DE2628468C2

DE2628468C2 - Verfahren zur Färbung von Basophilen und Reagens zur Durchführung dieses Verfahrens

Info

Publication number: DE2628468C2
Application number: DE19762628468
Authority: DE
Inventors: Jacques Paris Benveniste
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1975-06-27
Filing date: 1976-06-25
Publication date: 1982-05-06
Also published as: NL171840C; NL7607012A; GB1560729A; JPS5819063B2; CA1087966A; JPS5224589A; DE2628468A1; NL171840B; CH613523A5; SE7607282L; DK289076A; SE437079B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Färbung von jo Basophilen, die nicht degranuliert sind, sowie gegebenenfalls von anderen, in einer Probe eines biologischen Mediums, vorzugsweise in einer Blutprobe, enthaltenen Leukozyten, mit einem wäßrigen Reagens, das ein metachromatisches Färbemittel enthält. Die Erfindung j5 betrifft weiterhin ein Reagens zur Durchführung dieses Verfahrens.

Es ist bekannt, daß die häufigsten bis heute verwendeten diagnostischen Verfahren für Allergien im allgemeinen zahlreiche Injektionen der verschiedenen zu unterziehenden Allergene erforderlich machen. Abgesehen von den Unannehmlichkeiten, die diese Verabreichungsweise mit sich bringt, ist sie manchmal für die Patienten äußerst gefährlich und führt häufig zu unspezifischen, schwierig zu interpretierenden Reaktionen.

Seit eikiigen Jahren gibt es Meti.oden zum Nachweis von anaphylaktischen Antikörpern im Serum. Jedoch sind sie einerseits besonders kostspielig, da sie eine sehr komplexe Reinigungstechnologie, die Markierung mit radioaktivem Jod und die Fixierung der gereinigten Allergene und durch Immunisation eines Tieres erhaltenen und gereinigten Antikörper an unlöslichen Trägermaterialien notwendig machen. Andererseits erfordern sie spezielle Vorrichtungen (Zentrifugen, Zählvorrichtungen für radioaktive Elemente), wodurch sie kostspielig und unanwendbar außerhalb großer Stadtzentren in Entwicklungsländern werden. Dariiberhinaus weiß man heute, daß das Vorhandensein von Serumantikörpern nicht dazu ausreicht, eine Allergie f>o auszulösen.

So weiß man seit einiger Zeit, daß die Basophile des Blutes eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung von allergischen Symptomen spielen. Insbesondere wurde festgestellt, daß die allergischen Erscheinungen bis zu einem großen Ausmaß der Degranulation der Basophile dos im Kreislauf befindlichen Blutes unter der Einwirkung des allerf.nen Mittels zuzuschreiben sind, einer Degranulation, die unter anderem von der Freisetzung beträchtlicher Mengen an toxischen Produkten, insbesondere an Histamin, begleite' wird, die in den Basophilen enthalten waren.

Es wurde auch festgestellt, daß die allergische Reaktion in vitro reproduziert werden konnte, wobei die für die Degranulation unter der Wirkung des untersuchten Antigens empfindlichen Basophile verschiedene morphologische oder zelluläre Veränderungen eingehen, die an den Basophilen von Kontrollproben oder von Proben, die vorher mit unzweifelhaft im Hinblick auf diese Proben unwirksamen Allergenen in Kontakt gebracht worden waren, nicht beobachtet wurden.

Aus diesem Grunde haben verschiedene Autoren bereits Methoden zur Diagnostik von Allergien empfohlen, die auf der Untersuchung von zellulären Modifikationen in vitro basieren, di; die Basophile einer Blutprobe eines Patienten in Anwesenheit von Antigenen oder Allergenen, deren mögliche Induktion von anaphylaktischen Reaktionen bei (* :m Patienten untersucht werden soll, eingehen können.

Diese diagnostischen Methoden stoßen bis zum heutigen Tage auf große Schwierigkeiten. Einer der wesentlichsten Gründe dieser Schwierigkeiten liegt in dem relativ stark ausgeprägten Seltenheitsgrad der Basophile im Vergleich mit den anderen Bestandteilen des Blutes, so daß bekannte Verfahrensweisen im allgemeinen aus zwei Stufen bestehen, d. h. einer Stufe zur Konzentration der Basophile in der Blutprobe und anschließend einer Stufe zur geeigneten Anfärbung dieser Basophile.

Eine klassische Technik ist die von Shelley W. B. und L. Juhlin (Blood. 19:209,1962) beschriebene.

Die Durchführung der ersten Stufe umfaßt verschiedene Arbeitsgänge, die darin bestehen, die zu untersuchende Blutprobe mit einem zur Fixierung der Leukozyten einschließlich der Basophile und zur Zerstörung der Erythrozyten vorgesehenen Medium in Kontakt zu bringen, das aus 60 Teilen Äthylalkohol, 20 Teilen Eisessig und 20 Teilen Chloroform besteht, die ferner in der Konservierung der erhaltenen Mischung bei 4° C bis zum nächsten Morgen, zur vollständigen Fixierung, in der Eliminierung der überstehenden Flüssigkeit und im erneuten Suspendieren der dekantierten Zellen in dem gleichen Mi! ;u sowie in der Filtration der erhaltenen Suspension an Filterpapier zur Erzielung eines aus den Leukozyten gebildeten festen Rückstands an dem Filterpapier, bestehen.

Die zweite Stufe besteht dann darin, das Filter mit den Zellen während 30 Sekunden in eine Lösung von Toluidinblau zu tauchen, die insbesondere durch Auflösen von 100 mg Toluidinblau in 30 ml destillier_tem Wasser hergestellt wurde. Anschließend wird die Probe, deren Basophile rot gefärbt wurden, unter dem Mikroskop »gelesen«.

Diese Technik, deren wesentliche Fakten im vorstehenden gestreift wurden, ist jedoch äußerst schwierig durchzuführen und erfordert, wie die Autoren selbst erkannt haben, eine sorgfältige Ausbildung des Arbeitspersonals, da sehr häufig die Unterscheidung der degranulierten und der nicht degranulierten Basophile auf der Bewertung der morphologischen Umwandlungen beruht, die an jenen Basophilen festgestellt werden können, die eine Degranulation eingegangen sind.

Bestimmte Autoren haben vereinfachte Versionen der Methode von Shelley empfohlen. Beispielsweise haben Klopstock & KoII. (Israel Midical Journal

September-Oktober 1962, Band 21) neue Untersu chungstechniken für die morphologischen Umwandlungen von Basophilen einer Blutprobe unter der Einwirkung eines zu untersuchenden Antigens empfohlen, um eine diagnostische in vitro-Methode für Allergien aufzustellen.

Eine dieser Techniken besteht darin, eine vorhergehend in Anwesenheit des zu untersuchenden Antigens während 20 Minuten »heparinisierte« Blutprobe zu inkubieren und anschließend aliquote Teile dieser Probe und eine in Anwesenheit einer normalen Salzlösung inkubierte Probe mit dem Fünffachen ihres Volumens einer Farbmischung zu verdünnen, die aus 0,25% Toluidinblau und 2,5% Essigsäure besteht. Nach der fünfminütigen Inkubation der erhaltenen Mileus führt man die vergleichende Untersuchung des Verhältnisses von nicht degranulierten Basophilen zu Basophilen. die eine Degranulierung eingegangen sind, in jeder Probe iintpr dem Mikroskop durch, wobei die Bewertung der Degranulation immer noch auf den morphologischen Veränderungen beruht, die in den Zellen durch die Degranulationswirkung induziert wird. Zwar ist die Färbetechnik vereinfacht, doch bleibt die Bewertung der morphologischen Unterschiede von degranulierten und nicht degranulierten Basophilen weiterhin schwierig. Auch ist es wahrscheinlich, daß das stark saure Mileu zu weiteren Schwierigkeiten führen kann.

Die zweite von Klopstock & KoII. empfohlene Methode umfaßt erneut eine Konzentrationsstufe für die Basophile. insbesondere durch differentielles Zentrifugieren der vorhergehend in Anwesenheit des zu untersuchenden Antigens inkubierten Probe und die Untersuchung der Basophile in dem erhaltenen Konzentrat, das die Leukozyten und unter diesen die Basophile enthält, wird anschließend unter dem Mikroskop durchgeführt, nachdem man mit einem Reaktivfarbstoff auf der Basis von Toluidinblau in einer wäßrig-alkoholischen Lösung, die 50% Äthylalkohol enthält, eine Färbung durchgeführt hat.

Die Bewertung einer möglichen Degranulation der Basophile kann jedoch nach dieser Methode nur noch schwieriger erfolgen, da der Beobachter nicht nur die Basophile sieht, sondern auch sämtliche andere Leukozyten, wobei das Ganze in ein »Vlies« von Erythrozyten eingehüllt ist. Obwohl diese verschiedenen Methoden oder Techniken einen bestimmten Wirkungsgrad aufweisen, wurden sie in der Praxis nicht angewendet, da die Reaktionskomponenten äußerst genau hergestellt werden müssen, die Versuchsdauer sehr lang ist. die Untersuchungen unangenehm durchzuführen sind und ein sehr geschultes Personal erfordern.

Allgemein gesehen bestehen nur wenige Methoden zur Sichtbarmachung, die die einfache Zählung der Basophile ermöglichen. Die Schwierigkeiten, die sich bei diesen Zählungen ergeben, wurden von James E. Moore &Koll. (P.S.EB.M. 1953, Band 82, Seite 601-603) beschrieben.

Diese Autoren haben bereits dargelegt daß die Differenzierung der Basophile von den anderen Leukozyten einer Blutprobe voraussetzt, daß man vorher eine Hämolyse der Erythrozyten durchführt, ohne daß gleichzeitig die wasserlöslichen Granulate der Basophile gelöst werden. Sie haben bereits angegeben, daß insbesondere die Essigsäure unter den anderen anorganischen Säuren aufgrund der Löslichkeit der Granula der Basophile in den sie enthaltenden Reaktionskomponenten nicht geeignet ist obwohl sie zur Hämolyse der Erythrozyten wirksam ist Gleichzei-

tig haben diese Autoren festgestellt, daß alkoholische Lösungen von 15 — 30% nicht als Mittel zur Hämoylse wirksam sind, obwohl sie zur Fixierung der Granula geeignet sind.

Zur Überwindung dieser scheinbar unüberwindbaren Schwierigkeiten empfahlen sie daher ein völlig unterschiedliches, metachromatisches Färbeverfahren für die Basophile, das darin besteht, eine Probe des zu untersuchenden Blutes mii einer aus 40 Volumenteilen einer Lösung von Toluidnblau in einer isotonischen Salzlösung, Il Volumenteüen Äthylalkohol und 1 Volumenteil einer Saponinlösung in 50% Äthylalkohol gebildeten Mischung in Kontakt zu bringen.

Diese empfohlene Methode bleibt jedoch schwierig in der Anwendung, vor allem, wenn es sich darum handelt, die Basophile untereinander zu differenzieren im Hinblick darauf, ob sie degranuliert sind oder nicht, ein Problem, dessen Lösung sich die vorliegende Erfindung zum Ziele gesetzt hat.

Darüber hinaus ist die Reproduzierbarkeil dieses Verfahrens durchaus nicht perfekt, wenn es nur dazu angewendet wird, die Basophile von den anderen Leukozyten des Blutes zu unterscheiden. Die metachromatischen Färbungen sind nicht deutlich. Das Saponin neigt zur Ausfällung in dem Milieu.

Aufgrund der ganzen genannten Schwierigkeiten wurde bisher in hämatologischen Laboratorien keine Anwendung von Untersuchungsmethoden in vitro zur Diagnose von anaphylaktischen Sensibilitäten, insbesondere von Allergien, durchgeführt.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren /ur Sichtbarmachung und Zählung von Basophilen in vitro und insbesondere von nicht degranulierten Basophilen unter Ausschluß solcher, die eine Degranulation eingegangen sind und gegebenenfalls auch von Leukozyten, die auf Blutproben in einer einzigen Stufe anwendbar sind, zur Verfugung zu stellen, ohne daß vorher eine Konzentration bestimmter Bestandteile der Proben notwendig ist. Dieses Verfahren soll leicht und in reproduzierbarer Weise von jedem Arbeitspersonal durchgeführt werden können, auch wenn es nicht spezieil geschult wurde. Weiterhin soll ein Reagens zur Verfugung gestellt werden, das es ermöglicht, nach dem Kontakt mit den zu untersuchenden Blutproben eine rasche direkte Zählung mittels Zählvorrichtungen, insbesondere mittels klassischen Hämozytometern. durchzuführen. Dieses Reagens soll über einen langen Zeitraum stabil sein, so daß es nicht mehr notwendig ist. unmittelbar vor der Anwendung geeignete Reagenzien für jede Versuchsserie herzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Verfahren der oben beschriebenen Art dadurch gelöst, daß man auf die im nicht Fixierten Zustand vorliegende Probe ein Reagens einwirken läßt, das pro 100 ml 30 bis 250 mg des metachromatischen Färbemittels, 20 bis 50 ml eines zur Fixierung von Leukozyten und Basophilen geeigneten Alkohols, unter 1 ml einer Säure mit auflösenden Eigenschaften für Erythorzyten und als Rest Wasser enthält und dabei die Anteile der Probe und des Färbemittels so wählte, daß der pH-Wert der Mischung von Probe und Färbemittel zwischen etwa 3 und etwa 5 liegt

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet daß das verwendete Reagens als metachromatisches Färbemittel Toluidinblau, als Alkohol Äthanol und als Säure Essigsäure enthält

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagens verwendet, das pro Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält:

75 bis 60 ml destilliertes Wasser, 25 bis 40 ml Äthanol, 30 ϊ bis 100 mg Toluidinblau und 150 bis 600 ml Eisessig derart, daß der pH-Wert des Reagens zwischen 3 und 5 liegt.

Fine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein to Reagens verwendet, das pro Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält:

etwa 70 ml destilliertes Wasser, etwa 30 ml absolutes Äthanol, etwa 70 mg Toluidinblau. etwa 400 ml Eisessig derart, daß der pH-Wert des Reagens in der ιϊ Größenordnung von 3,4 bis 3,6 liegt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform wird dadurch gekennzeichnet, daß man als Blutprobe eine aus dem Gesamtblut bestehende Probe verwendet.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform wird ->o dadurch gekennzeichnet, daü man als Blutprobe eine aus gewaschenem Blut bestehende Probe verwendet.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform wird dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Mischung von Blut und Reagens auf einen Wert in der :> Größenordnung » on 4,5 einstellt, wobei dieser pH-Wert entweder durch einfaches Vermischen des Reagens mit der Blutprobe in den für diesen pH-Wert geeigneten Mengenanteilen oder durch Einstellen mittels eines zusätzlichen basischen oder sauren Reagens regelt. jn

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform wird dadurch gekennzeichnet, daß das Gesamtblut mit dem flüssigen Reagens auf das 9fache seines Volumens verdünnt wird.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform. bei ü welcher die Erfindung zur Diagnose von anaphylaktischen Sensibilitäten und insbesondere von Allergien angewendet wird, wird dadurch gekennzeichnet, daß man verschiedene Fraktionen der gleichen Blutprobe jeweils vor Einwirkenlassen des Reagens mit einem Mittel, dessen degranulierende Wirkung auf Basophile nachgewiesen werden soll, wie einem Antigen oder einem Allergen, und einem Kontrollantigen inkubiert und nach dem Einwirkenlassen des Reagens die Basophile in jeder Fraktion zählt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform wird dadurch gekennzeichnet, daß man die Blutprobe, an der die Inkubation mit einem Antigen durchgeführt wird, halbiert in eine Gesamtblutprobe und eine plasmafreie gewaschene Blutprobe und jede dieser Proben in so Anwesenheit des gleichen Antigens inkubiert und die anschließend durchgeführten Zählungen an der Gesamtblutprobe und der gewaschenen Blutprobe durchführt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform wird dadurch gekennzeichnet daß man die plasmafreie, gewaschene Blutprobe durch Trennung des Plasmas und der Zellbestandteile der vom Patienten entnommenen Blutprobe, insbesondere durch Zentrifugieren, Gewinnung und Waschen der Zellbestandteile mit einem isotonischen Puffer und erneuten Suspendieren dieser gewaschenen Zellbestandteile in einem isotonischen Puffer, herstellt und daß man die Gesamtblutprobe aus einer unter den gleichen Bedingungen behandelten Probe bildet wobei jedoch die Zellbestandteile erneut mit dem Plasma vereint werden, aus dem sie ursprünglich abgetrennt wurden.

Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform wird

dadurch gekennzeichnet, daß man einen isotonischen Puffer mit einen pH-Wert von 7,4 bis 7,6 verwendet, der Glukose und Proteine, insbesondere menschliche Serumalbumine, enthält, um die Zellbestandteile des Blutes in einer Glukose- und Proteinumgebung zu halten, die der des Gesamtblutes nahekommt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform wird dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer die Base (tris-hydroxymethyl)aminomethan verwendet.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform wird dadurch gekennzeichnet, daß man einen Puffer für die Wäsche verwendet, der auch antikoagulierende Substanzen, wie Heparin und EDTA, enthält.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform wird dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation gleichzeitig an Gesamtblutproben und an gewaschenen Blutproben, deren möglicher Gehalt an Kalzium vorher insbesondere durch Chelatbildung maskiert wurde, durchführt und zwar einerseits in Anwesenheit des zu untersuchenden Antigens, jedoch in Abwesenheit von Kalzium und andererseits in Anwesenheit eines Kalziumüberschusses, jedoch in Abwesenheit des Antigens.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens, das durch eine Lösung gekennzeichnet ist, die pro 100 ml enthält:

20 bis 50 ml eines zur Fixierung von Leukozyten und Basophilen geeigneten Alkohols, 80 bis 50 ml Wasser, 30 bis 250 mg eines metachromatischen Färbemittels und unter 1 ml einer Säure mit auflösenden Eigenschaften für Erythrozyten derart, daß der endgültige pH-Wert des Reagens zwischen 3 und 5 liegt.

Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Reagens ist dadurch gekennzeichnet, daß es frei von Mineralsalzen ist, die eine wäßrige Lösung isotonisch machen können.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Reagens ist dadurch gekennzeichnet, daß das metachromatische Mittel aus Toluidinblau besteht, der Alkohol Äthanol ist und die Säure Essigsäure ist.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Reagens ist dadurch gekennzeichnet, daß es pro 100 -.il enthält:

75 bis 60 ml destilliertes Wasser, 25 bis 40 ml Äthanol, 30 bis 100 ml Toluidinblau und 150 bis 600 ml Eisessig derart, daß der pH-Wert des Reagens zwischen 3 und 5 liegt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Reagens ist dadurch gekennzeichnet, daß es pro 100 ml enthält:

etwa 70 ml destilliertes Wasser, etwa 30 ml absolutes Äthanol, etwa 70 mg Toluidinblau und etwa 400 ml Eisessig derart, daß der pH-Wert des Reagens in der Größenordnung von 3,4 bis 3,6 liegt

Durch die Erfindung werden innerhalb des angegebenen pH-Bereichs eine Konkurrenz zwischen den Färbungsgeschwindigkeiten der intakten Besophile einerseits und der degranulierten Basophile andererseits durch das metachromatische Mittel sowie der Fixierungsgeschwindigkeiten der Basophile und gegebenenfalls der anderen Leukozyten ausgenutzt Dank der Konzentrationen an Fixierungsmittel bzw. der verwendeten metachromatischen Mittel haben lediglich die intakten Basophile ausreichend Zeit zur Anfärbung, bevor sie durch das Fixierungsmittel fixiert werden, wohingegen die degranulierten Basophile fixiert werden, bevor sie Zeit finden, eine Färbung einzugehen, die anschließend für das bloße Auge unsichtbar bleibt.

Interessanterweise wurde festgestellt, daß die nicht degranulierten Basophile dem Beobachter als in ihrer gesamten Masse angefärbt erscheinen, was einer beginnenden Auflösung der Granula der Basophile in dem M Heu, das in diese Basophile eingedrungen ist, wobei jedoch im Inneren der Zellen deren Fixierung die gelösten Materialien daran hindert, sich nach außen auszubreiten, zuzuschreiben ist

Man könnte in gleicher Weise die Abwesenheit einer sichtbaren Färbung in den Basophilen, selbst den lediglich teilweise degranulierten, dahingehend Interpretieren, daß die schwache möglicherweise in den Granula induzierte Färbung, die in diesen Basophilen noch besteht, aufgrund der sehr starken Verdünnung, selbst wenn diese lediglich in den Basophilen vorliegt, nicht mehr feststellbar ist.

Andere metachromatische Farbstoffe als Toluidinblau können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise die in »Msstceüs and b2soⁿ^i^^e" AnnaU n( *h^e New York Academy of Sciences, Vol.103, 1963, beschriebenen. Der bevorzugte Alkohol und die bevorzugte Säure sind Äthanol bzw. Essigsäure.

Es wurde festgestellt, daß es auf diese Weise möglich wird, in einer einzigen Stufe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Reagens gleichzeitig die Zerstörung der Erythrozyten der Blutprobe, die Fixierung der Leukozyten und die Stabilisierung der Basophile und schließlich und vor allem die selektive Anfärbung der nicht degranulierten Basophile in rot zu bewirken, wenn als metachromatischer Farbstoff ein Toluidinblau verwendet wird. Diese Färbung tritt in der Praxis unmittelbar auf und wird die Mischung in die Kammer eines Hämozytometers überführt, so ist es möglich, eine rasche Zählung der in einer Volumeneinheit der Blutprobe vorhandenen Basophile, die keine Degranulation eingegangen sind, mit in dieser Technik gut bekannten Methoden durchzuführen.

Liegt der pH-Wert der Mischung in der Größenordnung von 4,5, so beobachtet man eine Färbung des Zytopiasmas von lediglich den Basophilen. Man beobachtet auch eine sehr leichte Blaufärbung der Kerne der andere*. Leukozyten, jedoch ist das Zytoplasma der von den Basophilen unterschiedlichen Zellen niemals gefärbt, so daß die einzigen Zellen, die in ihrer Masse als rot gefärbt erscheinen, die Basophile sind. Es sei daran erinnert, daß die in dem Zytoplasma der Basophile enthaltenen Granula, die durch die vorstehenden metachromatischen Farbstoffe gefärbt werden, spezifisch für Basophile sind, was den Grund dafür darstellt, daß die Zytoplasmen der anderen Polynukleare und der Leukozyten nicht in gleicher Weise angefärbt werden, wodurch die Möglichkeit besteht, die polynuklearen Basophile einerseits und die anderen Polynukleare der Lymphozyten andererseits zu zählen.

Der gewählte pH-Wert resultiert aus der direkten Mischung der Anteile von Reagens und Blut, die in Funktion des gewünschten pH-Werts gewählt werden. Gegebenenfalls kann der pH-Wert der Mischung auch durch Modifizieren des pH-Werts des Reagens vor dem Vermischen, beispielsweise mit Hilfe von Essigsäure oder ChlorwasserstoffsSure oder einer Base wie beispielsweise Natronlauge eingestellt werden, je nachdem, ob man den pH-Wert der Mischung verringern oder erhöhen wilL Es ist selbstverständlich besonders einfach, den Säuregehalt des Reagens in Funktion des endgültig gewünschten pH-Werts der Mischung vorher zu regeln.

Das Verfahren kann äußerst einfach durchgeführt werden. Es Mt auf das gesamte Blut anwendbar, ohne daß vorausgehende Abtrennungen gewisser Bestandteile notwendig sind. Es kann auch ursprüngliches Blut 5 oder vorausgehend mit einem isotonischen Puffer gewaschenes Biut, beispielsweise dem unter dem Namen »Tyrode«-Puffer bekannten Puffer angewendet werden. Es kann direkt auf frisches Blut oder auf Blut angewendet werden, das ein Antikoagulans wie Heparin

ίο enthält, im Falle eines Blutes, das einige Zeit konserviert wurde.

Die Anteile an Blut und Reagens, die vermischt werden, hängen unter anderem vom ursprünglichen pH-Wert des Reagens und vom gewünschten pH-Wert

π der Mischung ab. So führt z.B. bei einer erwähnten bevorzugten Ausführungsform des Reagens eine Mischung von 1 Volumen Blut mit 9 Volumina dieses Reagens direkt zu einem pH-Wert in der Größenordnijne vnn 4¹V wodurch f>ine praktisch selektive Fürhnn»

2(i von lediglich den Basophilen ermöglicht wird, die nicht degranuliert wurden.

Die Einfachheit der Methode, die durch ihre ausgezeichnete »Ablesbarkeit« der Blättchen (rote Basophile, die sich deutlich vom klaren Hintergrund der

2i behandelten Probe abheben), machen sie für den raschen Gebrauch von ungeschultem Personal geeignet.

Schließlich ist das Reagens wenig kostspielig, da es

aus üblichen Bestandteilen besteht.

Außerdem führt die Auswahl der Anteile der Bestandteile des Reagens zu einer während der Zeitdauer von mehreren Monaten bei Raumtemperatur perfekt stabilen Mischung, obwohl man derartige Reagenzien im allgemeinen bei einer Temperatur in der Größenordnung von 4° C lagert, um das Risiko der Verdampfung von Alkohol zu vermindern.

Die Verträglichkeit der Bestandteile dieser Mischung, deren große Stabilität sowie die Wirksamkeit der metachromatischen Färbung der Basophile unter den angegebenen Bedingungen wurde bereits erwähnt.

4n Der große Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in seiner Einfachheit. Es basiert nur auf Zähltechniken, ohne daß es notwendig ist, sich vorher mit morphologischen Umwandlungen zu beschäftigen, die Basophile eingegangen sein können, die einer Degranulation unterzogen wurden. Es vermeidet auch

die 'Anwendung von Konzentrationsverfahren, die lediglich in speziell ausgerüsteten Laboratorien mit geschulten Technikern durchgeführt werden können.

Die Zählung wird vorzugsweise an Blutproben sofort

so nach der Inkubation in Anwesenheit des zu untersuchenden Allergens durchgeführt Sie kann auch später erfolgen. Es ist jedoch zweckmäßig, Reaktionen zu blockieren und die spätere Aggregation von Zellen zu verhindern, beispielsweise durch Zusatz eines Anti-Ag-

gregationsmittels wie das Natriumsalz von Äthylen-diamin-tetraessigsäure (EDTA).

Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfah rens erlaubt es in der Mehrzahl der Fälle, auf die Empfindlichkeit eines Patienten gegenüber einem untersuchten Antigen zu schließen, sobald man eine beträchtliche Verringerung der Zählwerte von in Anwesenheit dieses Antigens inkubierten Blutproben im Vergleich mit den Zählwerten unter analogen Bedingungen an einer Kontrollprobe feststellt

Dank der Einfachheit und Empfindlichkeit des ernndungsgetnäSen Verfahrens konnte man bei be stimmten Patienten auch einen offensichtlichen Unter schied zwischen dem, was man als Abwesenheit einer

Degranulation von Basophilcn, insbesondere falls die Zählung an einer Gesamt-Blutprobe vorgenommen wurde, interpretieren konnte und andererseits der deutlichen Empfindlichkeit dieser Patienten gegenüber dem untersuchten Antigen feststellen.

Darüberhinaus wurde es durch das erfindungsgemäße Verfahren möglich, die Natur der Phänomene, die der Ursprung dieser Unterschiede bzw. Verschiebungen darstellte, zu beleuchten und weitere Auskünfte über das Verhalten verschiedener in dem Blut enthaltener Faktoren im Hinblick auf die untersuchten Antigene erhalten. Insbesondere ergibt sich eine weitere Anwendung der Erfindung aus der Feststellung, daß das Plasma in bestimmten Fällen Faktoren enthalten konnte, die im folgenden »blockierende Faktoren« genannt werden und die der Allergen-Basophil-Reaktion entgegenstehen.

Bei dieser Anwendung, bei der man jeweils zu untersuchende Rlutentnahmen einer Inkubation mit verschiedenen Antigenen unter den vorstehend genannten Bergungen unterzieht, und nach der zur möglichen Erzielung einer zumindest teilweisen Degranulation der Basophile in Anwesenheit der entsprechenden Antigene bei gewissen Blutentnahmen notwendigen Zeit eine Zählung der Basophile durchführt, die keine Degranulation eingegangen sind, führt man die genannten Arbeitsgänge doppelt durch, und zwar einerseits an einer Probe des Gesamtblutes und andererseits an einer im folgenden als »gewaschen« genannten Blutprobe, aus der das Plasma vorher entfernt wurde. Von jeder der Blutentnahmen werden die vorstehenden Inkubierungen und Zählungen sowohl an einer Probe des Gesamtblutes als auch an einer gewaschenen Blutprobe durchgeführt, wobei ein eventueller beträchtlicher Unterschied zwischen den erhaltenen Zählungen für jede Blutprobe gleichzeitig die anaphylaktische Empfindlichkeit des Patienten gegenüber dem entsprechenden untersuchten Antigen sowie das Vorliegen von Faktoren in dem Plasma zum Ausdruck bringt, die der Degranulation der Basophile durch das Antigen entgegenwirken.

Tatsächlich kann, da sich die beiden Probentypen voneinander durch die Anwesenheit bzw. Abwesenheit von Plasma unterscheiden, die Beobachtung einer Verschiebung bzw. eines Unterschieds der Ergebnisse nur auf das Plasma zurückzuführen sein, insbesondere auf die Elemente oder Faktoren, die es enthält und die die Basophile, insbesondere die Immunoglobuline der Klasse IgE, die an ihre Oberfläche fixiert sind, gegen den Angriff der genannten Antigene schützen.

Wenn diese Faktoren in dem Plasma der gesamten Blutprobe vorliegen, so wird der Angriff des Antigens in diesen Proben inhibiert und die Anzahl der beobachteten Degranulatkrcen hat keine Bedeutung mehr im Hinblick auf die tatsächliche degranulierende Wirkung des Antigens.

Tatsächlich ist die Anzahl der in der gewaschenen Blutprobe beobachteten Degranulationen repräsentativer für die tatsächliche Schädlichkeit der untersuchten Antigene im Hinblick- auf die Basophile, da ihrer Einwirkung nicht durch die Faktoren entgegengewirkt wird, die bei dieser Art von entnommenem Blut in dem Plasma vorliegen.

Weisen dagegen die erhaltenen Zählwerte von Proben von gewaschenem Bhit und von dem Gesamtbhrt der gleichen Probe keine beträchtliche Differenz auf, so kann hieraus auf die Abwesenheit von das zu untersuchende Antigen blockierenden Faktoren in dem Plasma des Bluts des untersuchten Patienten geschlossen werden, was selbstverständlich dann gilt, wenn der Vergleich der erhaltenen Zählungen an Proben und Kontrollproben der gleichen Blutentnahme durchgeführt wurde, die in Abwesenheit dieser Antigene (oder in ihrer Anwesenheit, jedoch in Abwesenheit von Kalzium, was im folgenden noch diskutiert wird) inkubiert wurden.

Ein erster beträchtlicher Vorteil der vorstehenden

in Durchführungsform der Erfindung liegt darin, daß man in der Praxis Vergleiche wegfallen lassen kann, wie sie bisher bei den zu untersuchenden Antigenwirkungen und Kontrollantigenen notwendig waren, insbesondere falls es sich um keine Allergene für den Patienten, dem

ι-, die Blutprobe entnommen wurde, handelte, um die Existenz einer anaphylaktischen Reaktion dieses Patienten im Hinblick auf die zu untersuchenden Antigene auszuschließen.
Allgemein gesehen besteht die Probe des gewaschenen Bluts aus einer aus Zellen, insbesondere Erythrozyten und Leukozyten bestehenden Suspension in einem isotonischen, mit den Zellbestandteilen verträglichen Puffer. Anders ausgedrückt substituiert der isotonische Puffer in der Probe des gewaschenen Bluts das Plasma de^r Gesamtblutprobe. Vorteilhaft enthält dieser isotonische Puffer außerdem Bestandteile wie Kohlenhydrate, insbesondere Glukose und Proteine, um die Zellbestandteile in der gewaschenen Probe des Blutes in einem Milieu zu halten, das dem ähnelt, in dem sich die

in Zellbestandteile des Gesamtblutes befinden.

Vorteilhaft weist der Puffer einen pH-Wert in der Größenordnung von 7,4 bis 7,6 auf und basiert auf (Tris-hydroxymethyl)-aminomethan.

Er enthält gegebenenfalls auch eine geringe Menge

ji eines antikoagulierenderi Mittels wie Heparin und EDTA. Das EDTA weist unter anderem einen Stabilisierungseffekt der Reaktionen auf, macht das Blut unkoagulierbar, verhindert Zellaggregationen und die Abscheidung von Zellen an den Wänden der Untersu-

4n chungsröhrchen. Auch das Heparin trägt zu diesen Funktionen bei und schützt das EDTA vor der Chelatbildung mit zugefügtem Kalzium. Es versteht sich, daß man diese Bestandteile austauschen kann und zwar in dem Maße wie sie die gleichen 1-jnktionen

4i übernehmen können.

Vorteilhafterweise greift man auf eine Gesamtblutprobe zurück, die tatsächlich aus einer wiederhergestellten Gesamtblutprobe besteht, die durch Abtrennung der Zellbestandteile und des Plasmas aus einer ursprünglich

so von der zu untersuchenden Blutentnahme stammenden Probe unter Bedingungen erhalten wurde, die identisch mit den zur Herstellung der gewaschenen Blutprobe sind, wobei die so abgetrennten Zellbestandteile anschließend erneut mit dem Plasma vereint werden.

Das zur Bildung der gewaschenen Blutprobe verwendete Volumen an Puffer ist gleich dem vorher von den Zellbestandteilen abgetrennten Plasmavolumen.

Die Abtrennung der Zellbestandteile und des Plasmas in den erwähnten Fraktionen kann natürlich auf verschiedene, an sich bekannte Weisen erfolgen, insbesondere durch Zentrifugieren, wobei die Zeflbestandteüe der verschiedenen Proben gegebenenfalls mit dem gleichen Puffer gewaschen werden, die vom Plasma befreiten, schließlich erhaltenen Zellbestandteile anschließend mit den Plasmamengen, von denen sie abgetrennt win Jeu, wieder vereint werden, um Proben des Gesamtbhits zn ergeben und mit Volumina an isotonischem Puffer vereint werden, die gleich den

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vorher abgetrennten Plasmavolumina sind, um die Proben des gewaschenen Bluts zu ergeben. '

Bei einer oben erwähnten weiteren Ausführungsform der Erfindung nutzt man die Tatsache aus, daß die Degranulation der Basophile unter der Einwirkung bestimmter Antigene nur in Anwesenheit von Kalzium erfolgen kann.

Der Vergleich der so erhaltenen Ergebnisse erlaubt die Unterscheidung einer anaphylaktischen Sensibilität im Hinblick auf das untersuchte Antigen von jeder anderen möglichen Sensibilisierungsform der in Betracht gezogenen Basophile. Insbesondere kann eine an lediglich in Anwesenheit von Kalzium inkubierten Proben beobachtete Degranulierung nur eine Sensibilität der Basophile gegenüber anderen Faktoren als dem zu untersuchenden Antigen ausdrücken.

Das Nichtauftreten einer Degranulierung in den in Anwesenheit von lediglich dem Antigen untersuchten Proben erlaubt es, gekoppelt mit der Beobachtung der Degranulation der Basophile in Anwesenheit des gleichen Antigens, jedoch in Anwesenheit von Kalzium, die anaphylaktische Sensibilität des Patienten, von dem die Blutproben stammen, in bezug auf dieses Antigen zu bestätigen. Umgekehrt zeigt eine Degranularion der Basophile in Anwesenheit von lediglich dem Antigen und in Abwesenheit von Kalzium eine Toxizität des Antigens gegenüber den Basophilen auf, die nicht über das anaphylaktische IgE-System verläuft Diese Toxizität kann auf mehreren Faktoren beruhen, je nachdem, ob es sich um die Anwesenheit von Verunreinigungen oder Zersetzungsprodukten usw. in dem Milieu handelt

Die vorstehenden Beobachtungen zeigen die Vorteile, die sich durch das erfindungsgemäße Verfahren ergeben, und zwar sowohl im Hinblick auf die empfindlichere Einsatzmöglichkeit der Untersuchungen, als auch im Hinblick auf die Sicherheit der Diagnose.

Die Antigene, die den zu untersuchenden Blutproben zugesetzt werden, können im gelösten Zustand vorliegen. Eine bevorzugte Anwendungsform der Basisallergene betrifft jedoch kleine Röhrchen oder Platten und Mikroplatten sowie schälchenartige »Gefäße, wobei diese Röhrchen oder Schälchen vorbestimmte Mengen der verschiedenen Allergene im Trockenzustand enthalten. Die Mengen entsprechen den später gewünschten Verdünnungen in den in die Höhlungen oder Küvetten eingebrachten Blutproben. Die Einbringung der Allergene in diese Röhrchen oder Küvetten kann in jeder bekannten Weise erfolgen, beispielsweise ausgehend von Suspensionen oder Lösungen dieser Allergene, die vorher in die Röhrchen oder Küvetten eingebracht wurden, durch Lyophilisiercn oder Verdampfen des Lösungsmittels.

Auf diese Weise können die Diagnosen von Allergien rasch durchgeführt werden. Es genügt in der Tat, in jedes der Röhrchen oder Küvetten eine vorher bestimmte Blutprobe, beispielsweise mittels einer Mikropipette, einzubringen, die Inkubation des Blutes in Kontakt mit den Allergenen bei geeigneter Temperatur und Reaktionsdauer in einem oder mehreren dieser Röhrchen oder Küvetten durchzuführen, die Degranulation der Blutbasophile zu bewirken, soweit diese zu einer derartigen Reaktion in Anwesenheit des entsprechenden Allergens geeignet sind, und darauf in jedes der Röhrchen oder Küvetten ein ebenfalls vorher bestimmtes Volumen des erfindungsgemäßen Reagens zuzusetzen und schließlich eine Zählung der Basophile in jeder der Küvetten unter den vorstehend angegebenen

Bedingungen durchzuführen.

Um die vorstehend erwähnten Vergleiche zwischen dem Gesamtblut und dem gewaschenen Blut durchführen zu können, kann vorteilhaft ein Teil der Antigene bereits assoziiert mit einer Menge an Kalziumsalz vorliegen, die zur Degranulation der Basophile in der in die Höhlungen oder entsprechenden Küvetten eingebrachten Blutprobe notwendig ist Vorteilhaft sieht man in der Platte oder Mikroplatte für das Antigen eine

ίο Reihe von Höhlungen oder Küvetten vor, die jeweils die steigenden Dosierungen des gleichen Antigens erhalten, um die Herstellung von ansteigenden (oder absteigenden) Verdünnungen zu ermöglichen. Es wird auf diese Weise möglich, nicht nur das Vorhandensein einer

is möglichen Sensibilität eines Patienten im Hinblick auf ein gegebenes Antigen festzustellen, sondern auch das Sensibilitätsausmaß der Basophile im Hinblick au^f dieses Antigen festzustellen.

Es sei festgestellt, daß das in den folgenden der

Erläuterung der Erfindung dienenden Beispielen verwendete Blut über reinem Heparin gesammelt wurde (10 Einheiten Heparin pro ml Blut in siukonisierten Plastikröhrchen). Vor der Durchführung der Versuche wurde das Blut entweder in Eis oder unter Bewegung gehalten, um eine unspezifische Aggregation der Leukozyten zu vermeiden.

Beispiel 1 Herstellung des Färbungsreagens

Man vermischt 30 ml 95%iges Äthanol mit 70 ml destilliertem Wasser und fügt anschließend 75 mg Toluidinblau (wie dem von K und K,Lab.Plainview, NY, USA, erhältlichen) zu. Man bewegt diese Mischung bis zur völligen Auflösung. Anschließend bewegt man weiter und fügt 400 Microliter Eisessig zu, wodurch der pH-Wert der Lösung auf 3,4—3,6 gebracht wird. Diese Lösung wird 48 Stunden später Filtriert Das Filtrat kann während mehrerer Monate bei Raumtemperatur kon serviert werden. Jedoch ist zur Verringerung der Verdampfung des Äthanols eine Aufbewahrung bei 4°C bevorzugt. Es ist auch günstig, die Lösung etwa alle zwei Monate zu nitrieren.

Beispiel 2

Metachromatische Färbung und Zählung der Blutbasophile

Man gießt 0,50 bis 1 ml Blut (vom Menschen oder

so Kaninchen) in ein 10 Einheiten Heparin pro ml oder 25 Microliter 0,2 m-Natrium-EDTA vom pH-Wert 7,4 enthaltenden Röhrchen. Man verdünnt darauf diese Blutprobe im Neunfachen ihres Volumens mit dem Färbereagens von Beispiel 1, wodurch sich ein pH-Wert in der Größenordnung von 4,5 ergibt

Die Mischung wird anschließend vorsichtig bewegt und man beginnt nach 4 bis 5 Minuten mit der Zählung der Basophile, was in üblicher Weise in der Kammer \ eines Hämozytometers durchgeführt wird.

Man kann in gleicher Weise mit geringerem Volumen, beispielsweise 10 μΙ Blut (entnommen von einem Finger des Menschen) arbeiten. Zu 90 μ des am Boden eines Mikroröhrchens vom Typ »Rhesus« enthaltenden Reagens fügt man .10 μΙ Blut und zählt die roten Flecken,

b5 die sich bei der metachromatischen Färbung der Basophile wie im vorstehenden Falle ergeben.

Man erhält bei menschlichem Blut und Kaninchenblut folgende Ergebnisse.

Beim Menschen:

23 bis 70 Basophije pro mm³ Blut (12 Proben), was bei einem mittleren ± einem Abweichungsstandard von 44 ± 8 entspricht

Beim gesunden Kaninchen:

298 ± 23Basophilepromm³Blut(38 Proben).

Die vorstehend beschriebene Technik ermöglicht es auch, die anderen Leukozyten zu zählen, wenn man bei einem höheren pH-Wert arbeitet Insbesondere stellt man fest, daß bei progressiver Erhöhung des pH-Werts nach und nach die Kerne der kleinen Lymphozyten, anschließend die größere Lymphozyten, die Monozyten und schließlich die polynuklearen Leukozyten blau gefärbt werden.

Man erhält die höheren pH-Werte entweder durch Arbeiten mit einem Reagens, das weniger Essigsäure enthält oder aber durch Zusatz von Natronlauge zu dem Reagens vor dem Vermischen des Reagens mit der zu untersuchenden Blutprobe.

Beispiel 3 Untersuchung der Wirkung von Allergenen

Man bringt in zwei Reihen von Röhrchen eine bestimmte Blutmenge (250 bis 500 Microliter) ein. Man fügt ansteigende Mengen des zu untersuchenden Antigens in die Röhrchen der ersten Reihe und ansteigende Mengen des Kontrollantigens, gegenüber dem der Patient nicht sensibel ist, zu. Nach vorsichtigem Bewegen inkubiert man den Inhalt der Röhrchen 10 Minuten bei 37° C Man fügt darauf eine derartige Natrium-EDTA-Menge zu, daß man schließlich eine 2 * ΙΟ-⁴ m-Lösung erhält Das EDTA unterbricht die Reaktion und vermeidet die spätere Aggregation der Zellen. Die Anfärbung kann nunmehr innerhalb der folgenden sechs Stunden beispielsweise durch Entnahme von jeweils 10 Microliter Blut aus den Röhrchen und vermischt jede dieser Proben mit 90 Microliter des Färbungsreagens durchgeführt werden. Man führt anschließend eine Zählung der Basophile wie vorstehend ausgeführt durch. Beispielsweise werden in der folgenden Tabelle die erhaltenen durchschnittlichen Zählungen von Basophilen am Blut von zwei Patienten A und B nach Inkubieren in Anwesenheit von Pollen einerseits und Penicillin andererseits aufgeführt. Die Zählung in Anwesenheit von Pollen ist in der ersten waagrechten Reihe aufgeführt und die in Anwesenheit von Penicillin in der zweiten waagrechten Reihe der Tabelle. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Patient A allergisch gegen Pollen bzw. Blütenstaub ist, wohingegen der Patient B allergisch gegen Penicillin ist

Tabelle

55

Pollen Penicilin

7 50

Beispiel 4

50 12

Verwendung der Mikroplatten zur Untersuchung der Einwirkung von Allergenen

Ansteigende Verdünnungen des zu untersuchenden Antigens in mit Proteinen, beispielsweise 0,01 bis 0,1% menschlichem Serumalbumin, angereichertem destillier-

f>5 ten Wasser werden in die Küvetten von Mikroplatten des Typs Terasaki gefügt Das flüssige Lösungsmittel wird verdampft Die Mikroplatten sind fertig zur Anwendung. Man fügt 10 Microliter Blut in jede der Küvetten der Platte, bewegt und fügt die Mikroplane während IG Minuten in eine feuchte Atmosphäre von 37°C Das Blut wird anschließend in die trockenes EDTA enthaltenden Kapillarröhrchen eingebracht und rasch in die Küvetten ausgestoßen. Man fügt darauf 90 Microliter des Färbungsmittels in jede der Küvetten und führt die Zählung der Basophile wie vorstehend beschrieben durch. Die Zählung kann in unter der Bezeichnung »Fuchs Rosenthak-Zellen bekannten Zellen durchgeführt werden.

Anstelle des Allergens kann jegliches degranulierendes Mittel untersucht werden. Man kann so die Degranulation von Basophilen in Anwesenheit eines anti-IgE-Antiserums bewerten, was eineu weiteren Parameter für die allergische Reaktivität des Erkrankten liefert

Die gesamte Reaktion kann an dem »Gesamt«-Blut oder an dem zweimal mit einem Tyrode-Puffer oder einem anderen isotonischen Puffer gewaschenen Blut durchgeführt werden. Bringt man die zur Degranulation des Gesamt-BIuts und gewaschenen Bluts notwendigen Mengen an Allergen ein, so kann man das Vorhandensein von »blockierenden« Faktoren in dem Plasma bestimmen, d.h. an Faktoren, die das Antigen verbrauchen und die sehr wichtig in der Pathologie der Allergie sind.

Beispiel 5

In der Figur wird eine Mikroplatte dargestellt

Sie umfaßt eine Vielzahl von in acht Reihen mit den Buchstaben A bis h bezeichneten und in 12 Reihen, die mit den Ziffern 1 bis 12 versehen sind, angeordneten Küvetten.

Die mit den Buchstaben A und H versehenen horizontal angeordneten Höhlungen enthalten beispielsweise eine Dosis eines Kalziumsalzes ohne Antigen, die dazu bestimmt ist, Kontroll-Inkubations-Lösungen herzustellen, wie sie in der vorstehenden Beschreibung erwähnt wurden.

Die Höhlungen der sechs weiteren Reihen B bis G enthalten absteigende Dosierungen an Antigen, die die spätere Durchführung von Antigenverdünnungen ebenfalls in absteigenden Konzentrationen ermöglichen. Beispielsweise enthalten die Höhlungen der Reihe B Dosierungen, die es ermöglichen, zu einem späteren Zeitpunkt Verdünnungen von ΙΟ-⁵g Antigen zu erzielen, die Reihe C Dosierungen, die spätere Verdünnungen von 10~⁶ g Antigen und die Reihen D, E, F und O jeweils Dosierungen, die Verdünnungen von 10-', 10-» 10-* bzw. lO-io Antigen ermöglichen. Selbstverständlich stellen diese Dosierungen lediglich Beispiele dar und können je nach dem verwendeten Antigen variieren.

Die Küvetten der Spalten 1 bis 12 enthalten alle das gleiche Antigen (mit Ausnahme der die Reihen A und H bildenden Küvetten). Eine derartige Platte oder Mikroplatte ermöglicht daher den Vergleich der Zählung von nicht-granulierten Basophilen, die von sechs verschiedenen Blutproben stammen, nach der Inkubation der gewaschenen und von den gleichen Entnahmen stammenden Gesamtblutproben, in Anwesenheit von absteigenden Antigenverdünnungen, bei-

spielsweise den vorstehend angegebenen. Beispielsweise empfangen die Höhlungen der Spalten 1,3,5,7 9 und 11 bestimmte Volumina von Gesamtblutproben, die von sechs unterschiedlichen Blutentnahmen stammen, und die Küvetten 2,4,6,8,10 und 12 empfangen die gleichen Volumina an gewaschenem Blut, die von den gleichen Entnahmen stammen.

Die zweite Platte oder Mikroplatte enthält Präparate des gleichen Antigens in den entsprechenden Küvetten, in jedem Falle jedoch ohne Kalzium. ι ο

Nach der Inkubation der gesamten Platte während 10 Minuten bei 37" C werden vorbestimmte Volumina der Kflvetteninhalte aus jeder Höhlung der Mikroplatte entnommen und es werden Zählungen an jeder Probe, insbesondere unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt

Arbeitet man nach der beschriebenen Arbeitsweise, insbesondere mit verschiedenen Antigendosierungen (jeweils hinsichtlich der Paare der Höhlungen 1,2; 3,4; 5, 6; 7, 8; 9,10 und 11, 12), so ist es nicht nur möglich, die Degranulatioft in zwei entnommenen Proben, ausgehend von bestehenden Höhlungen einer Spalte der Mikroplatte in Anwesenheit des Antigens je nach dessen Aktivität zu bestimmen, sondern auch die Degranulations-Intensität zu bestimmen, die es auf die untersuchten Proben ausüben kann. Diese Intensitäten werden dann als der Wert des Verhältnisses der Antigenen-Dosis zum Anteil der Basophile ausgedrückt, die eine Degranulation eingegangen sind.

Es versteht sich, daß man auch Mikroplatten mit wesentlich größerer Anzahl an Höhlungen herstellen kann als die im vorstehenden Beispiel beschriebene.

Man kann auch »gemischte« Platten oder Mikropfatten verwenden, wobei jede dieser Platten oder Mikroplatten ansteigende Dosierungen unterschiede eher Antigene enthält Beispielsweise kann eine derartige Platte sechs unterschiedliche Antigene aufweisen, die jeweils die Kolonnenpaare 1,2; 3,4; 5,6; 7,8; 9, 10 und 11, 12 besitzen. Eine derartige Platte oder Mikroplatte ermöglicht daher den Vergleich der Zählungen von nicht degranulierten Basophilen in Proben (von Gesamtblut bzw. gewaschenem Blut), die von einer einzigen Blutentnahme stammen, jedoch in Anwesenheit von sechs zu untersuchenden Antigenen. Beispielsweise erhalten die Spalten 1,3; 5, 7; 9 und 11 vorherbestimmte Volumina an Gesamtblut und die Küvetten 2,4; 6,8; 10 und 12 die gleichen Volumina an gewaschenem Blut, das von der gleichen Blutentnahme stammt

50

Beispiel 6 Herstellung der Mikroplatten gemäß Beispiel 5

Man verwendet Lösungen der folgenden Zusammensetzung:

Lösung 1:	200 mg
Ca Cl₂,6 H₃O	200 mg
MgCMH₂O	100 mg
Menschliches Serum-Albumin	100 ml
Destilliertes Wasser

der Reihen A und H 10 Microliter der Lösung 1 ohne Antigen ein.

Man bringt darauf in die Küvetten der Reihen B, C, D, E, F und G Dosierungen des zu untersuchenden Antigens, verdünnt in 10 MicroHtern der Lösung 1 ein, die dazu geeignet sind, später Verdünnungen des Antigens in den zu untersuchenden Blutproben zu ergeben, die in die Küvetten in einem adäquaten Volumen von jeweils gleichen Verdünnungen, beispielsweise ΙΟ-⁵,10-^fi, ΙΟ-⁷, ΙΟ-⁸, ΙΟ-⁹und 10-'°eingebracht werden.

Man stellt in gleicher Weise entsprechende Platten oder Mikroplatten her, die zur Aufnahme der Antigene, jedoch ohne Kalzium, bestimmt sind, wobei man in gleicher Weise vorgeht wie für die ersten Platten, jedoch die Lösung 2 anstelle der Lösung 1 einsetzt

Man läßt die Lösungen über Nacht bei 37° C verdampfen und erhält so erfindungsgemäße Mikroplatten. Sie können mit einer Haut aus einem adhäsiven Kunststoffmaterial bedeckt werden, die zum Zeitpunkt der Anwendung abgezogen wird.

Vorbereitete Röhrchen, die dazu geeignet sind, das zu untersuchende Blut aufzunehmen, wobei diese Röhrchen insbesondere mit einer Menge an Antikoagulans und insbesondere Heparin und EDTA derart ausgekleidet sind, daß eine Koagulation der Proben, die zum Zeitpunkt der Anwendung eingebracht werden, verhindert werden kann, können mittels einer Lösung auf der Basis von Äthylen-diamin-tetraessigsäure und/oder Heparin hergestellt werden, wobei man die Lösung in den Röhrchen bei 37° C verdampfen läßt Beispielsweise kann man eine Lösung verwenden, die in 100 ml destilliertem Wasser enthält:

3,7 g Dinatrium-EDTA, 4,3 g Tetranatrium-EDTA, 0,4 g Heparin.

Puffer-Waschlösung, die vorteilhaft in beispielsweise auf das 1Ofache lyophilisierten oder konzentrierten Zustand in Form einer Ampulle oder ähnlichem zur Aufbereitung mit dem destillierten Wasser vorliegt, kann beispielsweise folgende Zusammensetzung auf-

Lösung 2:

Die gleiche Losung wie Lösung I, jedoch ohne Kalzium- und Magnesiumsalze.

Zur Herstellung einer Platte oder Mikroplatte zur Aufnahme jedes der zu untersuchenden Antigene in Anwesenheit von Kalzium bringt man in jede Höhhing

weisen:	3,03 g
(Hydroxymethyl)-aminomethan,	7,00 g
Tris-Puffer	0370 g
NaCl
KCI	1,00 g
Glukose (D-Glukose	0,040 g
+ wasserfreie Glukose)	0,46 g
Reines Heparin	0,54 g
Dinatrium-EDTA	240 g
Tetranatrium-EDTA
Menschliches Serum-Albumin	I₁OOOn
destilliertes Wasser
zur Ergänzung auf

Beispiel 7

Sichtbarmachung einer anaphylaktischen Reaktion, insbesondere einer allergischen Reaktion eines Erkrankten mit Hilfe einer Mikroplatte gemäß Beispiel 5

a) Entnahme der Blutproben

5 ml Blut werden dem Patienten entnommen und in eines der vorstehend definierten Röhrchen eingebracht Das Röhrchen wird in eine Vorrichtung eingesetzt, die eine sanfte Bewegung seines Inhalts bis zur Durchführung des Versuchs ermöglicht

b) Herstellung der Gesamtblutproben und der gewaschenen Blutproben

Man entnimmt dem genannten Röhrchen zwei Blutproben von ImI. Man zentrifugiert bei 800g während 10 Minuten bei Raumtemperatur und markiert an den Röhrchen das obere Niveau des Plasmas nach dem Zentrifugieren,

Man vervollständigt dün Inhalt der Röhrchen mit einem Gesamtvolumen von 4 ml Waschpuffer und trennt den Waschpuffer durch Zentrifugieren ab. Die Wäsche wird vorteilhaft wiederholt und nach der endgültigen Abtrennung wird der Bodensatz eines der Röhrchen unter leichtem Schütteln in dem Plasma suspendiert, von dem es abgetrennt worden war, bis das Originalniveau der Gesamtblutprobe wiederhergestellt ist, während der Bodensatz des anderen Röhrchens in dem zur Waschung verwendeten Puffer bis zum Originalniveau des entsprechenden Plasmas aufgefüllt wird, um die Fraktion des gewaschenen Blutes zu bilden.

c) Inkubierung auf der Mikroplatte

Entnahmen von 10 Microlitern der genannten Proben von Gesamtblut und gewaschenem Blut werden in die Höhlungen jeder der Mikroplatten eingefülK, die das Antigen enthalten, dessen Einwirkung auf die Proben man untersuchen will d. h. die Proben des gewaschenen Blutes werden in die vertikal aufgereihten Höhlungen 2, 4, 6, 8, 10 und 12 und die des Gesamtblutes in die Höhlungen 1,3,5,7,9 und 11 eingefüllt

Das in jeder Höhlung eingebrachte Blutvolumen wird abgesaugt und erneut mit der Mikropipette sanft eingebracht, um eine gute Vermischung sicherzustellen und die nicht bedeckte Platte wird anschließend in einen feuchten Ofen von 37° C während 10 Minuten eingebracht

d) Anfärbung

Schließlich werden 90 Microliter des vorstehend beschriebenen Farbstoffs in jede Höhlung eingebracht, wobei die Vermischung der anfärbenden Lösung und des Blutes durch Bewegen mittels Ansaugen und Zurückführen mit Hilfe einer Mikropipette sichergestellt wird.

e} Ablesung

Die Mischung in jeder Höhlung wird entnommen und in die Zellen eines Hämozytometers, beispielsweise dem unter dem Namen »Fuchs Rosenthalw-Zelle bekannten eingefüllt, worauf die Zählung unter dem Mikroskop durchgeführt wird.

Die Rückschlüsse, die man aus dem Vergleich der Anzahl der in Anwesenheit von einem oder mehreren Antigenen beobachtet Degranulationen mit den Ergebnissen in Anwesenheit von Antigenen, die keine Degranuiation bewirken, im Hinblick auf Kontrollversuche ziehen kann, die in dem vorstehend beschriebenen Beispiel in den Küvetten A und H hinsichtlich der alleinigen Anwesenheit von Kalzium und in den Küvetten im Bereich von D bis G der Mikroplatte, hergestellt mit dem Antigen, jedoch in Abwesenheit von Kalzium, durchgeführt werden, wurden bereits im vorstehenden erwähnt

Unter Verwendung der ansteigenden Anteile an Antigenei> in den verschiedenen Reihen B und G kann man auch ausgehend von den in Anwesenheit eines diese die Granulationen bewirkenden Antigens beobachteten Ergebnissen jeweils Kurven für die Änderung der Anzahl der beobachteten Degranulationen in Funktion der Verdünnungen aufstellen, woraus sich auch file Möglidikeit ergibt, Informationen über den Schädlichkeitsgrad der untersuchten Antigene oder das Sensibilitätsausmaß der Basophile des Patienten gegen über diesen Antigenen zu erhalten.

Hat man einmal diejenigen der Verdünnungen in Anwesenheit von Kalzium aufgestellt, die zu einem minimalen Degranulationsgrad führen, so kann man gegebenenfalls auch die Vergleiche der vorstehenden Art zur eventuellen Beobachtung des Verhaltens der Basophile in den Zellen der Küvetten der anderen Mikroplatte, die die gleichen Antigenverdünnungen, jedoch in Abwesenheit von Kalzium, enthalten, einschränken.

Wie bereits erwähnt, beziehen sich die /orstthenden Ausführungen auf spezielle Beispiele für Ausführungsformen der Erfindung, ohne eine Einschränkung darzustellen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Färbung von Basophilen, die nicht degranuliert sind, sowie gegebenenfalls von anderen, in einer Probe eines biologischen Mediums, vorzugsweise in einer Blutprobe, enthaltenen Leukozyten, mit einem wäßrigen Reagens, das ein metachromatisches Färbemittel enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die im nicht fixierten Zustand vorliegende Probe ein Reagens einwirken läßt, das pro 100 ml 30 bis 250 mg des metachromatischen Färbemittels, 20 bis 50 mf eines zur Fixierung von Leukozyten und Basophilen geeigneten Alkohols, unter 1 ml einer Säure mit auflösenden Eigenschaften für Erythrozyten und als Rest Wasser enthält, und dabei die Anteile der Probe ^! und des Färbemittels so wählt, daß der ρ H-Wert der Mischung von Probe und Färbemittel zwischen etwa 3 und etwa 5 liegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Reagens als metachromatisches Färbemittel Toluidinblau, als Alkohol Äthanol und als Säure Essigsäure enthält

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagens verwendet, das pro Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält:

75 bis 60 ml destilliertes Wasser,

25 bis 40 ml Äthanol,

30 bis 100 mg Toluidinblau und
150 bis SOOmI Eisessig derart, daß der pH-Wert des Reagens zwischen 3 und 5 liegt

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagens verwendet, das pro Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält:

etwa 70 ml destilliertes Wasser,

etwa 30 ml absolutes Äthanol,

etwa 70 mg Toluidinblau,
. etwa 400 ml Eisessig derart, daß der pH-Wert des Reagens in der Größenordnung von 3,4 bis 3,6 liegL

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 b:.^4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Blutprobe eine aus dem Gesamtblut bestehende Probe verwendet, ή

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Blutprobe eine aus gewaschenem Blut bestehende Probe verwendet

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Mischung von Blut und Reagens auf einen Wert in der Größenordnung von 4,5 einstellt, wobei dieser pH-Wert entweder durch einfaches Vermischen des Reagens mit der Blutprobe in den für diesen 5ί pH-Wert geeigneten Mengenanteilen oder durch Einstellen mittels eines zusätzlichen basischen oder sauren Reagens regelt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gesamtblut mit dem flüssigen «> Reagens auf das 9fache seines Volumens verdünnt wird.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Diagnose von anaphylaktischen Sensibilitäten und insbesondere von Allergien, dadurch gekenn- f>5 zeichnet, daß man verschiedene Fraktionen der gleichen Blutprobe jeweils vor Einwirkenlassen des Reagens mit einem Mittel, dessen degranulierende Wirkung auf Basophile nachgewiesen werden soll, wie einem Antigen oder einem Allergen, und einem Kontrollantigen inkubiert und nach dem Einwirkenlassen des Reagens die Basophile in jeder Fraktion zählt

tO. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Blutprobe, an der die Inkubation mit einem Antigen durchgeführt wird, halbiert in eine Gesamtblutprobe und eire plasmafreie gewaschene Blutprobe und jede dieser Proben in Anwesenheit des gleichen Antigens inkubiert und die anschließend durchgeführten Zählungen an der Gesamtblutprobe und der gewaschenen Blutprobe durchführt

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die plasmafreie, gewaschene Blutprobe durch Trennung des Plasmas und der Zellbestandteile der vom Patienten entnommenen Blutprobe, insbesondere durch Zentrifugieren, Gewinnung und Waschen der Zellbestandteile mit einem isotonischen Puffer und erneuten Suspendieren dieser gewaschenen Zeiibestandteiie in einem isotonischen Puffer, herstellt, und daß man die Gesamtblutprobe aus einer unter den gleichen Bedingungen behandelten Probe bildet, wobei jedoch die Zellbestandteile erneut mit dem Plasma vereint werden, aus dem sie ursprünglich abgetrennt wurden.

12. Verfahren gemäß Anspruch U₁ dadurch gekennzeichnet, daß man einen isotonischen Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 bis 7,6 verwendet, der Glukose und Proteine, insbesondere menschliche Serumalbumine, enthält, um die Zellbestandteile des Blutes in einer Glukose- und Proteinumgebung zu halten, die der des Gesamtbluts nahekommt.

13. Verfahren gemäß Ansprach 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer die Base (Tris-hydroxymethyl)aminomethan verwendet.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Puffer für die Wäsche verwendet, der auch antikoagulierende Substanzen, wie Heparin und EDTA, enthält.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation gleichzeitig an Gesamtblutproben und an gewaschenen Blutproben, deren möglicher Gehalt an Kalzium vorher insbesondere durch Chelatbildung maskiert wurde, durchführt und zwar einerseits in Anwesenheit des zu untersuchenden Antigens, jedoch in Abwesenheit von Kalzium und andererseits in Anwenseheit eines Kalziumüberschusses, jedoch in Abwesenheit des Antigens.

16. Reagens zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis !5, gekennzeichnet durch eine Lösung, die pro 100 ml enthält:

20 bis 50 ml eines zur Fixierung von Leukozyten und Basophilen geeigneten Alkohols.

80 bis 50 ml Wasser,

30 bis 250 mg eines metachromatischen Färbemittels und unter 1 ml einer Säure mit auflösenden Eigenschaften für Erythorzyten derart, daß der endgültige pH-Wert des Reagens zwischen 3 und 5 liegt.

17. Reagens gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es frei von Mineralsalzen ist, die eine wäßrige Lösung isotonisch machen können.

18. Reagens gemäß Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das metachromatische Mittel aus Toluidinblau besteht, der Alkohol Äthanol ist und die Säure Essigsäure ist.

19. Reagens gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es pro IOC ml enthält:

75 bis 60 ml destilliertes Wasser,

25 bis 40 ml Äthanol,

30 bis 100 mg Toluidinblau und
150 bis 600 ml Eisessig derart, daß der pH-Wert des Reagens zwischen 3 und 5 liegt.

20. Reagens gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es pro 100 mi enthält:

etwa 70 ml destilliertes Wasser,

etwa 30 ml absolutes Äthanol,

etwa 70 mg Toluidinblau und

etwa 400 ml Eisessig derart, daß ä".r pH-Wert des Reagens in der Größenordnung von 3,4 bis 3,6 liegt.