JP4553052B2 - コク味付与剤 - Google Patents

Description

この出願は、２００５年１１月９日に出願した日本国特許出願（出願番号２００５−３２５３００）、２００６年７月７日に出願した日本国特許出願（出願番号２００６−１８８４５８）、２００５年１１月２２日に出願した米国特許仮出願（仮出願番号６０／７３８５６２）、及び２００６年７月２０日に出願した米国特許仮出願（仮出願番号６０／８０７８３１）に基づく優先権を主張するものとしてここに記載する。
本発明は、コク味付与物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって得られるコク味付与物質を有効成分として含有するコク味付与剤、コク味が付与された食品、調味料、飲料等の飲食品の製造方法及びコク味が付与された飲食品に関する。

カルシウム受容体は、カルシウムセンシング受容体（Calcium Sensing Receptor：CaSR）とも呼ばれ、７回膜貫通型受容体（Ｇ蛋白質結合型受容体；GPCR）のクラスＣに分類されるアミノ酸１０７８個からなる受容体である。このカルシウム受容体は、１９９３年に遺伝子のクロ−ニングが報告され（非特許文献１）、カルシウム等で活性化されると細胞内カルシウム上昇等を介して様々な細胞応答を引き起こすことが知られている。ヒトカルシウム受容体の遺伝子配列はGenBank Accession No NM_000388として登録されており、動物間でよく保存されている。

上記カルシウム受容体は、生体内機能に促進的にはたらく場合もあれば、抑制的にはたらく場合もある。このため、現在、神経疾患、肝臓疾患、循環器疾患、消化器疾患、その他の疾患において、カルシウム受容体に対する活性化剤作用の治療薬と抑制剤作用の治療薬が病態に応じて使い分けられている。例えば、カルシウム受容体は、副甲状腺において血中カルシウム濃度の上昇を感知し、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の分泌を抑制し、血中カルシウム濃度を是正する働きを有する。従って、カルシウム受容体活性化剤は血中カルシウム濃度を低下させる効果が期待される。実際に、カルシウム受容体活性化剤を血液透析患者の続発性副甲状腺機能亢進症の治療に用いたとき、カルシウム濃度やリン濃度は上昇させずにPTH濃度を低下させることが明らかになっている。

カルシウム受容体の機能解析は、主としてカルシウムホメオスタシスに関して行われてきたため、今日までの応用研究もカルシウム調節が関わる骨代謝性疾患が中心であった。しかし、遺伝子発現解析などの結果から、カルシウム受容体が副甲状腺や腎臓以外の生体内に広く分布していることが明らかになり（非特許文献２、３）、様々な生体機能、疾患病因に関わっている可能性が提起された。例えば、カルシウム受容体が、肝臓、心臓、肺、消化管、リンパ球、膵臓、の機能に関わることが推測されている。本発明者もラットの各組織から抽出したＲＮＡを材料とした、ＲＴ−ＰＣＲによる解析から、生体内において広範囲の組織に発現していることを確認した。上記観点から、現在、カルシウム受容体の活性化剤や阻害剤の応用価値が急速に高まっている。

また、カルシウム受容体活性化剤としてはカルシウムの他に、ガドリニウムなどのカチオン、ポリアルギニンなどの塩基性ペプチド、スペルミンなどのポリアミン、フェニルアラニンなどのアミノ酸、などが報告されている（非特許文献４）。
これまでカルシウム受容体活性化剤として、上記の如く多くの特異的活性化剤が開発されているが、生体内に存在する化合物は少なく、また、生体内に存在する化合物である場合はその活性が極めて低かった。そのため、これらの活性化剤を含有してなる各種疾患に対する治療薬は、副作用、透過性及び活性の点で大きな問題があった。例えば、カルシウム受容体にアミノ酸が作用することが知られているが、活性が極めて弱いので活性化剤と
して具体的な応用は困難と考えられていた。また、上述の如くポリアルギニンのような巨大分子が活性化剤として報告されているが、不定構造である多荷カチオンとしての作用によるものと推測されている。すなわち、特定の構造を持ったペプチドがカルシウム受容体活性化剤として有用であることは知られていない。

一方、食品領域では呈味物質が古くから応用されてきた。特に、甘味、塩味、酸味、苦味、うま味で表される５基本味を有する物質やこれらを増強する物質が調味料として広く利用されている。上記以外では表せない味覚として「コク味」がある。コク味とは、前記５基本味では表せない味を意味し、基本味だけではなく、厚み・ひろがり・持続性・まとまりなど基本味の周辺の味をも増強した味をいう。従来、コク味を付与するための方法はいくつか報告されており、グルタチオン（特許文献１）、ゼラチン及びトロポミオシンの加熱物（特許文献２）、スルホン基含有化合物（特許文献３）、Ａｓｎ−Ｈｉｓ配列を含有するペプチド（特許文献４）などが報告されている。

このように、各種コク味付与物質の開発が試みられ、天然物の抽出物を中心に商品化がなされてきたが、天然物抽出物からコク味成分を純粋に分離した例はグルタチオンやＮ−（４−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｏｘｏ−１−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎ−２−ｙｌ）ｓａｒｃｏｓｉｎｅなど極めて少ないのが現状である。
従って、今後、高性能で、安全かつ安価なコク味付与物質の開発が望まれ、そのために、簡便かつ高感度のコク味付与物質スクリ−ニング法が必要とされている。
Nature. 1993 Dec 9;366(6455):575-80. J Endocrinol. 2000 May;165(2):173-7. Eur J Pharmacol. 2002 Jul 5;447(2-3):271-8. Cell Calcium. 2004 Mar;35(3):209-16. 特許第１４６４９２８号公報 特開平１０−２７６７０９号公報 特開平８−２８９７６０号公報 ＷＯ２００４／０９６８３６号公報

本発明は、コク味付与物質の簡便かつ高感度なスクリ−ニング法、高性能で、安全かつ安価なコク味付与剤、コク味が付与された食品、調味料、飲料等の飲食品の製造方法及びコク味が付与された飲食品を提供することを課題とする。

本発明者は、カルシウム受容体の活性化剤を探索した結果、グルタチオンを含む低分子ペプチドにカルシウム受容体を活性化する働きがあることを見出した。また、グルタチオンはコク味付与物質として知られていることから、カルシウム受容体の活性化剤である低分子ペプチドがコク味を呈するか否かを評価した結果、該低分子ペプチドがコク味を呈することを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。

（１） カルシウム受容体活性を指標とすることを特徴とする、コク味付与物質のスクリ−ニング方法。

（２） コク味付与物質が、塩味、うま味、甘味または酸味の少なくとも一種を増強するものである、（１）に記載のスクリーニング方法。

（３） カルシウム受容体と被検物質とを反応させ、カルシウム受容体活性を検出する第
１工程と、第１工程でカルシウム受容体刺激活性が検出された被検物質のコク味付与効果を測定する第２工程とを含有する、（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法。

（４） （１）〜（３）のいずれかに記載の方法により得られうるコク味付与物質を有効成分として含む、コク味付与剤。

（５） コク味付与物質が、γ-Glu-X-Gly （XはCysを除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y (Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す)、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH₂、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys（S-Me）（O）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me）、から選択される１種または２種以上である、（４）に記載のコク味付与剤。

（６） 前記XがCys(SNO)、Cys(S-allyl)、Gly、Cys(S-Me)、AbuまたはSerであり、前記YがGly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、CysまたはGlnである、（５）に記載のコク味付与剤。

（７） コク味付与剤が、塩味、うま味、甘味または酸味のいずれかを増強するものである、（４）〜（６）のいずれか一に記載のコク味付与剤。

（８） （４）〜（７）のいずれか一に記載のコク味付与剤から選択される、１種または２種以上、および、カルシウム受容体刺激活性を有する他の化合物から選択される１種または２種以上を含有する食品組成物。

（９） カルシウム受容体刺激活性を有する他の化合物がカルシウム、プロタミン、ポリアルギニン、スペルミン、ポリリジン、グルタチオンおよびシナカルセットである、（８）に記載の食品組成物。

（１０） （４）〜（７）のいずれか一に記載のコク味付与剤から選択される、１種または２種以上を、飲食品に対して１質量ｐｐｂ〜９９．９質量％含有させるように添加することを特徴とする、コク味が付与された飲食品の製造方法。

（１１） （４）〜（７）のいずれか一に記載のコク味付与剤から選択される１種または２種以上を、１質量ｐｐｂ〜９９．９質量％含有してなる調味料を、飲食品に対して０．０１〜１０質量％含有させるように添加することを特徴とする、コク味が付与された飲食品の製造方法。

（１２） （１０）又は（１１）に記載の方法により得られうる、コク味が付与された飲食品。

（１３） γ-Glu-Val-Glyを１質量ｐｐｂ〜９９．９質量％と、カルシウム、プロタミン、ポリアルギニン、スペルミン、ポリリジン、グルタチオンおよびシナカルセットから選ばれる１種または２種類以上を１質量ｐｐｂ〜９９．９質量％とを含んでなる組成物。

（１４） グルタチオン、プロタミン、ポリリジン、GABA及びそれらの塩から選択される1種または2種以上を１質量ppb〜99.9質量％と、カルシウムまたはその塩を１質量ｐｐｂ〜９９．９質量％とを含んでなる組成物。
（１５） 下記式を有する化合物。
γ-Glu-X-Gly （XはAsn, Gln, His, Lys, OrnまたはArgを表す）、又はγ-Glu-Val-Y (
YはLeu, Ile, Ser, Thr, Met, Cys, Asp, Asn, Gln, Lys, Orn, Arg, Phe, Tyr, Pro, Hyp, Trp, HisまたはAbuを表す)
（１６） （１）〜（３）のいずれかに記載の方法により得られうるコク味付与物質のコク味付与剤としての使用。
（１７） （１）〜（３）のいずれかに記載の方法により得られうるコク味付与物質を飲食品に添加することを含む、飲食品にコク味を付与する方法。

本発明により、コク味付与物質の簡便かつ高感度なスクリーニング法、当該スクリーニング法により得られうる、高性能で、安全かつ安価なコク味付与剤、コク味が付与された食品、調味料、飲料等の飲食品の製造方法及びコク味が付与された飲食品が提供される。

以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書中において「カルシウム受容体」とは、カルシウムセンシング受容体もしくはCalcium Sensing Receptor（ＣａＳＲ）と呼ばれる、７回膜貫通型受容体のクラスＣに属するものを指す。本明細書中において「カルシウム受容体活性」とは、上記カルシウム受容体に結合し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化して、シグナルを伝達することを意味する。また、本明細書中において「カルシウム受容体活性化剤」とは、上記カルシウム受容体に作用し、カルシウム受容体を活性化し、カルシウム受容体を発現している細胞の機能を調節するものをいう。
本明細書中において、「コク味」とは、甘味、塩味、酸味、苦味、うま味で表される５基本味では表せない味を意味し、基本味だけではなく、厚み・ひろがり・持続性・まとまりなど基本味の周辺の味をも増強した味をいう。また、「コク味付与剤又はコク味付与物質」とは、甘味、塩味、酸味、苦味、うま味で表される５基本味の増強と、それに伴う厚み・ひろがり・持続性・まとまりなど基本味の周辺の味を付与することができる剤又は物質をいう。従って、本発明のコク味付与剤は、甘味増強剤、塩味増強剤、酸味増強剤、苦味増強剤、うま味増強剤としても使用することができる。なお、コク味の強さとしての、先中味とは喫食後０から４秒までに感じる呈味であり、後味とは喫食後５秒以降に感じる呈味のことを示す。
本明細書中において各アミノ酸及び各ペプチドを構成するアミノ酸は、特に断わらない限りいずれもＬ−体である。

＜１＞コク味付与物質のスクリ−ニング方法
本発明のコク味付与物質のスクリ−ニング方法（以下、本発明のスクリ−ニング方法ともいう）は、カルシウム受容体活性を指標とすることを特徴とする。具体的には、本発明のスクリ−ニング方法は、カルシウム受容体と被検物質とを反応させ、カルシウム受容体活性を検出する第１工程と、第１工程でカルシウム受容体刺激活性が検出された被検物質のコク味付与効果を測定する第２工程とを含有する。

以下に本発明のスクリ−ニング方法を例示するが、これらのステップに限定されるものではない。
１）カルシウム受容体活性を測定するためのカルシウム受容体活性測定系に被検物質を添加して、カルシウム受容体活性を測定する。
２）被験物質を添加したときのカルシウム受容体活性と、被験物質を添加しなかったときのカルシウム受容体活性を比較する。
３）被験物質を添加したときに高いカルシウム受容体刺激活性を示す被験物質を選択する。
４）選択された被験物質のコク味付与効果を測定し、コク味付与効果を有する被験物質を選択する。

カルシウム受容体活性の測定は、例えば、カルシウム受容体を発現する細胞を用いた測定系を用いて行われる。上記細胞はカルシウム受容体を内在的に発現している細胞であっても、外来のカルシウム受容体遺伝子が導入された組み換え細胞であってもよい。上記カルシウム受容体活性測定系は上記カルシウム受容体を発現する細胞に、カルシウム受容体に特異的な細胞外リガンド（活性化剤）を加えたときに、活性化剤とカルシウム受容体との結合（反応）を検出することができるか、又は、活性化剤とカルシウム受容体との結合（反応）に応答して細胞内に検出可能なシグナルを伝達するものであれば、特に制限なく使用することができる。被検物質との反応によりカルシウム受容体活性が検出された場合、当該被検物質はカルシウム受容体刺激活性を有し、コク味付与物質であることが判別される。
一方、上記コク味付与効果は、ヒトによる味覚試験などの方法によって確認することができる。また、スクリ−ニングに用いる被験物質としては、特に制限はなく、低分子化合物、糖類、ペプチド、タンパク質などを用いることができる。

上記カルシウム受容体としては、GenBank Accession No NM_{_}000388で登録されているヒトカルシウム受容体遺伝子によってコードされるヒトカルシウム受容体が好ましく例示できる。尚、カルシウム受容体は、上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、カルシウム受容体機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。なお、カルシウム受容体機能はこれらの遺伝子を細胞に発現させ、カルシウム添加時の電流の変化や細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定することによって調べることができる。

上記カルシウム受容体は、その由来は特に制限されず、上記ヒトのカルシウム受容体のみならず、マウス、ラット、イヌなど含めた動物由来のカルシウム受容体が挙げられる。

上述の如く、カルシウム受容体活性は、カルシウム受容体又はその断片を発現した生きた細胞、カルシウム受容体又はその断片を発現した細胞膜、カルシウム受容体又はその断片のタンパク質を含むインビトロの系などを利用して確認することが出来る。
以下に生きた細胞を用いた一例を示すが、この一例に限定されるものではない。
カルシウム受容体は、アフリカツメガエル卵母細胞やハムスタ−卵巣細胞やヒト胎児腎臓細胞等の培養細胞に発現させる。これは外来遺伝子を保持するプラスミドにカルシウム受容体遺伝子をクロ−ニングしたものを、プラスミドの状態もしくはそれを鋳型にしたｃＲＮＡを導入することで可能となる。反応の検出には電気生理学的手法や細胞内カルシウム上昇の蛍光指示試薬を用いることができる。
カルシウム受容体の発現は、初めにカルシウムもしくは特異的活性化剤による応答で確認する。５ｍＭ程度の濃度のカルシウムに対して、細胞内電流が見られた卵母細胞もしくは蛍光指示試薬の蛍光が見られた培養細胞を使用する。カルシウムの濃度を変えて濃度依存性を測定する。次に、ペプチド等の被験物質を１μＭ〜１ｍＭ程度に調製し、卵母細胞もしくは培養細胞に添加することで、上記ペプチド等の被験物質のカルシウム受容体活性を測定する。

＜２＞コク味付与剤
本発明のコク味付与剤は、本発明のスクリ−ニング方法により得られうるコク味付与物質を有効成分として含有する。例えば、本発明のコク味付与剤は、γ-Glu-X-Gly （XはCysを除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y (Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す)、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Gl
u-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH₂、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys（S-Me）（O）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me）、（以下、本発明に用いられるペプチド及びアミノ酸ともいう）から選択される１種または２種以上を有効成分として含有する。これらのペプチド及びアミノ酸は、前述したスクリーニング方法によっても得られうる。ここに、アミノ酸とは、Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Asn, Gln, Pro, Hypなどの中性アミノ酸、Asp, Gluなどの酸性アミノ酸、Lys, Arg, Hisなどの塩基性アミノ酸、Phe, Tyr, Trpなどの芳香族アミノ酸や、ホモセリン、シトルリン、オルニチン、α-アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、タウリンなども含有する。
本明細書においてアミノ基残基の略号は以下のアミノ酸を意味する。
（１）Ｇｌｙ：グリシン
（２）Ａｌａ：アラニン
（３）Ｖａｌ：バリン
（４）Ｌｅｕ：ロイシン
（５）Ｉｌｅ：イソロイシン
（６）Ｍｅｔ：メチオニン
（７）Ｐｈｅ：フェニルアラニン
（８）Ｔｙｒ：チロシン
（９）Ｔｒｐ：トリプトファン
（１０）Ｈｉｓ：ヒスチジン
（１１）Ｌｙｓ：リジン
（１２）Ａｒｇ：アルギニン
（１３）Ｓｅｒ：セリン
（１４）Ｔｈｒ：トレオニン
（１５）Ａｓｐ：アスパラギン酸
（１６）Ｇｌｕ：グルタミン酸
（１７）Ａｓｎ：アスパラギン
（１８）Ｇｌｎ：グルタミン
（１９）Ｃｙｓ：システイン
（２０）Ｐｒｏ：プロリン
（２１）Ｏｒｎ：オルニチン
（２２）Ｓａｒ：サルコシン
（２３）Ｃｉｔ：シトルリン
（２４）Ｎ−Ｖａｌ：ノルバリン
（２５）Ｎ−Ｌｅｕ：ノルロイシン
（２６）Ａｂｕ：α−アミノ酪酸
（２７）Ｔａｕ：タウリン
（２８）Ｈｙｐ：ヒドロキシプロリン
（２９）ｔ−Ｌｅｕ：ｔｅｒｔ−ロイシン
また、アミノ酸誘導体とは、上記アミノ酸の各種誘導体であって、例えば、特殊アミノ酸や非天然アミノ酸、アミノアルコール、或いは末端カルボニル基やアミノ基、システインのチオール基などのアミノ酸側鎖が各種置換基により置換したものが挙げられる。置換基としては、アルキル基、アシル基、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、スルフォニル基や各種保護基などが挙げられ、例えば、Ａｒｇ（ＮＯ₂）：Ｎ−γ−ニトロアルギニン、Ｃｙｓ（ＳＮＯ）：Ｓ−ニトロシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）：Ｓ−メチルシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ−ａｌｌｙｌ）：Ｓ−アリルシステイン、Ｖａｌ−ＮＨ₂：バリンアミド、Ｖａｌ−ｏｌ：バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）などが含まれる。

尚、本明細書において、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＳＮＯ）−Ｇｌｙは下記の構造式を有するものであり、上記γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）およびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）式中の（Ｏ）はスルフォキシド構造であることを意味する。γ-Gluの(γ)とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシ基を介して他のアミノ酸が結合していることを意味する。

γ-Glu-X-Gly （XはCysを除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y (Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す)、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH₂、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys（S-Me）（O）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me）はコク味を付与する。従って、γ-Glu-X-Gly （XはCysを除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y (Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す)、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH₂、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys（S-Me）（O）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me）（以下、本発明に用いられるペプチド又はアミノ酸ともいう）はコク味付与剤として用いることができる。本発明に用いられるペプチド又はアミノ酸は単独で用いてもよく、また任意の２種又は３種以上を混合して用いることもできる。これらの中でも、γ-Glu-X-Gly （X はCys(SNO)、Cys(S-allyl)、Gly、Cys(S-Me)、AbuまたはSerである）、又はγ-Glu-Val-Y (YはGly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、 Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、CysまたはGlnである)の構造式を有する化合物が好ましい。
なお、これらのうち、γ-Glu-X-Gly （XはAsn, Gln, His, Lys, OrnまたはArgである）、及びγ-Glu-Val-Y (YはLeu, Ile, Ser, Thr, Met, Cys, Asp, Asn, Gln, Lys, Orn, Arg, Phe, Tyr, Pro, Hyp, Trp, HisまたはAbuである)については、本発明者らによって新たに合成された新規物質であって、本発明はこれらについての化合物の発明をも包含する。これら化合物のうち、中でも好ましい化合物は、γ-Glu-X-Gly （XはAsn, Gln, His, Lys, OrnまたはArgである）、及びγ-Glu-Val-Y (YはSer, Thr, Met, Cys, Asp, Asn, Gln, Lys, Orn, Arg, Pro または Hisである)である。
公知の呈味ペプチドは、約0.2%（MSGの閾値はその1/10）が閾値濃度（呈味を感知できる最低濃度）であって実用性に乏しかったが（J. Agr. Food Chem., vol.23, No.1, 49-53 (1975))、本発明の化合物は、0.0001%〜0.1%程度の極めて低濃度から実用的なコク味増強活性を示し、非常に活性が高い極めて有用な化合物である。
上記本発明に用いられるペプチド又はアミノ酸は、市販されているものであれば、市販品を用いることが可能である。また、ペプチドは、（１）化学的に合成する方法、又は（２）酵素的な反応により合成する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。本発明において用いられるペプチドは、含まれるアミノ酸の残基数が２〜３残基と比較的短いので、化学的に合成する方法が簡便である。化学的に合成する場合は、該オリゴペプチドをペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。化学的に合成する方法としては、例えばペプチド固相合成法が挙げられる。そのようにして合成したペプチドは通常の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。このようなペプチド固相合成法、およびそれに続くペプチド精製はこの技術分野においてよく知られたものである。

また、本発明において用いられるペプチドを、酵素的な反応により生産することも出来る。例えば、国際公開パンフレットＷＯ２００４／０１１６５３号に記載の方法を用いることが出来る。即ち、一方のアミノ酸又はジペプチドのカルボキシル末端をエステル化又はアミド化したアミノ酸又はジペプチドと、アミノ基がフリーの状態であるアミノ酸（例えばカルボキシル基が保護されたアミノ酸）とを、ペプチド生成酵素の存在下において反応せしめ、生成したジペプチド又はトリペプチドを精製することによっても生産することもできる。ペプチド生成酵素としては、ペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、又は、該微生物の菌体処理物、又は、該微生物に由来するペプチド生成酵素が挙げられる。

本発明において用いられるペプチド及びアミノ酸は塩の形態をも包含する。本発明のペプチド及びアミノ酸が塩の形態を成し得る場合、その塩は薬理学的に許容されるものであればよく、例えば、式中のカルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。式中に塩基性基が存在する場合の塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸などの無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。

本発明のスクリ−ニング方法により得られるコク味付与物質、並びに本発明に用いられるペプチド及びアミノ酸から選ばれる１種または２種以上を有効成分として含有するコク味付与剤の使用方法としては、特に制限されず、調味料、食品、飲料等の飲食品に添加して用いることができる。
本発明のスクリ−ニング方法により得られるコク味付与物質は、単独で、又はその他の各種添加物等と組み合わせて、調味料、食品、飲料等の飲食品に添加して用いることができる。

また、本発明のコク味付与剤は、例えば、上記本発明に用いられるペプチド及びアミノ酸から選ばれる１種または２種以上のみで構成されていても良く、さらにその他、コク味付与活性を有する既存の化合物 (グルタチオンやアリイン等)や各種添加物等を任意に添加され構成されることも可能である。この際、カルシウム受容体刺激活性を有する既存の化合物を1種または２種以上を添加してもよく、本発明はかかる組成物をも包含する。
カルシウム受容体活性を有する既存の化合物としては、カルシウム、カドリニウムなど
のカチオン、ポリアルギニン、ポリリジンなどの塩基性ペプチド、プトレッシン、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミン、プロタミンなどのタンパク質、フェニルアラニン、グルタチオンなどのペプチド、シナカルセットなどが挙げられる。これらの化合物も許容される塩の形態をとっても良い。なお、グルタチオンがカルシウム受容体刺激活性を有することは本発明者らにより発見された。
また、本発明者らは、本発明のコク味付与剤に加えて、グルタチオンなどの既存のコク味付与活性を有する化合物についても、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物との併用により、コク味付与活性が向上されることをも見出した。即ち、本発明は、グルタチオンなどの既知のコク味付与活性を有する化合物とカルシウム受容体刺激活性を有する化合物とを含有する組成物をも包含する。

上記添加物としては、調味料、食品、飲料等の飲食品に添加配合できることが知られているものであれば特に限定されることはなく用いることができる。そのような添加物としては、例えば、香料、糖類、甘味料、食物繊維類、ビタミン類、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）などのアミノ酸類、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）などの核酸類、塩化ナトリウムなどの無機塩類、水などが挙げられる。

本発明のスクリ−ニング方法により得られるコク味付与物質、又は本発明のコク味付与剤の飲食品に対する使用量は、コク味の付与に有効な量であればよく、用途に応じて適宜調節されるが、例えば、調味料、食品又は飲料の場合、本発明のコク味付与剤、又はコク味付与物質の合計量として調味料、食品又は飲料中に１質量ｐｐｂ〜９９．９質量％であり、好ましくは１０質量ｐｐｂ〜９９．９質量％、より好ましくは１０質量ｐｐｍ〜１０質量％程度である。
従って、本発明のスクリ−ニング方法により得られるコク味付与物質又は本発明のコク味付与剤の１種または２種以上を、飲食品に対して１質量ｐｐｂ〜９９．９質量％、好ましくは１０質量ｐｐｂ〜９９．９質量％、より好ましくは１０質量ｐｐｍ〜１０質量％程度含有させるように添加することで、コク味が付与された飲食品を製造することができる。

また、本発明のスクリ−ニング方法により得られるコク味付与物質又は本発明のコク味付与剤の１種または２種以上を１質量ｐｐｂ〜９９．９質量％含有してなる上記コク味が付与された調味料を、飲食品に対して０．０１〜１０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％含有させるように添加することでも、コク味が付与された飲食品を製造することができる。

本発明のスクリ−ニング方法により得られるコク味付与物質又は本発明のコク味付与剤を、飲食品に添加する際の形態としては、乾燥粉末、ペースト、溶液などの物性に制限はない。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

＜遺伝子（ｃＲＮＡ）の調製＞
カルシウム受容体の遺伝子の調製は以下のように行った。ＮＣＢＩに登録されたＤＮＡ配列（カルシウム受容体：NM_000388）を元に、ＰＣＲに使う合成オリゴＤＮＡ（フォワードプライマー（Ｎ）、及びリバースプライマー（Ｃ））を設計した（表１）（配列番号１及び２）。

ヒト腎臓由来のｃＤＮＡ（Clontech社製）を材料として、表１（hCASR_N：配列番号１及びhCASR_C：配列番号２）に示すプライマーを合成し、Pfu ultra DNA Polymerase（Stratagene社製）を用い、以下の条件でＰＣＲを実施した。９４℃で３分の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分を３５回繰り返した後、７２℃で７分の反応をした。ＰＣＲによって増幅がなされたかをアガロ−ス電気泳動法を行い、ＤＮＡ染色試薬で染色した後、紫外線照射によって検出した。同時に電気泳動したサイズ既知のＤＮＡマ−カ−と比較することで、ＰＣＲ産物の鎖長を確認した。プラスミドベクタ−ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＶ（Takara社製）によって切断した。その切断部位にＰＣＲによって増幅された遺伝子断片をLigation Kit（Promega社製）を用いて連結した。この反応溶液でエシェリヒア・コリＤＨ５α株を形質転換し、ＰＣＲ増幅産物がクロ−ニングされたプラスミドを保持する形質転換体を選抜した。ＰＣＲ増幅産物をＤＮＡ塩基配列解析によって確認した。この組換えプラスミドを鋳型とし、ｃＲＮＡ作製キット（Ambion社）を用いてカルシウム受容体遺伝子のｃＲＮＡを作製した。

＜各種試料の調製＞
Ｌ型アミノ酸試料として、各々特級グレ−ドのアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン（上記、味の素株式会社）、ヒドロキシプロリン（ナカライテスク株式会社）の２３種類を用いた。Ｄ−ＣｙｓおよびＤ−Ｔｒｐ（ナカライテスク株式会社）及び塩化カルシウムは特級グレ−ドのものを用いた。また、ペプチド試料として、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＳＮＯ）−Ｇｌｙ（株式会社同仁化学研究所）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ（Ａｂｕ：α−アミノ酪酸、Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（国産化学株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（国産化学株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ（国産化学株式会社）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ（受託合成品）、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（受託合成品）、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ（受託合成品）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（受託合成品）、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（受託合成品）、Ｌｅｕ−Ａｓｐ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ（受託合成品）、
γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（受託合成品）、
γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｏｒｎ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（受託合成品）を用いた。グルタミン、システインは用事調製し、他の試料は調製後、−２０℃に保存した。ペプチドは純度９０％以上のものを用いた。γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓのみ純度８０％以上のものを用いた。各試料を溶解した後、ｐＨが酸性、アルカリ性のものについては、ＮａＯＨ、ＨＣｌを用いて中性前後に調整した。アミノ酸、ペプチドの溶解液、アフリカツメガエル卵母細胞の調製用の溶液、卵母細胞の培養用の溶液は、以下の組成のものを使用した。ＮａＣｌ ９６ｍＭ ／ ＫＣｌ ２ｍＭ ／ ＭｇＣｌ₂ １ｍＭ
／ ＣａＣｌ₂ １．８ｍＭ ／ Ｈｅｐｅｓ ５ｍＭ ／ ｐＨ＝７．２。

＜γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの合成＞
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（８．６９ ｇ， ４０．０ ｍｍｏｌ）とＧｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ（８．０７ ｇ， ４０．０ ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１００ ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（６．１３ ｍｌ， ４４．０ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ， ６．７４ ｇ， ４４．０ ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， ８．４４ ｇ， ４４．０ ｍｍｏｌ）を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル（２００ ｍｌ）に溶解した。溶液を水（５０ ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（５０ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンから再結晶してＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（１３．２ ｇ， ３６．２ ｍｍｏｌ）を白色結晶として得た。
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（５．４７ ｇ， １５．０ ｍｍｏｌ）を４Ｎ−ＨＣｌ／ジオキサン溶液（４０ ｍｌ）に加え、室温で５０分撹拌した。ジオキサンを減圧濃縮で除き、残渣にｎ−ヘキサン（３０ ｍｌ）を加え減圧濃縮した。この操作を３回繰り返し、Ｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌを定量的に得た。
上記Ｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ及びＺ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（５．５７ ｇ， １５．０ ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５０ ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（２．３０ ｍｌ， １６．５ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ， ２．５３ ｇ， １６．５ ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， ３．１６ ｇ， １６．５
ｍｍｏｌ）を溶液に加え、室温で二夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を加熱した酢酸エチル（１５００ ｍｌ）に溶解した。溶液を水（２００ ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（２００ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（１５０ ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（２００ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（１５０ ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。析出した結晶を濾取、減圧乾燥してＺ−Ｇｌｕ（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（６．５１ ｇ，１０．５ ｍｍｏｌ）を白色結晶として得た。
上記Ｚ−Ｇｌｕ（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（６．２０ ｇ， １０．０３ ｍｍｏｌ）をエタノール（２００ ｍｌ）に懸濁し、１０％パラジウム炭素（１．５０ ｇ）を加え、水素雰囲気下に５５℃で５時間還元反応を行った。この間、全量で１００ ｍｌの水を徐々に加えた。触媒を桐山ロートで濾過して除き、濾液を半分に減圧濃縮した。反応液を更にメンブランフィルターで濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣を少量の水に溶かした後にエタノールを加えて結晶を析出させ、結晶を濾過して集め減圧乾燥して
γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの白色粉末（２．８５ ｇ， ９．４０ ｍｍｏｌ）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３０４．１．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．８７ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．８ Ｈｚ）， ０．８８ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．８ Ｈｚ）， １．９９−２．０９ （３Ｈ， ｍ）， ２．３８−２．５１ （２Ｈ， ｍ）， ３．７２ （１Ｈ，
ｔ， Ｊ＝６．３５ Ｈｚ）， ３．８６ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１７．８ Ｈｚ），
３．８０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１７．８ Ｈｚ）， ４．０７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．８ Ｈｚ）．

＜γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）−Ｇｌｙの合成［Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）：Ｓ−メチルシステイン］＞
還元型グルタチオン（１５．０ ｇ， ４８．８ ｍｍｏｌ）を水（４５ ｍｌ）に加え、窒素を吹き込みながら水酸化ナトリウム（４．５２ ｇ， ２．２当量， １０７ ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。ヨウ化メチル（４．５６ ｍｌ， １．５当量， ７３ ｍｍｏｌ）を加え、密栓して室温で２時間撹拌した。濃塩酸で反応液のｐＨを２〜３に調整し、エタノール（１５０ ｍｌ）を加え冷蔵庫に一夜保存した。油状物が分離したので、上澄みを除いた。残った油状物を水に溶かしエタノールを徐々に加えると、一部結晶を伴う油状物が析出したので再度上澄みを除いた。残渣を水（３００ ｍｌ）に溶解し、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ １−ａｃｅｔａｔｅ， ４００ ｍｌ）を充填したカラムに吸着させ、水洗した後に１Ｎ−酢酸水溶液で溶出した。溶出液を減圧濃縮し、水−エタノールから再沈殿させ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）−Ｇｌｙの白色粉末（５．０８ ｇ， １５．８ ｍｍｏｌ）を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３２２．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：２．１４ （３Ｈ， ｓ）， ２．１５−２．２２ （２Ｈ， ｍ）， ２．５０−２．５８ （２Ｈ， ｍ）， ２．８６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝９．０ Ｈｚ， Ｊ＝１４．０ Ｈｚ）， ３．０３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝５．０ Ｈｚ， Ｊ＝１４．０ Ｈｚ）， ３．８４ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝６．５ Ｈｚ）， ３．９９ （２Ｈ， ｓ）， ４．５９ （１Ｈ， ｄｄ，
Ｊ＝５．０ Ｈｚ， Ｊ＝９．０ Ｈｚ）．

＜その他ペプチドの合成＞
γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ₂、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ｏｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−ｔ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−ａｌｌｙｌ）−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）は実施例３および実施例４に準じて合成した。

＜カルシウム受容体の活性化作用の評価＞
カルシウム受容体の活性化作用の評価には、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いたＣａ濃度イオン依存性Ｃｌイオン電流測定法を用いた。カルシウム受容体を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞に、各活性化剤を添加すると、細胞内のＣａイオンが増加する。次にＣａ濃度イオン依存性Ｃｌチャネルが開き、イオン電流として細胞内電流値が変化する。この細胞内電流値の変化を測定することで、カルシウム受容体の活性化作用の有無を知り得ることができる。

具体的には、アフリカツメガエル腹部を切開し、卵塊を取り出した後、１％コラゲナ−ゼ溶液により２０℃で２時間処理することで個々の卵母細胞を得た。１個あたりの卵母細
胞に、マイクロガラスキャピラリ−を用いて５０ｎｌの１μｇ／μｌ受容体ｃＲＮＡもしくは５０ｎｌの滅菌水を導入し、１８℃で２〜３日培養した。培養時には、実施例２で示した溶液に２ｍＭピルビン酸と１０Ｕ／ｍｌペニシリンと１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたものを使用した。培養後、ｃＲＮＡを注入した卵母細胞もしくは滅菌水を注入した卵母細胞に対し、試験溶液を添加した。電気生理学的測定は、増幅器Ｇｅｎｅｃｌａｍｐ５００（Ａｘｏｎ社製）および記録用ソフトＡｘｏＳｃｏｐｅ９．０（Ａｘｏｎ社製）を用いて行った。卵母細胞を２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌイオンを介した細胞内電流を測定した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。

＜カルシウム受容体に対するカルシウムの活性化作用の評価＞
実施例６に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するカルシウムの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、カルシウム（２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図１に示した。この結果より、卵母細胞に注入したカルシウム受容体のｃＲＮＡが機能的に発現していることが確認された。また、水を注入した卵母細胞は、高い濃度のカルシウムにも反応していないことから、卵母細胞自身にはカルシウム受容体が発現していないことが確認された。

＜カルシウム受容体に対するＬ型アミノ酸の活性化作用の評価＞
実施例６に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するＬ型アミノ酸の活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、アラニン（１０ｍＭ）、アルギニン（１０ｍＭ）、アスパラギン（１０ｍＭ）、アスパラギン酸（１０ｍＭ）、システイン（１０ｍＭ）、グルタミン（１０ｍＭ）、グルタミン酸（１０ｍＭ）、グリシン（１０ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ）、イソロイシン（１０ｍＭ）、ロイシン（１０ｍＭ）、リジン（１０ｍＭ）、メチオニン（１０ｍＭ）、フェニルアラニン（１０ｍＭ）、プロリン（１０ｍＭ）、セリン（１０ｍＭ）、トレオニン（１０ｍＭ）、トリプトファン（１０ｍＭ）、チロシン（１０ｍＭ）、バリン（１０ｍＭ）、オルニチン（１０ｍＭ）、タウリン（１０ｍＭ）、又はヒドロキシプロリン（１０ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図２に示した。この結果より、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンがカルシウム受容体に対する明瞭な活性化作用を有することが示された。なお、上記アミノ酸についてはＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０００ Ａｐｒ ２５；９７（９）：４８１４−９で活性化作用が報告されている。

＜カルシウム受容体に対するＤ−システインの活性化作用の評価＞
実施例６に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するＤ−システインの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、Ｄ−システイン（１０ｍＭ）、Ｌ−システイン（１０ｍＭ）、Ｄ−トリプトファン（１０ｍＭ）又はＬ−トリプトファン（１０ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図３に示した。この結果より、Ｄ−システインがカルシウム受容体に対する明瞭な活性化作用を有することが示された。

＜カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用の評価＞
実施例６に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＳＮＯ）−Ｇｌｙ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（５００μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（５００μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ（５００μＭ）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ（１ｍＭ）、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（１ｍＭ）、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ（１ｍＭ）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（５０μＭ）、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（５００μＭ）、Ｌｅｕ−Ａｓｐ（１ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図４に示した。この結果より、上記ペプチドは、カルシウム受容体に対する活性化作用を有することが示された。

＜カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用の評価＞
実施例１０と同様に、カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用を評価した。膜に電位固定された卵母細胞に、表2の各ペプチドについて、１０００μＭ、３００μＭ、１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭを添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。電流が検出された最低濃度を表２に活性として示した。この結果より、これら３２種類のペプチドは、カルシウム受容体に対する活性化作用を有することが明らかとなった。

＜本発明に用いられるペプチド及びアミノ酸のコク味付与活性＞
カルシウム受容体活性化作用が見出された、γ-Glu-X-Gly （X はCys(SNO)、Cys(S-allyl)、Gly、Cys(S-Me)、AbuまたはSerである）、γ-Glu-Val-Y (YはGly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、CysまたはGlnである)、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ
-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH₂、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys（S-Me）（O）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me）、の中から代表例を選んで、官能評価試験によりコク味付与活性の有無を調べた。
官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化カルシウム（１ｍＭ）を含有する蒸留水に、試料としてアリイン（ａｌｌｉｉｎ: S-allyl-cysteine sulfoxide、コク味付与活性のコントロール）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌをそれぞれ０．２ｇ／ｄｌで混合した場合の、コク味付与活性の有無を判定した。なお試料溶解後に酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでｐＨ６．８〜７．２に合わせてから使用した。結果を表３に示した。

＜本発明に用いられるペプチドのコク味付与活性＞
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化ナトリウム（０．５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水に、試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌをそれぞれ０．１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。なお試料溶解後に酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでｐＨ６．８〜７．２に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、グルタチオン添加：３点として、ｎ＝３で実施し、結果を表４に示した。

＜本発明に用いられるペプチドのコク味付与活性＞
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化ナトリウム（０．５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水に、試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙをそれぞれ０．１ｇ／ｄｌ、必要に応じて０．０１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。なお試料溶解後に酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでｐＨ６．８〜７．２に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、グルタチオン添加：３点として、ｎ＝５で実施し、結果を表５に示した。

＜本発明に用いられるペプチドのコク味付与活性＞
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／
ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化ナトリウム（０．５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水に、試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙをそれぞれ０．１ｇ／ｄｌ、もしくは０．０１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。なお試料溶解後に酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでｐＨ６．８〜７．２に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、グルタチオン添加：３点として、ｎ＝１２で実施し、結果を表６に示した。

＜本発明に用いられるペプチドの基本味に対する活性＞
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて定量的な官能評価試験により基本味に対する活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。うま味標準液としてグルタミン酸ナトリウム（０．２ｇ／ｄｌ）、甘味標準液としてショ糖（５ｇ／ｄｌ）、塩味標準液として塩化ナトリウム（０．７ｇ／ｄｌ）、酸味標準液としてクエン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水に、試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙをそれぞれ０．０００１〜１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、それぞれ基本味に対する活性の強度を測定した。
なお試料溶解後に試料無添加標準液に対し酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨで標準液のｐＨに対しｐＨ±０．２の幅に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、やや強い：１点、強い：２点として、ｎ＝１２で実施した。上記添加濃度で幅広く基本味に対し強化活性を示した。代表的な濃度での結果を表７に示した。

＜本発明に用いられるペプチドのコンソメスープにおけるコク味付与活性＞
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて定量的な官能評価試験によりコンソメスープにおけるコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。コンソメスープ粉末（食塩 35％、グルタミン酸ナトリウム 18％、イノシン酸一リン酸 0.2％、白コショウパウダー 0.3％、黒コショウパウダー 0.5％、ビーフエキスパウダー 8.0％、白ワインパウダー 3.0％、セロリパウダー 2.0％、白菜エキスパウダー 8.0％、玉葱エキスパウダー 2.5％、乳糖 25.5％）を５ｇ／ｄｌで溶解し、コンソメスープを調製した。このコンソメスープに対し、試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙをそれぞれ０．０００１〜１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、それぞれコク味付与活性の強度を測定した。なお試料溶解後に試料無添加コンソメスープに対し酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでコントロールに対しｐＨ±０．２の幅に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、強い：３点、非常に強い：５点として、ｎ＝１２で実施した。上記添加濃度で幅広くコク味付与活性を示したが、代表的な濃度での結果を表８に示した。

＜本発明に用いられるペプチドのすまし汁におけるコク味付与活性＞
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて定量的な官能評価試験によりすまし汁におけるコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。かつお昆布だし(水３Ｌに乾燥昆布５ｇを加え加熱し、沸騰直前にかつお削り節２５ｇを加えた後、ろ過した液部)に、濃口醤油０．５ｇ／ｄｌ、食塩０．６ｇ／ｄｌを添加し、すまし汁を調整した。このすまし汁に対し、試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙをそれぞれ０．０００１〜１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、それぞれコク味付与活性の強度を測定した。なお試料溶解後に試料無添加すまし汁に対し酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでコントロールに対しｐＨ±０．２の幅に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、強い：３点、非常に強い：５点として、ｎ＝１２で実施した。上記添加濃度で幅広くコク味付与活性を示したが、代表的な濃度での結果を表９に示した。

＜本発明に用いられるペプチドのコーンスープにおけるコク味付与活性＞
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて定量的な官能評価試験によりコーンスープにおけるコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。市販コーンスープに対し、試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙをそれぞれ０．０００１〜１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、それぞれコク味付与活性の強度を測定した。なお試料溶解後に試料無添加コーンスープに対し酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでコントロールに対しｐＨ±０．２の幅に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、強い：３点、非常に強い：５点として、ｎ＝１２で実施した。上記添加濃度で幅広くコク味付与活性を示したが、代表的な濃度での結果を表１０に示した。

＜本発明に用いられるペプチドのカレーソースにおけるコク味付与活性＞
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて定量的な官能評価試験によりカレーソースにおけるコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。市販カレールーを用い定法に従い調整したカレーソースに対し、試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙをそれぞれ０．０００１〜１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、それぞれコク味付与活性の強度を測定した。なお試料溶解後に試料無添加カレーソースに対し酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでコントロールに対しｐＨ±０．２の幅に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、強い：３点、非常に強い：５点として、ｎ＝１２で実施した。上記添加濃度で幅広くコク味付与活性を示したが、代表的な濃度での結果を表１１に示した。

＜本発明に用いられるペプチドと他の既知のカルシウム受容体活性化剤等の添加物を併用した場合おけるコク味付与活性＞
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて、他の既知のカルシウム受容体活性化剤等の添加物を併用した場合の定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化ナトリウム（０．５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水に、ペプチド試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙをそれぞれ０．０００１〜１ｇ／ｄｌにて混合した場合と、更に他のカルシウム受容体活性化剤（乳酸カルシウム、プロタミン、ポリリジン）、GABAを併用した場合（添加濃度０．０００１〜１ｇ／ｄｌ）のコク味付与活性の強度を測定した。なお試料溶解後に酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでｐＨ６．８〜７．２に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、強い（0.05 g/dl γ-Glu-Cys-Glyおよび0.005 g/dl γ-Glu-Val-Glyの力価として）：３点、非常に強い（0.05 g/dl γ-Glu-Cys-Glyおよび0.005 g/dl γ-Glu-Val-Glyの２倍力価として）：６点として、ｎ＝１２で実施した。上記添加濃度で幅広くコク味付与活性を示したが、代表的な濃度での結果を表１２に示した。この結果、本発明のコク味付与剤に加えて、既知のコク味付与活性を有する化合物であるグルタチオンにおいても、カルシウムなどの既知のカルシウム受容体活性化剤などとの併用により、コク味付与活性が向上した。

本発明によって、カルシウム受容体活性化作用を有する特定のアミノ酸及びペプチドがコク味付与物質としても有用であることが明らかとなった。特に実施例１２〜２１で示したようにコク味付与物質として新たにジペプチド、トリペプチドが数種類発見されたが、ペプチドであることから、高い安全性の要求される食品領域における利用が可能である。加えて、カルシウム受容体活性化を指標としたコク味付与物質のスクリ−ニング方法が開発されたことにより、いわゆるハイスループットスクリーニングを用いることができるので、更に高性能のコク味物質の開発が可能となった。
本発明は、好ましい実施形態を参照して詳細に説明されているが、本発明の範囲から逸脱しないかぎり、多様な変更、均等物の使用が可能であることは当業者にとって明らかである。本明細書における全ての引用文献は本明細書の一部として参考のために示す。

カルシウム受容体に対するカルシウムの作用を示す図。 アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体ｃＲＮＡをマイクロインジェクションした。任意の濃度の塩化カルシウム溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。 カルシウム受容体に対するＬ型アミノ酸の作用を示す図。 アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体ｃＲＮＡをマイクロインジェクションした。１０ｍＭのＬ型アミノ酸溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。 カルシウム受容体に対するＤ型アミノ酸の作用を示す図。 アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体ｃＲＮＡをマイクロインジェクションした。１０ｍＭのＤ型アミノ酸溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。 カルシウム受容体に対するペプチドの作用を示す図。 アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体ｃＲＮＡをマイクロインジェクションした。任意の濃度のペプチド溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。

Claims (3)

1. 被検物質がカルシウム受容体活性を有する場合に、該被検物質をコク味付与物質であると判別することを特徴とする、コク味付与物質のスクリ−ニング方法。
2. コク味付与物質が、塩味、うま味、甘味または酸味の少なくとも一種を増強するものである、請求項１に記載のスクリーニング方法。
3. カルシウム受容体と被検物質とを反応させ、カルシウム受容体活性を検出する第１工程と、第１工程でカルシウム受容体活性が検出された被検物質のコク味付与効果を測定する第２工程とを含有する、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。

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