JPH07155184A - 発酵法によるｌ−リジンの製造法 - Google Patents

発酵法によるｌ−リジンの製造法

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JPH07155184A
JPH07155184A JP5308397A JP30839793A JPH07155184A JP H07155184 A JPH07155184 A JP H07155184A JP 5308397 A JP5308397 A JP 5308397A JP 30839793 A JP30839793 A JP 30839793A JP H07155184 A JPH07155184 A JP H07155184A
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residue
mutation
lysine
dna
replaces
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Hiroyuki Kojima
宏之 児島
Yuri Ogawa
由理 尾川
Kazue Kawamura
和枝 川村
Takanosuke Sano
孝之輔 佐野
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Ajinomoto Co Inc
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 発酵法によるＬ−リジンの効率の良い製造法
を提供する。 【構成】 Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除
される変異を有するエシェリヒア属細菌由来のジヒドロ
ジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡと、Ｌ−リジ
ンによるフィードバック阻害が解除される変異を有する
エシェリヒア属細菌由来のアスパルトキナーゼIIIをコ
ードするＤＮＡとが細胞内に導入されることによって形
質転換されたエシェリヒア属細菌を、好適な培地中で培
養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積させ、該培養
物からＬ−リジンを採取する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は微生物工業に関連したも
のであり、詳しくは、発酵法によるＬ−リジンの製造
法、この製造法に用いるＤＮＡ及び微生物に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】従来、発酵法によりＬ−リジンを製造す
る場合、生産性を向上させるために、自然界から分離し
た菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。Ｌ
−リジンを生産する人工変異株は数多く知られており、
その多くはアミノエチルシステイン（ＡＥＣ）耐性変異
株であり、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム
属、バチルス属、またはエシェリヒア属に属している。
また、組換えＤＮＡを使用した形質転換体を用いる（米
国特許第4278765号）等、アミノ酸の生産を増加させる
種々の技術が開示されている。
【０００３】例えば、エシェリヒア属においては、特開
昭56-18596号公報、米国特許第4346,170号およびApplie
d Microbiology and Biotechnology 15, p227-231(198
2)においてジヒドロジピコリン酸合成酵素（以下、「Ｄ
ＤＰＳ」と略すことがある）を増強する事による、Ｌ−
リジンの製造法が示されている。しかし、ここで用いら
れたＤＤＰＳは野生型であり、Ｌ−リジンによるフィー
ドバック阻害を受けるため、十分満足できるＬ−リジン
の生産性が得られていなかった。尚、上記Applied Micr
obiology and Biotechnology 15, p227-231(1982)に記
載されているＬ−リジン生産量は、グルコース７５ｇ／
ｌからＬ−リジン塩酸塩３ｇ／ｌであり、消費係数（糖
１ｇに対し生産されるＬ−リジンのｇ数、又はその百分
率）は０．０４もしくは４％と計算される。
【０００４】一方、Ｌ−リジンによるフィードバック阻
害を受けない事が知られているコリネバクテリウム属細
菌由来のＤＤＰＳを増強する事によるＬ−リジンの製造
法が、大韓民国特許公告92-8382号に示されている（消
費係数１７％）。しかし、コリネバクテリウム属細菌の
生育上限温度はエシェリヒア属細菌の生育上限温度より
も１０度程度低いために、コリネバクテリウム属細菌由
来のＤＤＰＳをコードするＤＮＡをエシェリヒア属細菌
に導入してＬ−リジン生産に利用するためには、培養温
度を下げて培養する必要があると考えられる。従って、
エシェリヒア属細菌が有する、生育温度が高く生育速度
及びＬ−リジン生産速度も速いという利点を発揮させる
事が困難であると予想される。また、一般に異種生物由
来の遺伝子を発現させる場合には、発現産物がプロテア
ーゼに分解されたり、不溶性の封入体を形成する事もあ
り、同種の遺伝子を発現させる場合よりも困難が予想さ
れる。さらに、コリネバクテリウム属細菌由来のＤＤＰ
ＳをコードするＤＮＡをエシェリヒア属細菌等に導入
し、工業的にＬ−リジンを生産させる場合には、組換え
ＤＮＡガイドラインに従って、同種遺伝子を導入した組
換え体を使用するよりも厳しい規制が課せられる。
【０００５】ところで、ジヒドロジピコリン酸合成酵素
（ＤＤＰＳ）は、アスパルトセミアルデヒドとピルビン
酸を脱水縮合させ、ジヒドロジピコリン酸を合成する酵
素であり、この反応はアスパラギン酸系アミノ酸の生合
成において、Ｌ−リジン生合成系への分岐の入口となっ
ている。エシェリヒア属細菌においてはアスパルトキナ
ーゼとともにＬ−リジン生合成の重要な調節部位を担っ
ている事が知られている。
【０００６】ＤＤＰＳはE. coli（エシェリヒア・コ
リ：大腸菌）ではdapAという遺伝子にコードされてい
る。このdapAはすでにクローニングされており、塩基配
列も決定されている（Richaud, F et al. J. Bacterio
l., 297 (1986)）。
【０００７】一方、アスパルトキナーゼ（以下、「Ａ
Ｋ」と略すことがある）は、アスパラギン酸をβホスホ
アスパラギン酸に変える反応を触媒する酵素であり、ア
スパラギン酸系のアミノ酸の生合成系の主な調節酵素と
なっている。E. coliのＡＫは３種あり（ＡＫＩ, ＡＫI
I,ＡＫIII）、うち２つはホモセリンデヒドロゲナーゼ
（以下、「ＨＤ」と略すことがある）との複合酵素であ
る。複合酵素の内のひとつはthrA遺伝子にコードされる
ＡＫＩ−ＨＤＩであり、もう一方は metLM 遺伝子にコ
ードされるＡＫII−ＨＤIIである。ＡＫＩはスレオニン
とイソロイシンによる協奏的抑制及びスレオニンによる
阻害を受け、ＡＫIIはメチオニンによる抑制を受ける。
【０００８】これらに対し、ＡＫIIIのみは単機能酵素
であり、lysCと名付けられた遺伝子の産物であって、Ｌ
−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けるこ
とが知られている。菌体内でのこれらの活性の割合は、
ＡＫＩ:ＡＫII:ＡＫIII＝約５:１:４となっている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】上述したように、コリ
ネバクテリウム属細菌由来のＤＤＰＳは、Ｌ−リジンに
よるフィードバック阻害を受けないが、これをエシェリ
ヒア属細菌に導入してＬ−リジン生産に利用するために
は、培養温度の点で問題がある。Ｌ−リジンによるフィ
ードバック阻害を受けないエシェリヒア属細菌由来のＤ
ＤＰＳあるいはＡＫIIIの変異酵素を取得することがで
きれば、エシェリヒア属細菌を用いて効率の良いＬ−リ
ジンの醗酵生産を行うことができることが期待される
が、これらの変異酵素を示した先行文献はなく、もちろ
ん同変異酵素がＬ−リジンの生産性を改善できることを
示唆した例は知られていない。
【００１０】本発明は、上記観点からなされたものであ
り、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除
されたエシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳとＡＫIIIを
取得し、従来よりもさらに改良された発酵法によるＬ−
リジンの製造法を提供することを課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｌ−リジンに
よるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリヒ
ア属細菌由来のＤＤＰＳをコードするＤＮＡを取得する
ことに成功した。尚、Ｌ−リジンによるフィードバック
阻害が十分に解除されたE. coli由来のＤＤＰＳをコー
ドするＤＮＡを本明細書において変異型ｄａｐＡあるい
はｄａｐＡ*とよぶことがある。
【００１２】本願発明者らはまた、Ｌ−リジンによるフ
ィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼおよ
び変異型ｄａｐＡを保持するエシェリヒア属細菌を創製
した。尚、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分
に解除されたE. coli由来のアスパルトキナーゼをコー
ドするＤＮＡを本明細書において変異型ｌｙｓＣあるい
はｌｙｓＣ*とよぶことがある。
【００１３】さらに本願発明者らは、変異型ｄａｐＡ及
び変異型ｌｙｓＣを保持するエシェリヒア属細菌を創製
した。そして同エシェリヒア属細菌を好適な培地で培養
することにより、該培養物中にＬ−リジンを著量生産蓄
積させ得ることを見出した。
【００１４】すなわち本願発明は、Ｌ−リジンによるフ
ィードバック阻害が解除される変異を有するエシェリヒ
ア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコード
するＤＮＡである。このＬ−リジンによるフィードバッ
ク阻害が解除される変異としては、配列表の配列番号３
に記載されるジヒドロジピコリン酸合成酵素のアミノ酸
配列中、Ｎ−末端から８１番目のアラニン残基をバリン
残基に置換させる変異、１１８番目のヒスチジン残基を
チロシン残基に置換させる変異、８１番目のアラニン残
基をバリン残基に置換させかつ１１８番目のヒスチジン
残基をチロシン残基に置換させる変異よりなる群から選
ばれる変異が挙げられる。
【００１５】本願発明はまた、Ｌ−リジンによるフィー
ドバック阻害が解除される変異を有するエシェリヒア属
細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする
ＤＮＡとエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベ
クターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡである。ま
た本願発明は、この組換えＤＮＡが細胞内に導入される
ことによって形質転換されたエシェリヒア属細菌、及び
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異
を有するエシェリヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン
酸合成酵素をコードするＤＮＡが染色体ＤＮＡ内に組み
込まれて形質転換されたエシェリヒア属細菌である。
【００１６】本願発明はさらに、Ｌ−リジンによるフィ
ードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼを保持
することを特徴とする前記の形質転換されたエシェリヒ
ア属細菌である。Ｌ−リジンによるフィードバック阻害
が解除されたアスパルトキナーゼを保持するエシェリヒ
ア属細菌としては、Ｌ−リジンによるフィードバック阻
害が解除される変異を有するアスパルトキナーゼIIIを
コードするＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれて形質転
換されたエシェリヒア属細菌、または該ＤＮＡとエシェ
リヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡと
を連結してなる組換えＤＮＡが細胞内に導入されること
によって形質転換されたエシェリヒア属細菌が挙げられ
る。尚、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除さ
れる変異を有するエシェリヒア属細菌由来のジヒドロジ
ピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡ及びＬ−リジン
によるフィードバック阻害が解除される変異を有するア
スパルトキナーゼIIIをコードするＤＮＡは、各々のＤ
ＮＡがエシェリヒア属細菌の染色体に保持されていて
も、細胞内で同一または別々のプラスミド上に保持され
ていてもよい。さらに、各々のＤＮＡの一方が染色体に
保持され、もう一方のＤＮＡがプラスミド上に保持され
ていてもよい。
【００１７】Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解
除されるアスパルトキナーゼの変異としては、配列表の
配列番号６に記載されるアスパルトキナーゼIIIのアミ
ノ酸配列中、Ｎ−末端から３２３番目のグリシン残基を
アスパラギン酸残基に置換させる変異、３２３番目のグ
リシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ４０８
番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる
変異、３４番目のアルギニン残基をシステイン残基に置
換させかつ３２３番目のグリシン残基をアスパラギン酸
残基に置換させる変異、３２５番目のロイシン残基をフ
ェニルアラニン残基に置換させる変異、３１８番目のメ
チオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、３
１８番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換さ
せかつ３４９番目のバリン残基をメチオニン残基に置換
させる変異、３４５番目のセリン残基をロイシン残基に
置換させる変異、３４７番目のバリン残基をメチオニン
残基に置換させる変異、３５２番目のスレオニン残基を
イソロイシン残基に置換させる変異、３５２番目のスレ
オニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ３６９番
目のセリン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変
異、１６４番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換
させる変異、４１７番目のメチオニン残基をイソロイシ
ン残基に置換させかつ４１９番目のシステイン残基をチ
ロシン残基に置換させる変異、よりなる群から選ばれる
変異が挙げられる。
【００１８】本発明はまた、Ｌ−リジンによるフィード
バック阻害が解除される変異を有するエシェリヒア属細
菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤ
ＮＡを保持し、さらにＬ−リジンによるフィードバック
阻害が解除されたアスパルトキナーゼを保持するエシェ
リヒア属細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−
リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採
取することを特徴とするＬ−リジンの製造法を提供す
る。
【００１９】尚、本明細書において、ＤＤＰＳ又はＡＫ
IIIをコードするＤＮＡ、あるいはこれらにプロモータ
ーを含むＤＮＡを、「ＤＤＰＳ遺伝子」又は「ＡＫIII
遺伝子」ということがある。また、Ｌ−リジンによるフ
ィードバック阻害が解除された変異酵素を単に「変型型
酵素」、これをコードするＤＮＡあるいはこれにプロモ
ーターを含むＤＮＡを「変異型遺伝子」ということがあ
る。さらに、「Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が
解除される」とは、実質的に阻害が解除されていればよ
いことを意味し、完全に解除されている必要はない。
【００２０】以下、本発明について詳細に説明する。
【００２１】＜１＞本発明の変異型ジヒドロジピコリン
酸合成酵素（ＤＤＰＳ）をコードするＤＮＡ 本発明の変異型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡは、野生型
ＤＤＰＳをコードするＤＮＡにおいて、コードされるＤ
ＤＰＳのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除さ
れる変異を有するものである。ＤＤＰＳとしては、エシ
ェリヒア属細菌由来のもの、特にE. coli由来のＤＤＰ
Ｓが挙げられる。また、ＤＤＰＳのＬ−リジンによるフ
ィードバック阻害を解除する変異としては、配列表の配
列番号３に記載されるＤＤＰＳのアミノ酸配列中、ＤＤ
ＰＳのＮ−末端から 81番目のアラニン残基をバリン残基に置換させる変
異、 118番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させ
る変異、 81番目のアラニン残基をバリン残基に置換させかつ11
8番目のヒスチジン残基を チロシン残基に置換させる
変異、 が挙げられる。
【００２２】野生型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡとして
は、エシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳをコードするも
のであれば特に制限されないが、具体的には配列番号３
に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、さ
らに具体的には配列番号３に示す塩基配列のうち、塩基
番号２７２〜１１４７で表される配列が挙げられる。こ
れらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こす
ような塩基配列の変異を有するものが、本発明の変異型
ＤＤＰＳをコードするＤＮＡである。尚、置換されたア
ミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコ
ードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種
や菌株の違いにより保持するＤＤＰＳの配列がわずかに
相異することが予想されるが、このような酵素の活性に
関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは
挿入を有するものも本発明の変異型ＤＤＰＳ遺伝子に含
まれる。
【００２３】このような変異型遺伝子を取得する方法は
以下の通りである。まず、野生型ＤＤＰＳ遺伝子又は他
の変異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡをイン
ビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合す
るベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。組
換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同
形質転換体のうちで変異型ＤＤＰＳを発現するように至
ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子を
保持している。また、野生型ＤＤＰＳ遺伝子又は他の変
異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主に
適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得
て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異
処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換
体を得、同形質転換体のうちで変異型ＤＤＰＳを発現す
るように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異
型遺伝子を保持している。
【００２４】野生型酵素を生産する微生物を変異処理
し、変異型酵素を生産する変異株を創成した後、該変異
株から変異型遺伝子を取得してもよい。もしくは、野生
型遺伝子が連結されている組換えＤＮＡが導入されてい
る形質転換体を変異処理し、変異型酵素を生産する変異
株を創成した後、該変異株から組換えＤＮＡを回収すれ
ば、同ＤＮＡ上に変異型遺伝子が創成される。
【００２５】ＤＮＡをインビトロ変異処理するための薬
剤としては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒド
ロキシルアミンは、シトシンをＮ4−ヒドロキシシトシ
ンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起
こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処
理する場合は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）等の通常人工突然変
異に用いられている変異剤による処理を行う。
【００２６】上記野生型ＤＤＰＳ遺伝子あるいは他の変
異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するDNAの供与菌とし
ては、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなる
ものを用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトら
の著書（Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia coli and
Salmonella Typhimurium,American Society for Micro
biology,Washington D.C.,1208, table 1）にあげられ
るものが利用できる。たとえば、E.coli JM109 株や、M
C1061 株などがあげられる。ＤＤＰＳ遺伝子を含有する
DNAの供与菌として野生株を用いた場合、野生型のＤＤ
ＰＳ遺伝子を含むDNAが取得できる。
【００２７】（１）野生型ＤＤＰＳ遺伝子の取得 以下に、ＤＤＰＳ遺伝子を含有するDNAの調製例につい
て述べる。まず、野生型のdapAをもつE. coli例えばMC1
061株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養する
には、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際
の効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが
好ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、コーンスィープリカーまたは大豆も
しくは小麦の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸
第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、
硫酸第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適
宜添加した物が用いられる。なお、培地の初発ｐＨは、
６〜８に調製するのが適当である。また培養は３０〜４
２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、通気攪拌
深部培養、振盪培養または静置培養等により行う。
【００２８】このようにして得られた培養物を、例えば
3,000 r.p.m.で５分間遠心分離してE. coli MC1061株の
菌体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法
（Biochem.Biophys.Acta.,72,619,(1963)）、K. S. Kir
byの方法（Biochem.J.,64,405,(1956)）等の方法により
染色体DNAを得ることができる。
【００２９】こうして得られた染色体ＤＮＡからＤＤＰ
Ｓ遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリー
を作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部
分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を
調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵
素が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度３０℃以上、
好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／mlで様
々な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこ
れを消化する。
【００３０】ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、
エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDN
Aに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染
色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素 Sau3AＩと同一末端
塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHＩを、温度
３０℃以上、酵素濃度１〜100ユニット／mlの条件下で
１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮＡに
作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、
上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と開裂切
断されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガー
ゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１６
℃、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時間
以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡ
を得る。
【００３１】得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリ
ヒア属の微生物、例えば大腸菌K-12株、好ましくはJE76
27 株（ponB704,dacB12,pfv+,tonA2,dapA,lysA,str,mal
A38,metB1,ilvH611,leuA371,proA3,lac-3,tsx-76）のよ
うなＤＤＰＳ欠損変異株を形質転換して染色体ＤＮＡラ
イブラリーを作製する。この形質転換は D.M.Morrison
の方法（Methods in Enzymology 68, 326, 1979）ある
いは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透
過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Bio
l.,53,159(1970)）等により行うことができる。なお、J
E7627株は国立遺伝学研究所（静岡県三島市）より入手
可能である。
【００３２】得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中か
ら、ＤＤＰＳ活性が増大した株あるいはＤＤＰＳ遺伝子
欠損に起因する栄養要求性が相補された株より ＤＤＰ
Ｓ 遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。例えば、
ＤＤＰＳ欠損変異株はジアミノピメリン酸要求性である
ので、ＤＤＰＳ欠損変異株を宿主に用いた場合は、ジア
ミノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった
菌株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収すること
により、ＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得るこ
とができる。
【００３３】ＤＤＰＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを
もつ候補株が、実際に ＤＤＰＳ遺伝子がクローニング
された組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認するに
は、候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液
を調製してＤＤＰＳ活性が増大していることを確認する
ことにより達成できる。ＤＤＰＳの酵素活性測定法は、
Yugariらの方法により行うことができる（Yugari,Y. an
d Gilvarg C. J.Biol.Chem.240,4710(1962)）。
【００３４】そして、上記菌株より、ＤＤＰＳ遺伝子を
含有するＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入された組換えＤ
ＮＡを、例えば P. Guerry らの方法（J. Bacteriol.,1
16,1064,(1973)）、D. B. Clewell の方法（J.Bacterio
l.,110,667,(1972)）などにより単離することができ
る。
【００３５】野生型ＤＤＰＳ遺伝子の取得は、染色体上
にＤＤＰＳ遺伝子を有する株から、斎藤、三浦の方法等
により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリ
アクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction；
White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）
により、ＤＤＰＳ遺伝子を増幅することによっても行え
る。増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ＤＤＰＳ
遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重
鎖の両３’末端に相補するものを用いる。ＤＤＰＳ遺伝
子の一部領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片を
プライマーとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体ＤＮ
Ａライブラリーよりスクリーニングする必要がある。Ｄ
ＤＰＳ遺伝子の全領域を増幅した場合には、増幅された
ＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反応
液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮＡ
断片を抽出することによって ＤＤＰＳ 遺伝子を含有す
るＤＮＡ断片を回収できる。
【００３６】ＤＮＡプライマーとしては、例えばE. col
iにおいて既知となっている配列（Richaud,F et al. J.
Bacteriol.,297(1986)）を基にして適宜作成すればよい
が、具体的には、ＤＤＰＳ遺伝子をコードする1150塩基
からなる領域を増幅できるプライマーが好ましく、配列
番号１及び２に示した２種のプライマーが適当である。
プライマーＤＮＡの合成は、ホスホアミダイド法（Tetr
ahedron Letters,22,1859(1981)参照）等の常法によ
り、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosyste
ms社製ＤＮＡ合成機 model 380B等）を用いて合成する
ことができる。また、PCR反応は、市販のＰＣＲ反応装
置（宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000
型等）を使用し、TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造（株）よ
り供給されている）を用い、供給者により指定された方
法に従って行うことができる。
【００３７】ＰＣＲ法により増幅されたＤＤＰＳ遺伝子
は、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能な
ベクターＤＮＡに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導
入することによって、ＤＤＰＳ遺伝子への変異の導入な
どの操作がしやすくなる。用いられるベクターＤＮＡと
形質転換法、さらに ＤＤＰＳ遺伝子の存在の確認方法
は上述した方法と同じである。
【００３８】（２）ＤＤＰＳ遺伝子への変異の導入 上記のようにして得られたＤＤＰＳ遺伝子に、アミノ酸
残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法と
しては、リコンビナントＰＣＲ法（Higuchi,R.,61,in P
CR Technology (Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(198
9))）、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J.,
Meth. in Enzymol.,154,350 1987); Kunkel,T.A. et.a
l.,Meth. in Enzymol.,154,367(1987)）などがある。こ
れらの方法を用いると、目的部位に目的の変異を起こす
ことができる。
【００３９】また、目的遺伝子を化学合成する方法によ
れば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導
入することができる。さらに、染色体もしくはプラスミ
ド上のＤＤＰＳ遺伝子を直接ヒドロキシルアミンで処理
する方法（Hashimoto,T. and Sekiguchi,M.,J.Bacterio
l.,159,1039(1984)）がある。また、ＤＤＰＳ遺伝子を
保有するエシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法また
はN−メチル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸
などの化学薬剤処理による方法を用いてもよい。これら
の方法によれば、ランダムに変異を導入できる。
【００４０】変異型遺伝子の選択方法としては、まずＤ
ＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡか
らなる組換えＤＮＡを、直接ヒドロキシルアミン等で変
異処理し、これで例えば E. coli W3110 株を形質転換
する。次にＬ−リジンのアナログである、Ｓ−２−アミ
ノエチルシステイン（ＡＥＣ）を含む最少培地、例えば
M9に形質転換株を培養する。野生型のＤＤＰＳ遺伝子を
含有する組換えＤＮＡを保持する株は、その組換えＤＮ
Ａにより発現されるＤＤＰＳがＡＥＣにより阻害される
ために、Ｌ−リジン及びジアミノピメリン酸(DAP)の合
成が出来なくなり生育が抑えられる。これに対し、Ｌ−
リジンによる阻害の解除されたＤＤＰＳ遺伝子を含有す
る組換えＤＮＡを保持する株は、同組換えＤＮＡ中のＤ
ＤＰＳ遺伝子にコードされる変異酵素がＡＥＣによる阻
害を受けないので、ＡＥＣが添加された最少培地上での
生育が可能になるはずである。この現象を利用し、生育
が、Ｌ−リジンのアナログであるＳ−２−アミノエチル
・システイン（AEC）に耐性となっている株、すなわち
阻害の解除された変異型ＤＤＰＳ遺伝子を含有する組換
えＤＮＡを保持する株を選択することができる。
【００４１】こうして得られた該変異型遺伝子を、組換
えＤＮＡとして適当な宿主微生物に導入し、発現させる
ことによりフィードバック阻害が解除されたＤＤＰＳを
保有する微生物を取得できる。宿主としては、エシェリ
ヒア属に属する微生物が好ましく、例えば大腸菌（E. c
oli）が挙げられる。
【００４２】また、組換えＤＮＡから変異型ＤＤＰＳ遺
伝子断片を取り出し、他のベクターＤＮＡに挿入したも
のを使用してもよい。本発明において用いることのでき
ることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベ
クターＤＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR32
2、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pM
W119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にも
ファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００４３】さらに、変異型ＤＤＰＳ遺伝子の発現を効
率的に実施するために、変異型ＤＤＰＳをコードするＤ
ＮＡ配列の上流に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内
で働く他のプロモーターを連結してもよく、ＤＤＰＳ遺
伝子に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅
して用いてもよい。
【００４４】また、上記のように、変異型遺伝子を自律
複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入
し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主に保
持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Te
chnol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０
９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molec
ular Genetics, ColdSpring Habor Lab.(1972)）を用い
た方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【００４５】＜２＞本発明に用いる変異型アスパルトキ
ナーゼIII（ＡＫIII）をコードするＤＮＡ 本発明に用いる変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡは、
野生型ＡＫIIIをコードするＤＮＡにおいて、コードさ
れるＡＫIIIのＬ−リジンによるフィードバック阻害が
解除される変異を有するものである。また、ＡＫIIIの
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異と
しては、配列表の配列番号６に示すＡＫIIIのアミノ酸
配列中、ＡＫIIIのＮ−末端から (イ)323番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換
させる変異、(ロ)323番目のグリシン残基をアスパラギン
酸残基に置換させかつ408番目のグリシ ン残基をアス
パラギン酸残基に置換させる変異、(ハ)34番目のアルギ
ニン残基をシステイン残基に置換させかつ323番目のグ
リシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、
(ニ)325番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に置
換させる変異、(ホ)318番目のメチオニン残基をイソロイ
シン残基に置換させる変異、(ヘ)318番目のメチオニン残
基をイソロイシン残基に置換させかつ349番目のバリン
残基をメチオニン残基に置換させる変異、(ト)345番
目のセリン残基をロイシン残基に置換させる変異、(チ)3
47番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変
異、(リ)352番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に
置換させる変異、(ヌ)352番目のスレオニン残基をイソロ
イシン残基に置換させかつ369番目のセリン 残基をフ
ェニルアラニン残基に置換させる変異、(ル)164番目のグ
ルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、(ヲ)417
番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させか
つ419番目のシステ イン残基をチロシン残基に置換さ
せる変異、が挙げられる。
【００４６】野生型ＡＫIIIをコードするＤＮＡとして
は、特に制限されないが、エシェリヒア属細菌、例えば
E. coli由来のＡＫIIIをコードするＤＮＡが挙げられ、
具体的には配列番号６に示すアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ、さらには配列番号６に示す塩基配列のうち、塩
基番号５８４〜１９３０で表される配列が挙げられる。
尚、E. coliのＡＫIIIは、lysC遺伝子にコードされてい
る。
【００４７】これらの配列において、上記アミノ酸残基
の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、
本発明の変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡである。
尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、その
アミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わ
ない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型Ａ
ＫIIIのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある。
このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残
基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも本発明の変
異型ＡＫIII遺伝子に含まれる。
【００４８】例えば、後記実施例２で得られた野生型ly
sC遺伝子の塩基配列（配列番号６）は、既に発表されて
いる E. coli K-12 JC411株のlysCの配列（Cassan,M.,P
arsot,C.,Cohen,G.N.,and Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,26
1,1052(1986)）と６ヶ所相違しており、そのうち２ヶ所
でコードされるアミノ酸残基が異なっている（JC411株
のlysCは、配列番号６に示すlysCのアミノ酸配列中、Ｎ
−末端から５８番目のグリシン残基がシステイン残基
に、４０１番目のグリシン残基がアラニン残基に置き換
わっている）。このE. coli K-12 JC411株のlysCと同一
の配列を有するlysCであっても、上記(イ)〜(ヲ)のいずれ
かの変異を導入すれば、Ｌ−リジンによるフィードバッ
ク阻害が解除された変異を有するlysCが得られることが
予想される。
【００４９】リジンによるフィードバック阻害が解除さ
れた変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡを取得する方法
は以下の通りである。まず、野生型ＡＫIII遺伝子又は
他の変異を有するＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡをイ
ンビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合
するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、
同形質転換体のうちで変異型ＡＫIIIを発現するように
至ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子
を保持している。また、野生型ＡＫIII遺伝子又は他の
変異を有するＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主
に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得
て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異
処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換
体を得、同形質転換体のうちで変異型ＡＫIIIを発現す
るように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異
型遺伝子を保持している。
【００５０】あるいは、野生型酵素を生産する微生物を
変異処理し、変異型酵素を生産する変異株を創成した
後、該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。ＤＮ
Ａを直接変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシ
ルアミン等が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シト
シンをＮ4−ヒドロキシシトシンに変えることによりシ
トシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤であ
る。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照
射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジ
ン（NTG）等の通常人工突然変異に用いられている変異
剤による処理を行う。
【００５１】上記野生型ＡＫIII遺伝子あるいは他の変
異を有するＡＫIII遺伝子を含有するDNAの供与菌として
は、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなるも
のを用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトらの
著書（Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia coli and S
almonella Typhimurium,American Society for Microbi
ology,Washington D.C.,1208, table 1）にあげられる
ものが利用できる。たとえば、E.coli JM109株や、MC10
61株などがあげられる。これらの株からＡＫIII遺伝子
を取得するに際し、染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡ
ライブラリーの作製等は、上記のＤＤＰＳ遺伝子の取得
と同様に行えばよい。ライブラリー作製に用いる宿主と
しては、ＡＫＩ、II、III全欠損株、例えばE. coli GT3
株（E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット
州）等から入手できる）等を用いることが好ましい。
【００５２】得られた染色体ＤＮＡライブラリーの内、
ＡＫIII活性が増大した株あるいは栄養要求性が相補さ
れた株としてＡＫIII遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株
を得る。候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵
素液を調製してＡＫIII活性を確認する。ＡＫIIIの酵素
活性測定法は、スタットマンらの方法により行うことが
できる（Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBras,G.,and Rob
ichon-Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,236,2033(196
1)）。
【００５３】例えば、ＡＫ完全欠損変異株を宿主に用い
た場合は、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチニオ
ンおよびジアミノピメリン酸を含有しない培地上で、ま
たはホモセリンおよびジアミノピメリン酸を含有しない
培地上で生育可能となった形質転換株を単離し、該菌株
から組換えＤＮＡを回収することにより、ＡＫIII遺伝
子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
【００５４】尚、ＰＣＲ法により染色体ＤＮＡからＡＫ
III遺伝子を増幅する場合には、ＰＣＲ反応に用いるＤ
ＮＡプライマーとしては、例えばE. coliにおいて既知
となっている配列（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,a
nd Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986)）を基に
して適宜作成できるが、lysC遺伝子をコードする1347塩
基からなる領域を増幅できるプライマーが適当であり、
例えば配列番号４及び５に示す配列を有する２種のプラ
イマーが適当である。
【００５５】上記のようにして得られたＡＫIII遺伝子
に、アミノ酸残基の置換、挿入および欠失等の変異を実
施する方法としては、前記ＤＤＰＳ遺伝子の変異処理と
同様に、リコンビナントＰＣＲ法、部位特異的変異法な
どがある。
【００５６】また、目的遺伝子を化学合成する方法によ
れば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導
入することができる。さらに、染色体もしくは染色体外
の組換えＤＮＡ上のＡＫIII遺伝子ＤＮＡを直接ヒドロ
キシルアミンで処理する方法（Hashimoto,T. and Sekig
uchi,M.,J.Bacteriol.,159,1039(1984)）がある。ま
た、染色体もしくは染色体外の組換えＤＮＡ上にＡＫII
I遺伝子を保持するエシェリヒア属細菌を紫外線照射す
る方法、またはN−メチル−N'−ニトロソグアニジンも
しくは亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法を用いても
よい。
【００５７】変異型ＡＫIII遺伝子の選択方法として
は、まず変異処理したＡＫIII遺伝子を含有する組換え
ＤＮＡをＡＫ完全欠損株、例えば E. coli GT3株に形質
転換する。次に著量のＬ−リジンを含む最少培地、例え
ばM9で形質転換株を培養する。野生型のＡＫIII遺伝子
を含有する組換えＤＮＡを保持する株は、唯一のＡＫが
Ｌ−リジンにより阻害されるために、Ｌ−スレオニン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、及びジアミノピメ
リン酸(DAP)の合成が出来なくなり生育が抑えられる。
これに対しＬ−リジンによる阻害の解除された変異型Ａ
ＫIII遺伝子を含有する組換えＤＮＡ保持株は、著量の
Ｌ−リジンが添加された最少培地上での生育が可能にな
るはずである。この現象を利用し、生育が、Ｌ−リジン
あるいはＬ−リジンのアナログであるＳ−２−アミノエ
チル・システイン（AEC）に耐性となっている株、すな
わち阻害の解除された変異型ＡＫIII遺伝子を含有する
組換えＤＮＡ保持株を選択することができる。
【００５８】こうして得られた該変異型遺伝子を、組換
えＤＮＡとして適当な微生物（宿主）に導入し、発現さ
せることによりフィードバック阻害が解除されたＡＫII
Iを保有する微生物を取得できる。宿主としては、エシ
ェリヒア属に属する微生物が好ましく、例えば大腸菌
（E. coli）が挙げられる。
【００５９】また、組換えＤＮＡから変異ＡＫIII遺伝
子断片を取り出し、他のベクターに挿入したものを使用
してもよい。本発明において用いることのできることの
できるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤ
ＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG29
9、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW
118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージ
ＤＮＡのベクターも利用できる。
【００６０】さらに、変異型ＡＫIII遺伝子の発現を効
率的に実施するために、変異型ＡＫIIIをコードするＤ
ＮＡの上流に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働
く他のプロモーターを連結してもよく、ＡＫIII遺伝子
に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅して
用いてもよい。
【００６１】また、上記のように、変異型遺伝子を自律
複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入
し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主に保
持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Te
chnol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０
９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molec
ular Genetics, ColdSpring Habor Lab.(1972)）を用い
た方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【００６２】＜３＞本発明によるＬ−リジンの製造 上記のようにして得られる変異型ＤＤＰＳ遺伝子を導入
することによって形質転換され、さらにＬ−リジンによ
るフィードバック阻害が解除されたＡＫを保持するエシ
ェリヒア属細菌を、好適な培地中で培養し、該培養物中
にＬ−リジンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リジン
を採取することにより、Ｌ−リジンを効率よく製造する
ことができる。すなわち、変異型ＤＤＰＳとＬ−リジン
によるフィードバック阻害が解除されたＡＫをともにエ
シェリヒア属細菌に保持させることによって、Ｌ−リジ
ンを効率よく製造させることができる。
【００６３】Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解
除されたＡＫを保持するエシェリヒア属細菌としては、
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異
を有するＡＫIIIをコードするＤＮＡが染色体ＤＮＡに
組み込まれて形質転換されたエシェリヒア属細菌、また
は該ＤＮＡとエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能
なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡが細胞
内に導入されることによって形質転換されたエシェリヒ
ア属細菌が挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィー
ドバック阻害が解除されたＡＫは、Ｌ−リジンによるフ
ィードバック阻害を受けない野生型ＡＫであってもよ
く、このような野生型ＡＫ遺伝子を同様にしてエシェリ
ヒア属細菌に導入したものでもよい。さらに、エシェリ
ヒア属細菌細胞を変異処理することにより、変異型ＡＫ
IIIを産生するようになったエシェリヒア属細菌変異株
であってもよい。
【００６４】一方、変異型ＤＤＰＳ遺伝子をエシェリヒ
ア属細菌に導入することによって形質転換するには、変
異型ＤＤＰＳ遺伝子を染色体ＤＮＡに組み込んで形質転
換してもよく、変異型ＤＤＰＳ遺伝子とエシェリヒア属
細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡとを連結し
てなる組換えＤＮＡを細胞内に導入することによって形
質転換してもよい。
【００６５】変異型ＤＤＰＳ遺伝子及び変異型ＡＫIII
遺伝子の両方をエシェリヒア属細菌に導入する場合に
は、両方の変異型遺伝子がエシェリヒア属細菌の染色体
ＤＮＡ上に組み込まれて保持されていても、細胞内で単
一または別々のプラスミド上に染色体外ＤＮＡとして保
持されていてもよい。さらに、各々の変異型遺伝子の一
方が染色体ＤＮＡ上に組み込まれて保持され、もう一方
の変異型遺伝子が細胞内でプラスミド上に染色体外ＤＮ
Ａとして保持されていてもよい。変異型ＤＤＰＳ遺伝子
及び変異型ＡＫIII遺伝子をエシェリヒア属細菌に導入
するに際しては、両遺伝子の導入の順序は問わない。
【００６６】宿主として用いるエシェリヒア属細菌とし
ては、その細胞内で変異型ＤＤＰＳ遺伝子及び変異型Ａ
ＫIII遺伝子のプロモーター又はこれらの遺伝子を発現
させるための他のプロモーターが機能し、さらに変異型
ＤＤＰＳ遺伝子及び／又は変異型ＡＫIII遺伝子をプラ
スミド上に染色体外ＤＮＡとして導入する場合には、導
入するのに用いるベクターＤＮＡの複製起点が細胞内で
機能して複製可能なものであれば利用できる。
【００６７】例えば、Ｌ−リジン生産性のE. coli、具
体的にはＬ−リジンアナログに耐性を有する変異株が例
示できる。このＬ−リジンアナログは、エシェリヒア属
細菌の増殖を阻害するようなものであるが、その抑制は
Ｌ−リジンが培地中に共存すれば、全体的または部分的
に解除されるようなものである。例えば、オキサリジ
ン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチ
ル）−システィン（以下、「ＡＥＣ」と略記する）、γ
−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等がある。
これらのリジンアナログに耐性を有する変異株は、通常
の人工変異操作をエシェリヒア属の微生物に施すことに
より得られる。Ｌ−リジン製造に用いる菌株として、具
体的には、エシェリヒア・コリ ＡＪ１１４４２（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−５０８４として寄託されている。特開昭５６
−１８５９６号公報第４７１頁左下欄参照）が挙げられ
る。以上の微生物のアスパルトキナーゼは、Ｌ−リジン
によるフィードバック阻害が解除されている。
【００６８】その他にも、たとえばＬ−スレオニン生産
菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生産菌も、一般的には
そのアスパルトキナーゼのＬ−リジンによる阻害が解除
されているからである。E. coliのＬ−スレオニン生産
菌としては、B-3996株が現在知られている内で最も高い
生産能を持っている。B-3996株は、Reserch Institute
for Genetics and Industrial Microorganism Breeding
に、登録番号ＲＩＡ１８６７のもとに寄託されている。
【００６９】本発明による変異型遺伝子を保持する形質
転換体の培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機
イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常
の培地である。
【００７０】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加
水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトー
ルなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸も
しくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００７１】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アン
モニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニ
アガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
【００７２】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、
Ｌ−イソロイシンなどの要求物質または酵母エキス等を
適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に
応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオ
ン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００７３】培養は、好気的条件下で１６〜７２時間実
施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中
ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるい
は有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニア
ガス等を使用することができる。
【００７４】発酵液からのＬ−リジンの採取は通常イオ
ン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせ
ることにより実施できる。
【００７５】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する
【００７６】
【実施例１】 変異型ＤＤＰＳ遺伝子の取得 ＜１＞野生型dapA遺伝子のクローニング E.coliのdapA遺伝子の塩基配列は既に報告されており
（Richaud,F et al. J.Bacteriol.,297(1986)）、オー
プンリーデイングフレーム(ORF)は876塩基対であり、29
2アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが
わかっている。このdapA遺伝子がどのように調節されて
いるか不明であるため、プロモーター領域を除き、ＳＤ
配列とORFのみを含む領域をPCR法を用いて増幅し、クロ
ーニングすることにした。
【００７７】E. coli K-12 MC1061株の全ゲノムＤＮＡ
を斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1
963)）により回収し、配列番号１及び２に示す配列を有
する２種のプライマーを作製し、これらを用いて、エル
リッチらの方法（PCR Technology, Stockton press (19
89)）に従ってＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡの増幅を
行った。得られたＤＮＡをそのまま市販のＰＣＲ断片用
クローニングベクターｐＣＲ１０００（Invitrogen社
（米国カルホルニア州）より購入）に挿入した。ｐＣＲ
１０００はlacZプロモーター（Placz）を含有してお
り、lacZプロモーターの下流の部位で切断した状態で市
販されている。このｐＣＲ１０００の両切断末端の間に
ＰＣＲ断片を連結して得られる組換えＤＮＡをE. coli
に導入すると、lacZプロモーター制御下でＰＣＲ断片が
転写される。ＰＣＲ断片をＰＣＲ１０００に連結する
際、このlacZプロモーターによる転写方向に対してdapA
の転写の向きが正方向となるように連結されたプラスミ
ドとしてpdapA1、逆方向となるように連結されたプラス
ミドとしてpdapA2の２種のプラスミドを得た（図１）。
【００７８】これらのプラスミドをＤＤＰＳ欠損株であ
るE. coli JE7627に導入したところ、プラスミドを導入
された株はJE7627のジアミノピメリン酸の要求性を相補
したので、両プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片は、活
性のあるＤＤＰＳをコードする遺伝子dapAを含有すると
確認した。
【００７９】pdapA1を野生型E. coli W3110株（国立遺
伝学研究所（静岡県三島市）から入手）に導入して得ら
れる形質転換株をW3110/pdapA1、pdapA2をE. coli W311
0株導入して得られる形質転換株をW3110/pdapA2とそれ
ぞれ命名した。そして以下の組成を有する最少培地M9に
リジンのアナログであるＳ−２−アミノエチルシステイ
ン（ＡＥＣ）を加え、これら２種の形質転換株をそれぞ
れ培養した。コントロールとしてプラスミドを導入して
いないW3110株も同培地で培養した。２種の形質転換株
もプラスミドを持たないW3110株も、ＡＥＣにより生育
が抑えられたが、その生育阻害はＬ−リジンの添加によ
って回復した。
【００８０】（最小培地 Ｍ９） Ａ：（20×M9） Na2HPO4・12H2 303 g/L KH2PO4 60 g/L NaCl 10 g/L NH4Cl 20 g/L Ｂ： 1M MgSO4 Ｃ： 50％ Gulcose Ｄ： 1g/L Thiamine
【００８１】上記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄを別々に滅菌し、Ａ：
Ｂ：Ｃ：Ｄ：水＝5:0.1:1:0.1:95の割合で混合する。
【００８２】＜２＞変異型ＤＤＰＳ遺伝子（dapA*）の
取得 Ｌ−リジンによる阻害が解除されたdapA*を含有するプ
ラスミド保持株は、著量のＳ−２−アミノエチルシステ
イン（ＡＥＣ）が添加された最少培地M9上での生育が可
能になると予想し、生育がＡＥＣに耐性となっている株
を選択することによって、阻害の解除されたdapA*を含
有するプラスミド保持株を選択することにした。
【００８３】dapA*を効率よく取得するために、＜１＞
で作製したpdapA1およびpdapA2上のdapAに変異処理を行
なうことにした。
【００８４】（1-2-1）dapA*を含有するプラスミド保持
株の選択条件の検討 上記で得られたW3110/pdapA1株およびW3110/pdapA2株
を、それぞれ種々の濃度のＡＥＣを含有するＭ９寒天平
板培地上で培養した。そしてＡＥＣによる生育阻止濃度
を調べ、dapA*を含有するプラスミド保持株の選択条件
の検討を行なった。
【００８５】各種濃度でＡＥＣを含むＭ９培地での形質
転換体の生育を表１に示す。尚、表中の＋は形質転換株
が生育することを示し、−は生育しなかったことを示
す。
【００８６】
【表１】
【００８７】pdapA1上のdapA遺伝子の転写方向はlacZプ
ロモーターによる転写の方向と一致している（図１）。
よってpdapA1上のdapA遺伝子はlacZプロモーターにより
発現量が増幅されているため、dapAが野生型のままでも
かなり高濃度のＡＥＣに耐性であったが、pdapA2上のda
pA遺伝子は転写方向がlacZプロモーターに対して逆方向
であり、自身のプロモーターも欠失しているため発現量
が少なく、より低濃度のＡＥＣで生育が阻害されること
がわかった（W3110/pdapA1株では30mM、W3110/pdapA2株
では15mMの添加区で生育が抑えられた）。なお、この生
育阻害はＬ−リジンの同時添加により消去されることを
確認した。
【００８８】したがって、変異導入対象にはpdapA2を用
い、最少培地Ｍ９にＡＥＣを60mM添加したものを、dapA
*を含有するプラスミド保持株の選択に用いた。以下、
実施例１においてこの培地を選択培地という。
【００８９】（1-2-2）ヒドロキシルアミンによるpdapA
2のインビトロ変異処理 pdapA2プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを直
接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理法
を用いた。
【００９０】２μgのＤＮＡを0.4Mヒドロキシルアミン
中（0.1M KH2PO4-1mM EDTA (pH6.0)100μl、1M ヒドロ
キシルアミン-1mM EDTA (pH6.0) 80μl、DNA 2μg、水
を加えて計200μlとする）で、75℃で１〜４時間処理し
た。処理後のＤＮＡをガラスパウダーで精製後、E. col
i W3110に導入し、完全培地（L-broth：1％ Bacto tryp
ton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％ NaCl, 1.5％ agar）
に撒き、コロニーを形成させた。これらを（1-2-1）で
述べた選択培地にレプリカし、選択培地上でコロニーを
形成するものを選択した。２度の実験で合計３６株の変
異プラスミドの候補が得られた。こうして得られた候補
株合計３６株を、再度選択培地にスポットし、AEC耐性
を確認した。
【００９１】（1-2-3）dapA*遺伝子の単離及びdapA*産
物の検討 上記３６株から変異型pdapA2を回収し、これらと野生型
pdapA2のそれぞれでdapA欠損株 JE7627を形質転換し、
各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、ＤＤＰＳの酵
素活性を測定した。
【００９２】無細胞抽出液（粗酵素液）は次のようにし
て調製した。形質転換株を２×TY培地（1.6％ Bacto tr
ypton, 1％ Yeast extract, 0.5％ NaCl）で培養し、Ｏ
Ｄ66 0が約0.8になったところで集菌した。菌体を０℃の
条件下で、0.85%NaClで洗浄し、20mMリン酸カリウム緩
衝液 pH7.5−400mM KClに懸濁し、ソニック（0℃,200W,
10分）で菌体を破砕した。菌体破砕液を０℃の条件下
で、33krpmで１時間遠心し、上清をとってこれに80％飽
和になるよう硫安を添加し、０℃で一夜保存した後遠心
し、ペレットを20mMリン酸カリウム緩衝液 pH7.5−400m
M KClに溶解した。
【００９３】ＤＤＰＳ酵素活性の測定は、Yugariらの方
法（Yugari,Y. and Gilvarg C. J.Biol.Chem.240,4710
(1962)）で行った。即ち下記組成の反応液の吸光度を、
37℃で分光光度計中で経時的に270nmの波長で測定し、
生じるジヒドロジピコリン酸を測定した。ブランクとし
ては反応系からピルビン酸ナトリウムを除いたものとし
た。
【００９４】（反応液組成） 50mM イミダゾール−HCl pH7.4 20mM Ｌ−アスパラギン酸セミアルデヒド 20mM ピルビン酸ナトリウム 酵素液 水 （バランス） 計 1.0ml
【００９５】ＤＤＰＳの酵素活性を測定する際、酵素反
応液中に種々の濃度のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンに
よる阻害の度合を調べた。図２に示す様に、野生型ＤＤ
ＰＳはＬ−リジンによる阻害を受けた。野生型に比べて
Ｌ−リジンによる阻害を受けにくくなったＤＤＰＳを有
する形質転換株由来の変異プラスミドは、候補プラスミ
ド３６種中３種類であった。これらをそれぞれ、pdapAS
8、pdapAS9およびpdapAS24と命名した。後の塩基配列の
決定で pdapAS8とpdapAS9は同一変異を有することが判
明した。
【００９６】pdapAS8、pdapAS9およびpdapAS24上のdapA
*にコードされる３種の変異型ＤＤＰＳのＬ−リジンに
よる阻害の解除の度合は様々ではあったが、３種ともＬ
−リジンによる阻害が解除されていた。酵素の比活性
は、菌体の生育状況や試料の調製に影響されるが、いず
れも野生型より若干の低下が見られた。しかし、育種素
材としては実質的に問題となる程ではないと判断した。
【００９７】（1-2-4）変異型dapA遺伝子の塩基配列の
決定 DNAシークエンサー ABI Model 373A （ABI社製）を使用
して、常法に従い、変異型dapA遺伝子の塩基配列の決定
を行った。その結果、配列番号３に示す野生型dapA遺伝
子の配列上で、pdapAS8及びpdapAS9は、４８７番目のＣ
がＴに、pdapAS24は５９７番目のＣがＴに変化している
ことが明かとなった。従って配列番号３に示すＤＤＰＳ
のアミノ酸配列において、pdapAS8及びpdapAS9のコード
するＤＤＰＳは、８１番目のアラニン残基がバリン残基
に、pdapAS24のコードするＤＤＰＳは、１１８番目のヒ
スチジン残基がチロシン残基に変化していることが明か
となった。
【００９８】（1-2-5）二重変異型dapAの作製 上述のように２種類の変異型dapA遺伝子が得られた。こ
れらの変異は阻害の解除が相加的に働くかどうかを検証
するために、２つの変異を同時に持つ変異型dapAを含有
するプラスミドを作成した。作成の手順は図３に示す通
りである。得られた二重変異プラスミドをpdapAS824と
命名した。
【００９９】
【実施例２】 変異型ＡＫIII遺伝子の取得 ＜１＞野生型lysC遺伝子のクローニング E. coliのＡＫIII遺伝子（lysC）の塩基配列は既に報告
されており（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,and Pat
te,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986)）、オープンリ
ーディングフレーム(ORF)は1347塩基対よりなり、449ア
ミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることがわか
っている。この遺伝子にはオペレーターが存在しＬ−リ
ジンによる抑制を受けるため、このオペレーター領域を
除くために、SD配列とORFのみを含む領域を、ＰＣＲ法
を用いて増幅し、クローニングすることにした。
【０１００】E.coli K-12 MC1061 株の全ゲノムＤＮＡ
を斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1
963)）により調製し、配列番号４及び５に示す配列を有
する２種のプライマーを作製し、これらを用いてエルリ
ッチらの方法（PCR Technology, Stockton press (198
9)）に従ってＰＣＲ反応を行い、lysC遺伝子の増幅を行
った。得られたＤＮＡをBamHIとAseIで消化した後、平
滑末端にし、多コピーベクターpUC18のSmaI部位に挿入
した。このSmaI部位はベクター内に存在するlacZプロモ
ーターの上流側に位置しており、pUC18のSmaI部位にＤ
ＮＡ断片を挿入して得られる組換えＤＮＡをE. coliに
導入すると、lacZプロモーター制御による読み越し（リ
ードスルー）転写により、挿入されたＤＮＡ断片が転写
される。pUC18のSmaI部位にＰＣＲ断片を挿入する際、p
UC18に含まれているlacZプロモーターによる転写方向に
対してlysCの転写の向きが逆方向となるように挿入され
たプラスミドとしてpLYSC1と、正方向となるように挿入
されたプラスミドとしてpLYSC2の２種のプラスミドを得
た（図４）。
【０１０１】これらのプラスミドでＡＫI、II、III完全
欠損株であるE. coli GT3（thrA1016b,metLM1005,lysC1
004）を形質転換したところ、GT3のホモセリンおよびジ
アミノピメリン酸の要求性が相補されたので、両プラス
ミドに挿入されたＤＮＡ断片は、活性のあるＡＫIIIを
コードする遺伝子lysCを含有すると確認した。
【０１０２】pLYSC1をＡＫ完全欠損株E. coli GT3に導
入して得られる形質転換株をGT3/pLYSC1、pLYSC2をE. c
oli GT3に導入して得られる形質転換株をGT3/pLYSC2と
命名した。最少培地Ｍ９に著量のＬ−リジンを加え、GT
3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株をそれぞれ培養した。GT
3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株ともに野生型のlysCを含
有するプラスミドを保持し、同プラスミド上のlysCにコ
ードされるＡＫIIIが唯一のＡＫである。著量のＬ−リ
ジン存在下では唯一のＡＫである野生型ＡＫIIIがＬ−
リジンにより阻害されるために、両株ともＬ−スレオニ
ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、及びジアミノ
ピメリン酸(DAP)の合成ができなくなり生育が抑えられ
た。
【０１０３】＜２＞変異型ＡＫIII遺伝子（lysC*）の取
得 Ｌ−リジンによる阻害の解除された lysC*を含有するプ
ラスミド保持株は著量のＬ−リジンが添加された最少培
地M9上での生育が可能になると予想し、生育がＬ−リジ
ンあるいはＬ−リジンのアナログであるＳ−２−アミノ
エチル・システイン（AEC）に耐性となっている株を選
択することによって、阻害の解除されたlysC*を含有す
るプラスミド保持株を選択することにした。
【０１０４】lysC*を効率よく取得するために、＜１＞
で作製したpLYSC1およびpLYSC2上のlysCに変異処理を行
なうことにした。
【０１０５】（2-2-1）lysC*を含有するプラスミド保持
株の選択条件の検討 GT3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株をそれぞれ種々の濃度
のＬ−リジンあるいはAECを含有するＭ９寒天平板培地
上で培養を行なった。そしてＬ−リジンあるいはAECに
よる生育阻止濃度を調べ、lysC*を含有するプラスミド
保持株の選択条件の検討を行なった。
【０１０６】各種濃度でＬ−リジンあるいはAECを含む
Ｍ９培地での形質転換体の生育を表２に示す。尚、表中
の＋は形質転換株が生育したことを示し、±はやや生育
したことを示し、−は生育しなかったことを示す
【０１０７】
【表２】
【０１０８】pLYSC2上のlysC遺伝子の転写はlacZプロモ
ーターによる転写の方向と一致している（図４）。よっ
てpLYSC2上のlysC遺伝子はlacZプロモーターで発現量が
増幅されているためlysCが野生型のままでもかなり高濃
度のＬ−リジン、AECに耐性であったが、pLYSC1上のlys
C遺伝子は転写方向がlacZプロモーターに対して逆方向
であり、自身のプロモーターも欠失しているため発現量
が少なく、より低濃度のＬ−リジン、AECで生育が阻害
されることがわかった（GT3/pLYSC2株ではＬ−リジンに
ついては100mMの添加区まで、AECについては3mMの添加
区まで生育が抑えられなかったのに対し、GT3/pLYSC1株
ではＬ−リジン、AECとも0.2mMの添加区で生育が完全に
抑えられた）。なお、この生育阻害はホモセリン及びジ
アミノピメリン酸の同時添加により消去されることを確
認した。
【０１０９】したがって、変異導入実験にはpLYSC1を用
い、最少培地Ｍ９にＬ−リジン10mM、もしくはＡＥＣ
0.2mMを添加したものを、lysC*を含有するプラスミド保
持株の選択に用いた。以下、実施例２においてこの培地
を選択培地という。
【０１１０】（2-2-2）ヒドロキシルアミンによるpLYSC
1のインビトロ変異処理 pLYSC1プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを直
接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理法
に加え、変異に多様性を与えるため、即ちヒドロキシル
アミンによるシトシンからチミンへの変異以外の変異を
期待して、プラスミドを保持した菌体をニトロソグアニ
ジン（NTG）で処理した後プラスミドを抽出するインビ
ボ変異処理法の２種の方法を用いた。
【０１１１】（ヒドロキシルアミンによるインビトロ変
異処理）2μgのＤＮＡを 0.4M ヒドロキシルアミン中
（0.1M KH2PO4-1mM EDTA (pH6.0)100μl、1M ヒドロキ
シルアミン-1mM EDTA (pH6.0) 80μl、DNA 2μg、水を
加えて計200μlとする）で 、75℃の条件下で、１〜４
時間処理した。処理後のＤＮＡをガラスパウダーで精製
後、ＡＫ完全欠損株E. coli GT3株に導入し、完全培地
（ L-broth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extrac
t, 0.5％ NaCl, 1.5％ agar）に撒きコロニーを形成さ
せた。これを（2-2-1）で設定した選択培地にレプリカ
し、選択培地上に生育可能な株を選択し候補株とした。
形質転換体の出現率と変異率は図５のような推移がみら
れた。４時間処理では 0.5〜0.8％とかなり高率で変異
株が得られた。
【０１１２】（ＮＴＧによるインビボ変異処理）pLYSC1
をE. coli MC1061に導入し、菌体ごとＮＴＧ処理をおこ
なった。処理後の菌体を一夜培養して変異を固定した後
プラスミドを抽出し、E. coli GT3に導入した。すなわ
ち、形質転換株を２×TY培地（1.6％ Bacto trypton, 1
％ Yeastextract, 0.5％ NaCl）で培養し、ＯＤ660が約
０．３になったところで集菌し、下記に示すＴＭ緩衝液
（TM buffer）で洗浄した後、ＮＴＧ液（0.2mg/mlの濃
度でＮＴＧをTM bufferに溶解させて調製）に懸濁し、3
7℃で０〜９０分処理した。菌体をTM buffer及び２×TY
培地で洗浄後、2×TY培地で一夜培養して変異を固定し
た後、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、E. coli GT
3株に導入し、候補株のスクリーニングををインビトロ
変異と同様に行い、リジン耐性（LysR）、ＡＥＣ耐性
（AECR）の変異体を得た。
【０１１３】（TM buffer） Tris 50mM マレイン酸 50mM (NH4)2SO4 1g/L MgSO4・7H2O 0.1g/L Ca(NO3)2 5mg/L FeSO4・7H2O 0.25mg/L NaOHを用いてpH6.0に調整
【０１１４】上記で得られた候補株合計180株(ヒドロキ
シルアミン処理48株、NTG処理132株)を再度選択培地に
スポットし、AEC及びＬ−リジン耐性を確認し153株を得
た。培地中のアミノ酸蓄積パターンの違いに注目して、
この153株を14群に分け各群の代表株を選んでＡＫ活性
を測定することにした。なお、ヒドロキシルアミン処理
による変異株と、NTG処理による変異株との間ではＡＫ
の活性に大きな差はなかったので、それぞれを区別する
ことなく以降の実験を行なった。
【０１１５】（2-2-3）lysC*遺伝子の単離及びlysC*産
物の検討 上記14群の代表株として、No.24, No.43, No.48, No.6
0, No.80, No.117, No.126, No.149, No.150, No.156,
No.158, No.167, No.169, No.172を選び、おのおのから
変異型pLYSC1を回収し、それぞれpLYSC1*24, pLYSC1*4
3, pLYSC1*48, pLYSC1*60, pLYSC1*80, pLYSC1*117, pL
YSC1*126, pLYSC1*149, pLYSC1*150, pLYSC1*156, pLYS
C1*158, pLYSC1*167, pLYSC1*169, pLYSC1*172と命名し
た。これらと野生型pLYSC1でＡＫ完全欠損株GT3を形質
転換し、各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、ＡＫ
IIIの酵素活性を測定した。
【０１１６】無細胞抽出液（粗酵素液）は次のようにし
て調製した。形質転換株を２×TY培地で培養し、ＯＤ
660が約0.8になったところで集菌した。菌体を０℃の条
件下、0.02M KH2PO4(pH6.75)-0.03M β−メルカプトエ
タノールで洗浄し、ソニック（0℃,100W,30秒×4）で菌
体を破砕した。菌体破砕液を０℃の条件下、33krpmで１
時間遠心し、上清をとりこれに80％飽和になるよう硫安
を添加し、遠心後ペレットを0.02M KH2PO4(pH6.75)-0.0
3M β−メルカプトエタノールに溶解し、０℃で一夜保
存した。
【０１１７】ＡＫIII酵素活性の測定は、スタットマン
らの方法にしたがった(Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBr
as,G.,and Robichon-Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,23
6,2033(1961))。すなわち、下記組成の反応液を27℃で4
5分インキュベートし、FeCl3溶液（2.8N HCl 0.4ml + 1
2％TCA 0.4ml + 5％FeCl3・6H2O/0.1N HCl 0.7ml）を加
え発色させ、これを遠心後、上清の540nmでの吸光度を
測定した。活性は１分間に生成するヒドロキサム酸の量
で表示（1U=1μmol/min）した。モル吸光係数は600とし
た。尚、反応液からアスパラギン酸カリウムを除いたも
のをブランクとした。
【０１１８】（反応液組成） reaction mixture *1 0.3ml ヒドロキシルアミン溶液 *2 0.2ml 0.1M アスパラギン酸カリ(pH7.0) 0.1ml 酵素液 水 （バランス） 計 1.0ml* 1; 1M Tris-HCl(pH8.1)9ml + 0.3M MgSO4 0.5ml + 0.2
M ATP(pH7.0) 5ml* 2; 8M ヒドロキシルアミン溶液を直前にKOHで中和した
もの
【０１１９】ＡＫの酵素活性を測定する際、酵素反応液
中に種々の濃度のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンによる
阻害の度合を調べた。結果を、図６及び表３に示した。
尚、野生型及びNo.24, 43, 48, 60, 80, 117, 126につ
いては図６Ａに、No.149, 150, 156, 158, 167, 169, 1
72については図６Ｂに示した。
【０１２０】この結果が示すように、野生型ＡＫIIIは
Ｌ−リジンによる阻害を非常に強く受け、Ｌ−リジン約
0.45mMで50％阻害され、5mMになるとほぼ100％阻害され
た。それに対し、今回得られた変異型ＡＫIIIは、解除
の度合は様々ではあったが、14種ともＬ−リジンによる
阻害が解除されていた。特にNo.24、80、117、169、172
では、Ｌ−リジン100mMでも阻害はほとんどみられず、5
0％阻害濃度は野生型のそれと比較して200倍以上であっ
た。また総蛋白当りの比活性は、菌体の生育状況や試料
の調製に影響されるが、いずれもほとんどが野生型と同
等もしくはそれ以上のものであり、変異導入による活性
低下の問題はほとんどなかった（表３）。このことよ
り、ＡＫIIIの活性中心とＬ−リジンによる調節部位が
それぞれ独立していることが予想された。尚、表３中、
阻害解除度（％）とは、反応液中Ｌ−リジン非存在下で
のＡＫ活性に対するＬ−リジン 100 mM存在下でのＡＫ
活性である。熱安定性（％）とは55℃で1.5時間処理後
の活性保持率である。
【０１２１】
【表３】 *1：L-リシ゛ン非存在下でのAK活性に対するL-リシ゛ン 100 mM
存在下でのAK活性(%)* 2：55℃で1.5時間処理後の活性保持率(%)
【０１２２】続いて変異型酵素の熱安定性を調べた。あ
る酵素を改良し活性を上げようとする場合、創成される
酵素が細胞内で安定に保持されることが重要である。細
胞内外でのプロテアーゼの活動の違いや、酵素をインビ
トロ保存するための保存用バッファーの影響などもある
ため、インビトロの測定には問題もあるが、簡便のため
１つのパラメーターとして変異型ＡＫIIIの熱安定性に
ついてインビトロで検討した。
【０１２３】ＡＫIIIの失活温度を種々の条件で検討し
た結果から、55℃、90分処理後の活性保持率を測定する
ことにした。表３に示すように、半数がむしろ野生型よ
りも優れていた。通常変異型酵素は野生型に比べ不安定
なものが多いが、今回得られた変異型ＡＫIIIには安定
性が野生型を上回るものもあり、Ｌ−リジン生産の実用
酵素としてかなり有力と思われるものが多かった。
【０１２４】（2-2-4）野生型lysCおよび変異型lysCの
塩基配列の決定 DNA シークエンサー ABI Model 373A（ABI社製）を使用
して、常法に従い、今回取得した野生型lysC遺伝子の塩
基配列の決定を行なった（配列番号６）。その結果、既
に発表されている E. coli K-12 JC411株のlysCの配列
（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,and Patte,J.C.,J.
Biol.Chem.,261,1052(1986)）と６ヶ所（アミノ酸レベ
ルでは２ヶ所）の相違があった。この６ヶ所の相違は使
用菌株の違いによるものであると考えられる。
【０１２５】同様に、14種の変異型pLYSC1上にあるlysC
*それぞれについて塩基配列を決定し、変異点を明らか
にした。結果を表４に示す。表中、（）内はヌクレオチ
ドの変異に基づくアミノ酸残基の変異を示す。14種のう
ち全く同一の変異型が２組（No.48とNo.167、及びNo.24
とNo.80）あったので、変異の種類は12種類であった。
尚、No.149,150,156,158,167,169,172 はヒドロキシル
アミン処理、No.24、43、48、60、80、117、126はＮＴ
Ｇ処理によって得た変異型であるが、変異のパターンは
いずれもシトシンからチミンへの変異、あるいは裏鎖の
シトシンからチミンへの変異による表鎖のグアニンから
アデニンへの変異であった。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
【実施例３】 dapA*を導入した株によるＬ−リジンの発
酵生産 E. coliでＬ−リジンを生産させるためには、特開昭56-
18596号公報、及び米国特許第4346,170公報及びApplied
Microbiology and Biotechnology 15,p227-231(1982)
に示されるように、ＤＤＰＳを増強する宿主としては、
アスパルトキナーゼがＬ−リジンによる阻害を受けなく
なっているように変化している事が必須であるとされて
いる。そのような株として、たとえばＬ−スレオニン生
産菌があげられる。E. coliスレオニン生産菌として
は、Bー3996株が現在知られている内で最も高い生産能を
持っている。そこで、dapA*を評価するに当たり、B-399
6株を宿主に用いることとした。B-3996株は、染色体外
に唯一のプラスミドとしてｐＶＩＣ４０を保持する。詳
細は特表平３−５０１６８２号公報に記載されている。
当該微生物は、Reserch Institute for Genetics and I
ndustrial Microorganism Breedingに、登録番号ＲＩＡ
１８６７のもとに寄託されている。
【０１２８】また、E. coliに導入するdapA*としては、
酵素の阻害解除度、比活性より判断して、pdapAS24に含
まれているdapA*（１１８番目のヒスチジン残基がチロ
シン残基に変異しているもの）を選択した。まず、dapA
*の発現量を増すためと、プラスミドの安定性を増すた
めに、pdapAS24上にあった変異型dapA*（以下、「dapA*
24」という）をｐＶＩＣ４０のテトラサイクリン耐性遺
伝子プロモーターの下流に連結し、図７に示す様にして
ＲＳＦ２４Ｐを得た。。
【０１２９】ＲＳＦ２４Ｐプラスミドを E. coli JM109
株に導入したものは、ＡＪ１２３９５と命名され、寄託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３９３５として工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている。pdapAS8およびpda
pAS9を保持する株は寄託しなかったが、各プラスミド上
のdapA*の変異点は前述の通りすべて明らかになってい
るので、上記寄託菌よりプラスミドをマニアティスらの
方法（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecul
ar Cloning, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1.2
1(1989)）により回収し、サイト・ダイレクテッド・ミ
ュータジェネシス法（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Mania
tis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press,15.63(1989)）により目的遺伝子を得るこ
とは当業者にとり容易である。
【０１３０】B-3996株からｐＶＩＣ４０を常法に従い脱
落させて、プラスミドを有しない株としてB-399株を取
得した。ＲＳＦ２４Ｐプラスミドを常法にしたがいBー39
9株に導入し、B-399/RSF24Pを得た。B-399/RSF24PのＬ
−リジン生産性について評価を行なった。
【０１３１】一方、コントロールのプラスミドとしてＲ
ＳＦＰを構築した。すなわち、図７に示すｐＶＩＣ４０
のBamHIおよびDraIによる二重消化物より大断片を選択
し、これをＤＮＡポリメラーゼ クレノー・フラグメン
トによって平滑末端化処理した。平滑末端化処理した大
断片を自己連結させてプラスミドＲＳＦＰを得た。B-39
9株にＲＳＦＰを常法に従い導入し、B-399/RSFPを得
た。B-399/RSFPについてもＬ−リジン生産性の評価を行
った。
【０１３２】培養は、以下の培地を用い、培養時間48時
間、温度37℃の条件下、攪拌114〜116rpmで行った。結
果を表５に示す。
【０１３３】（Ｌ−リジン生産培地） Ａ ： (NH4)2SO4 16 g/L KH2PO4 1 g/L MgSO4・7H2O 1 g/L FeSO4・7H2O 0.01 g/L MnSO4・5H2O 0.01 g/L Yeast Ext.(Difco) 2 g/L Ｌ−メチオニン 0.5 g/L KOHでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ (16
/20容) Ｂ ： 20％ Glucose （115℃で10分オートクレーブ）
(4/20容) Ｃ ： 局方 CaCO3 （180℃で２日間乾熱滅菌）
(30g/L) Ａ：Ｂを４：１で混合し、１Ｌに対してＣを３０ｇ加え
て溶解し、抗生物質（ストレフ゜トマイシン 100μg/ml，カナマイシン 5
μg/ml）を加える。
【０１３４】
【表５】
【０１３５】
【実施例４】dapA*及びlysC*を導入した株によるＬ−リ
ジンの発酵生産(I)実施例３で変異型ＤＤＰＳのＬ−リ
ジン生産に対する効果が示されたが、これをさらに改良
するために、実施例２で得られた変異型ＡＫIII遺伝子
を変異型ＤＤＰＳ遺伝子と共存させる事とした。共存さ
せる変異型ＡＫIII遺伝子としては、酵素活性、熱安定
性等からＮｏ．８０株由来のもの（lysC*80）を選択し
た。
【０１３６】lysC*80は、lysC*の発現量を増すためにpL
YSC1*80上にあったlysC*（以下、「lysC*80」という）
をpUC18の逆位挿入ベクターpHSG399（宝酒造社製）のla
cZプロモーターの下流につなぎかえることにより作成さ
れたプラスミドpLLC*80（図８）から切り出したものを
使用した。pLLC*80は、pLYSC1*80上のlysC*80が、転写
方向がlacZプロモーターに対して逆方向に配置されてい
るので、Ｌ−リジンの生産性を向上させるために、lacZ
プロモーターに対して転写方向が正方向となるようにly
sC*80を配置させるために作成されたプラスミドであ
る。
【０１３７】pLLC*80と、実施例３で得られたＲＳＦ２
４Ｐから、dapA*及びlysC*を有するプラスミドＲＳＦＤ
８０を図９の様にして作製した。ＲＳＦＤ８０は、テト
ラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター（Ptet）の下流
に、Ptetに対して転写方向が正方向となるようにdapA*2
4及びlysC*80がこの順序で配置されている。
【０１３８】ＲＳＦＤ８０プラスミドをE. coli JM109
株に導入したものを、ＡＪ１２３９６と命名した。ＡＪ
１２３９６は、ＦＥＲＭ Ｐ−１３９３６として工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。pLYSC1
*24, LYSC1*43, pLYSC1*48,pLYSC1*60, pLYSC1*117, pL
YSC1*126, pLYSC1*149, pLYSC1*150, pLYSC1*156, pLYS
C1*158, pLYSC1*167, pLYSC1*169, pLYSC1*172を保持す
る株は寄託しなかったが、各プラスミド上のlysC*の変
異点は前記の通りすべて明らかになっているので、上記
寄託菌よりプラスミドをマニアティスらの方法（Sambro
ok,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)）に
より回収し、サイト・ダイレクテッド・ミュータジェネ
シス法（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molec
ular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s,15.63(1989)）により目的遺伝子を得ることは当業者
にとり容易である。ＲＳＦＤ８０を常法にしたがいBー39
9株に導入し、B-399/RSFD80を得た。B-399/RSFD80のＬ
−リジン生産性について評価を行なった。コントロール
として、B-399/RSFPについてもＬ−リジン生産性の評価
を行った。
【０１３９】培養は、実施例３と同様のＬ−リジン生産
培地を用い、培養時間48時間、温度37℃の条件下、攪拌
114〜116rpmで行った。結果を表６に示す。
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
【実施例５】dapA*及びlysC*を導入した株によるL-リシ゛ン
の発酵生産（II） エシェリヒア属細菌に変異型dapA遺伝子と、変異型lysC
遺伝子を保持させて、Ｌ−リジンの生産性が改善できる
ことが実施例４で確認された。この効果が、宿主を変更
した場合にも維持されるかどうかを実験した。
【０１４２】宿主には、E. coli W3110(tyrA)株を用い
た。W3110(tyrA)株は欧州特許公開９２年４８８４２４
号公報に詳しい記載があるが、その調製方法について簡
単にふれると以下の通りである。国立遺伝学研究所（静
岡県三島市）よりE. coli W3110株を入手した。同株を
ストレプトマイシン含有のＬＢプレートにまき、コロニ
ーを形成する株を選択してストレプトマイシン耐性株を
取得した。選択したストレプトマイシン耐性株と、E. c
oli K-12 ME8424株を混合して、完全培地（L-Broth：1
％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％ NaC
l）で３７℃の条件下、１５分間静置培養して接合を誘
導した。E. coli K-12 ME8424株は、（HfrPO45, thi, r
elA1, tyrA::Tn10, ung-1, nadB）の遺伝形質を有し、
国立遺伝学研究所より入手できる。
【０１４３】その後で培養物を、ストレプトマイシン、
テトラサイクリンおよびＬ−チロシンを含有する完全培
地（L-Broth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extrac
t, 0.5％ NaCl, 1.5％ agar）にまき、コロニーを形成
する株を選択した。この株を、E. coli W3110(tyrA)株
と命名した。
【０１４４】ところで、欧州特許公開９２年４８８４２
４号公報には、W3110(tyrA)株にプラスミドを導入して
形成される株が多く記載されている。例えば、プラスミ
ドpHATermを導入して得られる株は、E. coli W3110(tyr
A)/pHATerm株と命名され、工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されており、登録番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３
６５３が付与されている。このE. coli W3110(tyrA)/pH
ATerm株からプラスミドpHATermを脱落させることによっ
てもW3110(tyrA)株を取得することができる。プラスミ
ドの脱落は常法によって行うことができる。
【０１４５】前記のようにして得られたW3110(tyrA)株
に、実施例４で得られたdapA*とlysC *をともに含有する
プラスミドＲＳＦＤ８０を導入し、W3110(tyrA)/RSFD80
を得た。W3110(tyrA)/RSFD80のＬ−リジン生産性につい
て評価を行なった。コントロールとして、W3110(tyrA)
株にＲＳＦＰを常法に従い導入し、W3110(tyrA)/RSFPを
得た。W3110(tyrA)/RSFPについてもＬ−リジン生産性の
評価を行った。コントロールとして、W3110(tyrA)/RSFP
についてもＬ−リジン生産性の評価を行った。
【０１４６】培養は、前記Ｌ−リジン生産培地を用い、
培養時間48時間、温度37℃の条件下、攪拌114〜116rpm
で行った。結果を表７に示す。
【０１４７】
【表７】
【０１４８】
【発明の効果】本発明により、Ｌ−リジンによるフィー
ドバック阻害が十分に解除されたエシェリヒア属細菌由
来のＤＤＰＳ変異遺伝子が得られた。この遺伝子を、Ｌ
−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパ
ルトキナーゼを保持するエシェリヒア属細菌に導入する
ことにより、従来よりもさらに改良されたＬ−リジン生
産菌を得ることができた。このＬ−リジン生産菌を用い
ることによって、従来より優れた発酵法によるＬ−リジ
ンの製造法を提供することができる。
【０１４９】
【配列表】
配列番号：1 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGCAACTAC TGACATGACG 20
【０１５０】配列番号：2 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGTAAGCCAT CAAATCTCCC 20
【０１５１】配列番号：3 配列の長さ：1197 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) 株名：MC1061 配列の特徴： 特徴を表わす記号：prim transcript 存在位置：248 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：272..1150 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：primer bind 存在位置：27..46 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：primer bind 存在位置：1156..1175 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：RBS 存在位置：261..265 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA 60 CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG 120 TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAAAAAAACA 180 TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA 240 TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC 292 Met Phe Thr Gly Ser Ile Val 1 5 GCG ATT GTT ACT CCG ATG GAT GAA AAA GGT AAT GTC TGT CGG GCT AGC 340 Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser 10 15 20 TTG AAA AAA CTG ATT GAT TAT CAT GTC GCC AGC GGT ACT TCG GCG ATC 388 Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile 25 30 35 GTT TCT GTT GGC ACC ACT GGC GAG TCC GCT ACC TTA AAT CAT GAC GAA 436 Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu 40 45 50 55 CAT GCT GAT GTG GTG ATG ATG ACG CTG GAT CTG GCT GAT GGG CGC ATT 484 His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile 60 65 70 CCG GTA ATT GCC GGG ACC GGC GCT AAC GCT ACT GCG GAA GCC ATT AGC 532 Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser 75 80 85 CTG ACG CAG CGC TTC AAT GAC AGT GGT ATC GTC GGC TGC CTG ACG GTA 580 Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly Ile Val Gly Cys Leu Thr Val 90 95 100 ACC CCT TAC TAC AAT CGT CCG TCG CAA GAA GGT TTG TAT CAG CAT TTC 628 Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe 105 110 115 AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTG 676 Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val 120 125 130 135 CCG TCC CGT ACT GGC TGC GAT CTG CTC CCG GAA ACG GTG GGC CGT CTG 724 Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu 140 145 150 GCG AAA GTA AAA AAT ATT ATC GGA ATC AAA GAG GCA ACA GGG AAC TTA 772 Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu 155 160 165 ACG CGT GTA AAC CAG ATC AAA GAG CTG GTT TCA GAT GAT TTT GTT CTG 820 Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu 170 175 180 CTG AGC GGC GAT GAT GCG AGC GCG CTG GAC TTC ATG CAA TTG GGC GGT 868 Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly 185 190 195 CAT GGG GTT ATT TCC GTT ACG ACT AAC GTC GCA GCG CGT GAT ATG GCC 916 His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala 200 205 210 215 CAG ATG TGC AAA CTG GCA GCA GAA GAA CAT TTT GCC GAG GCA CGC GTT 964 Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val 220 225 230 ATT AAT CAG CGT CTG ATG CCA TTA CAC AAC AAA CTA TTT GTC GAA CCC 1012 Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro 235 240 245 AAT CCA ATC CCG GTG AAA TGG GCA TGT AAG GAA CTG GGT CTT GTG GCG 1060 Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala 250 255 260 ACC GAT ACG CTG CGC CTG CCA ATG ACA CCA ATC ACC GAC AGT GGT CGT 1108 Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg 265 270 275 GAG ACG GTC AGA GCG GCG CTT AAG CAT GCC GGT TTG CTG T AAAGTTTAGG 1158 Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu 280 285 290 GAGATTTGAT GGCTTACTCT GTTCAAAAGT CGCGCCTGG 1197
【０１５２】配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20
【０１５３】配列番号：5 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAATTCCTTT GCGAGCAG 18
【０１５４】配列番号：6 配列の長さ：2147 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) 株名：MC1061 配列の特徴： 特徴を表わす記号：-35 signal 存在位置：242..249 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：-10 signal 存在位置：265..273 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：primer bind 存在位置：536..555 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：primer bind 存在位置：2128..2147 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：RBS 存在位置：575..578 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：584..1933 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：terminator 存在位置：1941..1968 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60 AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA 120 AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA 180 AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT 240 CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC 300 CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG 360 AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC 420 TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC 480 ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC 540 CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595 Met Ser Glu Ile 1 GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643 Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met 5 10 15 20 AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691 Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val 25 30 35 GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739 Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala 40 45 50 GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787 Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala Ile Arg 55 60 65 AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835 Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val Ile 70 75 80 CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 883 Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr Val Leu Ala Glu 85 90 95 100 GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931 Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser 105 110 115 CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979 His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu Ile Leu Arg Glu 120 125 130 CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027 Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr 135 140 145 AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075 Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu 150 155 160 CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123 Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val Ile 165 170 175 180 ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171 Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu 185 190 195 GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219 Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu 200 205 210 CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267 His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro Gly Ile Tyr Thr 215 220 225 ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315 Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile Asp Glu Ile Ala 230 235 240 TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363 Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His 245 250 255 260 CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411 Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile Pro Val Phe Val 265 270 275 GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459 Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys 280 285 290 ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 1507 Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gln 295 300 305 ACT CTG CTC ACT TTG CAC AGC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC 1555 Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe 310 315 320 CTC GCG GAA GTT TTC GGC ATC CTC GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC 1603 Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn Ile Ser Val Asp 325 330 335 340 TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC 1651 Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr 345 350 355 GGT TCA ACC TCC ACT GGC GAT ACG TTG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG 1699 Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln Ser Leu Leu Met 360 365 370 GAG CTT TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG 1747 Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu 375 380 385 GTC GCG TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA 1795 Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys 390 395 400 GAG GTA TTC GGC GTA CTG GAA CCG TTC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT 1843 Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg Met Ile Cys Tyr 405 410 415 420 GGC GCA TCC AGC CAT AAC CTG TGC TTC CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC 1891 Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala 425 430 435 GAG CAG GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT 1940 Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu 440 445 ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA 2000 ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT 2060 ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA 2120 TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC 2147
【０１５５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 pdapA1とpdapA2の製造工程を示す図
【図２】 野生型及び変異型ＤＤＰＳのＬ−リジンによ
る阻害を示す図
【図３】 二重変異型dapA*遺伝子を有するプラスミドp
dapAS824の製造工程を示す図
【図４】 pLYSC1とpLYSC2の製造工程を示す図
【図５】 ヒドロキシルアミン処理後の形質転換体の出
現率と変異率を示す図
【図６】 野生型及び変異型ＡＫIIIのＬ−リジンによ
る阻害を示す図
【図７】 プラスミドＲＳＦ２４Ｐの製造工程を示す図
【図８】 プラスミドｐＬＬＣ*８０の製造工程を示す
図
【図９】 プラスミドＲＳＦＤ８０の製造工程を示す図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:185） (72)発明者 佐野 孝之輔 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社中央研究所内

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が
    解除される変異を有するエシェリヒア属細菌由来のジヒ
    ドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡ。
  2. 【請求項２】 Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が
    解除される変異が、配列表の配列番号３に記載されるジ
    ヒドロジピコリン酸合成酵素のアミノ酸配列中、Ｎ−末
    端から８１番目のアラニン残基をバリン残基に置換させ
    る変異、１１８番目のヒスチジン残基をチロシン残基に
    置換させる変異、８１番目のアラニン残基をバリン残基
    に置換させかつ１１８番目のヒスチジン残基をチロシン
    残基に置換させる変異よりなる群から選ばれることを特
    徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 請求項１または２記載のＤＮＡとエシェ
    リヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡと
    を連結してなる組換えＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 請求項１または２記載のＤＮＡが染色体
    ＤＮＡ内に組み込まれて形質転換されたエシェリヒア属
    細菌。
  5. 【請求項５】 請求項３記載の組換えＤＮＡが細胞内に
    導入されることによって形質転換されたエシェリヒア属
    細菌。
  6. 【請求項６】 Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が
    解除されたアスパルトキナーゼを保持することを特徴と
    する請求項４または５記載のエシェリヒア属細菌。
  7. 【請求項７】 請求項３記載の組換えＤＮＡに、Ｌ−リ
    ジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有す
    るエシェリヒア属細菌由来のアスパルトキナーゼIIIを
    コードするＤＮＡが連結されて得られる組換えＤＮＡが
    細胞内に導入されることによって形質転換された請求項
    ５記載のエシェリヒア属細菌。
  8. 【請求項８】 アスパルトキナーゼIIIのＬ−リジンに
    よるフィードバック阻害が解除される変異が、配列表の
    配列番号６に記載されるアスパルトキナーゼIIIのアミ
    ノ酸配列中、Ｎ−末端から３２３番目のグリシン残基を
    アスパラギン酸残基に置換させる変異、３２３番目のグ
    リシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ４０８
    番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる
    変異、３４番目のアルギニン残基をシステイン残基に置
    換させかつ３２３番目のグリシン残基をアスパラギン酸
    残基に置換させる変異、３２５番目のロイシン残基をフ
    ェニルアラニン残基に置換させる変異、３１８番目のメ
    チオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、３
    １８番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換さ
    せかつ３４９番目のバリン残基をメチオニン残基に置換
    させる変異、３４５番目のセリン残基をロイシン残基に
    置換させる変異、３４７番目のバリン残基をメチオニン
    残基に置換させる変異、３５２番目のスレオニン残基を
    イソロイシン残基に置換させる変異、３５２番目のスレ
    オニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ３６９番
    目のセリン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変
    異、１６４番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換
    させる変異、４１７番目のメチオニン残基をイソロイシ
    ン残基に置換させかつ４１９番目のシステイン残基をチ
    ロシン残基に置換させる変異、よりなる群から選ばれる
    ことを特徴とする請求項７記載のエシェリヒア属細菌。
  9. 【請求項９】 請求項４または５において、さらにＬ−
    リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有
    するエシェリヒア属細菌由来のアスパルトキナーゼIII
    をコードするＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれて形質
    転換されたエシェリヒア属細菌。
  10. 【請求項１０】 アスパルトキナーゼIIIのＬ−リジン
    によるフィードバック阻害が解除される変異が、配列表
    の配列番号６に記載されるアスパルトキナーゼIIIのア
    ミノ酸配列中、Ｎ−末端から３２３番目のグリシン残基
    をアスパラギン酸残基に置換させる変異、３２３番目の
    グリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ４０
    ８番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させ
    る変異、３４番目のアルギニン残基をシステイン残基に
    置換させかつ３２３番目のグリシン残基をアスパラギン
    酸残基に置換させる変異、３２５番目のロイシン残基を
    フェニルアラニン残基に置換させる変異、３１８番目の
    メチオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、
    ３１８番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換
    させかつ３４９番目のバリン残基をメチオニン残基に置
    換させる変異、３４５番目のセリン残基をロイシン残基
    に置換させる変異、３４７番目のバリン残基をメチオニ
    ン残基に置換させる変異、３５２番目のスレオニン残基
    をイソロイシン残基に置換させる変異、３５２番目のス
    レオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ３６９
    番目のセリン残基をフェニルアラニン残基に置換させる
    変異、１６４番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置
    換させる変異、４１７番目のメチオニン残基をイソロイ
    シン残基に置換させかつ４１９番目のシステイン残基を
    チロシン残基に置換させる変異、よりなる群から選ばれ
    ることを特徴とする請求項９記載のエシェリヒア属細
    菌。
  11. 【請求項１１】 請求項４または５において、さらにＬ
    −リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を
    有するエシェリヒア属細菌由来のアスパルトキナーゼII
    IをコードするＤＮＡとエシェリヒア属細菌細胞内で自
    律複製可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤ
    ＮＡが細胞内に導入されることによって形質転換された
    エシェリヒア属細菌。
  12. 【請求項１２】 アスパルトキナーゼIIIのＬ−リジン
    によるフィードバック阻害が解除される変異が、配列表
    の配列番号６に記載されるアスパルトキナーゼIIIのア
    ミノ酸配列中、Ｎ−末端から３２３番目のグリシン残基
    をアスパラギン酸残基に置換させる変異、３２３番目の
    グリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ４０
    ８番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させ
    る変異、３４番目のアルギニン残基をシステイン残基に
    置換させかつ３２３番目のグリシン残基をアスパラギン
    酸残基に置換させる変異、３２５番目のロイシン残基を
    フェニルアラニン残基に置換させる変異、３１８番目の
    メチオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、
    ３１８番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換
    させかつ３４９番目のバリン残基をメチオニン残基に置
    換させる変異、３４５番目のセリン残基をロイシン残基
    に置換させる変異、３４７番目のバリン残基をメチオニ
    ン残基に置換させる変異、３５２番目のスレオニン残基
    をイソロイシン残基に置換させる変異、３５２番目のス
    レオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ３６９
    番目のセリン残基をフェニルアラニン残基に置換させる
    変異、１６４番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置
    換させる変異、４１７番目のメチオニン残基をイソロイ
    シン残基に置換させかつ４１９番目のシステイン残基を
    チロシン残基に置換させる変異、よりなる群から選ばれ
    ることを特徴とする請求項１１記載のエシェリヒア属細
    菌
  13. 【請求項１３】 請求項６〜１２のいずれか一項に記載
    のエシェリヒア属細菌を好適な培地で培養し、該培養物
    中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リ
    ジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
JP5308397A 1993-12-08 1993-12-08 発酵法によるｌ−リジンの製造法 Pending JPH07155184A (ja)

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