SK187099A3 - Bacterium belonging to the genus escherichia and method for producing l-amino acid - Google Patents

Bacterium belonging to the genus escherichia and method for producing l-amino acid Download PDF

Info

Publication number
SK187099A3
SK187099A3 SK1870-99A SK187099A SK187099A3 SK 187099 A3 SK187099 A3 SK 187099A3 SK 187099 A SK187099 A SK 187099A SK 187099 A3 SK187099 A3 SK 187099A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
amino acid
leu
bacterium
protein
ala
Prior art date
Application number
SK1870-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Arkadievich Vitaliy Livshits
Pavlovna Natalia Zakataeva
Kazuo Nakanishi
Vladimir Veniaminovich Aleshin
Petr Vladimirovich Troshin
Lyvovna Irina Tokhmakova
Original Assignee
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26653994&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK187099(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from RU98124016/13A external-priority patent/RU98124016A/ru
Application filed by Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Kk
Publication of SK187099A3 publication Critical patent/SK187099A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Baktéria patriaca do rodu Escherichia a spôsob produkcie L-aminokyseliny
Oblasť techniky
Tento vynález sa týka baktérie produkujúcej L-aminokyselinu, ktorá patri do rodu Escherichia a spôsobu produkcie L-aminokyselín, konkrétnejšie kyseliny L-glutámovej, L-lyzínu, L-treoninu, L-alaninu, L-histidínu, L-prolinu, L-argininu, L-valínu a L-izoleucínu s použitím baktérie.
Doterajší stav techniky
Na výrobu L-aminokyseliny prostredníctvom fermentácie bol na zlepšenie produktivity použitý kmeň izolovaný z prirodzeného prostredia alebo umelý mutant kmeňa. Napríklad v prípade L-lyzinu je známych mnoho umelých mutantov produkujúcich L-lyzín a väčšina z nich sú mutanty rezistentné voči S-2-aminoetylcysteínu (AEC) a patria do rodu Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus alebo Escherichia. Navrhnuté boli tiež rôzne techniky na zvýšenie produkcie aminokyselín, ako napríklad použitie transformantu získaného použitím rekombinantnej DNA (US patent č. 4 278 7665).
Techniky sú väčšinou založené na zvýšení aktivity enzýmu zahrnutého v biosyntetickej dráhe aminokyseliny, konverzii enzýmu tak, aby bol necitlivý voči inhibicii a podobne (pokiaľ ide o baktérie patriace do rodu Escherichia, pozri japonská prihláška vynálezu č. zverejnenia 56-18596 (1981) a číslo medzinárodného zverejnenia WO 95/16042).
Na druhej strane je ako príklad zlepšenia aminokyselinovej produktivity zosilnením aminokyselinového vylučovacieho proteínu, známa baktéria patriaca do rodu Corynebacterium, v ktorej je zosilnený L-lyzín vylučovací gén, lysE. Avšak pokiaľ ide o baktériu patriacu do rodu Escherichia, nie je známe ani či je L-aminokyselinový vylučovací proteín prítomný alebo nie. Takže nie je známe, či zosilnenie L-aminokyselinového vylučovacieho proteínu je účinné pri výrobe L-aminokyseliny, v ktorej sa používa baktéria patriaca do rodu Escherichia alebo nie.
-2Hoci už bola určená celá nukleotidová sekvencia E. coli kmeňa K-12 patriaceho do rodu Escherichia (Science, 277, 1453-1474 (1997)), existuje veľké množstvo proteínov, ktorých funkcie nie sú známe.
Cieľom vynálezu je získať proteín zúčastňujúci sa na vylučovaní L-aminokyseliny, a tým poskytnúť kmeň vylepšený z hľadiska L-aminokyselinovej produktivity a zlepšiť spôsob výroby L-aminokyseliny fermentáciou.
Pôvodcovia uskutočnili vyhľadávanie proteínu zúčastňujúceho sa na vylučovaní L-aminokyseliny. Výsledkom bolo zistenie, že výťažok L-aminokyseliny vzhľadom na spotrebovaný sacharid sa zvýšil, keď bol zosilnený konkrétny gén. Na základe tohto zistenia bol skompletovaný predložený vynález.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je baktéria patriacu do rodu Escherichia, ktorá má schopnosť produkovať L-aminokyselinu, pričom schopnosť produkovať L-aminokyselinu je zvýšená prostredníctvom zvýšenia exprimovaného množstva najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny, ktorá pozostáva z nasledujúcich proteínov (A) až (H) (ďalej označovaná aj ako baktéria podľa predloženého vynálezu):
(A) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 10;
(B) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, vrátane delécie, substitúcie, inzercie, pridania alebo inverzie jednej alebo niekoľkých aminokyselín, v aminokyselinovej sekvencii uvedenej v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 10, a ktorý zabezpečuje, že baktéria, ktorá ho obsahuje, má zvýšenú schopnosť produkovať L-aminokyselinu;
(C) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 12;
(D) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, vrátane delécie, substitúcie, inzercie, pridania alebo inverzie jednej alebo niekoľkých aminokyselín, v aminokyselinovej sekvencii uvedenej v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 12, a ktorý zabezpečuje, že baktéria, ktorá ho obsahuje, má zvýšenú schopnosť produkovať L-aminokyselinu;
(E) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 14;
(F) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, vrátane delécie, substitúcie, inzercie, pridania alebo inverzie jednej alebo niekoľkých aminokyselín, v aminokyselinovej sekvencií uvedenej v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 14, a ktorý zabezpečuje, že baktéria, ktorá ho obsahuje, má zvýšenú schopnosť produkovať L-aminokyselinu;
(G) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 16; alebo (H) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, vrátane delécie, substitúcie, inzercie, pridania alebo inverzie jednej alebo niekoľkých aminokyselín, v aminokyselinovej sekvencií uvedenej v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 16, a ktorý zabezpečuje, že baktéria, ktorá ho obsahuje, má zvýšenú schopnosť produkovať L-aminokyselinu.
Baktériou podľa predloženého vynálezu je výhodne L-lyzín produkujúca baktéria, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (D), (G) a (H); kyselinu Lglutámovú produkujúca baktéria, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (H); L-alanín produkujúca baktéria, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D); L-valín produkujúca baktéria, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D); L-histidín produkujúca baktéria, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) až (F); L-prolín produkujúca baktéria, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (F); L-treonín produkujúca baktéria, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (E) a (F); L-arginín produkujúca baktéria, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (G) a (H); alebo L-izoleucín produkujúca baktéria, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D).
Výhodne je v baktérii podľa predloženého vynálezu zvýšený počet kópií DNA kódujúcej uvedený proteín. DNA je výhodne nesená v bunke na multikópiovom vektore alebo na transpozóne.
Predložený vynález poskytuje aj spôsob produkcie L-aminokyseliny, ktorý zahŕňa nasledujúce kroky:
- kultiváciu baktérie podľa predloženého vynálezu v kultivačnom médiu, aby sa produkovala a akumulovala L-aminokyselina v médiu, a
- izolovanie L-aminokyseliny z média, (tu ďalej označovaný ako spôsob podľa predloženého vynálezu”).
Spôsobom podľa predloženého vynálezu je výhodne spôsob produkcie L-lyzínu použitím L-lyzín produkujúcej baktérie, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (D), (G) a (H); spôsob produkcie kyseliny L-glutámovej použitím kyselinu L-glutámovú produkujúcej baktérie, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (H); spôsob produkcie L-alanínu použitím L-alanín produkujúcej baktérie, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D); spôsob produkcie Lvalínu použitím L-valín produkujúcej baktérie, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D); spôsob produkcie L-histidínu použitím L-histidín produkujúcej baktérie, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) až (F); spôsob produkcie Lprolínu použitím L-prolín produkujúcej baktérie, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (F); spôsob produkcie L-treonínu použitím L-treonín produkujúcej
-5baktérie, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (E) a (F); spôsob produkcie Larginínu použitím L-arginín produkujúcej baktérie, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (G) a (H); alebo spôsob produkcie L-izoleucínu použitím L-izoleucín produkujúcej baktérie, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D).
Výhodne je pri spôsobe podľa predloženého vynálezu zvýšený počet kópií DNA kódujúcej uvedený proteín v bunke baktérie. DNA je v bunke výhodne nesená multikópiovým vektorom alebo na transpozóne.
Podľa predloženého vynálezu je možné zvýšiť schopnosť baktérie patriacej do rodu Escherichia produkovať L-aminokyselinu. Môže byť zlepšený aj spôsob produkcie L-aminokyseliny zlepšením výkonnosti produkcie L-aminokyseliny.
Predložený vynález bude podrobne vysvetlený nižšie. Nižšie, ak nie je uvedené inak, je aminokyselina v L-konfigurácii.
(1) Baktéria podľa predloženého vynálezu
Baktéria podľa predloženého vynálezu je baktéria patriaca do rodu Escherichia, majúca schopnosť produkovať aminokyselinu, v ktorej je schopnosť produkovať aminokyselinu zvýšená prostredníctvom zvýšenia exprimovaného množstva proteínu zabezpečujúceho zvýšenie schopnosti baktérie produkovať aminokyselinu alebo zvýšenie rezistencie voči aminokyseline alebo aminokyselinovému analógu. Nižšie je proteín označovaný ako aminokyselinový vylučovací proteín”, aby sa zabezpečila zrozumiteľnosť. Avšak tento výraz neznamená, že funkcia proteínu je obmedzená na vylučovanie aminokyseliny.
Príklady aminokyselinového vylučovacieho proteínu zahŕňajú proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č.: 10; proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č. 12; proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č. 14; a proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č. 16.
-6Aminokyselinový vylučovací proteín môže byť selektívny pre aminokyselinu. Aminokyselinový vylučovací proteín vhodný pre konkrétnu aminokyselinu je možné určiť tak, že sa umožní, aby sa aminokyselinový vylučovací proteín exprimoval v baktérii patriacej do rodu Escherichia, majúcej schopnosť produkovať aminokyselinu, a meria sa zvýšenie výťažku aminokyseliny, alebo sa meria zvýšenie minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) aminokyseliny alebo analógu aminokyseliny.
Napríklad, v prípade lyzínu je účinný proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č: 10, 12 alebo 16; v prípade kyseliny glutámovej je účinný proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č: 10, 12, 14 alebo 16; v prípade alanínu je účinný proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č: 12; v prípade valínu je účinný proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č: 12; v prípade histidínu je účinný protein, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č: 12 alebo 14; v prípade prolínu je účinný proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č: 10, 12 alebo 14; v prípade treonínu je účinný proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č: 14; v prípade arginínu je účinný proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č: 16; v prípade izoleucínu je účinný proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č: 12.
Tu používaný výraz exprimované množstvo je zvýšené zvyčajne znamená, že exprimované množstvo je vyššie ako množstvo v divom kmeni E. coli, ako napríklad v kmeni MG1655 alebo W3110. Výraz tiež znamená, že ak je kmeň získaný modifikáciou technikami genetického inžinierstva alebo podobnými technikami, je exprimované množstvo vyššie ako exprimované množstvo pred modifikáciou. Exprimované množstvo aminokyselinového vylučovacieho proteínu je možné určiť priamo alebo nepriamo, determináciou MIC aminokyseliny alebo aminokyselinového analógu alebo determináciou produktivity aminokyseliny baktériou patriacou do rodu Escherichia, ktorá obsahuje aminokyselinový vylučovací proteín.
-7Prikladom spôsobu na zvyšovanie exprimovaného množstva aminokyselinového vylučovacieho proteínu je spôsobom zvyšovania počtu kópií DNA kódujúcej aminokyselinový vylučovací proteín v bunke baktérie.
Na zvýšenie počtu kópií v bunke je možné ligovať fragment DNA kódujúci aminokyselinový vylučovací proteín do vektora, ktorý je funkčný v baktérií patriacej do rodu Escherichia, aby sa vytvorila rekombinantná DNA, ktorá je zavádzaná do hostiteľa na jeho transformáciu. Počet kópií génu kódujúceho aminokyselinový vylučovací proteín (gén aminokyselinového vylučovacieho proteínu) v bunke transformovaného kmeňa sa zvyšuje, čím sa zvyšuje exprimované množstvo aminokyselinového vylučovacieho proteínu. Vektor je výhodne multikópiový vektor.
Zvýšenie počtu kópií v bunke je možné dosiahnuť tým, že sa umožní, aby existovali viacnásobné kópie génu aminokyselinového vylučovacieho proteínu na chromozomálnej DNA hostiteľa. Zavedenie viacnásobných kópií génu aminokyselinového vylučovacieho proteínu do chromozomálnej DNA baktérie patriacej do rodu Escherichia je možné uskutočniť prostredníctvom homologickej rekombinácie tak, že sa ako cieľ použije sekvencia, ktorá v chromozomálnej DNA existuje vo viacnásobných kópiách. Ako sekvencia, ktorá existuje v chromozomálnej DNA vo viacnásobných kópiách, môže byť použitá opakujúca sa DNA a inverzné opakovanie prítomné v koncovej časti transponovateľného elementu.
Alternatívne, ako je opísané v japonskej prihláške vynálezu publikovanej pod číslom 2-109985 (1990), viacnásobné kópie je možné zaviesť do chromozomálnej DNA tak, že sa zabezpečí, aby bol gén aminokyselinového vylučovacieho proteínu nesený na transpozóne, a umožní sa, aby sa transpozón transponoval, čo je výhodné. Podľa ktorejkoľvek z vyššie uvedených metód sa zvyšuje počet kópií génu aminokyselinového vylučovacieho proteínu v transformovanom kmeni, čím sa zvyšuje exprimované množstvo aminokyselinového vylučovacieho proteínu.
Príkladmi multikópiového vektora sú plazmidové vektory, ako napríklad pBR322, pMW118, pUC19 alebo podobné, a fágové vektory, ako napríklad λ1059, ÄBF101, M13mp9 alebo podobné. Príkladmi transpozónu sú Mu, Tn10, Tn5 alebo podobné.
-8Zavedenie DNA do baktérie patriacej do rodu Escherichia sa môže uskutočniť napríklad spôsobom podľa D. M. Morrisona (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) alebo spôsobom, podľa ktorého sa recipientné bakteriálne bunky ošetria s chloridom vápenatým, aby sa zvýšila permeabilita DNA (Mandel, M. a Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) a podobne.
Okrem vyššie uvedenej génovej amplifikácie je možné dosiahnuť zvýšenie exprimovaného množstva aminokyselinového vylučovacieho proteínu aj zámenou expresnej regulačnej sekvencie, ako napríklad promótora génu aminokyselinového vylučovacieho proteínu silnejším promótorom (pozri japonská prihláška vynálezu zverejnená pod číslom 1-215280 (1989)). Ako silné promótory sú známe napríklad lac promótor, tip promótor, tac promótor, PR promótor a PL promótor. Zámena promótora zosiluje expresiu aminokyselinového vylučovacieho proteínu, čím sa zvyšuje exprimované množstvo aminokyselinového vylučovacieho proteínu. Posilnenie expresnej regulačnej sekvencie môže byť kombinované so zvýšením počtu kópií génu aminokyselinového sekrečného proteínu.
V baktérii podľa predloženého vynálezu je možné zvýšiť exprimované množstvá viacerých aminokyselinových vylučovacích proteínov.
Aminokyselinový vylučovací proteín je kódovaný génmi, ktoré sú známe ako yahN gén, yeaS gén, yfiK gén a yggA gén, a ktorých funkcie sú neznáme. Preto je možné získať DNA kódujúcu aminokyselinový vylučovací proteín prostredníctvom syntetizovania primerov na základe známych sekvencií (napríklad, už bola určená celá nukleotidová sekvencia chromozómu Escherichia coli kmeňa K-12 (Science, 277, 1453-1474 (1997))), a uskutočnením PCR amplifikácie použitím chromozomálnej DNA baktérie patriacej do rodu Escherichia ako templátu. Predmetný DNA fragment môže byť tiež vybraný hybridizáciou z chromozomálnej DNA knižnice baktérie patriacej do rodu Escherichia pripravením sondy na základe známych sekvencií. Alternatívne môže byť DNA kódujúca aminokyselinový vylučovací proteín syntetizovaná na základe známych sekvencií. Príklady nukleotidovej sekvencie DNA kódujúcej aminokyselinový vylučovací proteín sú uvedené v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 9,11,13 alebo 15.
-9Spôsoby prípravy chromozomálnej DNA, prípravy chromozomálnej DNA knižnice, hybridizácie, PCR, prípravy plazmidovej DNA, štiepenia a ligácie DNA, transformácie, výberu oligonukleotidov ako primerov a podobne, sú bežnými metódami, ktoré sú dobre známe odborníkovi v oblasti. Tieto metódy sú opísané v Sambrook, J., Fritsch, E. F., a Maniatis, T., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) a podobne.
Aminokyselinový vylučovací proteín môže obsahovať substitúcie, delécie, inzercie, pridanie alebo inverzie jednej alebo niekoľkých aminokyselín v jednej alebo vo viacerých polohách, s podmienkou, že nie je znehodnotená zvýšená schopnosť baktérie patriacej do rodu Escherichia a majúcej tento proteín, produkovať aminokyselinu. Výraz “niekoľko” sa môže meniť v závislosti na polohe v priestorovej štruktúre proteínu a na druhu aminokyselinového zvyšku. Je to z toho dôvodu, že niektoré aminokyseliny, ako napríklad izoleucín a valin, sú navzájom veľmi podobné a rozdiel medzi takýmito aminokyselinami veľmi neovplyvní priestorovú štruktúru proteínu.
DNA, ktorá kóduje v podstate rovnaký proteín ako aminokyselinový vylučovací proteín opísaný vyššie, je možné získať, napríklad, modifikáciou nukleotidovej sekvencie, napríklad, prostredníctvom spôsobu miestne-špecifickej mutagenézy tak, aby jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov na konkrétnom mieste zahŕňalo substitúciu, deléciu, inzerciu, pridanie alebo inverziu. DNA modifikovanú tak, ako je opísané vyššie, je možné získať bežne známym mutačným postupom. Mutačný postup zahŕňa spôsob in vitro ošetrenia DNA kódujúcej aminokyselinový vylučovací proteín, napríklad s hydroxylamínom a spôsob ošetrenia mikroorganizmu, napríklad, baktérie patriacej do rodu Escherichia, nesúcej DNA, ktorá kóduje aminokyselinový vylučovací proteín, ultrafialovým žiarením alebo mutačným činidlom, ako napríklad N-metyl-N'-nitro-Nnitrozoguanidínom (NG) a kyselinou dusitou, ktoré sa zvyčajne používajú na mutačné pôsobenie.
Substitúcia, delécia, inzercia, pridanie alebo inverzia jednej alebo viacerých aminokyselinových zvyškov zahŕňa prirodzene sa vyskytujúcu mutáciu alebo odchýlku, ktorá vyplýva z rozdielu medzi jednotlivými mikroorganizmami, ktoré majú
-10aminokyselinový vylučovací proteín a z rozdielu medzi druhmi, kmeňmi, alebo podobne.
DNA, ktorá kóduje v podstate rovnaký proteín ako aminokyselinový vylučovací proteín, je možné získať tak, že sa umožní, aby sa DNA, majúca vyššie opísanú mutáciu, exprimovala v bunke príslušnej baktérie patriacej do rodu Escherichia, a pátra sa po zvýšení aminokyselinovej produktivity bunky.
DNA, ktorá kóduje v podstate rovnaký proteín ako aminokyselinový vylučovací proteín, sa dá získať aj izolovaním DNA, ktorá hybridizuje s DNA, ktorá má, napríklad, nukleotidovú sekvenciu uvedenú v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 9, 11, 13 alebo 15, v prísnych podmienkach, a ktorá kóduje proteín, ktorý zvyšuje schopnosť baktérie patriacej do rodu Escherichia produkovať aminokyselinu, z DNA kódujúcich aminokyselinové vylučovacie proteíny, ktoré majú mutácie, alebo z buniek obsahujúcich tieto DNA. Výraz “prísne podmienky” tu znamená podmienky, v ktorých sa vytvára špecifický hybrid a nevytvára sa nešpecifický hybrid. Je ťažké jasne špecifikovať tieto podmienky použitím akýchkoľvek číselných hodnôt. Prísne podmienky, napríklad, zahŕňajú podmienky, v ktorých DNA s vysokou homológiu, napríklad DNA so vzájomnou homológiou nie nižšou ako 70% hybridizujú, a DNA so vzájomnou homológiou nižšou ako 70% nehybridizujú, alebo podmienky, v ktorých koncentrácia soli zodpovedá pri 60 °C 1 x SSC, 0,1 % SDS, výhodne 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, čo sú premývacie podmienky bežnej Southernovej hybridizácie.
Hoci medzi génmi, ktoré hybridizujú v takýchto podmienkach, môže byť gén, v ktorom je stop kodón vytvorený v strede, alebo gén kódujúci proteín, ktorý stratil aktivitu v dôsledku mutácie aktívneho centra, tieto sa dajú jednoducho eliminovať ligáciou génov z komerčne dostupným aktivitovým expresným vektorom a určením zvýšenej schopnosti baktérie patriacej do rodu Escherichia produkovať aminokyselinu, ako bolo opísané vyššie.
Tu použitý výraz “DNA kódujúci proteín znamená, DNA, ktorej jedno z vlákien kóduje proteín, ak je DNA dvojvláknová.
Zvýšením exprimovaného množstva aminokyselinového vylučovacieho proteínu v baktérii produkujúcej aminokyselinu, ktorá patrí do rodu Escherichia, ako bolo opísané vyššie, je možné zvýšiť produkované množstvo aminokyseliny. Ako
-11 baktéria patriaca do rodu Escherichia, v ktorej má byť zvýšené exprimované množstvo aminokyselinového vylučovacieho proteínu, sú použité kmene, ktoré majú schopnosť produkovať požadované aminokyseliny (aminokyselinové produktivity). Okrem toho môže byť schopnosť produkovať aminokyselinu dodaná baktérii, v ktorej je zvýšené exprimované množstvo aminokyselinového vylučovacieho proteínu. Príklady baktérií produkujúcich aminokyselinu, ktoré patria do rodu Escherichia, zahŕňajú E. coli AJ13199 (francúzsky patent č. 2747689) a tie, ktoré je možné získať zo známych materiálov (napr. E. coli ^3^0 (tyrA)/pCABD2, E. coli VL614, E. coli VL2054, E. coli VL2160, E. coli VL2151, E. coli W3350 arigE::Tn10/pKA10 ako je opísané nižšie, v príkladoch).
Prvýkrát bol aminokyselinový vylučovací proteín podľa predloženého vynálezu identifikovaný ako je opísané nižšie.
Pôvodcovia predloženého vynálezu identifikovali rhtB a rhtC ako gény treoninového vylučovacieho proteínu baktérie patriacej do rodu Escherichia. Pôvodcovia prehľadávali databázy na základe hypotézy, že aminokyselinové vylučovacie proteíny môžu zdieľať spoločnú štruktúru. Konkrétne sa uskutočnilo BLAST a PSI-BLAST prehľadávanie (Altschul, S. F. et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402 (1997)) na základe homológie proteínu kódovaného rhtB v GenBank CDS, PDB, SWISS-PROT, Spupdate a PIR. Tblastn prieskum sa uskutočnil v nedokončených mikrobiálnych genómoch. BLITZ prieskum (Sturrock, S. S., a Collins, J. F., Mpsch verzia 1.3. Biocomputing research unit University of Edinburgh, UK (1993)) sa uskutočnil v SWALL databáze. SMART prieskum (Ogiwara, I. et al., Protein Sci., 5, 1991-1999 (1996) sa uskutočnil v databázach translácii a SWISSPROT. Zo vzoriek viac ako 60 sekvencií ostali YeaS (zodpovedajúci f212, prístupové č. AE000274 v GenBank), YahN (zodpovedajúci f223, prístupové č. AE000140 v GenBank), YfiK (zodpovedajúci o195, prístupové č. AE000344 v GenBank) a YggA (zodpovedajúci f211, prístupové č. AE000375 v GenBank) ako proteíny, ktoré môžu mať podobnú funkciu ako RhtB, z tých proteínov, ktoré pochádzajú z E. coli. Keďže funkcie ktoréhokoľvek z týchto génov boli neznáme, skúmali sa účinky skutočne získaných génov na MIC aminokyselín a aminokyselinových analógov a na produkciu aminokyselín, prostredníctvom zosilnenia ich ťl'PJC· ·
-12aktivít. Výsledkom bolo, že sa zistil účinok zvyšujúci MIC niektorých aminokyselín a analógov vo vzťahu k YeaS, YfiK, YahN a YggA. Ďalšie skúmanie odhalilo, že proteíny kódované týmito génmi vykazujú účinok, ktorý zvyšuje akumuláciu aminokyseliny, hoci môžu byť selektívne voči niektorým aminokyselinám.
(2) Spôsob podľa predloženého vynálezu
Spôsob podľa predloženého vynálezu zahŕňa kroky kultivácie baktérie podľa predloženého vynálezu v kultivačnom médiu, aby sa v médiu vyprodukovala a akumulovala aminokyselina, a izolácie aminokyseliny z média.
Vhodné aminokyseliny zahŕňajú lyzín, kyselinu glutámovú, alanín, valín, histidín, prolín a treonín, arginín a izoleucín.
V spôsobe podľa predloženého vynálezu sa môže kultivácia baktérie patriacej do rodu Escherichia, zozbieranie a purifikácia aminokyseliny z kvapalného média, uskutočňovať spôsobom, ktorý je podobný s bežným spôsobom produkcie aminokyseliny fermentáciou použitím baktérie. Médiom použitým na kultiváciu môže byť buď syntetické médium alebo prirodzené médium, pokiaľ médium obsahuje zdroj uhlíka a dusíka a minerály, a ak je to nevyhnuté nutričné látky, ktoré použitá baktéria potrebuje pre rast v príslušnom množstve. Zdroj uhlíka môže zahŕňať rôzne karbohydráty, ako napríklad glukózu a sacharózu, a rôzne organické kyseliny. V závislosti na asimilačnej schopnosti použitej baktérie môže byť použitý alkohol vrátane etanolu a glycerolu. Ako zdroj dusíka môžu byť použité amoniak, rôzne amónne soli, ako napríklad síran amónny, iné dusíkové zlúčeniny, ako napríklad amíny, prirodzené zdroje dusíka, ako napríklad peptón, sójový hydrolyzát a poštiepený fermentatívny mikroorganizmus. Ako minerály sú použité fosforečnan draselný, síran horečnatý, chlorid sodný, síran železnatý, síran manganatý, uhličitan vápenatý.
Kultivácia je výhodne kultúra v aeróbnom stave, ako napríklad pretrepávaná kultúra, a prevzdušnená a miešaná kultúra. Teplota kultúry je zvyčajne 20 až 40 °C, výhodne 30 až 38 °C. pH kultúry je zvyčajne medzi 5 a 9, výhodne medzi 6,5 a 7,2.
-13pH kultúry je možné nastaviť amoniakom, uhličitanom vápenatým, rôznymi kyselinami, rôznymi zásadami a tlmivými roztokmi. 1 až 3 dni kultivácie zvyčajne vedú ku akumulácii cieľovej aminokyseliny v médiu.
Izolácia aminokyseliny sa môže uskutočňovať po kultivácii odstránením pevných zložiek, ako napríklad buniek, z média centrifúgáciou alebo membránovou filtráciou, a potom zozbieranie a purifikáciu cieľovej aminokyseliny iónovou výmenou metódou, koncentračnou metódou a kryštálovou frakčnou metódou a podobne.
Predložený vynález bude konkrétnejšie vysvetlený nižšie, s odvolaním sa na príklady.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava DNA fragmentov, ktoré kódujú aminokyselinové vylučovacie proteíny
Bola stanovená celá nukleotidová sekvencia chromozómu E. coli kmeňa K12 (Science, 277, 1453-1474, 1997). Na základe publikovanej nukleotidovej sekvencie boli syntetizované primery a prostredníctvom PCR sa amplifikovali gény yahN, yfiK, yeaS a yggA.
1) Chromozomálna DNA E. coli kmeňa MG1655 sa použila ako templát
Chromozomálna DNA sa pripravila bežným spôsobom (Sambrook, J., Fritsch
E. F. a Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.). Pri PCR reakcii boli použité štandardné podmienky opísané v PCR protocols. Current methods and applications (White, B.A., vyd. Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993). Získané PCR produkty sa purifikovali bežným spôsobom a štiepili sa reštrikčnými enzýmami ako je opísané nižšie.
YahN gén sa amplifikoval použitím primerov č. 1 a č. 2.
-14Primer č. 1: gtgtggaacc gacgccggat (sekvencia komplementárna so sekvenciou od bázy 1885 po bázu 1904 v nukleotidovej sekvencii registrovanej pod prístupovým č. AE000140 v GenBank; sekv. č.: 17), a
Primer č. 2: tgttgtatgg tacggggttc gag (sekvencia od bázy 223 po bázu 245 v rovnakej sekvencii ako bolo uvedené vyššie; sekv. č.: 18).
Získaný PCR produkt bol po purifikácii štiepený reštrikčnými enzýmami Pstl a Stul a ligoval sa do vektora pUC21 (Vieira, Messing, Gene, 100, 189-194, 1991) poštiepeným enzýmami Pstl a EcoRV, použitím ligačného kitu. Potom sa uskutočnila transformácia kompetentných buniek E. coliTGl (Sambrook, J., Fritsch E. F. a Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.) produktom, a bunky sa vysiali na L médium (10 g/l Bacto tryptónu, 5 g/l kvasinkového extraktu, 5 g/l NaCl, 15 g/l agaru, pH 7,0) s obsahom 10 pg/ml IPTG (izopropyl-p-D-tiogalaktopyranozid) a 40 pg/ml X-gal (5-bróm-4-chlór-3-indolyl-p-D-galaktozid) a 100 pg/ml ampicilínu, a kultivovali sa cez noc. Vzniknuté biele kolónie sa odpichli a podrobili sa jednokolóniovej izolácii, aby sa získali transformanty. Z transformantov sa pripravil plazmid použitím spôsobu alkalickej extrakcie a bol označený ako pYAHN.
YeaS gén sa amplifikoval použitím primerov č. 3 a č. 4.
Primer č. 3: ctttgccaat cccgtctccc (sekvencia komplementárna so sekvenciou od bázy 7683 po bázu 7702 v nukleotidovej sekvencii registrovanej pod prístupovým č. AE000274 v GenBank; sekv. č.: 19);
Primer č. 4: gccccatgca taacggaaag (sekvencia od bázy 5542 po bázu 5561 v rovnakej sekvencii ako bolo uvedené vyššie; sekv. č.: 20).
Získaný PCR produkt bol po purifikácii štiepený reštrikčným enzýmom Aval a ligoval sa do vektora pUC19. Po transformácii E. coll TG1 ako bolo opísané vyššie, sa získal plazmid označený ako pYEAS.
YfiK gén sa amplifikoval použitím primerov č. 5 a č. 6.
Primer č. 5: gaagatcttg taggccggat aaggcg (sekvencia komplementárna so sekvenciou od bázy 4155 po bázu 4177 v nukleotidovej sekvencii registrovanej pod
-15prístupovým č. AE000344 v GenBank, s pridaným miestom pre reštrikčný enzým Bglll na jej 5'-koniec; sekv. č.: 21);
Primer č. 6: tggttttacc aattggccgc (sekvencia komplementárna s vyššie uvedenou sekvenciou od bázy 6307 po bázu 6326; sekv. č.: 22).
Získaný PCR produkt bol po purifikácii štiepený reštrikčnými enzýmami Bglll a Munl a ligoval sa do vektora pUC21 poštiepeného reštrikčnými enzýmami Bglll a EcoRI. Po transformácii E. coli TG1 ako bolo opísané vyššie, sa získal plazmid označený ako pYFIK.
YggA gén sa amplifikoval použitím primerov č. 7 a č. 8.
Primer č. 7: acttctcccg cgagccagtt c (sekvencia komplementárna so sekvenciou od bázy 9606 po bázu 9626 v nukleotidovej sekvencii registrovanej pod prístupovým č. AE000375 v GenBank; sekv. č.: 23);
Primer č. 8: ggcaagctta gcgcctctgt t (sekvencia komplementárna s vyššie uvedenou sekvenciou od bázy 8478 po bázu 8498; sekv. č.: 24).
Získaný PCR produkt bol po purifikácii štiepený reštrikčnými enzýmami Hindlll a Clal a ligoval sa do vektora pOK12 (Vieira, Messing, Gene, 100, 189-194, 1991) poštiepeného rovnakými reštrikčnými enzýmami. Po transformácii E. coliľGI ako bolo opísané vyššie, sa získal plazmid označený ako pYGGA.
2) Ako templát bola použitá chromozomálna DNA E. coli kmeňa W3110
YahN gén sa amplifikoval použitím primerov č. 9 (sekv. č. 1) a č. 10 (sekv. č. 2).
YeaS gén sa amplifikoval použitím primerov č. 11 (sekv. č. 3) a č. 12 (sekv. č. 4).
YfiK gén sa amplifikoval použitím primerov č. 13 (sekv. č. 5) a č. 14 (sekv. č. 6).
YggA gén sa amplifikoval použitím primerov č. 15 (sekv. č. 7) a č. 16 (sekv. č. 8).
Získaný PCR produkt sa purifikoval, štiepil sa s reštrikčnými enzýmami Sad a Xbal (EcoRI a Pstl pre yggA) a ligoval sa do plazmidu pMW118 (Nippon Gene).
- 16Plazmidy, do ktorých boli zavedené DNA fragmenty, ktorých sekvencie boli identická s uvedenými sekvenciami, boli označené nasledovne: plazmid nesúci yahN: pMW118: :yahA/ plazmid nesúci yeaS: pMW118::yeaS plazmid nesúci yfiK: pMW118::y/7K plazmid nesúci yggA: pMW118::yggA
Príklad 2
Účinok amplifikácie yahN, yeaS, yfiK a yggA DNA fragmentov na E. coli TG1 rezistenciu k niektorým aminokyselinám a aminokyselinovým analógom
Homológia yeaS, yfiK, yahN a yggA génových produktov s lyzínovým transportérom, LysE z Corynebacterium glutamicum (Vrljic et al., Mol. Microbiol., 22, 815-826, 1996) a RhtB proteinom zúčastňujúcim sa na vylučovaní homoserínu, naznačuje analogické funkcie týchto proteínov. Je dobre známe, že zvýšenie expresie génov, zúčastňujúcich sa na vyplavovaní antibiotík a ťažkých kovov, zvyšuje úroveň rezistencie voči liečivám (Nikaido, H.J. Bacteriology, 178, 58535859, 1996). Preto bol testovaný účinok pYEAS, pYAHN, pYFIK, a pYGGA plazmidov na náchylnosť kmeňa TG1 ku niektorým aminokyselinám a aminokyselinovým analógom. Nočné kultúry E. coli kmeňov TG1/pYEAS, TG1/pYAHN, TG1/pYFIK, TG1/pYGGA a kontrolných kmeňov TG1/pUC21, TG1/pUC19 a TG1/pOK12 vyrastených v M9 minimálnom médiu s príslušným antibiotikom na rotačnej trepačke (10® cfu/ml) sa nariedili v pomere 1:100 v M9 minimálnom médiu a rástli 5 hodín v rovnakom médiu. Takto získané kultúry v logaritmickej fáze sa potom nariedili a približne 104 živých buniek sa aplikovalo na dobre vysušené testovacie platne s M9 agarom obsahujúcom dvojnásobne sa zvyšujúce množstvá aminokyselín alebo analógov. Tak boli skúmané minimálne inhibičné koncentrácie (MIC) týchto zlúčenín.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 1. Z tabuľky 1 vyplýva, že viacnásobné kópie yfiK génu zvyšujú rezistenciu ku prolínu, homoserínu, histidínu, treonínu, glutamátu, lyzínu, a-amino-3-hydroxyvalérovej kyseline (AHV), S-(2-aminoetyl)-L-cysteínu
-17(AEC) a α-aminobutyrovej kyseline; viacnásobné kópie yahN génu zvyšujú rezistenciu ku prolínu, viacnásobné kópie yeaS génu zvyšujú rezistenciu ku treonínu, homoserínu, lyzínu, glutamátu, histidínu, prolínu a ku a-aminobutyrovej kyseline; viacnásobné kópie yggA génu zvyšujú rezistenciu ku S-(2-aminoetyl)-Lcysteinu (AEC), lyzínu, a arginínu. Z týchto výsledkov vyplýva, že okrem YahN, každý z predpokladaných transportérov má špecificitu k niekoľkým substrátom (aminokyselinám a aminokyselinovým analógom) alebo môže, ako výsledok amplifikácie, vykazovať nešpecifické účinky.
Tabuľka 1
Substrát MIC (pg/ml) pre E. coli TG1, ktorá obsahuje plazmid
pUC21 pYFIK pYAHN pYEAS pYGGA
L-homoserin 500 1000 500 1000 500
L-treonín 30000 40000 30000 50000 30000
L-lyzín 5000 7500 5000 7500 15000
L-glutamát (sodná soľ) 5000 10000 5000 20000 5000
L-histidín 5000 10000 5000 30000 5000
L-valín 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
L-prolín 1000 5000 2000 2000 1000
L-arginín 10000 10000 10000 10000 20000
AHVA 100 200 100 100 100
AEC 5 10 5 5 200
α-aminobutyrová kyselina 2500 5000 2500 >10000 2500
4-aza-DL-leucín 100 100 100 100 100
Príklad 3
Účinok ampllifikácie yeaS, yahN a yfiK DNA fragmentov na produkciu kyseliny glutámovej
-18E. coli kmeň AJ13199 (FR patent č. 2747589) sa transformoval vektorom pUC21 a každým z plazmidov pYAHN, pYEAS a pYFIK. Tak sa získali kmene AJ13199/pUC21 (VKPM B-7728), AJ13199/pYAHN (VKPM B-7729), AJ13199/pYEAS (VKPM B-7731) a AJ13199/pYFIK (VKPM B-7730).
Z týchto kmeňov sa každý kultivoval pri 37 °C 18 hodín v nutričnom médiu so 100 mg/l ampicilínu a 0,3 ml získanej kultúry sa inokulovalo do 3 ml fermentačného média, obsahujúceho 100 mg/l ampicilínu, v 20 x 200 mm skúmavke, a kultivovalo sa pri 37 °C 48 hodín na rotačnej trepačke. Po kultivácii bolo naakumulované množstvo kyseliny glutámovej v médiu stanovené známym spôsobom.
Zloženie fermentačného média (g/l):
glukóza (NH4)2SO2 k2hpo4 NaCI 80 22 2 0,8
MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O MnSO4.5H2O Tiamín HCI 0,8 0,02 0,02 0,0002
kvasinkový extrakt CaCO3 1,0 30,0 (suchým teplom sterilizované pri 180 °C 2 hodiny)
(glukóza a K2HPO4 sa sterilizujú oddelene)
Výsledky sú uvedené v tabuľke 2. Ako je uvedené v tabuľke 2, kmene AJ13199/pYAHN, AJ13199/pYEAS, a AJ13199/pYFIK akumulovali kyselinu glutámovú vo väčšom množstve ako kmeň AJ13199/pUC21, v ktorom nebolo zvýšené exprimované množstvo aminokyselinových vylučovacích proteínov.
-19Tabuľka 2
Kmeň Kyselina glutámová, g/l
AJ13199/pUC21 AJ13199/pYAHN AJ13199/pYEAS AJ13199/pYFIK 21.9 27.9 29,7 28,4
Príklad 4
Účinok amplifikácie yeaS, yeahN a yfíK DNA fragmentov na produkciu lyzínu (1) Ako lyzín produkujúca baktéria patriaca do rodu Escherichia, bol použitý E. coli kmeň VV3110 (TyrA) (opísaný v európskej zverejnenej prihláške vynálezu č. 488424, do ktorého bol začlenený plazmid pCABD2 opísaný v medzinárodnom zverejnení č. WO 95/16042). Konkrétne boli do kmeňa E. coli W3110 (TyrA) zvedené každý z plazmidov pMV118::yahN, pMW118:.yeaS, pMW118:.yfíK a pMW118, aby sa získali nasledujúce kmene: W3110 (tyrA)/pCABD2+pMW118::yahN W3110 (tyrA)/pCABD2+pMW118::yeaS W3110 (tyrA)/pCABD2+pMW118::yffK W3110 (tyrA)/pCABD2+pMW118.
Produktivita lyzínu týmito kmeňmi sa stanovila kultiváciou. Zloženie média bolo nasledovné (g/l):
glukóza MgSO4.7H2O (NH4)2SO2 k2hpo4 FeSO4.7H2O MnSO4.7H2O Tiamín HCI 40 1.0 16,0 1.0 0,01 0,01 0,0002
kvasinkový extrakt (Difco) 1,0
-20pH sa upravilo na 7,0 a médium sa autoklávovalo pri 115 °C počas 10 minút. (Glukóza a MgSO4.7H2O sa sterilizovali oddelene) liekopisový CaCO3 25 g/l (suchým teplom sterilizovaný pri 180 °C 2 hodiny)
Ako antibiotiká boli pridané 20 mg/l streptomycínu a 50 mg/l ampicilínu v závislosti na druhu plazmidu. Kultivácia sa uskutočňovala pri 37 °C počas 30 hodín s trepaním pri 115 otáčok/minútu. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3
Kmeň Lyzín g/l Výťažok (%)
W3110(tyrA) 0,08 0,2
W3110 (tyrA)/pCABD2 + pMW118 12,2 30,5
W3110 (tyrA)/pCABD2 + pMW118::yahN 13,8 34,5
W3110 (tyrA)/pCABD2 + pMW118::yeaS 12,7 31,8
W3110 (tyrA)/pCABD2 + pMW118::yfiK 12,2 30,5
Výsledok v tabuľke 3 ukazuje, že vyprodukované množstvo a výťažok na základe spotrebovaného sacharidu lyzínu je zvýšené zosilnením YahN a YeaS.
(2) Ako lyzín produkujúca baktéria, patriaca do rodu Escherichia, bol použitý kmeň E. coli VL614. Tento kmeň je odvodený od známeho E. coli kmeňa VL613 (SU patent č. 1354458). Na druhej strane kmeň VL613 bol získaný zo známeho kmeňa Gif102 (Theze, J. a Saint Girons. J. Bacteriol., 118, 990-998, 1974) v troch krokoch:
V prvom kroku boli vybrané mutanty rezistentné voči 2 mg/ml S-(2aminoetyl)-Ľ-cysteínu a medzi nimi boli nájdený kmeň VL611, ktorý je schopný produkovať L-lyzín.
V druhom kroku boli do VL611 zavedené gény zúčastňujúce sa na využívaní sacharózy a umiestnené na transpozóne Tn2555 (Doroshenko et al., Mol. Biologiya, 22, 645-658,1988) použitím fágom P1 sprostredkovanej transdukcie, čím vznikol kmeň VL612.
V treťom kroku bola do VL612 zavedená mutácia rhtA23 z kmeňa VKPM B3996, ktorý dáva rezistenciu voči treonínu a homoserínu (US patent č. 5 175 107) prostredníctvom P1 fágovej transdukcie, čím vznikol kmeň VL613.
E. coli kmeň VL614 sa získal transdukciou divého typu alely rhtA génu z E. coli kmeňa VKPM B-6204 (MG1655 zb/3058::Tn10) do VL613. Transduktanty boli vyselektované na L-médiu obsahujúcom 10 mg/l tetracyklínu a medzi nimi bol nájdený kmeň VL614 (rhtA*) senzitívny voči 10 g/l homoserínu.
Kmeň VL614 sa transformoval pYGGA plazmidom alebo pOK12 vektorom, aby sa získali kmene VL614/pYGGA (VKPM B-7719) a VL614/pOK12 (VKPM B7722).
Z týchto kmeňov sa každý kultivoval pri 37 °C 18 hodín v nutričnom médiu s 50 mg/l kanamycínu a 0,3 ml získanej kultúry sa inokulovalo do 3 ml fermentačného média (príklad 3), obsahujúceho 0,3 g/l treonínu, 0,3 g/l metionínu a 50 mg/l kanamycínu, v 20 x 200 mm skúmavke, a kultivovalo sa pri 37 °C 48 hodín na rotačnej trepačke. Po kultivácii bolo naakumulované množstvo lyzinu a glutamátu v médiu stanovené známym spôsobom.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.
Tabuľka 4
Kmeň Lyzin, q/l Glutamát q/l
VL614/pOK12 2,6 0,8
VL614/pYGGA 3,6 2,2
Ako je ukázané v tabuľke 4, kmeň VL614/pYGGA akumuloval lyzin vo väčšom množstve ako kmeň VL614/pOK12, v ktorom nebol posilnený yggA gén.
-22Okrem toho, kmeň VL614/pYGGA akumuloval viac kyseliny glutámovej ako kmeň VL614/pOK12.
Príklad 5
Účinok amplifikácie yeaS, yahN a yfiK DNA fragmentov na produkciu treonínu, alanínu, valínu a izoleucínu
Ako treonín produkujúca baktéria patriaca do rodu Escherichia bol použitý E. coli kmeň VL2054. Tento kmeň bol odvodený od známeho E. coli kmeňa VKPM B3996 (US patent č. 5 175 107) nasledovne:
Najprv bol v niekoľkých krokoch skonštruovaný nový recipientný kmeň:
Bezplazmidové deriváty kmeňa VKPM B-3996 sa vybrali po spontánnej eliminácii pVIC40 plazmidu. Alela divého typu rhtA génu z E. coli kmeňa VKPM B6204 (MG1655 zb/3058::Tn10) sa zaviedla do takto získaného kmeňa, prostredníctvom P1 fágom sprostredkovanej transdukcie, rovnako ako v príklade 4.
Mutáciou inaktivovaný kan gén Tn5 transpozónu, začlenený do thd génu, sa získal po NG mutagenéze a selekcii kanamycín-senzitívnych buniek, ktoré ešte neboli schopné degradovať treonín. Tak sa získal kmeň VL2053.
Na druhej strane sa klonoval treonínový operón z pVIC40 do integračného Mud vektora pod kontrolu PR promótora lambda fágu. Ďalej bol do rovnakého vektora klonovaný cat gén z Tn9, ktorý zabezpečuje rezistenciu voči chloramfenikolu. Takto získaný konštrukt sa začlenil do chromozómu E. coli kmeňa C600 použitím známeho spôsobu (US patent č. 5 595 889) a transdukoval sa z takto získaného kmeňa do VL2053, čím vznikol nový, bezplazmidový kmeň VL2054, ktorý produkoval treonín. Tento kmeň akumuloval v kultivačnom médiu aj alanín, valín a izoleucín.
Kmeň VL2054 sa transformoval každým z plazmidov pYEAS, pYFIK a vektorom pUC21, aby sa získali E. coli kmene VL2054/pYEAS (VKPM B-7707), VL2054/pYFIK (VKPM B-7712) a VL2054/pUC21 (VKPM B-7707).
Každý z týchto kmeňov sa kultivoval pri 37 °C počas 18 hodín v nutričnom médiu so 100 mg/l ampicilínu a 0,3 ml získanej kultúry sa inokulovalo do 3 ml
-23fermentačného média (príklad 3), ktoré obsahovalo 100 mg/l ampicilínu, v 20 x 200 mm skúmavke, a kultivovalo sa pri 37 °C počas 48 hodín na rotačnej trepačke. Po kultivácii sa v médiu akulumované množstvá alanínu, valínu a izoleucínu určili známym spôsobom.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 5.
Ako je uvedené v tabuľke 5, kmeň VL2054/pYFIK akumuloval treonín vo väčšom množstve ako kmeň VL2054/pUC21, v ktorom nebol zosilnený gén yfíK. Okrem toho kmeň VL2054/pYEAS akumuloval viac alanínu, valínu a izoleucínu ako kmeň VL2054/pUC21, v ktorom nebol zosilnený gén yeaS.
Tabuľka 5
Kmeň Akumulácia aminokyseliny, g/l
treonín alanín valín izoleucín
VL2054/pUC21 5,8 0,4 0,31 0,15
VL2054/pYEAS 5,2 1,4 0,52 0,45
VL2054/pYFIK 8,8 0,5 0,22 0,14
Príklad 6
Účinok amplifikácie yeaS a yfíK DNA fragmentov na produkciu histidínu
Ako histidín produkujúca baktéria patriaca do rodu Escherichia, bol použitý E. coli kmeň VL2160. Tento kmeň sa získal na základe známeho kmeňa NK5526 rí/sG:.Tn10 (VKPM B-3384) transdukciou hisGR mutácie, ktorá potláča citlivosť ATPfosforibozyltransferázy, sprostredkovanou P1 fágom, z kmeňa CC46 (Astvatsaturianz et al., Genetika, 24, 1928-1934, 1988). Kmeň E. coli VL2160 sa transformoval každým z plazmidov pYEAS, pYFIK a vektorom pUC21, aby sa získali E. coli kmene VL2160/pYEAS (VKPM B-7753), E. coli VL2160/pYFIK (VKPM B-7754), E. coli VL2160/pUC21 (VKPM B-7752).
-24Každý z týchto kmeňov sa kultivoval pri 37 °C počas 18 hodín v nutričnom médiu so 100 mg/l ampicilínu a 0,3 ml získanej kultúry sa inokulovalo do 3 ml fermentačného média (príklad 3), ktoré obsahovalo zvýšené množstvo kvasinkového extraktu (3 g/l) a 100 mg/l ampicilínu, v 20 x 200 mm skúmavke, a kultivovalo sa pri 34 °C počas 68 hodín na rotačnej trepačke.
Po kultivácii sa v médiu akumulované množstvo histidínu určilo známym spôsobom. Výsledky sú uvedené v tabuľke 6.
Tabuľka 6
Kmeň Histidín, g/l
VL2160/pUC21 1,2
VL2160/pYEAS 1,8
VL2160/pYFIK 1,4
Ako je uvedené v tabuľke 6, kmene E. coli VL2160/pYEAS a E. coli VL2160/pYFIK akumulovali histidín vo vyššom množstve ako kmeň E. coli VL2160/pUC21, v ktorom neboli zosilnené gény yeaS a yfiK.
Príklad 7
Účinok amplifikácie yahN, yfiK a yeaS DNA fragmentov na produkciu prolínu
Ako prolín produkujúca baktéria patriaca do rodu Escherichia, bol použitý kmeň VL2151 (W3350 proB* AputAP Tn10). Tento kmeň sa získal transdukciou ÁputAP mutácie napojenej na Tn10 do W3350 a selekciou tetracyklín rezistentných mutantov neschopných využívať prolín ako jediný zdroj uhlíka. Takto získaný kmeň W3350 ΔρυίΑΡ Tn10 bol mutovaný s NG a vybrali sa mutanty rezistentné voči 20 mg/l 3,4-dehydro-DL-prolínu. Medzi nimi bol nájdený VL2151 kmeň (W3350 proB* Δρι/ίΑΡ Tn10), ktorý je schopný produkovať prolín.
-25Kmeň E. coli VL2151 sa transformoval každým z plazmidov pYEAS, pYFIK, pYAHN a vektorom pUC21, aby sa získali E. coli kmene VL2151/pYEAS (VKPM B7714), VL2151/pYFIK (VKPM B-7713), VL2151/pYAHN (VKPM B-7748) a E. coli VL2151/pUC21 (VKPM B-7715).
Každý z týchto kmeňov sa kultivoval pri 37 °C počas 18 hodín v nutričnom médiu so 100 mg/l ampicilínu a 0,3 mi získanej kultúry sa inokulovalo do 3 ml fermentačného média (príklad 3), ktoré obsahovalo 100 mg/l ampicilínu, v 20 x 200 mm skúmavke, a kultivovalo sa pri 37 °C počas 48 hodín na rotačnej trepačke. Po kultivácii sa v médiu akumulované množstvo prolínu určilo známym spôsobom. Výsledky sú uvedené v tabuľke 7.
Tabuľka 7
Kmeň Prolín, g/l
VL2151/pUC21 1.8
VL2151/pYAHN 2,2
VL2151/pYEAS 2,1
VL2151/pYFIK 2,5
Ako je uvedené v tabuľke 7, kmene E. coli VL2151/pYFIK, E. coli VL2151/pYAHN a E. coli VL2151 /pYEAS akumulovali prolín vo vyššom množstve ako kmeň E. coli VL2151/pUC21, v ktorom neboli zosilnené gény yfiK, yahN a yeaS. Amplifikácia génu yfiK mala najzreteľnejší účinok.
Príklad 8
Účinok amplifikácie yggA DNA fragmentov na produkciu arginínu
Ako arginín produkujúca baktéria, patriaca do rodu Escherichia, bol použitý kmeň W3350 argE;.Tn10/pKA10. Tento kmeň obsahuje plazmid pKA10, ktorý obsahuje DNA oblasť z Corynebacterium (Brevibacterium) flavum, ktorá je
-26komplementárna aspoň s argA a argE mutáciami v recipientom kmeni E. coli K-12 (Kharitonov A. a Tarasov A.P. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. č. 9, 29-33, 1986).
Kmeň E. coli\N3350 argE;:Tn10/pKA10 sa transformoval plazmidom pYGGA alebo vektorom pOK12, aby sa získali kmene E. coli W3350 aryE;.Tn10/pKA10, pYGGA (VKPM B-7716) a E. coli W3350 argE:.Tn10/pKA10, pOK12 (VKPM B7718).
Každý z takto získaných kmeňov sa kultivoval pri 37 °C počas 18 hodín v nutričnom médiu so 100 mg/l ampicilínu a 50 mg/l kanamycínu, a 0,3 ml získanej kultúry sa inokulovalo do 3 ml fermentačného média (príklad 3), ktoré obsahovalo 100 mg/l ampicilínu a 50 mg/l kanamycínu, v 20 x 200 mm skúmavke, a kultivovalo sa pri 37 °C počas 48 hodín na rotačnej trepačke. Po kultivácii sa v médiu akumulované množstvo arginínu určilo známym spôsobom.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 8.
Tabuľka 8
Kmeň Arginín, g/l
W3350 argE::Tn10/pKA10, pOK12 0,11
W3350 argE::Tn10/pKA10, pYGGA 0,46
Ako je uvedené v tabuľke 8, kmeň E. coli W3350 argE:;Tn10/pKA10, pYGGA akumuloval arginín vo vyššom množstve ako kmeň E. coli W3350 argE;.Tn10/pKA10, pOK12, v ktorom nebol zosilnený gén yggA.
Nasledujúce kmene E. coli boli uložené (v súlade s medzinárodným deponovaním na základe budapeštianskej dohody) v Ruskej národnej zbierke priemyselných mikroorganizmov (VKPM), 29. decembra, 1998, pod prístupovými číslami uvedenými v zátvorkách.
AJ13199/pUC21 (VKPM B-7728) AJ13199/pYAHN (VKPM B-7729)
-27AJ13199/pYEAS (VKPM B-7731)
AJ13199/pYFIK (VKPM B-7730)
VL614/pYGGA (VKPM B-7719)
VL614/pOK12 (VKPM B-7722)
VL2054/pYEAS (VKPM B-7707)
VL2054/pYFIK (VKPM B-7712)
VL2054/pUC21 (VKPM B-7708)
VL2160/pYEAS (VKPM B-7753)
VL2160/pYFIK (VKPM B-7754)
VL2160/pUC21 (VKPM B-7752)
VL2151/pYFIK (VKPM B-7713)
VL2151/pYEAS (VKPM B-7714)
VL2151/pYAHN (VKPM B-7748)
VL2151/pUC21 (VKPM B-7715)
W3350 argE.'.TnlO/pKAlO, pYGGA (VKPM B-7716)
W3350 a/pE”Tn1O/pKA1O, pOK12 (VKPM B-7718)
-28Zoznam sekvencií <110> Livshits, Vitaliy Arkadievich
Zakataeva, Natalia Pavlovna
Nakanishi, Kazuo
Aleshin, Vladimír Veniaminovich
Troshin, Petr Vladimirovich
Tokhmakova, Irina Lyvovna <120> Spôsob výroby L-aminokyseliny <130 <160 24 <210> 1 <211 >27 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220 <223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yahN génu <400 1 ggcgagctcc cagtaaccgg aaataag 27 <210 2 <211 >27 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220 <223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yahN génu
-29<400> 2 cgctctagaa aggaccacgc attacgg 27 <210>3 <211 >27 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escheríchia coli yeaS génu <400 3 ggcgagctca gattggttag catattc 27 <210>4 <211> 27 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escheríchia coli yeaS génu <400>4 cggtctagaa tcagcgaaga atcaggg 27 <210>5 <211 >27 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escheríchia coli yfiK génu
-30<400> 5 ggcgagctca tgttccgtgt cgggtac <210>6 <211 >27 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yfiK génu <400> 6 ggctctagat agcaagttac taagcgg 27 <210>7 <211 >35 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yggA génu <400> 7 ctctgaattc tctcttatta gtttttctga ttgcc 35 <210>8 <211 >38 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yggA génu
-31 <400> 8 cgtgacctgc agcgttctca cagcgcggta gcctttaa <210>9 <211 >672 <212> DNA <213> Escherichia coli <220>
<221>CDS <222> (1)..(672) <400>9
atg atg cag tta gtt cac tta ttt atg gat gaa atc act atg gat cct 48
Met Met Gin Leu Val His Leu Phe Met Asp Glu íle Thr Met Asp Pro
1 5 10 15
ttg cat gcc gtt tac ctg acc gta gga ctg ttc gtg att act ttt ttt 96
Leu His Ala Val Tyr Leu Thr Val Gly Leu Phe Val íle Thr Phe Phe
20 25 30
aat ccg gga gcc aat ctc ttt gtg gta gta caa acc age ctg get tcc 144
Asn Pro Gly Ala Asn Leu Phe Val Val Val Gin Thr Ser Leu Ala Ser
35 40 45
ggt ega ege gca ggg gtg ctg acc ggg ctg ggc gtg gcg ctg ggc gat 192
Gly Arg Arg Ala Gly Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Ala Leu Gly Asp
50 55 60
gca ttt tat tcc ggg ttg ggt ttg ttt ggt ctt gca acg cta att acg 240
Ala Phe Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Thr Leu íle Thr
65 70 75 80
cag tgt gag gag att ttt tcg ctt atc aga atc gtc ggc ggc get tat 288
Gin Cys Glu Glu íle Phe Ser Leu Íle Arg íle Val Gly Gly Ala Tyr
85 90 95
ctc tta tgg ttt gcg tgg tgc age atg ege ege cag tca aca ccg caa 336
Leu Leu Trp Phe Ala Trp Cys Ser Met Arg Arg Gin Ser Thr Pro Gin
100 105 110
atg age aca cta caa caa ccg att age gcc CCC tgg tat gtc ttt ttt 384
Met Ser Thr Leu Gin Gin Pro íle Ser Ala Pro Trp Tyr Val Phe Phe
115 120 125
cgc cgc gga tta att acc gat ctc tet aac ccg caa acc gtt tta ttt 432
Arg Arg Gly Leu íle Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gin Thr Val Leu Phe
130 135 140
ttt atc agt att ttc tca gta aca tta aat gcc gaa aca cca aca tgg 480
Phe íle Ser íle Phe Ser Val Thr Leu Asn Ala Glu Thr Pro Thr Trp
145 150 155 160
gca cgt tta atg gcc tgg gcg ggg att gtg ctc gca tca att atc tgg 528
Ala Arg Leu Met Ala Trp Ala Gly íle Val Leu Ala Ser íle íle Trp
165 170 175
ega gtt ttt ctt agt cag gcg ttt tet ttg ccc get gtg cgt cgt get 576
Arg Val Phe Leu Ser Gin Ala Phe Ser Leu Pro Ala Val Arg Arg Ala
180 185 190
tat 999 cgt atg caa cgc gtt gcc agt cgg gtt att ggt gca att att 624
Tyr Gly Arg Met Gin Arg Val Ala Ser Arg Val íle Gly Ala íle íle
195 200 205
ggt gta ttc gcg cta cgc ctg att tac gaa ggg gtg acg cag cgg tga 672
Gly Val Phe Ala Leu Arg Leu íle Tyr Glu Gly Val Thr Gin Arg
210 215 220 <210> 10 <211 >223 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 10
Met Met Gin Leu Val His Leu Phe Met Asp Glu íle Thr Met Asp Pro
1 5 10 15
Leu His Ala Val Tyr Leu Thr Val Gly Leu Phe Val íle Thr Phe Phe
20 25 30
Asn Pro Gly Ala Asn Leu Phe Val Val Val Gin Thr Ser Leu Ala Ser
35 40 45
Gly Arg Arg Ala Gly Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Ala Leu Gly Asp
50 55 60
Ala Phe Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Thr Leu íle Thr
65 70 75 80
Gin Cys Glu Glu íle Phe Ser Leu íle Arg íle Val Gly Gly Ala Tyr
90 95
Leu Leu Trp Phe Ala Trp Cys Ser Met Arg Arg Gin Ser Thr 110 Pro Gin
100 105
Met Ser Thr Leu Gin Gin Pro íle Ser Ala Pro Trp Tyr Val Phe Phe
115 120 125
Arg Arg Gly Leu íle Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gin Thr Val Leu Phe
130 135 140
Phe íle Ser íle Phe Ser Val Thr Leu Asn Ala Glu Thr Pro Thr Trp
145 150 155 160
Ala Arg Leu Met Ala Trp Ala Gly íle Val Leu Ala Ser íle íle Trp
165 170 175
Arg Val Phe Leu S,r Gin Ala Phe Ser Leu Pro Ala Val Arg Arg Ala
180 185 190
Tyr Gly Arg Met Gin Arg Val Ala Ser Arg Val íle Gly Ala íle íle
195 200 205
Gly Val Phe Ala Leu Arg Leu íle Tyr Glu Gly Val Thr Gin Arg
210 215 220
<210> 11 <211 >639 <212> DNA <213> Escherichia coli <220>
<221 > CDS <222> (1)..(639) <400> 11
gtg ttc get gaa tac ggg gtt ctg aat tac tgg acc tat ctg gtt ggg
Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly
1 5 10 15
gcc att ttt att gtg ttg gtg cca ggg cca aat acc ctg ttt gta ctc
Ala íle Phe íle Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu
20 25 30
aaa aat age gtc agt age ggt atg aaa ggc ggt tat ctt gcg gcc tgc
Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys
40
144
ggt gta ttt att ggc gat gcg gta ttg atg ttt ctg gca tgg get gga 192
Gly Val Phe íle Gly Asp Ala Val Leu Mét Phe Leu Ala Trp Ala Gly
50 55 60
gtg gcg aca tta att aag acc acc ccg ata tta ttc aac att gta cgt 240
Val Ala Thr Leu íle Lys Thr Thr Pro íle Leu Phe Asn íle Val Arg
65 70 75 80
tat ctt ggt gcg ttt tat ttg ctc tat ctg ggg agt aaa att ctt tac 288
Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys íle Leu Tyr
85 90 95
gcg acc ctg aag ggt aaa aat age gag gcc aaa tcc gat gag ccc caa 336
Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gin
100 105 110
tac ggt get att ttt aaa ege gcg tta att ttg age ctg act aat ccg 384
Tyr Gly Ala íle Phe Lys Arg Ala Leu íle Leu Ser Leu Thr Asn Pro
115 120 125
aaa gcc att ttg ttc tat gtg tcg ttt ttc gta cag ttt atc gat gtt 432
Lys Ala íle Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gin Phe íle Asp Val
130 135 140
aat gcc cca cat acg gga att tca ttc ttt att ctg gcg gcg acg ctg 480
Asn Ala Pro His Thr Gly íle Ser Phe Phe íle Leu Ala Ala Thr Leu
145 150 155 160
gaa ctg gtg agt ttc tgc tat ttg age ttc ctg att ata tet ggt get 528
Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu íle íle Ser Gly Ala
165 170 175
ttt gtc acg cag tac ata cgt acc aaa aag aaa ctg get aaa gtt ggc 576
Phe Val Thr Gin Tyr íle Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly
180 185 190
aac tca ctg att ggt ttg atg ttc gtg ggt ttc get gcc ega ctg gcg 624
Asn Ser Leu íle Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala
195 200 205
acg ctg caa tcc tga 639
Thr Leu Gin Ser
210 <210> 12 <211> 212 <212> PRT <213> Escherichia coli
<400> 12
Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu
1 5
Ala íle Phe íle Val Leu Val Pro
20
Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met
35 40
Gly Val Phe íle Gly Asp Ala Val
50 55
Val Ala Thr Leu íle Lys Thr Thr
65 70
Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu
85
Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser
100
Tyr Gly Ala íle Phe Lys Arg Ala
115 120
Lys Ala íle Leu Phe Tyr Val Ser
130 135
Asn Ala Pro His Thr Gly íle Ser
145 150
Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu
165
Phe Val Thr Gin Tyr íle Arg Thr
180
Asn Ser Leu íle Gly Leu Met Phe
195 200
Thr Leu Gin Ser
210
Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly
10 15
Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu
25 30
Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys
45
Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly
60
Pro íle Leu Phe Asn íle Val Arg
75 80
Tyr Leu Gly Ser Lys íle Leu Tyr
90 95
Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gin
105 110
Leu íle Leu Ser Leu Thr Asn Pro
125
Phe Phe Val Gin Phe íle Asp Val
140
Phe Phe íle Leu Ala Ala Thr Leu
155 160
Ser Phe Leu íle íle Ser Gly Ala
170 175
Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly
185 190
Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala
205
<210> 13 <211>588 <212> DNA <213> Escheríchia coli <220>
<221 > CDS <222> (1)..(588) <400> 13
gtg aca ccg acc ctt tta agt get ttt tgg act tac acc ctg att acc 48
Met Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu íle Thr
1 5 10 15
get atg acg cca gga ccg aac aat att ctc gcc ctt age tet get acg 96
Ala Met Thr Pro Gly Pro Asn Asn íle Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr
20 25 30
tcg cat gga ttt cgt caa agt acc ege gtg ctg gca ggg atg agt ctg 144
Ser His Gly Phe Arg Gin Ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met Ser Leu
35 40 45
gga ttt ttg att gtg atg tta ctg tgt gcg ggc att tca ttt tca ctg 192
Gly Phe Leu I.le Val Met Leu Leu Cys Ala Gly íle Ser Phe Ser Leu
50 55 60
gca gtg att gac ccg gca gcg gta cac ctt ttg agt tgg gcg ggg gcg 240
Ala Val Zle Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala
65 70 75 80
gca tat att gtc tgg ctg gcg tgg aaa atc gcc acc age cca aca aag 288
Ala Tyr íle Val Trp Leu Ala Trp Lys íle Ala Thr Ser Pro Thr Lys
85 90 95
gaa gac gga ctt cag gca aaa cca atc age ttt tgg gcc age ttt get 336
Glu Asp Gly Leu Gin Ala Lys Pro íle Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala
100 105 110
ttg cag ttt gtg aac gtc aaa atc att ttg tac ggt gtt acg gca ctg 384
Leu Gin Phe Val Asn Val Lys íle íle Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu
115 120 125
tcg acg ttt gtt ctg ccg caa aca cag gcg tta age tgg gta gtt ggc 432
Ser Thr Phe Val Leu Pro Gin Thr Gin Ala Leu Ser Trp Val Val Gly
130 135 140
gtc age gtt ttg ctg gcg atg att ggg acg ttt ggc aat gtg tgc tgg 480
Val Ser Val Leu Leu Ala Met íle Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp
145 150 155 160
gcg ctg gcg ggg cat ctg ttt cag ega ttg ttt ege cag tat ggt ege 528
Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gin Arg Leu Phe Arg Gin Tyr Gly Arg
165 170 175
cag tta aat atc gtg ctt gcc ctg ttg ctg gtc tat tgc gcg gta ege 576
Gin Leu Asn íle Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg
180 185 190
att ttc tat taa 588
íle Phe Tyr
195
-37<210> 14 <211> 195 <212> PRT <213> Escheňchia coli <400> 14
Met Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu íle Thr
1 5 10 15
Ala Met Thr Pro Gly Pro Asn Asn íle Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr
20 25 30
Ser His Gly Phe Arg Gin Ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met Ser Leu
35 40 45
Gly Phe Leu íle Val Met Leu Leu Cys Ala Gly íle Ser Phe Ser Leu
50 55 60
Ala Val íle Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala
65 70 75 80
Ala Tyr íle Val Trp Leu Ala Trp Lys íle Ala Thr Ser Pro Thr Lys
85 90 95
Glu Asp Gly Leu Gin Ala Lys Pro íle Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala
100 105 110
Leu Gin Phe Val Asn Val Lys íle íle Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu
115 120 125
Ser Thr Phe Val Leu Pro Gin Thr Gin Ala Leu Ser Trp Val Val Gly
130 135 140
Val Ser Val Leu Leu Ala Met íle Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp
145 150 155 160
Ala Leu Ala Gly H±s Leu Phe Gin Arg Leu Phe Arg Gin Tyr Gly Arg
165 170 175
Gin Leu Asn íle Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg
180 185 190
íle Phe Tyr
195 <210> 15 <211 >636 <212> DNA <213> Escheňchia coli
-38<220>
<221>CDS <222> (1)..(636) <400> 15
gtg ttt tct tat tac ttt caa ggt ctt gca ctt ggg gcg get atg atc 48
Met Phe Ser Tyr Tyr Phe Gin Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Met íle
1 5 10 15
cta ccg ctc ggt cca caa aat get ttt gtg atg aat cag ggc ata cgt 96
Leu Pro Leu Gly Pro Gin Asn Ala Phe Val Met Asn Gin Gly íle Arg
20 25 30
cgt cag tac cac att atg att gcc tta ctt tgt get atc agc gat ttg 144
Arg Gin Tyr His íle Met íle Ala Leu Leu Cys Ala íle Ser Asp Leu
35 40 45
gtc ctg att tgc gcc ggg att ttt ggt ggc agc gcg tta ttg atg cag 192
Val Leu íle Cys Ala Gly íle Phe Gly Gly Ser Ala Leu Leu Met Gin
50 55 60
tcg ccg tgg ttg ctg gcg ctg gtc acc tgg ggc ggc gta gcc ttc ttg 240
Ser Pro. Trp Leu Leu Ala Leu Val Thr Trp Gly Gly Val Ala Phe Leu
65 70 75 80
ctg tgg tat ggt ttt ggc get ttt aaa aca gca atg agc agt aat att 288
Leu Trp Tyr Gly Phe Gly Ala Phe Lys Thr Ala Met Ser Ser Asn íle
85 90 95
gag tta gcc agc gcc gaa gtc atg aag caa ggc aga tgg aaa att atc 336
Glu Leu Ala Ser Ala Glu Val Met Lys Gin Gly Arg Trp Lys íle íle
100 105 110
gcc acc atg ttg gca gtg acc tgg ctg aat ccg cat gtt tac ctg gat 384
Ala Thr Met Leu Ala Val Thr Trp Leu Asn Pro His Val Tyr Leu Asp
115 120 125
act ttt gtt gta ctg ggc agc ctt ggc ggg caa ctt gat gtg gaa cca 432
Thr Phe Val Val Leu Gly Ser Leu Gly Gly Gin Leu Asp Val Glu Pro
130 135 140
aaa cgc tgg ttt gca ctc ggg aca att agc gcc tct ttc ctg tgg ttc 480
Lys Arg Trp Phe Ala Leu Gly Thr íle Ser Ala Ser Phe Leu Trp Phe
145 150 155 160
ttt ggt ctg get ctt ctc gca gcc tgg ctg gca ccg cgt ctg cgc acg 528
Phe Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ala Pro Arg Leu Arg Thr
165 170 175
-39576
gca aaa gca cag cgc att atc aat ctg gtt gtg gga tgt gtt atg tgg
Ala Lys Ala Gin Arg íle íle Asn Leu Val Val Gly Cys Val Met Trp
180 185 190
ttt att gcc ttg cag ctg gcg aga gac ggt att get cat gca caa gcc
Phe íle Ala Leu Gin Leu Ala Arg Asp Gly íle Ala His Ala Gin Ala
195 200 205
ttg ttc agt tag
Leu Phe Ser
624
636
210 <210> 16 <211> 211 <212> PRT <213> Escherichia coli <400>16
Met Phe Ser Tyr Tyr Phe Gin Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Met íle
1 5 10 15
Leu Pro Leu Gly Pro Gin Asn Ala Phe Val Met Asn Gin Gly íle Arg
20 25 30
Arg Gin Tyr His íle Met íle Ala Leu Leu Cys Ala íle Ser Asp Leu
35 40 45
Val Leu íle Cys Ala Gly íle Phe Gly Gly Ser Ala Leu Leu Mét Gin
50 55 60
Ser Pro Trp Leu Leu Ala Leu Val Thr Trp Gly Gly Val Ala Phe Leu
65 70 75 80
Leu Trp Tyr Gly Phe Gly Ala Phe Lys Thr Ala Met Ser Ser Asn íle
85 90 95
Glu Leu Ala Ser Ala Glu Val Met Lys Gin Gly Arg Trp Lys íle íle
100 105 110
Ala Thr Met Leu Ala Val Thr Trp Leu Asn Pro His Val Tyr Leu Asp
115 120 125
Thr Phe Val Val Leu Gly Ser Leu Gly Gly Gin Leu Asp Val Glu Pro
130 135 140
Lys Arg Trp Phe Ala Leu Gly Thr íle Ser Ala Ser Phe Leu Trp Phe
145 150 155 160
Phe Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ala Pro Arg Leu Arg Thr
165 170 175
Ala Lys Ala Gin Arg íle íle Asn Leu Val Val Gly Cys Val Met Trp
1Θ0 185 190
Phe íle Ala Leu Gin Leu Ala Arg Asp Gly íle Ala His Ala Gin Ala
195 200 205
Leu Phe Ser
210
<210> 17 <211 >20 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yahN génu <400> 17 gtgtggaacc gacgccggat <210> 18 <211 >23 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yahN génu <400> 18 tgttgtatgg tacggggttc gag <210> 19 <211 >20 <212> DNA
-41 <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yeaS génu <400> 19 ctttgccaat cccgtctccc <210> 20 <211>20 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yeaS génu <400> 20 gccccatgca taacggaaag <210> 21 <211 >26 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yfíK génu <400> 21 gaagatcttg taggccggat aaggcg <210> 22 <211>20
-42<212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yfiK génu <400> 22 tggttttacc aattggccgc <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yggA génu <400> 23 acttctcccg cgagccagtt c <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetická sekvencia <220>
<223> Opis syntetickej sekvencie: primer na amplifikáciu Escherichia coli yggA génu <400> 24 ggcaagctta gcgcctctgt t

Claims (26)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Baktéria patriaca do rodu Escherichia, ktorá má schopnosť produkovať Laminokyselinu, pričom schopnosť produkovať L-aminokyselinu je zvýšená prostredníctvom zvýšenia exprimovaného množstva najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny, ktorá pozostáva z nasledujúcich proteínov (A) až (H):
    (A) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 10;
    (B) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, vrátane delécie, substitúcie, inzercie, pridania alebo inverzie jednej alebo niekoľkých aminokyselín, v aminokyselinovej sekvencií uvedenej v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 10, a ktorý zabezpečuje, že baktéria, ktorá ho obsahuje, má zvýšenú schopnosť produkovať Laminokyselinu;
    (C) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 12;
    (D) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, vrátane delécie, substitúcie, inzercie, pridania alebo inverzie jednej alebo niekoľkých aminokyselín, v aminokyselinovej sekvencií uvedenej v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 12, a ktorý zabezpečuje, že baktéria, ktorá ho obsahuje, má zvýšenú schopnosť produkovať Laminokyselinu;
    (E) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 14;
    (F) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, vrátane delécie, substitúcie, inzercie, pridania alebo inverzie jednej alebo niekoľkých aminokyselín, v aminokyselinovej sekvencií uvedenej v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 14, a ktorý zabezpečuje, že baktéria, ktorá ho obsahuje, má zvýšenú schopnosť produkovať Laminokyselinu;
    (G) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Zozname sekvencií ako sekv. č.: 16; alebo (H) proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, vrátane delécie, substitúcie, inzercie, pridania alebo inverzie jednej alebo niekoľkých aminokyselín, v amino-44- kyselinovej sekvencii uvedenej v Zozname sekvencii ako sekv. č.: 16, a ktorý zabezpečuje, že baktéria, ktorá ho obsahuje, má zvýšenú schopnosť produkovať Laminokyselinu.
  2. 2. Baktéria podľa nároku 1, kde L-aminokyselinôu je L-lyzín a je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (D), (G) a (H).
  3. 3. Baktéria podľa nároku 1, kde L-aminokyselinou je kyselina L-glutámová a je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (H).
  4. 4. Baktéria podľa nároku 1, kde L-aminokyselinou je L-alanín a je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D).
  5. 5. Baktéria podľa nároku 1, kde L-aminokyselinou je L-valín a je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D).
  6. 6. Baktéria podľa nároku 1, kde L-aminokyselinou je L-histidín a je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) až (F).
  7. 7. Baktéria podľa nároku 1, kde L-aminokyselinou je L-prolin a je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (F).
  8. 8. Baktéria podľa nároku 1, kde L-aminokyselinou je L-treonín a je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (E) a (F).
  9. 9. Baktéria podľa nároku 1, kde L-aminokyselinou je L-arginín a je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (G) a (H).
  10. 10. Baktéria podľa nároku 1, kde L-aminokyselinou je L-izoleucín a je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D).
  11. 11. Baktéria podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, kde v bunke je zvýšený počet kópií DNA kódujúcej uvedený proteín.
  12. 12. Baktéria podľa nároku 11, kde v bunke je DNA nesená na multikópiovom vektore.
  13. 13. Baktéria podľa nároku 11, kde v bunke je DNA nesená na transpozóne.
  14. 14. Spôsob produkcie L-aminokyseliny, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:
    - kultiváciu baktérie podľa nároku 1 v kultivačnom médiu na produkciu a akumuláciu L-aminokyseliny v médiu, a
    - izolovanie L-aminokyseliny z média.
  15. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že L-aminokyselinou je L-lyzín a v baktérii je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (D), (G) a (H).
  16. 16. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že L-aminokyselinou je kyselina L-glutámová a v baktérii je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (H).
  17. 17. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že L-aminokyselinou je L-alanín a v baktérii je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D).
  18. 18. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že L-aminokyselinou je L-valín a v baktérii je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D).
  19. 19. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že L-aminokyselinou je L-histidín a v baktérii je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) až (F).
  20. 20. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že L-aminokyselinou je L-prolín a v baktérii je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (A) až (F).
  21. 21. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že L-aminokyselinou je L-treonín a v baktérii je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (E) a (F).
  22. 22. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že L-aminokyselinou je L-arginín a v baktérii je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (G) a (H).
  23. 23. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že L-aminokyselinou je L-izoleucín a v baktérii je zvýšené exprimované množstvo najmenej jedného proteínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z proteínov (C) a (D).
  24. 24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 14 až 23, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že v bunke baktérie je zvýšený počet kópií DNA kódujúcej uvedený proteín.
  25. 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že v bunke je DNA nesená na multikópiovom vektore.
  26. 26. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že v bunke je DNA nesená na transpozóne.
SK1870-99A 1998-12-30 1999-12-29 Bacterium belonging to the genus escherichia and method for producing l-amino acid SK187099A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU98124016/13A RU98124016A (ru) 1998-12-30 Фрагменты днк, определяющие повышенную устойчивость бактерий escherichia coli к аминокислотам или их аналогам, и способ получения l-аминокислот
RU99104431/13A RU2175351C2 (ru) 1998-12-30 1999-03-09 Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK187099A3 true SK187099A3 (en) 2000-08-14

Family

ID=26653994

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1870-99A SK187099A3 (en) 1998-12-30 1999-12-29 Bacterium belonging to the genus escherichia and method for producing l-amino acid

Country Status (15)

Country Link
US (5) US6979560B1 (sk)
EP (4) EP1598416A1 (sk)
JP (1) JP4221862B2 (sk)
KR (4) KR20000048465A (sk)
CN (4) CN1228445C (sk)
AT (3) ATE461270T1 (sk)
AU (1) AU764189B2 (sk)
BR (3) BR9917719B1 (sk)
CA (1) CA2291895A1 (sk)
DE (3) DE69942160D1 (sk)
ID (1) ID24398A (sk)
MX (1) MXPA00000177A (sk)
RU (1) RU2175351C2 (sk)
SK (1) SK187099A3 (sk)
ZA (1) ZA997767B (sk)

Families Citing this family (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2175351C2 (ru) 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
JP4207426B2 (ja) 2000-01-21 2009-01-14 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
RU2212447C2 (ru) * 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
CN101597588B (zh) * 2001-02-13 2011-04-06 味之素株式会社 通过埃希氏菌属细菌生产l-氨基酸的方法
US7476531B2 (en) * 2001-02-13 2009-01-13 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia
EP1266966B1 (en) 2001-06-12 2009-04-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-lysine or L-arginine by using methanol assimilating bacterium
US7252978B2 (en) 2001-07-25 2007-08-07 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-arginine
RU2229513C2 (ru) * 2001-11-23 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
MXPA04004874A (es) * 2001-11-23 2004-09-03 Ajinomoto Kk Procedimiento para producir l-aminoacido utilizando escherichia.
AU2003205041A1 (en) 2002-07-12 2004-01-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by fermentation
DE10232930A1 (de) * 2002-07-19 2004-02-05 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie
JP4120364B2 (ja) 2002-11-20 2008-07-16 味の素株式会社 メタノール資化性菌を用いたｌ−リジンまたはｌ−アルギニンの製造法
JP2004166592A (ja) 2002-11-20 2004-06-17 Ajinomoto Co Inc メチロトローフを用いたｌ−アミノ酸の製造法
RU2276687C2 (ru) * 2003-07-16 2006-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-гистидина и способ получения l-гистидина
JP4380305B2 (ja) * 2003-11-21 2009-12-09 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JP4665537B2 (ja) * 2004-01-30 2011-04-06 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
DE602005016763D1 (de) 2004-01-30 2009-11-05 Ajinomoto Kk L-aminosäure produzierender mikroorganismus und verfahren zur l-aminosäureproduktion
JP4665558B2 (ja) * 2004-03-04 2011-04-06 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸生産微生物及びｌ−グルタミン酸の製造法
JP4836440B2 (ja) * 2004-03-10 2011-12-14 センター・フォー・ディーエヌエイ・フィンガープリンティング・アンド・ダイアグノスティックス 微生物を用いたアルギニン産生の方法
US8003367B2 (en) 2004-03-16 2011-08-23 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids by fermentation using bacteria having enhanced expression of xylose utilization genes
JP4760711B2 (ja) * 2004-03-31 2011-08-31 味の素株式会社 バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法
US20070004014A1 (en) * 2005-06-29 2007-01-04 Yuichiro Tsuji Method for producing l-threonine
RU2333950C2 (ru) * 2005-12-27 2008-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПРОДУКЦИИ АРОМАТИЧЕСКИХ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Methylophilus
EP1979486B1 (en) 2006-01-30 2013-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009089603A (ja) 2006-02-02 2009-04-30 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2007119574A2 (en) 2006-03-23 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010017082A (ja) 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2365622C2 (ru) * 2006-12-22 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПРОДУКЦИИ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Escherichia ИЛИ Bacillus
BRPI0703692B1 (pt) * 2006-12-25 2016-12-27 Ajinomoto Kk método para se obter os cristais de um hidrocloreto de aminoácido básico compreendendo gerar um aminoácido básico usando células microbianas por fermentação em um caldo de fermentação ou por um método enzimático em uma solução de reação de enzima usando as células como catalisadores
ES2631360T3 (es) 2007-01-22 2017-08-30 Ajinomoto Co., Inc. Microorganismo que produce un L-aminoácido y procedimiento para producir un L-aminoácido
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
PL2129370T3 (pl) * 2007-03-02 2013-04-30 Zytoprotec Gmbh Płyn do dializy otrzewnowej na bazie węglowodanów, zawierający resztę glutaminy
EP2147970B1 (en) 2007-04-17 2014-12-31 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an acidic substance having a carboxyl group
RU2392322C2 (ru) * 2007-08-14 2010-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН yahN
CN101939412B (zh) 2007-09-04 2016-01-20 味之素株式会社 生产氨基酸的微生物以及氨基酸的生产方法
RU2396336C2 (ru) 2007-09-27 2010-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
EP2248906A4 (en) 2008-01-23 2012-07-11 Ajinomoto Kk PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
BRPI0918299B1 (pt) 2008-09-08 2018-08-14 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
KR20160025043A (ko) * 2008-12-12 2016-03-07 메타볼릭스 인코포레이티드 폴리（5ｈｖ）및 5 탄소 화학물질의 생산을 위한 녹색 공정 및 조성물
JP2010142200A (ja) 2008-12-22 2010-07-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
EP2382320B1 (en) 2009-01-23 2018-04-18 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-amino acids employing bacteria of the enterobacteriacea family in a culture medium with controlled glycerol concentration
JP5521347B2 (ja) 2009-02-16 2014-06-11 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP5359409B2 (ja) 2009-03-12 2013-12-04 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
CN102471790B (zh) 2009-07-29 2014-10-29 味之素株式会社 产生l-氨基酸的方法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
BR112012012915B1 (pt) 2009-11-30 2020-12-01 Ajinomoto Co., Inc. método para produção de l-cisteína, l-cistina, um derivado das mesmas, ou uma mistura das mesmas
RU2460793C2 (ru) * 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
JP5803927B2 (ja) 2010-09-14 2015-11-04 味の素株式会社 含硫アミノ酸生産菌及び含硫アミノ酸の製造法
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2014087259A (ja) 2011-02-22 2014-05-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
JP6020443B2 (ja) 2011-04-01 2016-11-02 味の素株式会社 Ｌ−システインの製造法
BR112013027845A2 (pt) 2011-05-18 2017-01-03 Ajinomoto Kk Imunoestimulante, ração, método para produzir um imunoestimulante, e, método para imunoestimulação
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
RU2012112651A (ru) 2012-04-02 2013-10-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") САМОИНДУЦИРУЕМАЯ ЭКСПРЕССИОННАЯ СИСТЕМА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛЕЗНЫХ МЕТАБОЛИТОВ С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
EP3053999B1 (en) 2013-10-02 2019-11-20 Ajinomoto Co., Inc. Ammonia control apparatus and ammonia control method
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
BR112015005215B1 (pt) 2013-10-21 2022-12-13 Ajinomoto Co., Inc Métodos para a produção de um l-aminoácido e para a produção de l-lisina
WO2015060391A1 (ja) 2013-10-23 2015-04-30 味の素株式会社 目的物質の製造法
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2571157C2 (ru) * 2014-03-11 2015-12-20 Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук Защитная среда высушивания для получения симбиотического препарата
KR101599800B1 (ko) * 2014-03-21 2016-03-04 씨제이제일제당 주식회사 Ｌ-아미노산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
CN108026147B (zh) 2015-06-04 2021-10-01 Cj第一制糖株式会社 生产o-乙酰-高丝氨酸的微生物和使用其生产o-乙酰-高丝氨酸的方法
EP3420096A1 (en) 2016-02-25 2019-01-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
KR101968317B1 (ko) * 2018-02-23 2019-04-11 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-트립토판 배출 단백질 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
US20220064681A1 (en) 2018-12-26 2022-03-03 Daesang Corporation E. coli variant strain or corynebacterium glutamicum variant strain producing l-amino acids, and method for producing l-amino acids using same
BR112021011882A2 (pt) 2018-12-27 2021-09-08 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido básico
BR112021014194A2 (pt) 2019-02-22 2021-12-28 Ajinomoto Kk Método para a produção de um l-aminoácido
WO2020204179A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing l-amino acids
KR102205717B1 (ko) 2019-04-05 2021-01-22 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-트립토판 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
JP7475434B2 (ja) 2019-09-03 2024-04-26 寧夏伊品生物科技股▲ふん▼有限公司 Ｌ－トリプトファン産生効率を向上させるトランスポーター遺伝子の大腸菌における使用
KR102183209B1 (ko) 2019-09-09 2020-11-26 씨제이제일제당 주식회사 L-쓰레오닌 배출 단백질의 변이체 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법
JP2022550084A (ja) 2019-09-25 2022-11-30 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
KR102139806B1 (ko) * 2020-02-13 2020-07-30 씨제이제일제당 (주) 변이형 LysE를 포함하는 미생물, 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법
KR102647745B1 (ko) 2020-05-27 2024-03-14 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-타이로신을 생산하는 방법
KR102617168B1 (ko) * 2020-12-09 2023-12-21 씨제이제일제당 (주) 쉬와넬라 오네이덴시스 유래 단백질을 발현하는 미생물, 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
CN112662605B (zh) * 2020-12-30 2022-09-06 宁夏伊品生物科技股份有限公司 Yh66_10715基因改造的生产l-异亮氨酸的菌株及其构建方法和应用
CN113788881B (zh) * 2021-11-15 2022-02-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产l-半胱氨酸中的应用
KR20230131654A (ko) 2022-03-07 2023-09-14 씨제이제일제당 (주) 변이형 l-쓰레오닌 배출 단백질 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법
KR20230131653A (ko) 2022-03-07 2023-09-14 씨제이제일제당 (주) 변이형 l-쓰레오닌 배출 단백질 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법
WO2023195475A1 (ja) 2022-04-04 2023-10-12 味の素株式会社 寄生植物を防除する方法
CN117510598B (zh) * 2023-11-07 2024-06-21 苏州华赛生物工程技术有限公司 转运蛋白YahN在L-肌肽生产中的应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0746994B2 (ja) * 1984-10-04 1995-05-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
US5976843A (en) * 1992-04-22 1999-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of Escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
WO1990004636A1 (en) 1988-10-25 1990-05-03 Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky Institut Genetiki I Selektsii Promyshlennykh Mikroorganizmov (Vniigenetika) Strain of bacteria escherichia coli, producer of l-threonine
US5705371A (en) 1990-06-12 1998-01-06 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
US5534421A (en) 1991-05-30 1996-07-09 Ajinomoto Co., Inc. Production of isoleucine by escherichia coli having isoleucine auxotrophy and no negative feedback inhibition of isoleucine production
US6132999A (en) * 1992-09-21 2000-10-17 Ajinomoto Co., Inc. L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine
JPH07155184A (ja) * 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
CA2114677C (en) * 1994-02-01 1997-12-30 Horacio Correia Block for constructing retaining wall
US5998178A (en) * 1994-05-30 1999-12-07 Ajinomoto Co., Ltd. L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation
DE19548222A1 (de) 1995-12-22 1997-06-26 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren durch gesteigerte Aktivität von Exportcarriern
JP4088982B2 (ja) * 1996-10-15 2008-05-21 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
RU2144564C1 (ru) * 1998-10-13 2000-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ
US20060040364A1 (en) 1998-10-13 2006-02-23 Livshits Vitaly A DNA coding for a protein which imparts L-homoserine resistance to Escherichia coli bacterium, and a method for producing L-amino acids
RU2148642C1 (ru) 1998-12-23 2000-05-10 ЗАО "Научно-исследовательский институт АДЖИНОМОТО-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк rhtc, кодирующий синтез белка rhtc, придающего повышенную устойчивость к l-треонину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислоты
RU2175351C2 (ru) * 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
RU2207376C2 (ru) * 1999-10-14 2003-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
RU2209246C2 (ru) * 2000-01-26 2003-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Малая субъединица изозима iii и изозим iii синтетазы ацетогидроксикислот из escherichia coli, фрагмент днк (варианты), штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-валина (варианты) и способ получения l-валина
RU2212447C2 (ru) * 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
JP4380029B2 (ja) * 2000-07-05 2009-12-09 味の素株式会社 微生物を利用した物質の製造法
US7476531B2 (en) * 2001-02-13 2009-01-13 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia
RU2229513C2 (ru) * 2001-11-23 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
RU2333950C2 (ru) 2005-12-27 2008-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПРОДУКЦИИ АРОМАТИЧЕСКИХ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Methylophilus

Also Published As

Publication number Publication date
ATE461271T1 (de) 2010-04-15
ID24398A (id) 2000-07-13
CN1737119A (zh) 2006-02-22
CN1737120A (zh) 2006-02-22
RU2175351C2 (ru) 2001-10-27
AU6449399A (en) 2000-07-06
CA2291895A1 (en) 2000-06-30
US7527950B2 (en) 2009-05-05
MXPA00000177A (es) 2005-07-29
EP1580262B1 (en) 2010-01-27
BR9906287A (pt) 2001-01-23
CN100410366C (zh) 2008-08-13
CN1261626A (zh) 2000-08-02
DE69942160D1 (de) 2010-04-29
AU764189B2 (en) 2003-08-14
EP1016710B1 (en) 2010-03-17
EP1016710A3 (en) 2000-09-06
EP1598416A1 (en) 2005-11-23
KR20070034023A (ko) 2007-03-27
EP1016710A2 (en) 2000-07-05
ATE461270T1 (de) 2010-04-15
US7524656B2 (en) 2009-04-28
US20080050784A1 (en) 2008-02-28
ZA997767B (en) 2000-06-30
KR20070034024A (ko) 2007-03-27
BRPI9917718B1 (pt) 2015-05-26
KR20070034022A (ko) 2007-03-27
DE69941991D1 (de) 2010-03-18
US6979560B1 (en) 2005-12-27
BR9906287B1 (pt) 2011-09-06
CN1332021C (zh) 2007-08-15
EP1589096A1 (en) 2005-10-26
US20050202543A1 (en) 2005-09-15
DE69942140D1 (de) 2010-04-29
ATE456648T1 (de) 2010-02-15
US20080050785A1 (en) 2008-02-28
CN100415874C (zh) 2008-09-03
JP2000189180A (ja) 2000-07-11
US7399617B1 (en) 2008-07-15
CN1737121A (zh) 2006-02-22
BR9917719B1 (pt) 2012-08-07
KR20000048465A (ko) 2000-07-25
EP1580262A1 (en) 2005-09-28
JP4221862B2 (ja) 2009-02-12
EP1589096B1 (en) 2010-03-17
BRPI9917718B8 (pt) 2016-09-13
CN1228445C (zh) 2005-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7399617B1 (en) Method for producing an L-amino acid in an Escherichia bacterium via altering expression levels of target proteins
US6887691B2 (en) DNA coding for protein which confers on bacterium Escherichia coli resistance to L-homoserine, and method for producing L-amino acids
US7618803B2 (en) Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia
US7439038B2 (en) Method for producing L-amino acid using methylotroph
WO2007037503A1 (en) An l-amino acid-producing bacterium and a method for producing an l-amino acid
EP1486570A1 (en) Method for producing L-amino acid
US20060040364A1 (en) DNA coding for a protein which imparts L-homoserine resistance to Escherichia coli bacterium, and a method for producing L-amino acids
WO2020138178A1 (en) Method for producing basic l-amino acids or salts thereof by fermentation of an enterobacteriaceae bacterium