DE2602997C2

DE2602997C2 - Lyophilisierte Kollagenzubereitung und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2602997C2
Application number: DE2602997A
Authority: DE
Inventors: James R. Parsippany N.J. Butler; James E. Madison N.J. Turner
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1975-02-18
Filing date: 1976-01-27
Publication date: 1983-05-11
Also published as: US4002739A; JPS5336005B2; NO150297B; CH608889A5; SE431027B; DE2602997A1; JPS521009A; CA1059906A; NL179315B; AU499183B2; NL7601611A; NL179315C; SE7601746L; DK61476A; IE42769B1; MX3242E; GB1526852A; NO150297C; LU74358A1; IT1055886B

Description

•65

Der primäre hämostatische Vorgang im Körper

besteht in der Adsorption von Blutplättchen an durch eine Verwundung in einem Blutgefäß freigelegtes Subendothelialkollagen, Unmittelbar anschließend kommt es zu einer massenhaften Ansammlung von Blutplättchen um die Wunde herum. Hierbei entsteht ein Blut(plättchen)pfropfen, der einen (weiteren) Blutaustritt verhindert und eine Matrix zur Blutgerinnsel'oildung liefert

Es gibt einige pathologische Zustände, die die Ansammlung bzw. Aggregation von Blutplättchen beeinflussen. So kann beispielsweise eine Abnahme in der Fähigkeit von Blutplättchen zum Zusammenballen bzw. zur Aggregation zu Blutgerinnsel- und Blutungsstörungen führen. Andererseits kann eine erhöhte Zusammenball- bzw. Aggregationsneigung von Blutplättchen eine unerwünschte Thrombusbildung in Gang setzen und möglicherweise zu Herzinfarkten oder sonstigen intravaskulären Gerinnungs- bzw. Klfimpchenbildungsproblemen führen.

Um nun einen speziellen Blutungsfall diagnostizieren zu können bzw. um die Wahrscheinlichkeit weiterer Blutungs- oder Gerinnungsprobleme abschätzen zu können, ist es erforderlich, die Fähigkeit von Patientenblutplättchen zum Zusammenballen bzw. zur Aggregation zu ermitteln. Dies erfolgt in der Regel in vitro durch Bestimmen des durch verschiedene Aggregationsmittel, wie Adenosindiphosphat Epinephrin oder Kollagen, hervorgerufenen Grades der Blutplättchenaggregation. Eine solche Bestimmung wird in der Regel mittels eines Blutplättchenaggregometers durchgeführt Dieses Instrument mißt die Lichtmenge, die durch eine Probe plättchenreichen Plasmas, in dem eine Aggregation abläuft hindurchtritt

Kollagen ist in der Regel das Mittel der Wahl zur Bestimmung der Aggregation, da dieses in vivo bereits bei dem primären hämostatischen Vorgang mitwirkt Da jedoch im Handel keine geeigneten Kollagenzubereitungen erhältlich sind, stellen lediglich einige wenige klinische Laboratorien ihre eignen Kollagenzubereitungen her. Diese Zubereitungen stellen in der Regel eher Suspensionen als echte Lösungen dar, weswegen sie von Zubereitung zu Zubereitung schlecht reproduzierbare Ergebnisse liefern. Darüber hinaus verlieren sie beim Trocknen ihre Blutplättchenaktivität, so daß sie als Suspension bei 4° C gelagert werden müssen. Alles in allem bemißt sich also die Stabilität solcher Kollagenzubereitungen nur nach Tagen.

Der Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, aus unlöslichem Kollagen eine zur Aggregation von Blutplättchen fähige stabile, lösliche Kollagenzubereitung in lyophilisierter Form, bei welcher nach dem Wiederauflösen in Wasser die Blutplättchenagglutinierfähigkeit erhalten geblieben ist anzugeben. Der Gegenstand der Erfindung ist in den Ansprüchen näher erläutert

Durch die neue lösliche Kollagenzubereitung gemäß der Erfindung lassen sich die meisten bei unlöslichen Kollagensuspensionen auftretenden Probleme und Schwierigkeiten vermeiden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen:

Beispiel 1 Herstellungsverfahren

1. Säurelösliche Kollagendispersion

25 mg Achillessehnenkollagen wurden über Nacht bei einer Temperatur von 4° C in 25 ml 0,522 m-Essigsäure

hydratisiert Dann wurde das erhaltene Gemisch in einen 50 ml fassenden Homogenisierbecher überführt und darin bei einer Temperatur von 5° bis 8° C 30 min lang mittels eines handelsüblichen Homogenisators bei einer Einstellung von 80 homogenisiert Die erhaltene Dispersion wurde 15 min lang bei Raumtemperatur mit 2500 · g zentrifugiert Wenp sich am Boden des Zentrifugenröhrchens kein Pfropfen gebildet hat wird die Dispersion 15 min lang langsam gerührt und dann durch einen Glaswollepfropfen filtriert Wenn sich dagegen ein Pfropfen gebildet hatte, wurde das Ganze verworfen.

2. Verdünnen der Kollagendispersion

Die 1 mg Kollagen/ml enthaltende filtrierte Dispersion wird mit einer 0,2%igen wäßrigen Rinderserumalbuminlösung derart verdünnt daß eine Lösung mit 8 μg Kollagen/ml erhalten wird.

3. Lyophilisierung der Kollagenlösung

Aliquote Teile von 1 ml der Kollagenlösung werden 30 h lang in geeigneten Phiolen lyophilisiert Nach dem Lyophilisieren werden die Phiolen verschlossen und bei 4° C gelagert

4. Wiederaufbereiten des lyophilisierten Kollagens

Der Phioleninhalt wird mit 1 ml Wasser versetzt und dann 10 min lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Hierauf wird das Ganze 10 see lang in einem Wirbelmischer mit mittlerer Geschwindigkeit durchgemischt Die wiederaufbereitete Lösung sollte bei einem pH-Wert von 3,0 bis 44, vorzugsweise von 3,8, gelagert werden.

Beispiel 2

Verfahren zur Herstellung einer gepufferten löslichen Kollagenzubereitung

1. Säurelösliche Kollagendispersion Vgl. Stufe 1 von Beispiel 1.
2. Zubereitung eines O,O5m-Glycin/HCI-Puffers

3,7535 g Glycin und 2,0 g Rinderserumalbumin werden in 900 ml destilliertem Wasser gelöst Die erhaltene Lösung wird mit 0,In-HCl a;;f einen pH-Wert von 3,0 bis 44, vorzugsweise von 3,8, eingestellt und dann mit Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml aufgefüllt Erforderlichenfalls wird der pH-Wert der Pufferlösung erneut durch zusätzliche HCl eingestellt.

3. Lösen der Kollagendispersion

Die 1,0 mg Kollagen/ml enthaltende filtrierte Dispersion wird mit der Glycinpuffer/Rinderserumalbumin-Lösung auf die gewünschte Kollagenkonzentration, vorzugsweise 8 μg/m!, verdünnt

4. Lyophilisieren der Kollagenlösung Vgl. Stufe 3 von Beispiel 1.

5. Wiederaufbereiten des lyophilisierten Kollagens

Vgl. Stufe 4 von Beispiel <

Eine saure Kollagenzubereitung (2,5 mg/ml) wurde entsprechend Beispiel 1 zusammen mit bzw, ohne 7% Rinderserumalbumin lyophilisiert Lediglich die das Rinderserumalbumin enthaltende lyophilisierte Zubereitung ließ sich wieder in Lösung bringen und zeigte in dieser Form eine vollständige Blutplättchenaggregation.

Es handelte sich hierbei allerdings lediglich um kleine Aggregate, die kleine Ausschläge auf der Aggregometeraufzeichnung liefern. Eine erwünschte Eigenschaft einer Kollagenzubereitung besteht jedoch in der Fähigkeit große Blutplättchenaggregate und große Aggregometerausschläge zu liefern (vgl. die in der Zeichnung dargestellte Aggregometeraufzeichnung). Aus der Aggregometeraufzeichnung geht hervor, daß bei einer 7%igen Rinderserumalbuminkonzentration ein geringer inhibierender Effekt auf die Blutplättchenaggregation festzustellen ist

Ferner wurden 1 bis 5% Rinderserumalbumin enthaltende lyophilisierte Zubereitungen mit Wasser bzw. O,522m-Essigsäure wieder aufbereitet Die mit Wasser wieder aufbereiteten Zubereitungen aggregierten die Blutplättchen vollständig, die Ausschläge auf der Aggregometeraufzeichnung waren jedoch gering. Dies zeigt daß eine Rinderserumalbuminkonzentration von nur 1 Vo noch eine schwach inhibierende Wirkung auf die Blutplättchenaggregation besitzt Die mit Essigsäure wieder aufbereiteten Zubereitungen balken die Blutplättchen nicht zusammen, was auf eine weitere zusätzliche Inhibierung durch die Essigsäure hinweist Glücklicherweise wurden bei der zusätzlich zum Trocknen der Zubereitung durchgeführten Lyophilisierung etwas Essigsäure entfernt und so die Azidität der mit Wasser wieder aufbereiteten Proben auf einen pH-Wert von 2 bis 4 eingestellt Dies führt zu einem stärker aktiven Produkt Die unerwartete Aziditätserniedrigung durch die Lyophilisierung (und nicht durch eine Neutralisation mit Alkali) verhinderte ferner eine Zunahme der Ionenstärke und stellte dadurch eine vollständige Wiederauflösung des Kollagens in Wasser sicher.

Es wurden weitere 0,05 bis 1,0% Rinderserumalbumin enthaltende Kollagenzubereitungen lyophilisiert. Dies führt zu einem Blutplättchenaggregationsgrad, der in direkter Beziehung zur prozentualen Lichtdurchlässigkeit steht (vgl. die folgende Tabelle 1).

Die Tabelle I zeigt daß die Aggregation durch Rinderserumalbuminkonzentrationen bis zu 1% nicht merklich beeinträchtigt wird. Eine vollständige Lösung des Kollagens ließ sich bereits mit 0,2% Rinderserumalbumin erreichen, weswegen diese Konzentration für die weiteren Untersuchungen gewählt wurde.

Zur Bestimmung der für eine Blutplättchenaggregation erforderlichen optimalen Kollagenmenge wurden verschiedene Mengen an einer wiederaufbereiteten Kollagenzubereitung mit 0,2% Rinderseruma'bumin zu an menschlichen Blutplättchen reichem Plasma zugesetzt Es zeigte sich, daß 10 μΙ, 20 μΙ und 50 μΙ einer 2^ mg/ml Supsension eine vollständige Aggregation hervorriefen. Folglich wurden stärker verdünnte Kollagenlösungen zubereitet, lyophilisiert und in Wasser wieder aufbereitet. Der durch 50 μΐ jeder dieser Zubereitungen hervorgerufene Aggregationsgrad ist ebenfalls in Tabelle 1 angegeben.

Schließlich wurden noch weitere Verdünnungen einer 0,125 mg/ml enthalten>n wiederaufbereiteten KoIJagenzubereitung mit 1% Rinderserumalbumin hergestellt. Auch hier sind die Werte in Tabelle I enthalten.

Tabelle I

Grad der durch sieben verschiedene Kollagenkonzentrationen hervorgerufenen Blutplättchenaggregation

Kollagen (mg/ml)

Rinderserumaibumin (%)

Piätlchenaggregation (prozentuale Durchlässigkeit)

A	0,25	0,05
B	0,25	0,10
C	0.25	0.20
D	0.25	1.0
E	0.125	0,05
Ι	0.125	0,10
Ο	0.125	0,20
H (D	0.125	1,0
	η ΠΑ ι ς	!,0
(3)	0,0313	1,0
(4)	0,0156	1,0
(5)	0,008	1,0
(6)	0,005	1,0
(7)	0.004	1,0

nicht wieder aufbereitbar

desgl.

87

84 85 77 76 84 82 78 76 64 17 21

Eine vollständige Aggregation ließ sich entweder mit der 0,250 mg/ml- oder 0,125 mg/ml-Zubereitung erreichen. Bei einer Untersuchung der sechs Verdünnungsstufen (aus der Verdünnungsreihe der 0,125 mg/ml-Lösung in 1% Rinderserumaibumin) im Hinblick auf ihre Blutplättchenaggregationsaktivität zeigte es sich, daß bei eir°r Kollagenkonzentration von 8 μg/ml eine optimale, jedoch nicht maximale Blutplättchenaggregation erreicht wird. Unter diesen Versuchsbedingungen entspricht die optimale Blutplättchenaggregation bei normalen, d. h. gesunden Patienten einer etwa 60%igen Durchlässigkeit, die ohne weiteres einen Nachweis großer Abweichungen über dem und unter dem Normalwert ermöglichen.

Stabilitätsuntersuchungen zeigten, daß die löslichen Kollagenzubereitungen gemäß der Erfindung bei Raumtemperatur mindestens 8 Monate lang, bei 45°C bis zu zwei Wochen und bei 4° C mindestens 9 Monate lang stabil bleiben. Die Stabilität nach der Wiederaufbereitung beträgt 3 h bei Raumtemperatur.

Es ist bekannt, daß Acetylsalicylsäure und verschiedene andere Chemikalien eine Blutplättchenaggregation inhibieren. Folglich wurde eine Untersuchung darüber angestellt, ob die 8 μg Kollagen/ml-Zubereitung zwischen einer normalen Blutplättchenaggregation und abnormalen Blutplättchen unterscheiden kann. Von drei Versuchspersonen wurden vor und nach Verabreichung von Acetylsalicylsäure an Blutplättchen reiche Plasmas gewonnen und diese dann auf die Blutplättchenaggregation hin untersucht.

Die folgende Tabelle Il zeigt, daß die lösliche Kollagenzubereitung gemäß der Erfindung bei sämtlichen Proben eine in-vivo-Acetylsalicylsäureinhibierung der Blutplättchenaggregation nachzuweisen vermochte.

Tabelle Il

In-vivo-EfTekt von Acetylsalicylsäure auf die Blutplättchenaggregation

Versuchsperson

Prozentuale Durchlässigkeit

vor der Acetyl-

salicylsäurc-

verabreichung

nach der Acctyl-

salicylsäure-

verabreichung

62 55 62

24 13 20

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

1. Lyophilisierte Kollagenzubereitung mit Blutblättchenagglutinierfähigkeit, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Rinderserumalbumin.

2. Kollagenzubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer wäßrigen Dispersion vorliegt

3. Kollagenzubereitung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rinderserumalbuminkonzentration ausreicht, daß eine Kollagenkonzentration von 5 bis 1000 μ^πιΐ sichergestellt ist

4. Kollagenzubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Kollagendispersion vorliegt, der so viel Rinderserumalbumin ·5 zugesetzt ist, daß eine Kollagenkonzentration von 5 bis 10 μg/m] sichergestellt ist

5. Kollagenzubereitung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet daß die Kollagenkonzentration 8 μg/l^ϊ! beträgt

6. Kollagenzubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß der pH-Wert zwischen 3 und 4,5 liegt

7. Kollagenzubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet daß sie Essigsäure enthält

8. Verfahren zur Herstellung einer Kollagendispersion mit Blutblättchenagglutinierfähigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man eine bestimmte Menge Kollagen bei einer Temperatur von 4° C in einer b^iimmten Menge Säure hydratisiert, das hydratisierte Material homogenisiert, das homogenisierte Material zentrifugiert, falls sich am Boden des Zentrifugenröhrchens keir Pfropfen bildet das zentrifugierte Material rührt das gerührte Material J5 filtriert und das filtrierte Material mit so viel Rinderserumalbumin verdünnt daß die Kollagenkonzentration pro ml verdünnter Lösung 5 bis ICKX^g beträgt

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die verdünnte Lösung lyophiiisiert

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer 0,2%igen wäßrigen Rinderserumalbuminlösung verdünnt

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet daß man die Kollagenkonzentration pro ml verdünnter Lösung auf 5 bis IC^g einstellt

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kollagenkonzentration pro ml so verdünnter Lösung auf 8 μg einstellt

13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man O,522m-Essigsäure verwendet

14. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Material bei einer Temperatur von 5° bis 8⁰C homogenisiert

15. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet daß man bei Raumtemperatur 15 min lang mit 2500 · g zentrifugiert

16. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekenn- w zeichnet, daß man das filtrierte Material mit einem Glycin/Rtnderserumalbumin-Puffer eines pH-Werts von 3,0 bis 43 verdünnt.