SK238592A3 - Ahas mutant resistant towards imidazoline - Google Patents

Description

Vynález se týka nových sekvencí DNA, které kóduj í nové variantní formy enzýmu acetohydroxykyselina syntázy (dále AHAS) . Enzým AHAS je kritickým enzymem, který je rutinne produkován v ruzných rostlinách a širokém rozsahu mikroorganismú. Normálni funkce AHAS je inhibována imidazolinonovými herbicídy. Nové enzymy AHAS, kódované mutantními sekvencemi DNA však pusobí normálním katalytickým účinkem i za prítomnosti imidazolinonových herbicidu a v dusledku toho dodávaj í rostlinám nebo mikroorganismum, které je obsahují, rezistenci vúči tomuto herbicidu.

Nové sekvence DNA jsóu odvozený z kukurice a obsahují v poloze 621 normálni sekvence AHAS substituci aminokyseliny. Tato substituce v sekvenci génu AHAS má za následek vznik * plne funkčního enzýmu, ale činí enzým špecificky rezistentním vúči ihibici ruznými imidazolinonovými herbicídy. Dostupnost

A téchto variantních sekvencí poskytuje prostŕedek pro transformaci rúzných plodín za účelem dosažení rezistence vúči imidazolinonovým herbicidum a kromé toho, poskytuje nové selektovatelné markery pro použití v j iných typech experimentú genetické transformace.

Dosavadní stav techniky

Použití herbicidu v zemédélství je v současné dobé velmi rozšíŕeno. Ačkoliv existuje značný počet sloučenin, které účinné ničí plevel, ne všechny herbicídy jsou schopný se selektivné zaméŕit na nežádoucí rostliny, ve srovnání s plodinami a zároveň být netoxické vúči zvíŕatúm. Často je zapotŕebí se rozhodnout pro sloučeniny, které jsou jednoduše méné toxické vúči plodinám než vúči pleveli. Aby byly tyto obtíže odstránený, zaméfil se zemedélský výzkum intenzívne na vývoj plodín, které jsou rezistentní vúči herbicidúm.

Dúležitým aspektem vývoje herbicidní rezistence je porozumení, na jaký cíl herbicíd púsobí, po némž následuje manipulace postižené biochemické dráhy v plodinové rostliné tak, aby se bylo možno vyhnout inhibičnímu účinku, za současného zachování normálni biologické funk.ce rostliny. Jeden z prvních objevu biologického mechanizmu herbicídu se týkal série štruktúrne nepodobných herbicidních sloučenin, t.j. imidazolinonu, sulfonylmočovin . a triazolopyrimidinu. Nyní je známo ( Shaner a další, Plánt Physiol. 76: str. 545 až 546, 1984; US patent č. 4 761 373), že všechny tyto herbicídy inhibují rúst rostlin tím, že interferují s esenciálním enzymem, který je duležitý pro rust rostlin, acetohydroxykyselina syntázou (AHAS; stejný enzým bývá nekdy označován termínem acetolacetát syntéza či ALS) . AHAS je duležitý pro syntézu aminokyselín isoleucinu, leucinu a valinu.

Je známo, že enzým AHAS je prítomný ve vyšších rostlinách a zároveň byl zjišten v ruzných mikroorganismech, jako jsou kvasinky Saccharomyces cerevisiae a enterických bakteriích Escherichia coli a Salmonella tiphimurium. Byl také dobre charakterizován genetický základ produkce normálního AHAS v mnohých z techto druhú. Tak napríklad, jak v E. coli, tak v S. typhimurium existuj í tri isosymy AHAS, pŕičemž dva z nich jsou citlivé vúči herbicidum, zatímco tretí nikoliv. Každý z techto isosimú obsahuje jednu velkou a jednu malou podjednotku proteínu a mapováním jsou zarazený do operonú ILvIH, IlvGM a IlvBN. V kvasinkách byl jediný isosym AHAS mapován do místa ILV2. V každém prípade byly identifikovány senzitívni a rezistentní formy a byly stanovený sekvence ruzných alel (Friden a další., Nucl. Acid Res. 13: 3979-3993, 1985; Lawther a další., PNAS USA 78: 922-928, 1982; Squires a další., Nucl. Acids Res 811: 5299-5313, 1983; Wek a další; Nucl. Acids Res 13: 4011-4027, 1985; Falco a Dumas, Genetics 109 , 21-35 , 985; Falco a další Nucl. Acids Res 13; 4011-4027, 1985).

V tabaku je funkce AHAS kódována dvema nepripojenými gény SuRA a SuRB. Tyto dva gény jsou v podstate identické, jak na úrovni nukelotidú, tak na úrovni aminokyselín maturovaného proteínu, ačkoliv se N-terminální, pŕedpokládáná transitní oblast odlišuje podstatnéji (Lee a další, EMBO J. 7 : str. 1241 - 1248, 1988). Arabidopsis na druhé strane obsahuje jediný gen AHAS, který byl také úplne sekvenován (Mazur a další, Plánt Physiol. 85: 1110 - 1117, 1987). Porovnání sekvencí genú AHAS ve vyšších rostlinách ukazuje na vysoký stupeň konzervace určitých oblastí této sekvence. Konkrétne existuje pŕinejmenším 10 oblastí konzervace sekvence. Nedávno se predpokládalo, že tyto konzervované oblasti jsou kritické, pokud se tyče funkce enzýmu a že zachování této funkce je závislé na podstatné konzervaci sekvence.

Nedávno bylo oznámeno (US patent č. 5 013 659), že mutanty , vykazující herbicidní rezistenci,obsahuj í mutace v alespoň jedné aminokyseline v jedné nebo více techto konzervovaných oblastí. Zejména se zj istilo, že substituce určité aminokyseliny za aminokyselinu divokého typu v techto špecifických místech proteínové sekvence AHAS je tolerovaná a skutečne se projevuje dosažením herbicidní rezistence rostliny, která takovou mutaci obsahuje, pri zachování katalytické funkce ezymu. Popsané mutace kódují buä krížovou rezistenci vúči imidazolinonúm a sulfonylmočovinám nebo špecifickou rezistenci vúči sulfonylmočovinám, nebyly však zverejnený mutace, které by byly špecifické pro imidazolinony. Bylo prokázáno, že k takovým mutacím dochází u tabáku jak na míste SuRA, tak na místé SuRB. Podobné mutace byly také izolovány u Arabidopsis a kvasinek.

Imidazolinon-specifická rezistence bylai oznámená u mnohá rúzných rostlin v j iných pramenech. V US patentu č. 4 761 37 3 byl obecné popsán modifikovaný AHAS, jakožto základ herbicidní rezistence rostlin a konkrétne zde jsou uvedený určité imidazolinon-rezistentní línie kukurice. Haughn a další (Mol.Gen. Genet. 211 : 266 - 271, 1988) oznámili prítomnosť podobného fenotypu v Arabidopsis. Sathasivan a další ( Nucl. Acid Res. 18: 2 188, 1990) zjistili, že imidazolinon-specifická rezistence u Arabidopsis je založená na mutaci v poloze 653 normálni sekvence AHAS. Nyní byl v souvislosti s tímto vynálezem izolován gen kódující imidazolinon-specifickou rezistenci u jednodéložných rostlin a bylo zjišténo, že je založen na substituci jediné aminokyseliny v sekvenci aminokyselín AHAS divokého typu jednodeložných rostlin.

Podstata vynálezu

Pŕedmétem vynálezu jsou nové sekvence nukleových kyselín, kódující funkční enzymy AHAS jednodéložných rostlin, které jsou necitlivé vúči imidazolinonovým herbicidúm. Tyto sekvence obsahuj í mutaci v kodonu, který kóduje aminokyselinu serin v poloze 621 sekvence AHAŠ kukurice nebo v odpovídající poloze sekvenci j iných monokotyledonú. Je známo, že j iné monokotyledony, jako je pšenice, také vykazují imidazolinon-specifické , mutace (napríklad ATCC č. 40994 - 97). U kukurice obsahuje tato sekvence divokého typu v této poloze serin. V prednostním provedení tohoto vynálezu je serin nahrazen asparaginem, nicméné však existuj í i alternatívni možnosti substituce serinu kyselinou aspartovou, kyselinou glutamovou, glutaminem a tryptofanem. Nárokované sekvence jsou sice púvodné odvozený z monokotyledonú , jsou však užitečné i pri zpusobech produkce imidazolinon-rezistentních bunék rostlin jakéhokoliv typu. Pri téchto metodách se bunka cílové rostliny transformuje jednou nebo více pozmenenými sekvencemi podie vynálezu. Alternativné se pro vytvorení mutantú v bunkách rostlin nebo semenech, obsahujících sekvenci nukleových kyselín, kódující imidazolinonnecitlivý AHAS, používá mutageneze. V prípade mutantních bunék rostlin izolovaných z tkáňové kultury, se pak regeneruj! rostliny, které obsahuj í charakteristický znak rezistence nebo necitlivosti (insenzitivity) vúči imidazolinonúm. Do rozsahu vynálezu spadaj í také bunky rostlin, bakteriálni bunky, houbové bunky, bunečné tkáňové kultury, dospélé rostliny a semena rostlin, které obsahuj í mutantní sekvenci nukleových kyselín a které exprimují funkční imidazolinon-rezistentní enzýmy AHAS.

Dostupnosť téchto nových herbicidné rezistentních rostlin umožňuje vyvinout nové metódy pestování plodín za prítomnosti imidazolinonú. Místo toho, aby se péstovaly nerezistentní rostliny, mohou se pole osít rezistentními rastlinami zísaknými mutací nebo transformací mutantními sekvencemi podie tohoto vynálezu, načež se pole obvyklým zpusobem ošetrí imidazolinony, aniž by došlo k poškození plodiny.

Mutantní nukleové kyseliny podie tohoto vynálezu také poskytuj í nové selektovatelné markery pro použití pri transformačních experimentech. Sekvence nukleových kyselín, která kóduje rezistentní AHAS, se pripojí k druhému génu pred transferem do hostitelské buňky a celý konstrukt se transformuje do hostitele. Predpokladané transformované buňky se potom nechaj í rúst v kultuŕe za prítomnosti inhibičních množství herbicídu. U bunek, které prežijí, existuje vysoká pravdepodobnosť, že došlo k úspešnému zabudování požadovaného druhého génu. Alternatívne se múze postupovať tak, že se gen rezistentného AHAS ko-transformuje na nezávislém plasmidu s požadovaným genem,pŕičemž približne u 50 % všech transformantú je možno očekávat, že získaly oba gény.

Následuje vysvetlení nékterých pojmú, kterých se používá v tomto popisu a v nárocích. Pod pojmem funkční nebo normálni enzým AHAS se rozumí enzým AHAS, který je schopen katalýzovat první supeň syntetické dráhy vedoucí k esenciálním aminokyselinám isoleucinu, leucinu a valinu. Pod pojmem sekvence AHAS divokého typu se rozumí sekvence, která je prítomná v imidazolinon-senzitivním členu daného druhu. Pod pojmem rezistentní rostlina se rozumí rostlina, která produkuje mutantní, ale funkční enzým AHAS a která je schopná dosáhnout zralosti pri rústu za prítomnosti imidazolinonú o koncentraci, která normálne vykazuje inhibiční účinek. Poj6 mu rezistentní se v souvislosti s rostlinami používá v tomto popisu také ve významu tolerantní, t.j. jedná se o rostliny, které fenotypicky vykazují nepŕíznivé, ale nikoliv lethální reakce vuči imidazolinonum.

Pŕehled obrázku na výkrese

Na obr. 1 je uveden graf závislosti aktivity enzýmu AHAS u desetidenních semenáčku kukurice ( kukurice linie (R)

A619 nebo XI12) ne koncentraci imazethapyru (Pursuit A) (R) nebo chlorsulfuronu (Oust B). Aktivita herbicidne rezistentního AHAS se vypočítá jako procentický podíl aktivity AHAS za neprítomnosti inhibitoru. Smérodatná odchýlka pri téchto pokusech činí 10 %.

Na obr. 2 je znázornená Southernova analýza genomových klonia ve fágu EMBL3. Fágy 12-1A (z W22) , 12-7A, 18-8A, 12-11 a 12-17A (z XI12) se štepí Xbal nebo Sali, provede se separace na 1% agarózovém gélu, prenos na. nitrocelulózu a hybridizace s cDNA fragmentem AHAS, jako nukleotidovou sondou.

Na obr. 3 je uvedená Southernova analýza genomové DNA z linií kukurice XI12, XA17, QJ22, A188 a B73. DNA se vyštépí Xbal, separuje na 1% agarózovém gélu, pŕenese na nitrocelulózu a hybridizuje s cDNA fragmentem AHAS, jako nukleotidovou sondou.

Na obr. 4 je znázornená reštrikční mapa plazmidu pCD8A. Gen mutantního AHAS z XI12 se subklonuje jako 8kb fragment Pstl do vektoru pKS(+). Umístení a orientace génu AHAS je znázornená šipkou. Reštrikční místa Pstl, Xhol, HindlII, Xbal a Clal jsou označená symboly.

Na obr. 5 je znázornén gel pro sekvenování nukleotidu s nekódujícím vláknem (A) a se sekvencí dvouvláknové DNA (B) klonú AHAS W22/4-4, B73/10-4 a XI12/8A v oblasti aminokyselín 614 až 633. Umísténí prechodu cytosin-thymidin je označeno šípkou.

Na obr. 6 jsou uvedený nukleotidové a dedukované aminokyselinové sekvence mutantního génu AHAS XI12/8A.

Na obr. 7 je uvedeno seŕazení sekvence nukleotidu génu XII12/8A, B73/7-4 a W22/1A als 2. Znakem (^X) je označená základní zmena zpúsobující mutaci v poloze 621, znakem (=$=) jsou označený zmeny ve srovnání se sekvencí B73/7-4 a znakem O) jsou označený tiché zmeny.

Na obr. 8 je uvedeno seŕazení sekvencí aminokyselín génu XI12/BA, B73/7-4 a W22/1A als 2. Znakem (^x) je označená základní zmena zpúsobující mutaci v poloze 621, znakem (4) j SOU označený zmeny ve srovnání se sekvencí B73/7--4 a znakem (^>) jsou označený tiché zmeny.

Gen podie tohoto vynálezu je izolovatelný z kukurice línie XI12 (semena jsou uložená v Americké sbírce typových kultur /Američan Type Culture Collection - ATCC/ pod prírastkovým číslem 75 051 ). Tento gen se vloží do plasmidu pXI12/8A (uloženého ve sbírce ATCC pod pŕírustkovým. číslem 68 643) . Tento gen je také izolovatelný z jakéhokoliv j iného imidazolinon-specifického herbicidné rezistentního mutantu, jako je kukurice line QJ22 (uložená ve sbírce ATCC pod pŕírustkovým číslem 40 129) nebo rúzných rostlin pšenice (semena uložená ve sbírce ATCC pod čísly 40 994, 40 995, 40 996 a 40 997) . Vytvorí se knihovna genomové DNA, napríklad ve fágu EMBL-3 s DNA z jednoho imidazolinon-rezistentního mutantu, prednostne takového, který je homozygní, pokud se tyče charakteristického znaku rezistence a provede se skríning se sondou z nukleových kyselín obsahující celou sekvencí AHAS divokého typu nebo její část.

U kukurice se gen AHAS nalezá* na dvou místech alsl a als2 (Burr a Burr, Trends in Genetics 7: 55 - 61, 1991). Homologie mezi temito dvéma místy je na úrovni nukleotidú 95%. Mutace v XI12 se mapovaním zaradí na místo als2 na chromosom 5, kdežto nemutantní gen se mapováním zaradí na místo alsl na chromosom 4 (Newhouse a další., Imidazolinone-resistant crops). V The Imidiazolinone Herbicides, Shaner a O'Connor (Eds.) , CRC Press, Boca Raton, Florida, USA - v tiskú) jsou Southernovou analýzou identifikovány nekteré klony obsahuj ící mutantní gen als2 a nekteré klony obsahující nemutantní gen alsl.

Oba typy se subklonují do sekvenačních vektoru a sekvenují se dideoxy-sekvenační metodou.

Sekvenováním a porovnaním génu AHAS divokého typu a mutantního se zj istí rozdíl v jediném nukleotidu v kodonu kôdujícím aminokyselinu v poloze 621 (viz obr. 5)· Konkrétne, kodon AGT, kódující serin v divokém typu, je zménén na kodon AAT, kódující asparagin v mutantním AHAS (viz obr. 8). Mutantní gen AHAS se j inak podobá génu divokého typu, kódujícímu protein obsahující 638 aminokyselín, z nichž prvních čtyŕicet tvorí prechodový peptid, o némž se pŕedpokládá, že se pri transportu do chloroplastu in vivo odštepí. Sekvence nemutantního génu alsl z XI12 se zdá být totožná se sekvencí génu alsl z B73.

Mutantní gény podie tohoto vynálezu dodávaj í odolnost vúči midazolinonovým herbicidum, ale nikoliv vuči sulfonylmočovinovým herbicidum. Typy herbicídu, vúči kterým se dosa-

hu j e	rezistence,	j SOU	popsány napríklad	v US patentech	č.
4	188	487, 4	201	565,	4 221 586, 4	297	128, 4 554 013,	4 608	079 ,
4	638	068, 4	747	301,	4 650 514, 4	698	092, 4 701 208	, 4 709	036,
4	752	323, 4	772	311	a 4 798 619,

Odborníkúm v tomto oboru je zrejmé, že sekvence nukleo vých kyselín, která je znázornená na obr. 6, není jedinou sekvencí, které je možno použít pro dodání imidazolinon-specifické rezistence. Rovnéž se múze použít takových sekvencí nukle ových kyselín, které kóduj í stejný proteín, ale které v dusledku degenerace genetického kódu maj í odlišnou nukleotidovou sekvenci. Do rozsahu vynálezu také spadají gény kódující sekvence AHAS, v nichž je prítomna vyše uvedená mutace, ale které také kóduj í jednu nebo více tichých zmén aminokyselín v tech částech molekuly, které se nepodílejí na rezistenci nebo katalytické funkci. Do rozsahu také spadají génové sekvence z j iných imidazolinon-rezistentních monokotyledonú, které obsahuj! mutaci v odpovídající oblasti techto sekvenci.

Do rozsahu vynálezu tedy spadají také génové sekvence s takovými zmenami, které máji za následek tvorbu chemicky ekvivalentní aminokyseliny v určitém míste. Tak napríklad, . kodon pro aminokyselinu alanin, což je hydrofobní aminokyselina, je možno snadno nahradiť kodonem kódujícím j iný hydrofobní zbytek, jako napríklad glycin nebo kodonem kódujícím hydrofóbnejší zbytek, jako napríklad valin, leucin nebo isoleucin. Podobne je možno očekávat, že se získá biologicky ekvivalentní produkt, jestliže se provede výmena jednoho negatívne nabitého zbytku za j iný, jako je napríklad výmena kyseliny aspartové za kyselinu glutamovou, nebo výmena jednoho pozitívne nabitého zbytku za jiný, jako je napríklad výmena lysinu za arginin. Do rozsahu vynálezu také spadají chimerické gény, v nichž je substituovaná část génu AHAS z kukurice rekcmbinována s nezmenenými částmi normálních génu AHAS z j iných druhú. Jestliže se tedy v tomto popisu a nárocích používá pojmu gen AHAS imidazolinon-specifické rezistentní kukurice , rozumí se tím kterékoliv z techto alternativních provedení, stejné tak jako sekvence znázornená na obr. 6.

Izolované DNA sekvence AHAS podie tohoto vynálezu jsou užitečné pro transformaci rostlin cílových plodín, jimž se má dodať rezistence vuči imidazolinonum . Pro dosažení primá nebo neprime transformace vyšších rostlin exogenní DNA je v současné dobé k dispozici velká rada technik a do rozsahu tohoto vynálezu spadá použití jakékoliv z nich, kterou se múže nová sekvence zabudovať do genomu hostitele, pŕičemž dochází k ustálené dedičnosti. Znak imidazolinon-specifické rezistence se dedí jakožto jediný dominantní jaderný gen. Úroveň rezistence vúči imidazolinonúm se zvyšuje, je-li gen pŕítomen v homozygním stavu. Takové rostliny kukurice maj í napríklad úroveň rezistence približné 1 000 x vyšší než nerezistentní rostliny. Rostliny, v nichž je gen pŕítomen v heterozygním stavu však mají rezistenci pouze asi 50 až 500násobnou ve srovnání s nerezistentními rostlinami.

Transformaci rostlinných bunék je možno zprostŕedkovat použitím vektoru. Obvyklou metodou, které se pri transformaci používá je metóda, pri níž se cizí gen zavádí do buňky cílové rostliny pomoci Agrobacterium tumefaciens, tak napríklad, mutantní sekvence AHAS se vloží do plasmidového vektoru obsahuj ící lemující sekvence v Ti-plasmidu T-DNA. Tento plasmid se potom transformuje do E.coli. Provede se triparentální spojení (mating) tohoto kmene, kmene agrobaceterium obsahujícího odzbrojený (disarmed) Ti-plasmid obsahující virulentní funkce potrebné pro provedení prenosu T-DNA sekvencí obsahujících AHAS do chromosomu cílové rostliny a druhého kmene E. coli, obsahujícího plasmid, v nemž jsou prítomný sekvence potrebné pro mobilizaci prenosu konstruktu AHAS z E. coli do agrobacterium . Rekomibinantního kmene agrobacterium, který obsahuje potrebné sekvence pro transformaci rostliny, se použije pro infekci listových disku. Disky se nechají rust na selekčním médiu a identifikuj í se úspešné transformované regeneranty. Získané rostliny jsou rezistentní vuči účinkum herbicídu, pokud se nechají rust v jeho prítomnosti. Vhodným prostŕedkem pro prenos exogenní DNA jsou také rostlinné viry.

Múze se také použít postupu, pri nemí, buňky rostliny pŕijímají DNA pŕímo. Obvykle se postupuje tak, že se protoplasty cílové rostliny umístí do kultury za prítomnosti DNA, která má být prenesená a činidla podporujícího pŕijímání DNA protoplastem. Jako užitečná činidla tohoto typu je možno uvést polyethylenglykol nebo fosforečnan vápenatý.

Alternatívne je možno stimulovať pŕijímání DNA elektroporací. Pri této metóde se používa elektrického pulzu pro dočasné otevŕení póru v bunečné membráne protoplastu, pŕičemž temito póry se potom do bunek vtáhne DNA z obkolopujícího roztoku. Podobne se muže pro pŕímé dodaní DNA do bunky a prednostné do bunečného jádra, použít mikroinjekcí.

Pri každé z výše uvedených technik dochází k transformaci bunek rostliny v kulture. Po provedené transformaci je nutno z bunek rostliny regenerovať celé rostliny. Techniky regenerace zralých rostlin z callu nebo protoplastové kultury jsou nyní velmi dobre známé u velkého počtu ruzných druhú (viz napríklad. Handbook of Plánt Celí Culture, sv.l - 5, 1983 1989, McMillan, New York, USA). Jestliže se tedy již dosáhne transformace, regenerace zralých rostlin z transformovaných bunek rostliny predstavuje postup spadající do rozsahu dosavadního stavu techniky. ·

Nyní jsou také k dispozici alternatívni metódy, které nutné nevyžadují použití izolovaných bunek a tedy technik regenerace rostlin, pro provedení transformace. Tyto metódy bývaj í označovány jako balistické nebo metódy urychlování částic, pri nichž se do bunek rostliny vstrelují kovové částice povlečené DNA bud pomoci náplne strelného prachu (Kleina další, Náture 327 : str. 70 - 73, 1987) nebo pomoci elektrického výboje ( EPO 270 356). Tímto zpúsobem je možno stabilné transformovať sekvencí DNA, která je pŕedmétem zájmu, bunky rostliny v kulture nebo reprodukční orgány nebo buňky rostliny, napríklad pyl.

U nékterých dvojdéložných a jednodéložních rostlin je pŕímý príjem DNA prednostní metodou transformace. Tak napríklad, u kukurice, se bunečná stena kultivovaných bunek rozštepí v pufru pomoci jednoho nebo více enzymú degradujících stenu buňky, jako je celuláza, hemiceluláza a pektináza, za účelem izolace životaschopných protoplastú. Protoplasty se nekolikrát promyjí aby se odstranily enzymy a potom se smíchají s plazmidovým vektorem, obsahujícím gen, který je pŕedmetem zájmu. Bunky je možno transformovat pomoci PEG (napríklad 20% PEG 4 000) nebo elektroporací. Protoplasty se umístí na nitrocelulózový filtr a kultivují na médiu s uloženými bunkami kukurice, které slouží jako živné kultury. Po dvou až čtyŕech týdnech se kultury v nitrocelulózovém filtru umístí na médium obsahující približné 0,32 yuM imidazolinonu a na tomto médiu se udržuj í po dobu 1 až 2 mesícú. Nitrocelulózové filtry s bunkami rostlin se každé dva týdny pŕenášejí na čestvé médium s herbicídy a živnými bunkami. Netransformované bunky prestanou rust a po nekolika týdnech odumírají.

Predloženého vynálezu je možno použít pro transformaci v podstate jakéhokoliv typu rostlin a to jak jednodéložných tak dvoudeložných. Z plodín, u nichž je možno takové transformace pro dosažení herbicidní rezistence použít, je napríklad možno uvést kukurici, pšenici, rýži, proso, ječmen, oves, cirok, slunečnici, batáty, vojtéšku, cukrovou repu, druhy Brassica, rajčata, papriku, sóju, tabák, tykev, brambory, hrách, podzemnici olejnou, bavlník nebo kakaovník. Nových sekvencí je také možno používat pro transformaci okrasných druhú rostlin, jako jsou rúže a drevnatých rostlin, jako je. borovice a topol.

Nové sekvence podie vynálezu jsou také užitečné jako selektovatelné markery pri studiích genetiky rostlin. Tak napríklad, pri transformaci rostliny by bylo možno sekvence kódující rezistenci vúči imidazolinonúm, pŕipojit k génu, který je pŕedmetem zájmu, jehož se má použít pro transformaci cílové imidazolinon-senzitivní rostlinné bunky. Do bunky rostliny se potom zavede konstrukt, který obsahuje jak gen, který je pŕedmétem zájmu, tak imidazolinon-rezistentní sekvence a bunky rostliny se potom nechaj í rust za prítomnosti ihibičniího množství imidazolinonu. Alternatívne se muže postupovat tak, že se druhý gen, který je pŕedmetem zájmu ko-transformuje na separátním plasmidu, do bunék hostitele. Bunky rostliny, které tento postup prežijí, budou pravdepodobne obsahovať jak gen rezistence, tak gen, který je pŕedmetem zájmu a tudíž, pouze transformanty pŕežijí selekční proces za použití herbicídu. Potvrzení úspešné transformace a exprese obou génu se múže provést Southernovou hybridizací genomové DNA, PCR nebo pozorováním fenotypické exprese génu.

Vynález je blíže objasnen v následujících pŕíkladech. Tyto príklady mají výhradne ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádaném ohledu neomezují.

Príklady provedení vynálezu

Príklad 1

Potvrzení herbicidní rezistence celé rostliny na XI12

Rostliny XI12 se ošetrí herbicídy v dobe 10 dnu do stadia V3 listu (4-5 listú, z nichž 3 obsahují viditelné liguly). Imazethapyr se aplikuje v dávce 2 000, 500, 250, 125 a 62,5 g/ha. Chlorsulfuron se aplikuje v dávce 32, 16, 8, 4 a 2 g/ha. Rostliny se ošetrí postemergentne za použití objemu postŕiku 400 1/ha. Po postŕiku se rostliny umístí do skleníku , kde se dále sledují.

Pri všech stupních ošetrení imazethapyrem zustavají rostliny XI12 neovlivneny. Pri tom však není pozorována zvýšená rezistence vúči chlorsulfuronu. Rostliny XI12 tedy vykazují selektívni rezistenci vúči imidazolinonu, na úrovni celé rostliny ( viz obr. 1) .

Rezistence rostlin XI12 je dedičná ve forme jediné dominantní alely nukleárního génu. Heterozygne rezistentní rostliny XI12 se samoopylí . Potomstvo se rozdelí v pomeru 3 : 1 (rezistentní : susceptibilní) jak lze očekávat v prípade jediné dominantní alely jaderného génu. Pri této štúdii se segregující semenáčky postŕíkají postemergentne lethální dávkou imazethapyru (125 nebo 250 g/ha) za použití postŕiko vacích postupú popsaných výše, za účelem segregace podie rezistence.

Príklad 2

Extrakce AHAS

Semena rostlin XI12 se zasejí do zeme ve skleníku, v nemž se udržuje teplota ve dne i v noci 26,7 °C pri 15 hodinové osvetľovací perióde. Rostliny se sklidí 2 týdny po zasetí. Pro extrakci AHAS se použije hlavní části výhonu. 5 g tkáne se v kapalném dusíku rozdrtí na prášek, který se potom homogenizuje s pufrem pro stanovení AHAS, který sestává z 100 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného (pH 7,5), obsahujícího 10 mM pyruvátu, 5 mM chloridu hoŕečnatého, 5 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 100 uM FAD (flavinadenindinukleotid), 1 mM valinu, 1 mM leucinu, 10 % glycerolu a 10 mM cysteinu. Homogenát se 10 minút odstŕeduje pri otáčkách 10 000 min 1 a 3 ml získaného supernatantu se nanesou na ekvilibrovaný sloupec Bio-Rad Ečono-Desalting (10 DG). Eluce se provádí 4 ml pufru pro zkoušení AHAS.

Aktivita AHAS se méŕí stanovením obsahu produktu, acetolacetátu, po konverzi dekarboxylací za prítomnosti kyseliny na acetoin. Štandardní reakční smesi obsahuj í enzým v 50 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného ( pH 7,0), který obsahuje 100 mM pyruvátu sodného, 10 mM chloridu hoŕečnatého, 1 mM difosforečnanu thiaminu, 10 uM FAD a vhodné koncentrace rúzných inhibitoru. Získaná smés se inkubuje pri 37 °C, po dobu 1 až 3 hodin, v závislosti na druhu provádeného pokusu. Na konci této inkubační periódy se reakce zastaví pŕídavkem kyseliny sírové v takovém množství, aby se ve zkumavce dosáhlo konečné koncentrace 0,85 % kyseliny sírové. Reakční produkt se nechá dekarboxylovat pri 60 °C v prúbehu 15 minút. Vytvorený acetoin se stanoví inkubací s kreatinem ( 0,17%) a 1-naftolem (1,7% roztok v 4N hydroxidu sodném). Absorpce barevného komplexu, který vznikne, se meŕí pri 520 nm.

Aktivita AHAS z linií B73, A619 nebo j iných linií kukurice divokého typu je vysoce citlivá vuči inhibici ima(R) zethapyrem (Pursuit ) s hodnotou Ι^θ 1 yuM (viz obr. 1).

V kontrastu s tímto zjišténím vykazuje XI12 70 až 80% aktivitu enzýmu pri nejvyšších koncentracích (100 uM) produktu Pur(R) (R) suit^v ’ nebo Arsenal (imazepyr) a približne 70% za pŕítom(R) nosti produktu Scepter ’ (imazequin). Tento výsledek ukazuje na stonásobné zvýšení tolerance aktivity AHAS z XI12 vuči imazethapyru, ve srovnání s aktivitou AHAS-z A619 in vitro. Senzitivita aktivity AHAS z techto dvou linií vuči sulfonylmočovinám poskytuje zcela odlišný obrázek. Za prítomnosti produktu Oust' ' (sulfometuron methyl) o koncentraci 100 nM činí aktivita AHAS z XI12 pouze 15 až 20 %. Aktivita AHAS z (R) A619 za prítomnosti výrobku Oust je 5 až 10% a za prítomnosti výrobku Pursuit^ 15 - 20% ( viz obr. 1 ).

Príklad 3

Klonování génu AHAS XI12

Zasejí se semena mutantu XI12 získaného z tkáňové kultury imidazolinon-rezistentní kukurice. Rostliny získané z techto semen jsou segregující pro mutantní fenotyp AHAS. Aby se získalo homozygné rezistentní osivo, provede se samoopylení populace rostlin mutantu XI12. Semena jsou homozygní, pokud se týče mutantníhó génu AHAS po selekci na herbicidní rezistenci provádénou tri po sobé následující vegetační cykly. Homozygní semena se shromáždí a použije se j ich pro vypéstování semenáčku, které slouží pro izolaci génu AHAS.

DNA se extrahuje ze sedm dnu starých etiolovaných semenáčku homozygní linie XI12. 60 g rostlinné tkáné se v kapalném dusíku rozdrtí na prášek, který se pŕevede do 108 ml extrakčního pufru pro DNA ( 1,4 M chloridu sodného, 2,0 % Ctab /hexadecyltrimethylamoniumbromid/, 100 mM Tris-Cl o pH 8,0, 20 mM ethyldiamintetraoctové kyseliny a 2 % merkaptoethanolu) a 54 ml vody. Suspenze se inkubuje 30 minút pri 50 až 60 °C a potom se extrahuje stejným množstvím chloroformu. DNA se vysráží pŕídavkem stejného množství srážecího pufru (1 % Ctab, 50 mM Tris-Cl o pH 8,0 a 10 mM ethyldiamintetraoctové kyseliny) . Genomová DNA se prečistí odstŕeäováním pri vysoké rýchlosti v 6,6M roztoku chloridu cesného a ethidiumbromidu (rotor Ti80, otáčky 50 000 min , 20 °C, 24 hodin). Prečistená DNA se extrahuje butanolem, který je nasycen solí a 25 hodin dialýzuje proti 3 dávkám, vždy- po 1 litru dialy.začního pufru (10 mM Tris-Cl o pH 8,0, 1 mM ethyldiamintetraoctové kyseliny a 0,lM chloridu sodného). Spektrofotometricky se stanoví koncentrace genomové DNA z XI12, která činí 310 mg/ml. Výtežek je 0,93 mg.

Genomové DNA z XI12 se použije pro vytvorení genomové knihovny ve fágu EMBL-3. DNA se částečné rozštep! pomoci Mbol a získané fragmenty se separují na sacharózovém gradientu, za účelem získání fragmentu 8 až 22 kb, které se potom klonuj í do místa BamHl EMBL-3. Po získání 2,1 x 10° nezávislých klonu se knihovna jednou amplifikuje. Titr knihovny je podie analýzy 9 x ΙΟ^θ pfu/ml.

Za účelem získání nukleotidových sond pro analýzu knihovny XI12 se pomoci 800 nt BamHl nukleotidová sondy izolované z genomového klonu AHAS z Arabidopsis tŕídí cDNA knihovna W22 (divokého typu) v lambda gtll (zakoupeno od firmy Clontech Inc., California, USA ). Fágy se nanesou v hustote 50 000 pfu/ 15cm miska, pŕenesou se na nitrocelulózové filtry, pŕedhybridizují se v 6 x SSC, 0,2% SDS po dobu 2 hodin a hybridizují se s nukleotidovou sondou AHAS z Arabidopsis v 6 x SSC, 0,2% SDS pŕes noc. Identifikuje se 1 pozitívni fág, který se dále pre17 čistí a použije se ho pro subklonování 1,1 kb fragmentu EcoRl.

1, lkb fragment EcoRl se subklonuje do pGemA-4 a použije se ho jako nukleotidové sondy pro identifikaci génu AHAS XI12.

Genomová knihovna XI12 se nanese na 12 15cm misek (koncentrace 50 000 pfu/misku) a tŕídí se pomoci nukleotidové sondy cDNA AHAS W22. Filtry se pŕedhybrizuj í ( 2 hodiny) a hybridizují ( preš noc )v Churchové pufru (0,5 M fosforečnan sodný, 1,1 mM ethyldiamintetraoctové kyseliny, 1 % BSA a 7 % SDS pri 65 °C, načež se promyjí pri 65 °C dvakrát SSC, 0,2% SDS a 0,3 x SSC, 0,2 % SDS. Získá se 12 pozitivních plakú z celkem 7,5 x 10 zkoumaných pfu a 5 pozitivních klonu se dále čistí a izoluje podie Chisholma (BioTechniques 7: 21 - 23, 1989). Southernovou analýzou (viz obr. 2) se zjistí, že fágové klony predstavují 2 typy klonu AHAS. Klony typu 1 obsahuj! 1 velký (vetší než 6,5 kb) fragment Xbal, který se hybridizuje se sondou cDNA AHAS. Klony typu 2 obsahuj í 2,7 a 3,7 kb fragmenty Xbal, které se hybridizují se sondou cDNA AHAS. Southernova analýza genómu XI12 DNA ukazuje, že Xbal fragmenty získané rozštepením genomové DNA a hybridizací se sondou cDNA AHAS odpovídají Xbal fragmentum identifikovaným ve fágových klonech XI12 (viz obr. 3). Reštrikční štepení a Southernova analýza také ukazují, že z 5 klonu AHAS predstavuje 1 mutatní gény als2 a 4 predstavuj! alsl gen.

Gény AHAS odpovídající mutantnímu místu na chromozómu 5 (kloň 12/8A) a nemutatnímu místu na chromozómu 4 (kloň 12/17A) se subklonují jako fragment Pstl (klon/8A) nebo jako fragment Xbal (12/17A) do sekvenačního vektoru pBluescript II KSml3( + ) (pKS+; Stratagene) . Jak 2, Tkb tak 3,7kb Xbal fragment z fágu 12/17A obsahuje 1 úplnou kópii genfi AHAS, které se identifikuj!. Sekvence každé z nich se získá dideoxy-sekvenováním (za použití sekvenačních souprav Pharmacia T7), pŕičemž se používá primerú, které jsou komplementárni ke kódující sekvenci AHAS).

Metódy extrakce DNA, klonování genomové knihovny a trídení knihovny jsou stejné jako metódy popsané v souvislosti š genomovou DNA XI12. Gény AHAS z B73 se subklonují do sekvenačního vektoru pKS+ ve forme Xbal fragmentu a sekvenují se. Sekvence se získá dideoxy-sekvenováním, za použití priméru, které jsou komplementárni vuči kódující sekvencí AHAS, jak je to popsáno u génu AHAS z Síl2.

Roztŕídí se genomová knihovna W22 v EMBL3 (zakoupená od firmy Clontech Inc., California, USA). Fágy se nanesou na misky pri hustote 50 000 pfu/18cm miska. Potom se pŕenesou na nitrocelulózové filtry a hybridizují se.sondou cDNA AHAS W22, popsanou vyše (pŕehybridizační a hybridizační podmínky: 6 x SSC, 0,5% SDS, IX Denhardova DNA z telecího thymu 100 mg/ml, 65 °C; promývací podmínky : 3X x SSC, 0,2% SDS 2 hodiny pri 65 °C a 0,3 x SSC, 0,2% SDS 2 hodiny). Identifikují se a dále prečistí dva pozitívni fágy (12/1A a 12/4-4).

Genomový kloň 12/1A z W22 se subklonuje ve forme Sali fragmentu 0,78 kb (pGemA-4) a 3,0 kb (pGemA-14 ; Promega) do vektoru pGem-A2 a ve forme 6,5kb fragmentu Xbal do vektoru pKS+ (pCD200) . Sekvence kódujícího vlákna génu AHAS W22 se získá dideoxy-sekvenováním hnízdových (nested) delecí vytvorených ze subklonú pGem A-14 a pGem A-4 fágu 12-1A. Této sekvence se použije pro sestavení oligonukleotidu, které jsou komplementárni vuči nekódujícímu vláknu AHAS. Sekvence nekódujícího vlákna se získá dideoxy-sekvenováním klonu pCD200 za použití primeru, které jsou komplementárni vuči kódujícímu vláknu.Pri komplementaci sekvenování génu AHAS W22 se vytvorí primery obou vláken DNA a použije se j ich pro sekvenování génu AHAS izolovaných z genomových knihoven XI12 a B73.

Príklad 4

Klonování génu AHAS QJ22

Také se určí sekvence génu kódujícího AHAS v línii kukurice QJ22, která je selektívne rezistentní vúči imidazolinonum. Ve vektoru EMBL3 se vytvorí genomová knihovna QJ22. Knihovn-a fágu 800 000 se zkoumá pomoci 850-nukleotidového fragmentu Sall/Clal, izolovaného z klonu AHAS (A-4), odvozeného z linie kukurice W22 divokého typu. Získá se 5 pozitivních fágu, které se podrobí druhému kolu skríningu, za účelem částečné purifikace fágu. Cástečne purifikovaný fág se analýzuje PCR, aby se zj istilo, zda nekterý kloň predstavuje gen alsl QJ22. Takové klony se identifikuj! jako 3,7kb fragment Xbal s gen-specifickým místem Smal v poloze 495. Pri druhém skríningu se zj istí prítomnosť jednoho pozitivního klonu, který má tyto vlastnosti.

PCR produkt se purifikuje za použití obchodné dostupné soupravy (Mágie PCR Preps) od firmy Promega a prečistená DNA se sekvenuje pomoci sekvenačního systému na bázi TAQ polymerázy fmol, také od firmy Promega. Analýza sekvence obou vláken DNA mutatní AHAS QJ22 vykazuje nukleotidový prechod od G do A v kodonu pro aminokyselinu 621. Tato mutace je totožná s mutací pozorovanou u XI12. Zbytek sekvence je typický pro gen alsl.

VÝSLEDKY

Sekvence mutatních genú AHAS se porovná se sekvencemi získanými z linií kukurice divokého typu B73 a W22 (viz obr.7). Mutatní gen XI12 (XI12/8A) a mutatní gen QJ22 jsou shodné s genem divokého typu, s vyjímkou zmeny aminokyseliny v poloze 621, kde došlo k jednomu prechodu nukleotidu od AGT k AAT (viz obr. 8) . Gen mutantu XI12 (XI12/8A) se liší od génu divo kého typu B73/7-4 prídavným rozdílem v poloze 63. Na druhé strane, nemutantní kmeň AHAS XI12, klonovariý v XI12/17A je zcela homologický s odpovídajícím genem B73/10-2 v oblasti kódující maturovaný protein AHAS (data nejsou uvedená).

Uložení biologických materiálu

Ve sbírce Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20857, USA (ATCC) jsou uložený následující biologické materiály:

E. coli XLI Blue harboring plasmid pX12/8A, uložen

3. července 1991 , pod pŕírustkovým číslem ATCC 68643;

Semena kukurice XI12, uložená 16. července 1991, pod pŕírustkovým číslem ATCC 75051.

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sekvence nukleových kyselín monokotyledonu, kódující funkční enzým AHAS, kterýžto enzým obsahuje v poloze 621 sekvence AHAS kukurice divokého typu substituci aminokyseliny nebo který obsahuje homologickou substituci v sekvencí AHAS j iného jednodéložného druhu rostliny.
2. 2. Sekvence podie nároku 1, kde monokotyledon je kukurice a substituován je asparagin v poloze 621 enzýmu AHAS kukurice divokého typu.
3. 3. Funkční enzým AHAS monokotyledonu, který zahrnuje vzhledem k enzýmu AHAS monokotyledonu divokého typu substituci aminokyseliny, kterážto substituce udéluje enzýmu imidazolinon-specifickou rezistenci.
4. 4. Enzým podie nároku 3, kde monokotyledonem je kukurice a substituce se nalézá v poloze 621 enzýmu AHAS kukurice, divokého typu.
5. 5. Enzým podie nároku 4, kde substituovanou aminokyselinou je asparagin.
6. 6. Transformační vektor obsahujicí nukleovou kyselinu podie nároku 1.
7. 7. Hostiteľská bunka obsahující sekvencí nukleových kyselín podie nároku 1, nebo vektor podie nároku 6.
8. 8. Hostitelská buňka podie nároku 7, kterou je rostlinná nebo bakteriálni buňka.
9. 9. Imidazolinon-specificky rezistentní zralá rostlina obsahující sekvencí nukleových kyselín podie nároku 1 nebo jej í semena nebo pyl.
10. 10. Zpúsob udélováni imidazolinon-specifické rezistence buňkám rostlin, vyznačující se tím, žese do bunky rostliny zavede sekvence nukleových kyselín podie nároku 1.
11. 11. Zpúsob péstování imidazolinon-specifických rezistentních rostlin, vyznačuj ící se tím, žese péstuje rostlina produkující enzým podie nároku 3, za prítomnosti inhibičního množství imidazolinonu.
12. 12. Zpúsob selekce hostitelských bunék, které jsou úspéšné selektovány genem, který je pŕedmétem zájmu, vyznačuj i c i s e t í m, že se do zvolených hostitelských bunék zavede gen, který je pŕedmétem zájmu, pripojený k sekvenci nukleových kyselín podie nároku 1 nebo gen, který je pŕedmétem zájmu, nepripojený, ale za prítomnosti sekvence nukleových kyselín podie nároku 1, bunky se péstují za prítomnosti inhibičního množství imidazolinonu, načež se identifikuj í bunky, které pŕežily, jakožto bunky obsahujúci gen, který je pŕedmétem zájmu.
13. 13. Konstrukt nukleových kyselín obsahující sekvenci podie nároku 1, pripojenou ke génu, který kóduje agronomický užitečný charakteristický znak.