BR9917719B1 - bactÉria pertencente ao gÊnero escherichia e tendo uma capacidade para produzir um l-aminoÁcido selecionado do grupo que consiste de l-lisina, Ácido l-glutÂmico, l-alanina, l-valina, l-histidina, l-prolina e l-isoleucina, e, processo para produzir um l-aminoÁcido selecionado do grupo que consiste de l-lisina, Ácido l-glutÂmico, l-alanina, l-valina, l-histidina, l-prolina e l-isoleucina. - Google Patents

Description

"BACTÉRIA PERTENCENTE AO GÊNERO ESCHERICHIA E QUE TEM UMA CAPACIDADE PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO, E5 PROCESSO PARA PRODUZIR UM L-AMINOACIDO"

Dividido do PI 9906287-9, depositado em 28/12/1999.

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção diz respeito a um processo para produzir um aminoácido. Em particular, a presente invenção diz respeito a uma bactéria que produza L-aminoácido pertencente ao gênero Escherichia e a um processo para produzir L-aminoácidos, mais especificamente, ácido L- glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-alanina, L-histidina, L-prolina, L-arginina, L-valina e L-isoleucina, usando-se a bactéria.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Para a produção de um L-aminoácido por fermentação, uma cepa isolada do mundo natural ou um mutante artificial da cepa foi usado para melhorar a produtividade. Por exemplo, no caso da L-lisina, muitos mutantes artificiais que produzem L-lisina são conhecidos e a maioria deles são mutantes resistentes a S-2-aminoetilcisteína (AEC) e pertencem ao gênero Brevibacterium, Corynebacterium, BaciUus ou Escherichia. Também foram propostas várias técnicas para aumentar a produção de aminoácido, tal como o uso de um transformante obtido usando-se um DNA recombinante (Patente U.S. No. 4.278.765).

As técnicas são, na maior parte, fundamentadas na intensificação de uma atividade de uma enzima envolvida em um caminho biossintético de aminoácido, a conversão da enzima àquela dessensibilizada na inibição e outras (como para a bactéria pertencente ao gênero Escherichia, ver o Pedido de Patente Japonês Aberto ao Público No. 56-18596 (1981) e a Publicação Internacional No. WO 95/16042).

Por outro lado, como um exemplo da melhora da produtividade de aminoácido pela intensificação de uma proteína de excreção de aminoácido, é conhecida uma bactéria pertencente ao gênero Corynebacterium em que um gene de excreção de L-lisina, o IysE é intensificado. Entretanto, como para bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, desconhece-se ainda se uma proteína de excreção de L- aminoácido está ou não presente. Portanto, é desconhecido se a intensificação da proteína de excreção de L-aminoácido é eficaz na produção de L- aminoácido usando-se uma bactéria pertencente ou não ao gênero Escherichia.

Embora, a seqüência completa de nucleotídeo da cepa E. coli K-12 pertencente ao gênero Escherichia seja facilmente determinada (Science, 277, 1453-1474 (1997)), existe um grande número de proteínas das quais as funções são desconhecidas.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é obter uma proteína que participe na excreção de um L-aminoácido fornecendo, desse modo, uma cepa melhorada na produção de L-aminoácido e um processo melhorado para produzir um L-aminoácido por fermentação.

Os inventores conduziram a avaliação quanto a participação da proteína na excreção de um L-aminoácido. Como um resultado, os presentes inventores observaram que um rendimento de um L-aminoácido com base no açúcar consumido é aumentado quando um gene particular é intensificado. Com base na descoberta, a presente invenção foi completada.

Desse modo, a presente invenção fornece uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia e que tem uma capacidade para produzir um L-aminoácido, em que a capacidade para produzir o L-aminoácido é aumentada aumentando-se uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das seguintes proteínas de (A) até (H) (a seguir também referida como "a bactéria da presente invenção"):

(A) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10 na Listagem de Seqüência; (B) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido que inclua a supressão, substituição, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10 na Listagem de Seqüência, e que tenha uma atividade de aumentar a capacidade de produzir o L-aminoácido da bactéria que tenha a proteína;

(C) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQID NO: 12 na Listagem de Seqüência;

(D) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido que inclua a supressão, substituição, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12 na Listagem de Seqüência, e que tenha uma atividade de aumentar a capacidade de produzir o L-aminoácido da bactéria que tenha a proteína;

(E) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 14 na Listagem de Seqüência;

(F) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido que inclua a supressão, substituição, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 14 na Listagem de Seqüência, e que tenha uma atividade de aumentar a capacidade de produzir o L-aminoácido da bactéria que tenha a proteína;

(G) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 16 na Listagem de Seqüência; ou

(H) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido que inclua a supressão, substituição, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 16 na Listagem de Seqüência, e que tenha uma atividade de aumentar a capacidade de produzir o L-aminoácido da bactéria que tenha a proteína.

A bactéria da presente invenção, preferivelmente uma bactéria que produza a L-Iisina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas de (A) até (D), (G) e (H) é aumentada; uma bacteria que produza ácido L-glutâmico em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas de (A) até (H) é aumentada; uma bactéria que produza a L-alanina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas (C) e (D) é aumentada; uma bactéria que produza a L-valina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas (C) e (D) é aumentada; uma bactéria que produza a L-histidina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas de (C) até (F) é aumentada; uma bactéria que produza a L-prolina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas de (A) até (F) é aumentada; uma bactéria que produza a L-treonina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (E) e (F) é aumentada; uma bactéria que produza a L-arginina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (G) e (H) é aumentada; ou uma bactéria que produza a L-isoleucina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (C) e (D) é aumentada.

Preferivelmente, na bactéria da presente invenção, um número de cópia de um DNA que codifica para a dita proteína em uma célula é aumentado. O DNA é preferivelmente carregado em um vetor de cópia múltipla ou em um transposon na célula.

A presente invenção também fornece um processo para produzir um L-aminoácido que compreende as etapas de:

cultivar a bactéria da presente invenção em um meio de cultura para produzir e acumular o L-aminoácido no meio e recuperar o L-aminoácido do meio (a seguir, também referido como "o processo da presente invenção").

O processo da presente invenção, preferivelmente um processo de produção de L-lisina que usa uma bactéria que produza a L-lisina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas de (A) até (D), (G) e (H) é aumentada; um processo de produção de ácido L-glutâmico que usa uma bactéria que produza o ácido L-glutâmico em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas de (A) até (H) é aumentada; um processo de produção de L-alanina que usa uma bactéria que produza a L-alanina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas (C) e (D) é aumentada; um processo de produção de L-valina que usa uma bactéria que produza a L-valina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas (C) e (D) é aumentada; um processo de produção de L-histidina que usa uma bactéria que produza a L-histidina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas de (C) até (F) é aumentada; um processo de produção de L- prolina que usa uma bactéria que produza a L-prolina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas de (A) até (F) é aumentada; um processo de produção de L-treonina que usa uma bactéria que produza a L-treonina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (E) e (F) é aumentada; um processo de produção de L-arginina que usa uma bactéria que produza a L-arginina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (G) e (H) é aumentada; ou um processo de produção de L-isoleucina que usa uma bactéria que produza a L-isoleucina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (C) e (D) é aumentada.

Preferivelmente, no processo da presente invenção, um número de cópia de um DNA que codifica para a dita proteína em uma célula da bactéria é aumentado. O DNA é preferivelmente carregado em um vetor de cópia múltipla na célula ou em um transposon na célula.

De acordo com a presente invenção, uma capacidade para produzir um L-aminoácido de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia pode ser aumentada. Também, um processo para produzir um L- aminoácido pode ser melhorado em uma razão de produção de um L- aminoácido.

A presente invenção será explicada abaixo, em detalhes. Em seguida, um aminoácido é de configuração L a menos que de outro modo observado.

<1> BACTÉRIA DA PRESENTE INVENÇÃO

A bactéria da presente invenção é uma bactéria pertencente ao gênero Eseheriehia e que tenha uma capacidade para produzir um aminoácido, em que a capacidade para produzir um aminoácido é aumentada aumentando-se uma quantidade de expressão de uma proteína que tenha uma atividade de aumentar a capacidade de produzir o aminoácido da bactéria ou uma atividade de aumentar a resistência a um aminoácido ou um análogo de aminoácido. Em seguida, a proteína é referida como "proteína de excreção de aminoácido" em consideração à conveniência. Entretanto, o termo não significa que a função da proteína seja limitada à excreção de aminoácido.

Os exemplos das proteínas de excreção de aminoácido incluem uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 14 e uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 16. A proteína de excreção de aminoácido pode ter seletividade para aminoácido. Uma proteína de excreção de aminoácido apropriada para cada aminoácido pode ser determinada deixando-se a proteína de excreção de aminoácido ser expressa em uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia e que tenha uma capacidade para produzir o aminoácido e medindo-se um aumento de um rendimento do aminoácido ou medindo-se um aumento de uma concentração mínima de inibição (MIC) de um aminoácido ou de um análogo de aminoácido.

Por exemplo, no caso da lisina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10, 12 ou 16 é eficaz; no caso do ácido glutâmico, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10, 12, 14 ou 16 é eficaz, no caso da alanina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12 é eficaz; no caso da valina uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12 é eficaz; no caso da histidina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12 ou 14; no caso da prolina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10, 12 ou 14 é eficaz; no caso da treonina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ED NO: 14 é eficaz; no caso da arginina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 16 é eficaz e no caso da isoleucina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ED NO: 12 é eficaz.

O termo "uma quantidade de expressão é aumentada" usado neste, geralmente significa que a quantidade de expressão é maior do que aquela de uma cepa selvagem de E. coli, tal como a cepa MGl655 ou W3110. Os termos também significam que quando uma cepa é obtida pela modificação através das técnicas da engenharia genética ou outras, a quantidade de expressão é maior do que a anterior à modificação. A quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido pode ser determinada diretamente pela determinação da proteína de excreção de aminoácido ou indiretamente pela determinação de MIC de um aminoácido ou de um análogo de aminoácido ou da produtividade de aminoácido de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia e que tenha a proteína de excreção de aminoácido.

O processo para aumentar a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido é exemplificado por um processo para aumentar o número de cópia do DNA que codifica a proteína de excreção de aminoácido em uma célula da bactéria.

Para aumentar o número de cópia na célula, um fragmento de DNA que codifica para a proteína de excreção de aminoácido pode ser ligado a um vetor que funciona em uma bactéria pertencente ao gênero Eseheriehia para produzir um DNA recombinante que é introduzido em um hospedeiro para transformá-lo. O número de cópia do gene que codifica para a proteína de excreção de aminoácido (gene da proteína de excreção de aminoácido) na célula da cepa transformante aumenta, desse modo, aumentando a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido. O vetor é preferivelmente um vetor de cópia múltipla.

O aumento do número de cópia na célula pode ser alcançado deixando-se cópias múltiplas do gene da proteína de excreção de aminoácido para existir no DNA cromossômico do hospedeiro. A introdução de cópias múltiplas do gene da proteína de excreção de aminoácido ao DNA cromossômico de uma bactéria pertencente ao gênero Eseheriehia, pode ser conduzida através da recombinação homóloga usando-se uma seqüência da qual as cópias múltiplas existem no DNA cromossômico como um alvo. Como a seqüência das quais as cópias múltiplas existem no DNA cromossômico, um DNA repetitivo e uma repetição invertida presente em uma porção terminal de um elemento transponível podem ser usados. Alternativamente, como divulgado no Pedido de Patente Japonês Aberto ao Público No. 2-109985 (1990), as cópias múltiplas podem ser introduzidas ao DNA cromossômico fazendo-se com que o gene da proteína de excreção de aminoácido seja carregado em um transposon e deixando que o transposon seja transposto, o que é preferido. De acordo com qualquer um dos processos mencionados acima, o número de cópias do gene da proteína de excreção de aminoácido na cepa transformante aumenta, aumentando-se assim a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido.

O vetor de cópia múltipla é exemplificado pelos vetores plasmídicos, tais como pBR322, pMW118, pUC19 ou outros e vetores de fago, tais como λ1059, λΒΡΙΟΙ, M13mp9 ou outros. O transposon é exemplificado por Mu, Tnl0, Tn5 ou outros.

A introduçao de um DNA em uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia pode ser realizada, por exemplo, por um processo de D. M. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) ou um processo em que as células bacterianas receptoras são tratadas com cloreto de cálcio para aumentar a permeabilidade do DNA (Mandei, M. e Higa, A., J. MoL Biol., 53, 159 (1970)) e outros.

Além disso, a aplicação do gene mencionado acima, o aumento da quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido também pode ser alcançada substituindo-se uma seqüência reguladora de expressão tal como um promotor do gene da proteína de excreção de aminoácido por uma mais forte (ver o Pedido de Patente Japonês Aberto ao Público No. 1-215280 (1989)). Por exemplo, o promotor Iac, o promotor trp, o promotor tac, o promotor Pr e o promotor Pl do fago lambda e outros são conhecidos como um promotor forte. A substituição pelo promotor intensifica a expressão da proteína de excreção de aminoácido, desse modo aumentando-se a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido. A intensificação da seqüência reguladora de expressão pode ser combinada com o aumento do número de cópia da proteína de excreção de aminoácido.

Na bactéria da presente invenção, as quantidades de expressão das proteínas de excreção de aminoácido podem ser aumentadas.

A proteína de excreção de aminoácido é codificada pelos genes que são conhecidos como gene yahN, gene yeaS, gene yfiK e gene yggA e dos quais as funções não são conhecidas. Portanto, o DNA que codifica a proteína de excreção de aminoácido pode ser obtido sintetizando- se iniciadores com base em seqüências conhecidas (por exemplo, a seqüência de nucleotídeo inteira do cromossomo do Escherichia coli da cepa K-12 já foi determinada (Science, 277, 1453-1474 (1997))), e conduzindo-se a amplificação pelo PCR usando-se o DNA cromossômico de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia como um padrão. Também, o fragmento de DNA em questão pode ser selecionado pela hibridização de uma biblioteca de DNA cromossômico de uma bactéria pertencente ao gênero Eseheriehia pela preparação de uma investigação com base nas seqüências conhecidas. Alternativamente, o DNA que codifica a proteína de excreção de aminoácido pode ser sintetizado com base nas seqüências conhecidas. A seqüência de nucleotídeo do DNA que codifica a proteína de excreção de aminoácido é exemplificada por aquelas apresentadas na SEQ ID NO: 9, 11, 13 ou 15 na Listagem de Seqüência.

Os processos para a preparação de DNA cromossômico, preparação de biblioteca de DNA cromossômico, hibridização, PCR, preparação de DNA plasmídico, digestão e ligação de DNA, transformação, seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador e outros podem ser processos usuais bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. Estes processos são descritos em Sambrook, J., Fritsch, E. F., e Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) e outros.

A proteína de excreção de aminoácido pode compreender a substituição, supressão, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos em uma ou uma pluralidade de posições, desde que a atividade de aumentar a capacidade para produzir o aminoácido da bactéria pertencente ao gênero Escherichia e que tem a proteína não seja deteriorada. O termo "vários" pode variar dependendo de uma posição em uma estrutura estérica da proteína e de uma espécie de um resíduo de aminoácido. Isto ocorre porque alguns aminoácidos, tais como a isoleucina e a valina, têm alta similaridade uns aos outros, e uma diferença entre os tais aminoácidos não afetam amplamente a estrutura estérica da proteína.

O DNA que codifica para a substancialmente mesma proteína como a proteína de excreção de aminoácido, como descrito acima, pode ser obtido, por exemplo, modificando-se a seqüência de nucleotídeo, por exemplo, por meio do processo de mutagênese direcionada por sítio, de modo que um ou mais resíduos de aminoácido em um local especificado envolva a substituição, supressão, inserção, adição ou inversão. O DNA modificado como descrito acima pode ser obtido pelo tratamento de mutação convencionalmente conhecido. O tratamento de mutação inclui um processo para tratar um DNA que codifica para a proteína de excreção de aminoácido in vitro, por exemplo, com hidroxilamina e um processo para tratar um microorganismo, por exemplo uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia, que abriga um DNA que codifica para a proteína de excreção de aminoácido com irradiação ultravioleta ou um agente de mutação tal como N- metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NG) e ácido nitroso, comumente usado para o tratamento de mutação.

A substituição, supressão, inserção, adição ou inversão de um ou mais resíduos de aminoácido incluem uma mutação ou variação que ocorre naturalmente que são resultados de uma diferença entre os microorganismos individuais que tenham a proteína de excreção de aminoácido e uma diferença entre espécies, cepas ou outros.

O DNA, que codifica para, substancialmente a mesma proteína como a proteína de excreção de aminoácido, pode ser obtido deixando-se um DNA que tenha a mutação como descrita acima, ser expresso em uma célula de uma bactéria apropriada pertencente ao gênero Escherichia e que investiga o aumento da produtividade de aminoácido da célula.

Também, o DNA que codifica substancialmente para a mesma proteína como a proteína de excreção de aminoácido, pode ser obtido isolando-se um DNA que hibridiza com o DNA que têm, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9, 11, 13 ou 15 na listagem de seqüência sob condições rigorosas e que codifica para uma proteína que tenha a atividade de aumentar a capacidade de produzir o aminoácido da bactéria pertencente ao gênero Escherichia, de DNAs que codificam as proteínas de excreção de aminoácido que tenham mutações ou células que contenham os DNAs. O termo "condições rigorosas" referido neste, significa uma condição sob a qual um híbrido específico é formado e um híbrido não específico não é formado. É difícil expressar claramente esta condição usando-se qualquer valor numérico. Entretanto, por exemplo, as condições rigorosas incluem uma condição sob a qual os DNAs que tenham alta homologia, por exemplo, DNAs que tenham homologia de não menos do que 70% entre eles sejam hibridizados e DNAs que tenham homologia entre eles, menor do que a acima não sejam hibridizados ou uma condição de uma concentração de sal que corresponda a 60°C, 1 χ SSC, 0,1% de SDS, preferivelmente 0,1 χ SSC, 0,1% de SDS que é uma condição de lavagem de hibridização comum do sul.

Embora, possa ser um gene em que um códon de interrupção é feito no meio ou um gene que codifique uma proteína que perdeu a atividade devido a mutação do centro ativo entre os genes que hibridizam sob tais condições, tais genes podem ser facilmente eliminados ligando-se os genes a um vetor de expressão de atividade comercialmente disponível e que determina a atividade de aumento da capacidade para produzir o aminoácido da bactéria pertencente ao gênero Escherichia como descrito acima.

O termo "DNA que codifica para uma proteína" usado neste significa um DNA do qual um dos filamentos codifica para a proteína quando o DNA é de filamento duplo.

Aumentando-se uma quantidade de expressão de uma proteína de excreção de aminoácido em uma bactéria que produza aminoácido pertencente ao gênero Eseheriehia como descrito acima, uma quantidade produzida do aminoácido pode ser aumentada. Como a bactéria pertencente ao gênero Eseheriehia na qual a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido é para ser aumentada, as cepas que tenham capacidade para produzir os aminoácidos desejados (produtividades de aminoácido) são usadas. Além disso, uma capacidade para produzir um aminoácido pode ser comunicada a uma bactéria em que a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido é aumentada. Os exemplos de bactéria que produza aminoácido, pertencentes ao gênero Escheriehia incluem E. eoli AJl3199 (patente FR No. 2747689) e aquelas obteníveis dos materiais conhecidos (por exemplo, E. coli W3110 (tyrA)/pCABD2, E. coli VL614, E. coli VL2054, E. coli VL2160, E. coli VL2151, E. eoli W3350 argE: :Tnl0/pKA10 como descrito nos Exemplos abaixo).

Por referência, a proteína de excreção de aminoácido de acordo com a presente invenção foi identificada pela primeira vez, como descrito abaixo.

Os presentes inventores identificaram o rhtB e o rhtC como genes de proteína de excreção de treonina de uma bactéria pertencente ao gênero Eseheriehia. Os presentes inventores pesquisaram o banco de dados com base em uma hipótese de que as proteínas de excreção de aminoácido pudessem compartilhar uma estrutura comum. Isto é, a pesquisa BLAST e PSI-BLAST (Altschul, S. F. et ai, Nucleic Acids Res., 25, 3389 a 3402 (1997)) quanto a homologia de uma proteína codificada pelo rhtB foi realizada em GenBank CDS, PDB, SWISS-PROT, Spupdate e PHL A pesquisa Tblastn foi realizada em genomas microbianos não acabados. A pesquisa BLITZ (Sturrock, S. S. e Collins, J. F., Mpsch versão 1.3. Unidade de Pesquisa de Biocomputação da Universidade de Edinburgh, UK (1993)) foi realizada no banco de dados SWALL. A pesquisa SMART (Ogiwara, I. et al., Protein Sci., 5, 1991 a 1999 (1996)) foi realizada no banco de dados de translações e SWISS-PROT. Das amostras de mais do que 60 seqüências encontradas, a YeaS (que corresponde ao f212 de ACESSO No. AE000274 no GenBank), a YahN (que corresponde ao f223 de ACESSO No. AE000140 no GenBank), a YfiK (que corresponde ao o 195 de ACESSO No. AE000344 no GenBank) e a YggA (que corresponde ao f211 de ACESSO No. AE000375 no GenBank) permaneceram como proteínas que podem ter função similar ao RhtB, entre aqueles que se originam do E. coli. Visto que as funções de qualquer um destes genes são desconhecidas, os genes são atualmente obtidos e os efeitos destes no MIC dos aminoácidos e dos análogos de aminoácidos e na produção de aminoácido foram examinados intensificando-se as suas atividades. Como um resultado, um efeito de aumentar o MIC de alguns aminoácidos e análogos foi observado com respeito a YeaS, YfiK, YahN e YggA. Outro exame revelou que as proteínas codificadas por estes genes apresentam um efeito de aumentar uma acumulação de aminoácido, embora possam ter alguma seletividade de aminoácido.

<2> PROCESSO DA PRESENTE INVENÇÃO

O processo da presente invenção compreende as etapas de cultivar a bactéria da presente invenção, em um meio de cultura, para produzir e acumular o aminoácido no meio e recuperar o aminoácido do meio. Os aminoácidos adequados incluem, lisina, ácido glutâmico, alanina, valina, histidina, prolina, treonina, arginina e isoleucina.

No processo da presente invenção, o cultivo da bactéria pertencente ao gênero Escherichia, a coleta e purificação do aminoácido do meio líquido podem ser realizadas de uma maneira similar àquela do processo convencional para produzir um aminoácido pela fermentação usando-se uma bactéria. Um meio usado no cultivo pode ser um meio sintético ou um meio natural, contanto que o meio inclua uma fonte de carbono e uma de nitrogênio e minerais e, se necessário, nutrientes que a bactéria usada requer para se desenvolver em quantidades apropriadas. A fonte de carbono pode incluir vários carboidratos, tais como a glicose e a sacarose e vários ácidos orgânicos, dependendo da capacidade assimiladora da bactéria usada, o álcool, incluindo o etanol e o glicerol, pode ser usado. Como fonte de nitrogênio, amônia, vários sais de amônio, tais como sulfato de amônio, outros compostos de nitrogênio, tais como aminas, uma fonte natural de nitrogênio, tal como peptona, hidrólito de soja e micróbios digeridos, de fermentação são usados. Como minerais, fosfato de monopotássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês e carbonato de cálcio são usados.

O cultivo é preferivelmente cultivado sob uma condição aeróbica, tal como uma cultura de vibração e uma cultura de aeração e de agitação. A temperatura da cultura é usualmente de 20 a 40°C, preferivelmente de 30 a 38°C. O pH da cultura está usualmente entre 5 e 9, preferivelmente entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura pode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases e tampões. Geralmente, um cultivo de 1 a 3 dias leva à acumulação do aminoácido alvo no meio.

A recuperação do aminoácido pode ser realizada removendo- se os sólidos do meio, tais como as células, por centrifugação ou por filtração da membrana após o cultivo e então coletando-se e purificando-se o aminoácido alvo por troca de íon, processos de concentração e fração cristalina e outros.

MELHOR MANEIRA PARA REALIZAR A INVENÇÃO

A presente invenção será mais concretamente explicada abaixo por referência aos Exemplos:

EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA QUE CODIFICAM PARA AS PROTEÍNAS DE EXCREÇÃO DE AMINOÁCIDO

A seqüência de nucleotídeo completa do cromossomo da cepa E. coli K-12 foi determinada (Science, 277, 1453 a 1474, 1997). Com base na seqüência de nucleotídeo relatada, os iniciadores foram sintetizados e os genes YahN, YfiK, YeaS e YggA foram amplificados por PCR.

(1). O DNA cromossômico da cepa E. coli MGl 655 foi usado como um padrão.

O DNA cromossômico foi preparado por um processo usual (Sambrook, J., Fritsch E. F. e Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2a. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.). Na reação de PCR, uma condição padrão descrita no "PCR protocols. Current methods and applications". (White, Β. A., ed. Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993) foi usada. Os produtos de PCR obtidos foram purificados por um processo comum e digeridos com enzimas de restrição como descrito abaixo.

O gene YahN foi amplificado usando-se os iniciadores No. 1 e No. 2.

Iniciador No. 1: gtgtggaaccgacgccggat (uma seqüência complementar a uma seqüência da base 1885 até a base 1904 em uma seqüência de nucleotídeo registrada sob o ACESSO No. AEOOO140 no GenBank; SEQ ID NO: 17), e Iniciador No. 2: tgttgtatggtacggggttcgag (uma seqüência da base 223 até a base 245 na mesma; SEQ ID NO: 18).

O produto de PCR obtido após a purificação foi digerido com enzimas de restrição Pstl e Stul e ligado ao vetor pUC21 (Vieira, Messing, Gene, 100, 189 a 194, 1991) digerido com a enzima Pstl e EcoRV usando-se um conjunto de ligação. Então, a transformação das células aptas do E. coli TGl (Sambrook, J., Fritsch, E. F., e Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Segunda Edição", Cold Spring Harbor, Ν. Y.) com o produto foi conduzida e as células foram espalhadas no meio L (10 g/l de Bactotrypton, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de agar, pH 7,0) contendo 10 μg/ml de IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranosídeo) e 40 μg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo) e 100 μg/ml de ampicilina e cultivado durante a noite. Surgiram colônias brancas que foram retiradas e submetidas ao isolamento de colônia única para se obter transformantes. O plasmídeo foi preparado a partir dos transformantes usando-se um processo de extração alcalina e designado como pYAHN.

O gene YeaS foi amplificado usando-se os iniciadores No. 3 e No. 4.

Iniciador No. 3: ctttgccaatcccgtctccc (uma seqüência complementar a uma seqüência da base 7683 até a base 7702 em uma seqüência de nucleotídeo registrada sob o ACESSO No. AE000274 no GenBank; SEQID NO: 19);

Iniciador No. 4: gccccatgcataacggaaag (uma seqüência da base 5542 até a base 5561 na mesma; SEQ ID NO: 20).

O produto de PCR obtido após a purificação foi digerido com uma enzima de restrição Aval e ligado ao vetor pUC19. Após a transformação do E. coli TGl como acima, o plasmídeo designado como pYEAS foi obtido.

O gene YfiK foi amplificado usando-se os iniciadores No. 5 e No. 6. Iniciador No. 5: gaagatcttgtaggccggataaggcg (uma seqüência da base 4155 até a base 4177 em uma seqüência de nucleotídeo registrada sob o ACESSO No. AE000344 no GenBank; com um sítio Bglil de enzima de restrição adicionado na extremidade 5' desta SEQ ID NO: 21);

Iniciador No. 6: tggttttaccaattggccgc (uma seqüência complementar a uma seqüência da base 6307 até a base 6326 na mesma; SEQ ID NO: 22).

O produto de PCR obtido após a purificação foi digerido com enzimas de restrição Bglll e Munl e ligado ao vetor pUC21 digerido com enzimas de restrição BgHl e EcoRl. Após a transformação do E. coli TGl como acima, o plasmídeo designado ρYFIK foi obtido.

O gene YggA foi amplificado usando-se os iniciadores No. 7 e No. 8.

Iniciador No. 7: acttctcccgcgagccagttc (uma seqüência complementar a uma seqüência da base 9606 até a base 9626 em uma seqüência de nucleotídeo registrada sob o ACESSO No. AE000375 no GenBank; SEQID NO: 23);

Iniciador No. 8: ggcaagcttagcgcctctgtt (uma seqüência da base 8478 até a base 8498 na mesma; SEQ ID NO: 24).

O produto de PCR obtido após a purificação foi digerido com enzimas de restrição Hindlll e Clail e ligado ao vetor pOK12 (Vieira, Messing, Gene, 100, 189 a 194, 1991) digerido com a mesma enzima de restrição. Após a transformação do E. coli TGl como acima, o plasmídeo designado pYGGA foi obtido.

(2). O DNA cromossômico da cepa E. coli W3110 foi usado como um padrão.

O gene YahN foi amplificado usando-se os iniciadores No. 9 (SEQ ID NO. 1) e No. 10 (SEQ ID NO. 2)

O gene YeaS foi amplificado usando-se os iniciadores No. 11 (SEQID NO. 3) e No. 12 (SEQ ID NO. 4)

O gene YfiK foi amplificado usando-se os iniciadores No. 13 (SEQ BD NO. 5) e No. 14 (SEQ ID NO. 6)

O gene YggA foi amplificado usando-se os iniciadores No. 15 (SEQ ID NO. 7) e No. 16 (SEQ ID NO. 8)

O produto de PCR obtido foi purificado, digerido com enzimas de restrição Sacl e XbaI {EcoRl e Pstl para YggA) e ligado ao plasmídeo pMW118 (Nippon Gene). O plasmídeo no qual um fragmento de DNA cuja seqüência foi idêntica à seqüência relatada, foi inserido e designado como segue:

Um que carrega YahN: pMWl 18: :YahN

Um que carrega YeaS : pMWl 18: :YeaS

Um que carrega YfiK: pMWl 18: :YfiK

Um que carrega YggA : pMWl 18:: YggA

EXEMPLO 2. EFEITO DA AMPLEFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA YahN, YeaS, YfiK E YggA NA RESISTÊNCIA DO E. coli TGl A ALGUNS AMINOÁCIDOS E ANÁLOGOS DE AMINOÁCIDO.

A homologia dos produtos de gene YahN, YeaS, YfiK e YggA com o transportador de lisina, LysE, do Corynebacterium glutamicum (Vrljic et al, Mol. Microbiol., 22, 815 a 826, 1996) e a proteína RhtB envolvida na excreção de homosserina, indica a função análoga para estas proteínas. É bem conhecido que a expressão aumentada dos genes envolvidos em antibióticos e um efluxo de metal pesado aumenta o nível de resistência aos medicamentos (Nikaido, H. J. Bacteriology, 178, 5853 a 5859, 1996). Portanto, o efeito dos plasmídeos ρYEAS, ρΥΑΗΝ, ρYFEEC e ρYGGA na suscetibilidade da cepa TGl a alguns aminoácidos e análogos de aminoácido foi testado. Durante a noite, as culturas das cepas E. coli TGl/pYEAS, TGl/pYAHN, TGl/pYFIK e TGl/pYGGA e das cepas de controle TGl/pUC21, TGl/pUC19 e TGl/pOK12, cultivadas em meio M9 mínimo com um antibiótico apropriado em um agitador rotativo (IO9 cfu/ml) foram diluídos 1:100 em meio M9 mínimo e cultivadas por 5 horas no mesmo meio. Então, as culturas de fase log assim obtidas foram diluídas e cerca de 10^4 células vivas foram aplicadas às placas de teste de reservatório seco com agar M9 contendo os incrementos de duplicação dos aminoácidos ou análogos. Assim, a concentração mínima de inibição (MIC) destes compostos foi examinada.

Os resultados são mostrados na Tabela 1. Conclui-se da Tabela 1 que as cópias múltiplas do gene yfiK conferiram resistência aumentada à prolina, homosserina, histidina, treonina, glutamato, lisina, ácido a-amino-P-hidroxivalérico (AHVA), S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC) e ao ácido α-aminobutírico; as cópias múltiplas do gene yahN conferiram resistência aumentada à prolina, as cópias múltiplas do gene yeaS conferiram resistência aumentada à treonina, homosserina, lisina, glutamato, histidina, prolina e ao ácido α-aminobutírico; as cópias múltiplas do gene yggA conferiram resistência aumentada à S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), lisina e arginina. Estes resultados indicam que exceto para a YahN, cada um dos transportadores supostos têm especificidade a diversos substratos (aminoácidos e análogos de aminoácido) ou podem mostrar efeitos não específicos como um resultado de amplificação. TABELA 1

<table>table see original document page 22</column></row><table>

EXEMPLO 3. EFEITO DA AMPLEFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA yeaS, yahN, EyfiKNA PRODUÇÃO DO ÁCIDO GLUTÂMICO.

A cepa E. coli AJl3199 (patente FR No. 2747689) foi transformada com o vetor pUC21 e com cada um dos plasmídeos pYAHN, ρYEAS e pYFIK. Assim as cepas AJ13199/pUC21 (VKPM B-7728), AJ13199/pYAHN (VKPM B-7729), AJ13199/pYEAS (VKPM B-7731) e AJ13199/pYFIK (VKPM B-7730) foram obtidas.

Estas cepas foram, cada uma, cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 100 mg/l de ampicilina e 0,3 ml da cultura obtida foi inoculada em 3 ml de um meio de fermentação contendo 100 mg/l de ampicilina em um tubo de teste de 20 χ 200 mm e cultivados a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, uma quantidade acumulada de ácido glutâmico no meio foi determinada pelo processo conhecido.

A composição do meio de fermentação (g/l): <table>table see original document page 23</column></row><table>

(A glicose e K2HPO4 foram esterilizados separadamente)

Os resultados são mostrados na Tabela 2. Como mostrado na Tabela 2, as cepas AJ13199/pYAHN, AJ13199/pYEAS e AJ13199/pYFIK acumularam ácido glutâmico em uma quantidade maior do que as cepas AJ13199/pUC21 em que uma quantidade de expressão das proteínas de excreção de aminoácido não foi intensificada.

TABELA 2

<table>table see original document page 23</column></row><table>

EXEMPLO 4. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA yeaS, yahN E yfiK NA PRODUÇÃO DE LISINA.

(1). Como a bactéria que produz lisina pertencente ao gênero Escherichia, cepa E. coli W3110 (TyrA) descrita na Publicação de Patente Européia No. 488424 a qual o plasmídeo pCABD2 foi introduzido, descrito na Publicação Internacional No. WO 95/16042) foi usada. Especificamente, o plasmídeo pCABD2 e cada um dos plasmídeos pMW118: :yahN, pMW118: :yeaS, pMWl 18: :yfiK e pMWl 18 foram introduzidos na cepa E. coli W3110 (TyrA) para obter as seguintes cepas:

W3110 (tyrA) / pCABD2+pMWl 18: :yahN

W3110 (tyrA) / pCABD2+pMWl 18: :yeaS

W3110 (tyrA) / pCABD2+pMWl 18: :yfiK

W3110 (tyrA) / pCABD2+pMWl 18.

A produtividade de lisina destas cepas foi estimada pela cultura. A composição do meio usado foi como segue (g/l):

<table>table see original document page 24</column></row><table>

Ajustado para o pH 7,0 e submetido a autoclave a 115°C por 10 minutos. (A glicose e o MgSO4 .7H20 foram esterilizados separadamente)

CaCOs farmacopéico 25 g/l (esterilizado em aquecimento seco a 180°C por 2 horas).

Como antibióticos, 20 mg/l de estreptomicina e 50 mg/l de ampicilina foram adicionadas dependendo do tipo de plasmídeo. O cultivo foi conduzido a 37°C por 30 horas com agitação a 115 rpm. Os resultados são mostrados na Tabela 3. TABELA 3

<table>table see original document page 25</column></row><table>

O resultado na Tabela 3 mostra que a quantidade produzida e o rendimento com base no açúcar consumido da lisina é aumentado pela intensificação do YahN e YeaS.

(2). Como a bactéria que produz lisina pertencente ao gênero Escherichia, a cepa E. coli VL614 foi usada. Esta cepa é uma derivada da cepa E. coli VL613 conhecida (Patente US No. 1354458). Sucessivamente, a cepa VL613 foi obtida a partir da cepa Gifl 02 conhecida (Theze, J. e Saint Girons. LBacteriol., 118, 990 a 998, 1974) nas três etapas:

Na primeira etapa os mutantes resistentes a 2 mg/ml de S-(2- aminoetil)-L-cisteína foram selecionados, e entre eles observou-se que a cepa VL611 é capaz de produzir L-lisina.

Na segunda etapa, os genes envolvidos na utilização de sacarose e localizados no transposon Tn2555 (Doroshenko et al., Mol. Biologiya, 22, 645 a 658, 1988), foram introduzidos na VL611 usando-se a transdução mediada pelo fago Pl dando a cepa VL612.

Na terceira etapa a mutação rhtA23 da cepa VKPM B-3996, que confere resistência à treonina e à homosserina (Patente US No. 5.175.107) foi introduzida na VL612 pela transdução do fago Pl dando a cepa VL613.

A cepa E. coli VL614 foi obtida pela transdução do alelo do tipo selvagem do gene rhtA da cepa E. coli VKPM B-6204 (MG1655 zbi3058: :Tnl0) para a VL613. Os transdutantes foram selecionados do meio L contendo 10 mg/l de tetraciclina e entre eles, a cepa VL614 (rhtA+) sensível a 10 g/l de homosserina foi encontrada.

A cepa VL614 foi transformada com o plasmídeo pYGGA ou com o vetor pOK12 para se obter as cepas VL614/pYGGA (VKPM B-7719) e VL614/pOK12 (VKPM B-7722).

Estas cepas foram, cada uma, cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 50 mg/l de canamicina e 0,3 ml da cultura obtida foi inoculada em 3 ml de um meio de fermentação (Exemplo 3) contendo 0,3 g/l de treonina, 0,3 g/l de metionina e 50 mg/l de canamicina, em um tubo de teste de 20 χ 200 mm e cultivada a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, cada quantidade acumulada de lisina e glutamato no meio foi determinada pelo processo conhecido.

Os resultados são mostrados na Tabela 4.

TABELA 4

<table>table see original document page 26</column></row><table>

Como mostrado na Tabela 4, a cepa VL614/pYGGA acumulou lisina em uma quantidade maior do que a cepa VL614/pOK12 na qual o genQyggA não foi intensificado. Além disso, a cepa VL614 acumulou mais ácido glutâmico do que a cepa VL614/pOK12.

EXEMPLO 5. EFEITO DA AMPLEFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA yeaS, yahN E yfiK NA PRODUÇÃO DE TREONINA, ALANINA, VALINA E ISOLEUCINA.

Como a bactéria que produz treonina pertencente ao gênero Escherichia, a cepa E. coli VL 2054 foi usada. Esta cepa foi derivada da cepa E. coli VKPM B-3996 (Patente US No. 5.175.107) como segue.

Inicialmente, uma nova cepa receptora foi construída em várias etapas:

- O derivado sem plasmídeo da cepa VKPM B-3996 foi selecionado após a eliminação espontânea do plasmídeo pVIC40.

- O alelo do tipo selvagem do gene rhtA da cepa E. coli VKPM B-6204 (MG1655 ζό/3058: :TnlO) foi introduzida na cepa assim obtida pela transdução mediada pelo fago Pl como no Exemplo 4.

- Um gene kani inativador de mutação do transposon Tn5 inserido no gene tdh foi obtido após a mutagênese NG e seleção das células sensíveis à canamicina ainda incapazes de degradar a treonina. Desse modo, a cepa VL2053 foi obtida.

Por outro lado, o opéron de treonina do pVIC40 foi clonado em vetores Mud integradores sob o promotor Pr do fago lambda. Além disso, o gene cat do Tn9 que confere resistência ao cloranfenicol foi clonado no mesmo vetor. O constructo assim obtido foi inserido no cromossomo da cepa E. coli C600 pelo uso do processo conhecido (Patente US No. 5.595.889) e transduzido a partir da cepa assim obtida para a VL2053, dando a nova cepa VL2054 que produz a treonina sem plasmídeo. Esta cepa também acumulou no caldo de cultura, alanina, valina e isoleucina.

A cepa VL2054 foi transformada com cada um dos plasmídeos pYEAS, pYFIK e com o vetor pUC21 para obter as cepas E. coli VL2054/pYEAS (VKPM B-7707), VL2054/pYFDC (VKPM B-7712) e VL2054/pUC21 (VKPM B-7708).

Estas cepas foram, cada uma cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 100 mg/l de ampicilina e 0,3 ml da cultura obtida foi inoculada em 3 ml de um meio de fermentação (Exemplo 3) contendo 100 mg/l de ampicilina em um tubo de teste de 20 χ 200 mm e cultivados a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, cada quantidade acumulada de treonina, alanina, valina e isoleucina no meio foi determinada pelo processo conhecido. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Como mostrado na Tabela 5, a cepa VL2054/pYFIK acumulou treonina em uma quantidade maior do que a cepa VL2054/pUC21 na qual o gene yfiK não foi intensificado. Além disso, a cepa VL2054/pYEAS acumulou mais alanina, valina e isoleucina do que a cepa VL2054/pUC21 na qual o gene yeaS não foi intensificado.

TABELA 5

<table>table see original document page 28</column></row><table>

EXEMPLO 6. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA yeaS E yfiK NA PRODUÇÃO DE HISTIDINA.

Como a bactéria que produz histidina pertencente ao gênero Escherichia, a cepa E. coli VL2160 foi usada. Esta cepa foi obtida na base da cepa NK5526 hisG: :TnlO (VKPM B-3384) pela transdução mediada pelo fago Pl da mutação de hisGR que dessensibiliza a fosforribosiltransferase da cepa CC46 (Astvatsaturianz et al., Genetika, 24, 1928 a 1934, 1988). A cepa E. coli VL2160 foi transformada com cada um dos plasmídeos pYEAS, pYFIK e com os vetores pUC21 para se obter as cepas E. coli VL2160/pYEAS (VKPM B-7753), E. coli VL2160/pYFIK (VKPM B-7754), E. coli VL2160/pUC21 (VKPM B-7752).

Estas cepas foram, cada uma cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 100 mg/l de ampicilina e 0,3 ml da cultura obtida foi inoculada em 3 ml do meio de fermentação (Exemplo 3) contendo uma quantidade aumentada de extrato de levedura (3 g/l) e 100 mg/l de ampicilina em um tubo de teste de 20 χ 200 mm e cultivados a 34°C por 68 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, uma quantidade acumulada de histidina no meio foi determinada pelo processo conhecido. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

TABELA 6

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Como mostrado na Tabela 6, as cepas E. coli VL2160/pYEAS e E. coli VL2160/pYFIK acumularam histidina em uma quantidade maior do que a cepa E. coli VL2160/pUC21 na qual os genes yeaS e yfiK não foram intensificados.

EXEMPLO 7. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA yahN, yfiK E yeaS NA PRODUÇÃO DE PROLINA.

Como a bactéria que produz prolina pertencente ao gênero Escherichia, a cepa VL2151 (W3350 proB* kputAP Tnl0) foi usada. Esta cepa foi obtida pela transdução no W3350 da mutação ÍSputAP ligada ao Tnl0 e selecionando os transdutantes resistentes à tetraciclina incapazes de utilizar a prolina como uma fonte única de carbono. A cepa W3350 ISputAP Tnl0 assim obtida foi submetida à mutagênese com NG e os mutantes resistentes a 20 mg/l de 3,4-deidro-DL-prolina foram selecionados. Entre eles, observou-se que a cepa VL2151 (W3350proB* ÍSputAP Tn 10) foi capaz de produzir prolina.

A cepa E. coli VL2151 foi transformada com cada um dos plasmídeos ρ YE AS, ρ YFIK, ρ YAHN e com os vetores pUC21 para se obter as cepas E. coli VL2151/pYEAS (VKPM B-7714), VL2151/pYFIK (VKPM B-7713), VL2151 /pYAHN (VKPM B-7748) e E. coli VL2151/pUC21 (VKPM B-7715).

Estas cepas foram, cada uma cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 100 mg/l de ampicilina e 0,3 ml da cultura obtida foi inoculada em 3 ml de um meio de fermentação (Exemplo 3) contendo 100 mg/l de ampicilina em um tubo de teste de 20 χ 200 mm e cultivada a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, uma quantidade acumulada de prolina no meio foi determinada pelo processo conhecido. Os resultados são mostrados na Tabela 7.

TABELA 7

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Como mostrado na Tabela 7, as cepas E. coli VL2151/pYFIK, E. coli VL215 l/pYAHN e E. coli VL215 l/pYEAS acumularam prolina em uma quantidade maior do que a cepa E. coli VL215 l/pUC21 na qual os genes yfiK, yahN, e yeaS não foram intensificados. A amplificação do gene yfiK teve o efeito mais pronunciado.

EXEMPLO 8. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA yggA NA PRODUÇÃO DE ARGININA.

Como a bactéria que produz arginina pertencente ao gênero Escherichia, a cepa W3350 argE: :Tnl0/pKA10 foi usada. Esta cepa abriga um plasmídeo, pKAlO, que contém uma região de DNA da Corynebacterium (Brevibacterium) flavum que complementa pelo menos as mutações argA e argE na cepa receptora de E. coli K-12 (Kharitonov A. Tarasov A. P. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. No. 9, 29 a 33, 1986).

A cepa E. coli W3350 argE: :Tnl0/pKA10 foi transformada com o plasmídeo pYGGA, ou com o vetor pOK12 para se obter as cepas E. coli W3350 argE: :Tnl0/pKA10, pYGGA (VKPM B-7716) e E. coli W3350 argE: :Tnl0/pKA10, pOK12 (VKPM B-7718). Os transformantes assim obtidos foram, cada um, cultivados a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 100 mg/l de ampicilina e 50 mg/l de canamicina e 0,3 ml da cultura obtida foi inoculada em 3 ml de um meio de fermentação (Exemplo 3) contendo 100 mg/l de ampicilina e 50 mg/l de canamicina em um tubo de teste de 20 χ 200 mm e cultivada a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, uma quantidade acumulada de arginina no meio foi determinada pelo processo conhecido.

Os resultados são mostrados na Tabela 8.

TABELA 8

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Como mostrado na Tabela 8, as cepas E. coli W3350 argE: :Tnl0/pKA10, o pYGGA acumulou arginina em uma quantidade maior do que a cepa E. coli W3350 argE: :Tnl0/pKA10, pUC21 em que o genQyggA não foi intensificado.

As seguintes cepas E. coli foram depositadas (de acordo com o depósito internacional com base no Tratado de Budapeste) na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais (VKPM) em 29 de Dezembro de 1998 sob os números de acesso mostrados em parênteses.

AJ13199/pUC21 (VKPMB-7728)

AJ13199/pYAHN (VKPM B-7729)

AJ13199/pYEAS (VKPM B-7731)

AJ13199/pYFIK (VKPM B-7730)

VL614/pYGGA (VKPM B-7719)

VL614/pOK12 (VKPM B-7722)

VL2054/pYEAS (VKPMB-7707)

VL2054/pYFIK (VKPM B-7712)

VL2054/pUC21 (VKPMB-7708) VL2160/pYEAS (VKPMB-7753)

VL2160/pYFIK (VKPM B-7754)

VL2160/pUC21 (VKPMB-7752)

VL2151/pYFIK (VKPM B-7713)

VL215 l/pYEAS (VKPMB-7714)

VL2151 /pYAHN (VKPM B-7748)

VL2151/pUC21 (VKPMB-7715)

W3350 argE: :Tnl0/pKA10, ρYGGA (VKPM B-7716)

W3350 argE: :Tnl0/pKA10, pOK12 (VKPMB-7718) LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS

< 110> Livshits, Vitaliy Arkadievich

Zakataeva, Natalia Pavlovna

Nakanishi, Kazuo

Aleshin, Vladimir Veniaminovich

Troshin, Petr Vladimirovich

Tokhmakova, Irina Lyvovna

<120> Processo para Produzir L-Aminoácido

<130>

<160> 24

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yahN do Escherichia coli

<400> 1

ggcgagctcc cagtaaccgg aaataag 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yahN do Escherichia coli

<400> 2

cgctctagaa aggaccacgc attacgg 27

<210> 3 <211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yeaS do Escherichia coli

<400>3

ggcgagctca gattggttag catattc 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yeaS do Escherichia coli

<400>4

cggtctagaa tcagcgaaga atcaggg 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yfiK do Escherichia coli

<400> 5

ggcgagctca tgttccgtgt cgggtac 27

<210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yfiK do Escherichia coli

<400> 6

ggctctagat agcaagttac taagcgg 27

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yggA do Escherichia coli

<400> 7

ctctgaattc tctcttatta gtttttctga ttgcc 35

<210>8

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yggA do Escherichia coli

<400> 8

cgtgacctgc agcgttctca cagcgcggta gcctttaa 38

<210> 9

<211> 672

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<220> <221> CDS <222> (1) . . (672) <400> 9

atg atg cag tta gtt cac tta ttt atg gat gaa ate act atg gat cct Met Het Gln Leu Val His Leu Phe Hat Aso Glu Ile Thr Hst Asp Pro 1 5 10 15

ttg cat gcc gtt tac ctg acc gta gga ctg ttc gtg att act ttt ttt Leu His Ala Val Tyr Leu Hir Val Gly Lsu Phe Val Ile Thr Phe Phe

20 25 30

aat ccg gga gcc aat ctc ttt gtg gta gta caa acc age ctg gct fc

Asn Pro Gly Ala Asn Leu Phe Val Val Val Gln Thr Ser Ley Ala Ssr 35 40 45

ggt cga cgc gea ggg gtg ctg acc ggg ctg ggc gtg gcg ctg ggc gat Gly Arg Arg Ala Gly Val Leu Thr Gly Ley Gly Val Ala Leu Glv Asd

50 55 só

gea ttt tat tcc ggg ttg ggt ttg ttt ggt ctt gea acg cta att acg Ala Pbe Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Thr Leu Ile Thr 65 70 75 80

cag tgt gag gsg att ttt tcg ctt ate aga ate gtc ggc ggc gct tat Gln Cys Glu Glu Ile Phe Ser Leu He Arg Ile Val Gly Gly Ala Tyr

85 90 O5

ctc tta tgg ttt gcg tgg tgc age atg cgc cgc cag tca aca ccg caa Leu Leu Trp Phe Alá Trp Cys Ser Het Arg Arg Gln Ssr Thr Pro Gln

100 105 ito

atg age aca cta caa caa ccg att age gcc ccc tgg tat gtc ttt ttt Met Ser Thr Leu Gln Gln Pro Ile Ser Ala Pro Trp Tyr Val Phe Phe

115 120 125

cgc cgc gga tta att acc gat ctc tet aac ccg csa acc gtt tta ttt Arg Arg Gly Leu Ile Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gln Thr Val Leu Phe

130 135 140

ttt ate agt att ttc tca gta aca tta aat gcc gaa aca cca aca tga Phe Ile Ser Ile Phe Ser Val Thr Leu Asn Ala Glu Tbr Pro Thr Tro 145 ISO 155 16β

gea cgt tta atg gcc tgg gcg ggg att gtg ctc gea tca att ate tgg Ala Arg Leu Ket Ala Trp Ala Gly Ile Val Leu Ala Ser Ile Ile Trp

165 170 175

csa gtt-ttt ctt agt cag gcg ttt tet ttg ccc gct gtg cgt cgt gct Arg Val Phe Leu Ser Gln Ala Phe Ser Leu Pro Ala Val Ars ^rg Ala

1S0 185 I9J

tat ggg cgt atg caa cgc gtt gcc agt cgg Qtt att aqt gea aH att Tyr Gly Arg Met Gln Arg Val Ala Ser Arg Val Ile Gly Ala Il= IIp

195 200 205

ggt gta ttç gcg cta cgc ctg att tac gaa ggg Stg acg cag cag taa Glv Val Phe Ala Leu Arg Leu Hs Tyr Glu Gly Val Thr Gln Arg 210 215 ?20 <210> 10

<211> 223

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 10

Het Het Gln Leu Val His Leu PNe Het Asp Glu Ile Thr Hst Asp Pro

1 5 10 15

Leu His Ala Val Tyr Leu Thr Val Gly Ieu Phe VaT Ile Thr Phe Phe

20 25 30

Asn Pro Gly Ala Asn Leu Phe Val Val Val Qln Thr Ser Isu Ala Ser

35 40 45

Gly Arg Arg Ala Gly Val Leu Thr Gly teu 61 ν Val Ala Leu Gly Asp

50 55 60

Ala Phe Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Tnr Leu He Thr 65 70 75 80

Sln Cys GTu Glu Ile Phe Ser Leu Ile Arg Ile Val Gly Sly Ala Tyr

85 90 95

Leu Leu Trp Phe Ala Trp Cys Ser Met Arg Arg Gln Ser Thr Pro Gln

100 105 11Q

Ket Ser Thr Leu Gln Gln Pro He Ser Ala Pro Trp Tyr Val Phe Phe

115 120 125

Arg Arg Gly Leu Ile Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gln Thr Val Leu Ph*

130 135 140

Phe Ile Ser Ile Phe Ser Val Thr Leu Asn Ala Glu Thr Pro Thr Trp 145 150 155 IgQ

Ala Arg Leu Met Ala Trp Ala Gly Ile Val Leu Ala Ser Ile Ile Trp

165 170 175

Arg Val Phe Leu Ser Gln Ala Phe Ser Leu Pro Ala Val Arg Arg Ala

180 185 190

Tyr Gly Arg Met Gln Arg Val Ala Ser Arg Val Ile Gly Ala Ile Ile

200 205

Gly Val Phe ATa Leu Arg Leu Ile Tyr Glu Gly Val Thr Gln Arg 210 215 220 <210> 11

<211> 639

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) . . (639)

<400> 11

gtg ttc gct gaa tac ggg gtt ctg aat tac tgg acc tat Ct9 gtt ggg Met Phe Ala Glu Tyr Gly VaI Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr

gt9 ttS 9t9 cca 9Sg cca aat acc ctg ttt gta et Ala Ile Phe Ile Val Uu Val Pr0 Gly Pro Asn Thr Uu Phe Val

aaa aat age gtc agt age ggl atg aaa ggc ggt tat ctt gcg oce toe

LyS As, Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu

40 45

ggt gta ttt att ggc gat gcg gta ttg ata ttt cta ar tnn aaa gcc att ttg ttc tat gtg tcg ttt ttc gta cag ttt ate gat gtt 4-32 Lys Ala He Ieo Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val

130 135 140

aat gcc oca cat acg gga att tca ttç ttt att ctg gcg gcg acg ctg 480 Asn Ala Pro His Thr Ely !Ie Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160

gaa ctg gtg agt ttc tgc tat ttg age ttc ctg att ata tet ggt gct 52S Glu Leu Val Ser PKe Cys Tyr Lsu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly AU

165 170 175

ttt gtc acg cag tac ata cgt acc aaa aag aaa ctg gct aaa gtt ggc- 575 Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Iys Leu Ala Lys Val Gly

180 185 190

aac tca ctg att ggt ttg atg ttc gtg ggt ttc gct gcc cga ctg gcg 624 Asr Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe AU Ala Arg Leu Ala

195 200 205

acg ctg caa tcc tga 639

Thr Leu Gln Ser

210 <210> 12

<211> 212

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 12

Het Phe AU Glu Tyr Gly Val Ieu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly

1 5 10 15

Ala He Phs Ile Val Ieu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val ^su

20 25 30

Lys Asn Ser Val Ser Ser Qly Het Lys Giy Gly Tyr Leu Ala Ala Cys

35 40 45

Gly Val Fhe Ile Gly Asp Ala Val Leu Het Phe Leu Ala Trp Ala Gly

50 55 60

Val Ala Thr Leu Ile Lys Tnr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg 65 TO 75 80

Tyr Lsu Gly Ala Phe Tyr Uu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr

85 90 95

Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln

100 105 110

Tyr Gly Ala He Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Ieu Thr Asn Pro

115 Τ20 125

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130 135 . UO

Asn Ala Pro His Tnr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala AU Thr Leu 145 150 155 160

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165 170 175

Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu AU Lys Val Gly

1S0 185 190

Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe AU Ala Arg Leu AU

195 200 205

Thr Leu Gln Ser

210

<210> 13

<211> 588

<212> DNA

<213> Eseheriehia coli

<220>

<221> CDS <222> (1) .. (588)

<400> 13

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1 S 10 15

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20 25 30

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50 55 60

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115 |20 125

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130 135 140

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180 185 1W <210> 14

<211> 195

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 14

Ket Thr Pro Thr Leu Leu Ser Al â Phe Trp Tnr Tyr Thr Uu Ile Thr

1 5 10 15

Ala Het Thr Pro Gly Pro Asn Asn Ik Ley Ala Leu Ser Ser Ala Thr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Ala Val Ile Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala 65 70 75 80

Ala Tyr Ile Val Trp Leu Ala Trp Lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr Lys

85 80 95

Glu Asp Gly Leu Gln Ala Lys Pro Ile Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala

100 105 110

Leu Gln Phe Val Asn Val Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu

115 120 125

Ser Thr Phe Val Leu Pro Sln Thr Gln Ala Leu Ser Trp Val Val Gly

130 135 140

Val Ser Val Leu Leu Ala Het Ile Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Tro HS 150 155 160

Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gln Arg leu Phe Arg Gln Tyr Gly Arg

165 170 175

Gln Uu Aso Ile Val Leu Ala leu Leu Leu VaT Tyr Cys Ala Val Aro 180 185 130

Ile Phe Tyr 195

<210> 15

<211> 636

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS <222> (1). . (636) <400> 15

gtg ttt tct tãt tac ttt caa ggt ctt gea ctt ggg gcg gct atg ate 48 Het Phe Ser Tyr Tyr Phe Gln Oly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Het Ile

1 5 10 I5

cta ccg ctc ggt cca caa aat gct ttt gtg atg aat cag egc ata cgt 9S Leu Pro Leu Giy Pro Gln Aso Ala Phs Val Met Asn Gln Gly Ile Ara

20 25 30

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50 55 60

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130 135 140

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ttt ggt ctg gct ctt ctç gea gcc tgg ctg gea ccg cgt ctg çgc acg 5?8 Phe Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ala Pro Arg Leu Arg Thr

165 170 175

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1S0 185 190

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195 200 205

ttg ttc agt tag <210> 16 <211> 211 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 16

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40

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55 60

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Lys Arg Trp Phe Ala Leu Gly Thr Ile Ser Ala Ser Phe Leu Trp Phe 145 150 155 160

Phe Gly Ley Ala Leu teu Ala Ala Trp Leu Ala Pro Arg Leu Arg Thr

155 170 175

Ala Lys Ala Gln Arg Ile Ile Asn Leu Val Val Gly Cys Val Het Trp

180 185 190

Phe Ile Ala Leu Gln Leu Ala Arg Asp Gly Ile Ala His Ala Gln Ala

195 200 205

Leu Phe Ser 210

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yahN do Escherichia coli

<400> 17

gtgtggaacc gacgccggat 20

<210> 18 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yahN do Escherichia coli

<400> 18

tgttgtatgg tacggggttc gag 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yeaS do Escherichia coli

<400> 19

ctttgccaat cccgtctccc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yeaS do Escherichia coli <400> 20

gccccatgca taacggaaag 20

<210> 21 <211> 26 <212> DNA

<213> S eqüência Artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yfiK do Escherichia coli <400> 21

gaagatcttg taggccggat aaggcg 26

<210> 22 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yfiK do Escherichia coli

<400> 22

tggttttacc aattggccgc 20

<210> 23 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yggA do Escherichia coli <400> 23

acttctcccg cgagccagtt c 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yggA do Escherichia coli <400> 24

ggcaagctta gcgcctctgt t 21

Claims (10)

1. Bactéria pertencente ao gênero Escherichia e tendo uma capacidade para produzir um L-aminoácido, caracterizada pelo fato de que a capacidade para produzir o L-aminoácido é aumentada pelo aumento de uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das seguintes proteínas de (C) e (D): (C) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12 na Listagem de Seqüência; e (D) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido incluindo supressão, substituição, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: - 12 na Listagem de Seqüência, e que tenha uma atividade de aumentar a capacidade de produzir o L-aminoácido da bactéria que tenha a proteína.

2. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito L-aminoácido é L-lisina, ácido L-glutâmico, L- alanina, L-valina, L-histidina, L-prolina, ou L-isoleucina.

3. Bactéria de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que um número de cópias de um DNA que codifica para a dita proteína em uma célula é aumentado.

4. Bactéria de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o dito DNA é carregado em um vetor de cópia múltipla na célula.

5. Bactéria de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o dito DNA é carregado em um transposon na célula.

6. Processo para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cultivar a bactéria como definido na reivindicação 1 em um meio de cultura, para produzir e acumular o L-aminoácido no meio e recuperar o L-aminoácido do meio.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito L-aminoácido é L-lisina, ácido L-glutâmico, L- alanina, L-valina, L-histidina, L-prolina, ou L-isoleucina.

8. Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que um número de cópias de um DNA que codifica para uma dita proteína em uma dita bactéria é aumentado.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito DNA é carregado em um vetor de cópia múltipla na célula.

10. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito DNA é carregado em um transposon na célula.