NO300462B1 - Monoklonale antistoffer og peptider som kan anvendes til diagnose av HIV-infeksjoner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt in vitro diagnose av virusinfeksjoner. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen monoklonale antistoffer som kan an-

vendes ved in vitro diagnose av Human Immunodeficiency Virus (HIV)-infeksjoner.

Det infektiøse middel som er ansvarlig for Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) og dets prodromalfaser, AIDS-relatert kompleks (ARC) og lymfadenopatisyndrom (LAS), er et hittil ukjent lymfotrofisk retrovirus. Viruset er vekselvis blitt betegnet LAV, HTLV-III, ARV og i senere tid

HIV.

Etter hvert som utbredelsen av HIV når pandemiske proporsjoner, blir behandlingen av infiserte individer og forebyggelsen av transmisjon til uinfiserte individer med risiko for eksponering av meget stor betydning. Forskjellige terapeutiske strategier har vært rettet mot forskjellige stadier i virusets livssyklus, og disse omtales i Mitsuya og Broder, 1987, Nature 325:773. Ved en metode anvendes antistoffer som bindes til viruset og inhiberer virusreplikasjon enten ved å interferere med virusets inn-trengning i vertceller, eller ved hjelp av andre mekanismer. Når først den eller de viruskomponenter som mistenkes for antistoffintervensjon er identifisert, håper man at anti-stofftitere som er tilstrekkelige til å nøytralisere virusets infeksjonsevne, vil kunne fremkalles ved vaksinasjon eller ved passiv administrering av immunoglobuliner eller monoklonale antistoffer med den ønskede spesifisitet.

De glycoproteiner som omgir de fleste retrovirus, menes å reagere med reseptormolekyler på overflaten av mottagelige celler, hvorved virusets infeksjonsevne overfor visse verter fastlegges. Antistoffer som bindes til glycoproteinene, kan blokkere virusets interaksjon med cellereseptorene, idet de nøytraliserer virusets infeksjonsevne. Se generelt The Molecular Biology of Tumor Viruses,

534 (J. Tooze, utgitt 1973) og RNA Tumor Viruses, 226, 236

(R. Weiss et al., utgitt 1982). Se også Gonzalez-Scarano

et al., 1982, Virology 120:42 (La Crosse Virus),

Matsuno og Inouye, 1983, Infect. Immun. 39:155 (Neonatal Calf Diarrhea Virus) og Mathews et al., 1982, J. Immunol., 129:2763 (Encephalomyelitis-virus).

Den generelle struktur av HIV er en ribonucleo-proteinkjerne omgitt av et lipidholdig svøp som viruset under celleavsnøringen erverver fra den infiserte vertcelles membran. Innleiret i svøpet og ragende ut derfra finner man de viralt innkodede glycoproteiner. HIV's svøp-glycoproteiner syntetiseres innledningsvis i den infiserte celle som et forløpermolekyl på 150.000-160.000 dalton (gpl50 eller gpl60) som deretter behandles i cellen til et N-terminalfragment på 110.000-120.000 dalton (gpllO eller gpl20) til utvikling av det eksterne glycoprotein, og et C-terminalfragment på 41.000-46.000 dalton (gp41) som representerer transmembransvøpglycoproteinet.

Av de ovenfor diskuterte årsaker har HlVs gpllO glycoprotein vært gjenstand for utstrakt forskning som et potensielt mål for avbrytelse av virusets livssyklus.

Sera fra HIV-infiserte individer er blitt vist å nøytralisere HIV in vitro, og antistoffer som bindes til renset gpllO, finnes i seraene. Robert-Guroff et al., 1985, Nature 316:72, Weiss et al., 1985, Nature 316:69 og Mathews et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 83:9709. Renset og rekombinant gpllO stimulerte produksjon av nøytraliserende serumantistoffer ved anvendelse for immunisering av dyr, Robey et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 83:7023, Lasky et al., 1986, Science 233:209 og et menneske,

Zagury et al., 1986, Nature 326:249. Binding av gpllO-molekylet til CD4-(T4) reseptoren er også blitt vist, og monoklonale antistoffer som gjenkjenner visse epitoper av CD4-reseptoren, er blitt vist å blokkere HIV-binding, syncytia-dannelse og infeksjonsevne. McDougal et al.,

1986, Science 231:382. Putney et al. (1986, Science 234:1392) fremkalte nøytraliserende serumantistoffer i dyr etter immunisering med et rekombinant fusjonsprotein inneholdende carboxylterminalhalvdelen av gpllO-molekylet, og

viste ytterligere at glycosylering av svøpproteinet er unødvendig for en nøytraliserende antistoffreaksjon.

En subenhetsvaksine mot AIDS under anvendelse av HIV gpllO-molekylet eller deler derav, kan således være ønskelig. Subenhetsvaksiner er et alternativ til vaksiner fremstilt fra inaktiverte eller svekkede vira. Inaktiverte vaksiner er bekymringsfulle på grunn av risikoen for at ikke alle viruspartiklene er blitt drept, og svekkede vira kan være i stand til å mutere og gjenvinne deres sykdoms-fremkallende evne. Ved subenhetsvaksiner anvendes bare de deler av viruset som inneholder antigener eller epitoper som er i stand til å fremkalle immunreaksjoner, dvs. nøytraliserende antistoffer, ADCC og cytotoksisk T-celle-reaksjon, til immunisering av verten. En vesentlig fordel ved subenhetsvaksiner er at irrelevant virusmateriale er utelukket.

Virussubenheter til bruk i en vaksine kan fremkalles på flere forskjellige måter. Eksempelvis kan svøpglycopro-teinet uttrykkes og renses fra en bakterievert selv om dette molekyl vil mangle de fleste post-translaterings-modifikasjoner (slik som glycosylering) eller en annen behandling. En slik modifikasjon kan oppnås ved hjelp av et eukaryotisk ekspresjonssystem slik som gjær eller dyrkede pattedyrceller. Virusgener er blitt innført i pattedyrceller ved anvendelse av vacciniavirus som vektor. Se f.eks. Mackett, M., et al., 1982, Proe. Nat. Acad. Sei.

USA 79-7415, Panicali, D. og Paoletti, E., 1982, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 79:4927. Rekombinant vacciniavirus kan konstrueres ved fremgangsmåten ifølge Hu et al., Nature 320:537 (1986) eller Chakrabarti et al., Nature 320:535

(1986). I disse systemer glycosyleres virusglycoproteiner fremstilt fra celler infisert med rekombinant vaccinia på passende måte og kan transporteres til celleoverflaten for ekstrusjon og endelig isolering.

Et viktig trinn ved fremstilling av en subenhetsvaksine er passende rensing av det ønskede glycoprotein fra den komplekse blanding i ekspresjonssystemet. Flere metoder kan anvendes til denne rensing. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, preparativ polyacrylamidgelelektroforese, gelpermeeringskromatografi og forskjellige kromatografiske metoder (dvs. ionebytting, revers fase, immunoaffinitet, hydrofob interaksjon) og andre. De fleste av disse metoder anvendes i forskjellige kombinasjoner under dannelse av hovedsakelig rene preparater (Kleid, D.G., et al., 1981, Science 214:1125, Cabradilla, CD. et al., 1986, Biotechnology 4:128, Dowbenko, D.J., 1985, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 82:7748).

For fremstilling av subenhetsvaksiner er det behov for fremgangsmåter hvorved antall trinn som kreves for å oppnå maksimal rensing av et gitt virusantigen fra en kompleks ekspresjonsblanding, reduseres. Den effektive separasjon av antigenene fra uvedkommende komponenter kan oppnås under anvendelse av immunoaffinitetskromatografi. Denne teknikk som også er kjent som immunoadsorpsjon, består i prinsippet av selektiv adsorpsjon av et antigen til en fast bærer hvortil et spesifikt antistoff er kovalent bundet. Det selektivt adsorberte antigen elueres deretter fra en slik antistoffaffinitetsadsorbent ved forandring av f.eks. bufferens pH og/eller ionestyrke.

Polyklonale antistoffer erholdt fra dyr immunisert med det ønskede antigen eller fra naturlig infiserte individer (se f.eks. Lasky et al., supra), er hyppig blitt anvendt som immunoadsorbenter, men disse reagenser er generelt beheftet med betydelige ulemper, slik som at (i) ikke alle de til den uoppløselige bærer bundne antistoffer er spesifikke for det molekyl som er av interesse, hvilket nødvendiggjør ytterligere rensing, (ii) utbytter av det ønskede antigen ofte er lave, og (iii) antistoff-affiniteter ofte varierer fra den ene fremstilling til den andre, hvilket krever modifisering av elueringsprosedyrene. Disse vanskeligheter ville kunne unngås ved anvendelse av monoklonale antistoffer som var spesifikke for det ønskede virusantigen som skal anvendes i et subenhetsvaksine-preparat, istedenfor polyklonale antistoffer.

Murine, monoklonale antistoffer som binder HIV-antigener, er blitt beskrevet. Flere grupper har rapportert om monoklonale antistoffer som er spesifikke for kjerne-protein p25 (se f.eks. di Marzo Veronese, et al., 1985, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 82:5199 og Chassagne, J., et al., 1986, J. Immunol. 136:1442). Monoklonale antistoffer som er spesifikke for membranglycoproteinet gp41, er også blitt beskrevet (se f.eks. di Marzo Veronese, et al., 1985, Science 229:1402).

Innenfor området eksisterer det stadig et behov for monoklonale antistoffer som er spesifikke for epitoper innenfor veldefinerte områder av hoved-svøpglycoproteinet gpllO. Monoklonale antistoffer som bindes til disse områder og fremkaller en reduksjon eller eliminering av HlVs replikasjon og transmisjonsevne, ville således ha betydelig terapeutisk og profylaktisk anvendelighet. De monoklonale antistoffer ville også kunne anvendes til rensing av det ønskede område av gpllO fra oppbrutt virus eller rekombinante ekspresjonssystemer for bruk i f.eks. vaksiner. Dessuten ville det område som inneholder den eller de epitoper som gjenkjennes av de monoklonale antistoffer, kunne syntetiseres kjemisk, hvorved de vanskeligheter som oppstår ved rensing og administrering av større fragmenter av gpllO-molekylet, kunne unngås. Foreliggende oppfinnelse oppfyller disse og andre lignende behov.

Peptider som er i stand til immunologisk å etterligne nøytraliserende epitoper av HIV-proteiner, nuclein-syreprober som koder for slike peptider, og monoklonale antistoffer som kan reagere med slike peptider samt andre peptider som interfererer med HIV infeksjonsevne, tilveie-bringes således. Disse hittil ukjente materialer finner f.eks. anvendelse ved diagnostiske analyser til påvisning av HIV-infeksjoner, og i terapeutiske forskrifter for behandling av eller vaksinasjon mot slike infeksjoner.

Foreliggende oppfinnelse angår inhibering av dannelsen eller den cellulære transmisjon av infeksiøs HIV i en vert. Nærmere bestemt anvendes peptider som etterligner et nøytraliserende område av HIV og monoklonale antistoffer som kan reagere med et slikt område for diagnose av HIV-infeksjoner. I dette henseende indikerer uttrykket "nøytraliser-ende område" de deler av HIV, i særdeleshet HIV-proteiner, som inneholder aminosyresegmenter som definerer én eller flere epitoper som kan reagere med antistoffer, som enten individuelt eller i kombinasjon med andre antistoffer er i stand til å nøytralisere HIV-infeksjoner. Egnede analyser for nøytralisering er velkjente og kan innbefatte reduksjon av HIV-infeksjoner i T-cellelinjer, reduksjon av plakkdann-ende enheter av VSV(HIV) pseudotyper som bærer HIV svøpglyco-proteiner, tester og syncytial inhibering og virionreseptor-bindingstester. Den nøytraliserende aktivitet kan sammenlig-nes med antistoffreaktiviteten ved immunokjemiske tester slik som immunofluorescens-, immunoavtrykks- og radioimmunoutfell-ingsanalyse.

Oppfinnelsen angår således et monoklonalt antistoff, hvilket antistoff er kjennetegnet ved at det nøytraliserer HIV ved spesifikt å reagere med en gpllO nøytraliserende epitop innenfor HIV-området fra aminosyre 301-336 av LAV som har sekvensen II (29a)

og homologer derav. Oppfinnelsen angår også cellelinjer som er kjennetegnet ved at de er HIV-gpllO-1, ATCC HB9175, HIV-gpllO-2, ATCC HB9176, HIV-gpllO-3, ATCC HB9177, HIV-gpllO-4, ATCC HB9405, HIV-gpllO-5, ATCC HB9406, HIV-gpllO-6, ATCC HB9404, HIV-p25-6, ATCC HB9409, HIV-p25-7 og ATCC HB9410. Oppfinnelsen angår sluttelig anvendelse av monoklonale antistoffer ved in vitro diagnose av HIV. (a) aminosyresekvensene av HIV-isolater og LAVDnn kan bringes på linje for å oppnå maksimal homologi mellom de to sekvenser; (b) peptider omfattende HIV-isolaters aminosyre- sekvenser svarende til lokaliseringen av LAV_._. -peptider

BRU

som immunologisk etterligner LAVr)_>T-protiner, kan identifiseres. De således identifiserte peptider omfattende HIV-isolataminosyresekvenser, vil typisk immunologisk etterligne tilsvarende HIV-isolatproteiner.

Denne metode kan anvendes til HIV-stammer som ennå ikke er oppdaget. Når nye stammer av HIV identifiseres,

kan f.eks. deres svøp- og kjerneaminosyresekvenser bringes på linje med LAVBRUlg for å oppnå maksimal homologi. De metoder hvorved sekvensene bringes på linje, er kjente for fagmannen. Når sekvensene bringes på linje, ønskes det å bibeholde så stor homologi som mulig mellom cysteinrester. Aminosyresekvensen av den nye HIV-stamme eller art som svarer til lokaliseringen av de her spesifikt beskrevne peptider, kan syntetiseres og anvendes i overensstemmelse med oppfinnelsen.

En annen metode for bestemmelse av sekvenser av et homologt område i andre HIV-stammer, beskrives av Scharf et al., Science (1986) 233:1076. Denne anvender to oligo-nucleotidprimere som bindes til bevarte sekvenser utenfor det sekvensområde som er av interesse, og inneholder forskjellige restriksjonsposisjoner i hver primer. DNA fra HIV-stammer kan deretter forsterkes in vitro, hvoretter de resulterende oligonucleotider kan klones i vektorer for sekvensanalyse og inkorporeres i en vaksine som en kassett som representerer en særlig epitope fra HIV-stammen.

Det er ikke nødvendig at de i slike sekvenser inne-holdte epitoper er kryssreaktive med antistoffer for alle stammer eller arter av HIV. Peptider som omfatter immuno-logiske epitoper som skjelner en art eller serogruppe fra en annen, vil kunne anvendes til identifisering av særlige arter eller serogrupper, og kan i realiteten hjelpe til med å iden-tifisere individer infisert med én eller flere arter eller serogrupper av HIV.

De peptider som er av interesse, vil fortrinnsvis stamme fra virusets gpllO-område. Av særlig interesse i dette område er peptider kodet innenfor den åpne env leseramme som strekker seg fra omkring basepar (bp) 6667 til omkring 6774 i LAVBRU~isolatet. Forskjellige homologe områder av andre HIV-isolater innbefatter således de homologe sekvenser oppnådd fra Los Alamos Data Bank (med unntak av LAV2) som angitt i tabell I.

Blant andre peptider som er egnet til utvikling av eller screening for monoklonale antistoffer, er slike som kodes i den åpne env leseramme fra omkring bp 7246 til omkring 7317 i LAVBRU- Slike antistoffer og reaktive peptider er spesielt anvendbare til immunoanalyser.

I LAVBRU~isolatets gag-område er p25 aminosyresekvensene fra omkring 278 til 319 og 315 til 363 ytterligere nøytraliserende områder av HIV. Fagmannen vil forstå at ytterligere nøytraliserende områder av HIV kan identifiseres på grunnlag av de her angitte anvisninger, i særdeleshet kombinasjoner av monoklonale antistoffer som reagerer med forskjellige HIV-epitoper, vil utvise nøytral-iserende aktivitet.

Koden for peptid I, også kalt peptid 29, befinner seg i den åpne env leseramme fra omkring aminosyrerest 308 til omkring 328, og peptidet vil ha følgende aminosyresekvens hvor oligopeptider innbefattet i den etterfølgende sekvens, vil innbefatte lineære epitoper innenfor en slik sekvens:

hvori Y og Y', når disse forefinnes, hver betegner sekvenser på opptil ca. 20 aminosyrer. Når Y og/eller Y' er til stede, kan de f.eks. omfatte én eller flere aminosyrer fra sekvenser som flankerer aminosyrerest nr. 308 til 328 i HIV svøpsekvensen eller en hvilken som helst del av disse flankesekvenser. Eksempelvis kan Y omfatte hele LAVT,r)TT-i3.RU svøpaminosyresekvensen fra omkring rest nr. 301 til 307 eller deler derav, og Y<1> kan omfatte hele LAVD_.TT-svøp-dKU aminosyresekvensen fra omkring rest nr. 329 til nr. 336, eller deler derav, som følger: Alternativt kan avkortede sekvenser av peptider ifølge oppfinnelsen fremstilles. I dette henseende kan følgende sekvenser av peptid 29 være spesielt anvendelige: hvori Y og/eller Y<1>, når disse er til stede, hver især representerer sekvenser på opptil tyve aminosyrerester.

hvori Y og Y', når disse er til stede, hver især representerer sekvenser på opptil tyve aminosyrerester.

I en annen utførelsesform innkodes homologe områder av ARV-2-isolatet av særlig interesse i den åpne env leseramme fra omkring aminosyrerest nr. 306 til omkring nr. 323, og vil typisk ha følgende aminosyresekvens hvor oligopeptider innbefattet i følgende aminosyresekvens, vil innbefatte lineære epitoper med en slik sekvens:

hvori Y og Y', når disse er til stede, hver især representerer inntil ca. tyve aminosyrerester eller flere. Når Y og/eller Y<1> er til stede, kan de omfatte én eller flere aminosyrerester fra sekvenser som flankerer aminosyrerest nr. 306 til 323 i ARV-2-svøpsekvensen, eller en hvilken som helst del av disse flankeringssekvenser. Spesielt kan Y omfatte hele HIV-svøpaminosyresekvensen fra omkring nr. 299 til 306 eller deler derav, Y<1> kan omfatte hele HIV-svøpaminosyresekvensen fra rest nr. 324 til 333.

Alternativt kan avkortede sekvenser av peptid V fremstilles. I dette henseende kan følgende sekvenser være spesielt verdifulle:

hvori Y og/eller Y', når disse er til stede, hver representerer sekvenser på opptil tyve eller flere aminosyrerester.

Et ytterligere eksempel omfatter homologe områder av LAV-2-isolatet, f.eks. som det innkodes i den åpne env leseramme fra aminosyrerest nr. 311 til 330 og vil typisk ha følgende sekvens:

hvori Y og/eller Y<1>, når disse er til stede, hver især representerer sekvenser på opptil tyve eller flere aminosyrerester. (Se Nature 326:662 (1987)).

De monoklonale antistoffer er i stand til selektivt ved ekstremt høye titere (fra IO<2> til IO<4> til IO<7>

eller mer) å gjenkjenne nøytraliserende områder inneholdt i en på forhånd bestemt sekvens av svøpglycoprotein gpllO eller p25, deres proteinforløpere, biologisk uttrykte, rekombinante fusjonsproteiner og syntetiske peptider som inneholder én eller flere epitoper i det på forhånd bestemte sekvensområde av gpllO eller p25. De angjeldende hybridceller har et identifiserbart kromosom hvori kimlinje DNA'et er om-leiret til å kode for et antistoff med et bindingssted for en epitop for gpllO eller p25 som er felles for visse kliniske HIV-isolater eller alle. Disse monoklonale antistoffer kan

anvendes til diagnose og til identifisering av andre kryssreaktive antistoffer slik som blokkerende antistoffer.

Frembringelse av monoklonale antistoffer

Fremstilling av monoklonale antistoffer kan utføres ved udødeliggjørelse av ekspresjonen av nucleinsyresekvenser som koder for antistoffer som er spesifikke for HIV, ved innføring av slike sekvenser, typisk cDNA, som koder for antistoffet, i en vert som kan dyrkes i kultur. Den udøde-liggjorte cellelinje kan være en pattedyrcellelinje som er blitt transformert via onkogenese, ved transfeksjon, muta-sjon eller lignende. Blant slike celler er myelomalinjer, lymfomalinjer eller andre cellelinjer som er i stand til å understøtte ekspresjonen og utskillelsen av antistoffet in vitro. Antistoffet kan være et naturlig forekommende immunoglobulin fra et pattedyr, hvilket er fremstilt ved transformasjon av en lymfocytt, i særdeleshet en splenocytt, ved hjelp av et virus eller ved fusjon av lymfocytten med en neoplastisk celle, f.eks. en myeloma under dannelse av en hybridcellelinje. Splenocytten vil typisk stamme fra et dyr immunisert mot HIV-viruset eller et fragment derav inneholdende et epitopt sted.

Immuniseringsforskrifter er velkjente og kan variere betydelig, men likevel være effektive. Se Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 2. utgave (1986). Brutt virus, syntetiske peptider og bakteriefusjonsproteiner som inneholder antigeniske fragmenter av gpllOeller p25-molekylet, kan anvendes som immunogener. Immunogenet av brutt virus, peptider eller rekombinantproteiner, vil fortrinnsvis være beriket med hensyn til proteiner eller fragmenter derav inneholdende de epitoper til hvilke antistoffproduserende B-celler eller splenocytter ønskes. Nærmere bestemt kan oppløsninger inneholdende brutte viruslysater eller ekstrakter eller supernatanter av biologisk uttrykte rekombinante proteiner eller brutte ekspresjonsvektorer om ønsket være beriket

med hensyn til glycoproteiner ved anvendelse av metoder

slik som f.eks. polyacrylamidgelelektroforese. Lecitin-

affinitetsrensing er en foretrukket og hensiktsmessig metode for rensing av gpllO og andre glycoproteiner, f.eks. affinitetsrensing ved hjelp av lentillectin. Den grad hvortil glycoproteinene renses fra løsningene for bruk som immunogen, kan variere sterkt, dvs. fra mindre enn 50%, vanligvis eller minst 75% til 95%, fortrinnsvis 95% til 99%, og helst til absolutt homogenitet.

Når først proteinene er blitt renset i den ønskede grad, kan de suspenderes eller fortynnes i en passende fysiologisk bærer for immunisering, eller de kan kobles til en adjuvans. En foretrukket teknikk innbefatter f.eks. adsorpsjon av proteinene og fragmentene derav på lentil-lectinagarose eller en annen makromolekylær bærer for injeksjon. Immunogene mengder av antigeniske preparater anriket med hensyn til HIV-proteiner innbefattende gpllO-glycoprotein og p25-kjerneprotein, eller antigeniske deler derav, injiseres vanligvis i konsentrasjoner i området fra 1 ug til 20 mg/kg vert. Administreringen kan skje ved injeksjon, f.eks. intramuskulært, peritonealt, subkutant, intravenøst etc. Administreringen kan skje en eller flere ganger, vanligvis med 1 til 4 ukers mellomrom. Immuniserte dyr overvåkes for produksjon av antistoff mot de ønskede antigener, hvoretter miltene fjernes, og milt B-lymfocytter isoleres og fusjoneres med en myelomacellelinje eller transformeres. Transformasjonen eller fusjoneringen kan utføres på konvensjonell måte, og fusjoneringsteknikken er beskrevet i et stort antall patentskrifter, f.eks.

US patentskrifter nr. 4.172.124, 4.350.683, 4.363.799, 4.381.292 og 4.423.147. Se også Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980) og de deri anførte referanser, samt Goding, supra.

De udødeliggjorte cellelinjer kan klones og screenes i overensstemmelse med konvensjonelle teknikker, og de antistoffer i cellesupernatantene som er i stand til å bindes til de ønskede gpllO- eller p25 HIV-virusproteiner, rekombinante fusjonsproteiner eller syntetiske peptider som inneholder det ønskede epitopeområde, kan påvises. De passende udødeliggjorte cellelinjer kan deretter dyrkes in vitro eller injiseres i peritonealhulen på en passende vert for dannelse av ascitesvæske. I kraft av at man har enkelte antistoffer som er kjent for å være spesifikke for epitoper inneholdt f.eks. i de områder som kodes for av LAVBRU-genområdet fra omkring bp6688 til omkring bp6750 (koder for peptid 29) eller fra omkring bp7246 til omkring 7317 (koder for peptid 36) (bp-nummerering i henhold til Wain-Hobson et al., Cell 44:9, 1985), kan supernatantene screenes i konkurranse med de angjeldende, monoklonale antistoffer ved en konkurrerende analyse. Ytterligere udødeliggjorte hybridomacellelinjer med de ønskede bind-ingskarakteristika kan således lett fremstilles fra en rekke kilder på grunnlag av tilgjengeligheten av antistoffer som er spesifikke for det bestemte antigen. Alternativt kan disse cellelinjer fusjoneres med andre neoplastiske B-celler hvor slike andre B-celler kan tjene som resipienter for genomt DNA som koder for antistoffet.

Selv om neoplastiske B-celler fra gnagere, og i særdeleshet av murin opprinnelse foretrekkes, kan andre pattedyrarter anvendes slik som lagomorfa, kveg, sau, hest, svin, fjærkre eller lignende. Disse dyr kan lett immunis-eres, og deres lymfocytter, og i særdeleshet splenocyttene, kan oppnås til fusjoner.

Det av de transformerte cellelinjer eller hybridcellelinjer utskilte monoklonale antistoff, kan være av en hvilken som helst av immunoglobulinklassene eller -under-klassene slik som IgM, IgD, IgA, IgG^_4 eller IgE. Da IgG er den mest alminnelig anvendte isotype ved diagnostiske analyser, foretrekkes den oftest. De monoklonale antistoffer kan anvendes intakte eller som fragmenter, slik som Fv,

Fab, F(ab')2» men anvendes vanligvis intakte.

For å unngå den mulige antigenisitet av et monoklonalt antistoff som stammer fra et annet dyr enn mennesket i en human vert, kan det konstrueres kimære antistoffer hvori antigenbindingsfragmentet av et immunoglobulinmolekyl

(variabelt område) forbindes med en peptidbinding med i

det minste en del av et annet protein som ikke gjenkjennes som fremmed av mennesker, slik som den utdrevne del av et humant immunoglobulinmolekyl. Dette kan oppnås ved å fusjonere variable dyreområdeexoner med humane kappa eller gamma konstante regionexoner. Forskjellige teknikker er kjent for fagmannen, slik som de som er beskrevet i PCT 86/01533, EP171496 og EP173494.

Anvendelse av monoklonale antistoffer til immunoaffinitetsrensing

Monoklonale antistoffer som er spesifikke for polypeptider inneholdende gpllO eller andre antigeniske determinanter, i særdeleshet de antigeniske determinanter erholdt fra biologisk uttrykte rekombinerte fusjonsproteiner eller lysater eller ekstrakter av dyrket HIV, er spesielt for-delaktige å anvende ved rensingsforskrifter. Generelt vil antistoffene ha affinitetsassosiasjonskonstanter i størr-elsesorden 10 8 til 10 12M. Slike antistoffer kan anvendes til å rense de rekombinerte fusjonsproteiner fra dyrknings-mediet fra det rekombinante ekspresjonssystem hvis det uttrykte protein utskilles, eller fra komponentene i det brutte, biologiske ekspresjonssystem hvis de ikke utskilles. Generelt knyttes de monoklonale antistoffer som er i stand til å reagere med gpllO eller andre antigeniske determinanter, til eller immobiliseres på et substrat eller en bærer. Løsningen inneholdende de HIV-antigeniske determinanter, bringes deretter i kontakt med det immobiliserte antistoff under betingelser som er egnet til dannelse av immunkomplekser mellom antistoffet og polypeptidene inneholdende de gpllO antigeniske determinanter. Ubundet materiale separeres fra de bundne immunkomplekser, hvilke komplekser eller gpllO antigeniske fragmenter deretter separeres fra bæreren.

De monoklonale antistoffer vil typisk bli renset grovt for ascitesvæske eller cellekultursupernatanter før binding til en bærer. Slike prosedyrer er velkjente for fagmannen og kan innbefatte fraksjonering med nøytrale salter i høy konsentrasjon. Andre metoder slik som DEAE-kromatografi, gelfiltreringskromatografi, preparativ gel-elektroforese eller protein A affinitetskromatografi, kan også anvendes til rensing av det monoklonale antistoff før det anvendes som immunoadsorbant.

Bæreren til hvilken de monoklonale antistoffer immobiliseres, bør ha følgende generelle karakteristika: (a) svak interakjon mellom proteiner generelt for å minimere ikke-spesifikk binding, (b) gode strømningskarakteristika som tillater gjennomstrømning av materialer med høy molekyl-vekt, (c) være i besittelse av kjemiske grupper som kan aktiveres eller modifiseres for å tillate kjemisk binding av det monoklonale antistoff, (d) være fysisk og kjemisk stabile under de betingelser som anvendes til binding av det monoklonale antistoff, og (e) være stabile overfor de betingelser og komponenter som inngår i de buffere som er nødvendige for adsorpsjon og eluering av antigenet.

Enkelte generelt anvendbare bærere er agarose, derivatiserte polystyrener, polysaccharider, polyacrylamidperler, aktivert cellulose, glass og lignende. Det finnes forskjellige kjemiske metoder til binding av antistoffer til substratbærere. Se generelt Cuatrecasas, P., Advances in Enzymology, 36:29 (1972). Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan knyttes direkte til bæreren eller via en sammenkjedings-eller avstandsarm.

Generelle betingelser for immobilisering av monoklonale antistoffer til kromatografiske bærere er velkjente for fagmannen. Se f.eks. Tijssen, P., 1985, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay. Aktuelle koblingsprosedyrer vil avhenge litt av hvilke karakteristika antistoffet som skal kobles, har og dets type. Monoklonale antistoffer har karakteristika som vanligvis

er ensartet fra parti til parti, hvorved det er mulig at slike betingelser kan optimeres. Tilknytning finner typisk sted ved hjelp av covalente bindinger.

En suspensjon av ekstrakter eller lysater av HIV-virus, supernatanten fra et dyrket biologisk ekspresjonssystem eller en suspensjon av de brutte celler tilsettes deretter til separasjonsmatriksen. Blandingen inkuberes under slike betingelser og i et tidsrom som er tilstrekkelig til at immunkompleksdannelse finner sted, vanligvis minst 30 minutter og mer vanlig fra 2 til 24 timer. Immunkompleksene inneholdende polypeptider med antigeniske deler av gpllO separeres deretter fra blandingen. Typisk fjernes blandingen f.eks. ved eluering, og de bundne immunkomplekser vaskes grundig med adsorpsjonsbuffer. Immunkompleksene kan deretter elueres fra separasjonsmatriksen ved hjelp av et elueringsmiddel som er forenlig med den spesielle bærer som anvendes. Slike elueringsmidler er velkjente for fagmannen. Polypeptidene inneholdende gpllO eller andre antigeniske deler, kan også fjernes selektivt. Eksempelvis kan peptider som inneholder en epitope som gjenkjennes av antistoffene, anvendes til å konkurrere om anti-stoffbindingsposisjonen, hvilket gir en alternativ eluerings-teknikk som kan utføres under milde elueringsbetingelser. Det selektivt adsorberte polypeptid inneholdende gpllO-antigenet, kan elueres fra et antistoffaffinitetsadsorp-sjonsmiddel ved forandring av bufferens pH og/eller ionestyrke. Chaotrope midler kan også anvendes ved fjerning av det bundne antigen. Valget av chaotropt middel, dets konsentrasjon og andre elueringsbetingelser, avhenger av karakteristika for antistoff-antigeninteraksjonen, men så snart disse er bestemt, skulle de ikke være gjenstand for forandringer som vanligvis er nødvendige i polyklonale affinitetsseparasjonssystemer.

Det eluerte materiale kan kreve justering til en fysiologisk pH hvis buffere med lav eller høy pH-verdi eller ionestyrke anvendes til separasjon av de bundne gpllO-antigener fra separasjonsmatriksen. Dialyse eller gelfiltreringskromatografi kan også være nødvendig for å fjerne overskudd av salter anvendt i elueringsmidlet for å muliggjøre rekonstituering av gpllO eller polypeptider inneholdende antigeniske fragmenter av gpllO til naturlig oppbygning.

Fremgangsmåtene gir eksempelvis i det vesentlige renset gpllO eller polypeptider inneholdende antigeniske fragmenter derav, fremstilt enten naturlig med infiserte cellekulturer eller med rekombinerte ekspresjonssystemer av bakterier, gjær eller dyrkede insekt- eller pattedyrceller. gpllO og fragmentene eller andre rensede proteiner vil typisk, være mer enn 50% rene, mer vanlig minst 75% rene og hyppig mer enn 95 til 99% rene. Disse molekyler kan deretter finne anvendelse til mange forskjellige formål.

HIV gpllO-proteinene, polypeptider innehold-

ende de antigeniske fragmenter derav eller andre proteiner som er vesentlig renset ved fremgangsmåten, kan finne anvendelse til mange forskjellige formål, her-

under i AIDS subenhetsvaksineformuleringer, hvori immunogenet omfatter en virksom dose av antigeniske determinanter av f.eks. gpllO eller et nøytraliserende område derav. Andre komponenter i formuleringen vil kunne innbefatte de antigeniske deler av HIV-proteiner eller glycoproteiner som stimulerer fremstillingen av antistoff (fortrinnsvis nøytraliserende antistoffer) i en immunisert vert, hvilke antistoffer er i stand til å beskytte mot etterfølgende infeksjon med HIV.

Diagnostiske anvendelser av monoklonale antistoffer Monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen anvendes til diagnostiske formål. Til slike formål kan de enten være merket eller umerket. Diagnostiske analyser medfører typisk påvisning av dannelsen av et kompleks via bindingen av det monoklonale antistoff til et HIV-antigen. Når de er umerket, kan antistoffene f.eks. finne anvendelse til agglutineringsanalyser. Umerkede antistoffer kan dessuten anvendes i kombinasjon med andre merkede antistoffer (andre eller sekundære antistoffer) som kan reagere med det monoklonale antistoff, slik som antistoffer som er spesifikke for immunoglobulin. Alternativt kan de monoklonale antistoffer være merket direkte. Vidt forskjellige markører kan anvendes slik som radionucleider, fluorescensfrembringende midler, enzymer, enzymsubstrater, enzymkofaktorer, enzyminhibitorer, ligander (i særdeleshet haptener) etc. Tallrike typer av immunoanalyser er til-gjengelig, og enkelte av analysene beskrives eksempelvis i US patentskrifter nr. 3.817.827, 3.850.752, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345, 4.034.074 og 4.098.876.

Vanligvis anvendes de monoklonale antistoffer

og peptidene ved enzymimmunoanalyser hvor f.eks.

de angjeldende antistoffer eller sekundære antistoffer fra en annen art, konjugeres til et enzym. Når en biologisk prøve inneholdende HIV-antigener, slik som humant blodserum, saliva, sædvæske, vaginalsekreter eller virusinfisert cellekultursuspensjon kombineres med de angjeldende antistoffer, inntreffer det binding mellom antistoffene og de molekyler som utviser den ønskede epitope. Slike proteiner eller viruspartikler kan deretter separeres fra de ubundne reagenser, og et sekundært antistoff (merket med et enzym) tilsettes. Tilstedeværelsen av antistoff-enzymkonjugat som spesifikt er bundet til antigenet, påvises deretter. Andre konvensjonelle teknikker som er velkjente for fagmannen, kan også anvendes.

Det kan også leveres sett eller utstyr til bruk

med de omhandlede antistoffer ved påvisning av HIV-infeksjon, eller av tilstedeværelsen av HIV-antigen. De angjeldende monoklonale antistoffpreparater kan således leveres, vanligvis i lyofilisert form, enten alene eller i forbindelse med ytterligere antistoffer som er spesi-

fikke for andre HIV-epitoper. Antistoffene som kan være konjugert til en markør eller ukonjugerte, inkluderes

i settene eller utstyrene sammen med buffere slik som Tris, fosfat, carbonat etc, stabiliseringsmidler, biocider, inerte proteiner, f.eks. kvegserumalbumin eller lignende. Vanligvis vil disse materialer være til stede i en mengde på mindre enn ca. 5 vekt% basert på mengden av aktivt antistoff, og vanligvis til stede i en samlet mengde på minst ca. 0,001 vekt%, igjen basert på antistoffkonsentrasjonen. Det vil hyppig være ønskelig å inkludere et inert fordrøy-ningsmiddel eller eksipient for å fortynne de aktive be-standdeler hvor eksipienten kan være til stede i en mengde fra ca. 1 til 99 vekt% av det samlede preparat. Når et annet eller sekundært antistoff som er i stand til å bindes til det monoklonale antistoff anvendes, vil dette vanligvis forefinnes i en separat beholder. Det andre antistoff konjugeres typisk til en markør og formuleres på analog måte med de ovenfor beskrevne antistofformuleringer.

Påvisning av gpllO eller p25-antigener, eller hele viruset i forskjellige biologiske prøver kan finne anvendelse ved diagnose av en verserende infeksjon med HIV-viruset. Biologiske prøver kan innbefatte, men er ikke begrenset til, blodserum, saliva, sædvæske, vevsbiopsi-prøver (fra hjerne, hud, lymfekjertler, milt, etc), celle-kultur supernatanter , brutte, eukaryotiske og bakterielle ekspresjonssystemer og lignende. Det testes for tilstedeværelse av virus ved inkubering av det monoklonale antistoff med den biologiske prøve under betingelser som bidrar til immunkompleksdannelse, etterfulgt av påvisning av kompleksdannelse. I en utførelsesform påvises kompleksdannelse ved anvendelse av et sekundært antistoff som er i stand til å bindes til det monoklonale antistoff som typisk konjugeres til en markør og formuleres på analog måte med de ovenfor beskrevne antistofformuleringer. I en annen utførelsesform bindes det monoklonale antistoff til en fast bærer som deretter bringes i kontakt med en biologisk prøve. Etter et inkubasjonstrinn tilsettes merket, monoklonalt antistoff til påvisning av det bundne antigen.

Fremstilling og anvendelse av syntetiske peptider

De nye peptider etterligner blant annet immunologisk proteinepitoper for hvilke det kodes av HIV-retroviruset,

i særdeleshet epitoper innkodet i env- eller gag-områdene av virusgenomet som koder for hhv. gpllO og p25. For å tilpasse variasjoner fra stamme til stamme blant forskjellige isolater kan det foretas justeringer for konservative substitusjoner og utvelgelse blant alternativene hvor det er tale om ikke-konservative substitusjoner. Disse peptider kan anvendes som immunogener til inhibering eller eliminering av HIV-antigenproduksjon in vitro til påvisning av viruset eller av antistoffer mot viruset i en fysiologisk prøve. Avhengig av arten av forskriften kan peptidene være konjugert til en bærer eller andre forbindelser, merkede eller umerkede, bundet til en fast overflate eller lignende.

I en utførelsesform stammer peptider av interesse fra virusets gpllO-område. Av særlig interesse er området i den åpne env leseramme som strekker seg fra ca. basepar (bp) 6688 til ca. 6750, og ca. fra basepar 7246 til ca. 7317.

De interessante peptider, herunder blokkerings-peptider, vil innbefatte minst 5, av og til 6, av og til 8, av og til 12, av og til 21, vanligvis færre enn ca. 50,

og mer alminnelig færre enn ca. 35 og fortrinnsvis færre enn ca. 25 aminosyrer som er innbefattet i en sekvens for hvilken et HIV-retrovirus koder. Peptidet vil fordelaktig være så lite som mulig under fortsatt opprettholdelse av hovedsakelig hele immunoreaktiviteten eller den antivirale aktivitet av det større peptid. I enkelte tilfeller kan det være ønskelig å sammenføye to eller flere oligopeptider som ikke er overlappende, under dannelse av en enkelt peptid-struktur, eller å anvende dem på samme tid som individuelle peptider som separat eller sammen gir ekvivalent sensi-bilitet med utgangspunktet.

Peptidet kan modifiseres ved innføring av konservative substitusjoner i peptidet, idet vanligvis mindre enn 20 antallprosent og mer alminnelig mindre enn 10 antalls-prosent av aminosyrene utskiftes. I de situasjoner hvor områder finnes å være polymorfe, kan det være ønskelig å variere en eller flere spesielle aminosyrer for mer effektivt å etterligne de forskjellige retrovirusstammers av-vikende epitoper. I mange tilfeller kan methionin erstattes med norleucin (Nor) for å tilveiebringe kjemisk stabilitet.

Det skal bemerkes at det anvendte peptid ikke behøver å være identisk med noen spesiell HIV-polypep-tidsekvens så lenge den angjeldende forbindelse er i stand til å konkurrere immunologisk med proteiner fra minst én av HIV-retrovirusstammene. Det angjeldende peptid kan derfor være gjenstand for forskjellige endringer slik som innskudd, utelatelser eller substitusjoner, enten konservative eller ikke-konservative, hvor slike endringer kan gi visse bruksmessige fordeler. Ved konservative substitusjoner forstås substitusjoner innenfor grupper slik som gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; og nor, met. Vanligvis vil sekvensen ikke avvike med mere enn 20% fra sekvensen av minst én HIV-retrovirusstamme, unntatt hvor ytterligere aminosyrer kan være tilføyet ved den ene av endene eller begge, med det formål å tilveiebringe en "arm", hvormed peptidet hensiktsmessig kan immobiliseres. Armene vil vanligvis være minst én aminosyre lange og kan være 50 eller flere, oftere 1 til 10 aminosyrer lange.

Det peptid hvori aminosyresekvensen modifiseres ved substitusjon, addisjon eller strykning av aminosyrerester, bør hovedsakelig bibeholde hele immunoreaktiviteten eller antivirusaktiviteten av de umodifiserte peptider, hvilket hensiktsmessig kan måles ved hjelp av forskjellige her beskrevne analyseteknikker. d-isomerformen av en eller flere aminosyrer kan, om ønsket, anvendes til modifikasjon av biologiske egenskaper slik som aktivitet, nedbrytnings-hastighet, etc.

Dessuten kan 1, 2 eller flere aminosyrer adderes til endende på et oligopeptid eller peptid for å muliggjøre lett sammenkjeding av peptider med hverandre, kobling til en bærer eller et større peptid, av grunner som omtales senere, for å modifisere peptidets eller oligopeptidets fysiske eller kjemiske egenskaper eller lignende.

Aminosyrer slik som tyrosin, cystein, lysin, glutamin- eller asparaginsyre eller lignende, kan innføres ved peptidets eller oligopeptidets C- eller N-ende for å tilveiebringe en verdifull funksjonalitet til sammenkjeding. Cystein foretrekkes spesielt for å lette covalent kobling til andre peptider, eller for å danne polymerer ved oxydasjon.

Peptid- eller oligopeptidsekvensene kan dessuten avvike fra den naturlige sekvens ved at sekvensen er modi-fisert ved terminalaminoacylering, f.eks. acetylering eller thioglycolsyreamidering, carboxyterminalamidering, f.eks. med ammoniakk eller methylamin, under dannelse av stabilitet, forøket hydrofobisitet for sammenkjeding med eller binding til en bærer eller et annet molekyl, eller for polymerisering.

Eksempelvis er det tale om en foretrukket utførelses-form når Y eller Y' forefinnes i de ovenfor omtalte peptider I-VIII og IX-XV, når Y eller Y' omfatter én eller flere cysteinrester eller en kombinasjon av én eller flere cysteinrester med avstandsaminosyrer. Glycin er en særlig foretrukket avstandsaminosyre. Foretrukne peptider til bruk ved oxydativ polymerisering er slike hvori Y eller Y' betegner minst to cysteinrester. Når to cysteinrester forefinnes ved samme ende av peptidet, er det en foretrukket utførelsesform når cysteinrestene er adskilt fra hverandre med én eller to avstandsaminosyrer, fortrinnsvis glycin. Tilstedeværelsen av cysteinrester kan tillate dannelse av dimerer av peptidet og/eller en økning av det resulterende peptids hydrofobisitet, hvilket letter immobilisering av peptidet i fast fase eller immobiliserte analysesystemer. Av særlig interesse er anvendelse av mercaptan-gruppen i cysteiner eller thioglycolsyrer anvendt til acylering av terminalaminogrupper eller lignende til sammenkjeding av to av peptidene eller oligopeptidene, eller kombinasjoner derav, via en disulfidbinding eller en lengre binding under dannelse av polymerer som inneholder et antall epitoper. Slike polymerer har den fordel at de gir forøket immunologisk reaksjon. Hvor forskjellige peptider anvendes til oppbygning av polymeren, har de den ytterligere evne til å fremkalle antistoffer som immunoreagerer med flere antigeniske determinanter på forskjellige HIV-isolater.

For å oppnå dannelse av antigeniske polymerer (syntetiske multimerer) kan det anvendes forbindelser med bis-halogenacetylgrupper, nitroarylhalogenider eller lignende, hvor reagensene er spesifikke for thiogrupper. Bindingen mellom de to mercaptogrupper i de forskjellige peptider eller oligopeptider kan således være en enkelt binding eller en sammenkjedingsgruppe på minst 2, vanligvis minst 4 og ikke mer enn ca. 16, og vanligvis ikke mer enn ca. 14 carbonatomer.

Det angjeldende peptid kan anvendes bundet til en oppløselig makromolekylær (f.eks. ikke mindre enn 5kDal) bærer. Bæreren kan hensiktsmessig være en polyaminosyre, enten naturlig forekommende eller syntetisk, mot hvilken det er usannsynlig at man vil finne antistoffer i humant serum. Eksempler på slike bærere er poly-L-lysin, albu-skjell hemocyanin, thyroglobulin, albuminer slik som kvegserumalbumin, tetanustoxoid, etc. Valget av bærer avhenger primært av den påtenkte endelige anvendelse av antigenet og av hensiktsmessighet og tilgjengelighet.

Med slike konjugater vil det være minst ett molekyl av minst ett omhandlet peptid pr. makromolekyl, og ikke mer enn ca. 1 pr. 0,5kDal, vanligvis ikke mere enn ca. 1

pr. 2kDal av makromolekylet. Ett eller flere forskjellige peptider kan være kjedet til samme makromolekyl.

Sammenkjedingsmåten er konvensjonell, idet det anvendes slike reagenser som p-maleimidobenzosyre, p-methyl-dithiobenzosyre, maleinsyreanhydrid, ravsyreanhydrid, glutaraldehyd, etc. Sammenkjedingen kan finne sted ved N-enden, C-enden eller i en posisjon mellom molekylets ender. Det angjeldende peptid kan derivatiseres ved sammenkjeding, kan sammenkjedes mens det er bundet til en bærer eller lignende.

Forskjellige analyseforskrifter som er velkjente for fagmannen, kan anvendes for påvisning av tilstedeværelse av enten antistoffer mot retrovirusproteiner eller selve retrovirusproteinene. Av særlig interesse er anvendelse av peptidet som det merkede reagens, hvor markøren sørger for et påviselig signal eller binding av peptidet til en overflate enten direkte eller indirekte, hvor antistoff mot peptidet i prøven vil bli bundet til peptidet på overflaten. Nærvær av humant antistoff bundet til peptidet, kan deretter påvises ved anvendelse av et xenogent antistoff som er spesifikt for humant immunoglobulin, normalt både humant IgM og IgG, eller et merket protein som er spesifikt for immunkomplekser, f.eks. Rf-faktor av S. aureus protein A.

Illustrerende for en analyseteknikk er anvendelse av en prøvebeholder, f.eks. brønner i mikrobrønnplater, hvor det angjeldende polypeptid eller konjugater derav adsorberes til beholderbunnen og/eller veggene, enten covalent eller ikke-covalent. Prøven, normalt, humant blod eller serum fortynnet i et passende bufret medium, tilsettes til beholderen, og et tilstrekkelig tidsrom tillates å forløpe til at det kan dannes kompleks mellom polypeptidet eller -peptidene og eventuelle beslektede antistoffer i prøven. Supernatanten fjernes, og beholderen vaskes for å fjerne ikke-spesifikt bundne proteiner. Et merket, spesifikt bindingsprotein som spesifikt bindes til kom-plekset, slik som xenogent antiserum mot humant immunoglobulin, anvendes til påvisning.

Peptidet kan fremstilles på mange forskjellige måter. På grunn av dets forholdsvis korte lengde kan peptidet syntetiseres i oppløsning, eller på en fast bærer i henhold til konvensjonelle teknikker. I dag finnes det forskjellige automatiske syntetisatorer i handelen som kan anvendes i overensstemmelse med kjente forskrifter. Se f.eks. Steward og Young, Solid Phase Peptide Synthesid, 2. utgave, Pierce Chemical Co., 1984, og Tam et al., J. Am. Chem. Soc. (1983) 105:6442.

Alternativt kan det anvendes hybrid DNA-teknologi hvor et syntetisk gen kan fremstilles under anvendelse av enkle strenger som koder for polypeptidet, eller hovedsakelig komplementære strenger derav, hvor de enkle strenger overlapper hverandre og kan bringes sammen i et normaliser-ingsmedium for å hybridisere. De hybridiserte strenger kan deretter ligeres under dannelse av det komplette gen,

og ved valg av passende terminaler kan genet innføres i ekspresjonsvektorer som er umiddelbart tilgjengelige i dag. Se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Det område av virusgenomet som koder for peptidet, kan også klones ved konvensjonelle rekombinant DNA-teknikker og bringes til uttrykk (se Maniatis, supra).

Blant DNA-kodningssekvenser fra LAV,,-.,- og ARV 2-isolatene av HIV som kan anvendes til ekspresjon av peptidene, er følgende:

Fragmenter av en sekvens kan anvendes til ekspresjon av peptidfragmenter, konservative baseendringer kan foretas hvor det eller de modifiserte kodoner koder for samme aminosyre(r), eller ikke-konservative endringer i kodningssekvensen kan foretas hvor den resulterende aminosyre kan være en konservativ eller en ikke-konservativ endring av aminosyresekvensen som tidligere omtalt.

Kodningssekvensen kan forlenges enten ved 5'-eller 3'-enden eller begge for å forlenge peptidet under bibeholdelse av dets epitope sted(er). Forlengelsen kan tilveiebringe en arm for sammerikjedning, f.eks. med en markør slik som et enzym, til sammenføyning av to av peptidene eller alle peptidene i samme kjede, for tilveie-bringelse av antigenisk aktivitet, egnede restriksjonsposisjoner for kloning eller lignende.

Selve DNA-sekvensen, fragmenter derav eller større sekvenser, vanligvis på minst 15 baser, fortrinnsvis minst 18 baser, kan anvendes som nucleotidprober til påvisning av retroviralt RNA eller proviralt DNA, eller til identi-fikasjon av homologe områder for kloning eller sekvensanalyse. Tallrike teknikker finnes beskrevet slik som Grunstein-Hogness-teknikken, Southern-teknikken, Northern-teknikken, dot-blotteknikken, forbedringer av disse samt andre metoder, f.eks. som beskrevet i US patentskrift nr. 4.358.535.

Oppfinnelsen belyses nærmere ved hjelp av de etter-følgende eksempler.

Eksempel 1

Utvikling og karakterisering av monoklonale antistoffer

Eksempel 1 beskriver utvikling av hybridcellelinjer som produserer monoklonale antistoffer som er spesifikke for HIV svøpglycoproteinene. Denne fremgangsmåte gjør bruk av lectinrensede ekstrakter av LAVD_.T7 knyttet

BRU

til lentillectin agarose som immunogen. De monoklonale antistoffer som deretter utvikles med hybridcellelinjene, er karakterisert ved deres evne til å immunoavtrykke og radioimmunoutfelle gpllO fra renset LAV, og som biologisk uttrykt rekombinant fusjonsprotein. De monoklonale antistoffer som bindes til epitoper på gpllO, er også reaktive ved ELISA med brutt, helt virus, fusjonsproteiner og syntetiske peptider, og reagerer med helvirus ved indirekte

fluorescensanalyser.

Forskriftene for utvikling av hybridcellelinjene som produserer monoklonalt antistoff, og karakterisering av antistoffene, var som følger.

LAV-virus renset for infiserte CEM-celler

(A.T.T.C. nr. CRL8904) ble oppbrutt i 50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1,0% aprotinin, 2,0% "Nonidet" P-40 (NP-40)

(octylfenoxypolyethoxyethanol). Ekstraktet ble klaret to ganger ved sentrifugering og ble innstilt til 0,5% NP-40

ved tilsetning av tre volumer oppbrytningsbuffer uten NP-40. Lentillectin "Sepharose" ble forvasket i oppbrytningsbuffer uten NP-40 og ble deretter bragt til likevekt i adsorpsjonsbuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1,0% aprotinin, 0,5% NP-40). Renset virusekstrakt ble adsorbert med lentillectin "Sepharose" i 42 timer ved 4°C. Uadsor-bert materiale ble fjernet ved vasking med adsorpsjonsbuffer i overskudd. Eluering av adsorbert materiale ble utført med 0,2 M alfamethylmannosid i adsorpsjonsbuffer. Elueringsmidlet ble dialysert overfor PBS for å fjerne sukkeret, og materialet ble readsorbert på lentillectin "Sepharose".

Glycoprotein-lentillectin "Sepharose"-komplekset ble anvendt til immunisering av BALB/c--mus ved tre intraperj-toneale injeksjoner uten adjuvans, gitt med 2-3 ukers mellomrom. Miltene ble fjernet fra immuniserte mus som ut-viste sirkulerende antistoff mot HIV-glycoproteiner ved immunoavtrykk, RIP og/eller ELISA.

Til utvikling av cellelinjer ble det generelt anvendt Kohler og Milsteins forskrifter (Nature 256:495 (1985)) med de av Goldstein, L.C., et al., (Infect. Immun. 38:273

(1982)) foreslåtte modifikasjoner. B-lymfocytter fra

milter fra de immuniserte mus ble fusjonert med NS-1 myelomaceller ved hjelp av 40 vekt/vol% polyethylenglycol. Etter fusjonering ble celleblandingen resuspendert i HAT-medium (RPMI - 1640 medium supplert med 15% kalvefoster--4 -7

serum, 1 x 10 M hypoxanthm, 4 x 10 M ammoptenn og 1,6 x 10 — 5M thymidin) for å utvelge på grunnlag av veksten av hybridceller, og ble deretter fordelt til 96-brønns mikrokulturbrett i en konsentrasjon på 1 til 3 x 106 celler/ml

og ble inkubert ved 37°C i en fuktet atmosfære inneholdende 6% CC>2' Kulturene ble matet ved erstatning av halvparten av supernatanten med friskt HAT-medium. Brønnene ble observert under invertmikroskop med hensyn til tegn på celleformering, og når cellene hadde tilstrekkelig densitet, ble supernatantene testet med hensyn til anti-LAV-antistoff.

Brønner inneholdende hybridceller som produserte antistoff mot LAV, ble identifisert ved ELISA som målte bindingen til enten renset, helt oppbrutt virus eller biologisk uttrykte fusjonsproteiner. ELISA-analyser med oppbrutt virus ble utført på LAV EIA-plater. Platene ble inkubert med celledyrkningsvæsker ved 3 7°C i 45 minutter og ble deretter vasket tre ganger med 0,05 "Tween"-20 i fosfatbufret saltvann (PBS-"Tween").

Peroxydase-geiteantimuse-IgG (1:2.000 fortynning

i PBS-"Tween") ble tilsatt 100 pl pr. brønn, og platene ble inkubert ved 3 7°C i 45 minutter og ble vasket som ovenfor angitt. Substrat (0,025 M sitronsyre, 0,05 M dibasisk natriumfosfat, pH 5,0, inneholdende 14 mg o-fenylendiamin og 10 ul 30% hydrogenperoxyd pr. 50 ml) ble tilsatt, og platene ble inkubert i mørket ved romtemperatur i 30 minutter. Reaksjonen ble stanset med 3 N svovelsyre, og kolo-rimetriske reaksjoner ble avlest kvantitativt med en auto-matisert mikroplateavleser. Brønner som ga positive resultater, ble subklonet ved grensefortynning, ble testet på nytt med hensyn til spesifisitet og ble deretter ekspandert.

De av de resulterende hybridcellelinjer utskilte monoklonale antistoffer, ble karakterisert ytterligere med hensyn til spesifisitet og reaktivtet ved inununoavtrykning, immunoutfelling og ELISA med oppbrutt LAV-virus, rekombinante LAV-fusjonsproteiner og syntetiske LAV-peptider. Alle antistoffene ble bestemt å være av IgG-^-isotype. Cellelinjene HIV-gpllO-1, HIV-gpllO-2 og HIV-gpllO-3 er før inn-levering av foreliggende søknad blitt deponert ved American Type Culture Collection under følgende deponeringsnumre

HB 9175, HB 9176 og HB 9177.

Rekombinante fusjonsproteiner som er testet med hensyn til reaktivitet, er tidligere blitt betegnet som ENV2, ENV3, ENV4.og ENV5. Protein ENV2 uttrykkes av pENV2 (A.T.C.C. nr. 53071) som er et område av LAV fra basepar (bp) 6598 til bp 7178 (nummerering i henhold til Wain-Hobson et al., Cell 44:9 (1985)), ENV3 uttrykkes av pENV3 (A.T.C.C. nr. 53072) som omfatter LAV-området fra bp 7178 til bp 7698, ENV4 uttrykkes av pENV4 (A.T.C.C. nr. 53073)

og omfatter pb 7698 til bp 8572, og ENV5 uttrykkes av pENV5 (A.T.C.C. nr. 53074) som omfatter LAV-området bp 5889 til bp 7698. Fremstillingen av de rekombinante fusjonsproteiner beskrives nærmere i søkerens US patentsøknad nr. 721.237.

Samling av syntetiske peptider

Peptid I (29) og VIII (110-2-2) ble anbragt på en benzhydrylamin- (polystyren/divinylbenzen) harpiks. Peptid V

(177) ble anbragt på en t-butyloxycarbonyl-(Boe)-ethylbenzyl-cystein-fenylacetamidomethyl(PAM)polystyren/divinylbenzen-harpiks. Symmetriske anhydridkoblinger ble utført i en syntetisator av typen Applied Biosystems 430A. Cystein ble tilsatt som den første rest i begge peptider.

Dicyclohexylcarbodiimidkoblinger i nærvær av hydroxylbenzotriazol ble anvendt til asparagin og glutamin. Benzylbasert sidekjedebeskyttelse og Boe alfa-aminbeskyttelse ble anvendt. Annen rutinemessig anvendt sidekjedebeskyttelse var Boe-(formyl)-tryptofan, Boc-methioninsulfoxyd, Boc-(tosyl)-arginin, Boe-(methylbenzyl)-cystein, Boc-(tosyl)-histidin, Boe-(klorbenzyloxycarbonyl)-lysin og Boe-(brom-benzyloxycarbonyl)-tyrosin.

Da peptidene ble radiomerket, skjedde dette ved acetylermg av ammoenden med <3>H-eddiksyre og dicyclohexylcarbodiimid i overskudd.

Avbeskyttelse og spalting av peptidet fra harpiksen skjedde etter "lav-høy" HF-forskriften ifølge Tam (Tam et al., supra). Ekstraksjon fra harpiksen skjedde med 5% eddiksyre, og ekstraktet ble underkastet gelfiltreringskromatografi i 5% eddiksyre*

Blant syntetiske HIV-peptider som ble testet for reaktivitet med de monoklonale antistoffer, var peptid 29,

36 og 39. Peptid 2 9 kodes av LAVBRU-genomområdet fra ca.

bp 6688 til bp 6750, peptid 36 kodes av området fra ca.

bp 7246 til bp 7317, og peptid 39 kodes av området fra ca. bp 7516 til bp 7593. Peptid 36 og 39 beskrives nærmere i US patentskrift 4.629.783.

Blokkeringspeptidene IX-XV ble anbragt hovedsakelig som ovenfor beskrevet på en methyl-benzhydrylamin-(polystyren/divinylbenzen) harpiks. Symmetriske anhydridkoblinger ble utført på en syntetisator av typen Applied Biosystems 430A. Dicyclohexylcarbodiimidkoblinger i nærvær av hydroxylbenzotriazol ble anvendt til asparagin. Til be-skyttelse ble det anvendt benzylbasert sidekjede- og boc-alfa-aminbeskyttelse, mens Boe-(brombenzyloxycarbonyl) spesielt ble anvendt til tyrosinsidekjeder. Eventuell acetylering ble utført ved hjelp av eddiksyreanhydrid eller iseddiksyre og dicyclohexylcarbodiimid. Avbeskyttelse og spalting av peptidet fra harpiksen ble utført ved "høy" HF standard-forskrift (Stewart et al., supra). Ekstraksjon fra har-piksene ble utført med 50% eddiksyre, og ekstraktet ble deretter underkastet gelfiltreringskromatografi i 20% eddiksyre. Om ønsket, ble væskekromatografi med høy ytelse utført på en "Vydac" C18-kolonne under anvendelse av en 0,1% trifluor-eddiksyre, acetonitrilgradient.

Immunoavtrykning

Karakterisering ved immunoavtrykning ble utført på klonsupernatanter eller ascitesvæske under anvendelse av renset LAV-virus og rekombinante fusjonsproteiner som antigener. Antigenene ble først separert ved polyacrylamid-gradientgelelektroforese (7,0-15,0%) og ble overført til nitrocellulosemembran (NCM) ved elektroforese i 4 timer ved 25 Vi 25 mM natriumfosfat (pH 7,0). Etter overføring ble NCM blokkert for å forebygge ikke-spesifikke, innbyrdes reaksjoner ved inkubering i PBS-"Tween" eller "Blotto" (5% fettfri tørrmelk i PBS) ved romtemperatur i 1 time. NCM

ble inkubert med cellekultursupernatant eller ascitesvæske fortynnet i PBS-"Tween" ved romtemperatur i 1 time og ble skylt med tre porsjoner PBS-"Tween". I det andre trinn ble

NCM inkubert med geiteanti-muse-IgG-pepperrotperoxydase fortynnet i PBS-"Tween" i en time ved romtemperatur. Denne inkubering ble etterfulgt av vasking med PBS-"Tween" og nedsenkning i pepperrotperoxydasefargefremkallingsoppløsning i 20 minutter. Reaksjonen ble stanset ved nedsenkning i avionisert vann. Reaktiviteten av monoklonalt antistoff ble sammenlignet med et positivt kontrollserum som reagerte med renset, brutt virus eller uttrykt fusjonsprotein. Resultatene viste at alle antistoffer ble bundet til gpllO og dets forløpermolekyl gpl50 ved anvendelse av preparater av brutt virus. Antistoff 110-1 og 110-2 gjenkjente også fusjonsproteinet ENV3, mens antistoff 110-3, 110-4, 110-5

og 110-6 dannet immunokompleks med ENV2.

Immunoutfelling

Virusekstrakter til radioimmunoutfelling ble fremstilt fra CEM-celler infisert med LAV,3„T-isolatet av HIV tilpasset lytisk vekst ved kontinuerlig overføring. Når tidligere cytopatiske virkninger sås klart, ble cellene over-ført til merkningsmedier inneholdende ]-methionin

(0,05 mCi/ml) eller <3>[H]-glucosamin (0,025 mCi/ml), ble deretter inkubert i 24 timer inntil mesteparten av cellene var lysert under frigivelse av viruset til kultursupernatanten. Virus ble pelletisert (1 time ved 100.000 x g) fra den cellefrie supernatant, og detergentekstrakter ble fremstilt i P-RIPA-buffer (fosfatbufret saltvann inneholdende 1,05% "Triton" X-100, 1,0% deoxycholat, 0,1% SDS og 1% aprotinin). Lignende ekstrakter ble fremstilt fra supernatantene fra uinfiserte CEM-celler.

Immunoutfellingsanalyser ble utført med 100 ul virusekstrakt inkubert med 100 ul kultursupernatant fra hybridcellelinjene i en time på is. 4 mikroliter kanin-anti-muse-Ig ble tilsatt til hver prøve og ble inkubert i 30 minutter. 100 ul immunoprecipitin resuspendert i P-RIPA-buf f er inneholdende 1,0% ovalbumin, ble tilsatt til hver prøve og inkubert i ytterligere 30 minutter. De bundne komplekser ble vasket og separert ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (15,0% acrylamid, DATD-gel). Etter elektroforese ble gelene fiksert, utbløtt i Enhance, tørket og eksponert til Kodak XR-5 film. Et positivt referanseserum som immunoutfelte alle HIV-virusproteiner, ble omsatt med virusinfiserte og etterligningsinfiserte CEM-cellesuper-natanter som positive og negative kontrollprøver.

Resultatene viste at alle seks monoklonale antistoffer spesifikt immunoutfelte" gpllO og gpl50.

Enzymkjedet immunoadsorbansanalyse

For å kartlegge de gpllO-epitoper som ble gjen-kjent av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen, ble kultursupernatanter fra hybridcellelinjer eller ascitesvæske ytterligere karakterisert ved reaktivitet ved ELISA-er med biologisk uttrykte fusjonsproteiner og syntetiske peptider. Prosedyrene var de samme som ovenfor beskrevet, med det unntak at fusjonsproteiner eller syntetiske peptider erstattet renset virus som det til overflaten av mikrotiter-brønnene adsorberte antigen.

Når peptider ble anvendt som antigen, var pletter-ingsforskriften som følger. Lyofilisert peptid ble oppløst i 6M guanidin HC1. Like før plettering i 96-brønnsplatene ble guanidinoppløsninen fortynnet i 0,05 M carbonat/bicarbona buffer (pH 9,6) til en peptid-sluttkonsentrasjon på opptil 100 ug/ml. Et 50 ul volum av det fortynnede peptid ble anbragt i hver mikrotiterbrønn, hvoretter platene ble inkubert natten over ved 4°C. Overskytende peptidløsning ble "ristet ut", platene ble blokkert med Blotto, og den ovenfor beskrevne prosedyre ble fulgt for resten av ELISA-en.

På tilsvarende måte ble rekombinant protein fortynnet til en sluttkonsentrasjon på ca. 2 ug/ml i 0,05 M carbonat/bi-carbonatbuffer (pH 9,6) før den samme prosedyre ble fulgt.

Resultatene er vist i tabell II. Monoklonale antistoffer produsert av cellelinjene HIV gpllO-1 og HIV gpllO-2, reagerte med ENV3, ENV5, peptid 36 og brutt virus. Antistoffer fra cellelinjene HIV-gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV-gpllO-5 og HIV-gpllO-6 reagerte med såvel ENV2 og peptid 2 9 som brutt virus.

Resultatene i tabell II viste at de monoklonale antistoffer 110-1 og 110-2 gjenkjente en antigenisk determinant for hvilken det kodes av en DNA-sekvens i pENV3-området, nærmere bestemt det område av HIV-genomet som er definert av en aminosyresekvens i peptid 36. De monoklonale antistoffer gpllO-1 og 110-2 bindes således til et peptid-område av gpllO, for hvilket det kodes innenfor bp7246 til bp7317, hvilket dannelsen av immunkomplekser med peptid 36

og ENV3 viser. Dette område av HIV-genomet er tidligere blitt identifisert som bevart, dvs. at det er liten endring i DNA-sekvensen i det område som peptid 36 koder for blant forskjellige virusisolater fra forskjellige geografiske lokaliteter. Se Starcich et al., Cell 46:637 (1986). I mot-setning dertil bindes de monoklonale antistoffer gpllO-3,

-4, -5 og -6 til HIV-peptider definert ved det område for hvilket peptid 29 fra bp 6688 til ca. bp 6750 koder. Det av peptid 29 definerte område i gpllO, er blitt identifisert som inneholdende flere nucleotidsubstitusjoner blant forskjellige virusisolater. Monoklonale antistoffer som selektivt binder gpllO-polypeptider som inneholder bevarte epi-

toper slik som antistoff 110-1 og 110-2, kan ha forøket anvendelighet under mange forskjellige omstendigheter, slik som ved affinitetskromatografi etc. Ved en ELISA-analyse reagerte peptid 110-2-2 også med sera fra det individ hvor-fra LAV-2 ble isolert.

Indirekte immunofluorescensanalyse

Indirekte immunofluorescensanalyser under anvendelse av monoklonale antistoffer rettet mot HIV gpllO-antigenet, ble utført på aceton-fikserte og levende celler. Aceton-fikserte preparater fremstilt ut fra LAV-infiserte CEM-celler, ble inkubert med fortynnet kultursupernatant eller ascitesvæske ved 37°C i 1 time, mens levende celler ble inkubert med kultursupernatant eller ascitesvæske ved 4°C i 1 time, før cellene ble anbragt på objektglass og aceton-fiksert. Til begge metoder ble det anvendt fluorescein-isothiocyanatmerket anti-muse-IgG til påvisning av celler med det reaktive gpllO-antigen. Monoklonalt antistoff HIV-gpllO-1 ga positive resultater ved anvendelse av enten levende eller aceton-fikserte LAV-infiserte celler.

Eksempel II

Immunoaffinitetsseparasjon av gpllO ved hjelp av monoklonalt antistoff

Monoklonale antistoffer mot HIV gpllO-antigenet kan anvendes til hovedsakelig å rense bakterielt uttrykte rekombinante fusjonsproteiner ved immunoaffinitetssepara-sjonsprosedyrer. Hvis det uttrykte protein utskilles av bakterien, kan proteinet isoleres fra kultursupernatanten. Hvis proteinet ikke utskilles, kan brytning av bakterie-cellene være nødvendig.

Konstruksjonen av plasmid pENV-5 (A.T.C.C. nr. 53074) beskrives i søkerens US patentsøknad nr. 721.237. Plasmid pENV-5 koder for en større del av carboxylenden av gpllO og en del av aminoenden av gp41 fra LAV innført i trp-ekspresjonsvektoren. E. coli C600 transformert med denne vektor, uttrykker, men utskiller ikke, gpllO-fusjonspro-

teinet.

E. coli C600 inneholdende pENV-5-plasmidet, dyrkes

i medium inneholdende tryptofan (20 ug/ml) og ampicillin (100 ug/ml) over natten ved 37°C under luftning. Kulturene som har stått over natten, inokuleres deretter til 1:100 i friskt, minimalt medium inneholdende ampicillin (100 ug/ml), men ikke tryptofan. Disse kulturer dyrkes under luftning i 2-3 timer (opptil tidlig logaritmisk fase) ved 37°C. Induktoren 3-B-indolacrylsyre tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 20 ug/ml fra friskt fremstilt forråd av 20 ug/ml i 95% ethanol. Induserte kulturer dyrkes deretter ved 37°C under luftning i 4 til 5 timer, pelletiseres deretter og fryses eventuelt. Proteinutbytter fra pENV-5 er typisk mindre enn 1 mg/liter.

De pelletiserte bakterieceller lyseres under anvendelse av P-RIPA-buffer (PBS inneholdende 1% "Triton" X-100,

1% deoxycholat, 0,1% natriumdodecylsulfat og 1% aprotinin) som vil lysere E. coli-celler. Suspensjonen kan lydbehandles for å overskjære DNA og RNA, etterfulgt av sentrifugering for å fjerne partikkelformet materiale. Et fortynnings-eller konsentreringstrinn kan deretter være nødvendig for å standardisere proteinkonsentrasjonen.

Monoklonalt antistoff HIV-gpllO-1 utfelles først fra ascitesvæske eller cellekultursupernatanter ved romtemperatur eller kaldt med (NH4)2S04 eller Na2S04~oppløs-ninger bufret til pH 7,3 til sluttmetning på hhv. 33 og 18%. Utfelte proteiner fjernes ved sentrifugering og oppløses igjen i PBS og utfelles enda en gang med 33% (NH4)2S04 eller 12-15% Na2S04. Dette trinn kan gjentas etter behov. Pelleten oppløses igjen i PBS, og overskytende salter fjernes ved gelfiltrering gjennom en avsaltningsmatriks, eller ved grundig dialyse overfor PBS.

Renset, monoklonalt 110-1-antistoff kan deretter kobles til cyanogenbromid-aktivert "Sepharose". Den nødven-— 3

dige mengde gel svelles i 10 M HCl-løsning pa et glassfilter (1 g frysetørret materiale gir et sluttvolum på ca. 3,5 ml) og vaskes 15 minutter med samme oppløsning, og anti-

stoffet tilsettes umiddelbart deretter. Generelt forløper koblingsreaksjonen mest effektivt i et pH-invervall på fra 8-10, men en lavere pH kan anvendes hvis det er nødvendig av hensyn til antistoffstabiliteten. Antistoffet bør opp-løses i PBS eller en carbonat/bicarbonat- eller boratbuffer med høy ionestyrke med 150 mM NaCl. Suspensjonen av aktivert "Sepharose" og antisto'ff omrøres forsiktig ved romtemperatur i 2-4 timer eller over natten ved 4°C, og vaskes deretter med koblingsbuffer på et grovt sintret glassfilter. Eventuelle gjenværende, aktive grupper blokkeres ved behandling av 1,0 M ethanolamin ved pH 8 i 2 timer. Det sluttelige antistoff-"Sepharose"-produkt vaskes deretter suksessivt med bufferoppløsninger med høy og lav pH (hhv. boratbuffer, 0,1 M, pH 8,5, 1 M NaCl og acetatbuffer,

0,1 M pH 4,0, 1 M NaCl) fire eller fem ganger. Denne vasking fjerner spor av ikke-covalent adsorberte materialer.

Den ferdige immunoaffinitetsseparasjonsmatriks oppbevares under 8°C i nærvær av et passende bakteriostatisk middel slik som 0,01% azid.

Tilsetning av den uttrykte proteinsuspensjon til immunoaffinitetsseparasjonsmatriksen resulterer i selektiv fjerning av gpllO-antigenet. Blandingen får reagere i 2-24 timer, fortrinnsvis 12-18 timer, under langsom omrør-ing eller vugging. Det kan også anvendes et kolonneformat hvor immunoaffinitetsmatriksen helles i en kolonne, bringes i likevekt, og den uttrykte proteinsuspensjon tilsettes langsomt til kolonnen. Etter at proteinsuspensjonen er tilsatt, bør gjennomstrømningen stanses for å tillate maksimal immunkompleksdannelse.

Ubundet materiale utvaskes eller separeres ved grundig vask med absorpsjonsbuffer. Et grovt sintret glassfilter med vakuum eller kolonnegjennomstrømning kan anvendes. Det bundne materiale elueres deretter under anvendelse av buffere med lav eller høy pH (acetatbuffer, pH 4,0 eller boratbuffer, pH 8,56) eller et chaotropt middel.

Eksempel III

Immunoaffinitetsrensing av rekombinant gpllO fra et pattedyr-ekspresjonssystem

De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen finner anvendelse ved immunoaffinitetsrensing av rekombinant fusjons gpllO uttrykt av pattedyrceller. Pattedyrceller infiseres med rekombinant vaccinia (Mackett et al., J. Virol. 49:857 (1984) som inneholder sekvenser som koder for i det minste den del av gpllO som er antigenisk og fremkaller nøytraliserende antistoffer.

Den rekombinante vaccinia konstrueres i henhold til den i US patentsøknad nr. 842.984 beskrevne metode. I korte trekk innføres sekvenser som koder for HIV-svøpglycopro-teinet i en plasmidvektor (pGS20) nedstrøms for et vaccinia-transkripsjonskontrollelement. Dette kimære gen flankeres av sekvenser som koder for det virale thymidinkinase- (TK) gen.

Kimære plasmidvektorer inneholdende vacciniavirus-promotor ligert til LAV-svøpgenet, anvendes til transfor-mering av E. coli stamme MC1000. Innføring av de kimære LAV-env-sekvenser i vacciniavirusgenomet utføres ved in vivo-rekombinasjon muliggjort ved at de kimære gener i pv-env5-plasmider flankeres av vacciniavirussekvenser som koder for TK-genet. Dette plasmid innføres deretter i celler som på forhånd er infisert med vill-type vacciniavirus, og rekombinasjon får lov til å finne sted mellom TK-sekvensene på plasmidet og de homologe sekvenser i vacciniavirusgenomet, hvorved det kimære gen innføres. African Green Monkey nyreceller (stamme BSC-40, en linje avledet av BSC-1-celler, A.T.C.C. nr. CCL26) anvendes som vert i ekspresjonssystemet .

Sammenflytende BSC-40-celler infiseres til en in-feksjonsmultiplisitet på 10 med rekombinant vacciniavirus. Infeksjonen får lov til å forløpe i 12 timer, hvoretter cellene høstes, vaskes en gang med PBS og oppsamles ved sentrifugering. Cellepellets resuspenderes i lyseringsbuffer (1,0% NP 40, 2,5% natriumdeoxycholat, 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-HC1, pH 7,4, 1 mM EDTA), hvoretter lysatet klares ved sentrifugering. Immunoaffinitetsseparasjon av det uttrykte rekombinante fusjonsprotein utføres som beskrevet ovenfor, for bakterieekspresjonssystemet, under anvendelse av det monoklonale antistoff gpllO-1. De med dette ekspresjonssystem produserte proteiner ligner langt mer naturlig fremstilt HIV gpllO på grunn av den behandling" og glycosylering som patte-dyrcellene gir.

Mikroorganismedeponeringsdata

Følgende mikroorganismer som utgjør en del av oppfinnelsen, ble deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.

Data vedrørende deponeringene er som følger:

Vitenskapelig

Hybridomene HB 9175, HB 9176 og HB 9177 ble testet og ble funnet å være levedyktige den 26. august 1986. De øvrige hybridomer ble testet og funnet å være levedyktige den 4. mai 1987.

Claims (6)

1. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det nøytraliserer HIV ved spesifikt å reagere med en gpllO nøytraliserende epitop innenfor HIV-området fra aminosyre 301-336 av LAV som har sekvensen II (29a) II (29a) Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys og homologer derav.

2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det binder til en nøytraliserende gpllO epitop som befinner seg innenfor LAVBru aminosyresekvens 308 til 328, eller homologer derav.

3. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er erholdt fra en cellelinje som er HIV-gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV-gpllO-5 eller HIV-gpllO-6, med deponeringsnr. ATCC HB9177, HB9405, HB9406 og HB9404, eller konkurrerer med et monoklonalt antistoff erholdt fra minst én av disse cellelinjer om binding til gpllO.

4. Cellelinjer, karakterisert ved at de er HIV-gpllO-1, ATCC HB9175, HIV-gpllO-2, ATCC HB9176, HIV-gpllO-3, ATCC HB9177, HIV-gpllO-4, ATCC HB9405, HIV-gpllO-5, ATCC HB9406, HIV-gpllO-6, ATCC HB9404, HIV-p25-6, ATCC HB9409, HIV-p25-7 og ATCC HB9410.

5. Anvendelse av monoklonalt antistoff ifølge kravene 1-3 for diagnose med hensyn til tilstedeværelse av HIV i en biologisk prøve, ved at man inkuberer et monoklonalt antistoff som er i stand til å reagere med HIV gpllO sammen med en biologisk prøve, og påviser tilstedeværelsen av immunkomplekser dannet mellom det monoklonale antistoff og den antigeniske determinant i den biologiske prøve, og på grunnlag derav be-stemmer tilstedeværelsen eller fraværet av HIV i prøven.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor det monoklonale antistoff er i stand til å reagere med et nøytraliserende område av gpllO.