viral codant respectivement gpll0 ou p25. pour satisfaire les variations de souche ä souche, parmi les différents isolats, des ajustements pour les substitutions conservatives, et une selection parmi les alternatives si des substitutions non-conservatives sont necessaires, peuvent titre realises.

Ces peptides peuvent être utilises comme des immunogenes, pour inhiber ou éliminer la production d'anti-
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gène HIV in vitro ou in vivo, pour la detection du virus ou des anticorps sur le virus dans un échantillon physiologique.

En fonction de la nature du protocole, les peptides peuvent etre conjugues b un support ou d'autres composes, marqués ou non marqués, liés ä une surface solide, ou analogue.

Suivant un mode de réalisation, des peptides d'interest peuvent dériver de la région gpl10 du virus. La région qui pre- sente un intérêt particulier est celle qui se trouve dans le cadre de lecture ouvert env s'etendant depuis environ la paire de bases 6688 bp jusqu'à environ 6750 bp et depuis environ 7246 bp jusqu'a environ 7317.

Les peptides d'intérêt, comprenant les peptides bloquants, comprennent au moins cinq, parfois six, quelquefois huit. parfois douze, parfois 21, habituellement un peu moins que 50, plus habituellement un peu moins qu'environ 35 et de préférence moins d'environ 25 acides amines compris dans une séquence codee par un retrovirus HIV. O'une manière desirable, le peptide sera aussi petit que possible tout en maintenant encore sensiblement toute l'activiste antivirale ou d'immunoréactivité du peptide plus important. Dans quelques cas, 11 peut etre desirable de reunir deux ou plus d'oligopeptides qui ne se chevauchent pas pour former une structure de peptide unique ou pour les utiliser comme des peptides individuels en même temps, lesquels procurent ensemble ou séparé- ment une sensibilité equivalente au peptide pere.

Le peptide peut etre modifié en introduisant des substitutions conservatives ou non-conservatives dans le

peptide, habituellement moins de 20%, plus habituellement moins de 10% des acides aminés etant échangés. Dans les situations oü des régions sont trouvées comme etant poly- morphiques, il peut etre désirable de faire varier un ou plusieurs acides aminés particuliers pour imiter plus effi- cacement les differents epitopes des différentes souches retrovirale. Dans beaucoup de cas pour obtenir une stabilité chimique, la méthionine peut être remplacée par la norleucine (Nor).

11 convient de comprendre que le peptide utilisé dans la presente invention n'a pas besoin d'etre identique ä une séquence de polypeptides d'HIV particulière, pour autant que le compose soit capable de procurer une compétition immuno- logique avec des proteines d'au moins l'une des souches du rétrovirus HIV. Par consequent, le peptide de l'invention peut etre sujet ä divers changements, tels que des insertions, des suppressions et des substitutions, soit conservatifs ou non-conservatifs, si de tels changements peuvent procurer certains avantages lors de l'utilisation. Par substitutions conservatives, on entend des substitutions dans des groupes tels que gly, ala ; val, ile, leu ; asp, glu ; asn, gln; ser, Ihr ; lys. arg ; phe, tyr ; et nor, met.

Habituellement, la séquence ne diffère de pas plus de 20% par rapport ä la séquence d'au moins une souche d'un rétrovirus HIV sauf oü des acides aminés supplémentaires peuvent être ajoutés sur l'un ou l'autre terminal de façon ä procurer un"bras"par lequel le peptide de cette invention peut etre convenablement immobilisé. Les bras peuvent avoir une longueur qui est habituellement d'au moins 1 acide aminé et peut etre de 50 ou plus d'acides aminés, plus souvent de 1 à 10 acides aminés.

Le peptide dans lequel la séquence d'acides amines est modifiée par la substitution, l'addition ou la suppression des residus d'acides amines, doit retenir sensiblement toute l'activité antivirale ou d'immunoréactivité des peptides non modifies, ce qui peut etre commodement mesure par diverses

techniques de test presentement decrites. La forme isomère d d'un ou plusieurs acides aminés peut etre utilisée, si on 1e desire, pour modifier les propriétés biologiques, telles que l'activité, 1e tau x de rupture etc..

En outre, un, deux ou plusieurs acides aminés peuvent etre ajoutes sur les parties terminales d'un oligopeptide ou d'un peptide pour faciliter la liaison des peptides l'un ä l'autre, pour le couplage ä un support ou un peptide plus grand, pour des raisons qui seront discutées plus loin, pour modifier les propriétés physiques ou chimiques du peptide ou de l'oligopeptide, ou analogues.

Des acides amines tels que la tyrosine, la cystéine, la lysine, l'acide aspartique ou glutamique. ou analogues, peuvent etre introduits sur le C ou N terminal du peptide ou de l'oligopeptide pour procurer une fonctionnalité utile dans la liaison. La cystéine est particulièrement préférée pour faciliter le couplage covalent ä d'autres peptides ou pour former des polymères par oxydation.

En outre, les sequences de peptide ou d'oligopeptide peuvent differer de la séquence naturelle par le fait que la sequence est modifiée par acylation du MH--terminal, par exemple acetylation ou amidation par acide thioglycolique, amidation du carboxy-terminal, par exemple, avec de l'ammoniac ou de la méthylamine, pour procurer une stabi- lite, un pouvoir hydrophobe accru pour la liaison ä un support ou une autre molécule, ou pour la polymérisation.

Ainsi, par exemple, dans les peptides I-VIII et IX-XV decrits ci-dessus, lorsque Y ou Y'sont presents, un mode de realisation préféré existe si Y ou Y'comprend un ou plusieurs residus de cystéine ou une combinaison d'un ou plusieurs residus de cystéine avec des acides amines d'espacement. La glycine constitue un moyen d'espacement ou une entretoise particulièrement préféré. Des peptides préférés pour utilisation dans une polymérisation oxydante sont ceux dans lesquels Y ou Y' représente au moins deux résidus de cystéine.

Si deux

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résidus de cystéine sont presents ä la même extrémité du peptide, une realisation préférée existe lorsque les residus de cystéine sont séparés au moyen d'un ä trois residus d'acides amines d'espacement, de preference la glycine. La présence de residus de cystéine peut permettre la formation
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de dimeres du peptide et/ou augmenter le caractere hydrophobe du peptide résultant ce qui facilite l'immobilisation du peptide dans des systèmes immobilisés de test ou des systemes de phase solide.

Un usage d'un intéret particulier est celui du groupe mercaptan des cysteines ou des acides thioglycoliques utilisés pour les groupes amino terminaux d'acylation ou analogues pour lier deux des peptides ou oligopeptides ou leurs combinaisons par une liaison disulfure ou une liaison plus grande pour former des polymbres qui contiennent un certain nombre d'épitopes. De tels polymères présentent l'avantage d'une reaction immunologique accrue. Si differents peptides sont utilises pour fabriquer le polymère, ils possèdent la possibilite supplémentaire d'induire des anticorps qui immunoreagissent avec plusieurs déterminants antigéniques de
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differents isolats HIV.

Pour obtenir la formation de polymères antigéniques (multimètres synthétiques), on peut utiliser des composés possedant des groupes bis-haloacetyles, des nitroarylhalogénures, ou analogues, lorsque les réactifs sont spécifiques pour les groupes thio. Ainsi, la liaison entre les deux groupes mercapto des differents peptides ou oligopeptides peut être une liaison simple ou un groupe liant d'au moins 2, habituellement d'au moins 4, et pas plus d'environ 16, habituellement pas plus d'environ 14 atomes de carbone.

Le peptide objet de l'invention peut être utilise en etant lie à un support macromoleculaire soluble (par exemple pas moins de 5 kDal). D'une manière commode, 1e support peut etre un poly (acide aminé), soit naturel ou synthétique, visa-vis duquel des anticorps ont peu de chance d'être rencontrés

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dans le serum humain. Des exemples de tels supports sont la poly-L-lysine, l'hémocyanine limpet keyhole, la thyroglobuline, les albumines, telles que l'albumine de sérum bovin, le toxoide du tétanos etc.. Le choix du support est essentiel- lement dependant de l'utilisation ultime de l'antigene, et dépend des commodites et des disponibilités.

Avec de tels produits conjugues, il y aura au moins une molecule d'au moins un peptide de l'invention par macro- molecule, et pas plus qu'environ 1 par 0,5kOal, habituellement pas plus d'environ 1 par 2kDal de la macromolecule. Un ou plusieurs peptides differents peuvent etre liés à la même macromolécule.

La façon de réaliser la liaison est classique, et utilise des réactifs tels que l'acide p-maleimidobenzoique, l'acide p-méthyldithiobenzoique, l'anhydride d'acide maléique, l'anhydride d'acide succinique, le glutaraldehyd etc. La liaison peut se produire sur le N-terminal, le C-terminal ou sur un site intermédiaire entre les extrémités de la molécule.

Le peptide objet de l'invention peut etre dérivé par liaison, peut etre lie tout en etant relie ä un support, ou analogues.

Divers protocoles d'essai connus de ceux qui sont familiers de la technique peuvent être utilises pour détecter la présence de soit les anticorps sur les proteines rétrovirales soit les protéines retrovirale elles-mêmes. 11 y a un intérêt particulier à utiliser le peptide sous la forme du reactif marqué. si le marqueur permet un signal detectable, ou Åa lier le peptide, soit directement ou indirectement sur une surface, si l'anticorps sur le peptide dans l'échantillon devient lie au peptide sur la surface.

La présence d'un anticorps humain lie au peptide peut alors etre détectée en utilisant un anticorps xénogène spécifique pour l'immunoglobuline humaine, normalement ä la fois IgM et IgG humaines, ou une proteine marquée spécifique pour des complexes immuns, par exemple le facteur Rf de la protéine A S. aureus.

A titre d'illustration d'une technique d'essai, on

citera l'utilisation d'un conteneur d'échantillons, par exemple les puits de plaques comportant des micropuits, où le polypeptide objet de l'invention ou les produits conjugues de celui-ci sont adsorbes sur le fond du recipient et/ou les parois soit de façon covalente ou non covalente.

L'echantillon, qui est normalement du sang humain ou du sérum dilué dans un milieu tamponné de manière appropriee, est mis dans le recipient et un temps suffisant est laisse pour la formation du complexe entre le ou les polypeptides et tous les anticorps parents dans l'échantillon. Le sur- nageant est éliminé et le récipient lavé pour enlever les protéines non specifiquement liées. Une protéine de liaison specifique marquée qui se lie spécifiquement au complexe, tel que l'antisérum xenogénique pour l'immunoglobuline humaine, est utilisée pour la détection.

Le peptide peut etre préparé suivant une grande variété de façons. Le peptide, en raison de ses dimensions relativement courtes. peut être synthetise en solution ou sur un support solide suivant les techniques classiques. Divers appareils automatiques de synthèse sont disponibles dans le commerce aujourd'hui et peuvent être utilises avec des protocoles connus. Voir par exemple Stewart et Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2e ed., Pierce Chemical Co., 1984 ; et Tarn et autres, J. Am. Chem. Soc. (1983) 105 : 6442.

Alternativement, la technologie AON hybride peut être utilisée si un gène synthetique peut être préparé en utilisant des brins uniques qui codent pour le polypeptide ou des brins sensiblement complémentaires de celui-ci, si les brins uniques se chevauchent et peuvent etre mis ensemble dans un milieu de recuisson de façon ä permettre l'hybridation. Les brins ou filaments hybrides peuvent être ensuite ligatures pour former le gène complet. et, par le choix de terminaisons appropriees, le gene peut etre inséré dans des vecteurs d'expression, qui sont facilement disponibles aujourd'hui.

Voir par exemple Maniatis et autres, Molecular Cloning,

A Laboratory Manual. CSU. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

Ou bien la région du genome viral codant pour le peptide peut etre clonee par des techniques ADN recombinant classiques et exprimée (voir Maniatis, supra).
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Des des isolats LAVSRU or < u de HIV qui peuvent etre utilisées pour exprimer les peptides, sont les suivantes : LAV BRU TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT
ATC CGT ATC CAG AGG GGA CCA GGG AGA GCA TTT
GTT ACA ATA GGA AAA ATA GGA AAT ATG AGA CAA
GCA CAT TGT
ARV-2 TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT
ATC TAT ATA GGA CCA GGG AGA GLA TTT CAT ACA
ACA GGA AGA ATA ATA GGA GAT ATA AGA AAA GCA
CAT TGT
Des fragments d'une sequence peuvent être utilises pour l'expression de fragments de peptide, des changements de base conservatifs peuvent etre faits, si le ou les codons codent pour le ou les memes acides aminés,

ou bien des chan- gements non-conservatifs dans la séquence codante peuvent être faits, si l'acide amine resultant peut etre un changement conservatif ou non-conservatif dans la sequence d'acides amines, comme cela a été discute précédemment.

La sequence codante peut être étendue soit au
5'ou 3' terminal ou aux deux terminaux pour allonger le peptide, tout en retenant son ou ses sites épitopiques.

L'allongement peut procurer un br'as pour la liaison, par exemple ä un marqueur, tel qu'un enzyme, pour réunir deux ou tous les peptides ensemble dans la même chaine, de façon ä procurer une activité antigénique, des sites de restriction convenables pour le clonage, ou analogues.

La sequence ADN par elle-meme, ses fragments, ou des sequences plus grandes, habituellement d'au moins 15 bases, de préférence d'au moins 18 bases, peuvent etre utilisés comme sondes nucleotidiques pour la détection d'ARN rétroviral

ou d'ADN proviral, ou pour identifier les regions homolo- gues pour le clonage ou la formation de séquence. Oe nombreu- ses techniques sont décrites, telles par exemple la technique
Grunstein-Hogness, la technique Southern, la technique
Northern, dot-blot, leurs perfectionnements, aussi bien que d'autres methodologies, telles que celles décrites dans le brevet américain NO 4 358 535 qui est donné ici ä titre de référence.

Les peptides objet de l'invention, comprenant des peptides de blocage, et leurs analogues trouvent une utilisa- tion en eux-mêmes ou en combinaison dans des vaccins. De manière similaire, des anticorps anti-idiotypes c'est--dire réagissant avec les idiotypes des anticorps de la présente inven- tion et contenant par conséquent des epitopes imitant les regions neutralisantes de HIV, peuvent également etre utili- ses dans des vaccins. Les peptides ou anticorps anti-idiotypes peuvent 8tre formulés d'une manière convenable, généralement à des concentrations dans l'intervalle de 1 yg ä 20 mg/kg d'höte. Des milieux physiologiquement acceptables peuvent etre utilises comme supports, tels que l'eau sterile, une solution saline, une solution saline tamponnée au phosphate ou analogues.

Des adjuvants peuvent etre utilises tels que le gel d'hydroxyde d'aluminium, les substances actives en surface telles que la lysolecithin, les polyols pluroniques, les polyanions, les peptides, les protéines (par exemple toxine du choléra ou diphtérie) et les emulsions d'huile.

Les peptides peuvent également etre incorpores dans des liposomes, ou conjugués à des polysaccharides, des polypeptides ou des polymères pour une utilisation dans une formule de vaccin. L'administration peut se faire par injection, par exemple par voie intramusculaire. péritonéale, sous-cutanee, intraveineuse etc. L'administration d'une dose immunogéniquement efficace peut etre faite en une ou plusieurs fois, habituellement dans un intervalle de une ä quatre semaines. Une"dose immunogéniquement efficace"correspond à

une quantite de vaccin convenable pour obtenir une reponse immunitaire chez un hole, ce qui demontre chez l'hôte une infection accrue.

D'autres caractéristiques et avantages de la presente invention apparaitront mieux dans les expériences qui suivent, et qui décrivent l'invention a titre d'exemple.

Ces exemples ne doivent pas etre considérés comme limitant la présente invention.
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EXEMPLE 1 Production et caractérisation des anticrops monoclonaux
L'exemple I décrit la production de lignées cellulai- res hybrides qui produisent des anti corps monoclonaux spéci- fiques pour les glycoproteines d'enveloppe de HIV. Cette methode implique l'utilisation d'extraits purifiés de lectine de LAvn., fixes ä l'agarose de lectine de lentille comme l'immunogène. Les anticorps monoclonaux produits par la suite par les lignees cellulaires hybrides sont caractérises par leur pouvoir ä précipiter radioimmunitairement et en "immunoblot" gp110 à partir de LAV purifié et comme proteine de fusion recombinante biologiquement exprimee.

Les anticorps monoclonaux qui se lient aux epitopes sur gpllO sont également réactifs dans le test ELISA avec le virus entier rompu, des protéines de fusion et des peptides synthétiques, et réagissent avec le virus entier dans des tests de fluorescence indirecte.

Les protocoles pour la production de lignées de celJules hybrides produisant un anticorps monoclonal et la caractérisation des anticorps sont les suivants.

Du virus LAV purifie Åa partir de cellules CEM infectées (A. T. T. C. NO CRL8904), fut rompu ou brisé dans du Tris 50 mM, pH 7, 4, NaCl 0, 15 M, aprotinine 1%, Nonidet P-40 (R) (NP-40) (octylphénoxypolyéthoxyéthanol) 2%. L'extrait fut clarifie deux fois par centrifugation et ajuste ä 0, 5% NP-40 avec l'addition de trois volumes de tampon de dislocation

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100 NP-40. De la Sepharose de lectine de lentille (Pharmacia, Piscataway, N. J.) fut prelavee dans le tampon de dislocation
100 NP-40 et ensuite équilibrée dans le tampon d'adsorption (Tris 50 mM, pH 7,4, NaC1 0, 15 M, aprotinine 1%, NP-40 0,5%).

L'extrait viral clarifie fut adsorbe avec de la Sepharose lectine de lentille pendant 42 heures Åa 4OC. Le matériau non adsorbé fut éliminé par lavage avec du tampon d'adsorption en excès. L'élution du matériau adsorbé fut réalisée avec de l'alpha methyl mannoside 0, 2 M dans du tampon d'adsorption.

L'eluant fut dialyse contre PBS pour eliminer le sucre et le materiau fut rgadsorbö sur la Sepharose de lectine de lentille.

Le complexe de Sepharose de lectine de lentille- glycoproteine fut utilisé pour immuniser des souris SALB/c par trois injections intrapéritonéales sans adjuvant et donnees séparément sur une période de 2-3 semaines. Des rates furent éliminées des souris immunisées, qui démontraient la présence d'un anticorps circulant sur les glycoprotéines de
HIV par immunoblot, RIP et/ou ELISA.

Les protocoles utilises pour la production de lignées cellulaires étaient généralement ceux de Kohler et Milstein (Nature 256 : 495 (1985)) avec les modifications de Goldstein L. C. et autres (Infect. Immun. 38 : 273 (1982)). Les lymphocytes B spleniques des souris immunisées furent fusionnes avec des cellules de myélome NS-1 utilisant 40% (poids/volume) de polyéthylène glycol.

Apres la fusion, le mélange de cellules fut remis en suspension dans un milieu HAT (milieu RPMI - 1640 supplémenté avec 15% de serum de veau foetal, de l'hypoxanthine l x 10-4M, de l'aminopterine 4 x 10-7M et de la thymidine 1, 6 x 10-5M) pour choisir la croissance des cellules hybrides, et ensuite le mélange fut délivré dans des plateaux de microculture à 96 puits à une concentration de 1 ä 3 x 106 cellules/ml et incubé ä 370C dans une atmosphère humide contenant 6% de Cules cultures furent alimentées par remplacement d'une moitié du surnageant avec du

milieu HAT frais.

Les puits furent observes en utilisant un microscope inversé pour les indications de proliferation de cellules et lorsque les cellules étaient d'une densite suffisante les surnageants furent testés pour l'anticorps anti-LAV.

Les puits contenant des cellules hybrides produisant un anticorps vis-ä-vis de LAV furent identifiés par test
ELISA en mesurant la liaison ä soit le virus rompu entier purifie soit les proteines de fusion biologiquement exprimees.

Des tests ELISA utilisant du virus rompu furent réalisés sur des plaques LAV EIA (Genetic Systems, Seattle, Washington).

Les plaques furent incubées avec des fluides de culture de cellule ä 37 C pendant 45 minutes et ensuite lavées trois fois avec 0, 5% de Tween 20 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS-Tween).

De 1'IgG anti-souris chèvre-peroxydase (dilution
1 : 2. 000 dans PBS-Tween ; Zymed Laboratories, Inc., San
Francisco Sud, Californie) fut ajouté (100 nul par puits), et les plaques furent incubées pendant 45 minutes à 370C et lavees comme ci-dessus. Un substrat (acide citrique 0, 025 M, phosphate de sodium dibasique 0, 05 M, pH 5 contenant 14 mg de o-phénylènediamine et 10 ul de peroxyde d'hydrogène 30% par
50 ml) fut ajouté et les plaques furent incubées pendant 30 minutes à température ambiante dans le noir. La reaction fut arretee avec de l'acide sulfurique 3N, et des reactions colorimétriques furent quantifiées avec un lecteur automatique de microplaques.

Les puits qui donnaient des resultats positifs furent sous-clones par dilution limitee, retestespour la spécificité, puis etendus.

Les anticorps monoclonaux sécrétés par les lignees de cellules hybrides resultantes furent ensuite caractérisés en ce qui concerne la specificite et la reactivite par immunoblot, immunoprécipitation et test ELISA en utilisant du virus LAV rompu, des protéines de fusion LAV recombinantes et des peptides LAV de synthèse. Tous les anticorps furent determines

comme etant de l'isotype IgGl. Des lignées cel1u1aires HIV- gpl10-1, HIV-gpl10-2 et HIV-gpl10-3 ont été déposées au- pres de (l'American Type Culture Collection) avant 1e depot de cette demande et sont référencées sous les NOs ATCC HB 9175, HB 9176 et HB 9177 respectivement.

Les protéines de fusion recombinantes testées pour la réactivité ont précédemment été appelées ENV2, ENV3, ENV4 et ENV5. La protéine ENV2 est exprimée à partir de pENV2 (ATCC NO 53071), qui est une région de LAV de la paire de bases bp 6598 ä bp 7178 (numérotation selon Wain-Hobson et autres Cell 44 : 9 (1985)). ENV3 est exprimée ä partir de pENV3 (ATCC NO 53072) qui comprend la region LAV de bp 7178 ä bp 7698 ; ENV4 est exprimée ä partir de pENV4 (ATCC NO 53073),
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et comprend bp 7698 ä bp 8572 et ENV5 est exprimee à partir de pENV5 (ATCC NI 53074) qui comprend la region LAV bp 5889 à bp 7698.

Assemblage de peptides de synthèse
Les peptides I (29) et VIII (110-2-2) furent assemblés sur une resine de benzhydrylamine (polystyrene/divinylbenzène) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Californie). Le peptide V (177) fut assemblé sur une résine p-butyloxy- carbonyl (Boc)-éthylbenzylcystéine-phénylacétamidométhyl(PAM) polystyrene/divinylbenzène. Des couplages d'anhydride symétriques furent réalisés dans un synthétiseur 430A (Applied Biosystems). De la cystéine fut ajoutée comme un premier residu dans les deux peptides.

Des couplages de dicyclohexylcarbodiimide en présence d'hydroxylbenzotriazole furent utilises pour l'asparagine et la glutamine. Une protection de chaine latérale ou ramifiée à base de benzyle et uns protection d'alpha-amine Boc furent utilisées. D'autres protections de chaine latérale utilisées de maniere habituelle étaient constituées par tryptophane (formyl) Boc, sulfoxyde de methionine Boc, arginine (tosyl) Boc, cystéine (méthylbenzyl) Boc, histidine (tosyl) Boc, lysine (chlorobenzyloxycarbonyl) Boc et tyrosine (bromobenzyl-

oxycarbonyl) Boc.

Lorsque les peptides furent radiomarqués, ce le fut par acetylation du terminal amino avec de l'acideacetique-H et un exces de dicyclohexylecarbodiimide.

La deprotect. ion et le clivage du peptide ä partir de la resine furent effectues par le protocole HP"bas-eleve" Tarn (Tam et autres, supra). L'extraction de la resine fut faite avec de l'acide acétlque 5% et l'extrait fut soumis ä une chromatographie de filtration par gel dans de l'acide
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acetique 5%.

Les peptides de synthèse HIV testés pour la réactivité avec les anticorps monoclonaux comprenaient les peptides 29,36 et 39. Le peptide 29 est codé par la region de génome
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LAVBRU partir de 6688 bp jusqu'a 6750 bp le peptide 36 D HU est codé par la région depuis environ 7246 bp jusqu'a 7317 bp ; et le peptide 39 est code par la région depuis environ 7516 bp jusqu'a 7593 bp. Les peptides 36 et 39 sont décrits en déteil dans le brevet américain NO 4 629 783 qui est donne ici ä titre de référence.

Les peptides de blocage, IX-XV furent assembles essentiellement comme décrit ci-dessus sur une resine de méthyl-benzhydrylamine (polystyrène/divinylbenzene) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Californie). Les couplages d'anhydride symétriques furent réalistes sur un appareil de synthèse 430A (Applied Biosystems). Les couplages de dicyclohexylcarbodiimide en presence d'hydroxylbenzotriazole furent utilises pour l'asparagine. Pour la protection, une protection par Boc alpha-amine et par chaine latérale à base
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de benzyle fut utilisee, tandis que Boc (bromobenzyloxy- carbonyl ) fut utiliscifiquement pour les chaines ramifirées de tyrosine. L'acetylation, si elle est présente, fut réalisée en utilisant de l'anhydride acetique ou de l'acide acetique glacé et du dicyclohexylcarbodiimide.

La deprotection et le clivage du peptide de la resine furent accomplis par le protocole HF "haut"standard (Stewart et autres, voir supra).

L'extraction de la résine fut réalisée avec 50% d'acide acetique, et l'extrait fut ensuite soumis à une chromatographie de filtration sur gel dans 20% d'acide acétique. Comme desire, une chromatographie liquide ä haute performance fut réalisée sur une colonne Vydac C18 (Rainin Instrument Co., Emeryville, CA) en utilisant un acide trifluoacetique 0, 1%, gradient d'acetonitrile.

Immunoblot
La caracterisation par immunoblot fut réalisée sur des surnageants de clone ou un fluide ascite en utilisant du virus LAV purifié et des proteines de fusion recombinantes comme antigènes. Les antigènes furent d'abord séparés par électrophorèse sur gel à gradient polyacrylamide (7-15%) et transférés sur une membrane de nitrocellulose (NCM) par électrophorèse pendant 4 heures à 25 V dans du phosphate de sodium 25 mM (pH 7). Après transfert, le NCM fut bloque pour empêcher les interactions non spécifiques par incubation dans PBS-Tween ou Blotto (5% lait sec non gras dans PBS) pendant une heure ä la temperature ambiante.

Le NCM fut incube avec du surnageant de culture de cellules ou un fluide ascite dilue dans PSS-Tween pendant une heure ä la temperature ambiante et fut rincé avec trois changements de PBS-Tween.

Dans la seconde phase, le NCM fut incubé avec une peroxydase de radis noir IgG anti-souris chevre, diluée dans PBS-Tween pendant une heure ä la température ambiante. Cette incubation fut suivie par un lavage avec PSS-Tween et ensuite une immersion dans une solution de developpement en couleur de peroxydase de radis noir (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californie) pendant 20 minutes. La réaction fut arrêtée par immersion dans de l'eau déionisée. La réactivité de l'anticorps monoclonal fut comparée ä un sérum temoin positif réagissant avec le virus rompu purifié ou une protéine de fusion exprimée.

Les resultats montraient que tous les anticorps se liaient à gpl10 et sa molecule precurseur, gpl50, en utilisant des preparations de virus rompus ou séparés. Les anticorps 110-1

et 110-2 reconnaissaient également la protéine de fusion ENV3, tandis que les anticorps 110-3,110-4, 110-5 et 110-6 formaient un immunocomplexe ENV2.

Immunoprecipitation
Des extraits de virus pour precipitation radioimmune furent préparés ä partir de cellules CEM infectées avec l'isolat LAVgp.. de HIV apte ä une croissance lytique par passage continu. Lorsque les effets cytopathes précoces étaient évidents, les cellules furent transférées dans un
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milieu marquant contenant de la méthionine rs 3 r i (0, puis incubées pendant 24 heures jusqu'ä ce que la plupart des cellules aient été lysees, ce qui relâche le virus dans le surnageant de la culture.

Le virus fut transformé en pilules ou comprimes (une heure ä 100. 000 xg) ä partir du surnageant dépourvu de cellules, et des extraits de détergent furent prepares dans un tampon P-RIPA (solution saline tamponnée
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au phosphate contenant 1% de Triton X-100, 1% de déoxycholate, 0, 1% de SOS et 1% d'aprotinine). Des extraits similaires furent préparés ä partir des surnageants de cellules CEM non infectées.

Les tests d'immunoprecipitation furent realises avec 100 pl d'extrait de virus incubé avec 100 pl de surnageant de culture à partir de lignees cellulaires hybrides pendant une heure sur de la glace. Quatre microlitres d'Ig anti-souris lapin (Zymed Laboratories, So. San Francisco, Californie) furent ajoutés ä chaque échantillon et incubés pendant 30 minutes. Oe l'immunoprécipitine (100 ul ; Bethesda Research Laboratory, Bethesda, Maryland) remise en suspension dans un tampon P-RIPA contenant 1% d'ovalbumine fut ajoutée ä chaque echantillon et incubee pendant 30 minutes supplementaires.

Les complexes lies furent lavés et separes par électrophorèse sur gel polyacrylamide-SOS (15% acrylamide ; gel OATD). A la suite de l'électrophorèse, les gels furent fixés, trempés dans le produit"Enhance" (New England Nuclear, Boston, MA),

seches et exposés ä un film Kodak XR-5. Un serum positif de référence qui immunoprecipitait toutes les protéines virales HIV fut mis en réaction avec des surnageants de cellules CEM faussement infectées et infectées par virus comme témoins negatifs et positifs.

Les résultats ont montré que tous les six anticorps monoclonaux immunoprécipitaient spécifiquement gp110 et gpl50.

Test d'immunoadsorbant lie par enzyme
Pour établir que les épitopes gpll0 étaient reconnus par les anti corps monoclonaux de la présente invention, des surnageants de culture ä partir de lignées cellulaires hybrides ou fluides ascites furent en outre caractérisés par réactivité dans le test ELISA avec des protéines de fusion biologiquement exprimées et des peptides de synthèse.

Les processus étaient les mimes que ceux décrits ci-dessus Åa l'exception que les proteines de fusion ou les peptides de synthèse remplaçaient le virus purifié comme l'antigene adsorbe sur la surface des puits de microtitrage.

Lorsque des peptides furent utilises comme antigène, le protocole de mise sur plaque etait le suivant. Le peptide lyophilise fut dissous dans de la guanidine 6M HC1. Juste avant la mise sur plaque dans des plaques de 96 puits, la solution de guanidine fut diluée dans un tampon de bicarbonate/ carbonate 0. 05 M (pH 9,6) jusqu'a une concentration finale de peptide allant jusqu'a 100 p9/ml. Un volume de 50 ul du peptide dilué fut place dans chaque puits de microtitrage et les plaques furent ensuite incubées toute la nuit ä 4 C.

La solution de peptide en exces fut"secouee", les plaques fermees ou bloquees Blotto, et le processus décrit ci-dessus fut suivi pour le reste du test ELISA. De maniere similaire, une proteine recomblnante fut diluée jusqu' une concentration finale d'environ 2 V9/ml dans un tampon bicarbonate/carbonate
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0, M (pH 9, avant que le meme processus soit suivi.

Les résultats sont donnes dans le Tableau II. Les

anticorps monoclonaux produits par les lignées de cellules HIV-gpl10-1 et HIV-gpl10-2 réagissaient avec ENV3, ENV5, le peptide 36 et le virus disloqué. Les anticorps provenant des 1ignées de cellules HIV-gpllO-3, HIV-gpll0-4, HIV-gpllO-5 et HIV-gpl10-6 réagissaient avec ENV2 et le peptide 29 aussi bien que le virus disloque ou rompu.

TABLEAU II
Test ELISA montrant la reactivite des anticorps monoclonaux avec des protéines recombinantes et des peptides de synthèse
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<tb>
<tb> Proteine <SEP> de <SEP> fusion <SEP> recombinante <SEP> Peptide <SEP> de <SEP> synthèse <SEP> LAV <SEP> CEM
<tb> te- <SEP> té- <SEP>
<tb> ENV2 <SEP> ENV3 <SEP> ENV4 <SEP> ENV5 <SEP> 29 <SEP> 36 <SEP> 39 <SEP> mois <SEP> mon <SEP>
<tb> 110-1 <SEP> 0,077 <SEP> 3,000 <SEP> 0,113 <SEP> 3,000 <SEP> ND <SEP> 2,421 <SEP> 0,054 <SEP> 0,908 <SEP> 0,125
<tb> 110-2 <SEP> -0,003 <SEP> 3,000 <SEP> 0,000 <SEP> 3,000 <SEP> ND <SEP> 2,305 <SEP> -0,005 <SEP> 1,214 <SEP> 0,009
<tb> 110-3 <SEP> 3,000 <SEP> 0,011 <SEP> ND <SEP> ND <SEP> 3,000 <SEP> ND <SEP> 0,017 <SEP> 0,363 <SEP> 0,046
<tb> 110-4 <SEP> 3,000 <SEP> 0,020 <SEP> ND <SEP> ND <SEP> 3,000 <SEP> ND <SEP> 0,016 <SEP> 0,383 <SEP> 0,067
<tb> 110-5 <SEP> 3, <SEP> 000 <SEP> 0,

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Les résultats dans le Tableau II montrent que les anticorps monoclonaux 110-1 et 110-2 reconnaissaient un déterminant antigénique code par une séquence ADN dans la région pENV3, plus particulièrement par la région du génome de HIV définie par une sequence d'acides amines dans le peptide 36.

Autrement dit, les anticorps monoclonaux gpl10-1 et 110-2 se lient ä une région de peptide de gpl10 codee dans 7246 bp ä 7317, comme cela est mis en évidence par la formation de complexes immuns avec le peptide 36 et ENV3. Cette region du génome de HIV a precedemment été identifieecomme conservee, c'est-Åa-dire peu de changement dans la séquence d'ADN dans la region codee par le peptide 36 parmi differents isolats viraux à partir de divers lieux geographiques. Voir Starcich et autres, Cell 46 (1986). Par contraste, les anticorps monoclonaux gpl10-3,-4,-5 se lient ä des peptides de

HIV definis par la region codee par 1e peptide 39 de 6688 pb ä environ 6750 bp.

La région dans gpllO definie par 1e peptide 29 a été identifiee comme contenant plusieurs substi- tutions de nucléotide parmi différents isolats de virus. Les anti corps monoclonaux qui se lient selectivement aux poly- peptides gpllO qui contiennent des epitopes conserves, tels que les anticorps 110-1 et 110-2 peuvent posseder une utilité renforcée dans différentes circonstances, tellesque dans la chromatographie d'affinité etc. Egalement, dans un test
ELISA, 1e peptide 110-2-2 réagissait avec des sérums de l'individu a partir duquel LAV-2 fut isolé.

Test immunofluorescent indirect
Des tests immunofluorescents indirects utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre l'antigène gp110 de HIV furent réalisés sur des cellules vivantes et fixees par l'acétone. Des cadres ou Chassis fixés par acétone, préparés à partir de cellules CEM infectées par LAV furent incubés avec un surnageant de culture dilue ou un fluide ascite pendant une heure à 370C, tandis que des cellules vivantes furent incubées avec un surnageant de culture ou un fluide ascite pendant une heure Åa 4 C avant que les cellules soient placées sur des cadres ou analogues et fixées par l'acétone.

Les deux methodes utilisaient de l'IgG anti-souris marquee à l'isothiocyanate de fluorescéine pour detecter les cellules portant l'antigène gp110 reactif. L'anticorps monoclonal HIV-gp110-1 a donné des resultats positifs en utilisant soit
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des cellules vivantes soit des cellules infectées par LAV fixees par l'acetone.

EXEMPLE 11 Neutralisation du pouvoir infectieux de HIV par des anticorps monoclonaux anti-gpllO
Cet exemple décrit et caractérise la neutralisation du pouvoir infectieux de HIV en utilisant des anticorps monoclonaux qui se lient ä gpl10 et des peptides dans gpllO. Les résultats indiquent que les anticorps monoclonaux GpllO-3,

-4, -5 et -6 possèdent une activité neutralisante, et que gp110-3 et -4 possèdent des niveaux particulièrement élevés d'activité neutralisante.

Test de neutralisation Un test de neutralisation sensible fut développé pour quantifier l'effet des anticorps monoclonaux sur le pouvoir infectieux de HIV. Une lignée cellulaire CD4+ hautement susceptible ou sensible ä l'infection HIV, CEM fut choisie comme cible pour des comparaisons du pouvoir infectieux. Un fluide ascite préparé comme décrit dans l'Exemple I, ou sa fraction IgG purifiee en utilisant une precipitation de sulfate d'ammonium, fut désactivé ä la chaleur ä 560C pendant 30 minutes, puis dilue comme requis dans un milieu RPMI contenant 10% de serum de veau foetal. Une suspension de
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LAVSRU fut moissonnée depuis des cultures d'environ D HU
4 jours de CEM dans une phase de croissance logarithmique, filtrée au travers de filtres de 0, 2 ou 0. 45 micron, mise sous forme d'aliquotes et congelées à -70 C.

Un aliquote fut décongelé, titré pour determiner le TCID50, et des tests subséquents ont été réalisés avec des aliquotes fraichement décongelés, dilué ä 1 : 500 dans un milieu de culture jusqu'a une concentration d'approximativement dix fois la quantité requise pour infecter 50% de cellules CEM dans la culture (10 TCID50).

La suspension de virus fut mélangée avec un volume egal (250 ul) d'une préparation d'anticorps monoclonal selon cinq dilutions depuis 1 : 5 à 1 : 9, 765, 625. Le melange virus/anticorps fut incubé pendant 45 minutes à 37 C et ensuite dupliqué de 1 : 5 à 1 : 9, 765, 625. Le mélange virus/ anticorps fut incube pendant 45 minutes ä 37 C et ensuite des echantillons dupliqués de 200 pI furent utilisés pour inoculer des puits contenant 1 ml d'approximativement 2 x 105 cellules CEM par puits. Les cultures furent incubées à 37 C dans une atmosphère de 5% de C02 humidifiée pendant 14 jours. Les cellules furent récoltées, mises en comprimés, et lysees avec 1% de Triton X-100 dans PBS pendant environ 10 minutes.

La

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quantité de virus (ou d'antigene viral) présente dans les cellules lysees fut quantifiee en utilisant un immunotest enzyme"sandwich"ä capture d'antigène HIV sensible. Le titrage de l'activité neutralisante, s'il y en a, fut déterminé comme la reciproque de la dilution d'anticorps monoclonal qui inhibait la production d'antigène sur plus de 50% de cultures témoin de virus incubées sans anticorps, ou avec un anticorps monoclonal du meme isotype qui avait précédemment
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été montré comme manquant d'activité Le test de capture antigenique HIV decrit ci-dessus utilisait deux anticorps monoclonaux diriges contre des neutralisante.antigènes p25 comme reactifs de capture.

Ces lignées de cellules hybridomes furent produites par les méthodes décrites ci-dessus avec des modifications mineures, y compris en utilisant une protéine de fusion recombinante de gag purifiée comme l'immunogène et caractérisant les anticorps monoclonaux résultante en ce qui concerne la specificite et la réactivité utilisant les protéines de fusion recombinantes précédemment appelées GAG-1, GAG-2 et GAG-3, et le peptide synthèse 141.

La protéine GAG-1 est exprimée ä partir de pGAG-l (ATCC NO 53379), GAG-2 est exprimee ä partir de pGAG-2 (ATCC NO 53111) et GAG-3 est exprimée ä partir de pGAG-3 (ATCC NO 53112).

Le peptide de synthèse 141 est codé par la région de génome
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LAV correspondant aux résidus d'acides aminés 198-242. B HU
BRUDes anticorps monoclonaux produits par des lignées de cellules hybridomes p25-2 et p25-3 ont été trouves comme réagissant avec des protéines de fusion recombinantes GAG-1, GAG-2 et GAG-3 et le monoclonal de p25-3 est également réactif avec le peptide de synthèse 141.

Pour réaliser le test de capture d'antigène, les réactifs de capture furent d'abord adsorbes sur un support solide. Un fluide ascite dérivant des lignées de cellules hybridomes p25-2 et p25-3 fut dilué 1 : 5. 000 dans un tampon Tris 25 mM, pH 8, 5 et 200 jjl furent places dans des puits de plaques à micropuits. Les puits furent fermés de maniere

étanche et incubés pendant environ 16 heures à 4 C. La solution fut éliminée des puits par aspiration avant d'ajouter une solution de blocage de 0. 3% Blotto dans BBS. Le blocage fut réalisé pendant 15 minutes à la temperature ambiante.

La solution de blocage fut aspirée et l'échantillon fut ajoute. Deux cents microlitres de la suspension cellulaire lysée et 5 l de conjugat de détection, préparé comme décrit ci-dessous, furent ajoutes ä chaque puits. Les plaques ou bandes de puits furent incubées pendant 2 heures à 37OC, après quoi la suspension fut aspirée et les puits lavés quatre fois avec du tampon (0, 05% Tween 20 dans PBS). Le produit conjugué de detection fut préparé comme suit. Les anticorps monoclonaux p25-6 et p25-7 furent conjugues avec la peroxydase de radis noir (HRP) suivant un rapport molaire 3 : 1 (Ab : HRP) pendant trois heures en utilisant une methode d'oxydation au périodate (Nakane et autres, J. Histochem.

Cytochem. 22 : 1084 (1974). Les produits conjugues furent dilués 1 : 1500 dans 2, 5% (poids/volume) de lait sec non gras, 0, 01% de thimérosal et 0, 05% d'anti-mousse A dans du citrate de sodium 20 mM. Le restant du test ELISA fut réalisé comme decrit dans l'Exemple I.

Les résultats de l'essai de l'activité neutralisante avec les anticorps gpllO-3,-4,-5 et-6 sont les suivants.

Les titres les plus élevés qui retenaient l'activite neutralisante furent déterminés comme étant : gp110-3 = 15. 625 ; gpllO-4 = 9, 765, 625 ; gpl10-5 = 125 ; et gp110-6 = 625.

Etant donné la variabilité génétique predite de la region définie par le peptide 29, le pouvoir de l'anticorps monoclonal gp110-4 Åa reconnaitre d'autres isolats de HIV fut examiné. Les tests d'immunofluorescence furent realises comme decrit ci-dessus. L'anticorps gpl10-4 détectait un antigene dans des cultures d'au moins 3 à 16 isolats HIV testés.

L'anticorps gp110-4 était capable de neutraliser des virus isolés sur quinze semaines à partir d'un chimpanze

inoculé avec du LAV BRU comme animal temoin dans un essai de vaccin SIOA. L'anticorps monoclonal était capable de neutra- liser les isolats même si l'animal avait des anticorps de sérum qui neutralisaient HIV in vitro, et avait développé une reponse mesurable immunitaire engendree par les cellules, à l'infection HIV. Ceci indique un defaut de mouvement anti- génique in vivo pour l'6pitope reconnu par l'anticorps gpllO-4.

EXEMPLE III
Neutralisation du pouvoir infectieux de HIV par un cocktail d'anticorps monoclonaux anti-gpllO et anti-p25
Cet exemple décrit la neutralisation du pouvoir infec- tieux HIV en utilisant des anticorps monoclonaux qui se lient à gpllO et aux peptides dans gpl10 en combinaison avec des anticorps monoclonaux qui se lient ä p25 et des peptides dans p25, lesquels seuls montrent peu ou pas d'activité neutra- lisante. Lesrésultatsindiquentquel'anticorpsmonoclonal gpllO-2 en combinaison avec soit p25-6 ou p25-7 possède des niveaux particulièrement élevés d'activite neutralisante.

Des lignées de cellules hybridomes p25-6 et p25-7 ont été produites par les méthodes décrites ci-dessus avec des modifications qui comprennent l'utilisation du virus disloqué ou rompu inactivé ou ou une proteine de fusion recombinante de gag purifiée exprimee dans E. Coli, comme immunogène. et caractérisant les anticorps monoclonaux résultants en ce qui concerne la spécificité et la réactivité, utilisant les proteines de fusion recombinantes précédemment appelées GAG-1, GAG-2 et GAG-3 et les peptides de synthèse 15,88, 150, 147 et 148.

Les peptides de synthèse sont codés par la région de génome LAV-p. correspondant aux residus d'acides aminés comme suit : peptide 15, résidus d'acides aminés 329 ä 350 ; peptide 88, résidus d'acides aminés 315 ä 350 ; peptide 150, résidus d'acides amines 318 ä 363 ; peptide 147, résidus d'acides aminés 278 ä 319 ; et peptide 148, residus

d'acides amines 290 à 319. Les anticorps monoclonaux produits par les lignées de cellules hybridomes p25-6 et p25-7 réagis- sent avec la protéine recombinante GAG-3, p25-6 réagit avec les peptides de synthèse 147 et 148, et p25-7 réagit avec les peptides de synthese 15,88, et 150.

Des essais de neutralisation furent réalisés comme decrit ci-dessus, sauf lorsque des Cocktails ont été utilises ; des anticorps monoclonaux d'individus furent d'abord dilués 1 : 5 dans un milieu de culture et ensuite mélangés suivant des rapports égaux pour donner une dilution finale de 1 : 10.

Le restant de l'essai fut realisé comme décrit ci-dessus.

Les anticorps monoclonaux gpllO-2, p25-6 et p25-7 montrent moins de 50% d'activité neutralisante lorsqu'ils sont utilises seuls. Lorsqu'ils sont utilises dans un cocktail qui comprend les anticorps monoclonaux gpllO-2 avec p25-6 ou gpllO-2 avec p25-7 suivant une dilution 1 : 10. il se produit une neutralisation totale. Un cocktail comprenant les anticorps monoclonaux p25-6 en combinaison avec p25-7 a donné
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un taux d'activité neutralisante de 60-90%.

EXEMPLE IV Immunopotentialite du peptide 29 et ses homologues
Le pouvoir du peptide 29 et des peptides homologues, y compris le peptide 177, ä stimuler une réponse immunitaire contre HIV fut d'abord examine dans deux souches de souris.

Les processus pour la preparation des immunogènes de peptide, les protocoles d'immunisation, et pour la caractérisation de la reponse immunitaire engendree sont donnés en detail cidessous.

Le peptide 29 fut préparé pour immunisation par conjugaison avec une thyroglobuline purifiee. La thyroglobuline peut etre dérivée avec du N-succinimidyl-4- (N-maleimido- methyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC) pour conjugaison selon le processus souligne dans le brevet américain NO 4 629 783, colonne 10, lignes 28 à 51. Comme second immunogene, la thyroglobuline fut dérivée avec du glutaraldéhyde comme suit.

De la thyroglobuline porcine, 27 mg, fut dissoute dans 1 ml de bicarbonate de sodium 0,1 M, auquel 8, 3 pI d'une solution de glutaraldéhyde 25% furent ajoutés goutte ä goutte, et le melange fut agite toute la nuit ä la temperature ambiante.

1 ml de tampon de bicarbonate/carbonate de sodium, pH 9, 3, fut ajouté à la solution et ensuite dialyse pendant 8 heures sur 2 litres du meme tampon à 4 C, avec un changement complet du dialysat après 4 heures. Le peptide 29 fut ensuite ajouté ä la thyroglobuline dérivée suivant approximativement un exces molaire de 100, et le melange fut agité toute la nuit ä la température ambiante. Le glutaraldéhyde qui n'avait pas réagi fut bloque avec 200 pl d'une solution de lysine 0, 2 M, lequel mélange fut agité pendant plusieurs heures (ou pendant toute la nuit) à la temperature ambiante. Le conjugat de thyroglobuline-peptide fut ensuite dialysé d'une maniere extensive sur du PBS ä 4OC.

Deux souches de souris (noire C57 et BALB/c) furent inoculées avec des peptides prepares par chaque méthode de conjugaison. Tous les animaux avaient un äge d'environ 2-4 semaines au moment de l'inoculation. Les voies d'inoculation comprennent le bout de la patte, une scarification de la queue, une administration sous-cutanée, intranasale, ou intraperitoneale. L'inoculum consistait de 25 pg de peptide conjugue en suspension dans 0, 5 ml d'adjuvant de Freund complet, avec des inoculations renforcees et répétées aux semaines 2,3 et 5, avec le meme immunogene en suspension dans un adjuvant de Freund incomplet. Des echantillons de sérum de souris individuelles furent recueillis avant immunisation, 4 jours après l'immunisation renforcee a 3 semaines, et 4 jours apres l'inoculation renforcee ä 5 semaines.

Les échantillons de sérum furent analysés pour les anticorps contre les peptides homologues ou le virus entier par "screening" dans le test ELISA. Les sérums présentant une activite d'anticorps pour LAV sont en outre triés pour l'activité de neutralisation, ce apres quoi on analyse les

sérums dans des immunoblots pour l'antigene LAV rompu et des tests de radioimmunoprécipitation avec gpll0 radiomarqué.

Les résultats des immunisations indiquaient que les souris immunisées avec le peptide 29 developpaient des anti corps réactifs avec le peptide 29 et le virus LAV-1 rompu ou brisé dans les tests ELISA. La conjugaison du peptide 29 ä travers du glutaraldéhyde révélait généralement un titre plus élevé d'anticorps pour le peptide 29 dans des souris Balb/c, bien que la conjugaison ä travers de la maléimide faisait mettre au jour avec succes des anticorps anti-peptide 29 dans quelques souris 8alb/c.

Des souris immunisées avec le peptide 177 développaient des anticorps pour le peptide, et une conjugaison du peptide 177 ä travers du glutaraldéhyde était meilleure pour mettre au jour une réponse immunologique. Des souris C57 étaient plus sensibles ä une stimulation immune avec le peptide 177 que les souris Balb/c. Des souris immunisées avec le peptide
110-2-2 de LAV-2 developpaient des anticorps contre 110-2-2 et le virus LAV-2 comme montre par les tests ELISA.

Un peptide 110-2-2 conjugue ä travers du glutaraldéhyde étant immunogenique à la fois dans des souris Balb/c et C57, bien que les titres pour le peptide 110-2-2 soient généralement plus élevés dans les souris Balb/e que C57, tandis que les titres au virus LAV-2 etaient généralement plus élevés dans les souris C57 que dans les souris Balb/c.

Généralement. les echantillons de sérum ä partir de souris immunisees qui (i) presentent des anticorps vis- à-vis du virus entier ; (ii) sont capables de neutraliser HIV, tel que dans les tests décrits dans l'Exemple II ; et (iii) reagissent avec le peptide 29 dans le test ELISA, indiquent de manière cumulative l'efficacite de l'utilisation du peptide 29 dans une formulation de vaccin.

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EXEMPLE V Separation d'un anticorps monoclonal utilisant gallo Les anti de l'antigene gpllO HIV peuvent etre utilises dans des processus de séparation d'immunoaffinite pour purifier sensiblement les proteines recombinantes d'expression bactérienne. Si la proteine exprimée est sécrétée par les bactéries. la proteine peut etre isolde du surnageant de la culture si la protéine n'est pas sécrétée, la rupture des cellules bactériennes peut etre nécessaire.

Le plasmide pENV-5 (ATCC NO code une fraction majeure de l'extrémité carboxyle de gpl10 et une fraction du terminal amino de LAV inséré dans le vecteur d'expression trp. C600 transforme par ce vecteur exprime mais ne sécrète pas la protéine gpl1D.

Des E. Coli C 600 contenant le plasmide pENV-5 sont soumises a la croissance dans un milieu contenant du tryptophane (20 ug/ml) et de l'ampicil1ine pendant toute une nuit a 370C avec aeration. Les cultures de la nuit sont alors inoculées suivant 1 dans un milieu minimal frais contenant de l'ampicilline (100 pg/ml) mais pas de tryptophane. Ces cultures croissent avec aeration pendant 2-3 heures (jusqu'Åa la phase logarithmique précoce) a 37OC. L'inducteur, l'acide 3-B-indole-acrylique (Sigma Chemical Co., Saint-Louis, MO) est ajouté à une concentration finale de 20 Mg/ml ä partir de stocks fraichement obtenus de 20 mg/ml dans 95% d'ethanol. cultures induites sont ensuite soumises ä la croissance à 370C avec une aeration pendant 4 heures puis mises en comprimes et, facultativement, congelees.

Les rendements de proteines provenant de pENV-5 sont typiquement moindres que 1 mg/litre.

Les cellules bactériennes en grains ou pilules sont lyses en utilisant du tampon P-RIPA (PBS contenant 1% de Triton X-100, 1% de desoxycholate, 0, de sulfate de sodium

d'immunoaffinitedodecyl, et 1% d'aprotinine) qui provoquera la lyse des cellules E. - Coli. La suspension peut être soumise à des ondes sonores pour cisailler l'ADN et l'ARN, ce après quoi on effectue une centrifugation pour eliminer les particules.

Une phase de dilution ou de concentration peut être néces- saire pour standardiser la concentration de proteine.

L'anticorps monoclonal HIV-gpl10-1 est précipité initialement ä partir de fluides ascites ou de surnageants de culture de cellules ä la température ambiante ou dans le froid avec des solutions de (NH4)2SO4 ou Na2SO4 tamponnées à pH 7,3 jusqu'à saturation finale de 33 ou 18% respectivement. Les proteines précipitées sont éliminées par centrifugation et redissoutes dans PBS et precipitees une seconde fois avec 33% de (NH4)2SO4 ou 12-15% de Na2SO4. Cette phase peut etre répétée si nécessaire. Le comprimé est de nouveau dissous dans PBS et les sels en exces sont enlevés par filtration sur gel ä travers une matrice de dessalage ou par dialyse exhaustive sur PBS.

L'anticorps monoclonal purifie 110-1 peut ensuite etre couple ä de la Sepharose activee par bromure de cyanogene. La quantite nécessaire de gel est gonflée dans
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une solution de HC1 sur un filtre de verre (l de
10 Mmateriau séché par congelation donne un volume final de gel d'approximativement 3,5 ml) et lavee pendant 15 minutes avec la meme solution, et l'anticorps est ajoute immédiatement apres. En general, la reaction de couplage a lieu plus efficacement dans un intervalle de pH 8-10, mais un pH plus faible peut etre utilisé si nécessaire pour la stabilité de l'anticorps. L'anticorps doit être dissous dans PBS ou un tampon de borate ou bicarbonate/carbonate de force ionique élevée avec du NaCl 150 mM.

La suspension d'anticorps et de
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Sepharose activee est agitee doucement pendant 2-4 heures a la temperature ambiante, ou toute la nuit ä 4QC, et ensuite lavee sur un filtre de verre fritté avec tampon de couplage. Tous les groupes actifs restants sont bloques par traitement

avec de l'éthanolamine 1 M Åa pH 8 pendant 2 heures. Le produit final Sepharose-anticorps est ensuite lav6 alternativement avec des solutions tampons à pH élevé et faible (tampon borate, 0, lM, pH 8, 5. tampon acetate et NaCl 1M, O,lM, pH 4, NaC1 1 M, respectivement) quatre ou cinq fois. Ce lavage élimine les traces de matériaux adsorbés de façon non covalente.

La matrice de séparation d'immunoaffinité finie est stockée en dessous de 8"C en présence d'un agent bactériostatique convenable, tel que azide 0, 01%.
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L'addition de la suspension de protéine exprimée ä la matrice de séparation d'immunoaffinité provoque l'élimination sélective de l'antigene gpllO. On laisse le mélange interagir pendant 2 ä 24 heures, de préférence 12-18 heures, avec oscillation ou agitation lente. Un système ä colonne peut également être utilise dans lequel la matrice d'immunoaffinité est versée sur une colonne, équilibrée et la suspension de
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proteine exprimée ajoutee lentement ä la colonne. Après que la suspension de protélne a été ajoutée, l'écoulement peut etre arrêté pour permettre une formation de complexe immunitaire maximum.

Le matériau non lié est lavé ou enlevé par séparation par un lavage extensif avec un tampon d'adsorption. Un filtre de verre fritte avec du vide peut etre utilisé ou bien on utilise un écoulement au travers de la colonne. Le matériau lie est ensuite élué en utilisant des tampons de pH faible ou élevé (tampon d'acétate, pH 4 ou tampon de borate, pH 8,6) ou bien un agent chaotropique.

* EXEMPLE VI
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d'immunoaffinite
PurificationÅa partir d'un système d'expression de mammifere
Les anticorps monoclonaux de la présente invention trouvent une utilisation dans la purification d'immunoaffinité de gpl10 recombinant exprimé par des cellules de mammifère.

Les cellules de mammifère sont infectées avec des vaccins recombinants (Mackett et autres, J. Virol. 49 : 857 (1984) qui

contiennent des sequences codant au moins la partie de gpllO qui est antigène et met ä jour les anticorps de neutralisa- tion.

Les vaccins recombinants sont construits selon la méthode décrite dans la demande de brevet américain NO 842 984 qui est donnée ici à titre de reference. Brièvement parlant, des sequences codant pour la glycoprotdine d'enveloppe de HIV sont inserees dans un vecteur plasmide (pGS20) en aval d'un element temoin de transcription de vaccin. Ce gène chimérique est flanqué de séquences codant le gene (TK) de la thymidine kinase virale.

Des vecteurs de plasmide chimériques contenant un promoteur de virus de vaccin ligaturé au gène d'enveloppe LAV sont utilises pour transformer la souche E. Coli MC1000.

L'insertion des séquences LAV-env chimériques dans le genome de virus des vaccins fut realisee par recombinaison in vivo, ce qui est rendu possible par le fait que les gènes chimeriques dans les plasmides pv-env5 sont flanqués ou disposes
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ä cOté de sequences de virus de vaccin codant pour le gène TK.

Ce plasmide est ensuite introduit dans des cellules précédemment infectées par un virus de vaccin du type sauvage et on laisse se produlre la recombinaison entre les sequences TK sur le plasmide et les séquences homologues dans le genome viral de vaccin, ce qui assure l'insertion du gène chimerique.

Des cellules de rein du Singe Vert d'Afrique (souche BSC-40, lignée derivee de cellules BSC-1. ATCC NQ CCl26) sont utilisées comme cellule hôte dans le systeme d'expression.

Les cellules BSC-40 confluentes sont infectées suivant un multiple d'infection de 10 par virus de vaccin recombinant. On laisse s'effectuer l'infection pendant 12 heures, auquel moment, les cellules sont récoltées, lavées une fois avec PBS, et recueillies par centrifugation. Les grains cellulaires sont remis en suspension dans un tampon de lyse (1% NP 40, 2, 5% désoxycholate de sodium, NaCl 0, 1 M, M Tris-HCl 0, 01 M, pH 7, 4, EDTA 1 mM), et le lysat est ensuite clarifié

par centrifugation.

Une séparation d'immunoaffinité de la proteine recombinante exprimée est réalisée comme decrit ci-dessus pour le système d'expression bactérien, en utilisant l'anticorps monoclonal gpll0-l. Les protéines produites
EMI61.1
par ce systeme d'expression ressemblent au 9pilla HIV produit naturellement en raison du traitement et de la glycosylation fournis par les cellules de mammifère.

EXEMPLE VII
Inhibition de l'infection par HIV avec des peptides bloquants L'efficacite des peptides bloquants dans l'inhibition de l'infection des cellules de tissus par la souche LAVBRU de HIV fut étudiée en utilisant une modification du protocole pour l'revaluation du peptide T, comme publié par Pert et autres, voir supra. Les tests d'inhibition préférées de HIV
EMI61.2
consistent ä combiner des volumes égaux de peptide bloquant et de cellules CEM (2, 5 x 105) dans un milieu (RPMI, 10% FCS et 2 mg/ml po1ybrène), et à incuber pendant 45 minutes ä 37 C.

Du virus est ensuite ajoute Åa des doses différentes (10, 50, 500 TCID 50) le melange est incube pendant 14 jours ä 370C et ensuite le supernageant testé pour la production d'anti- ger) e du virus (par exemple noyau p25).

Une préincubation des cellules CEM avec les peptides avant l'addition de virus dans les cultures renforce l'effet d'inhibition dans les tests. L'inhibition fut trouvée comme étant dépendante de la dose de virus, et presente une forte activité à des doses moyennes et faibles, mais moins d'effet pour des doses de virus très élevées.

Environ 60% ä 90% d'inhibition de la production d'antigène dans les experiences avec doses de virus faibles, furent obtenus avec du peptide T. Des experiences supplemen- taires avec des peptides X-XV, typiquement Åa COOH-terminal
EMI61.3
amide et NHL-terminal ont donné des resultats 2 acetylé.similaires, tandis que le peptide XI etait particulièrement efficace sur un large intervalle de dose. Les anticorps

neutralisants peuvent etre ajoutés soit pendant la periode de préincubation ou au moment où le virus est ajoute pour produire une inhibition synergique ou additive de la production d'antigene viral.

On comprend de ce qui precede que les anticorps monoclonaux et peptides, comprenant les peptides bloquants, de la presente invention, constituent des méthodes perfec- tionnées pour neutraliser et/ou inhiber les infections par
HIV. Ceci permet Åa des compositions thérapeutiques et prophylactiques d'être plus facilement développées et qui peuvent etre efficaces contre des infections dues pour la plupart, sinon toutes, aux souches HIV. En outre, les nouveaux matériaux de l'invention trouvent des utilisations dans les tests de diagnostic et d'autres processus bien connus.

On donnera ci-après un tableau comportant les ruferences d'un certain nombre de microorganismes qui constituent une partie de la presente invention et qui ont été déposés auprès de l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA.
EMI62.1

Description
<tb> scientifique <SEP> Ref. <SEP> Déposants <SEP> Ref. <SEP> ATCC <SEP> Date <SEP> depart
<tb> Hybridome
<tb> souris
<tb> (balb <SEP> c/NS-1) <SEP> HIV-gp <SEP> 110-1 <SEP> HB <SEP> 9175 <SEP> 15 <SEP> Aoüt <SEP> 1986
<tb> " <SEP> HIV-gp <SEP> 110-2 <SEP> HB <SEP> 9176 <SEP> 15 <SEP> Août <SEP> 1986
<tb> It <SEP> HIV-gp <SEP> 110-3 <SEP> Ha <SEP> 9177 <SEP> 15 <SEP> Août <SEP> 1986
<tb> HIV-gp <SEP> 110-6 <SEP> HS <SEP> 9404 <SEP> 30 <SEP> Avril <SEP> 1987
<tb> " <SEP> HI <SEP> V- <SEP> gp <SEP> 110- <SEP> 4 <SEP> HB <SEP> 9405 <SEP> 30 <SEP> Avril <SEP> 1987
<tb> HIV-gp <SEP> 110-5 <SEP> HB <SEP> 9406 <SEP> 30 <SEP> Avril <SEP> 1987
<tb> HIV-p <SEP> 25-2 <SEP> HS <SEP> 9407 <SEP> 30 <SEP> Avril <SEP> 1987
<tb> HIV-p <SEP> 25-3 <SEP> HB <SEP> 9408 <SEP> 30 <SEP> Avril <SEP> 1987
<tb> n <SEP> HIV-p <SEP> 25-6 <SEP> HB <SEP> 9409 <SEP> 30 <SEP> Avril <SEP> 1987
<tb>

HIV-p <SEP> 25-7 <SEP> HB <SEP> 9410 <SEP> 30 <SEP> Avril <SEP> 1987
<tb>

EMI63.1
On notera que les hybridomes HB 9175, HB 9176 et HB 9177 ont ete testés et trouvés viables le 26 Aoüt 1986.

Les hybridomes restants ont ete testes et trouves viables le 4 Mai 1987.

Bien entendu, la presente invention n'est nullement limitee aux exemples donnes qui doivent être considérés comme clarifiant l'invention mais ne la limitant pas.
EMI63.2

C'est dire que l'invention comprend tous les equi- valents techniques des moyens decrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont effectuees suivant son esprit.

Claims

EMI64.1

R E V E N D I C A T 1 0 N S REVENDICATIONS 1.- Composition à utiliser pour le traitement d'infections par HIV, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose thérapeutiquement efficace d'au moins un anticorps monoclonal spécifiquement réactif avec une ou plusieurs régions neutralisantes de HIV, et un excipient pharmaceutiquement efficace.
2.-Composition suivant La revendication 1, caractérisée en ce que les regions neutralisantes contiennent des épitopes codés par les régions env ou gag du génome de HIV.
3.-Composition suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que les epitopes sont situes sur les protéines gp1l0 ou p25 de HIV.
4.-Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend aussi un ou plusieurs peptides bloquants capables d'atténuer 1e pouvoir infectieux de HIV et/ou anticorps monoclonaux réactifs avec des epitopes de ces peptides.
5.-Composition suivant la revendication 4, caractérisée en ce que les peptides bloquants comprennent au moins environ 5 acides aminés contigus provenant d'une protéine gpllO de HIV.
6.-Composition suivant la revendication 5, caractérisée en ce que les peptides bloquants comprennent des peptides provenant de la séquence d'acides aminés 190 ä 197 de LAVBRU, ou des homologues de cette sequence.
7.-Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'un anticorps monoclonal est réactif avec au moins un épitope de la séquence d'acides amines 278 à 319 de p25 <Desc/Clms Page number 65> de LAVBRU et/ou ses homologues, et un second anticorps monoclonal est réactif avec au moins un épi tope de la séquence d'acides aminés 315 à 363 de p25 de LAVBRU et/ou ses homologues.
8.-Composition suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'un anti- corps monoclonal est réactif avec au moins un épitope de p25 de HIV et un second anticorps monoclonal est réactif avec au moins un épitope de gpl10 de HIV.
9. - Composition suivant la revendication 8, caractérisée en ce que l'epitope de p25 est situé dans la séquence d'acides aminés 278 à 319 ou 315 ä 363 de LAVBRU, ou dans les homologues de ces séquences.
10.-Composition suivant l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisée en ce que l'epitop de gpllO est situé dans les séquences d'acides amines de l'enveloppe 190 ä 197,301 ä 336 ou 308 à 328 de LAVBRTj, ou dans des homologues de ces séquences.
11.-Composition suivant l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, un cocktail d'anticorps monoclonaux réactifs avec ces séquences ou différents homologues de ces séquences.
12.-Composition d'anticorps monoclonaux, caractérisée en ce qu'elle est spécifiquement réactive avec une région neutralisante de HIV.
13.-Composition suivant la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, un anticorps monoclonal réactif avec un peptide bloquant de HIV.
14. - Composition suivant l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que la region neutralisante est située sur gpllO de HIV.
15.-Composition suivant la revendication 14, caractérisée en ce que la région comprend la séquence <Desc/Clms Page number 66> EMI66.1 d'acides 301 a 336 ou 308 de amines d'environgpllO de HIV ou des homologues de ces séquences.
16.-Composition suivant la revendication 14, caractérisée en ce que la région neutralisante et le peptide bloquant sont situés sur gpllO de HIV.
17.-Composition suivant la revendication 16, caractérisée en ce que le peptide bloquant comprend la séquence d'acides aminés d'environ 190 à 197 de gpllO de HIV, ou des homologues de cette séquence.
18.-Composition suivant l'une quelconque des revendications 12 et 13 ; caractérisée en ce que la région neutralisante est située sur p25 de HIV. EMI66.2
19.- en ce qu'elle comprend (a) au moins un anticorps Composition, caractériséeavec une région neutralisante de HIV et, (b) un peptide bloquant contenant au moins environ 5 acides aminés contigus provenant des séquences d'acides amines de gpllO de HIV ci-après, ou de leurs homologues IX (173) Y-Ala-Ser-Tr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y', ou XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y' où Y et Y', au cas où ils sont présents, comprennent chacun une séquence d'acides aminés comptant jusqu'a environ 20 acides amines.
20.-Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend (a) un anticorps monoclonal spécifique pour une région neutralisante de HIV, et (b) un peptide bloquant contenant au moins l'une des séquences d'acides aminés ci-après ou de leurs homologues : <Desc/Clms Page number 67> XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y', ou XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y', ou XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y', ou XIV (190) Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y' où Y et Y', au cas où ils sont présents, comprennent chacun une séquence d'acides aminés comptant jusqu'à environ 20 acides amines.
21.-Composition suivant l'une quelconque des revendications 19 et 20, caractérisée en ce que le peptide bloquant définit au moins un déterminant antigénique capable de faire apparaître des anticorps par immunisation d'un hôte, les anticorps ainsi apparus étant protecteurs contre des infections par HIV.
22.-Composition suivant l'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisée en ce que Y et/ou Y'comprennent un résidu de liaison choisi dans la classe formée essentiellement par la glycine, la tyrosine, la cystéine, la lysine, l'acide glutamique et l'asparagine.
23. - Composition suivant l'une quelconque,. es revendications 19 à 22, caractérisée en ce que le peptide comprend un terminal amino acétylé et/ou un terminal carboxy amidé et/ou un acide aminé d.
24. - Peptide, caractérisé en ce qu'il comprend au moins environ 5 acides aminés contigus provenant de la séquence d'acides aminés de gpllO de HIV ci-après, ou de ses homologues : <Desc/Clms Page number 68> II (29a) Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile- Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr- Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.
25.-Peptide suivant la revendication 24, caractérisé en ce que les acides aminés contigus définissent au moins un déterminant antigénique capable de faire apparaître des anticorps par immunisation d'un hôte, ces anticorps étant protecteurs contre des infections par HIV.
26. - Peptide, caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences d'acides amines de gpllO de HIV ciaprès ou de leurs homologues : 1 (29) EMI68.1 Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-ProGly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y', V (177) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-ArgAla-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Gly-Y', ou VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val- Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y', où Y et Y', au cas où ils sont presents, comprennent chacun une séquence d'acides amines comptant jusqu'a environ 20 acides aminés.
27.-Peptide suivant la revendication 26, caractérisé en ce que Y et/ou Y'comprennent un résidu de liaison choisi dans la classe formée essentiellement par la glycine, la tyrosine, la cystéine, la lysine, l'acide glutamique et l'asparagine. EMI68.2
28. risées en ce qu'elles codent pour les peptides suivant <Desc/Clms Page number 69> EMI69.1 l'une quelconque des revendications 24 à 27.
29.-Composition, en ce qu'elle comprend un segment d'acides nucléiques d'environ 150 nucléotides ou moins codant pour un segment de peptide bloquant de HIV.
30.-Composition suivant la revendication 29, caract6risée en ce que le segment d'acides nucléiques code, en outre, pour un peptide d'une region neutra- lisante de HIV.
31. - Segment d'acides nucléiques d'environ 150 nucléotides ou moins, caractérisé en ce qu'il code pour un peptide d'une région neutralisante de HIV.
32.-Segment d'acides nucléiques suivant la revendication 31, caractérisé en ce qu'il code aussi pour un peptide bloquant de HIV.
33.-Segment d'acides nucléiques suivant l'une quelconque des revendications 31 et 32, caractérisé en ce que le peptide d'une region neutralisante comprend au moins environ 5 acides aminés provenant des acides aminés 310 à 336 de gpllO de LAVBRU, ou des séquences d'acides aminés 278 à 319 ou 315 à 363 de p25 de LAVBRU, et des homologues de ces séquences.
34.-Jeu de sondes, à utiliser pour des tests de diagnostic par hybridation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux séquences d'acides nucléiques codant pour les peptides mentionnés au tableau I.
35.-Vaccin contre une infection par HIV, caractérisé en ce qu'il comprend une dose immunologi- quement efficace d'un ou plusieurs peptides de moins d'environ 50 acides amines contenant des régions neutralisantes de gpllO et/ou de p25, ces peptides étant mé1angés avec un excipient physiologiquement acceptable.
36.-Vaccin suivant la revendication 35, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, au moins <Desc/Clms Page number 70> environ 5 acides amines d'un peptide bloquant.
37.-Vaccin suivant l'une quelconque des revendications 35 et 36, caractérisé en ce que les peptides sont conjugués avec un support immunogénique.
38. - Lignée cellulaire immortalisée, caractérisée en ce qu'elle produit un anticorps monoclonal capable de réagir avec un déterminant antigenique de la glycoprotéine gpl10 de l'enveloppe contenu dans une région neutralisante ou un peptide bloquant de HIV.
39.-Les lignées cellulaires HIV-gpllO-l, HIV-gpl10-2, HIV-gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV-gpllO-5, EMI70.1 HIV-gpllO-6, HIV-p25-6 et HIV-p25-7.
40. en ce - Anticorps monoclonal :, caractériséqu'il est produit par une lignée cellulaire suivant l'une quelconque des revendications 38 et 39.
41.- Anticorps monoclonal, caractérisé en ce qu'il est capable de réagir avec un déterminant antigénique de la glycoprotéine gpllO de l'enveloppe de HIV.
42. - Anticorps monoclonal, capable de réagir spécifiquement avec un déterminant antigénique de HIV, caractérisé en ce qu'il bloque la liaison d'un anticorps produit par les lignées cellulaires suivant l'une quelconque des revendications 38 et 39.
43." Procédé pour engendrer des lignées cellulaires qui produisent des anticorps réactifs avec des déterminants antigéniques de gpllO de HIV, carac- EMI70.2 térisé en ce qu'il comprend :l'administration un hôte d'une quantité immunogénique d'une preparation antigenique enrichie en protéines de HIV, l'observation, chez l'hôte, immunisé de la EMI70.3 production d'anticorps réactifs avec des determinants antigéniques de gpllO, l'obtention, à partir de l'hôte, de cellules <Desc/Clms Page number 71> productrices d'anticorps et l'immortalisation de ces cellules, 1a sélection des cellules immortalisées qui EMI71.1 produisent des anticorps à l'egard de gpl10 de HIV, et le clonage des cellules immortalisées pour produire les lignées cellulaires.
44. - procédé suivant la revendication 43, caractérisé en ce que les protéines de HIV sont des protéines de fusion recombinantes exprimées par un hôte eucaryote ou bactérien, ou bien les protéines de HIV sont obtenues à partir d'un extrait ou lysat de HIV.
45. - procédé pour diagnostiquer la présence de HIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : l'incubation d'un anticorps monoclonal capable de réagir avec gpllO de HIV contenu dans le dit échan- tillon biologique, et la détection de la présence de complexes immuns formes entre l'anticorps monoclonal et le déterminant antigénique dans l'échantillon biologique, et partant la détermination de la présence ou de l'absence de HIV dans 'échantillon.
46.- Procédé suivant la revendication 45, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal est capable de réagir avec une région neutralisante ou un peptide bloquant de gpllO.
47. - procédé pour diagnostiquer la présence d'anticorps contre HIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : l'incubation d'un peptide provenant d'une région neutralisante de gpllO ou p25 de HIV avec le dit échantillon biologique, et la détection de la présence de complexes immuns formés entre le peptide et les anticorps de 1'échantillon réactifs avec le peptide, et partant la <Desc/Clms Page number 72> détermination de la présence ou de l'absence de HIV dans l'échantillon.
48. - Procédé pour diagnostiquer la présence de HIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : l'incubation, dans des conditions d'hybridation, d'un segment d'acide nucléique codant au moins pour une partie d'une région neutralisante de HIV avec l'acide nucléique que contient 1échantillon biologique, et la détection de la présence de complexes hybrides formés entre le segment d'acide nucléique et l'acide nucléique de l'échantillon, et partant la determination de la présence ou de 1 ' absence de HIV dans l'échantillon.
49. - procédé pour déterminer une souche de HIV EMI72.1 chez un hôte infecté, caractérisé en ce qu'il comprend : l'incubation d'un échantillon biologique prélevé chez l'hole avec un peptide provenant d'une région neutralisante de HIV, et la détection de la présence de complexes immuns formés entre 1e peptide et des anticorps de l'échantillon, et partant la détermination de la souche de HIV infectant l'hôte.
50.-Composition a utiliser pour 1e traitement d'un patient suspecté d'avoir été exposé à HIV, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose thérapeu- tiquement ou immunologiquement efficace d'au moins un anticorps monoclonal réactif avec une région neutralisante de HIV.
51. - Trousse à utiliser pour 1e traitement d'un patient suspecté d'avoir ete expose a HIV, carac- térisée en ce qu'elle comprend une dose thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace d'un ou <Desc/Clms Page number 73> plusieurs anticorps monoclonaux réactifs avec une région neutralisante de HIV, des peptides bloquants capables d'atténuer le pouvoir infectieux de HIV et/ou des anticorps monoclonaux réactifs avec les peptides bloquants.
52.-Trousse suivant la revendication 51, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal réactif avec la région neutralisante de HIV est produit par une lignée cellulaire portant la désignation ATCC HB 9405 et un peptide bloquant est le peptide T ou un derive, ou analogue de celui-ci.
- 53. - Composition à utiliser pour le traitement d'un patient infecte par HIV après détermination de la souche de HIV par le procédé suivant la revendication 49, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal spécifiquement réactif avec une région neutralisante de la souche de HIV.
54. - Composition à utiliser pour vacciner un patient contre des infections par HIV, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose immunologiquement efficace d'un anticorps monoclonal anti-idiotypique, l'anticorps étant spécifiquement réactif avec un idiotype d'un second anticorps monoclonal capable de se fixer sur une région neutralisante de HIV.