PL155084B1 - A method of monoclonic antibodies generating and the useof theses antibodies in distributions based on immulogical affinity - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 155 ®84

POLSKA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr Zgłoszono: 87 08 20 (P. 267401)

Int. Cl.⁵ A61K 39/42 A61K 39/21

Pierwszeństwo: 86 08 20 dla zastrz. 1-3

Stany Zjednoczone Ameryki Mllllll

05 01 dla zastrz. 4-6 Η ό B A fi

Stany Zjednoczone Ameryki ’

Zgłoszenie ogłoszono: 88 07 21

Opis patentowy opublikowano: 1992 04 30

Twórcy wynalazku: Mary K. Shriver, Elaine K. Thomas, Wesley L. Cosand,

Larry H. Gosting, Edna S. Dickinson, Janela /NMI/ McClure, George J. Todaro, Robert C. Nowiński

Uprawniony z patentu: Genetic Systems Corporation,

Seattle (Stany Zjednoczone Ameryki)

Sposób wytwarzania linii komórkowych produkujących przeciwciała przeciw wirusowi HIV

Przedmiotem wynalazku jest wytwarzanie linii komórkowych produkujących przeciwciała przeciw wirusowi HIV, zwłaszcza przeciwciała reaktywne z determinantami antygenowymi HIVgp 110 lub p25.

Przeciwciała otrzymywane z linii komórkowych wytwarzanych sposobem według wynalazku znajdują zastosowanie w wykrywaniu i neutralizacji wirusa HIV. Mogą być również stosowane w szczepionkach ochronnych przeciw temu wirusowi, w postaci kompozycji farmaceutycznych zawierających te przeciwciała.

Czynnikiem wywołującym infekcje zespołu nabytego braku odporności (AIDS) i jego faz zwiastunowych, infekcje zespołu pokrewnego z ADIS (ARC) i białaczki limfatycznej (LAS) jest nowy retrowirus rozwijający się w limfocytach. Dla określenia tego wirusa przyjęły się różne nazwy, a mianowicie: LAV, HTLV-III, ARV, a ostatnio HIV.

Wobec zjawiska rozprzestrzeniania się wirusa HIV w sposób pandemiczny, leczenie pacjentów zakażonych i zapobieganiu przenoszeniu się choroby na jednostki niezakażone, a zagrożone tym wirusem jest zadaniem o fundamentalnym znaczeniu. Proponowane dotychczas różnorodne strategie leczenia opierają się na ataku skierowanym na różne stadia rozwojowe tego wirusa. Są one opisane przez Mitsuya i Broder'a w Naturę, 325,773 (1987). Jedną z takich strategii jest zastosowanie przeciwciał wiążących się z wirusem i hamujących jego replikację albo na drodze przeszkadzania we wnikaniu wirusa do wnętrza komórki gospodarza albo według jakiegoś innego mechanizmu. Wraz ze zidentyfikowaniem komponenty (lub komponent) wirusowej wrażliwej na działanie przeciwciała, powstała nadzieja, że przez szczepienie albo uodpornienie bierne, poprzez podanie immunoglobulin albo monoklonalnych przeciwciał o żądanej specyficzności, będzie można uzyskać w organiźmie odpowiednie miano przeciwciał, wystarczające do zneutralizowania zaraźliwości wirusa.

155 084

Uważa się, że glikoproteiny płaszczowe większości retrowirusów reagują z cząsteczkami receptorowymi na powierzchni wrażliwych komórek, co determinuje zaraźliwość wirusa w stosunku do niektórych gospodarzy. Przeciwciała wiążące się z glikoproteinami mogą blokować działanie wirusa i komórek receptorowych, neutralizując zaraźliwość tego wirusa. Patrz: /The Noleculer Biology of Tumor Viruses, 534 (pod red. J. Toczą, 1973) oraz RNA Tumor Viruses, 226, 236 (R. Wiss i wsp., 1982). Patrz również: Gonzalez-Scarano i wsp. Virology 120, 42 (1982), Wirus La Grosse/; Matsuno i Inouyc, Infect. IMMun., 39,155 (1983) - wirus biegunki noworodków cieląt oraz Mathews i wsp., J. Immunol., 129, 2763 (1982) - wirus zapalenia rdzenia mózgowego.

W ogólnej strukturze wirusa HIV wyodrębnia się rybonukleoproteinowy rdzeń, otoczony zawierającym lipidy płaszczem, który wirus nabywa w czasie swego rozwoju z błony zakażonej komórki gospodarza. W płaszczu osadzone są i wystają na zewnątrz kodowane przez wirusa glikoproteiny. Glikoproteiny płaszczowe HIV są początkowo syntetyzowane w zainfekowanej komórce w formie cząsteczki prekursorowej o wielkości 1500(X)-160000 daltonów (gp 150 albo gp 16X), a następnie ulegają przetwarzaniu w komórce na N-terminalny fragment o wielkości 1100ΧΟ-12ΧΧΧΧΧ daltonów (gp 110 albo gp 120) z jednoczesnym wytworzeniem zewnętrznej glikoproteiny i fragmentu C-terminalnego o wielkości 41000-46000 daltonów (gp41) reprezentującego transbłonową glikoproteinę płaszczową.

Z omówionych powyżej powodów glikoproteiny gp 110 wirusa HIV stały się przedmiotem wielu badań, służąc jako potencjalny cel, poprzez który można będzie przerwać cykl rozwojowy wirusa. Surowice chorych zakażonych HIV neutralizowały HIV in vitro. W surowicach tych były obecne przeciwciała wiążące się z oczyszczonym gp 110 (Robert Guroff i wsp., Naturę, 316, 72, 1985; Weiss i wsp., Naturę 316,69 (1985) i Mathews i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,9709 (1986). Oczyszczone i rekombinantowe gp 110, zastosowane do uodpornienia zwierząt stymulowało wytwarzanie neutralizujących przeciwciał w surowicy (Robey i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7023 (1986); Lasky i wsp., Science, 233, 209 (1986). Zagury i wsp., /Naturę, 326, 249 (1986) donosi o takich samych doświadczeniach uodparniania ludzi. Wykazano również wiązanie się cząsteczki gp 110 z receptorem CD4/T4/. Ponadto okazało się, że monoklonalne przeciwciała, które rozpoznają pewne epitopy receptora CD4, blokują wiązanie HIV, powstawanie syncytiów i zaraźliwość. /McDougal i wsp., Science, 231, 382 (1986). Putney i wsp., Science 234,1392 (1986)/ wykazał obecność przeciwciał neutralizujących w surowicy u zwierząt po immunizacji rekombinantowym białkiem fuzyjnym zawierającym C-terminalną połowę cząsteczki gp 110, a następnie dowiódł, że glikozylacja białka płaszczowego jest niezbędna dla uzyskania odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał neutralizujących.

Tak więc, może się okazać użyteczna przeciw AIDS szczepionka zawierająca podjednostki antygenowe (subunit vaccine), w której stosuje się cząsteczkę gp 110 HIV, bądź jej część. Szczepionki zawierające podjednostki antygenowe są alternatywą szczepionek sporządzanych z wirusów dezaktywowanych lub pozbawionych zjadliwości (atenuowanych). W przypadku szczepionek dezaktywowanych należy mieć na uwadze możliwość, że nie wszystkie cząsteczki wirusowe zostały zabite w trakcie przygotowywania szczepionki, natomiast wirusy atenuowane mogą posiadać zdolność mutacji i odzyskiwania działania wywołującego chorobę. W przypadku szczepionek podjednostkowych do immunizacji gospodarza stosowane są tylko te cząsteczki wirusa, które zawierają antygeny lub epitopy zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej, to jest neutralizacji przeciwciał, ADCC oraz cytotoksycznej odpowiedzi komórek limfocytarnych - T. Główną zaletą szczepionek podjednostkowych jest to, że wyklucza się nierelewantny materiał wirusowy.

Podjednostki wirusowe przeznaczone do przygotowania szczepionek można generować kilkoma metodami. Przykładowo, można wywoływać ekspresję glikoproteiny płaszczowej w gospodarzu bakteryjnym i następnie oczyścić tę glikoproteinę, jakkolwiek w tym gospodarzu nie będą prawdopodobnie zachodzić modyfikacje post-translacyjne (takie jak glikozylacja) lub inne procesy tego typu. Modyfikacje tego typu można uzyskać stosując eukariotyczny system ekspresyjny, taki jak drożdże lub hodowle komórkowe ssaków. Geny wirusowe wprowadza się do komórek ssaków stosując jako wektory wirusa krowianki (Mackett M. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,7415 1982; Panicali D. i Paoletti E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4927, 1982).

155 ¢84

Rekombinantowy wirus krowianki można uzyskać metodą Hu i wsp., Naturę, 320,537 (1^86) albo Chakrabarti i wsp., Naturę, 320, 535 (1986). Obydwie te metody są podane w niniejszym opisie. W układach tego typu glikoproteiny wirusowe wytwarzane przez komórki zakażone rekombinantowym wirusem krowianki są odpowiednio zglikozylowane i mogą być transportowane na powierzchnię komórki, usuwane poza komórkę i izolowane.

Istotnym etapem w produkcji szczepionek podjednostkowych jest odpowiednie oczyszczenie żądanej glikoproteiny ze złożonej mieszaniny systemu ekspresyjnego.

Do celów oczyszczania można zastosować szereg metod, takich jak preparatywna elektroforeza w żelu poliakryloamidowym, chromatografia żelowa, jak również różne inne metody chromatograficzne (na przykład wymiany jonowej, faz odwróconych, powinowactwa immunologicznego, interakcji hydrofobowej) i inne. Dla uzyskania rzeczywiście czystych preparatów, większość tych metod stosuje się w różnych kombinacjach (Kleid D. G. i wsp., Science, 214,1125, (1981), Cabradilla C. D., i wsp., Biotechnology, 4,128 (1986), Dowbenko D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7748, (1985)), podanych w niniejszym opisie.

Do produkcji szczepionek podjednostkowych potrzebne są metody pozwalające na ograniczenie ilości etapów wymaganych dla maksymalnego oczyszczenia konkretnego antygenu wirusowego izolowanego ze złożonej mieszaniny ekspresyjnej. Wydajność oddzielania antygenów od obecnych komponentów uzyskuje się stosując chromatografię powinowactwa. Technika ta, znana również jako immunoadsorpcja, polega w zasadzie na selektywnej adsorpcji antygenu na stałym nośniku, związanym uprzednio wiązaniami kowalencyjnymi ze specyficznym przeciwciałem. Antygen, zaabsorbowany selektywnie w układzie przeciwciało-adsorbent wymywa się następnie przez zmianę, na przykład pH i/lub siły jonowej buforu.

Jako immunoadsorbenty często stosuje się przeciwciała poliklonalne, uzyskane od zwierząt immunizowanych żądanym antygenem albo od osobników zakażonych w sposób naturalny (np. Lasky i wsp., jak wyżej). Reagenty takie posiadają jednak na ogół zasadnicze wady, a mianowicie, (i) nie wszystkie przeciwciała związane z nierozpuszczalnym nośnikiem są specyficzne w stosunku do danej cząsteczki, co wymaga dodatkowego oczyszczania, (ii) wydajności żądanego antygenu są na ogół niskie, oraz (iii) powinowactwo przeciwciała jest często różne w różnych preparatach, co wymaga modyfikacji w procesie eluowania. Zastosowanie monoklonalnych przeciwciał, specyficznych dla żądanego antygenu wirusowego, który ma być użyty w preparacie szczepionki podjednostkowej zamiast przeciwciał poliklonalnych pozwala na ominięcie tych niedogodności.

W literaturze zostały opisane monoklonalne przeciwciała mysie wiążące się z antygenami HIV. Były doniesienia o monoklonalnych przeciwciałych specyficznych w stosunku do białka rdzeniowego p25 (na przykład di Marżo Veronese i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5199, (1985) i Chassagne J., i wsp., J. Immunol. 136, 1442 (1986). Opisano również monoklonalne przeciwciała specyficzne w stosunku do błonowej glikoproteiny gp 41 (di Marżo Veronese i wsp., Acience, 229, 1402, (1985).

Pozostało jeszcze uzyskanie monoklonalnych przeciwciał specyficznych w stosunku do epitopów w obrębie dobrze poznanych regionów większej glikoproteiny płaszczowej gp 110. Monoklonalne przeciwciała wiążące się z tymi regionami i zmniejszające lub całkowicie eliminujące replikację i przenoszenie wirusa HIV mogłyby mieć istotne zastosowanie lecznicze i profilaktyczne. Takie monoklonalne przeciwciała mogłyby być poza tym użyte do oczyszczania żądanego regionu gp 110 do rozszczepionych części wirusa lub jego izolacji z rekombinantowych układów ekspresyjnych, z przeznaczeniem na przykład jako szczepionki.

Ponadto, region zawierający epitop lub epitopy rozpoznawcze przez monoklonalne przeciwciała mógłby być syntetyzowany chemicznie, przez co można byłoby uniknąć trudności związanych z oczyszczaniem i podawaniem większych fragmentów cząsteczki gpl O.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych linii komórkowych zdolnych do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych.

Przeciwciała te, przy wyjątkowo wysokich mianach (od 10²-10⁴ do około 10⁷, a nawet wyższych) mają zdolności rozpoznawania regionów neutralizujących zawartych w określonej sekwencji glikoproteiny płaszczowej gp 110 albo p25 w prekursorach białkowych tych glikoprotein, w białkach fuzyjnych powstających przez ekspresję biologiczną i w syntetycznych peptydach, które zawierają jeden lub więcej epitopów w tym określonym regionie gpllO lub p25. Hybrydowe

155 084 komórki wytwarzane sposobem według wynalazku posiadają możliwy do zidentyfikowania chromosom, w którym nastąpiło przegrupowanie DNA w nowo powstających liniach w taki sposób, że koduje on przeciwciało posiadające miejsce wiązania z epitopem zawartym w gpUO lub p25, wspólnym dla niektórych lub wszystkich klinicznych izolatów wirusa HIV. Te przeciwciała monoklonalne mają różnorodne zastosowania, w tym w diagnostyce i w lecznictwie, jak również do identyfikacji innych reagujących krzyżowo przeciwciał, takich jak przeciwciała blokujące. Peptydy albo polipeptydy zawierające epitop, z którym reagują, mają znaleźć oddzielne zastosowanie jako immunogeny do szczepionek lub jako środki lecznicze.

Według wynalazku sposób wytwarzania linii komórkowych produkujących przeciwciała reaktywne z determinantami antygenowymi HIV gpl 10 lub p25 polega na tym, że do gospodarza wprowadza się immunogeniczną ilość preparatu antygenowego wzbogaconego w białko HIV i monitoruje się immunizowanego gospodarza na produkcję przeciwciał reaktywnych z determinantami antygenowymi gpl 10 lub p25. Następnie z gospodarza pozyskuje się komórki produkujące przeciwciała i immortalizuje się te komórki, wybiera się immortalizowane komórki produkujące przeciwciała przeciw HIV gpl 10 lub p25 i klonuje się immortalizowane komórki otrzymując linie komórkowe. Wzrost linii komórkowych prowadzi się „in vitro“ w pożywce, albo wstrzykuje się je śródbłonowo gospodarzowi, a następnie odzyskuje się przeciwciała monoklonalne. Monitorowanie gospodarza na produkcję przeciwciał polega na tym, że próbkę biologiczną pobraną z gospodarza inokuluje się „in vitro“ białkiem z neutralizującego regionu HIV i wykrywa się obecność immunokompleksów tworzonych pomiędzy białkiem i przeciwciałami w próbce.

Monoklonalne przeciwciała uzyskuje się przez „unieśmiertelnienie ekspresji sekwencji kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała specyficzne w stosunku do HIV. Sekwencje te, na ogół cDNA kodujący dane przeciwciało, wprowadza się do gospodarza nadającego się do hodowli. Taka „unieśmiertelniona linia komórkowa może być linią komórek ssaków transformowaną na drodze onkogenezy, przez transfekcję, mutację lub na innej drodze. Do takich komórek należą linie szpiczaka, chłoniaka lub inne linie zdolne do wspomagania ekspresji i wydzielania przeciwciała in vitro. Przeciwciałem może być występująca w stanie naturalnym immunoglobulina ssaka, produkowana przez transformację limfocytu, zwłaszcza limfocytu śledziony wirusem lub przez fuzję limfocytu z komórką szpiczaka, z wytworzeniem hybrydowej linii komórkowej. Na ogół, limfocyty śledziony otrzymuje się od zwierząt immunizowanych przeciw wirusowi HIV lub fragmentowi tego wirusa zawierającemu miejsce epitopowe.

Sposoby immunizacji są znane i mimo wzajemnych różnic są skuteczne. (Monoclonel Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, II wyd. /1986/).

Jako immunogeny stosuje się rozerwane cząsteczki wirusa, syntetyczne peptydy i bakteryjne białka fuzyjne, zawierające fragmenty antygenowe cząsteczki gpl 10 lub p25. Korzystnie, immunogen będący rozszczepioną cząsteczką wirusa, peptydem lub rekombinantowym białkiem można wzbogacić w białka lub ich fragmenty zawierające epitopy, w stosunku do których limfocyty B lub limfocyty śledziony będą wytwarzały przeciwciała. Jeśli to potrzebne, roztwory zawierające lizaty lub ekstrakty wirusowe albo supernatanty wytwarzanych biologicznie białek rekombinantowych lub rozszczepionych wektorów ekspresyjnych mogą być wzbogacane w glikoproteiny, z zastosowaniem metody oczyszczania takiej jak elektroforeza w żelu poliakryloamidowym. Korzystną i dogodną metodą oczyszczania gpl 10 i innych glikoprotein jest oczyszczanie z wykorzystaniem powinowactwa do lektyny a zwłaszcza do lektyny z soczewicy. Stopień oczyszczania glikoprotein z roztworów przeznaczonych do użycia jako immunogenów może być bardzo różny. Może on wynosić nawet poniżej 50 procent, zazwyczaj będzie wynosił 75-90 procent, korzystnie 95-99 procent, a najbardziej korzystnym stopniem oczyszczania jest absolutna homogeniczność.

Po oczyszczeniu białek do żądanej czystości, do celów immunizacji zawiesza się je lub rozcieńcza w odpowiednim nośniku fizjologicznym albo sprzęga się z adiuwantem. Korzystną techniką jest na przykład adsorpcja białek i ich fragmentów przeznaczonych do iniekcji na lektyno-agarozie z soczewicy lub na innym nośniku wielocząsteczkowym. Immunogenne ilości preparatów antygenowych, wzbogaconych w białka HIV, zawierające glikoproteinę gpl 10 i białko rdzeniowe p25 lub ich części antygenowe wstrzykuje się do organizmu żywiciela, na ogół w stężeniach od 1 //g do 20 mg/kg. Można stosować iniekcje domięśniowe, dootrzewnowe, podskórne lub dożylne. Preparat podaje się raz lub wielokrotnie, zwykle w odstępach od tygodnia do 4 tygodni. U immunizowa155 084 nych zwierząt monituje się wytwarzanie przeciwciał przeciw żądanemu antygenowi, następnie usuwa się śledziony, izoluje z nich limfocyty B i dokonuje ich fuzji z linią komórek szpiczaka albo transformacji tą linią. Transformację lub fuzję prowadzi się w dowolny znany sposób. Techniki fuzji są podane w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4 172 124,4 350 683, 4 363799, 4381292 i 4423 147 oraz opisane przez Kennett'a i wsp., (Monoclonal Antibodies /1980/) oraz Goding'a (patrz wyżej).

Unieśmiertelnione linie komórkowe klonuje się i wykonuje skrining w znany sposób. W supernatantach komórkowych wykrywa się przeciwciała zdolne do wiązania się z żądanymi białkami gpllO lub p25 wirusa HIV z rekombinantowymi białkami fuzyjnymi lub peptydami syntetycznymi zawierającymi żądany region epitopowy. Odpowiednie unieśmiertelnione linie komórkowe można hodować in vitro albo dokonać iniekcji do jamy otrzewnowej odpowiedniego gospodarza w celu uzyskania płynu wysiękowego.

Dla udowodnienia, że utworzyły się przeciwciała według wynalazku specyficzne dla epitopów zawartych na przykład w regionach kodowanych przez genomowy region LAV/BRU od 6688 bp do 6750 bp (kodujący peptyd29) lub od 7246 do 7317 bp (kodujący peptyd36), wykazuje się skrining supematantów porównując go z wzorcowymi monoklonalnymi przeciwciałami w tekście porównawczym (numeracja par zasad według Wein, Hobson'a Celi, 44, 9 /1985/}. Tak więc, można łatwo wytworzyć unieśmiertelnione linie komórek hybrydomy o żądanych charakterystykach wiązania, wychodząc z różnych źródeł, w oparciu o dostępność przeciwciał według wynalazku, specyficznych w stosunku do konkretnego antygenu. Alternatywnie, można dokonać fuzji tych linii komórkowych z innymi nowotworowymi limfocytami B, gdzie takie inne komórki B mogą służyć jako biorcy genomowego DNA kodującego przeciwciała.

Pomimo, iż korzystne są nowotworowe komórki B gryzoni, zwłaszcza mysie, to można również użyć do tego celu limfocyty innych gatunków ssaków, na przykład lagomorpha, bydlęce, owcze, końskie, świńskie, ptasie. Zwierzęta te można łatwo immunizować i izolować ich limfocyty, a zwłaszcza limfocyty śledziony do dalszej fuzji.

Monoklonalne przeciwciało wydzielane przez transformowane lub hybrydowe linie komórkowe wytwarzane sposobem według wynalazku może należeć do dowolnej klasy lub podklasy immunoglobulin, takich jak lgM, IgD, IgA, IgGi-4 lub IgE. Ponieważ IgG jest izotypem najczęściej stosowanym w diagnostyce, jest on często preferowany. Przeciwciała monoklonalne mogą być stosowane w całości lub jako ich fragmenty, takie jak Fv, Fab, F/ab'/2, ale zazwyczaj jako cząsteczki intaktywne.

Dla uniknięcia antygenowości w organiźmie człowieka, monoklonalnego przeciwciała pochodzącego od zwierzęcia innego niż człowiek, można skonstruować przeciwciała chimerowe, w których fragment wiążący antygen w cząsteczce tej immunoglobuliny (region zmienny) łączy się wiązaniem peptydowym z przynajmniej częścią innego białka nie rozpoznanego jako obce przez ludzi, takiego jak odrzucona część cząsteczki immunoglobuliny ludzkiej. Można tego dokonać na drodze fuzji egzonów zwierzęcych ze zmiennymi regionami z ludzkimi egzonami kappa lub gamma o stałych regionach. Techniki prowadzenia tej operacji są znane (przykładowo opis patentowy POT 86/01533, opis patentowy europejski EP nr 171496 i EP nr 173 494).

Monoklonalne przeciwciała produkowane przez linie komórkowe wytwarzane sposobem według wynalazku reagują z peptydami zdolnymi do immunologicznego imitowania (naśladowania) neutralizujących epitopów białek HIV.

Peptydy naśladujące region neutralizujący wirusa HIV oraz przeciwciała monoklonalne reagujące z tym regionem mają zastosowanie do diagnozowania, leczenia i do celów szczepień przeciw zakażeniom wirusem HIV. W tym aspekcie, termin „region neutralizujący oznacza te części wirusa HIV, zwłaszcza białek HIV zawierające segmenty aminokwasów definiujące jeden lub więcej epitopówreagującychzprzeciwcialamiiktórealbopojedyńczoalbozkombinacjizinnyffiiprze·ciwciałami mają zdolności neutralizacji infekcji HIV. Odpowiednie testy na neutralizację są znane. Należą do nich: testy zmniejszania się infekcji HIV w liniach limfocytów T, zmniejszenia liczby jednostek tworzących łysinki w pseudotypach VSV/HIV/, zawierających głikoproteiny płaszczowe wirusa HIV, testy hamowania powstawania syncytiów oraz testy wiązania wirionu z receptorem. O ile to potrzebne, aktywność neutralizującą porównuje się z reaktywnością przeciwciał w testach immunochemicznych, takich jak immunofluorescencja, barwna reakcja immunologiczna (immunoblot) oraz radioimmunoprecypitacja.

155 084

Peptydy zdolne do immunologicznego imitowania neutralizujących epitopów białek HIV złożone z poniżej 50 aminokwasów zawierają pięć lub więcej sąsiadujących ze sobą aminokwasów tworzących epitopy zasadniczo podobne do epitopów zlokalizowanych w regionach neutralizujących gpl 10 albo p25 wirusa HIV, kodowanych odpowiednio przez regiony env i gag genomu HIV. Przedmiotem szczególnego zainteresowania są regiony rozciągające się od reszty aminokwasowej 301 do 336 w gpl 10 i w peptydzie p25, od reszty 278 do 319 i od reszty 315 do reszty 363. Wszystkie te regiony pochodzą ze szczepu HIV oznaczonego jako LAV/bru· Oznaczenie reszt aminokwasowych pochodzi z Banku Danych w Los Alamos (AIDS virus seąuence database, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division, Los Alamos, NM 87545).

Jest oczywiste, że można zidentyfikować dodatkowe regiony analogiczne („homologi) pochodzące z innych izolatów HIV w oparciu o ich lokalizację w pokrewnych białkach z różnych izolatów. W praktyce, homologi te można zidentyfikować przez porównanie z danymi dla sekwencji LAVbru w sposób następujący:

/a/ można uszeregować sekwencje aminokwasowe izolatów LAVbru tak, aby otrzymać maksymalną homologię tych dwu sekwencji, /b/ można zidentyfikować peptydy zawierające sekwencje aminokwasowe izolatów HIV korespondujące z lokalizacją peptydów LAVbru, naśladujące immunologicznie białka LAVbru- Te peptydy zawierające sekwencje aminokwasowe z izolatów HIV będą immunologicznie naśladować odpowiednie białka z izolatów HIV.

Sposób ten można zastosować do szczepów HIV, które jeszcze nie zostały wykryte. Przykładowo, w przypadku wykrycia nowego szczepu wirus HIV, jego sekwencje aminokwasowe płaszcza i rdzenia porównuje się do LAV/bru tak, aby uzyskać maksymalną homologię.

Sposoby szeregowego porównywania sekwencji są znane. Przy wykonywaniu tej pracy należy utrzymać możliwie największą homologię pomiędzy cząsteczkami cysteiny. Sekwencję aminokwasową nowego szczepu HIV lub nowych gatunków, która koresponduje z logalizacją peptydów ujawnionych w opisie można syntetyzować i stosować zgodnie z wynalazkiem.

Scharf i wsp. (Science, 233, 1076 /1986/), opisali inny sposób oznaczenia sekwencji regionu homologicznego w innych szczepach HIV. W sposobie tym stosuje się dwa primery oligonukleotydowe, zawierające odmienne miejsce restrykcyjne w każdym z nich, wiążące się z sekwencjami konserwatywnymi poza interesującym regionem.

DNA ze szczepów HIV można następnie amplifikować in vitro, a otrzymane oligonukleotydy klonować w wektorach w celu analizy sekwencji i wprowadzać do szczepionki jako kasetę reprezentującą określony epitop z tego szczepu HIV.

W niniejszym wynalazku nie ma wymogu, aby epitopy zawarte w takich sekwencjach reagowały krzyżowo 'z przeciwciałami przeciw wszystkim szczepom lub gatunkom HIV. Peptydy zawierające w sobie epitopy immunologiczne, które rozróżniają konkretny gatunek lub grupę serologiczną znajdą zastosowanie do identyfikacji tych konkretnych gatunków lub grup serologicznych i mogą być pomocne przy wykrywaniu osobników zarażonych jednym lub więcej niż jednym gatunkiem lub grupę serologiczną wirusa HIV. W kombinacji z innymi peptydami pochodzącymi z regionu homologicznego lub innego regionu neutralizującego, mogą być również użyteczne do sporządzania kompozycji terapeutycznych.

Peptydy te powinny pochodzić z regionu gp 110 wirusa, a w obrębie tego regionu - powinny być kodowane w obszarze otwartej ramy odczytu env rozciągającej się od 6667 bp do 6774 bp izolatu LA V/bru, a zatem różne regiony homologiczne innych izolatów HIV zawierają sekwencje homologiczne otrzymane z Banku Danych w Los Alamos (za wyjątkiem LAV2), jak to jest przedstawione w tabeli I.

Do innych peptydów nadających się do generowania lub skriningu przeciwciał monoklonalnych należą peptydy kodowane w otwartej ramie odczytu env od 7246 bp do 7317 bp LAVbru. Takie przeciwciała i reaktywne peptydy są użyteczne, zwłaszcza do testów immunologicznych.

W regionie gag izolatu LAVbru p25 sekwencje aminokwasowe od 278 do 319 i od 315 do 363 są dodatkowymi regionami neutralizującymi wirusa HIV. Dla specjalistów jest oczywiste, że w oparciu o ujawnienia podane w niniejszym opisie można zidentyfikować dodatkowe regiony neutralizujące HIV. Aktywność neutralizującą bądą zwłaszcza wykazywały kombinacje przeciwciał monoklonalnych reagujących z wieloma różnymi epitopami HIV.

155 084

Tablica I

ΗΧΒ2

ΒΗ102

ΒΗ8

ΗΧΒ3

Η9Μ

BRU

MAL

ELI

ARV2

WMJ 2

RFENV

Z6

Z3

NY5

CDC42

LAV2

ΗΧΒ2

TGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAAAGA..................ATCCGTATC

CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysArg..................IleArglle

-----------------------------Sir--------------------------------------------------------Lys------------------------------ LYS--------------------------------------------------------Sir--------------------------------------------------------Sir----------------------------------------Gly----------ArgGly---------------------HisPhi

---Ala------TyrGln--------Gin-----------------------Thrpro—

-----------------------------Sir---------------------Tyr---------------Try------Val---ArgSir-----------------LiuSir---------------------------------Sir-------------------ThrLys

------------TyrLys---------GlnSir-----------------Thrpro---------------GlySirAspLysLysili--------------------GlnSir---------------------------Lys---Gly--------------------Ala---------------------His------------ValThrLiu..................

------------Gly---Lys---Val---Gin-------------------MitLiu

CAGAGA.........CGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATG

GlnArg.........GlyProGlyArgAlaPhiValThrIliGlyLyslliGlyAsriMet

BH102 --------------------------------------------------------------BH8 --------------------------------------------------------------ΗΧΒ3 --------------------------------------------------------------H9M --------------------------------------------------------------BRU --------------------------------------------------------------MAL -----------------------Gin LiuTyr---Thr. . .IliVal---Aspili

ELI GLyLiu-------------. . . GlnSirLiuTyrThr---Arg---IliValSirARGSir

ARV2 His---Thr---Arg---IliGlyAsp

WMJ Arg---ArgGlu. . .---IleGlylle

RFENV ValIliTyrAgaThr---Gin---IliGlyAso

Z6 GlyLiu--------------. . .GlnAlaLiuTyrThr---Arg---ArgThrLysllilli

Z3 ArgI li---------:-----------LysVal---TyrAlaLys---Gly............

NY5 GlyPro--------------. . .------ThriiuTyrAlaArgClu---------Aspili

CDC4 2 .............................ValTrpTyr---Thr---Glu---LiuGlyAsn

LAV2 MitSir--------------------HisVal---HisSirHisTyrGgnProIll---Lys

HYB2 ...AGA...GAAGCACATTGT

...Arg...GlnAlaHisCys 331

BH102 --------------------- 331

BH8 --------------------- 333

ΗΧΒ3 --------------------- 331

H9M --------------------- 331

BRU --------------------- 336

MAL ----------Arg---Tyr— 334

309

309

309

309 314

314

310

312

306

322

311

306

304

300

302

326

326

326

326

326

331

329

323

327

320

337

327

319

320 335 323

155 084

Tablica I - ciąg dalszy

ELI IlelleGly-------------330

ARV2 Ile---Lys. . .----------333

WMJ2 Ile-------------------326

RFENV Ile---Lys, , ,----------34 3

Z6 Gly. . .----------------334

Z3 IleThrGly-------------326

NY5 ----------------------325

CDC42 Ile-------------------341

LAV2 ArgProArg------Met----330

Peptyd I, oznaczony również jako peptyd29, jest kodowany w otwartej ramie odczytu enr od 308 do 328 reszty aminokwasowej. Będzie on posiadał poniższą sekwencję aminokwasową (oligopeptydy zawarte w tej sekwencji będą zawierały liniowe epitopy):

I /29/

Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-I!e-Gln-Alg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ill-Gly-Lys-Ill-Y' w której Y i Y', o ile są obecne, oznaczają sekwencje o długości do około 20 aminokwasów. Jeśli Y i /łub Y' są obecne, to mogą zawierać przykładowo jeden lub więcej aminokwasów pochodzących z sekwencji flankujących reszty aminokwasowe 308 do 328 sekwencji płaszczowych HIV lub dowolną część tych sekwencji flankujących. Przykładowo, Y może zawierać całkowitą sekwencję aminokwasową płaszcza LAVbru od 301 do 307 lub część tej sekwencji, a Y' może zawierać całą lub częściową, przedstawioną poniżej sekwencję aminokwasową LAVbru od reszty 329 do 336;

II /29a/

Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Ίhir-Arg-Lys-Slr-Ώe-Arg-Ill-GIn-Arg-Gly-Pro-Gly-AIg-Ala-Phe-ValThr-Ile-Gly-Lys-ne-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.

Alternatywnie można uzyskać skrócone („przycięte) sekwencje peptydów, z których szczególnie użyteczne są, uzyskiwane z peptydu 29, sekwencje o następującej strukturze:

III /29b/

Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Y' w której Y i /lub Y', jeżeli są obecne, oznaczają sekwencje zawierające do 20 reszt aminokwasowych, oraz

IV /29c/

Y-Iil-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile'Ύ', w której Y i Y', jeśli są obecne, oznaczają sekwencje zawierające do 20 reszt aminokwasowych.

Homologiczne regiony izolatu ARV-2, będące przedmiotem zainteresowania są kodowane w otwartej ramie odczytu enr od 306 do 323 reszty aminokwasowej. Będą one posiadać sekwencję aminokwasową V, przy czym oligopeptydy zawarte w tej sekwencji będą zawierać liniowe epitopy:

V /177/

Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Πe-Thr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phl-His-Thr-Gly-Arg-Ill-Y' gdzie Y i Y', jeśli są obecne, oznaczają od 1 do 20 reszt aminokwasowych. Y i/lub Y', o ile są obecne, mogą zawierać jedną lub więcej reszt aminokwasowych pochodzących z sekwencji flankujących reszty aminokwasowe od 306 do 323 płaszcza ARV-2 lub dowolną część tych sekwencji flankujących. Y może zwłaszcza zawierać całą lub część sekwencji aminokwasowej płaszcza HI V od 299 do 306 reszty aminokwasowej, Y' może zawierać całość lub część sekwencji aminokwasowej płaszcza HIV od reszty 324 do reszty 333.

Alternatywnie przygotowuje się skrócone („przycięte) sekwencje peptydu V. W tym przypadku, szczególnie użyteczne są sekwencja VI i VII.

VI /177a/

Y-ThrAro-T ,vs-Ser-IH-Tvr-He-Glv-Pro-Glv-Y' oraz

155 084

VII

Y-Asp-Gys-Lys-'nir-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-PiO-Ala-Ala-'nir-Leu-Glu-Glu-Leu-Nor-Leu-ThrAla-Cys-Y' w których Y i/lub Y', o ile są obecne, oznaczają sekwencje do 20, a nawet więcej aminokwasów.

Następnym przykładem są regiony homologiczne izolatu LA V-2, kodowane przykładowo w otwartej ramie odczytu env od 311 do 330 reszty aminokwasowej o następującej sekwencji:

VIII /110-2-2/

Y-Lys-Thr-V-l-]Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y' w której Y i/lub Y', jeśli są obecne, oznaczają sekwencje do 20, a nawet więcej aminokwasów (Naturę, 326, 662, 1987).

W połączeniu z opisanymi powyżej peptydami lub nautralizującymi monoklonalnymi przeciwciałami stosuje się dodatkowe peptydy lub przeciwciała przeszkadzające wiązaniu HIV z receptorami i dalej zmniejszające zaraźliwość tego wirusa. Tak zwane „peptydy blokujące posiadają właściwości hamowania proliferacji wirusa, jak również monoklonalne przeciwciała specyficzne w stosunku do epitopów zawartych w tych peptydach blokujących mogą być użyte do zwiększenia skuteczności leczenia zakażeń wirusem HIV.

Peptydy blokujące HIV na ogół korespondują z sekwencjami aminokwasowymi HIV, o których sądzi się, że są niezbędne do przyłączenia się wirusa do komórki gospodarza, takimi, jak kodowane w regionie env reszty aminokwasowe od 190 do 197 LAVbru i od 185 do 192 reszty aminokwasowej ARV-2 i HTLV-III (BH-10). Należy do nich oktapeptyd zwany peptydemT (Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr) oraz różne jego pochodne (na przykład IX, poniżej) i analogi (na przykład XI, podany poniżej) opisane przez Pert'ego i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9254-9258 /1986// zlokalizowane w glikoproteinie płaszczowej gpl 10 lub gpl20).

Przykładowo, peptydy blokujące mają następujące sekwencje aminokwasowe, często zacetylowane w końcowej grupie aminowej i zamidowane w końcowej grupie karboksylowej:

IX /177D/

Y-_dAla-Ser-'Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y'

X /186/

Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y',

XI/187/

Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y',

XII /188/

Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y',

XIII /189/

Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y',

XIV /190/

Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y',

XV /191/

Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y', przy czym, w każdym z tych peptydów Y i Y', o ile są obecne, oznaczają sekwencje aminokwasowe do 20 aminokwasów. Epitopy lub determinanty antygenowe w tych peptydach są zwykle zdefiniowane obecnością co najmniej 5 sąsiadujących ze sobą aminokwasów i znajdują zastosowanie między innymi do naśladowania naturalnie występujących miejsc antygenowych HIV i do produkcji reagujących z HIV przeciwciał i szczepionek.

Monoklonalne przeciwciała otrzymywane z linii komórkowych wytwarzanych sposobem według wynalazku wykazujące aktywność neutralizującą, takie, które reagują z miejscem epitopowym w gpl 10 lub p25 mogą również wchodzić w skład kompozycji farmaceutycznych przeznaczonych do zwalczania infekcji wirusem HIV. Kompozycja taka powinna zawierać terapeutycznie lub profilaktycznie skuteczną ilość co najmniej jednego monoklonalnego przeciwciała według wynalazku, łącznie z nośnikiem farmaceutycznym. Nośnikiem farmaceutycznym powinna być nietoksyczna substancja nie powodująca niezgodności, odpowiednia do wprowadzenia monoklonalnych przeciwciał do organizmu pacjenta. Jako nośnik można użyć sterylizowaną wodę, alkohol, tłu10

155 084 szcze, wosk i obojętne ciała stałe. Do takiej kompozycji można również wprowadzić dopuszczone w farmacji środki pomocnicze (buforujące, dyspergujące). Kompozycje te mogą zawierać pojedyńcze monoklonalne przeciwciała, specyficzne przykładowo w stosunku do szczepów HIV z glikoproteinami płaszczowymi zawierającymi miejsce epitopowe w regionie kodowanym przez pary zasad od 6688 do 6750.

Alternatywnie, kompozycja farmaceutyczna może zawierać jedno lub więcej monoklonalnych przeciwciał, tworząc mieszaninę („koktail). Taka mieszanina monoklonalnych przeciwciał przeciw różnym szczepom HIV mogłaby być produktem uniwersalnym, użytecznym w leczeniu i zapobieganiu infekcjom większością klinicznych izolatów HIV. Mieszanina taka może zawierać monoklonalne przeciwciała wiążące się z białkami lub glikoproteinami HIV innymi niż gpl 10 lub p25, takimi jak glikoproteina gp41 lub nukleozo/integraza p34.

Stosunek molowy różnych komponent monoklonalnych przeciwciał nie powinien przekraczać współczynnika 10, zazwyczaj nie przekracza wartości 5, a w praktyce wzajemny stosunek molowy poszczególnych przeciwciał wynosi 1:1-2.

Monoklonalne przeciwciała otrzymywane z linii komórkowych wytwarzanych sposobem według wynalazku można stosować jako oddzielną formę leku podawaną łącznie z innymi środkami przeciw retrowirusom, w tym z peptydami blokującymi. Obecny stan badań w grupie środków przeciw retrowirusom jest przedstawiony przez Mitsua'ę i wsp., Naturę, 325, 773-778 /1987/.

Monoklonalne przeciwciała, kompozyje farmaceutyczne zawierające te przeciwciała nadają się do podawania doustnego lub parenteralnego. Korzystnie, te kompozycje farmaceutyczne podaje się parenteralnie, to jest podskórnie, domięśniowo lub dożylnie. Tak więc sporządza się kompozyje przeznaczone do podawania parenteralnego, zawierające roztwór monoklonalnego przeciwciała, peptydu lub ich mieszaninę (koktail), rozpuszczoną w odpowiednim nośniku, na przykład w nośniku wodnym. Można stosować wiele nośników wodnych, takich jak woda, buforowane roztwory wodne, 0,4% solanka, 0,3% roztwór gliceryny i podobne. Roztwory te są sterylne i w zasadzie wolne od cząsteczek nierozpuszczalnych. Kompozycje te sterylizuje się w znany sposób. Mogą one zawierać dopuszczone do profilaktyki farmaceutycznej substancje dodatkowe wymagane dla uzyskania odpowiednich warunków fizjologicznych. Środki to ustalania pH takie jak środki buforujące, obniżające toksyczność i podobne, na przykład octan sodowy, chlorek sodowy, chlorek potasowy, chlorek wapniowy, mleczan sodowy i podobne. Stężenie przeciwciała w tych formach leku może być różne i wynosić od poniżej 0,5%, zwykle od co najmniej 1% do 15-20% (wagowo). Stężenie dobiera się zależnie od drogi podawania, uwzględniając objętość cieczy, lepkość i inne parametry.

Tak więc typowa kompozycja farmaceutyczna przeznaczona do iniekcji domięśniowych będzie zawierała 50 mg monoklonalnego przeciwciała w 1 ml sterylnego, buforowanego roztworu wodnego. Typowa kompozycja do infuzji dożylnych będzie zawierać 150 mg monoklonalnego przeciwciała i 250 ml sterylnego roztworu Ringera. Stosowane obecnie metody sporządzania kompozycji przeznaczonych do podawania parenteralnego są znane i oczywiste dla specjalistów z tej dziedziny, jak również są one szczegółowo opisane w encyklopedii „Remington'a Pharmaceutical Science*, 15 wydanie, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania /1980/.

Do celów przechowywania, monoklonalne przeciwciała i peptydy można liofilizować, a przed użyciem rekonstytuować w odpowiednim nośniku. Technika ta okazała się efektywna w przypadku konwencjonalnych immunoglobulin. Można tu stosować znane techniki liofilizacji i rekonstytuowania. Należy jednak mieć na uwadze, że liofilizacja i rekonstytucja mogą powodować obniżenie w różnym stopniu aktywności przeciwciał (przykładowo, w przypadku konwencjonalnych immunoglobulin, przeciwciała IgM wykazują większą stratę aktywności niż przeciwciał IgG), a więc, należy podać taką ilość preparatu, aby skompensować te straty.

Kompozycje zawierające monoklonalne przeciwciała, peptydy, lub ich mieszaninę, przeznaczone są do stosowania w celach profilaktycznych i/lub do leczenia infekcji wirusem HIV. Przy zastosowaniu leczniczym, kompozycje te podaje się pacjentom już zarażonym wirusem HIV w ilościach wystarczających do wyleczenia, a przynajmniej do częściowego zahamowania rozwoju choroby i powikłań z niej wynikających. Ilość tę definiuje się jako „dawkę terapeutycznie skuteczną. Ilość ta będzie zależeć od zaawansowania choroby oraz ogólnego stanu systemu immunologicznego pacjenta, lecz na ogół będzie wynosić od 1 do 200 mg przeciwciała na kilogram wagi ciała,

155 084 a zwykle będzie się stosować dawki do 5 do 25 mg/kg. Należy zaznaczyć, że substancje te na ogół będą stosowane w ciężkich stanach chorobowych, zagrażających życiu lub przynajmniej potencjalnie zagrażających życiu pacjenta. W takich przypadkach jest możliwe i zalecane podanie znacznego nadmiaru tych przeciwciał.

W celach profilaktycznych, kompozycje te podaje się pacjentom jeszcze nie zarażonym wirusem HIV, ale prawdopodobnie niedawno wystawionym na kontakt z wirusem lub posądzonym o ten kontakt, albo pacjentom z ryzykiem kontaktu z tym wirusem, w celu wzmocnienia własnej odporności pacjenta na potencjalne zakażenie albo w celu szczepień przeciw HIV. Ilość podawaną w tym celu definiuje się jako „dawkę profilaktycznie skuteczną. Również w tym przypadku konkretnie przyjęte dawkowanie będzie zależne od stanu zdrowia pacjenta i jego ogólnej odporności, na ogół jednak będzie się mieścić w granicach od 0,1 mg do 25 mg/kg, zazwyczaj od 0,5 mg do

2,5 mj^kg.

Wybór podania jednorazowego lub wielokrotnego powyższych kompozycji, wielkość dawki i sposób dawkowania powinien być dokonany przez prowadzącego lekarza. W każdym przypadku, formy leku powinny zawierać ilość przeciwciał otrzymywanych z linii komórkowych wytworzonych sposobem według wynalazku, która wystarcza do skutecznego leczenia pacjenta.

Ponadto, omawiane monoklonalne przeciwciała mogą znaleźć zastosowanie jako specyficzne w stosunku do cząsteczki docelowej nośnika (substancje targetowe). Przeciwciało można wiązać z toksyną tworząc immunotoksynę albo z materiałem radioaktywnym lub lekiem, uzyskując środek radiofarmaceutyczny lub farmaceutyczny. Metody wytwarzania immunotoksyn i radiofarmaceutyków są znane (na przykład: Cancer Treatment Reports 68, 317 /1984/).

Istnieje również możliwość, że heteroagregaty utworzone z monoklonalnych przeciwciał produkowanych przez linie komórkowe wytworzone sposobem według wynalazku i z aktywatorów ludzkich limfocytów T, takich jak monoklonalne przeciwciała przeciw antygenowi CD3 albo przeciw receptorowi Fc gamma znajdującemu się na limfocytach T, umożliwią ludzkim limfocytom T albo komórkom z receptorami Fc-gamma (takim jak komórki K lub neutrofile) niszczenie komórek zainfekowanych wirusem HIV na drodze zależnej od przeciwciała cytolizy (antibody dependent cell-mediated cytolysis /ADCC/). Takie heteroagregaty można sporządzić na przykład przez konwencyjne sieciowanie przeciwciał anty-HIV z przeciwciałami anty-CD3, stosując Nsuksynimidylo-3-/2-pirydyloditiolo/propionian jako reagent heterobifunkcjonalny (Karpowsky i wsp., J. Exp. Med., 160, 1686 /1984/.

Kompozycje opisanych powyżej peptydów jako takich, mogą również znaleźć zastosowanie lecznicze w przypadkach, gdy ich podanie spowoduje zmniejszenie infekcji lub eliminację wirusa HIV z organizmu gospodarza. Takie kompozycje, zawierające peptyd 29, peptydy blokujące oraz peptyd 126 (ten ostatni ujawniony w opisie zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych nr 930 785 będącego w toku) można podawać w odpowiednich nośnikach fizjologicznych dożylnie, podskórnie, domięśniowo, dootrzewnowo lub inną drogą. Jako nośniki można stosować sól fizjologiczną buforowaną fosforanem, sól fizjologiczną, wodę, chlorek potasowy, mleczan sodowy lub inne znane środki. Stężenie peptydów w tych kompozycjach będzie różne, zależne od przeznaczenia, aktywności i drogi podania. Korzystnie, w peptydach tych, końcową grupę karboksylową przeprowadza się w grupę amidową, końcową grupę aminową formyluje się lub sporządza inne pochodne dopuszczalne w praktyce farmaceutycznej. Dodanie peptydów blokujących do peptydów naśladujących region neutralizujący HIV i/lub specyficznie reagujących przeciwciał otrzymywanych sposobem według wynalazku będzie znacznie zwiększać ich skuteczność leczniczą. W omawianych formach leku można stosować również inne środki przeciw wirusowi HIV (poza monoklonalnymi przeciwciałami, które wiążą peptydy), takie jak 3'-azydo-3'-dezoksytymidynę, 2',3'-didezoksycytydynę, 2',3'-didezoksy-2',3'-didehydrocyiydynę i podobne związki.

Zastosowanie monoklonalnych przeciwciał produkowanych przez linie komórkowe wytworzone sposobem według wynalazku, do oczyszczania z wykorzystaniem powinowactwa immunologicznego.

Monoklonalne przeciwciała specyficzne w stosunku do polipeptydów zawierających gp 110 lub innych determinant antygenowych, zwłaszcza tych determinant antygenowych, które otrzymuje się z rekombinantowych białek fuzyjnych wytwarzanych przez ekspresję biologiczną albo z liz.atów lub ekstraktów hodowli HIV są szczególnie przydatne w procesie oczyszczania. W zasadzie, przeciwciała te będą się charakteryzować asocjacyjnymi stałymi powinowactwa rzędu 10⁸ do l0¹²m.

155 084

Przeciwciała te mogą być stosowane do oczyszczania rekombinantowych białek fuzyjnych z brzeczki hodowlanej rekombinantowego układu ekspresyjnego w przypadku, gdy białko jest wydzielane poza komórki albo z komponent rozerwanego biologicznego układu ekspresyjnego jeśli białko nie jest wydzielane poza komórkę. Na ogół monoklonalne przeciwciała zdolne do reakcji z gpl 10 lub innymi determinantami antygenowymi przyłącza się do substratu bądź nośnika albo unieruchamia na nośniku. Następnie, roztwór zawierający determinanty antygenowe HIN kontaktuje się z unieruchomionym przeciwciałem w warunkach odpowiednich do powstania kompleksów immunologicznych pomiędzy przeciwciałem a polipeptydami zawierającymi determinanty antygenowe gp 110. Niezwiązany materiał oddziela się od związanych kompleksów immunologicznych, i następnie kompleksy te albo fragmenty antygenowe gpl 10 oddziela się od nośnika.

Na ogół, przed osadzeniem na nośniku, monoklonalne przeciwciała wstępnie oczyszcza się z płynu wysiękowego lub supernantów hodowli komórkowych. Procedura ta jest znana specjalistom i obejmuje frakcjonowanie w roztworach objętych soli o wysokim stężeniu. Do oczyszczania monoklonalnych przeciwciał przed ich użyciem jako immunoadsorbantów można stosować również inne metody, takie jak chromatografię DEAE, chromatografię filtracji żelowej, preparatywną elektroforezę żelową lub chromatografię powinowactwa do białka A.

Nośnik, na któiym unieruchamia się monoklonalne przeciwciała powinien charakteryzować się następującymi właściwościami:

/a/ słabą ogólną interakcją z białkami dla zmniejszenia do minimum wiązania niespecyficznego;

/b/ dobrą charakterystyką płynięcia, umożliwiającą przepływ materiałów o wysokim ciężarze cząsteczkowym;

/c/ powinien posiadać grupy chemiczne, które można aktywować lub modyfikować, umożliwiając wiązanie chemiczne monoklonalnych przeciwciał;

/d/ stabilnością fizyczną i chemiczną w warunkach stosowanych do wiązania monoklonalnych przeciwciał oraz /e/ niewrażliwością na warunki i bufory stosowane przy adsorpcji i eluowaniu antygenu. Do powszechnie stosowanych nośników należy agaroza, derywatyzowane polistyreny, polisacharydy, perełki poliakryloamidowe, aktywowana celuloza, szkło i podobne. Istnieją różne metody chemiczne przyłączania przeciwciał do nośników (Cuatrecasas P, Advances in Enzymology, 36, 29 /1972/).

Przeciwciała produkowane przez linie komórkowe wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być przyłączane do nośnika bezpośrednio, albo poprzez linker, albo poprzez ramię.

Ogólne warunki wymagane do immobilizacji monoklonalnych przeciwciał na nośnikach chromatograficznych są znane (na przykład Tijssen P., Practice and Theory of Enzyme immunoassay, 19185). W praktyce, procedury sprzęgania będą tylko w niewielkim stopniu zależeć od charakterystyki i typu sprzęganego przeciwciała. Monoklonalne przeciwciała charakteryzują się właściwościami, które na ogół utrzymują się na stałym poziomie w poszczególnych szarżach, co pozwala na optymalizację warunków procesu. Przyłączenie odbywa się na ogół poprzez wiązania kowalencyjne.

Następnie do takiej matrycy dodaje się zawiesinę ekstraktów lub lizatów HIV bądź supernatanty pochodzące z hodowli biologicznych układów ekspresyjnych albo zawiesiny rozbitych komórek i mieszaninę inkubuje się w warunkach i w czasie pozwalającym na utworzenie się kompleksu immunologicznego, a więc, przez co najmniej 30 minut, a zazwyczaj 2 do 24 godzin. Następnie z mieszaniny wydziela się kompleksy zawierające polipeptydy z częściami antygenowymi gpl 10. Zwykle, mieszaninę usuwa się przez eluowanie i związane kompleksy immunologiczne ekstensywnie wymywa się buforem adsorpcyjnym. Następnie kompleksy te ełuuje się z matrycy stosując eluant odpowiedni do danego nośnika. Eluanty takie są znane. Można również selektywnie usunąć polipeptydy zawierające gpl 10 lub inne składniki antygenowe. Przykładowo, do konkurencyjnego wiązania z przeciwciałem można użyć peptydy zawierające epitop rozpoznawany przez te przeciwciała. Jest to alternatywna technika eluowania, którą można prowadzić w łagodnych warunkach. Selektywnie zaadsorbowany polipeptyd zawierający antygen gpl 10 można eluować z kompleksu przeciwciał-adsorbant przez zmianę pH i/lub siły jonowej buforu.

Do usunięcia związanego antygenu można również użyć środki chaotropowe. Wybór odpowiedniego środka chaotropowego, jego stężenia i innych parametrów eluowania zależy od charak155 084 terystyki wzajemnego działania przeciwciało-antygen lecz oznaczone raz, nie powinny być zmieniane, tak jak się to dzieje w poliklonalnych systemach rozdziału metodą powinowactwa.

Eluowany materiał może wymagać doprowadzenia pH do wartości fizjologicznej, o ile pH jest za niskie lub za wysokie lub też, dla oddzielenia związanych antygenów gpl 10 od matrycy stosuje się bufory o odpowiedniej sile jonowej. Może być również potrzebna dializa lub chromatografia filtracji żelowej dla usunięcia nadmiaru soli użytej w roztworze eluującym, dla umożliwienia rekonstytucji gpl 10 lub polipeptydów zawierających fragmenty antygenowe gpl 10 do pierwotnej konformacji.

Można uzyskać w zasadzie oczyszczone gpl 10 lub polipeptydy zawierające antygenowe fragmenty tej glikoproteiny wytwarzane bądź w sposób naturalny w zakażonych hodowlach komórkowych, bądź w rekombinantach układach ekspresyjnych: bakteryjnych, drożdżowych lub w hodowlach owadów lub komórek ssaków. Czystość gpl 10 i powyższych fragmentów lub innych oczyszczonych białek, jaką uzyskuje się w tej procedurze na ogół przewyższa 50%, zazwyczaj wynosi przynajmniej 75%, a często przewyższa 95 do 99%. Tak oczyszczone cząsteczki mogą znaleźć następne wielorakie zastosowanie.

Białko gpl 10 wirusa HIV, polipeptydy zawierające antygenowe fragmenty tego białka lub inne białka oczyszczone, mogą być użyte do wielu celów, w tym do produkcji szczepionek podjednostkowych przeciw AIDS, w których immunogen zawiera skuteczną dawkę determinant antygenowych, na przykład glikoproteiny gpl 10 lub jej regionu neutralizującego. Do innych składników tej szczepionki należą te antygenowe cząsteczki białek lub glikoprotein HIV, które stymulują wytwarzanie przeciwciał (korzystnie przeciwciał neutralizujących) przed następną infekcją wirusem HIV.

Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych produkowanych przez linie komórkowe wytwarzane sposobem według wynalazku w diagnostyce.

Monoklonalne przeciwciała nadają się również do celów diagnostycznych. W tym celu mogą być znakowane lub nieznakowane. Na ogół, w próbie diagnostycznej wykrywa się tworzenie się kompleksu poprzez wiązanie monoklonalnego przeciwciała z antygenem HIV. Nieznakowane przeciwciała mają zastosowanie na przykład w testach aglutynacji. Mogą one być ponadto stosowane w połączeniu z innymi znakowanymi przeciwciałami (drugimi przeciwciałami) reagującymi z monoklonalnym przeciwciałem, takimi jak przeciwciała przeciw immunoglobulinie. Alternatywnie, monoklonalne przeciwciała można bezpośrednio znakować. Można w tym celu stosować wiele środków znakujących, takich jak redionuklidy, fluorescery, enzymy, substraty enzymów, kofaktory enzymów, inhibitory enzymów, ligandy (zwłaszcza hepteny) i podobne. Dostępnych jest wiele testów immunologicznych. Przykłady takich testów są podane w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3 817 827, 3 850752, 3901654, 3935074, 3984533, 3996 345, 4034074 oraz 4 098 876.

Na ogół, monoklonalne przeciwciała i peptydy stosuje się w enzymatycznych testach immunologicznych, tam, gdzie przeciwciała te albo drugie przeciwciała z innych gatunków łączy się z enzymem. Jeśli próbkę biologiczną zawierającą antygeny HIV, taką jak surowica ludzka, ślina, nasienie, wymazy pochwowe lub zawiesinę hodowli komórek zakażonych wirusem łączy się z tymi przeciwciałami, wtedy następuje wiązanie przeciwciał z tymi cząsteczkami, które posiadają żądany epitop. Takie białka lub cząsteczki wirusowe oddziela się od niezwiązanych reagentów i dodaje drugie przeciwciało (oznakowane enzymem). Następnie oznacza się obecność koniugatu przeciwciało-enzym specyficznie związanego z antygenem. Można również stosować inne znane techniki.

Do wykrywania infekcji wirusem HIV lub obecności antygenu HIV sporządza się zestawy, w których stosuje się przeciwciała wytwarzane przez linie komórkowe wytwarzane sposobem według wynalazku. W skład takich zestawów wchodzą kompozycje monoklonalnych przeciwciał, zwykle w postaci liofilizowanej, albo jako takie, albo w połączeniu z dodatkowymi przeciwciałami specyficznymi w stosunku do innych epitopów H1V. Przeciwciała, które mogą być skoniugowane lub nieskoniugowane ze środkiem znakującym umieszcza się w zestawach łącznie z buforami, takimi jak tris, fosforany, węglany i podobne, stabilizatorami, biocydami, białkami obojętnymi, na przykład z albuminą surowicy bydlęcej. Na ogół, materiały te są obecne w ilości poniżej 5% w stosunku do ilości aktywnego przeciwciała, zazwyczaj stanowią łącznie co najmniej 0,001% stężenia przeciwciała. Często dodaje się obojętnego wypełniacza lub rozcieńczalnika dla rozcieńczenia składników aktywnych. W tych przypadkach zawartość rozcieńczalnika może wynosić od 1 do 99% ogólnej wagi kompozycji.

15S 684

Jeśli stosuje się drugie przeciwciało mające zdolności wiązania z monoklonalnym przeciwciałem, to jest ono na ogół umieszczone w oddzielnej fiolce. Drugie przeciwciało jest zwykle związane ze środkiem znakującym i przygotowane w postaci formy farmaceutycznej w sposób analogiczny jak formy przeciwciał opisane powyżej.

Wykrywanie antygenów gpllO lub p25 albo całych wirusów w różnych próbkach biologicznych może być stosowane do diagnozowania bieżących infekcji wirusem HIV. Takie próbki biologiczne mogą obejmować surowicę krwi, ślinę, nasienie, próbki z bipsji tkankowych (mózg, skóra, węzły limfatyczne, śledziona), supernatanty hodowli komórkowych, rozerwane eukariotyczne i bakteryjne układy ekspresyjne i podobne. Testy na obecność wirusa wykonuje się inkubując monoklonalne przeciwciało z próbką biologiczną w warunkach prowadzących do powstawania kompleksu immunologicznego i następnie wykrywa się powstanie takiego kompleksu.

Jednym sposobem wykrywania powstania kompleksu jest użycie drugiego przeciwciała zdolnego do wiązania z monoklonalnym przeciwciałem, które jest skoniugowane ze środkiem znakującym i przygotowane w postaci formy farmaceutycznej w sposób opisany powyżej dla form przeciwciał. W innym sposobie monoklonalne przeciwciało jest osadzone w stałym nośniku, który kontaktuje się z próbką materiału biologicznego. Po etapie inkubacji, dla wykrycia związanego antygenu dodaje się znakowane monoklonalne przeciwciało. Przeciwciała produkowane przez linie komórkowe wytwarzane sposobem według wynalazku mają zdolności rozpoznawania peptydów, które peptydy, między innymi naśladują immunologicznie epitopy kodowane przez retrowirusa HIV, zwłaszcza epitopy kodowane w regionach env lub gag genomu wirusowego, kodującego odpowiednio gpllO i p25. Dla wyrównania różnic między szczepami pochodzącymi z różnych izolatów, można przeprowadzić adiustację substancji konserwatywnych i selekcję tych spośród tych, w których występują substytucje niekonserwatywne. Peptydy te można użyć jako immunogeny dla zahamowania lub wyeliminowania produkcji antygentu HIV in vitro lub in vivo, do wykrywania wirusów lub przeciwciał przeciw tym wirusom w próbkach materiału biologicznego.

Zależnie od rodzaju postępowania, peptydy mają być skoniugowane z nośnikiem lub innymi związkami, znakowane lub nieznakowane, lub też związane ze stałą powierzchnią. Peptydy te pochodzą z regionu gpl 10 wirusa, a zwłaszcza z otwartej ramy odczytu regionu eav, rozciągającej się od 6688 pary zasad bp do 6750 bp i od 7246 bp do 7317 bp. Peptydy te, w tym również peptydy blokujące, zawierają co najmniej 5, czasem 6, czasem 8, czasem 12, czasem 21, na ogół poniżej 50, zwykle poniżej 35, a korzystnie poniżej 25 aminokwasów w sekwencji kodowej retrowirusa HIV. Korzystne jest aby peptydy te były tak małe jak to tylko możliwe, zachowując jednak przy tym w zasadzie całkowitą reaktywność immunologiczną lub przeciwwirusową większego peptydu. W niektórych przypadkach korzystne jest połączenie dwóch lub więcej oligopeptydów nie pokrywających się wzajemnie z utworzeniem struktury pojedyńczego peptydu albo użycie ich jako odrębnych pepdytów. Razem lub oddzielnie, stanowią one równoważnik immunologiczny peptydu macierzystego.

Peptydy te można modyfikować, wprowadzając podstawienia konserwatywne bądź niekonserwatywne, stanowiące na ogół poniżej 20% a zwykle poniżej 10% liczby wymienianych aminokwasów. W tych przypadkach, gdzie regiony wykazują polimorfizm, korzystna jest zamiana jednego lub kilku aminokwasów w celu bardziej efektywnego naśladowania zmiennych epitopów różnych szczepów retrowirusa. W wielu przypadkach, dla uzyskania stabilności chemicznej, metioninę zastępuje się norleucyną /NOR/.

Zaznacza się, że stosowane peptydy nie muszą być identyczne z jakąkolwiek sekwencją polipeptydową HIV tak długo, jak długo dany związek może konkurować pod względem immunologicznym z przynajmniej jednym szczepem wirusa HIV.

Peptydy te mogą być zatem przedmiotem różnych zmian, takich jak insercję, delecje i podstawienia, konserwatywne bądź niekonserwatywne, jeśli zmiany te dadzą korzyści w ich stosowaniu. Za konserwatywne podstawienia przyjmuje się podstawienia w obrębie grup takich jak gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; oraz nor, met. Zmieniona sekwencja nie powinna różnić się bardziej niż 20% od sekwencji przynajmniej jednego szczepu retrowirusa HIV, chyba, że zostały oddane dodatkowe aminokwasy na którymś końcu służące jako „ramię, za pomocą którego peptyd ten unieruchamia się na nośniku. Takie ramię może składać się z 1do 50, a nawet więcej aminokwasów, najczęściej konstruuje się ramiona o długości 1 do 10 aminokwasów.

15S®84

Peptyd, w którym została zmodyfikowana sekwencja aminokwasowa przez podstawienie, addycję lub delecję reszt aminokwasowych, powinien zachować zasadniczo całkowitą reaktywność immunologiczną lub przeciwwirusową peptydu niemodyfikowanego, co można łatwo oznaczyć, stosując ujawnione w opisie techniki testowania. Dla modyfikacji właściwości biologicznych, takich jak aktywność, szybkość rozpadu i podobne, można również użyć jeden lub więcej aminokwasów w formie izomerycznej-D.

Ponadto, dla modyfikacji fizycznych lub chemicznych własności peptydu lub oligopeptydu, w celach, które są omawiane poniżej, na końcach tego peptydu lub oligopeptydu można dodać jeden, dwa lub więcej aminokwasów, co ułatwia wiązanie peptydów między sobą, oraz wiązanie z nośnikiem lub z większym peptydem.

W celu w$3®^SMŁz^nia grup funkcyjnych potrzebnych do wiązania, umieszcza się na końcach z grupą karboksylową lub aminową peptydu lub oligopeptydu aminokwas takiej jak tyrozyna, cysteina, lizyna, kwas glutaminowy lub asparginowy. Cysteina jest szczególnie korzystna dla ułatwienia wiązania kowalencyjnego z innymi peptydami albo do wytworzenia polimerów przez utlenianie.

Sekwencje peptydowe lub oligopeptydowe mogą różnić się ponadto od sekwencji pochodzenia naturalnego tym, że mają zmodyfikowane sekwencje na przykład przez acylację końcowej grupy aminowej, lub zamidowanie kwasu tioglikolowego, zamidowanie końcowej grupy karboksylowej amoniakiem lub metyloaminą, uzyskując przez to stabilność, i zwiększoną hydrofobowość - cechy potrzebne do wiązania z nośnikiem lub z inną cząsteczką lub do polimeryzacji. Tak więc, w ujawnionych peptydach I-VIII i IX-XV jeśli obecne są podstawniki Y i Y', to na ogól oznaczają jedną lub więcej reszt cysteinowych lub kombinację jednej lub więcej grup cysternowych z resztą aminokwasową stanowiąc ramię do dalszych procesów.

Szczególnie dobrym aminokwasem będącym ramieniem jest glicyna. Korzystnymi peptydami do użycia w polimeryzacji utleniającej są te, w których Y i Y' oznacza co najmniej dwie reszty cysteinowe. Jeśli na tym samym końcu peptydu znajdują się dwie reszty cysteinowe, to korzystne jest, aby były one od siebie oddzielone jedną do trzech, stanowiących ramię, reszt aminokwasowych, korzystnie glicyną. Obecność reszt cysteinowych pozwala na tworzenie dimerów danego peptydu i/lub zwiększa hydrofobowość otrzymanego peptydu, co ułatwia unieruchomienie go w fazie stałej lub ułatwia testy oparte na immobilizacji.

Szczególne znaczenie ma użycie grupy merkaptanowej cysteiny lub kwasu glikolowego, stosowanych do acylowania końcowych grup aminowych lub podobnych do wiązania dwóch peptydów lub oligopeptydów lub ich kombinacji wiązaniami disulfidowymi lub dłuższymi, z utworzeniem polimerów posiadających wiele epitopów. Polimery takie odznaczają się zwiększoną reaktywnością immunologiczną. Jeśli do wytworzenia polimeru używa się różnych peptydów, to posiadają one dodatkową zdolność indukowania przeciwciał, które reagują immunologicznie z kilkoma antygenami determinantami różnych izolatów HIV.

Dla uzyskania polimerów antygenowych (syntetycznych multimerów) stosuje się związki posiadające grupy bis-chlorowcoacetylowe, halogenki nitroarylowe i podobne, tam, gdzie reagenty są specyficzne w stosunku do grup tiolowych. A zatem, połączeniem dwóch grup merkaptanowych należących do różnych peptydów lub oligopeptydów może być pojedyńcze wiązanie lub grupa mostkowa, złożona z co najmniej 2, na ogół przynajmniej 4, ale nie więcej niż 16, zwykle nie więcej niż 14 atomów węgla.

Omawiane peptydy mogą być stosowane w postaci związanej z rozpuszczalnym nośnikiem wielkocząsteczkowym (nie mniejszym niż 5 kilodaltonów). Nośnikiem takim może być poli/aminokwas/, występujący w stanie naturalnym albo syntetyczny, w stosunku do którego nie występują przeciwciała w surowicy ludzkiej.

Przykładami takich nośników są: poli-L-lizyna, hemocyjanina z pijawek, tyreoglobulina, albuminy, takie jak albumina z surowicy bydlęcej, toksoid tężca i podobne. Wybór nośnika w pierwszym rzędzie zależy od przeznaczenia antygenu oraz łatwości wykonania operacji i dostępności tego nośnika.

W takich koniugatach powinna występować przynajmniej jedna cząsteczka co najmniej jednego peptydu w makrocząsteczce ale nie więcej niż jedna na 0,5 kilodaltona. Zwykle nie więcej niż 1 na 2 kilodaltony makrocząsteczki można przyłączyć jeden lub więcej różnych peptydów.

155 084

Stosuje się tu konwencjonalny sposób wiązania, z użyciem takich reagentów jak kwas pmaleimidobenzoesowy, kwas p-metyloditiobenzoesowy, bezwodnik kwasu maleinowego, bezwodnik kwasu bursztynowego, aldehyd glutarowy i podobne. Wiązanie może występować przy końcu aminowym, karboksylowym albo w miejscu pośrednim w stosunku do końców cząsteczki. Peptyd można derywatyzować przez wiązanie, można go również sprzęgać w stanie związanym z nośnikiem.

Dla wykrycia obecności przeciwciał przeciw białkom retrowirusa lub samych białek retrowirusowych stosuje się różne testy, podobne do znanych. Przydatne jest zwłaszcza użycie peptydu jako znakowanego reagenta, w którym znakowanie daje możliwy do detekcji sygnał albo wiązanie tego peptydu bezpośrednio lub pośrednio na powierzchni, dzięki czemu, przeciwciało przeciw temu peptydowi w badanej próbce będzie z tym peptydem na tej powierzchni. Obecność ludzkiego przeciwciała związanego z peptydem wykrywa się następnie stosując ksenogeniczne przeciwciało przeciw ludzkiej immunoglobulinie, na ogół obydwie ludzkie IgM i IgG albo znakowane białko specyficzne w stosunku do kompleksów immunologicznych, na przykład czynnika Rf białka A z

S.aureus.

Ilustracją techniki testowania jest użycie pojemnika próbek, to jest wgłębień w płytce plastykowej do mikrotestów, w których to wgłębieniach polipeptyd lub jego koniugaty adsorbuje się na dnie i/lub ściankach zagłębienia kowalentnie lub niekowalentnie. Następnie do zagłębień dodaje się ludzką krew lub surowicę, rozcieńczone odpowiednim buforem i pozostawia na okres potrzebny do powstawania kompleksu między polipeptydem i pokrewnymi przeciwciałami w próbce. Następnie usuwa się supernatant; zagłębienia przemywa w celu usunięcia niezwiązanych swoiście białek. Do detekcji stosuje się znakowane, wiążące się swoiście białko, które wiążące się z utworzonym kompleksem, takim jak ksenogeniczna antysurowica przeciw immunoglobulinie ludzkiej.

Omawiane peptydy wytwarza się stosując różne drogi syntezy. Ponieważ są to peptydy stosunkowo krótkie, syntetyzuje się je w roztworze albo na stałym nośniku, zgodnie z obecnie stosowanymi technikami. W pracy tej można zastosować różne automatyczne syntetyzery, dostępne obecnie w handlu. Patrz Stewart i Young, „Slid Phase Peptide Synthesis, 2 wyd., Pierce Chemical Co., 1984 oraz Tam i wsp., J. Am. Chem. Soc. 105, 6442 /1983/.

Alternatywnie można zastosować technologię hybrydowego DNA. W technologii tej przygotowuje się syntetyczny gen stosując pojedyńcze nici kodujące ten polipeptyd lub nici komplementarne, na które nakładają się nici pojedyńcze i są ze sobą łączone w odpowiednim roztworze do hybrydyzacji. Zhybrydyzowane nici poddaje się ligacji z utworzeniem kompletnego genu, dobierając odpowiednie końce. Gen taki wprowadza się do wektorów ekspresyjnych, obecnie łatwo dostępnych. (Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manuał, CSH. Cold Sprong Harbor Laboratory, 1982).

Następną techniką jest klonowanie regionu genomu wirusowego kodującego peptyd znanymi sposobami rekombinacji DNA (patrz Maniatis, jak wyżej). Do ekspresji peptydów można używać sekwencje kodujące DNA z izolatorów LAVbru i ARV-2 wirusa HIV o następującej strukturze:

LAVbru TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC CGT ATC CAG AGG GGA CCA GGG AGA GCA TTT GTT ACA ATA GGA AAA ATA GGA AAT ATG AGA CAA GCA CAT TGT.

ARV-2 TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC ATA ATA GGA CCA GGG AGA GLA TTT CAT ACA ACA GGA AGA ATA ATA GGA GAT ATA AGA AAA GCA CAT TGT.

Do ekspresji fragmentów peptydowych stosuje się fragmenty tych sekwencji. Można również dokonać konserwatywnych zmian zasad tam, gdzie zmodyfikowany kodon koduje ten sam aminokwas albo zmiany niekonserwatywnych w sekwencji kodującej, przy czym, otrzymany aminokwas może stanowić zmianę konserwatywną lub niekonserwatywną w sekwencji aminokwasowej, co jest omówione powyżej.

Sekwencję kodującą można wydłużyć na końcu 5' albo 3' albo na obydwu końcach, wydłużając tym samym wytwarzany peptyd, i zachowując jego miejsce epitopowe. Celem wydłużenia jego dobudowa „ramienia służącego do wiązania, na przykład z czynnikiem znakującym, takim jak enzym, połączenie dwóch lub wszystkich peptydów w jeden łańcuch dla uzyskania aktywności antygenowej lub uzyskanie dogodnych miejsc restrykcyjnych do klonowania.

155 084

Sekwencje DNA jako takie, fragmenty lub większe sekwencje z tych sekwencji DNA o długości co najmniej 15 zasad, korzystnie co najmniej 18 zasad stosuje się jako sondy nukleotydowe do detekcji retrowirusowego RNA lub prowirusowego DNA albo do identyfikacji regionów homologicznych do klonowania lub sekwencjonowania. Do tego celu służą różne techniki, takie jak technika Grunsteina-Hognessa, technika Southerna, technika Northerna, technika „dot-blot“ oraz ich ulepszenia oraz inne metodologie takie jak ujawniona w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 358 535.

Omawiane peptydy mają w szczepionkach zastosowanie jako takie albo w kombinacjach. Jako szczepionki można również stosować przeciwciała anty-idiotypowe to jest, reagujące z itiotypami przeciwciał produkowanych przez linie komórkowe wytwarzane sposobem według wynalazku, a zatem posiadające epitopy naśladujące regiony neutralizujące HIV. Peptydy te oraz przeciwciała anty-idiotypowe przygotowuje się w postaci form farmaceutycznych w znany sposób, na ogół w dawkach od 1 pg do 20 mg/kg wagi gospodarza. Jako nośniki stosuje się tu dopuszczalne fizjologicznie środki, takie jak sterylizowana woda, płyn fizjologiczny, płyn fizjologiczny buforowany fosforanem i podobne. Można również stosować środki pomocnicze, takie jak żel wodorotlenku glinu, substancje powierzchniowo-aktywne, takie jak izolecytyna, pluorono-poliole, poliaminy, peptydy, białka (na przykład toksyny błonicy lub cholery) oraz emulsje olejowe. Peptydy te można również wprowadzać do liposomów lub koniugować z polisacharydami, polipeptydami lub polimerami i stosować je w szczepionkach. Szczepionki te podaje się parenteralnie, to jest domięśniowo, dootrzewnowo, podskórnie i dożylnie. Dawkę skuteczną immunogenicznie podaje się jednorazowo albo wielokrotnie, na ogół z przerwami od jednego do 4 tygodni. „Dawką efektywną immunogenicznie jest ilość szczepionki potrzebna do wywołania odpowiedzi immunogicznej gospodarza, z objawami zwiększonej infekcji.

Wynalazek zostanie bliżej objaśniony w przykładach wykonania, które ilustrują wynalazek.

Przykład I. Wytwarzanie i charakteryzowanie przeciwciał monoklonalnych.

W przykładzie tym jest opisany sposób wytwarzania hybrydowych linii komórkowych produkujących monoklonalne przeciwciała specyficzne w stosunku do glikoprotein płaszcza HIV. W sposobie tym, jako immunogen stosuje się oczyszczone na lektynie ekstrakty LAVbru przyłączone do lektynoagarozy z soczewicy. Następnie, monoklonalne przeciwciała generowane przez hybrydowe linie komórkowe charakteryzuje się w próbie „immunoblot i na zdolność radioimmunologicznej precypitacji gpl 10 z oczyszczonego LAV oraz jako rekombinantowe białko fuzyjne wytwarzane na drodze ekspresji biologicznej. Monoklonalne przeciwciała wiążące się z epitopami na gpl 10 są również reaktywne w próbach ELISA z rozerwanymi całymi wirusami, z białkami fuzyjnymi i peptydami syntetycznymi i reagują z. całym wirusem w pośrednich próbach fluorescencji.

Sposób wytwarzania hybrydowych linii komórkowych produkujących monoklonalne przeciwciała i charakteryzowanie tych przeciwciał jest następujące:

Wirus LAV wyizolowany z zakażonych komórek CEM (ATCC nrGRL8904) poddaje się rozerwaniu w roztworze o składzie: 50 M Tris (pH7,4), 0,15 M NaCl, 1,0% aprotyniny, 2,0% odczynnika „Nonidet 2-40^/R/ /NP-40, oktylofenoksypolietoksyetanol/. Ekstrakt klaruje się dwukrotnie przez wirowanie i doprowadza do stężenia 0,5% NP-40 przez dodanie trzech objętości powyższego buforu, ale bez NP-40. Lektyno-agarozę z soczewicy /Pharmacia, Piscataway. N.J./ przemywa się wstępnie buforem do rozrywania bez NP-40 i doprowadza do stanu równowagi w buforze adsorpcyjnym o składzie: 50 mM Tris (pH 7,3),= 15 M NaCl, 1,0% aprotyniny, 0,5% NP-40. Sklarowany ekstrakt wirusowy adsorbuje się na lektyno-agarozie z soczewicy w czasie 42 godzin w temperaturze 4°C. Materiał niezaadsorbowany usuwa się przez wymywanie nadmiarem buforu adsorpcyjnego. Materiał zaadsorbowany eluuje się 0,2 M roztworem a-metylomannozydu w buforze adsorpcyjnym. Eluent dializuje się wobec PBS dla usunięcia cukru i uzyskany materiał powtórnie adsorbuje się na lektynosefarozie.

Kompleks: glikoproteina - lektyno - sefaroza z soczewicy, stosuje się do immunizacji myszy szczepu BALB/o, podając trzy dootrzewnowe iniekcje bez adiuwanta w odstępach 2-3 tygodniowych. Śledziony pobiera się od myszy, które wykazują obecność będących w obiegu przeciwciał glikoproteinom HIV w próbach „immuboblot, RIP i/lub ELISA.

Generowanie linii komórkowych prowadzi się w zasadzie w sposób opracowany przez Kohlera i Milsteina (Naturę, 256, 495 /1985/ z modyfikacjami Goldsteina L.C. i wsp., /Infect.

155 084 immunol. 38, 273 /1982/). Limfocyty B ze śledziony immunizowanych myszy poddaje się fuzji z komórkami szpiczaka NS-1 wobec 40% (wag./obj.) glikolu polietylanowego. Po fuzji mieszaninę komórek zawiesza się w pożywce HAT (pożywka ROMI-1640 wzbogacona ilością 15% płodowej surowⁱc^y cⁱe^lęcej^, 1 X HrM hipoksantyny,4^χ K)'⁷mamⁱno^pter^yn^{yi 1,6}X Μ⁵ M t^ym^idyn^y), ^dla wytworzenia warunków selekcyjnych pozwalających na wzrost tylko komórek hybrydowych, po czym mieszaninę taką rozlewa się do zagłębień w płytkach do rnikrohodowli o 96 zagłębieniach, w stężeniu 1 do 3 X 10“ komórek /ml i prowadzi inkubację w temperaturze 37°C w nawilżanej atmosferze o zawartości 6% CO2. Hodowle żywi się przez wymianę połowy supematantu świeżą pożywką HAT. Zagłębienia obserwuje się w mikroskopie inwersyjnym śledząc oznaki proliferacji komórek i po osiągnięciu wystarczającej gęstości komórek supernatanty testuje się na obecność przeciwciał anty LAV.

Zagłębienia zawierające komórki hybrydowe produkujące przeciwciała przeciw LAV identyfikuje się w próbie ELISA, oznaczając ich wiązanie albo z całym oczyszczonym, rozerwanym wirusem, albo z białkami fuzyjnymi wytwarzanymi przez ekspresję biologiczną. Próbkę ELISA z wykorzystaniem rozerwanych wirusów prowadzi się na płytkach LAV EIA (Genetic Systems, Seattle, Washington). Płytki z płynem hodowli komórek inkubuje się w temperaturze 37°C przez 45 minut, a następnie trzykrotnie wymywa roztworem 0,05% Tween 20 w solance buforowanej fosforanem (PBS-Tween).

Dodaje się peroksydazę - kozią IgG przeciw myszy (rozcieńczenie 1: 2000 w PBS-Tween, Tymed Laboratories, Inc., South San Francisco, California /w ilości 100pl na zagłębienie, po czym płytki inkubuje się przez 45 minut w temperaturze 37°C i przemywa jak wyżej. Następnie dodaje się substrat (0,025 M kwasu cytrynowego, 0,05 M dwuzasadowego fosforanu sodowego (pH 5,0) oraz 14 mg o-fenylodwuaminy i 10 μΐ 30% nadtlenku wodoru w 50 ml i prowadzi inkubację płytek przez 30 minut, w temperaturze pokojowej, w ciemności. Reakcję zatrzymuje się 3N kwasem siarkowym i wykonuje się odczyty reakcji kolorymetiycznej w automatycznym czytniku do mikropłytek. Wgłębienia dające wyniki dodatnie poddaje się dalszemu subklonowaniu, stosując rozcieńczenia graniczne, powtórnie oznacza się specyficzność i namnaża się.

Monoklonalne przeciwciała wydzielane przez otrzymane linie komórek hybrydowych charakteryzuje się następnie, oznaczając ich swoistość i reaktywność w testach „immunoblot, immunoprecypitacji i ELISA z użyciem rozerwanych wirusów LAV, rekombinantowych białek fuzyjnych LAV oraz syntetycznych peptydów LAV. Z oznaczeń wynika, że wszystkie przeciwciała mają izotyp IgGi. Przed dokonaniem niniejszego zgłoszenia linie komórek HIV-gpl 10-1, HIV-gpl 10-2 i HlV-gplO-3 zdeponowano w American Type Culture Collection pod numerami ATCC odpowiednio: nr nr HB9175, HB9176 1 HB9177.

Testowane na reaktywność rekombinantowe białka fuzyjne posiadały wcześniej nadane oznaczenia ENV2, ENV3, ENV4 i ENV5. Białko ENV2 pochodzi z ^resji pENV2 (ATCC 53071) będącego regionem LAV od 6598 bp do 7178 bp (numeracja par zasad według Wain. Hobsona i wsp., Celi, 44, 9/1985//, ENV3 pochodzi z ekspresji pENV3 (ATCC 53072) zawierającego region LAV od 7178 bp do 7698 bp, eNv4 pochodzi z ekspresji pENV4 (ATCC nr 53073) zawierającego sekwencję od 7698 do 8572 bp, a ENV5 pochodzi z ekspresji PENV5 (ATCC 53074), który zawiera region LAV od 5889 do 7698 bp. Wytwarzanie rekombinantowych białek fuzyjnych jest szczegółowo opisane w będącym w toku załatwiania zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 721 237.

Wytwarzanie peptydów syntetycznych. Peptydyl /29/ i VIII /110-2-2 syntetyzuje się na żywicy benzhydryloaminowej (polistyren) dwuwinylobenzen/, (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California). Peptyd V /177/ syntetyzuje się na żywicy t-butyloksykarbonylo/Boc/etylobentylocysteino-fenyloacetamidometylo (PAM)-polistyreno/dwuwinylobenzenowej. Symetryczne sprzęganie bezwodnikiem prowadzi się w syntetyzerze Applied Biosystems 430A. W obydwu peptydach jako pierwszą resztę aminokwasową stosuje się cysteinę.

Dla asparaginy i glutaminy stosuje się sprzęganie dwucykloheksylokarbodwuimidem w obecności hydroksybenzotriazolu. Stosuje się benzylowanie łańcucha bocznego i blokowanie BOC grupy σ-aminowej. Ponadto rutynowo stosuje się następującą blokadę reaktywnych grup w łańcuchach bocznych: Boc/formylo/tryptofan, Boc sulfotlenek metioniny, Boc/tolueno-sulfonylo/arginina, Boc/metylobenzylo/cysteina. Boc/tolueno-sulfanylo/histydyna, Boc/chlorobenzyloksykarbonylo/lizyna i Boc/bromobenzyloksykarbonylo/tyrozyna.

155 ®Μ 19

Znakowanie peptydów pierwiastkiem radioaktywnym prowadzi się przez acetylację końca aminowego kwasu ³H-octowym, stosując nadmiar dwucykloheksylokarbodwuimidu.

Odblokowanie i odczepienie peptydu od żywicy prowadzi się sposobem Tam'a „low-high“ z użyciem HF (Tam i wsp., jak wyżej). Ekstradycję peptydu z żywicy prowadzi się 5% kwasem octowym i ekstrakt poddaje się filtracyjnej chromatografii żelowej w 5% kwasie octowym. Do syntetycznych peptydów HIV testowanych na reaktywność z monoklonalnymi przeciwciałami należą peptydy; 29, 36 i 39. Peptyd 29 jest kodowany przez region genomowy LAVbru od 6688 bp do 6750 bp, peptyd 36 jest kodowany przez region rozciągający się od 7246 bp do 7317 bp, a peptyd 39 jest kodowany przez region od 7516 bp do 7593 bp. Peptydy 36 i 39 są ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 629 783.

Peptydy blokujące IX do XV konstruuje się w sposób opisany powyżej, na żywicy metylobenzhydralaninowej (polistyren/dwuwinylobenzen) (Applied Biosystems Inc., Foster City, California). Symetryczne sprzęganie bezwodnikiem prowadzi się w syntetyzerze Applied Biosystems 430A. Dla asparaginy stosuje się sprzęganie dwucykloheksyiokarbodwuimidem w obecności hydroksylobenzotriazolu. Stosuje się benzylowanie łańcucha bocznego i blokowanie BOC grupy (aminowej, natomiast dla łańcuchów bocznych tyrozyny stosuje się blokowanie grupą Boc /bromobenzyloksykarbonylową). Acetylowanie, jeśli potrzebne prowadzi się bezwodnikiem octowym lub lodowatym kwasem octowym w dwucykloheksylokarbodwuimidzie. Odblokowanie i odszczepienie peptydu od żywicy prowadzi się techniką standardową „high“ z użyciem HF (Stewart i wsp., jak wyżej). Ekstrakcję peptydu z żywicy prowadzi się 50% kwasem octowym i ekstrakt poddaje filtracyjnej chromatografii żelowej w 20% kwasie octowym. Tam, gdzie to potrzebne, prowadzi się oczyszczanie metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na kolumnie Vydac 08/ Rainin Instrument Co., Emiryville, CA/ stosując gradient 0,1% kwasu trójfluorooctowego w acetonitrylu.

Barwna reakcja immunologiczna („Immunoblotting“) w tej próbie, charakteryzację prowadzi się na supernatantach klonów lub na płynie wysiękowym, stosując jako antygeny oczyszczony wirus LAV i rekombinantowe białka fuzyjne. Antygeny rozdziela się prowadząc elektroforezę w gradiencie żelu poliakryloamidowego (7,0-15,0%) i przenosi na błonę nitrocelulozową (NMC) w procesie elektroforezy w czasie 4 godzin przy 25 V, w 25 mM fosforanie sodowym (pH 7,0). Po przeniesieniu, błony nitrocelulozowe blokuje się dla uniknięcia reakcji nieswoistych przez inkubację w płynie PBS-Tween albo Blotto (5% odtłuszczonego mleka w proszku w PBS), w czasie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie te błony nitrocelulozowe inkubuje się z supematantem hodowli komórek lub z płynem wysiękowym rozcieńczonym w PBS-Tween przez godzinę w temperaturze pokojowej i wymywa, wymieniając trzykrotne PBS-Tween. W następnym etapie, błony nitrocelulozowe inkubuje się przez godzinę w temperaturze pokojowej z roztworem: kozia IgG przeciw antygenom mysim peroksydaza z chrzanu, rozcieńczonym w PBS-Tween. Po inkubacji prowadzi się wymywanie roztworem PBS-Tween i błony zanurza na 20 minut w roztworze dającym barwną reakcję z peroksydazą chrzanu (bio-Rad Laboratories, Richmond, California). Reakcję zatrzymuje się przez zanurzenie w dejonizowanej wodzie. Reaktywność monoklonalnych przeciwciał porównuje się z dodatnią surowicą kontrolną reagującą z oczyszczonym rozerwanym wirusem lub białkiem fuzyjnym uzyskanym przez ekspresję. Wyniki próby wskazują, że przy stosowaniu preparatów rozerwanych wirusów wszystkie przeciwciała wiążą się z gpllO i jego prekursorową cząsteczką gpl50. Przeciwciała 110-1 i 110-2 również rozpoznają białko fuzyjne ENV3, podczas gdy przeciwciała 110-3,110-4,110-5 i 110-6 kompleksują immunologicznie ENV2.

Immunoprecypitacja. Ekstrakty wirusowe do precypitacji radioimmunologicznej preparuje się z komórek CEM zakażonych izolatem LAVbru wirusa HIV przystosowanych do wzrostu litycznego przez ciągłe pasażowanie. Przy zaobserwowaniu wczesnych zmian cytopatycznych komórki przenosi się do płynu do znakowania zawierającego ³⁵/S/-metiomnę (0,05 mCi/ml) albo ³/H/-glukozamianę (0,025 mCi/ml), następnie inkubuje się w czasie 24 godzin. W tym czasie większość komórek ulega lizie i wirus uwalnia się do supernatantu hodowli. Z wolnego od komórek supernatantu odwirowuje się wirus (wirowanie przez godzinę z szybkością 100000 g), po czym sporządza się ekstrakty detergentowe w buforze P-RIPA (buforowana fosforanem solanka zawierającą: 1,0% Tritonu Χ-100, 1,0% dezoksycholanu, 0,1% SDS i 1% aprotyniny). Podobne ekstrakty sporządza się z supernatantów niezakażonych komórek CEM.

W próbach immunoprecypitacji inkubuje się 100//1 ekstraktu wirusowego z ilością 100/zl supernatant hodowli linii komórek hydrydowych, przez godzinę na lodzie. Do każdej próbki

155 084 dodaje się po 4μ1 Ig królika przeciw antygenom mysim (Zymed Laboratories, So. San Francisco, California) i prowadzi inkubację przez 30 minut. Następnie do każdej próbki dodaje się immunoprecypitynę(lOO/d), Bethesda Research Laboratory, Bethesda, Maryland) zawieszoną w buforze P-RIPA zawierającym 1,0% albuminy jaja i prowadzi inkubację przez dodatkowe 30 minut. Związane kompleksy przemywa się i rozdziela przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowymSDS (15,0% akryloamidu: żel DATD). Po elektroforezie żele utrwala się, zanurza w kąpieli Enbance (New England Nuclear, Bosto, MA), suszy i fulmuje na błonie Kodak XR-5. Jako porównawcze kontrole pozytywne i negatywne stosuje się surowicę, która immunoprecypituje wszystkie białka wirusa HIV, prowadząc jej reakcję z supernantami zakażonych wirusem komórek CEM i pozornie zakażonych tych komórek. Wyniki próby wykazują, że wszystkie 6 monoklonalnych przeciwciał swoiście precypituje gpl 10 i gpl50.

Próba immunoenzymatyczna w fazie stałej. Dla oznaczenia epitopówgpl 10 rozpoznawanych przez monoklonalne przeciwciała według wynalazku, charakteryzuje się supernatanty hodowli z hybrydowych linii komórkowych albo z płynu wysiękowego, oznaczając w próbach ELISA ich reaktywność z białkami fuzyjnymi uzyskanymi z ekspresji biologicznej i z syntetycznymi peptydami. Procedura jest taka sama jak opisana powyżej, z tym, że jako antygen zaadsorbowany na powierzchni wgłębienia w płytce do mikromiareczkowania stosuje się białka fuzyjne lub syntetyczne peptydy zamiast wirusa.

Przy stosowaniu peptydów jako antygenu, sposób postępowania jest następujący: liofilizowany peptyd rozpuszcza się w 6M chlorowodorku guanidyny. Bezpośrednio przed rozlaniem do wgłębień na płytkach z 96 wgłębieniami roztwór guanidynowy rozcieńcza się buforem 0,05M węglanu/dwuwęglanu (pH 9,6) do końcowego stężenia peptydu do Κ^Ομ/ml. W każdym wgłębieniu umieszcza się 50μ1 rozcieńczonego peptydu i płytki inkubuje się przez dobę w temperaturze 4°C. Nadmiar roztworu peptydowego „wytrząsa się“, płytki blokuje się roztworem „Blotto“ i dalej postępuje w sposób opisany powyżej dla próby ELISA. Podobnie, rekombinantowe białko rozcieńcza się do końcowego stężenia 2 μΐ/ml buforem 0,05M węglan/dwuwęglan (pH 9,6) i wykonuje się tę samą procedurę.

Wyniki są przedstawione w tabeli II. Monoklonalne przeciwciała wytwarzane przez linie komórkowe HIV gpl 10-1 i HIV gpl 10-2 reagują z ENV3, ENV5, peptydem36 i rozerwanym wirusem. Przeciwciała z linii komórkowych HIV-gp-110-3, HIV-gp-l 10-4, HIV-gp-110-5 i HIVgp-110-6 reagują z ENY2 i peptydem 29 oraz z rozerwanym wirusem.

Tabela II

Wyniki próby ELISA wykazującej reaktywność monoklonalnych przeciwciał przeciw białkom reakombinowanym i syntetycznym peptydom

	Rekombinantowe białko fuzyjne	Peptyd syntetyczny	, W'irus LAV kontrola	Komórki CEM kontrola
ENV2	ENV3	ENV4	ENV5	29	26	39
110-1	0,077	3,000	0,113	3,000	ND	2,421	0,054	0,908	0,125
110-2	-0,003	3,000	0,000	3,000	ND	2,305	-0,005	1,214	0,009
110-3	3,000	0,011	ND	ND	3,000	ND	0,017	0,363	0,046
i 10-4	3,000	0,020	ND	ND	3,000	ND	0,016	0,383	0,067
110-5	3,000	0,014	ND	ND	3,000	ND	0,016	0,368	0,025
110-6	3,000	0,033	ND	ND	1,937	ND	0,017	0,486	0,032

Wyniki przedstawione w tabeli II wykazują, że monoklonalne przeciwciała 110-1 i 110-2 rozpoznają determinantę antygenową kodowaną przez sekwencję DNA w regionie pENV3, a zwłaszcza przez region genomu HIV zdefiniowany sekwencją aminokwasową peptydu 36. Tak więc, monoklonalne przeciwciała gpl 10-1 i 110-2 wiążą się z regionem peptydowym gpl 10, kodowanym w odcinku od 7246 bp do 7317 bp, czego dowodem jest utworzenie się kompleksów immunologicznych z peptydem 36 i ENV3. Ten region genomu HI V był uprzednio identyfikowany jako region konserwatywny, to jest, w sekwencji DNA regionu zdefiniowanego peptydem 36 pochodzącego z izolatów różnych wirusów z odmiennych obszarów geograficznych występowały jedynie niewielkie zmiany. Patrz Stercich i wsp., Celi, 46, 637 /1986/. W przeciwieństwie do tego, monoklonalne przeciwciała gpl 10-3, -4, -5 i -6 wiążą się z peptydami HIV zdefiniowanymi regionem kodującym peptyd29, rozciągającym się od 6688 bp do 6750bp. Ten region w gpl 10,

155 084 zdefiniowany peptydem29 zawiera jednak w różnych izolatach wirusowych szereg substancji nukleotydowych. Monoklonalne przeciwciała, które selektywnie wiążą polipeptydy gp 110 zawierające konserwatywne epitopy, takie jak przeciwciała 110-1 i 110-2, posiadają większą użyteczność w wielu okolicznościach, na przykład w chromatografii powinowactwa. Również w próbie ELISA peptyd 110-2-2 reaguje z surowicą osobnika, od którego wyizolowano LAV-2.

Próba immunofluorescencji pośredniej. Pośrednie próby immunofluorescencji z zastosowaniem monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi gpl 10 HIV prowadzi się na utrwalanych acetonem i na żywych komórkach. Utrwalone acetonem próbki sporządzone z zakażonych LAV komórek CEM inkubuje się z rozcieńczonym supernatantem hodowli lub z płynem wysiękowym przez godzinę w temperaturze 37°C, podczas, gdy żywe komórki inkubuje się z supernatantem hodowli lub z płynem wysiękowym przez godzinę w temperaturze 4°C, po czym sporządza się preparaty komórkowe utrwalone acetonem. W obydwu metodach, dla wykrycia komórek zawierających reaktywny antygen gpl 10 stosuje się izotiocyjanian fluoresceiny — znakowaną IgG przeciw antygenom mysim. Monoklonalne przeciwciało HIV-gpll0-l daje dodatnie wyniki zarówno z żywymi jak i z utrwalonymi acetonem, komórkami zakażonymi wirusem LAV.

Przykładu. Neutralizacja zaraźliwości wirusa HIV przez monoklonalne przeciwciała przeciw gpl 10.

W niniejszym przykładzie jest opisana i scharakteryzowana neutralizacja zaraźliwości HIV przez zastosowanie monoklonalnych przeciwciał, które wiążą się w gpl 10 i peptydami w obrębie gpl 10. Wyniki prób wskazują, że monoklonalne przeciwciała gpl 10-3, -4, -5 i -6 posiadają aktywność neutralizującą i że gpl 10-3 i -4 posiadają wyjątkowo wysokie poziomy aktywności neutralizującej.

Próba neutralizacji. Została opracowana czuła próba neutralizacji, aby ilościowo określić wpływ monoklonalnych przeciwciał na zaraźliwość wirusa HIV. Jako komórkę targetową do porównań zaraźliwości wybrano linię komórkową CD4+ (CEM) bardzo wrażliwą na zakażenie wirusem HIV. Płyn wysiękowy, przygotowany w sposób opisany w przykładzie I, albo jego frakcję IgG oczyszcza się stosując precypitację siarczanem amonowym i inaktywuje przez ogrzewanie w temperaturze 56°C przez 30 minut, następnie rozcieńcza w pożywce RPMI zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej. Z 4-dniowej hodowli CEM w logarytmicznej fazie zbiera się zawiesinę wirusa HIV, szczep LAVbru, filtruje ją przez filtry o średnicy oczek 0,2 lub 0,45μπι, porcjuje i zamraża w temperaturze -70°C. Jedną porcję odmraża się, miareczkuje, aby oznaczyć TCID50 i prowadzi następne próby ze świeżo rozmrożonymi porcjami, rozcieńczonymi 1: 500 w pożywce hodowli do stężenia około 10-krotnie wyższego, niż potrzeba do zakażenia 50% komórek CEM w hodowli (lOTCIDso. Zawiesinę wirusową miesza się z równą objętością (25^μ1) pięciokrotnych rozcieńczeń preparatu monoklonalnego przeciwciała 1:5 do 1:9 765, 625. Mieszaninę wirus /przeciwciało inkubuje się w czasie 45 minut w temperaturze 37°C, a następnie rozcieńcza 1:5 do 1:9, 765, 625. Taką mieszaninę wirus/ przeciwciało inkubuje się przez 45 minut w temperaturze 37°C a następnie próbki tej mieszaniny po 200μ1 stosuje się do szczepienia wgłębień zawierających 1,0 ml roztworu o stężeniu około 2X 105 komórek CEM/wgłębienie. Hodowle inkubuje się w temperaturze 37°C, w nawilżonej atmosferze z zawartością 5% CO2 przez 14 dni.

Następnie komórki zbiera się, sporządza peletkę i wykonuje lizę w roztworze 1% Tritonu Χ-100 w PBS w czasie 10 minut. Ilość wirusa (lub antygenu wirusowego) obecną w zlizowanych komórkach oznacza się ilościowo stosując opisaną powyżej czułą próbę immunoenzymatyczną wychwytywania antygenu HIV typu „Aandwich. Miano aktywności neutralizującej oznacza się jako odwrotność rozcieńczania monoklonalnego przeciwciała, które hamuje wytwarzanie antygenu więcej niż o 50% w stosunku do kontrolowanych hodowli wirusowych inkubowanych bez przeciwciała albo z monoklonalnym przeciwciałem o tym samym izotypie, który w poprzednich badaniach nie wykazywał aktywności neutralizującej.

W powyższej próbie wychwytywania antygenu HIV stosuje się dwa monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw antygenom p25 jako reagenty wychwytujące (kapturowe). Te linie komórek hybrydowych generuje się w sposób opisany powyżej, z niewielkimi modyfikacjami, do których należy zastosowanie oczyszczonego rekombinantowego białka gag jako immunogenu i charakteryzacja wytworzonych przeciwciał monoklonalnych pod względem swoistości i reaktywności, z zastosowaniem rekombinantowych białek fuzyjnych oznaczonych symbolami GAG-l, GAG-2 i GAG-3 i syntetycznego peptydu 141. Białko GAG-l jest produktem ekspresji plazmidu pGAG-1

155 084 (ATCC nr 53379), GAG-2 jest produktem ekspresji pGAG-2 (ATCC 53111) i białko GAG-3 jest produktem ekspresji pGAG-3 (ATCC nr 53112). Wytwarzanie rekombinantowych białek fuzyjnych jest szczegółowo opisane w zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 764 460 i 828 828. Syntetyczny peptyd 141 jest kodowany przez genomowy region LAVbru odpowiadający resztom aminokwasowym 198-242. Okazało się, że monoklonalne przeciwciało produkowane przez linie komórek hybrydowych p25-2 i p-25-3 reaguje z rekombinantowymi białkami fii7vinvmi GAG-I. GAG-7 i GAG-3. a monoklonalne nrzeciwciało z n25-3 reaeuie

155 084 komórkowe p25-6 i p25-7 reagują z rekombinantowym białkiem fuzyjnym GAG-3, p25-6 i reagują z syntetycznymi peptydami 147 i 148, a p25-7 reagują z syntetycznymi peptydami 15, 88 i 150.

Próby neutralizacji prowadzi się w sposób opisany powyżej, z tym, że jeśli się stosuje mieszaninę (koktail), to uprzednio rozcieńcza się indywidualne przeciwciała monoklonalne w stosunku 1:5 w pożywce hodowli, a następnie miesza w równych stosunkach otrzymując końcowe rozcieńczenie 1:10. Dalszą część próby prowadzi się w sposób opisany powyżej.

Monoklonalne przeciwciała gpl 10-2, p25-6 i p25-7 wykazują poniżej 50% aktywność neutralizującą gdy są stosowane osobno. Jeśli stosuje się je w mieszaninie, która zawiera monoklonalne przeciwciała gpl 10-2 łącznie z p-25-6 albo p25-7 w rozcieńczeniu 1: 10, uzyskuje się całkowitą neutralizację. Mieszanina zawierająca monoklonalne przeciwciała p25-6 w kombinacji z p25-7 daje aktywność neutralizacyjną rzędu 60 do 90%.

Przykład IV. Siła działania immunologicznego peptydu29.

Zdolność peptydu29 i peptydów homologicznych, w tym peptydu 177 do stymulowania odpowiedzi immunologicznej przeciw wirusowi HIV oznaczono na dwóch szczepach myszy.

Sposób przygotowania immunogenów peptydowych, sposób immunizacji i określenia odpowiedzi immunologicznej jest podany poniżej.

Preparat peptydu 29 do celów immunizacji przygotowuje się przez koniugację z oczyszczaną tyroglobuliną. Tyroglobulinę derywatyzuje się N-sukcynimidylo--4/N-maleimidometylo/cykloheksano-l-karboksylanem (SMCC) według ujawnienia podanego w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 529 783, kolumna 10, wiersz 28-51. Jako drugi immunogen przygotowuje się tyroglobulinę derywatyzowaną aldehydem glutarowym w sposób następujący: ilość 27 mg wieprzowej tyroglobuliny rozpuszcza się w 1ml 0,1 M dwuwęglanu sodowego, do którego dodaje się kroplami 8,3/tzł 25% roztworu aldehydu glutarowego i mieszaninę miesza się przez dobę w temperaturze pokojowej. Do roztworu dodaje się 1 ml buforu: węglan/dwuwęglan sodowy o pH9,3 i poddaje dializie w czasie 8 godzin wobec 2 litrów tego samego buforu w temperaturze 4°C, z całkowitą wymianą dializatu po 4 godzinach. Do derywatyzowanej tyroglobuliny dodaje się następnie peptyd 29 w 100 molowym nadmiarze i mieszaninę miesza się przez dobę w temperaturze pokojowej. Nieprzereagowany aldehyd glutarowy blokuje się ilością 200pl 0,2M roztworu lizyny i mieszaninę miesza się przez kilkanaście godzin (dobę) w temperaturze pokojowej. Koniugat peptyd-tyroglobulina dializuje się następnie ekstensywnie wobec PBS w temperaturze 4°C.

Peptydy przygotowane każdą z tych metod koniugacji podaje się dwóm szczepom myszy (czarnym C57 i BALB/c). W czasie zaszczepienia wiek wszystkich myszy wynosi 2-4 tygodnie. Preparaty podawano do poduszek łapek, przez sakryfikację ogona, podskórnie, donosowo lub dootrzewnowo. Inokulum zawiera 25pg skoniugowanego peptydu zawieszonego w ilości 0,5 ml kompletnego adiuwantu Freunda. Ponadto stosuje się inokulacje wspomagające powtarzane w tygodniach 2, i 3 i 5 tym samym immunogenem w niekompletnym adiuwancie Freunda. Od poszczególnych myszy zbiera się próbki surowicy przed immunizacją, po 4 dniach od wspomaganej inokulacji w 3 tygodniu i po 4 dniach po ostatniej inokulacji w 5 tygodniu. W próbkach surowicy wykrywa się obecność przeciwciał wobec peptydów analogicznych albo całych wirusów wykonując skrining metodą ELISA. Surowice wykazujące aktywność przeciwciał względem LAV poddaje się dalszemu skriningowi na aktywność neutralizacyjną, następnie analizuje się te surowice w barwnych próbach immunologicznych („immunoblot) względem antygenu rozerwanych cząstek wirusa LAV oraz metodą radioimmunoprecypitacji wobec znaczonych gpl 10.

Wyniki immunizacji wykazują, że myszy immunizowane peptydem 29 posiadały przeciwciała reagujące z peptydem 29 oraz z rozerwanym wirusem LAV-1 w próbie ELISA. Koniugacja peptydu 29 aldehydem glutarowym na ogół dawała wyższe miana przeciwciała przeciw peptydowi 29 u myszy BALB/c, jakkolwiek koniugacja meleimidem dawała zadawalające wyniki w produkcji przeciwciał przeciw peptydowi 29 u niektórych myszy BALB/c. U myszy immunizowanych peptydem 177 rozwijały się przeciwciała przeciw temu peptydowi, a koniugacja tego peptydu aldehydem glutarowym w większym stopniu wywoływała odpowiedź immunologiczną. Na stymulację immunologiczną peptydem 177 były bardziej wrażliwe myszy C57 niż myszy BALB/c. Jak wykazały próby ELISA, myszy immunizowane peptydem 110-2-2 z LAV-2 posiadały przeciwciała przeciw 110-2-2 i przeciw wirusowi LAV-2. Peptyd 110-2-2 skoniugowany poprzez aldehyd glutarowy był

155 084 immunogenny w stosunku do myszy C57 jak i myszy BALB/c, jakkolwiek miana dla peptydu 110-2-2 były na ogół wyższe u myszy BALB/c niż u myszy C57, podczas gdy miana w stosunku do LAV-2 były na ogół wyższe u myszy C57 niż u myszy BALB/c.

Reasumując, można stwierdzić, że próbki surowicy z immunizowanych myszy, które /i/ posiadają przeciwciała przeciw stałym cząstkom wirusa, /ii/ neutralizują HIV, co wykazano w próbach opisanych w przykładzie II, oraz /iii/ reagują z peptydem 29 w próbie ELISA, łącznie wskazują na skuteczność peptydu 29 w preparatach szczepionek.

Przykład V. Rozdział gpllO metodą immunopowinowactwa z zastosowaniem monoklonalnych przeciwciał.

Monoklonalne przeciwciała przeciw antygenowi gpllO HIV mogą być użyte w procesie rozdziału metodą immunopowinowactwa dla całkowitego oczyszczenia otrzymanych w wyniku ekspresji bakteryjnej rekombinantowych białek fuzyjnych. Jeśli wytwarzane przez bakterie białko jest wydzielane, to białko to można izolować z supernatantu hodowli. Jeśli natomiast nie jest ono wydzielane z komórki bakteryjnej, niezbędne jest rozbicie tej komórki. Konstrukcja plazmidu pENV-5 (ATCC nr 53074) jest podana w będącym w toku zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 721 237. Plazmid pENV-5 koduje większą część końca karboksylowego gpl 10 i część końca aminowego gp41 LAV stanowiącego insercję w wektorze ekspresyjnym trp., E.coli 0600 transformowana tym wektorem wytwarza białko fuzyjne gpl 10, ale nie wydziela go poza komórką.

Wzrost E.coli COOO zawierającej plazmid pENV-5 prowadzi się na pożywce zawierającej tryptofan (20/ig/ml) i ampicylinę (100/rg/ml) przez dobę w temperaturze 37°C w warunkach napowietrzania. Jednodobowe hodowle zaszczepia się następnie w stosunku do 1: 100 do świeżej pożywki minimalnej zawierającej ampicylinę (100/(g/ml), ale nie tryptofan. Wzrost tych hodowli prowadzi się w warunkach napowietrzania przez 2-3 godzin (do wczesnej logarytmicznej fazy wzrostu) w temperaturze 37°C. Następnie dodaje się środek indukujący, kwas 3/3-indoloakrylowy (Sigma Chemica Co., St. Louis, MO) w postaci świeżo przygotowanego roztworu o stężeniu 20mg/ml w 95% etanolu (do końcowego stężenia w hodowli 20/ig/ml). Wzrost indukowanych kolonii prowadzi się w temperaturze 37°C, z napowietrzaniem, w czasie 4 do 5 godzin, następnie sporządza się peletkę i ewentualnie zamraża. Wydajność białka z pENV-5 wynosi na ogół poniżej 1 mg/litr.

Peletkę komórek bakteryjnych poddaje się lizie buforu P-RIPA (PBS zawierający: 1% Tritonu Χ-100, 1% dezoksycholanu, 0,1% dodecylosiarczanu sodowego i 1% aprotyniny) wywołując lizę komórek E.coli. Zawiesinę poddaje się działaniu ultradźwięków dla ścięcia DNA i RNA, następnie odwirowuje się ją dla usunięcia nierozpuszczonych cząstek. W celu standaryzacji stężenia białka może być potrzebny etap rozcieńczania lub zatężania.

Monoklonalne przeciwciała HIV-gpl 10-1 wytrąca się początkowo z płynu wysiękowego lub z supernatantów hodowli komórkowej w temperaturze pokojowej albo niższej, roztworami /NH4/2SO4 albo NaiSOą buforowanymi (pH 7,3) dodawanymi w ilości potrzebnej do uzyskania końcowych stężeń odpowiednio 33 i 18%. Wytrącone białka odwirowuje się i powtórnie rozpuszcza w PBS i wytrąca po raz drugi ilością 33% /NH4/2SO4 lub ilością 12-15% Na2SC>4. Ten etap ewentualnie się powtarza. Utworzoną peletkę znów rozpuszcza się w PBS i usuwa nadmiar soli przez filtrację żelową przez odsalającą matrycę albo przez wyczerpującą dializę wobec PBS.

Oczyszczone przeciwciało monoklonalne 110-1 sprzęga się z sefarozą aktywowaną bromocyjanem. Odpowiednią ilość żelu spęcznia się w roztworze 10-³ MHC1 na filtrze szklanym (lg liofilizowanego materiału daje końcową objętość żelu około 3,5 ml) i przemywa się przez 15 minut tym samym roztworem, po czym bezpośrednio po tym dodaje się przeciwciało. Na ogół, reakcja sprzęgania zachodzi najefektywniej przez pH8-10, lecz można stosować niższe pH jeśli to potrzebne dla zachowania stabilności przeciwciała. Przeciwciało powinno być rozpuszczone w PBS albo w buforze: węglan/dwuwęglan lub boran, o wysokiej sile jonowej z zawartością 150 mM NaCl. Zawiesinę aktywowanej sefarozy i przeciwciała miesza się łagodnie w czasie 2-4 godzin w temperaturze pokojowej albo przez dobę w temperaturze 4°C, a następnie na filtrze ze spiekanego szkła z buforem sprzęgającym. Wszystkie pozostające grupy aktywne blokuje się przez działanie l,0M etanoloaminą przy pH 8, przez 2 godziny. Końcowy produkt — przeciwciało-sefaroza przemywa się 4 do 5-krotnie na zmianę roztworami buforów o wysokim i niskim pH (bufor boranowy, 0,1M,

155 084 25 ρΗ 8,5 IM NaCl oraz bufor octanowy, O,IM, pH 4,0, IM NaCl). W takim przemywaniu usuwa się resztki niezaadsorbowanych kowalentnie materiałów. Otrzymaną matrycę do rozdziału metodą immunopowinowactwa przechowuje się w temperaturze poniżej 8°C w obecności odpowiedniego środka bakteriostatycznego, takiego jak 0,01% azydek.

Dodanie do takiej matrycy zawiesiny wytworzonego białka powoduje selektywne usunięcie antygenu gpl 10. Mieszaninę pozostawia się na 2 do 24 godzin, korzystnie na 12-18 godzin przy powolnym mieszaniu albo wstrząsaniu. Można również użyć kolumnę, wówczas matrycę do prób immunopowinowactwa podaje się na kolumnę, równoważy, i powoli podaje się zawiesinę białka. Po podaniu zawiesiny białka, wstrzymuje się przepływ na kolumnie aby uzyskać maksymalne tworzenie się kompleksu immunologicznego.

Niezwiązany materiał wymywa się albo oddziela przez wyczerpujące wymywanie buforem adsorpcyjnym. Można zastosować filtr spiekanego szkła z próżnią albo „column flow-through“. Niezwiązany materiał eluuje się następnie stosując bufory o niskim i wysokim ρΗ/bufor octanowy o ph4,0 lub bufor boranowy o ph 8,5^// albo środek chaotropowy.

Przykład VI. Oczyszczanie rekombinantowego gpl 10 otrzymanego z systemu ekspresyjnego ssaków metodą immunopowinowactwa.

Monoklonalne przeciwciała produkowane przez linie komórkowe wytwarzane sposobem według wynalazku znajdują zastosowanie do oczyszczania rekombinantowego białka gpl 10 uzyskanego przez ekspresję z komórek ssaków metodą immunopowinowactwa. Komórki ssaka zakaża się rekombinantową krowianką (Mackett i wsp., J. Virol. 49, 857 /1984,/, zawierającą sekwencje kodujące przynajmniej część białka gpl 10, które jest antygenem i powoduje wytwarzanie przeciwciał neutralizujących.

Rekombinantową krowiankę przygotowuje się w sposób podany w opisie zgłoszenia Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 842 984. W sposobie tym, sekwencje kodujące glikoproteinę płaszczową HIV wprowadza się jako insercję do wektora plazmidowego (pGS20) za elementem kontrolującym transkrypcję w krowiance. Taki gen chimerowy jest flankowany sekwencjami kodującymi gen kinazy tymidynowej (TK).

Chimerowe wektory plazmidowe zawierające promotor wirusa krowianki przyłączony przez ligację do genu płaszczowego LAV stosuje się do transformowania szczepu E.coli M01000. Insercji chimerowych sekwencji LAV-env do genomu wirusa krowianki dokonano przez rekombinację in vivo, co było możliwe dzięki temu, że chimerowe geny w plazmidach pv-env5 są flankowane sekwencjami wirusa krowianki kodującymi genTK. Następnie, plazmid ten wprowadza się do komórek uprzednio zakażonych dzikim typem wirusa krowianki, gdzie następuje rekombinacja pomiędzy sekwencjami TK w plazmidzie a sekwencjami homologicznymi w genomie wirusowym krowianki, co powoduje insercję chimerowego genu. Jako gospodarza w systemie ekspresyjnym użyto komórki nerki zielonej małpy afrykańskiej (szczep BSC-40 linia pochodząca z komórek BSC-1, ATCC nrCCL26).

Komórki BSC-40 zakaża się wielokrotnością 10 rekombinantowego wirusa krowianki. Po 12 godzinach od zainfekowania komórki zbiera się, przemywa raz w PBS i odwirowuje. Peletki komórek zawiesza się w buforze do lizy komórek (1,0% NP 40, 2,5% dezoksycholanu sodowego, 0,1M NaCl, 0,01M Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA) i lizat komórkowy klaruje się przez odwirowanie. Rozdział metodą immunopowinowactwa otrzymanego w wyniku ekspresji rekombinantowego białka fuzyjnego prowadzi się w sposób opisany powyżej dla bakteryjnego systemu ekspresyjnego, stosując monoklonalne przeciwciała gpl 10-1. Białka wytwarzane w tym systemie ekspresyjnym są bardziej zbliżone do wytwarzania naturalnie białek HIV gpl 10 dzięki temu, że w komórkach ssaków zachodzą procesy glikozylacji.

Przykład VII. Hamowanie zakażeń wirusem HIV za pomocą peptydów blokujących.

Skuteczność blokujących peptydów w hamowaniu zakażenia hodowli komórek tkankowych szczepem LAVbru wirusa HIV badano stosując zmodyfikowaną metodę oceny peptydu T opublikowaną przez Petr'ego i wsp., jak wyżej. Korzystna próba hamowania infekcji HIV polega na połączeniu równych objętości peptydu blokującego i komórek CEM (2,5 X 10⁵)wpożywce(RPMI, 10% FOS i 2mg/ml odczynnika „polybrene) i inkubacji przez 45 minut w temperaturze 37°C. Następnie dodaje się wirus, w różnych dawkach (10,50,300 TCID50), mieszaninę inkubuje się przez 14 dni w temperaturze 37°C, a następnie analizuje się supernatant na wytwarzanie antygenu wirusowego (na przykład rdzeniowego p25).

155 084

Wstępna inkubacja komórek CEM z peptydami przed dodaniem wirusa do hodowli wzmaga działanie hamujące widoczne w prowadzonych testach. Okazuje się, że hamowanie to jest zależne od dawki wirusa: przy małych i średnich dawkach obserwuje się wysoką aktywność hamującą lecz przy najwyższych dawkach wirusa aktywność ta jest mniejsza.

W próbach z peptydem T osiągano około 60 do 90% hamowania wytwarzania antygenów wirusowych przy niskich dawkach wirusa. Dodatkowe eksperymenty z peptydami X-XV na ogół po amidowaniu końca z wolną grupę karboksylową i po acylowaniu wolnej, końcowej grupy aminowej dawały podobne wyniki. Natomiast peptyd XI wykazywał szczególną efektywność w szerokim zakresie dawek. W celu uzyskania dodatkowego lub synergicznego hamowania wytwarzania antygenów wirusowych można dodać przeciwciała neutralizujące albo w czasie wstępnej inkubacji albo w czasie dodawania wirusa.

Na podstawie powyższych przykładów można stwierdzić, że monoklonalne przeciwciała produkowane przez linie komórkowe wytworzone sposobem według wynalazku wraz z peptydami, w tym peptydami blokującymi umożliwiają zastosowanie ulepszonych metod neutralizacji i/lub hamowania zakażeń wirusem HIV. Umożliwiają rozwój w dziedzinie kompozycji profilaktycznych i terapeutycznych, skutecznych w zakażeniach większością, jeśli nie wszystkimi szczepami HIV. Ponadto, nowe materiały znajdują zastosowanie w próbach diagnostycznych i innych znanych procedurach.

Niniejszy wynalazek został szczegółowo opisany dla jego ilustracji, a przykłady podane dla ułatwienia jego zrozumienia i jest oczywiste, że w zakresie załączonych zastrzeżeń mogą być wprowadzone pewne zmiany i modyfikacje, dane dotyczące zdeponowania mikroorganizmów. Następujące mikroorganizmy wytworzone i stosowane w niniejszym wynalazku zdeponowano w Amerykańskim Muzeum Szczepów „American Type Culture Collection, 12301 Perklawn Drive, Rockwille, Maryland 20852, USA. Poniżej podaje się dane dotyczące depozytów:

Nazwa naukowa	Nazwa nadana przez deponującego	Numer ATCC	Data zdeponowania
Mysie komórki hybrydowe (Balbc/NJS-1)	HIV-gp 110-1	HB 9175	30 sierpień 1986
	HIV-gp 110-2	HB 9176
	HIV-gp 110-3	HB9177	n
	HIV-gp 110-6	HB 9404	30 kwiecień 1987
	HIV-gp 110-4	HB 9405
	HIV-gp 110-5	HB 9406
	HIV-p 25-2	HB 9407
	HIV-p 25-3	HB 9408	n
	HIV-p 25-6	HB9409
	HIV-p 25-7	HB 9410

Komórki hybrydowe HB 9175, HB9176 i HB9177 testoswano i stwierdzono, że są żywe w dniu 26 sierpnia 1986 r. Pozostałe komórki testowano i stwierdzono ich żywotność w dniu 4 maja 1987 r.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania linii komórkowych produkujących przeciwciała reaktywne z determinantą antygenową HIVgpll0, znamienny tym, że do gospodarza wprowadza się immunogenną ilość preparatu antygenowego wzbogaconego w białko HIV, monitoruje immunizowanego gospodarza na produkcję przeciwciał reaktywnych z determinantą antygenową gpl IO, pozyskuje się komórki produkujące przeciwciała z gospodarza i immortalizuje się te komórki, wybiera się immortalizowane komórki produkujące przeciwciała przeciwko HIV gpl 10 i klonuje się immortalizowane komórki otrzymując linie komórkowe.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że klonowanie prowadzi się „in vitro“ w pożywce albo wstrzykuje się linie komórkowe śródbłonowo gospodarzowi i odzyskuje się przeciwciała monoklonalne.

   155 084
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę biologiczną pobieraną z gospodarza inokuluje się „in vitro“ białkiem z neutralizującego regionu HIV i wykrywa się obecność immunokompleksów tworzonych pomiędzy białkiem i przeciwciałami w próbce.
4. 4. Sposób wytwarzania linii komórkowych produkujących przeciwciała reaktywne z determinantą antygenową HIV p25, znamienny tym, że do gospodarza wprowadza się immunogenną ilość preparatu antygenowego wzbogaconego w białko HIV, monitoruje immunizowanego gospodarza na produkcję przeciwciał reaktywnych z determinantą antygenową p25, pozyskuje się komórki produkujące przeciwciała z gospodarza i immortalizuje się te komórki, wybiera się immortalizowane komórki produkujące przeciwciała przeciwko HIVp25 i klonuje się immortalizowane komórki otrzymując linie komórkowe.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że klonowanie prowadzi się „in vitro“ w pożywce albo wstrzykuje się linie komórkowe śródbłonowo gospodarzowi i odzyskuje się przeciwciała monoklonalne.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że próbkę biologiczną pobraną z gospodarza inokuluje się „in vitro“ białkiem z neutralizującego regionu HIV i wykrywa się obecność immunokompleksów tworzonych pomiędzy białkiem i przeciwciałami w próbce.

   155 084

   Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz. Cena 3000 zł