DE2446005A1

DE2446005A1 - Nonapeptidamid-derivate und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2446005A1
Application number: DE19742446005
Authority: DE
Inventors: Masahiko Fujino; Tsunehiko Fukuda; Susumu Shinagawa
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1973-09-29
Filing date: 1974-09-26
Publication date: 1975-04-03
Also published as: DK148305C; NL179289B; DK148305B; HU173783B; NO143218C; GB1434694A; NL930015I2; ES430495A1; FI61028B; NL7412837A; NL930015I1; FI61028C; NO1994010I1; ATA772674A; FR2245375A1; SE420717B; SE7412140L; FI284774A; CH603559A5; US4008209A

Description

DR.-1NG. VON KREISLER Dfc.-ING. SCHDNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLiR DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLDPSCH DIPL.-ING. SELTiNG

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

24. September Kl/Br.

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27, Doshomachi 2-chome , Higashi-ku, Osaka (Japan).

. Nonapeptidamid-Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nonapeptidamid-Derivate mit starker ovulationsinduzierender Wirksamkeit, welche die allgemeine Formel.

₁ ₂₃R^ (l)

vorin R₁ Tyr oder Phe, R^ D-Leu, D-IIe, D-NIe, D-VaI, D-Nva, D-Abu, a-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr oder D-Met, R₃ Leu, lie oder Nie und R^ Alkyl mit 1 bis 3* Kohlenstoffatomen, welches gegebenenfalls durch eine Hydroxylgruppe substituiert sein kann, bedeuten und Verfahren zu. deren Herstellung.

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Im folgenden werden die Aminosäuren und Peptide mit Abkürzungen beizeichnet, welche auf diesem Gebiet allgemein üblich sind und vom Committee on Biochemical Nomenclature of IUPAG-IIIB empfohlen bzw. bewilligt wurden. Die Aminosäuren haben, wenn nicht anders angegeben, jeweils L-Konfigurat ion.

Nachstehend sind Beispiele für die im folgenden verwendeten Abkürzungen angeführt:

Abu

OC-Aibu

Arg

BOG

BzI

DCC

GIy

His

HONB

HOSu

IBOC !

He

Leu :

Nie J

Nva j

Met :

OMe :

OBzI :

ONB :

OSu !

Phe :

Phg :

Pro J

(Pyr)Glu j

: a-Amxnobuttersäure

: a-Aminoisobuttersäure

{ Arginin

5 t-Butoxycarbonyl

ϊ Benzyl

t N,N¹«Dicyclohexylcarbodiimid

: Glycin

! Histidin

i N-Hydroxy-5-*iorbornen-2,3-dicarboximid

; N-Hydroxysuccinimid

ι Isobornyloxycarbonyl

ι Isoleucin

! Leucin

! Norleucin

Norvalin

Methionin

Methyl-Ester

Benzyl-Ester

N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid~Ester

N-Hydroxysuccinimid-Ester

Phenylalanin

OC-Phenylglyc in

Prolin

Pyroglutaminsäure

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Ser	• _._ __ ...» _. .	- Serin
Thr	• •	Tlir eonin
Tos	• •	Tosyl
Trp	:	Tryptophan
Tyr	S	Tyrosin
VaI	S	Valin
Z	S	Benzylox'ycarbonyl

h
Als Beispiele für die mit H bezeichnete gerad-

oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen, welche gegebenenfalls durch eine Hydroxylgruppe
substituiert sein kann, seien Methyl, Äthyl, n-Propyl,
i-Propyl, Hydroxymethyl, 1-Hydroxyäthyl, 2-Hydroxyäthyl, 2-Hydroxy»n-propyl, 3-Hydroxy-n-propyl, 2 ₉ 2-Dihydroxy-±~

propyl od.dgl. genannt.

Es ist schon lange bekannt, daß der Hypothalamus Faktoren enthält, welche auf höheren? Ebene die Sekretion von tropischen Hormonen durch die Hypophyse steuern» Kürzlieh wurde folgend auf die Isolierung eines Thyrotropin
freistitsenden Hormones (TEH) ein Hormon, welches die
Freisetzung von Gelbkörperbildung induzierendem,
"luteinisierend©«!¹' Hormon fördert, in reiner Form aus
Schweinen und Schafen extrahiert» Es erwies sich als ein " Dekapeptid der Formel (Pyr)Glu—His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GIy-NH-(A.V.Schally et al_s Biochem« Biophys.Res» Comman., Vj, 133^ (l97l): R. Guillemin et al, Proc. Nat. Aoad. Sei., U.S.A., 6£, 2?8(l972));

Aufgrund dieser Erkenntnis wurde eine Anzahl von ähnlichen Peptiden hergestellt, an welchen biologische
Untersuchungen vorgenommen wurden. Dennoch wird die physiologische Wirksamkeit der Peptide durch selbst geringfügige Modifikationen der oben angeführten Aminosäureausammensetzung stark beeinträchtigt und die oben angeführte

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chemische Struktur ist als wesentlich zur Entfaltung der maximalen physiologischen Wirksamkeit anzusehen (A.V.Schally et al, Biochem. Biophys. Res.Commun, Jf, 366 (1972)).

Es ist nun gelungen, die Nonapeptidamid-Derivate der Formel (i) herzustellen und es wurde überraschend gefunden, daß diese Verbindungen eine wesentlich stärkere ovulationsinduzierende Wirkung besitzen als die in der Natur vorkommenden Decapeptide« Weiters wurde gefunden, daß diese Verbindungen durch ihre Wirkung auf die Hypophyse der Ausscheidung von luteinisierendem und follikelstimulierendem Hormon fördern. Es wurde weiters gefunden, daß diese Verbindungen nicht nur als Medikamente für den menschlichen Gebrauch, z.B. für die Diagnose der Hypophysenfunktion, gegen Gonadotropinraangel und für die Therapie von AisenorrhSe^ sondern auch als tierärztliche Medikamente, vor allem für die Tierzucht, verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen unerwarteten Erkenntnissen«,

Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung neuer Nonapeptidamidderivate der allgemeinen Formel (l) mit starker ©vulationsindusierender Wirkung.

Weiters ist Ziel übt vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zuv Herstellung der Nonapeptidamid-Derivate der allgemeinen Formel (l).

Die Ziele der vorliegenden Erfindung sind im folgenden näher erläuterts

Das Nonapeptidamidderivat der allgemeinen Formel (l) wird nach einem Verfahren hergestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist , daß eine Reaktionskomponente (a) L-Pyroglutaminsäure oder ein Peptidfragment, welches eine N°»endständige L-Pyroglutarainsäure-Einheit (d.h. (Pyr)Glu-) aufweist, und gleichseitig von dort an die oben angeführte

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Aminosäuren-Sequenz aufweist, mit einer Reaktionskomponente (b) - einer Aminkomponente, welche dem übrigen Rest des Nonapeptidamidderivates der allgemeinen Formel (l) entspricht - kondensiert wird, wobei nach Bedarf die beiden Reaktionskomponenten (a) und (b) durch eine oder mehrere Gruppen geschützt sein können, wonach die gegebenenfalls vorhandenen Schu'tzgruppen wieder entfernt werden.

Die Reaktionskomponente (a) ist daher eine Pyroglutaminsäure oder ein Peptidfragment mit einer N-endständigen L-Pyroglutaminsäure-Einheit, welches gleichzeitig von dort an die Aminosäuren-Sequenz der allgemeinen Formel (l) aufweist und die mit der Reaktionskomponente (a) zu kondensierende Reaktionskomponente (b) ist eine Amin-Komponente, welche dem Rest des Nonapeptidamidderivates der allgemeinen Formel (i) entspricht. Dabei können die Reaktionskomponenten (a) und (B) gegebenenfalls geschützt sein.

Aus der nachstehenden Tabelle sind grundsätzliche Kombinationen der Reaktionskomponenten (a) und (b) ersichtlich.

Tabelle

N^Reagen^s Kombina-\ tion \	(A)	(B)
1	(Pyr)GIu-OH	H-His-Trp-S er-R-j-Rg- R^-Arg-Pro-HH-R,
2	(Pyr)Glu-His-OH	H-Trp-Ser-R-j-Rg-R^- Arg-Pro-NH-R^
3	(Pyr)Glu-His- Trp-OH	H-Ser-Rj-Rg-R^Arg- PrO-HH-R₄

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Kombina~\ tion \	(A)	(B)
4	(Pyr)Glu-His- Trp-Ser-OH	H-Rj-Rp-R^-Arg-Pro- KH-R₄
5	(Pyr)Glu-His» TrP-Se^-R₁-OH	H-R₂~R₅-Arg-Pro~ NH-R₄
6	(Pyr)ßlu-His- Trp-Ser-R-j-Rg- OH	H-R₅-Arg-Pro-M-R₄
7	(Pyr)Glu-His- Trp-Ser-R-j^-Rg- R₃-OH	H-Arg-Pro-NH-R₄
8	(Pyr)Glu-His- Trp-Ser-R^Rg- R-~Arg-0H	H-PrO-NH-R₄
9	(Pyr)Glu-His- Trp-Ser-R^Rg- R^-tArg-Pro-OH	NH₂-R₄

Es war weiterhin bekannt, daß eine geschützte Glutamy!gruppe der allgemeinen Formel

R-Co-CH₀-CH^CH(NH₉)CO-

, (II)

worin R„ eine Alkoxygruppe, wie z.B„ Methoxy, Äthoxy, i-Propoxy N-Fropoxy, n-Biatoxy, od.dgl., eine Aralkyl«- oxygruppe, wie z.B. Benzyloxy, od,dgl. oder Amino bedeutet, leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umgewandelt werden kannt

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.N V_7

und zwar durch Behandlung mit einer Base, wie z.B. Ammoniak od.dgl., oder einer Säure, wie z.B. Essigsäure od.dgl., und daß die Gruppe der allgemeinen Formel (il) in dieser Hirfsicht der L-Pyroglutamylgruppe selbst äquivalent ist* Auf Grund des erfindungsgemäßen. Verfahrens ist anzunehmen, daß das L-Pyro glut amyl (d.h. (pyr)Glit-) der Heaktionsko mponen'te (a) nicht nur die L-Pyro glut amyl«· gruppe selbst, sondern auch die geschützte L-Glutamylgruppe der Formel (il) umfaßt. Wenn das (Pyr)Glu- der Reaktionskomponente (a) die Grupe der Formel (il) bedeutet, kann die Gruppe (ix) nach an· sich bekannten Verfahren leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umgewandelt werden.

Die erfindungsgemäße Kondensatiojisreaktion kann nach jedem beliebigen, für die Herstellung von Peptidbindungen üblichen Kondensationsverfahren durchgeführt werden» Dazu gehören das Azid-, Chlorid-, Säureanhydrid-, gemischte Säureanhydrid-, DCC-, aktive Ester-Verfahren₉ das Verfahren, mit Woodwardreagens K, das Carbodiimidazol-Verfahren, das Oxidations-Reduktions-Verfahren (The Peptides, VoI„ 1 (l966)_s Schröder and Lubke, Academic Press, New York, TJeS.A..), das DCC/HONB-Verfahren (BE-PS 796 399).

Vor der Kondensationsreaktion können die Carboxyl- und Aminogruppen,welche an der beabsichtigten Reaktion nicht teilhaben sollen, geschützt werden,euch ist es möglich, die an der Reaktion teilnehmenden Carboxyl- und/oder Aminogruppen' nach an sich bekannten Verfahren zu aktivieren. Die Carboxylgruppen im Ausgangsmaterial können in Form von Metallsalzen (wie z.B. von Natrium- oder Kaliumsalzen) oder von Estern (wie z.B. Methyl-, Äthyl-, Benssyl-,

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p-Nitrobenzyl-, tert.-Butyl- oder tert.-Amyl-Estern) geschützt werden.

Als Schutzgruppen für die Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien können alle bei der Herstellung von Peptiden üblichen Schutzgruppen für Aminogruppen, wie z.B. Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, od.dgl., verwendet werden. Die Hydroxylgruppe des Serins kann durch eine herkömmliche Schutzgruppe wie Benzyl, tert.-Butyl und andere ätherbildende Gruppen geschützt werden. Die Hydroxylgruppe dee Tyrosine kann ebenfalls durch BenJsyl, tert.-Butyl und andere ätherbildende Gruppen geschützt werden. Die Guanidingruppe des Arginine kann mit Gruppen wie z.B. Nitro, Tosyl, Carbobenzoxy, Isobornyloxycarbonyl oder Adamantyloxycarbonyl geschützt werden. Als Beispiele für aktivierte Carboxylgruppen in den Ausgangsreagentien sind die entsprechenden Säureanhydride, Azide und aktiven Ester (Ester mit Alkoholen, wie z.B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanmethylalkohol, p-Nitrophenol, N-Hydroxy-5-Norbornen-2,3-Dicarboxinid, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxybenztriazol od.dgl.), zu nennen. Die aktivierten Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien können z.B. in Form des entsprechenden Phosphorsäureamides vorliegen.

Aus der folgenden Tabelle sind Beispiele für Kombinationen derartiger Formen von Carboxyl- und Aminogruppen in den Materialien (a) und (b) ersichtlich

Tabelle 2

Korabina-

tions-

beispiele

Reaktionsxnittel

(A)

(B)

COOH

NH,

COOH

NH.

1*
2

frei geschützt aktiviert geschübzt frei geschützt

geschützt

frei

geschützt

frei ! frei j aktiviert'

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Anmerkung": Ια dem rait * bezeichneten Pall ist im Reaktions— • system vorzugsweise ein Dehydratisiei*ung3mxttel wie z.B. ein.Cärbodiimidreagenz wie Dicyclolieacylcarbodiimid vorhanden. Eine AusfünrungsdForzn der vorliegenden Erfindung kann wie folgt dargestellt werden:-

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(Pyr)Öiu-His

h Ser-BL -»Sehwtsgruppe Kondensat ion (ss ,Bi

dcg/honb)

NO,

ia-His-Trp«Ser-R₁ »Schutzgruppe

Bzitfenrang der Schuts gruppe ( ss · B..' katalyt i

sehe Reduktion mit Pd-aKatalysator)

(Pyr)Glu-His»Trp-Ser-R

Entfernung der Schutzgruppe
(z.B. in Gegenwart von
HBr)

„NO,

Kondensation (z,B. in Gegenwart von DGG-HONB oder DCC/1-Hydroxybenztriazol)

(Pyr)GIu-His«>Trp-.Ser-R -R₂-R₃-

Entfernung der Schutzgruppe (z.B. in Gegenwart von SnCl„ in Ameisensäure/Wasser, katalytisch^ Reduktion mit Pd-Katalysator oder HF)

(Pyr)Glu<^His-Trp-Ser-R₁-R₂-R₃-

V ·

Diese Reaktion kann in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt werden, welches als geeignet für die Kondensationsreaktion zur Herstellung von Peptiden bekannt ist. So z.B. können wasserfreies oder wässeriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichlormethan, Tetrahydrofuran und geeignete Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden.

Die Reaktionstemperatur wird innerhalb eines Bereiches gewählt, welcher für Reaktionen zur Bildung von Peptidbindungen geeignet ist, d«h. üblicherweise innerhalb eines Bereiches von etwa -20 C bis etwa +30 C. Die Ausgangsmaterialien (geschützten Peptide) der erfindungsgemäßen Verbindungen können leicht nach Festphase-Syntheseverfahren hergestellt werden.

Nach Beendigung der gewünschten Kondensationsreaktion können die gegebenenfalls ira Produkt vorhandenen. Schutzgruppen nach an sich bekannten "Verfahren wieder entfernt werden. Als Beispiele für solche Verfahren sind katalytische Reduktion in Gegenwart eines Katalysators wie Palladiumschwarz, Palladium auf Kohle, Platin od.dgl., Solvolyse mit Fluorwasserstoff, Trifluoressigsäure od.dgl· _t und Reduktion mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak zu nennen.

Das so hergestellte Peptid der allgemeinen Formel (i) kann aus dem Gemisch der Reaktionsprodukte nach für die Gewinnung von Peptiden bekannten Verfahren wie Extraktion, Verteilung, Säulenchromatographie od.dgl. gewonnen werden.

Die Peptide der allgemeinen Formel (i) können

auch in Form eines Salzes oder einer Metallkomplexverbindung gewonnen werden.

Beispiele für Säuren, welch· mit Peptiden der allgemeinen Formel (i) Salze bilden können, sind anorga-

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nische Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, (rauchende) Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefel· und Phosphorsäure und organische Säuren wie Ameisen-, Essig-, Propion-, Glycol-, Milch-, Brenztrauben-, Oxal-, Maloxi-, Bernstein-, Malein-, Fumar-, Anthranyl-, Zimt-, Naphthalinsulfon- oder Sulfanilsäure.

Als Metalle, welche mit den Peptiden der allgemeinen Formel (l) Metallkomplexverbindungen bilden können, sind u.a. Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer imdEisen zu nennen. Eine derartige Metallkomplexverbindung kann nach an sich bekannten'Verfahren wie z«B. durch Umsetzen eines Peptides der allgemeinen Formel (l) mit dem Hydroxid oder Oxid eines Metalles der oben angeführten Art bei einem pH—Wert von etwa 6 bis 8 hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide der allgemeinen Formel (l) besitzen LH-rRH-Wirkung (d.h. die Wirkung eines ein luteinisierendes Hormon freisetzenden Hormons) Txnd können daher die Ausscheidung von LH (luteinisierendem Hormon) und FSH (foilikelstimulierendem Hormon) fördern. Die Polypeptide der allgemeinen Formel (i) werden daher als Medikamente zur Ovulationsförderung bei Frauen und Tieren wie Ratten, Schafen, Schweinen, Kühen, Stuten, Wachteln oder Hennen verwendet. Sie können auch für andere pharmazeutische Zwecke verwendet werden, für welche bisher herkömmliche LH-KH-, LH- und FSH-Präparate eingesetzt wurden.

Da die LH-RH-Wirkung der Polypeptide der allgemeinen Formel (l) etwa 5 his 6o mal größer ist als jene der

wdm
in der Natur vorkommen'', kann die Dosierungsmenge für jede Anwendung auf der Basig des oben angeführten Vielfachen bestimmt werden, wobei auch andere Faktoren wie der Empfänger der Verabreichung und die Krankheitsart in Betracht gezogen werden. Eine geeignete Dosierungsmenge kann z.B. innerhalb eines Bereiches von etwa 2 ng bis

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2 ng pro Kilogramm Körpergewicht und Tag gewählt werden.

Die Polypeptide der allgemeinen Formel (i)

werden üblicherweise nicht peroral, sondern durch Injektion, rektal oder vaginal verabreicht, obgleich sie in manchen Fällen auch peroral verabreicht werden.

Ala Beispiele für geeignete Dosierungsformen sind Injektionen, Suppositorien, Pessare und Pulver zu nennen. Die Injektionen können durch Lösen von etwa 10 Y bia 100 γ des Polypeptides der allgemeinen Formel (i) in 1 ml physiologischer Salzlösung hergestellt werden. Die Polypeptide der allgemeinen Formel (i) können auch unter Zugabe von Mannitol als .Hülle in lyophilisierte Ampullenprodukte übergeführt werden und sind in dieser Form jederzeit als Injektionen verwendbar.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsstoffe eingesetzten Peptide, können nach jedem beliebigen, für die Herstellung von Peptiden geeigneten Verfahren oder nach einem angepaßten Verfahren hergestellt werden.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.

In den Beispielen bedeuten folgende Abkürzungen den Rf-Wert bei Dünnschichtchromatographie an Silikagel mit den folgenden Lösungsmittelsystemem

Rf : ChloroformsMethanol:Essigsäur©, 9 t 1 s 0,5

Rf : Äthyl-acetatsPyridinsEssigsäure-: Wasser, 3O $ 10 s 3 t Rf : n-Butanol-sXtnylacetatsEssigsäKX'egWasser,! s 1 S- 1 S

Nachstehend werden die-in eless Beispielen verwendeten, eingetragenen Handelsnatasn

Biogel P-2? Materialien für Gelfiltration, hergestellt von BIO-RAD, U.S.A.

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Sephadex LH-20: Verestertes Dextran-Gel, hergestellt

Pharmacia Fina Chemicals, Schweden Amfoerlite XAD-Ss Polystyrolharz

Amberlite IR-45? schwach basisches AnionenaustauscheriiarK Araberlite XRA-41O: stark basisches Anionenaustaxischerliara Amberlite CG-4iOs stark basisches Anionenaustauscherharz Amberlite CG-45s schwach basisches Anionenaustauscherhara

Alle diese Harze werden von Rohm & Haas Co. Ltd USA, hergestellt.

Beispiel 1;

Herstellung von (Pyr)Glu-His~Trp-Ser-Ty:r«.D~Leu«- Leu-Arg-Pro-NH-CH₂CH„

a) Herstellung von Z-D~Leu-Leu-.Arg(N0₂)~Pro~NH-

In 50 ml Biehlormethan werden 1,58 g Z-D-LeU-OH(C)I) und 1,2 g HONB gelöst und nachher 2„8 g H-Leu-Arg(N0₂)-Pro-

NE~CH„-CH„ sis ge geben«, Die Mischung wird auf O⁰C gekühlt, . «a J

Kacliiier werden l₉h g BCC zu der Mischung zugegeben and es wird dann die Mischung bei Raum tempera tür 8 Stiaisdea lang gerührt. Der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexy!harnstoff wird abfiltriert und. das Filtrat unter -vermindertem Bnicli ζητ Trockene ©±sage©ngt„ Der Rückstand wird ±n 15O ml Ätfeylacetat gelSat, di© Läsuing wird zweimal mit k $«.±g©:r tfäss©~ V±g<BT NatriunnhydrogencarbonaJäösung und zweimal mit Hasses·

Über NatE'&isiBsialfat getrocknet und sclall©B2icfe νβηα1ιιάθ3"&@Σ!ΐ De¹HsIs star Trocken® esisageeimgi

wird aus Atiaylaestat/PetroleuaibenaiiJ werctea 3_e6 g des* gewöwsachtesi VerbisiduKg 8

Bleaietaranalys© für

Berechnete G 56*3t H 7*59 Ή 17,91 Gefundent C 5^^©S R 7,82 N 17t69

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-

Leu-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH In 30 ml 25 $-igem HBR-Eisessig werden 3,6 g Z-D-Leu-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH gelöst und die Lös^mg wird bei Raumtemperatur 50 min lang gerührt. Zu der Lösung werden 300 ml Äther zugegeben und der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert. Nach dem· Trocknen wird der Niederschlag in 50 ml Wasser gelöst und über eine (2,5 χ 20 cm)-Kolonne, Amberlite CG-410 (freie Base), geleitet. Die Srvulf; .wird, mit 30 ^c/n-±g wässrigem Methanol gut gewaschen. Der Effluent und die Ifaschwässer werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Entfernung des Methanols eingeengt, wonach Lyophilisierung erfolgt. Es. werden 3»t g der freien Base von H-D-Leu-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH„ erhalten.

Rf²=O,24; Rf³=O,68. In 4 ml Dimethylformamid werden 228 mg des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes und 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH gelöst und danach werden ihh mg HONB zugegeben. Die erhaltene Mischung wird auf -10 C gekühlt und es werden 90 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird dann bei -10 C zwei Stunden lang, bei 0 C h Stunden lang und bei Raumtemperatur weitere h Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wird danach zur Entfernung des entstandenen Dicyclohexy!harnstoffes filtriert» Nach der Zugabe von Äthylacetat zu dem Filtrat wird dabei der erhaltene Niederschlag abfiltriert. Dieser Niederschlag wird getrocknet und in 20 ?£-ig wässerigem Äthanol gelöst. Die Lösung wird über eine Kolonne, Amberlite XAD-2 (200 Mesh, 3 x 20 cm), geleitet und danach erfolgt eine Gradienten-Elution mit 20 $>-igem Äthanol und absolutem Äthanol (jeweils 300ml). Das gewünschte Produkt ist in den (260 ~ 36O ml)-Fraktionen enthalten. Diese Fraktionen werden bei vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert.

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Es werden "^hG rag des gewünschten Produktes erhalten. ⁵ -38,28° (c=O,1 in 0,5 $ Methanol); Rf²=O,235,

c) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CHo

In 20 ml 60 fe-lgev wässriger Ameisensäure werden 300 mg der gemäß (b) erhaltenen N0„«-Verb in dung gelöst und danach werden 6θΟ mg SnCIp . HpO zugegeben. Die Mischung wird 2 Stunden lang auf 80 bis 85⁰C erhitzt und danach unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird mit 50 ml warmem Wasser (80 C) extrahiert und der Extrakt filtriert. Das erhaltene Filtrat wird über eine (3 χ 20 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2 (200 Mesh), geleitet. Nach dem Waschen mit Wasser erfolgt Gradienten-Elution mit Wasser und absolutem Äthanol (jeweils höO ml)„ Das gewünschte -Produkt ist in den {150 - 260 ml)^Fraktionen enthalten. Die Fraktionen werden •vereinigt und unter vermindertem Druck zur Entfernung des Äthanols eingeengte Das Konzentrat wird über eine (2 χ 33 ein)-Kolonne, Carboxymethylcellulose, geleitet und danacii erfolgt Gradienten-Elution mit 0,005M bis 0,2M Ansiraoniumaceiat (pH 6,8). Das gewünschte Peptid befindet sich in den (330 - 520 ml)-Fraktionen» Die Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Es werden 282 mg eines weißen flaumigen Pulvers erhalten«.

ö -32,66° (caO,545 in 5 & wässriger Essigsäure); sO, 10, Hf³ =Ο,75·>
Aialsiosäisreasialyse (Hydrolyse mit δ η HGl in Gegenwart von Tfcioglycolsäure)* His, 1,00; Arg, 0,96; Trp, 0,96; Ser, 1,00; GIu₃, !,CO; Pro, 1,0h; Leu, 2₉ΟΟϊ Tyr, 1,00.

Beispiel 2s

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-a-Aibu-Leu-Arg-Prο-NH-CH₂-CH,

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a) Herstellung von Z-a-Aibu-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃

In 7 ml Dimethylformamid werden 0,6 g Z-a-Aibu-OH und 0,9 g Η-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CHg-CH gelöst. Die Lösurlg wird auf 0⁰C gekühlt, es werden 0,71 g l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-c'arbodiimid (ein wasserlösliches Carbcfimid) zugegeben und danach wird 12 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand in 100 ml Chloroform gelöst. Diese Lösung wird mit k 56-iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und IN Salzsäure gewaschen, mit Wasser nachgewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet· Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wird mit Äther behandelt, wobei ein Pulver erhalten wird, das abfiltriert wird. Das Pulver wird aus Äthylacetat/Äther umgefällt und es werden hJ3 mg des gewünschten Produktes erhalten.
Fp.s 1O4-1O7°C,

Ζά_7²β -^5,8° (C=O,55 in DMF). Rf¹=0,50 Elementaranalyse für C- H OgN₉.0.5H₃O Berechnet: C 5^,28 H 7,50 N 18,38 Gefunden: C 5**,32 H 7,32 N 17,97

b) Herstellung von B0C-Tyr{Bzl)-a-Aibu-Leu-Arg(N0₂)-PrO^-NH-CH₂-CH

In 3 ml 25 $£-igem HBR-Eisessig werden hZ3 mg Z-a-Aibu-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH„ gelöst und die Mischung wird dann bei Raumtemperatur 4-0 min lang gerührt, wonach 50 ml trockener Äther zugefügt wird. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxyd in einem Exsjkkator getrocknet· Das erhaltene Pulver wird in 3 ml DMF gelöst und die Lösung mit 0,24 ml N-Äthylmorpholin neutralisiert,, wonach aui? 0 C gekühlt wird. Hernach erfolgt die Zugabe von 557 mg BOC-Tyr(Bzl)-0H und 298 g HONB und schließlich werden noch

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-4t·.

280 mg DCC zugegeben.. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 6 Tage lang gerührt. Der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexy.lharnstoff wird abfiltriert und das DMF unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit 1 N HCl und 4 #-iger Natriumfaydrogencarbonat-Lösung gewaschen, mit Wasser nachgewaschen über Magnesiumsulfat getrocknet und danach unter vermindertem Druck ztu? Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird aus Äthylacetat umgefällt. Ausbeute: 275 mg. Fp. t 127-129°C Dt-J^ -27,6° (c=O,54 in DMF), Rf¹=Ö,60.

Elementar-Analyse für ^ci^^H6₇°₁₀ ^N ₁₀·^H2° Berechnet: C 57,82 H 7,6l N 15,32 Gefunden: C 58,32 H 7»51 N 15,10

c) Herstellung von BOC»Ser-Tyr(Bzl)-cc-Aibu-Leu-Arg(N0₂)^PrO-NH-CH₂-CH₃

In 3 Jnl Trifluoressigsäure, welche 0,1 ml Anisol enthält, werden 250 mg B0C-Tyr(Bzl)-a-Aibu-Leu-Arg(NO₂)-Pro"NH-CH₂-CH-gelöst und diese Lösung wird bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt. Dann werden 30 ml trockener Xther zugegeben und der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 5 ml DMF gelöst und die Lösung mit 0,08 ml N-Xthylmorpholin neutralisiert» Dann werden I50 mg (BOC-Ser-)Trichlorphenylester zugegeben und die Lösung 2 Tage lang gerührt. Das DMF wird abdestilliert und der Rückstand wird mit Xther behandelt, wobei ®±n Pulver erhalten wird. Dieses wird abfiltriert und zweimal aus Äthylacetat umgefällt.

Ausbeute: 100 ragj Fp.: l4O-l42°C (Zersetzung) | /ÖJ^⁵ -34,8 (c»0_e44 In DMF)j Rf¹=0,7^.
Slementaranalyse für C^₇H₇₂O₁₂N .3H₃O Berechnets C 5**t ¹O H 7,58 N 14,84 Gefunden* C 5k,66 H 7,45 N 14,91

S0SSU/11i1

d) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-a-Aibu-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH

In 3 nil Trifluoressigsäure, welche 0,1 ml .Anisol enthält, werden 77 mg B0C-Ser~Tyr(Bzl)-a-Aibu-Leu-Arg(NG₂).~ Pro-NK-CH^-CH- gelöst und die Lösung wird bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt. Dann werden 30 ml trockener Äther zugegeben, der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 3 nil DMP gelöst und die Lösung wird mit 0,21 ml einer 10 $-igen Lösung von N-Äthylmorpholin in DMF neutralisiert. Dann werden zu dieser Mischung 37 mg Kristalle von (Pyr)Glu-His-Trp-»OH zugegeben, die Mischung wird auf -10 C gekühlt, wonach die Zugabe von 21 mg HONB und 30 mg DCC erfolgt. Diese Mischung wird bei 0 C 12 Stunden lang gerührt, danach wird der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylhamstoff abfiltriert und das Filtrat wird sodann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, Der erhaltene Rückstand wird in 20 $-igem Äthanol gelöst und an einer (1 χ 10 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2, adsorbiert. Die Elution wird nach dem Gradienten-Verfahren unter Verwendung von 20 %-igem bis absolutem Äthanol (jeweils 200 ml) durchgeführt. Die Fraktionen, welche das gewünschte Produkt angereichert enthalten, entsprechen den Konzentrationsbereichen des Äthanols von ^O bis 70 f*»

Sie werden gesammelt und danach unter vermindertem Druck ·

i eingeengt und lyophilisiert. Es werden 30 mg des geschützten ' Fonäpeptids (Ef =0,31)erhalten. Unter.Zugabe von 0,1 ml Anisol und 0,1 snl Mercaptoäthanol wird dieses geschützte Uonapeptid mit 3 nil wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt | vnä die Mischung wird danach bei 0 C 6θ min lang gerührt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der entstandene Rückstand wird in 10 ml { Wasser gelöst. Die Lösung wird dreimal mit je 2 ml Äther extrahiert und die wässrigen Schichten werden vereinigt und

S098U/1161

4frf ι, ' ' ' lsi * »

^mamsm ι» ι tift . )

iiber eine (2x4 cm)-Kolonne, Amberlite CG-410 (Acetat-Form), geleitet, welche Kolonne danach mit Wasser gewaschen wird» Der Effluent und die Tfaschlösungen werden vereinigt, ■und über eine Kolonne, Carboxymethylcellulose, und Ain'berlxte XAD-2_? wie in Beispiel 1 beschrieben, geleitet.

Nach Lyophilisierung werden 14 mg eines weißen ■flaumigen Pulvers erhalten.

β ~5^»1° (C=O, 31 in 5 Yo wässriger Essigsäure):

Araioosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure)t His 0,94; Arg 0,97; Trp 0,81; Ser 1,06; GIu 0,97? Pro O₅ 97? Leu 1,03? Tyr 1,03? OC-Aibu 1,00;

Herstelllang von (pyrjGlu-His-Trp-Ser-Phe-D-Leu-Leu-

Arg-Px-o »NH~CH_p-CH_

a) Herstellirag von (Pyr)Glu-»His-Trp-Ser-Phe-OH In 100 ml Methanol werden 4,0 g Z-Ser-Phe-OMe gelöst und dieses wird bei Atmosphärendruck unter Einsatz von 500 mg Palladiumschwarz als Katalysator 1,5 Stunden lang reduziert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Methanol wird dann rasen unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird in 25 ml DMF gelöst und es warden 4,1 g kristallines (Pyr)Glu-His-Trp-OH zugegeben. Die Mischung wird auf -5°C gekühlt, wonach 3₉8 g HONB und 3 g DCC zugefügt werden» Die so erhaltene Mischung wird dasa bei -5 G 2 Stunden^ bei 0 G 2 Stunden lang und zuletzt bei Räumtemperattsr 8 Stunden lang gerührt. Der als Mebenprodukt anfallend© Dicyclohexy!harnstoff wird abfiltriert und das FiItrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthylacetat behandelt und das erhaltene Pulver wird abfiltriß rt (6,7 δ)« Dieses Pulver wird in 30 ml I5 $»igem Methanol/Chloroform gelöst und die Lösung über eine (6 χ 12 cm)»Kolonne,

5098U/1181

Silikagel, welche mit 15 /£-igem Methanolchloroform konditioniert ist, geleitete

Die Elution wird ausgeführt, indem 6OO ml 15 fo-lges Methanol/Chloroform, 1 1 25 $-iges Methanol/ Chloroform und 1 1 30 $-iges Methanol/Chloroform eingesetzt werden. Die Fraktionen zwischen hOO ml der 25 $-igen Methanol/Chloroform-Lösung und 700 ml der 30 $-igen Methanol/ Chloroform-Lösung werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit Äthylacetat behandelt und das entstandene Pulver wird abfiltriert. Es werden 4,2 g des gewünschten Produktes erhalten.
Rf²=O,29

In 20 ml Methanol werden 3t5 S dieses Methylesters suspendiert und bei O C werden 8 ml 1N NaOH zugegeben» Die Mischung wird 1 Stunde lang gerührt und danach mit 8 ml 1N HCl neutralisiert. Das Methanol wird unter reduziertem Druck abdestilliert und es erfolgt danach Zugabe von 20 ml . kaltem Wasser. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gewonnen, mit gekühltem Wasser und danach mit Äthanol/Äther (¹H6) gewaschen und getrocknet. Es werden 2,32 g des gewünschten Produktes erhalten.-

D^>5 -3,3° (e=Q,55 In Eisessig); rAo,61

b) Herstellung von (Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Phe*·])»Lan«

In h ml DMF verd©rs 290 mg fPyx)GIu-Hi3-

Phe-OH und 228 mg H-B-gg gelöst, wonach die Zugabe voss. XkQ seg HONB erfolgt« Bifö Mischung wird auf -1Q⁰C gekühlt und danach werdeis, $0 mg'' ISQO-zugegeben. Diese Mischung w±r,d b@i -1Q⁰G 2-Stunden bei 0°C 3 Stunden lang und letztlich bei Bäumtemperir 5 Stunden lang gerührt, in genau derselben Weise wi© Beispiel 1 beschrieben., wird diese Fieaktionsmischiuig einer

-50.98.14/110.1

Säulen-Chromatographie mit Amberlite XAD-2 unterworfen. Dabei werden Jk2 mg des gewünschten Produktes erhalten. /«-/β⁵ -¹H, 7**° ( c=O, 115 in Methanol); Rf ²=0,265, RfA=O,

In 20 ml einer 60 ^c/o-±gen wässrigen Ameisensäure-Lösung werden 3OO mg des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes gelöst, wonach 600 mg SnCl₂„H₂0 zugegeben werden. Die Mischung wird 2 Stunden lang bei 8Q-85 C stehen gelassen_s wonach sie unter -vermindertem Druck zur Trockene eingeengt wird» Bann wird in geaata derselben Weise, wie in Beispiel beschrieben, das Konzentrat mittels einer Kolonne, Amberlite XAD-2 _t und einer Kolonne, Carboxymethylcellulose₉ gereinigt. Dabei werden 211 mg eines weißen, flaumigen Pulvers erhalten,

ÄJq -38,%9° (ο^α,53₉· in .5 $ wässriger Essigsäure); Rf²»0, 12} ³* '

(Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von ^Ehioglycolaäure); His 1,00» Arg 1₉θ4? trp 0,98? Ser 0,92?

l^OOj Pro I₈OO? heu l₉o4j Phe l_s00i.Tyr 0,98.

von ( Pyr ) G-lu-'His -»Trp-Sar-Tyr-D-Phg-

i
a) Herstfelltmg von Z»D™Fiftg~Leu~ArgCWö^)»Pro-NH~

Jm. eisser Mischung Ύοη 10 ml BirnethyifoirmasHid und SO ml BichloraietfeaiTi werden 58Ο mg Z-D-Phg-ΌΗ wad I₉Ih g L^g(STO₉)-Pro«-ME<°CH_-CH_#:s gelöst „ 2u dieser Miscfeimg %00 rag BOMB nnd tsat©r Eühliang ssit Eis werden mg BSG¹ sKSg©geb©s3e Bie Mischung iiird bsi Ma««teti3p©ratti

lang ges'IHirt wr&a das dabei esatstaaeene Hebeia-» w öic«.el@la©säyl&ara8t©i*f wird abfiltriert _ff wosiaela

n? ,1», X0O s»3L JCt&j^lseetat gelöst _p die ©rlialtene

»it % fS-iges* MatritSffiliyärogeasar&oaat-LiistiBg ransd Wasser

111114/1111

gewaschen, danach über trockenem Natriumsulfat getrocknet und zum Entfernen des Äthylacetats destilliert. Der Rückstand wird aus Äthylacetat/Petroläther umgefällt und es

1 2 werden 1,4 g eines Pulvers erhalten. Rf =0,65; Rf =0,8.3.

£a_J^⁵ -80,2° (c=0,5 in Methanol).

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phg-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH

In 20 ml Essigsäure werden I50 mg Z-D-Phg-Leu-Arg(Np₂)-PrO-NH-CH₂-CH^ gelöst„ Nach Zugabe von 100 mg Palladiums chwa'rz wird bei Atmosphärendruck Wasserstoff gas durch die Lösung geleitet, wobei die Reduktion, stattfindet.

Nach 4 Stunden wird der Katalysator abfiltri«rt und es werden 0,4 ml 1N HCl zugegeben. Die Lösung wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und das erhaltene Konzentrat wird in 20 ml Wasser gelöst undlyophilisiert. Das erhaltene Pulver wird in 8 ml Dimethylformamid gelöst und es werden 0,25 ml 10 $-ige Lösung von N-Äthylmorpholin in Diraethylformamid tropfenweise zugesetzt. Dann werden l4l mg (Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH zugegeben, wonach die Zugabe von 50 mg 1-Hydroxybenzotriazol und letztlich von 4o mg DCC bei -5°C erfolgt.

Die Mischung wird bei -5°C 2 Stunden lang, bei O C weitere 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur letztlich 8 Stunden lang gerührt. Danach wird Äther zur Reaktionsmischung zugegeben, der erhaltene Niederschlag wird filtriert und in 20 ml Wasser gelöst.Die unlöslichen Anteile werden

abfiltriert, das Filtrat über eine Kolonne_e Amberlite TRA-hiö (Acetatform), geleitet, welche Kolonne danach mit Wasser gewaschen wird. Der Effluent und die Waschlösungen werden, vereinigt und über eine (l,5 χ 25 cm)-Kolonne, Carboxymethylcellulose, geleitet. Danach erfolgt die Gradienten-Elution unter Verwendung von Q,005M Ammoniumacetat und 0,175*1 Ammoniumacetat (pH 6,8) (jeweils 3OO ml). Das gewünschte Produkt befindet sich in den (l?0 - 240 ml)-Frak-

S 0 9 8 U / 1 1 81

tionen. Diese Fraktionen werden vereinigt und über eine (2 χ 20 cm)-Kolonne, Ainberlite XAD-2, geleitet. Das dort absorbierte, gewünschte Produkt wird nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von Wasser (25O ml) und Äthanol (28O ml) eluiert, wobei sin die reine Verbindung in den (19O - 2hO ml)-Fraktionen befindet. Das Eluat wird unter vermindert©«! Druck eingeengt und lyophilisiert. Es -werden 110 mg des gewünschten Produktes erhalten. Rf =0,098

, 73·

^-57,0° (c=o j 56 in 5 °/o wässeriger Essigsäure) Äininosäureanalyses (Hydrolyse mit βΝ HGl in Gegenwart von Thioglycolsäure)g His O₉96? Arg 1,θ4? Trp 0,92j Ser O,93i GIu 1,00} Pro 1,00; Leu 1,01; Phg O_?98; Tyr 1,01. Beispiel 5 s
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D~

S'er-Leu-Arg-Pro-NH-CH₀-CH₀

d. J

a) Herstellung von Z-D»Ser»Leu-Arg(N0₂)~Pro-NH~ CH₂-CH₃

In einer Mischung von 10 ml Dioxan und 10 ml Di methylformamid werden 955 rag Z~D-S@r-OH_S 1,82 g H-Leu-Arg-(MOg)-PrO-HH-CH₂-GH₃ und 7S8 mg HONB gelöst. Die Lösung wird auf O⁰C gekühlt und es werden 90? mg DGC zugegeben.

Mischung wird bei 0°C 2 Ständen lang und danach bei

5 Strander* lang gerührt. Das anfallende Nebenprodukt Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das FiItrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Hüclcstand wird in 100 ml Chloroform gelöst. Die ©rnaltene Lösung wird mit O₂5 N HCl und h ^-iger Na^riumhydrogencarbonat-Lösung in der erwähnten Reihenfolge gewaschen5, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther behandelt _s das erhaltene Pulver wird abfil'triert und aus Ithanol/Äther umgefällt. Ausbeute: 2,4 g;

609814/1161

2446Q05

ar

Fp.: 123-126°C (Zersetzung) /α_/^⁷ -49,8° (c=0,5 in Methanol) Elementaranalyse für C- HK₇O₉N .H_0 Berechnet: C 51_t79 H 7,09 N 18,12 Gefunden: C 52,01 H 6,96 N 18,Ok, Rf¹=0,40

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp«Ser-Tyr-D-Ser-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃

In einer Mischung aus 20 ml Methanol und 1 ml Eisessig werden 334 mg Z-D-Ser-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH_ gelöst und unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator wird bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck k Stunden lang katalytisch reduziert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird durch Zugabe von 9,6 ml 0,1N HCl gelöst und lyophilisiert. Das dabei erhaltene trockene Pulver und 280 mg

■ werdjsn^

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH werden in 3 ml DMF gelöst und es/

100 mg 1-Hydroxybenztriazol und O,6l5 ml einer

10 50-igen Lösung von N-Äthylmorpholin in DMF zugegeben·

ο Die Mischung wird auf -5 C gekühlt und ©a werden

dann I65 mg DCC zugegeben'. Die erhaltene Mischung wird bei -5°C h Stunden lang und bei Raumtemperatur 8 Stunden X&Rg gerührt. Das als Nebenprodu&fc anfallende Harnstoffderivat wird abfiltriert und das Filtrat - unt-es*·" veiiatittäert ein "Druck zur Trockene eingeengt· Der erhK.lt*ne Rückstand wird $1% 20 ml Wasser gelöst und die unlgslicheEt J»te&!.e abfiltriert. Das Filtrat selbst wird d&nn &xt£ ein* (lO ml), Amberlite IRA-'ft© fAeetatfoTBt)g 'm&tgmhv*Xi Effluent und die WaschlSaungeit werden vereinigt vmü Übet» eine (1*5 χ 2? cm)-Kolosuie_t

geleitet. Die Elution erfolgt nach~ y

unter Verwendung von Q,.QÖ5M Aflimonimiiiac©tatp«fför ($00 ml)

•503814/1ti1

-%/&■*■

und O,15M Ammoniumacetat (300 Eil). Die erhaltene Verbindung befindet sich in den (280 ml - 322 ml)-Fraktionen. Diese Fraktionen werden vereinigt tand lyophilisiert, wobei 135 mg eines Rohproduktes erhalten werden. Dieses wird in einer kleinen Menge Waseer gelöst und auf eine (l,5 χ 17 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2» srafgegeben. Die Elution wird nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von 5 $-ig wässerigem Alkohol (300 ral) raid So /Ä-ig wässerigem Alkohol (330 ml) durchgeführt. Die (^96 ml - 231 ml)-Fraktionen werde» gesammelt und nach Entfernung des Äthanols durch Destillation lyophilisiert. Ausbeute 62 mg.

Das Produkt wird in 0_f1M wässriger Essigsäure gellist und einer Gelfiltration, auf einer (1 χ 5^ cm)-Kolonne,

LH-20, unterworfea_r Nach Lyophilisierung werden mg dea gewünschten»reinem Produktes erhalten. .

o»^ (C=O₁-S to 3^aß> wässriger Essigsäure) _t

(Hydrolyse nait 6M HCl in Gegenwart von. 13iioerlycolsaure)tHijs I_s00i Arg l,0fcj Trp I₉OO; Ser l_f8lj

l,00| Pro I₈OOj Le« 1₉0%| Tyr 0,96; lthylamin I

Herstellung
ro«NH-CH_o»C

a) HerstellWBg υθϊι Z«©-Äbti-Lew-Arg(WO„)-Pro

β H«L*Bh#As%C5^_a)-P*e-ilB^3fi^*€aK* gelöste ©te SsöeusßS' wirfrl atsf Φ ^ gelsthtit ts^d es we rotere

⁰ 1 Stirn«!© 3.8»g tsa# h&i BasssBtampers'fe^E' 5 StKKden lassg

Öas Ka.rastföi'fSe-rivat i?ls*d abfilferi©i"t und das * wiJPd «»tea? vermisiaesffccaEi Unacls a»r T^ockem Sflelssf&ad värd iß SO θ! Slfelorsfors? ge3,S@t taxad

. Ä

mit IN HCl und einer h "/o-lgen Natriumhydrogencarbonat-Lösiang gewaschen.

Nach dem Waschen mit Wasser wird über Magnesiumsulfa getrocknet und danach unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird danach-mit Ätlaer behandelt, das dabei erhaltene Pulver abfiltriert und aas Äthylacetat/Petroleumbenzin umgefällt. Ausbeuteϊ 489 sag! Fp.: 111-1i4°C.
Za_/J⁶ -51,2° (c=O,6 in Methanol); Rf¹=O_s66

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser»Tyr~D-.Abia~ . Leu-Arg»Prο-NH-CH₂-CH₃

Z-D-Abu-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH^ wird mit 25 $-igem HBr-Eisessig behandelt und mit Äther gefällt»

Der Niederschlag wird über eine Kolonne₉

Amberlite CG-410 (freie Base), geleitet, um HBr Bu entfernen· In 3 "ti DMF werden 220 mg der freien Base des so erhaltenen H-D-Abu-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH_CH„ gelöst und danach werden 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH sowie I50 Big HONB sagegeben. Die Mischung wird auf -10°C gekühlt und 85 mg DCC werden zugegeben. Die so erhaltene Mischung wird bei -10 C 2 Stimden lang und letztlich bei Raumtemperatur 7 Stunden lang gerührt» Zur Reaktionsmischung wird dann Äthylacetat zugegeben und der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert. Dieser Niederschlag wird danach in 20 $~±g@än wässrigen Methanol unter Erhitzen gelöst, die Lösung wis-d. abgekühlt, wobei ein Niederschlag ausfällt-. Dieser wird abfiltriert, Ausbeute 28** mg;Rf²=0,240_} Rf³=0,772. (la beiden Lösungsmitteln enthält das Produkt etwa 10 ?δ Verunreinigungen, welche einen kleineren Rf-Wert aufweisen}-«

In 15 ml 60 5^-iger wässriger Ameisensäure werden. 200 mg des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes gelost, wonach ^00 mg SnCIg.H₃O zugegeben werden. Die Mischung wird dann auf 80 - 85⁰C 2 Stunden lang erhitzt, danach unter· ver-

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mindertem Druck zur Trockene eingeengt und der dabei entstandene Rückstand wird sodann mit 50 ml warmem Wasser extrahiert.

Die unlöslichen Anteile werden dann abfiltriert, das Filtrat über eine Kolonne, Amberlite XAD-2, Carboxymethylcellulose und Sephadex LH-20, in der beschriebenen Reihenfolge geleitet, wonach eine Lyophilisierung erfolgt. Es werden 104 mg eines weißen, flaumigen Pulvers erhalten. ZÖ-Jd^ -^3,6° (c=O,5O in 5 # wässriger Essigsäure), Rf²=O,O8. Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure): His 0,98; Arg 0,96; Trp 0,94; Ser 0,92; GIu 1,00; Pro 1,00; Leu 0,98; Abu 1,00; Tyr 1,00; Äthylamin 1,02.

Beispiel 7:

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH„

a) Herstellung von Z-D-Nva-OH

In üblicher Weise wird H-D-Nva-OH mit Carbobenzoxychlorid in 2N Natriumhydroxid umgesetzt und die dabei entstandene Verbindung wird aus Äthylacetat/Petroleumbenzin umkristallisiert. Dabei werden Nadeln erhalten. Fp.:83-8^ C. Elementaranalyse für C-H₁-O^N L^a-Jρ +12,1

Bereichnet: C62,i4 H 6,82 N 5,57 (c=l,0 in Methanol) Gefunden* C 62,17 H 6,88 N 5,62

b) Herstellung von Z-D-Nva-Leu-Arg(NO_)-Pro-NH-CH₂-CH₃

In 5 ml DMF werden 376 mg Z-D-Nva-OH, 685 mg H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃ und 295 mg HONB gelöst und danach werden bei 0 C 3^0 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird bei 0 C 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur 8 Stunden lang gerührt. Das als Nebenprodukt anfallende Harnstoffderivat wird abfiltriert und es werden 100 ml Äthylacetat zu dem Filtrat zugegeben, die Mischung wird mit 0,5 N HCl

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und 4 $-iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Danach wird die Lösung mit Wasser gewaschen, und über trockenem Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und danach mit Äther behandelt. Das dabei entstehende Pulver wird abfiltriert und zur Reinigung aus Äthylacetat/Äther umgefällt. Ausbeute: 900 mg; Fp.: 1O5-1O7°C (Zersetzung):
/a_7p⁶ -51,2° (c=1 in Methanol); Rf¹=O,6o Elementaranalyse für C^₂Hf ..OqNq
Berechnet: C 55,71 H 7,45 N 18,27 Gefunden: C 55,54 H 7,62 N 18,09

c) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CHo-CH.,

Ausgehend von Z-D-Nva-Leu-Arg(NOg)-PrO-NH-CH₂-CH^ (wie in b) beschrieben, erhalten und (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-0H wird dieselbe Reaktion und derselbe Reinigungsvorgang wie in beispiel 6 b) beschrieben, durchgeführt und es wird die gewünschte Verbindung erhalten.

/ä_/J⁵ -39,8° (c=0,51 in 5 # wäss-riger Essigsäure)? Rf²=O,O94; Rf³=O,74.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure): His 1,00; Arg 0,98; Trp 0,93? Ser O,94| GIu 1,08; Pro 1,02; Nva 0,98; Leu 1,00; Tyr. 0,98; Äthylamin 1,0.4-· .

Beispiel 8:

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-.S©r«-Plie-D-Hva~l«eu«»

₂2₃ a) Herstellung -von 2-~

In 2 ml 25 fS-igem HBr-Eises»±g werd©ss ?20 tag Z-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH₂-CH₃ gelüst wijd ä±e !»mang wird 4o min lang geschüttelt«, Bann werden 2© ml trockeaeff Äther zugegeben und der erhaltene WiederacJilag wird triert. Der Niederschlag wird mit trockenem jliher gut

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■waschen. Banacit wird er über Natriumhydroxid unter vermindertem Druck im einem Exsiccator getrocknet.

Naeli dem Trocknen wird das Produkt in 5 ml DMF gelöst und es werden 250 mg Z-D-Nva-OH zugegeben, wonach die Zugabe von ö_r15 ml Triäthylamin und 200 mg HONB erfolgt. Die Mischung; wird auf 0 C gekühlt, es werden weitere 230 mg DCG zugegeben und danach wird 8 Stunden lang bei Raumtemperatur geriiltjrfci Bann erfolgt die Zugabe von 80ml Äthylacetat und die daran zwiückbleibenden unlöslichen Anteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird mit 1N HCl, h $-iger Natrium hydrogeüGa'£°bosat—Losung und Wasser gewaschen und danach über Natriumsulfat getrocknet.

Es wird dann bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt imd der Rückstand wird mit Petroläther-behandelt. Bas erhaltene Pulver wird aus Äthylacetat/Petroläther umgefällt. Äiisfeeiites 718 mg.
ÄJ^fJ -5t»®® fe=l_f0 in Methanol); Rf¹=0,64

Bleinentaranalyse für C₀₀H-„0οΝ_Λ

33 53 ο 9

Berechnet* C 56,23 H 7,58 N 17,89 Gefunden* O 56* 1% H 7,7© N 17,58

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His~Trp-Ser«-Phe-D-Nva-

₂₃

In 3 E*l 25 ^-igens HBr-Eisessig werden 500 mg Z-0-Kva-Len-Are(HGg)-Pro-NH-CH₂-CH₂-CH. gelöst und die er LiSsttt&g 5® β?&*& lang geschüttelt«, Dann werden 60 ml

Jltiser wxgegel3@ss₈ d@r erhalten© Niedersclilag wird •!»filtriert «ä fe h® ml Masser .gelöste Di© Lösung

ober ©äa© f 1 s 1%. em)«Kolo,iine_; Aroberlite CG-410 8teee}p geleitet ₉ äi® aax&n. mit 3®· ^-igf wässrigem

gewÄflfclaejffi w±rß_e Pea⁵ Effluent uad die Waschwässer ves"«3d85i.{is& ρ wonacls dass Methanol taater vermindert ess lbäesfeä.Hisir'·! wird» Der Rückstand wird und @e weröes 32© Big ύ®τ freien

-.08814/116

Pro-NH-CH₂-CH_-CH_ erhalten. In 2 ml DMF werden 225 mg dieses Produkts und 280 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH

gelöst, wonach die Zugabe von 130 mg HONB erfolgt. Die Mischung wird auf -10°C gekühlt und es werden 87 mg DCC zugegeben. Diese Mischung wird bei -10 C 3 Stunden lang, bei 0°C 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur schließlich 6 Stunden lang gerührt. Dann werden ko ml Äthylacetat zugegeben,

i der dabei entstehende Niederschlag wird'abfiltriert und dann in 30 °ß>~±^ wässrigem Äthanol unter Erhitzen gelöst. Die unlöslichen Anteile werden abfiltriert, das Piltrat wird gekühlt, wobei ein Niederschlag erhalten wird, welcher abfiltriert und mit kaltem Wasser gewaschen und schließlich getrocknet wird. Ausbevite JkO mg. In 20 ml 6o.%-ig wässriger Ameisensäure werden 300 mg des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes gelöst, wonach die Zugabe von 58O mg SnCl₂.H₂O erfolgt. Die Mischung wird dann 2 Stunden lang auf 85 C erhitzt und danach erfolgt ein Einengen zur Trockene unter vermindertem Druck, wonach die Mischung mit warmem Wasser extrahiert wird.

Der Extrakt wird durch Chroniatographie auf Amberlite XAD-2, Carboxymethylcellulose und Biogel P-2 gereinigt. Es werden 170mg des gewünschten Produktes erhalten /ß-_J_O -37,7° (c=O,5O5 in 5 f° wässriger Essigsäure); Rf²= 0,13, Rf³=O,76.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure): His 1,02; Arg 0,98; Trp 0,97; Ser 0,98; GIu 1,02; Pro 1,00; Leu 1,00; Nva 1,02; Phe 0,98. /Beispiel 9:

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abe-Leu-Arg-Pro-NH-CH(CH₃)₂

a) Herstellung von Z-D-Abu-Leu-Arg(NO_?)-Pro-NH-CH(CH₃)₂

5 0 9 8 U / 1 1 6 1

In 3 ml 25 ^o/o-lgem HBr-Eisessig werden 700 mg Z-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH(CH ) gelöst und die Lösung wird 6O min lang heftig gerührt, wonach 50 ml trockener Äther zugefügt werden. Der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, das getrocknete Produkt wird dann in 6 ml DMF gelöst und zu dieser Lösung werden 2ho mg Z-D-Abu-OH zugefügt. Danach erfolgt Neutralisation dieser Lösung mit 0,15 ml Triäthylamin.

Es werden dann 200 mg HONB zugegeben und die

Mischung wird auf 0 C gekühlt, worauf die Zugabe von 230 mg DCC erfolgt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 6 Stunden lang gerührt. Dann werden 100 ml Äthylacetat zugegeben und die unlöslichen Anteile abfiltriert. Das Filtrat wird mit 0,5N HCl und h 56-iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, getrocknet und danach über Natriumsulfat getrocknet. Es wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und mit Äther behandelt. Das erhaltene Pulver wird aus Äthylacetat/ Äther umgefällt. Ausbeute: 725 mg.

° (c05 in Methanol) Rf¹

^ -52,0° (c=0,5 in Methanol), Rf¹ =0,62. Elementaranalyse für Cj₂H₁OqNq Berechnet: C 55,71 H 7,45 N 18,27 Gefunden: C 55,42 H 7,59 N 18,01

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-

Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH(CH )₂

Aus dem wie in a) beschrieben erhaltenen Z-D-Abu-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH(CH )₂ und (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH wird die oben angeführte Verbindung nach ganz demselben Verfahren, wie in Beispiel 5 beschrieben, erhalten. /jxjjjy -41,0 (c=O,62 in 5 fo wässriger Essigsäure); Rf²=0,11; Rf³=O,7^.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure): His 1,00; Arg 0,90; Trp 0,87; Ser 0,97; GIu 1,00; Pi*o 0,94; Abu 1,00; Leu 1,02; Tyr 0,96.

50981 A/1 161

Beispiel 10:

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Prο-NH-CHp-CH_ durch Fest-Phase-Verfahren

a) Herstellung von BOC-Pro-Harz

In 50 ml DMF werden I5 g chlormethyliertes Harz (Chlorgehalt 9,^5 mMol) eingebracht, wonach die Zugabe von 6,1 g BOC-Pro-OH und 3,33 ml Triäthylamin erfolgt. Die Mischung wird 5 Tage lang geschüttelt. Das Harz wird .danach filtriert, gut mit DMF, Äthanol, Wasser, Äthanol und Äther in der genannten Reihenfolge gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 17,55 S

Die Aminosäureanalyse ergibt, daß dieses Harz 0,31^ m/Mol/g BOC-Pro enthält.

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(BzI)-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-Harz

Das Reaktionsgefäß eines automatischen Peptid-Synthetisators wird mit 3,1^5 g BOC-Pro-Harz (wie in a) beschrieben erhalten) gefüllt. Das Harz wird mit Dichlormethan innerhalb von 12 Stunden angequollen, wonach Aminosäuren im folgenden Zyklus zugeführt wurden.

Dichlormethan (3 min χ 3) —> 50 # Trifluoressigsäure/Dichlormethan (lO min und 30 min) ■ ■ Dichlormethan

(3 min x 3) ^ Äthanol (3 min χ 3) > Dichlormethan

(3 min χ 3) *■ 10 # Triäthylamin/Chloroform (lO min) *·

Chloroform (3 min χ 3') * Dichlormethan (3 min χ 2)

BOC-Aminosäure-anhydrid (synthesiert aus BOC-Aminosäure und

DCC auf herkömmliche Weise) (30 min und 60 min) > Acety—

lierung (Dichlormethan, Triäthylamin und Essigsäureanhydrid)

(l Stunde) *■ Dichlormethan (3 min χ 3) ((Pyr)Glu-OH

allein wird direkt mit DCC in DMF kondensiert).

Danach wurde das Harz mit Äthanol, Chloroform,* Dimethylformamid und Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 3,89 g.

*) (Simadzu Seisakusho,Modell APS-80Ö)

5098U/1161

c) Herstellung von (Pyr)Glu-TIis (Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr-(BzI)-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-CH₂-CH

In 20 ml Methanol werden 3f52 g des wie in to)

beschrieben erhaltenen Harzes suspendiert und die Suspension wird auf 20 C gekühlt. Äthylamin, welches durch Erhitzen von 80 $-ig wässrigem Athylamin in einem warmen Wasserbad erhalten wurde, wurde nach Durchleiten durch Natriumhydroxid in die Suspension eingebracht.. Nach genügender Sättigung wurde die Mischung 40 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, Das Harz wird durch Filtration gewonnen und das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther behandelt und es werden 835 mg eines pulvrigen Rohproduktes erhalten. Dieses Rohprodukt enthält einen großen Anteil einer Verunreinigung, welche vermutlich der Methylester ist. Daher werden 503 mg dieses Produktes in Methanol/DMF (jeweils 8 ml) gelöst und in derselben Weise wie oben beschrieben, wird Athylamin in die Lösung eingeleitet. Die Lösung wird 34 Stunden'lang gerührt, wobei der Methylester verschwindet.

Die Lösung wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und der dabei erhaltene Rückstand wird mit Äther behandelt. Das ei-halterae Pulver wird abfiltriert, Ausbeute: 465 mg.

d) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D~ Leu-Leu-Arg-Prο-NH-CHg-CH«

In Gegenwart von 0,4 ml Anisol und 0,4 ml MercaptoätharcoX, werden 327 »8 mg des wie in c) beschrieben erhaltenen Rohproduktes in 8 ml wasserfreier HF gelöst. Die LcSsung wird bei 0 C eine Stunde lang gerührt, wonach sie unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt wird. Der Rückstand wird in 20 ml Wässer gelöst und' die unlöslichen Anteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird dann über eine (l_f5 χ 20 cns)-Kolonne, Ansberlite IRA-410 (Acetatform) ge-

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leitet und dann auf chromatographischem Wege an Carboxymethylcellulose und Amberlite XAD-2 gereinigt. Dann wird das so erhaltene Produkt einer Gelfiltration auf einer Kolonne, Sephadex LH-20, unterworfen. Es werden 98 mg des gewünschten Produktes erhalten.

JjLJj' -32,0° (c=0,52 In 5 fo wässriger Essigsäure); Rf²=0,10; Rf³=O,75.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure): His 0,98; Arg 1,00; Trp 0,87; Ser 0,90; GIu l,O2; Pro l,O2; Leu 2,01; Tyr 0,98; Äthylatnin 1,10.

Beispiel 11; .

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH

a) Herstellung von BOC-D-KIe-Leu-Arg(NO₃)-Pro-NH-CH₂-CH₃

In 10 ml DMF werden Jk6 mg BOC-D-NIe-OH und 82O mg H-Leu-Arf:(N0_i,)-Pro-NH-CH_?-0H gelöst. Die Mischung wird auf O°C gekühlt, wonach die Zugabe von 322mg HONB und 371 mg DCC erfolgt. Die so erhaltene Mischung wird bei 0°C 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Harnstoffverbindung, welche als Nebenprodukt anfällt, wird abfiltriert, das Filtrat wird danach mit 10 ml Chloroform extrahiert, der Extrakt wird mit 0,1N HCl, 5 Jo-iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, wonach über· wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet wird. Das Chloroform wird abgedampft, der Rückstand wird mit Äther angerieben und aus Äthanol/Äther umgefällt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wird. Ausbeiite: 8II mg; Fp.: 12*l-126°C (Zersetzung).

/Ö_7p² -46,2° (c=0,5 in Methanol) Elementaranalyse für C_ H 0_gN .l/2H„0 Berechnet: C 53,08 H 8,31 N 18,57 Gefunden: C 53,07 H 8,27 N 19,05

5098 U/1 161

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-Arg-Pro

B0C-D-Nle-Leu-Arg(NO₂)-PrO-NH-CH₂-CH , welches wie oben unter a) beschrieben erhalten wurde, wird mit Trifluoressigsäure behandelt und danach mit Äther gefällt und abfiltriert. Das Produkt wird danach über eine Kolonne, Amberlite CG-^5 (freie Base), zur Entfernung der Trifluoressigsäure geleitet. In 2 ml DMF werden 190 mg der Verbindung H-D-Nle-Leu-Arg-(NO₂)-PrO-NH-CH₂-CH₃ und I68 mg (pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH gelöst. Die Mischung wird auf 0°C abgekühlt, wonach die Zugabe von 65 mg HONB und 75 mg DCC erfolgt. Die Mischung wird bei O C 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Harnstoffverbindung, welche als Nebenprodukt anfällt, wird abfiltriert und Äthylacetat zu dem Filtrat !zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gewonnen und mit 4 ml wasserfreiem HF in Gegenwart von 0,1 ml Anisol, 0,1 ml Mercaptoäthanol bei OCl Stunde lang behandelt. Der Fluorwasserstoff wird dann unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand gut getrocknet und in 10 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird dann über eine Kolonne, Amberlite IRA-410 (Acetatform), geleitet und der Effluent wird an einer (l,2 χ 22 cm)-Kolonne, Carboxymethylcellulose, adsorbiert. Es wird danach eine Gradienten-Elution mit 0,005M Ammoniumacetat (200 ml) und 0,15M Ammoniumacetat (200 ml) durchgeführt. Die (l^7 - I68 ml)-Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Ausbeute: k0 mg. ZcL7i) -42,2° (c=0,5 in 5 # wässriger Essigsäure) Rf²«s0,11, Rf ³=0,755

Aeinosäureanalyse (Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure): Hie 1,05; Arg 1,00; Trp 0,93; Ser 0,89; Tyr 1,00; GIu 1,00; Pro 1,02; Leu 1,00; Nie 1,00; Xthylaniin 1,05.

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Beispiel 12;

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Phe-Leu-ArS-PrO-NH-CH₂-CH₃

a) Herstellung von H-D-Phe-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃

Zu einer Mischung von IO ml Dichlormethan und 1 ml DMF werden 6OO mg Z-D-Phe-OH, 5OO mg HONB und 950 mg H-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH_ zugegeben und die Mischung wird erwärmt. Danach wird auf 0 C abgekühlt und es werden 5OO mg DCC zugegeben. Die Mischung wird dann h Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird in Chloroform gelöst. Die Lösung wird zweimal in h $-iger Natriumhydrogencarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen und danach über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, wonach unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt wird. Dann wird der Niederschlag sofort in 2 ml Eisessig gelöst. Nach Zugabe von 5 ^m^ 25 96-igem HBr-Eisessig wird die Mischung bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt, wonach die Zugabe von 50 ml trockenem Äther erfolgt. Der Niederschlag, welcher sich abscheidet, wird abfiltriert-und gut mit Äther gewaschen und danach getrocknet. Dieser Niederschlag wird dann in 10 ml 30 /έ-ig wässerigem Methanol gelöst. Die Lösung wird über eine Kolonne, Amberlite IRA-410 (freie Form), geleitet, welche danach mit 100 ml 30 #-ig wässrigem Methanol eluiert wird.

Der Effluent wird gesammelt und zur Entfernung des Methanols eingeengt.

Bei der Lyophilisierung des Rückstandes wird die gewünschte Verbindung H-D-Phe-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH„ als weißes Pulver erhalten. Ausbeute; 1,67 g ²D -9^,26° (c=l,01 in Methanol)

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2AA6005

Elementaranalyse für C₂-H. OgN .H₃O Berechnet: C 54,09 H 7,62 N 20,28 Gefunden:- C 53,84 H 7,79 N 19,91

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NH-CH-.-CH,,

(Z _> I

In 6 ml DMF werden 290mg (Pyr)Glu -His-Trp-Ser-Phe-OH und 24ö mg H-D-Phe-Leu-Arg(N0p)-Pro-NH-CH₂-CH_ gelöst, wonach die Zugabe von I50 mg HONB erfolgt. Die Mischung wird auf -10°C gekühlt und 90 mg DCC werden zugegeben. Die Mischung wird bei -10°C 2 Stunden lang, bei 0°C weitere 2 Stunden lang und danach bei Raumtemperatur 6 Stunden lang gerührt. Die als Nebenprodukt anfallende Harnstoffverbindung wird abfiltriert und es* werden 4o ml Äther zu dem Filtrat zugegeben. Der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert. Bei Umfällung aus Ä'thanol/Äthylacetat wird ein rohes geschütztes Peptid erhalten. Ausbeute? 510 ^mS· Dieses Roh-Peptid wird in 40 ml 60 ?&-ig wässriger Ameisensäure gelöst. Nach.Zugabe von 1 g SnCl₃^H₂O zu dieser Lösung wird die Mischung bei 80 - 85 Q- 2 Stunden lang stehen gelassen. Diese Mischung wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, nach Zugabe von 50 ^ml Wasser zu dem Rückstand wird die Mischung mit wässriger Ammoniaklösung auf den i»H 0,7 eingestellt.Der Niederschlag wird abfiltriert, das Filtrat wird dann auf einer Kolonne, Amberlite XAD-2 und Carboxymethylcellulose, gereinigt und, wie in Beispiel 1 beschrieben, lyophilisiert, wobei die gewünschte Verbindung in Form eines weißen,flaumigen Pulvers erhalten wird. Ausbeute: 392 mg.

/ctJ7_D -71 >8° (c=»O,195 in 5 °/o wässriger Essigsäure) Rf²=O,14, ³6

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure)t His 0,98; Arg 1,00; Trp 0,97;.Ser 0,93; GIu 1,00; Pro 0,98? Leu 1,00; Phe 1,96.

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Beispiel 13i

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Thr-Leu-Arg-Prο-NH-CH₂-CH₃

a) Herstellung von BOC-D-Thr-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH-

In 10 ml Acetonitril werden 438 mg BOC-D-Thr-OH (ölige Substanz) und 18 rag HONB gelöst, wonach 912 rag H-Leu-Arg(NO)-PrO-NH-CH₂-CH- zugegeben werden. Die Mischung wird auf 0°C gekühlt und dann werden 494 mg DCC zugegeben. Die so erhaltene Mischung wird bei Raumtemperatur 10 Stunden lang gerührt und die unlöslichen Anteile werden danach filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und der dabei entstehende Rückstand mit 100 ml Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird, mit 5 $iger Natriumhydrögencarbonat-Lösung, 10 $-iger wässriger Zitronensäurelösung und Wasser, in der genannten Reihenfolge gewaschen rmd danach über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Er wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und der erhaltene Rückstand wird aus Äthanol/Äther üragefällt. Es werden 900 mg der gewünschten Verbindung erhalten. Pp.: 119-121°C (Zersetzung);

/a_7§^k -38,6° (c=0,5 in Methanol), Rf¹=O,45. Elementaranalyse für CpgH 0qN_q.H₂0
Berechnet: C 49,76 H 7,90 N 18,65 Gefunden: C 49,64 H 7,70 N 18,46 . - ·

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Thr-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃

In 10 ml Trifluoressigsäure werden 657 mg BOC-D-Thr-Leu-Arg(NOg)-Pro-NH-CH₂-CH gelöst und die Lösung wird kO min lang geschüttelt. Dann werden 60 ml Äther zugegeben und der dabei erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und mit 30 ml Wasser gewaschen. Die wässrige Lösung wird über eine (l χ 10 cm)-Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Base), geleitet,

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' -4ο-

24A6005

welche dann selbst mit 30 ^-igem wässrigem Methanol gewaschen wird. Der Effluent und die Waschlösungen werden vereinigt und zur Entfernung des Methanols unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird lyophilisiert und es werden 471 mg D-Thr-Leu-Arg(NOp)-PrO-NH-CH₂-CH₃ erhalten. In 2 ml DMF werden I67 mg des so erhaltenen Produktes und 175 «ng (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH gelöst,, wonach eine Zugabe von 67 mg HONB erfolgt. Die Mischung wird auf -5°C gekühlt und 77 mg DCC werden zugegeben. Diese Mischung wird bei -5 C 3 Stunden lang und dann bei Raumtemperatur 10 Stunden lang gerührt. Die unlöslichen Anteile werden abfiltriert und es werden dann 50 ml Äthylacetat dem Filtrat zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wird filtriert und aus DMF-Äthylacetat umgefällt. Ausbeute 290 mg. I60 mg dieses Produktes werden in 10 ml 60 $-ig wässriger Ameisensäure gelöst und unter Zugabe von 400 mg SnClg.H-O wird die Lösung bei 80°C 2 Stunden lang behandelt. Die Reaktionsmischung wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Dann werden 10 ml Wasser zugegeben und die unlöslichen Anteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird auf chromatographischem Wege auf Amberlite XAD-2, Carboxymethylcellulose und Bio-gel P-2 gereinigt. Es werden 65 mg des gewünschten Produktes erhalten.

/ct_7²p -37,4° (c=0,5 in 5 % wässriger Essigsäure), Rf²= 0,12, Rf³=O,68

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure): His 1,00; Arg 0,97; Trp 0,94} Thr 1,03; Sex 0,90} GIu 1,00; Pro 1,06; Leu 1,06; Tyr 1,00; Äthylamin 1,10.

Beispiel l4;

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ile-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃

a) Herstellung von Z-Ile-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH

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In 12 ml einer 25 /6-igen HBr-Eisessigslöung werden 1,43 g Z-Arg(N0₂)-PrO-NH-CH₂-CH gelöst und die Mischung wird bei Raumtemperatur 40 min lang geschüttelt. Zu dieser Lösung werden 300 ml trockener Äther zugegeben und der dabei entstehende Niederschlag wird abfiltriert und in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 25 ml DMF gelöst und die Lösung wird mit 0,84 ml Triäthylamin neutralisiert, wonach Kühlung auf 0°C erfolgt* Dann werden 795 mg Z-IIe-OH, 590 mg HONB und 680 mg DCC zugegeben und die Mischung wird dann bei 0 C 5 Stunden lang und schließlich 8 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Diese Reaktionsmischung wird abfiltriert und das Filtrat wird eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst, danach mit 0,-1N HCl 5 %-iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, wonach eine Trocknung über Magnesiumstilfat erfolgt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand aus Äthylacetat/Äther umgefällt. Nach der TJmfällung aus Äthanol/Äther werden 1,1 g des gewünschten Produktes erhalten, Fp. ι, .103-105⁰C

/ά_7²^ -58,1° (c=l,0 in Methanol), Rf¹=0,48 Elementaranalyse für Cg-HjL-O-Ng.l/^HgO Berechnet: C 54,08 H 7,23 N 18,68 Gefunden: C 53,80 H 7,15 N 18,84

b) Herstellung von Z-D-Ieu-Ile-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃

In 4 ml 25 9i-igem HBR-Eisessig werden

590 mg Z-Ile-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH_ gelöst und die Mischung bei Raumtemperatur 40 min heftig gerührt. Zu dieser Lösung werden 50 ml trockenen Äthers zugegeben und der entstandene· Niederschlag wird durch Filtration gesammelt- und hernacfh in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 8 ml DMF gelöst und die Lösung

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2448005

wird mit O,i4 ml Triäthylamin behandelt, wonach eine Kühlung auf O°C erfolgt. Dann werden 264 mg Z-D-Leti-OH, 216 mg HONB und 247 mg DCC zugegeben und die Mischung wird bei 0°C 2 Stunden lang, danach bei Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wird dann, wie in Beispiel a) beschrieben, weiterbehandelt und es werden 620 mg des gewünschten Produktes erhalten. Fp.: 112-113 C.

p -47,8° (c=O,5 in Methanol), Rf¹SO,53

Elementaranalyse für C__oH__0_QN_.H„0

33 53 ο 9 2

Berechnet: C 54,91 H 7,68 N 17,47 Gefunden: C 5^,72 H 7,52 N 17,19

c) Herstellung von (Pyr)Glü-His-Trp-Ser-Tyr-D-

Leu-Ile-Arg-Pro-NH-CH₂-CH In 3 ml 25 $-igem HBr-Eisessig werden 220

mg

Z-D-Leu-Ile-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH- gelöst und die Lösung wird bei Raumtemperatur 50min lang heftig gerührt.Zu dieser Lösung werden 50 ml trockener Äther zugegeben und der entstandene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet. Dieses Material wird dann in einer kleinen Menge Wasser gelöst und über eine (l,2 χ 7 cm)-Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Form), geleitet. Der Effluent und die Waschlösungen werden vereinigt

ι
undlyophilisiert. Dieses Material wird dann in 5 ml DMF

zusammen mit 230 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH und 108mg HONB gelöst. Die Mischung wird auf -10°C gekühlt und es werden 124 mg DCC zugegeben. Diese Mischung wird bei -10°C 2 Stunden lang, bei 0 C weitere 2 Stunden lang und schließlich 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, wonach abjfiltriert wird. Das Filtrat wird eingeengt und der Rückstand auf einer (l,8 χ 20cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2 (200-300 Mesh), mittels Gradientenelution mit 5 ^c/o-lg wässrigem Äthanol bis 80 $-ig wässrigem Äthanol (jeweils 250 ml) gereinigt. Das gewünschte Produkt befindet sich

5098U/1181

in den (15O bis 350 ml)-Fraktionen. Diese Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert. Das so ^erhaltene Material wird in 7 ml 6O ⁰Jo-ig wässriger Ameisensäure gelöst und es werden **50 mg SnClp»H₂0 zugegeben. Die Mischung wird 2 Stunden lang auf 80 - 85 C erhitzt. Die unlöslichen Anteile werden abfiltriert und das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt i Der Rückstand wird dann mit 30 ml warmem Wasser (80 C) extrahiert. Der Extrakt wird filtriert und das Filtrat auf eine (l,8 χ 15 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2 (200 bis 300 mesh), aufgegeben. Die Kolonne wird danach mit ¥assergut gewaschen. Für die Elution wird die Linear-Gradienten-Methode unter Einsatz von wässrigem Äthanol ("20 - 80 $, 250 ml/2-50ml) eingesetzt. Die gewünschte Verbindung befindet sich in den (lOO ml - 230 ml)-Fraktionen. Diese Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Entfernung des Äthanols eingeengt. Das Konzentrat wird dann auf eine (l,2 χ ^O cm)-Kolonne, Carboxymethylcellulose, aufgebracht. Danach wird das Produkt nach der Linear-Gradienten-Elutionsmethode (0,005M - 0,2M Ammoniunfacetat, pH 6,8, 200 ml/200 ml) eluiert. Das gewünschte Peptid wird in den (180 ml - 290 ml)-Fraktionen erhalten. Diese Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Ausbeute I30 mg -

/a_/p³ -39,2° (c=0,5 in 5 <jfi> wässriger Essigsäure), Rf²=0,11 Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit ON HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure): His 0,97; Arg 1,02; Trp 0,92; Ser 0,9**; GIu 1,00; Pro 1,05; He 1,00; Leu 1,00; Tyr 0,97.

Beispiel 15t

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pro-NH-CH₂-CH

a) Herstellung von Z-Nle-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH_ In 10 ml.'25 $-iger HBr-Eisessigsäure werden 7I5 mg

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Z-Arg(NO_)-Pro-NH-CH₂-CH_ gelöst und die Mischung wird bei Raumtemperatur 30 min lang heftig gerührt. Dieser Lösung werden 250 ml trockener Äther zugegeben und der entstandene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet. Da,s so erhaltene Pulver wird in 15 ml DMF zusammen mit 400 mg NIe-OH gelöst und die Lösung wird auf 0°C gekühlt. Dann werden 0,45 ml Triethylamin, 295 mg HONB sowie 34O mg DCC zugegeben. Die Mischung wird bei 0 C 3 Stunden lang und danach 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird dann, wie in Beispiel l4a beschrieben, weiterbehandelt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wird. Ausbeute 824 mg; Fp.: 109-110°C.

Jjt-J^ -50,4° (c=0,5 in Äthanol); Rf¹=0,4i Elementaranalyse für C₃₇Hr₂0_Ng.l/2H₂0 Berechnet: C 54,08 H 7,23 N 18,68 Gefunden: C 53,79 H 7,09 N 18,34

b) Herstellung von Z-D-Leu-Nle-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃

In 5 ml 25 $-igem HBr-Eisessig werden 590 mg Z-Nle-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH_ gelöst und die Mischung wird

min bei Raumtemperatur geschüttelt. Es werden 200 ml trockener Äther zugegeben und der dabei entstandene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und über Natriumhydroxid in einem Exsikkator getrocknet. Das Produkt wird dann in 5 ml DMF gelöst und die Lösung mit 0,l4 ml Tri ethylamin bei 0 C neutralisiert. Dann werden 264 mg Z-D-Leu-OH zugegeben, weiters 216 mg HONB und 247 mg DCC bei OC. Die Mischung wird dann 2 Stunden lang bei 0°C gerührt, wonach 10 Stunden lang bei Raumtemperatur weitereertihrt wird« Sie wird dann wie in Beispiel b) beschrieben weiterbehandelt. Ee werden 594 mg des gewünschten Produktes erhalten. Fp.t 101-103°C.

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/ä_/[p -45,2° (c=O,5 in Methanol), Rf¹=0,55 Elementaranalyse für C„„H -OoNg.H^O Berechnet: C 54,91 H 7,68 N 17,47 Gefunden: C 54,63 H 7,5** N 17,08

c) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pro-NH-CH₂-CH

In 4 ml 25 $-igem HBr-Eisessig werden 350 mg

Z-D-Leu-Nle-Arg(N0_)-Pro-NH-CH₂-CH» gelöst und die Mischung wird 40 min lang bei Raumtemperatur heftig gerührt. Zu dieser Mischung werden 300 ml trockener Äther zugegeben und der dabei entstandene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet.

Das erhaltene Produkt wird in 2 ml Wasser gelöst und diese Lösung über eine (l,2 χ 7 cm)-Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Form), geleitet. Die Kolonne wird danach gut mit Wasser gewaschen. Der Effluent und die Waschlösungen werden kombiniert und lyophilisiert. Das erhaltene Produkt wird dann mit 345 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH in 6 ml DMF in Gegenwart von 180 mg HONB und 2θ6 mg DCC gekuppelt. Die aufgearbeitete Mischung und das erhaltene Produkt werden auf chromatographischem Wege auf Amberlite XAD-2,*wie in Beispiel 14 c) beschrieben, gereinigt. Die Entfernung der Nitrogruppe und die Reinigung des gewünschten Peptides werden in ähnlicher Weise, wie in Beispiel 14 c) beschrieben, durchgeführt. Ausbeute: 213 mg·

/a_7²n "38,6° (c=0,5 in 5 % wässriger Essigsäure).

Rf =0,10.Aininosäureanalyse (Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure): His 0,98; Arg 1,00; Trp 0,91; Ser 0,95; GIu 1,00; Pro 1,08; Leu 1,00; Nie 1,00; Tyr 0,96.

Beispiel l6:

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Val-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃

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a) Herstellung von BOC-D-VaI-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃ ■

Zu einer Lösung von 5^0 rag BOC-D-VaI-OH(Ol) und l,lA g H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH^ in 10 ml DMF werden 537 mg HONB und 620 mg DCC bei 0°C zugegeben. Die Mischung wird 3 Stunden lang bei 0 C und danach bei Raumtemperatur

10 min lang gerührt. Dann wird abfiltriert. Das Filtrat wird bei verminderten! Druck zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird in 100 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 0,1N HCl und 5 $-iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, getrocknet und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wird mit Petroläther. angerieben und gibt ein Rohprodukt, welches aus Xthylacetat/Äther umgefällt wird. Ausbeute: 1,1 gj Fp. s lhh-lh6°C (Zersetzung) JjlJ^ -^3,7° (c=l,Q in Methanol); Rf¹ =0,55 Elementaranalyse für C₃₉H _OgN.1/2HgO Berechnet: C 52,39 H 8,18 N 18,96 Gefunden: C 52_f4o H 8,32 N 18,52

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Val-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH

In 5 ml Trifluoressigsaure werden 300 mg BOC-D-VaI-Leu-Arg(NO_Q)-Pro~NH-CH„-CH„ gelöst und die Mischung wird 30 min lang bei Raumtemperatur heftig gerührt, dann werden 50 ml trockener Äther zugegeben und das erhaltene, weiße •feete Produkt wird gesammelt und unter verminderten Druck in einem Exsikkator über NaOH getrocknet. Das Material das so erhalten wird,wird in 20 ml 20 °/>-±s wässrigem Methanol gelöst und die Lösung wird auf eine (l χ 5 cm)-Kolonne, Amberlite IR-^5 (freie Form), aufgebracht. Die Säule wird dann mit demselben Lösungsmittel gewaschen. Der Effluent und die Waschlösungen werden kombiniert, zu einem kleinen Volumen eingeengt und lyophilisiert. Es werden I65 mg Produkt erhalten. Davon werden I50 mg in 2 ml DMF zusammen

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mit l68 mg (Pyr)GIu-IIis-Trp-Ser-Tyr-OH und 65 mg HONB gelöst und die Mischung wird auf O°C gekühlt. Dann werden 75 mg DCC zugegeben und die Mischung wird 2 Stunden lang bei O C und danach 12 Stunden bei Raximtemperatur gerührt. Die Reak-

<r -

tionsmischung wird abfiltriert und mit 50 ml Äthylacetat verdünnt. Der durch Filtration gewonnene Niederschlag wird getrocknet und durch Säulenchromatographie auf Silikagel (4g)

2 gereinigt. Für die Elution"wird das Rf -Lösungsmittelsystem verwendet. Die Fraktionen, welche das geschützte Nonapeptid enthalten, werden miteinander vereinigt und das Lösungsmittel soweit eingedampft, daß das Produkt trocken ist· Es werden 1^O g Produkt erhalten. Von dem erhaltenen, geschützten Nonapeptid werden 110 mg mit k ml wasserfreiem-Fluorwasser-' stoff in Gegenwart von 0,1 ml Anisol und 0,02 ml Mercaptoäthanol bei OCl Stimde lang behandelt. Der Fluorwasserstoff wird dann unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit 20 ml Wasser extrahiert. Der Extrakt wird mit Äther gewaschen und über eine (l,5 x 3 cm)-Kolonne, Amberlite IRA-ifOO (Acetat-Form), geleitet, wonach die Kolonne selbst mit Wasser gewaschen wird. Der Effluent und die Waschlösungen werden vereinigt und lyophilisiert. Das Material wird in einer kleinen Menge Wasser gelöst und die Lösung wird auf eine 1,2 χ 30 cm-Kolonne, Carboxymethylcellulose, aufgebracht. Für die Elution wird das Lineargradienten-Elutions-Verfahren unter Einsatz von Ammoniumacetat (0,005M - 0,2M, I50 ml - 150 ml) verwendet. Das gewünschte Produkt befindet sich in den (IIO-I3O ml)-Fraktionen. Diese Fraktionen werden miteinander vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 87 mg. .

£α_7_Ώ -4o,8 (c=0,5 in 5 ^ wässriger Essigsäure), Rf²=0,12, Rf³=O,66

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von Thioglyco:j.säure): His 1,00; Arg 1,02; Trp 0,855 Ser 0,95

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GIu 0,98; Pro l,O2| VaI 0,91? Leu 0,95; Tyr 1,00; Äthylamln 1,01.

Beispiel 17t

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D- Met-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH

a) Herstellung von B0C-D-Met-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃

BOC-D-Met-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃ wird hergestellt in ganz ähnlicher Weise wie es in Beispiel l6 a) beschrieben ist, nämlich aus 623 mg BOC-D-Met-OH, I,l4 g H-Leu-Arg(N0_o)-Pro-NH-CH_-CH„_f 537 mg HONB und 620 mg DCC. Ausbeute: 1,1 g. Fp.: 125-I3O C (Zersetzung) /ά_7²^ -51,5° (c=l,0 in Methanol), Rf¹=0,59

Elementaranalyse C_0nH^₀OoN₀S

29 53 ο 9

Berechnet: C 50,6** H 7,77 N 18,32 S k,65 Gefunden: C 50,51 H 7,52 N 18,5** S 4,30

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Met-Leu-Arg-Pro-NH-CH -CH

In 3 ml Trifluoressigsäure werden 3OO mg BOC-D-Met-Leu-Arg(N0p)-Pro-NH-CH₂-CH_ gelöst und die Mischung wird 20 min lang bei Raumtemperatur heftig gerührt. Dann werden kO ml trockener Äther hinzugefügt und der erhaltene, weiße Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Dieses Material wird in die freie Form tibergeführt, indem es über eine (l χ 5 cm)-Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Form), wie in Beispiel l6 b) beschrieben, geleitet wird. Das erhaltene, teilweise geschützte Tetrapeptid H-D-Met-Leu-Arg(NO_)-Pro-NH-CH₂-CH₃ (1^7 mg) wird sodann mit 17I mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH in Gegenwart von 67 mg HONB und 77 mg DCC umgesetzt, wobei ein teilweise geschützt-es Nonapeptid erhalten wird. Diese Verbindung wird auf einer Amberlite XAD-2-Kolonne gereinigt und danach mit SnCl₃.H₀O in 60 i/o wässriger Ameisensäure 2 Stunden lang bei 80 bis 85⁰C

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behandelt. Das erhaltene Endprodukt wird chromatοgraphisch auf Amberlite XAD-2 und Carboxymethylcellulose gereinigt. Alle diese Vorgänge sind ähnlich den in Beispiel 16 b) beschriebenen. Ausbeute» 79

^ -39,6° (c=O,5 in 5 # vässriger Essigsäure) Rf²=O,l6. Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von Thioglycölsäure): His 1,02; Arg 1,00; Trp 0,90; Ser 0,89; GIu 1,00; Pro 1,00; Met 0,91; Leu 0,98; Tyr 1,02; Äthylamin 1,00.

Beispiel 18:

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ile-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH

a) Herstellung von B0C-D-Ile-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₃

BOC-D-Ile-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃ wird in ähnlicher Weise, wie in Beispiel 16 a) beschrieben, aus 579 mg BOC-D-IIe-OH, 1,1** g H-Leu-Arg(NO₂)-PrO-NH-CH₂-CH₃, 537 mg HONB und 620 mg DCC hergestellt. Ausbeute 0,9 g; Pp.:.127-131^OC (Zersetzung).

^³-48, 3° (c=l,0 in Methanol)

Elementaranalyse für C__H_ OgN₉ Berechnet: C 53,79 H 8,27 N 18,18 Gefunden: C 53,81 H 8,31 N 18,65

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ile-Leu-Arg-Prd-NH-CH₂-CH₃

In 3 ml Trifluoreasigsäure werden 300 mg BOC-D-Ile-Leu-Arg(NO₂)-Pr₀-NH-CH₂-CH₃ gelöst und di· Mischung wird 25 min lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann werden Ίθ ml trockener Äther zugegeben und der erhalten· Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet.· Dieses Material wird dann in die freie Form übergeführt, indent es über eine (l χ 5 cm)-Kolonne, Amberlite IR-^5 (freie Form), wie in Beispiel l6 b) beschrieben, geleitet wird. Das erhalten·,

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teilweise geschützte Tetrapeptid H-D-Ile-Leu-Arg(NO„)-Pro-NH-CH₂-CR₃ (1^2 mg) wird mit I7I mg (p^r)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, 67mg HONB und 77 mg DCC umgesetzt, wobei ein teilweise geschütztes Nonapeptid erhalten wird. Diese Verbindung wird auf einer Amberlite XA.D-2-Säule gereinigt und danach mit SnCIp.H_0 in 60 /έ-ig wässriger Ameisensäure 2 Stunden lang bei 8O bis 85⁰C behandelt. Das so erhaltene, gewünschte Produkt wird chromategraphisch auf Amberlite XAD-2 und Carboxymethylcellulose gereinigt. Alle Vorgänge sind ähnlich den in Beispiel l6 b) beschriebenen. Ausbeute: 93 mg·

-41,5 (c=0,5 in 5 9έ wässriger Essigsäure) >,13, Rf³=O,66

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure): Hia 0,98; Arg 1,00; Trp 0,89; Ser 0,91; GIu 0,95} Pro 1,00; He 1,00; Leu 1,00; Tyr 1,00; Xthylamin 1,01.

. 0 Figuren
22 Ansprüche

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Claims

Patentansprüche

-R₁-R₃-R -Arg-Pro-NH-R^ (l)

worin R Tyr oder Phe, R₃ D-Leu, D-IIe, D-NIe, D-VaI, D-Nva, D-Abu, a-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr oder D-Met; R_g Leu, He oder Nie und R. Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeuten, das gegebenenfalls durch. OH-Gruppen substituiert ist.
2. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R₂ D-Leu, D-NIe, D-Nva, D-Abu, D-Phg, D-Phe, a-Aibu oder D-Ser bedeuten und R₁, R_ und R. die im Anspruch 1 genannte Bedeutung haben·
3· Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R₂ D-VaI, D-He, D-Thr oder D-Met bedeuten und R , R_ und R. die im Anspruch 1 genannte Bedeutung haben.
k. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R^ Äthyl bedeutet.
5. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Tyr, R₂ D-Leu, R_ Leu und Rr Äthyl bedeutet.
6. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Tyr, R₂ a-Aibu, R_ Leu und Rl Äthyl bedeutet.
7. Verbindung der allgemeinen Formel I,- worin R Phe, R₂ D-Leu, R_ Leu und R. Äthyl bedeutet.
8. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Tyr, R D-Phg, R_ Leu und R. Äthyl bedeutet.
9. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Tyr, R₂ D-Ser, R_ Leu und R. Äthyl bedeutet.
10.Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Tyr, R₂ D-Abu, R_ Leu und R. Äthyl bedeutet.
11. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R₁ Tyr, R₂ D-Nva, R Leu und R. Äthyl bedeutet ·

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12. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Phe, R₂ D-Nva, R„ Leu und R^ n-Propyl bedeutet.
13. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Tyr, R„ D-Abu, R„ Leu und R^ i-Propyl bedeutet.
I^. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Tyr, R„ D-NIe, R_ Leu und R^ Xthyl bedeutet.
15. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R₁ Phe, R₂ D-Phe, R~ Leu und R^ Äthyl bedeutet.
16. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R₁ Tyr, R₂ D-Thr, R_ Leu und R^ Äthyl bedeutet.
17. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Tyr, R₂ D-Leu, R_ He und R^ Äthyl bedeutet.
18. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Tyr, R₂ D-Leu, R«, Nie und Rr Äthyl bedeutet.
19. Verbindung der. allgemeinen Formel I, worin R₁ Tyr, Rp D-VaI, R_ Leu und Rj, Äthyl bedeutet.
20. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Tyr, R₂ D-Met, R_ Leu und R^ Äthyl bedeutet.
21. Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R Tyr, R„ D-IIe, R Leu und R^ Äthyl bedeutet.
22. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R₁-R₃-R -Arg-Pro-NH-R^ (i)

worin R. Tyr oder Phe, R₃ D-Leu, D-He, D-NIe, D-VaI, D-Nva, D-Abu, ot-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr oder D-Met; R~ Leu, D-IIe oder Nie und R^ Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch OH-Griippen substituiert ist, bedeuten,dadurch gekennzeichnet', daß eine Reaktionskomponente (a) - L-Pyroglutaminsäure oder ein Peptidfragment mit einer N-endständigen L-Pyroglutaminsäureeinheit (d.h. (Pyr)Glu-), welches gleichzeitig von dort an die oben angeführte Aminosäuresequenz aufweist, mit einer Reaktionskomponente (b) - einer Aminkomponente,

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velche dem Rest des. oben angeführten No.napeptxdamidderivates entspricht - kondensiert wird, wobei die Reaktionskomponenten (a) und (b) gegebenenfalls geschützt sind, und die gegebenenfalls vorhandene(n) Schutzgruppe(n) schließlich entfernt wird (werden).

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