DE2649114A1 - Octapeptide - Google Patents

Description

Parke, Davis & Company Joseph Campau at the River, Detroit, Michigan 48232

betreffend:

Octapeptide

Die Erfindung betrifft neue Peptidverbindungen, die geeignet sind, als Antagonisten für den das luteinisierende Hormon freisetzenden Faktor und Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft besonders neue Qctapeptide der allgemeinen Formel

R₁-Trp-Ser-Tyr-R₂-Leu-Arg-Pro-R₅ (I)

und deren Salze, wobei R^ Z-GIn, Z-GIn (bzl), Bhoc-Gln, Boc-His (bzl), Z-His (bzl), Boc-Ser (bzl), Boc-Pro, Z-Leu, Boc-Leu, Z-Tyr (bzl), Z-IIe, Boc-Cys (bzl), Z-Phe oder Z-Ser (bzl), R₂ D-Phe, D-AIa, D-Leu, D-Trp, D-Tyr, D-Tyr (Me), D-Ser, D-Met, D-Arg, D-VaI, D-His, D-GIn, D-Phs, D-Thr, D-Pro oder D-Asn und R₃ NH₂, NH-(nieder Alkyl) N=(nieder Alkyl)_o, NH-Benfyl, NHCH₉GH₉N(nieder Alkyl)₉ oder NHCH₂CH₂SO₂NH-⁰⁶¹¹Ut. Die Erfindung betrifft auch bestimmte Peptidzwischenprodukte und ihre Salze, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen angewandt werden. "In der Formel I werden die üblichen Symbole für Aminosäurereste von Peptidverbindungen und Schutzgruppen, die daran gebunden sind, angewandt, wobei die dort angegebenen Symbole im einzelnen die folgende Bedeutung haben:

*(LRF-Antagonisten)

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'"*" 2S491H ,3 .

Trp = L-Tryptophyl; Ser = L-Seryl; Tyr = L-Tyrosyl; Leu = L-Leucyl; Arg = L-Arginyl; Pro = L-Prolyl, GIy = Glycin; Z-GIn = I^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl; Z-GIn (bzl) = N^Benzyl-N^a-benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl; Bhoc-Gln = N^-Benzhydryloxycarbonyl-L-glutaminyl; Boc-His (bzl) = Na-t-Butoxycarbonyl-N^im-benzyl-L-histidyl; Z-His (bzl) = N^a-Benzyloxycarbonyl-N^im-benzyl-L-histidyl; Boc-Ser (bzl)= O-Benzyl-N^-t-butoxycarbonyl-L-seryl; Boc-Pro = N^-t-Butoxycarbonyl-L-prolyl; Z-Leu = N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl; Boc-Leu = N^-t-Butoxycarbonyl-L-leucyl; Z-Tyr (bzl) = 0-Benzyl-N°^benzyloxycarbonyl-L-tyrosyl; Z-IIe = N^-Benzyloxycarbonyl-L-üsoleucyl; Boc-Cys (bzl) = S-Benzyl-N^-tbutoxycarbonyl-rL-cysteinyl; Z-Phe = N^-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl; Z-Ser (bzl) = O-Benzyl-N^-benzyloxycarbonyl-L-seryl; D-Phe = D-Phenylalanyl; D-AIa = D-Alanyl; D-Leu = D-Leucyl; D-Trp = D-Tryptophyl; D-Tyr = D-Tyrosyl; D-Tyr(Me) = O-Methyl-D-tyrosyl; D-Ser = D-Seryl; D-Met = D-Methionyl; D-Arg = D-Arginyl; D-VaI = D-Valyl; D-His = D-Histidyl; D-GIn = D-Glutaminyl; D-Phs = D-Phenylseryl(erythro oder threo); D-Thr = D-Threonyl; D-Pro = D-Prolyl; und D-Asn = D-Asparaginyl. Außerdem bedeutet der Ausdruck "nieder Alkyl" eine grade, verzweigte oder cyclische gesättigte Kohlenwasser stoff gruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, wie eine Methyl-, Äthyl-, Isopropyl- oder Cyclopropylgruppe. Die in der Formel I angewandten Symbole werden auch in den folgenden für andere Verbindungen angegebenen Formeln angewandt und haben dabei jeweils die oben angegebene Bedeutung.

Die Verbindungen der Formel I, und deren Säureadditionssalze können erfindungsgemäß hergestellt werden durch Umsetzung eines Azids der Formel

X-N₃ (II)

mit einer Verbindung der Formel

R₃ (III)

in einem nicht reagierenden Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid oder einem Dimethylformamid-Tetrahydrofuran-Gemisch, wobei X R^Trp-Ser-Tyr, I^-Trp-Ser-Tyr-Rg

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oder ^-Trp-Ser-Tyr-Rg-Leu, Y Arg, Leu-Arg oder Rp-Leu-Arg ist und IL, und R, die oben angegebene Bedeutung haben. Die Verbindungen der Formeln II und III werden so für die Reaktion ausgewählt, daß das entstehende Produkt ein Octapeptid der Formel I ist.

Das Azid der Formel II wird in situ hergestellt und angewandt, während die Verbindung der Formel III in der Form angewandt wird, in der die Arg-Gruppe in Form eines Säureadditionssalzes mit einer starken Säure, wie Salzsäure oder Trif'luoressigsäure, vorliegt. Die beiden Komponenten II und III werden im allgemeinen in ungefähr aquimolaren Mengen bei Temperaturen von ungefähr -30 bis ungefähr +30⁰C 16 bis 50 Stunden lang umgesetzt, obwohl Temperaturen von 30 bis 50⁰C unter Verkürzung der Reaktionszeit angewandt werden können.

Die Verbindungen der Formel I werden vorzugsweise in Form eines Säureadditionssalzes isoliert, können jedoch gegebenenfalls auch in Form der freien Base isoliert werden.

Die Pept4.dazidverbindungen der Formel II, die als Reaktionspartner bei dem oben angegebenen Verfahren angewandt werden, werden üblicherweise in situ hergestellt durch Umsetzung einer Peptidhydrazidverbindung der Formel

X-NHNH₂ (IV)

in der X die oben angegebene Bedeutung hat,mit einem niederen Alkylnitrit, vorzugsweise Isoamylnitrit_; in Gegenwart einer Säure in einem inerten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid,und das entstehende Azid wird weiter, wie oben angegeben,ohne vorherige Isolierung umgesetzt.

•ι
Die bevorzugte Säure zur Azidherstellung ist eine Lösung von Chlorwasserstoff.in Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, wobei zwischen 3 und 6 Äquivalent Säure pro Äquivalent Hydrazid der Formel IV angewandt werden. Die Herstellung des Azids wird bei einer Temperatur zwischen -60 und 10⁰C durchgeführt. Nach der in-situ-Bildung des Azids der Formel II und vor der weiteren Umsetzung des

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Peptidazids mit einer Verbindung der Formel III unter Bildung -des Octapeptids der Formel I, wird ein tertiäres Amin, wie Triäthylamin zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um die angewandte Säure zu neutralisieren. Diese Azide fallen ebenfalls unter die Erfindung.

Die Peptidhydrazidverbindungen der Formel IV können nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Bestimmte dieser Verbindungen können in Form von Säureadditionssalzen, wie als Hydrochloride, Sulfat-, Acetat^ Citrat-, Trifluoracetatsalze uswA,vorliegen,und diese Salze fallen ebenfalls unter die Erfindung. Das Hydrazid der Formel IV, bei dem X die oben angegebene Bedeutung hat, wird hergestellt durch Umsetzung eines Esters der Formel

X-OR₄ (V)

in der X die oben angegebene Bedeutung hat und R; eine niedere Alkyl-·, vorzugsweise Methylgruppe ist₍ mit überschüssigem Hydrazin (1:1,1 bis 100), vorzugsweise in Form des Hydrats,, in einem organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Methanol, Äthanol usw. Die Reaktion wird im allgemeinen bei Raumtemperatur durchgeführt, obwohl Temperaturen von 5 bis 100⁰C und Zeiten von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 200 Stunden, vorzugsweise ungefähr 72 Stunden angewandt werden können.

Die Ester der Formel V werden hergestellt durch Umsetzung einer Verbindung der Formel

X^I-0R₄ (VI)

in der R, die oben angegebene Bedeutung hat und Χ·*- Trp-Ser-Tyr, R₂-LeU, Trp-Ser-Tyr-R₂, Trp-Ser-Tyr-R₂-Leu oder Leu ist, wobei^Rp die oben angegebene Bedeutung hat oder einem Salz der Verbindung VI, vorausgesetzt, daß in Rp ein basisches Zentrum vorhanden ist, mit einer Verbindung der Formel

X¹^-OH (VIl)

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26491H

wobei X^¹R₁, R^-Trp-Ser-Tyr oder R^Trp-Ser-Tyr^ bedeutet in einem organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid. Diese Kupplungsreaktion kann nach verschiedenen Verfahren erreicht werden. Zu Anfang kann sie durchgeführt werden bei einer Temperaturen von ungefähr -10⁰C innerhalb von 2 Stunden und anschließend ungefähr 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Anwendung der Verbindung VII in Form des Pentachlorphenylesters und Triäthylamin. Ein zweites Verfahren, das wieder Dimethylformamid als Lösungsmittel anwendet und die ersten drei Stunden bei -10 bis O⁰C arbeitet und anschließend zwei Tage bei Rfeiumtemperatur, beruht auf der Verwendung von 1-Hydroxybenztriazol und Dicyclohexylcarbodiimid zur Beschleunigung der Reaktion. Ein drittes Verfahren umfaßt die Umwandlung von Verbindungen der Formel VII in den Methylester nach üblichen Veresterungsverfahren oder der Ester kann direkt durch Synthese, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, erhalten werden.

Der Methylester wird dann in das entsprechende Hydrazid umgewandelt,nach dem zur Herstellung der Hydrazide der Formel IV angegebenen Verfahren,und diese Substanz kann zu dem entsprechenden Azid nach dem zur Herstellung der Verbindungen der Formel II angegebenen Verfahren umgewandelt und an eine Verbindung der Formel VI gekuppelt werden, nach dem oben beschriebenen Azidkupplungsverfahren .

Bei Anwendung der oben angegebenen allgemeinen Verfahren in entsprechender Weise kann man irgendeinen der gewünschten Ester der Formel V herstellen.

Solche Ester der Formel VI, die nicht bereits in der Literatur angegeben sind, werden hergestellt nach dem gleichen Verfahren, wie es für die Herstellung von Verbindungen der Formel V angegeben ist, wobei eine Verbindung der Formel

^vIII-0H

-Λ.

zusammengebracht wird mit einer Verbindung der Formel

X^IV-0R₄

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III

wobei X Trp, R₂ oder Trp-Ser-Tyr ist und wobei die endständige Aminogruppe durch eine Benzyloxycarbonyl-, Benhydryloxycarbonyl- oder t-Butoxycarbonylgruppe geschützt ist, X^IV R₂, Leu, R₂-LeU, Ser-Tyr oder Ser-Tyr-R₂~Leu bedeutet und R^ die oben angegebene Bedeutung hat_rund anschließende Entfernung der Benzyloxycarbonyl- oder Benzylhydryloxycarbonylgruppe durch Lösen des Produktes in Methanol und anschließende Behandlung mit Palladium-auf-Kohle in Gegenwart von molekularem Wasserstoff ungefähr 2,5 Stunden bei Raumtemperatur oder Entfernung der tert.-Butoxycarbonylgruppe durch Zersetzung mit einer schwachsauren Lösung unter Anwendung einer verdünnten wäßrigen Säure, 'wie Salzsäure oder Trifluoressigsäure.

Alle Verbindungen X -OH sind in nicht geschützter Form bekannt mit Ausnahme von Trp-Ser-Tyr-OH. Während die meisten der geschützten Verbindungen ebenfalls bekannt sind, können die nicht in der Literatur angegebenen hergestellt werden durch Umsetzung von Carbobenzoxychlorid oder Benzhydryloxycarbonylchlorid mit der entsprechenden Aminosäure in Gegenwart einer Base,nach dem in der Peptidchemie allgemein zur Einführung von Schutzgruppen angewandten Verfahren oder durch Umsetzung von tert.-Butoxycarbonylazid mit der entsprechenden Aminosäure,nach dem Verfahren das beschrieben ist in "Solid Phase Peptide Synthesis" von J.M. Steward und J.D. Young, W.H. Freeman & Company, San Francisco (1969), Seite 28.

Das geschützte Tripeptid wird vorzugsweise erhalten durch das oben beschriebene Kupplungsverfahren unter Anwendung von geschütztem Trytophan mit Ser-Tyr-OR/, wobei R^ die oben angegebene Bedeutung hat. Das Ser-Tyr-OR^ wird erhalten durch Entfernung der Schutzgruppe des Carbobenzoxyderivats von Ser-Tyr-OR. mit Hilfe der oben beschriebenen Standardverfahren.

Die Verbindung der Formel X-OR^, in der X Leu ist, .ist in der Literatur angegeben. Das Verfahren zur Herstel-

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~^r~

lung von X -OR, , wobei X^IV Ser-Tyr ist, ist unmittelbar oben

IV
angegeben. Wenn X Ser-Tyr-R^-Leu ist, wird die Verbindung

IV
X -OH hergestellt durch Kupplung von geschütztem Ser-Tyr-OH mit Rg-Leu-OR^, wobei Rp und R, die oben angegebene Bedeutung haben^unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens und eines Azidzwischenproduktes oder Kupplung der beiden Fragmente mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid in einem nicht polaren Lösungsmittel bei Raumtemperatur bis die Ausfällung von Dicyclohexylharnstoff vollständig ist und anschließende Entfernung der Schutzgruppe unter Anwendung de? oben beschriebenen Verfahren* zur Entfernung der Schutzgruppe. Die Verbindungen der Formel R^-Leu-OR, werden hergestellt durch Kupplung der geschützten bekannten Verbindung Rp-OH mit bekanntem Leu-OR^ unter Anwendung der oben angegebenen Azid- oder Dicyclohexylcarbodiimid-Verfahren und der oben angegeben Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppe. Wenn X Rp ist, werden übliche Veresterungsverfahren angewandt.

Die Verbindungen der Formel VII, die nicht bereits in der Literatur angegeben oder in einem anderen Teil dieser Beschreibung beschrieben worden sind, werden im wesentlichen nach dem gleichen Verfahren hergestellt, wie es zur Herstellung von Verbindungen der Formel V angegeben ist. Eine Verbindung der Formel

X^V-OH
wird mit einer Verbindung der Formel

zusammengegeben, wobei X R^-Trp-Ser-Tyr und X R₂ ist,nach dem zur Herstellung von Verbindungen der Formel V angegebenen Verfahren. Die Hydrolyse der entstehenden Ester unter Verwendung von verdünntem Alkali in nur etwas größeren als äquimolaren Mengen, ergibt die freie Säure der Formel VII, oder der Ester kann über das Hydrazid-und Azidverfahren angewandt werden, wie an anderer Stelle beschrieben, zur direkten Herstellung der Verbindung der F_ormel'VII.

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Die Verbindungen der Formel X¹¹OH, in der X¹¹ R. ist, .sind alle bekannt mit der Ausnahme von Bhoc-Gln, das hergestellt wird aus Benzhydryloxycarbonylhydrazid, Natriumnitrit und L-Glutamin unter Verwendung von wäßriger Essigsäure als Lösungsmittel bei einer Temperatur von 5⁰C. Die Verbindungen der Formel X OH, bei denen X IL-Trp-Ser-Tyr ist, werden hergestellt durch Umsetzung einer bekannten R^-OH-Verbindung mit dem Tripeptid Trp-Ser-Tyr-OR^, nach dem zur Herstellung von Verbindungen der Formel V beschriebenen Verfahren und anschließende Hydrolyse des Esters,oder der Ester kann angewandt werden über das an anderer Stelle zur direkten Herstellung der Verbindung der Formel VII beschriebene Hydrazidkupplungsverfahren.

Die Verbindungen der Formel X OR^ werden hergestellt aus bekannten D-Aminosäuren nach Standardveresterungsverfahren.

Die Verbindungen der Formel III und ihre Säureadditionssalze, wie die Hydrochiοrid-, Sulfat-, Acetat- Citrat-, Trifluoracetat-, Benzoatsalze usw.,können nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Die neuen Verbindungen der Formel III und ihre Säureadditionssalze , die ebenfalls unter die Erfindung fallen, sind diejenigen, bei denen Y Y¹ ist und Y¹ definiert ist als Rp-Leu-Arg. Verbindungen der Formel ΙΙΪ und ihre Säureadditionssalze, bei denen Y, Rp und R-i die oben angegebene Bedeutung haben, werden hergestellt durch Reduktion (Abspaltung) der Schutzgruppe oder Entfernung einer Schutzgruppe durch saure Zersetzung aus einer Verbindung der Formel

Y"_p_ro-R (VIII)

vorzugsweise in Form des Säureadditionssalzes, wobei R^ die oben angegebene Bedeutung hat und Y" Arg, Leu-Arg oder vorzugsweise R2~Leu-Arg ist, wobei die endständige Aminogruppe geschützt ist durch eine Gruppe, die leicht durch Reduktion abgespalten werden kann, wie eine Benzyl-

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oxycarbonyl- oder Benzhydryloxycarbonylgruppe, wobei die Verbindung in einem Lösungsmittel, wie einem niederen Alkylalkohol, vorzugsweise Methanol, gelöst ist und ein Edelmetallkatalysator, wie Palladium-aui-Kohle_; in Gegenwart von molekularem Wasserstoff angewandt wird oder durch Spaltung, wenn die Schutzgruppe leicht durch saure Zersetzung entfernt werden kann, wie eine tert-Butoxycarbonylgruppe.unter Anwendung einer Säure, wie Trifluoressigsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure usw. in einem entsprechenden Lösungsmittel, wie Dioxan, Di chlorine than, Essigsäure usjW. Die Reduktion oder Säurezersetzungsreaktion werden durchgeführt bei ungefähr 10 bis ungefähr 50⁰C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, und zwar einige Minuten bis zu ungefähr 8 Stunden, vorzugsweise ungefähr 15 Minuten für die Säurezersetzung. Der pH-Wert kann so eingestellt werden, daß die Verbindung in die freie Base umgewandelt wird.

Die Salze der Verbindungen der Formel VIII werden hergestellt aus den Methylestern der Formel

Y»-Pro-OCH₃.HC1 (IX)

in der Y" die oben angegebene Bedeutung hat. Diese Verbindung wird ^umgesetzt mit einer Verbindung aus der Gruppe von Ammoniak, niederen Alkylaminen oder Di-(niederen Alkyl)aminen. Die Reaktion wird bei Temperaturen von ungefähr 5 bis ungefähr 60°C einige Stunden bis zu ungefähr 10 Tagen durchgeführt. Wenn stark flüchtige Amine angewandt werden, wird die Reaktion in einem geschlossenen Druckgefäß durchgeführt.

Es ist auch häufig vorteilhaft, wenn R^H weniger reaktionsfähig ist, Verbindungen der Formel III herzustellen, ausgehend von P-Pro-R^ (lila), wobei P eine geeignete Schutzgruppe ist, wie eine Benzyloxycarbonyl- oder tert.-Butyloxycarbonylgruppe. Nach Entfernung der Schutzgruppe von P-Pro-R^ nach den oben beschriebenen Verfahren, kann das entstehende Pro-R^ gekuppelt wer-

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an Y¹ 'OH Ά/Ι.

den/nach Standardverfahren in der Peptidchemie wie mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid in tert.-Butanol. Die Entfernung der Schutzgruppe von dem entstehenden Y"-Pro-R-3 ergibt dann die gewünschte Verbindung der Formel III (Y-Pro-R,).

Die Herstellung von P-Pro-R, kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden einschließlich der Umsetzung von R,H mit P-Pro-OH .,nachdem die zuletzt genannte Verbindung umgewandelt worden ist in ein aktiviertes Zwischenprodukt über Dicyclohexylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid in Kombiaation mit Pentachlorphenol, mit Diphenylphosphorylazid (Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 22, 859-863,1974) oder mit Hilfe des gemischten Anhydridverfahrens.

Die Verbindungen der Formel IX werden hergestellt aus bekanntem Pro-OCH^.HCl -, das gekuppelt wird an bekanntes geschütztes Arg-OH, geschütztes Leu-Arg-OH oder geschütäes Rp-Leu-Arg-OH, nach dem zur Herstellung von Verbindungen der Formel V angegebenen Verfahren. Ein zweites Verfahren zur Herstellung bestimmter Verbindungen der Formel IX umfaßt die Kupplung von Arg-Pro-OCH,.HCl mit bekanntem geschützten Leu-OH oder geschütztem Rp-Leu-OH.

Außerdem können die Verbindungen der Formel VIII hergestellt werden durch Umsetzung von geschütztem Pro-OR^ mit einem Amih der Formel R,H, wobei R^ die oben angegebene Bedeutung hat₍ unter Anwendung der zur Herstellung von Verbindungen der Formel VIII angegebenen Reaktionsbedingungen. Das entstehende Produkt, geschütztes Pro-R , wird nach den. zur Entfernung einer Schutzgruppe von einer Verbindung der Formel VIII angegebenen Verfahren von der Schutzgruppe befreit. Die Verbindungen der Formel Pro-R^ werden entweder an bekanntes geschütztes Arg-OH oder geschütztes Leu-Arg-rOH gekuppelt nach dem Verfahren, das angegeben ist zur Herstellung von Verbindungen der 'Formel V.

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Schließlich kann die Amidfunktion in eine freie Säure der Formel

Y"-Pro-OH

in der Y" die oben angegebene Bedeutung hat, eingeführt werden unter Anwendung des Verfahrens, wie es allgemein beschrieben ist zur Herstellung bestimmter Verbindungen der Formel VIII,und die entstehende Verbindung der Formel

Y"-Pro-R₃

wird, wie oben bei der Herstellung von Verbindungen der Formel III angegeben, von der Schutzgruppe befreit.

Alternativ können Verbindungen der Formel III hergestellt werden durch stufenweise Kupplung und Entfernung der Schutzgruppe von einer Verbindung der Formel Υ''-Pro-R^ unter Verwendung von geschütztem Leu-OH, geschütztem Arg-OH, geschütztem Leu-Arg-OH, geschütztem Rp-OH in der entsprechenden Anzahl und Reihenfolge nach dem Verfahren, wie es angegeben ist zur Herstellung von Verbindungen der Formel V.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen bilden Säureadditionssalze mit einer Vielzahl von anorganischen und organischen Säuren. Pharmazeutisch geeignete Säureadditionssalze werden gebildet von solchen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Gluconsäure, Pamoasäure und verwandten Säuren. Die Erfindung umfaßt auch allgemein Säureadditionssalze, da ein toxisches Salz in die freie Base oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz umgewandelt werden kann. Die freie Base und die Säureadditionssalze sind durch Einstellung des pH-Wertes oder mit Hilfe von Ionenaustauscherharzen ineinander umwandelbare Sie können sich in der Löslichkeit unterscheiden, sind jedoch, wie oben erwähnt, im übrigen für die erfindungsgemäßen Zwecke äquivalent.

../12

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Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre Säureadditionssalze in wasserfreien sowie in solvatisierten einschließlich hydratisierten Formen vorliegen. Im allgemeinen sind die hydratisierten und mit pharmazeutisch geeigneten Lösungsmitteln solvatisierten Formen den wasserfreien oder nicht solvatisierten Formen für die erfindungsgemäßen Zwecke äquivalent. Typische Hydrate sind die obenerwähnten Hydrochloride oder Sulfate in Form ihrer Monohydrate.

Die erfindungsgemäßen Octapeptide wurden auf ihre LRF-Antagonisten-Wirkung in vitro untersucht, wobei Zellkulturen von Hypophysen-Vorderlappen von Ratten (rat anterior pituitary cell cultures) angewandt wurden (VaIe et al Endocrinology, 91, 562 (1972)). Db Hemmung der durch LRF-induzierten Freisetzung von luteinizierendem Hormon (LH) in das Zellkulturmedium wird als Endpunkt dieser in-vitro-Bestimmung angesehen. Aktive Peptide wurden dann in vivo nach dem von Humphrey et al (Endocrinology, 92, 1515, (1972)) angegebenen Verfahren untersucht. Die Antagonistenwirkung wurde bestimmt durch die Hemmung der durch LRF-induzierten LH-Freisetzung bei der weiblichen Ratte und der LRF-induzierten Ovulation bei Kaninchen.

Im folgenden sind die Ergebnisse der oben angegebenen in-vitro-Tests für bestimmte bevorzugte Verbindungen angegeben.

../Tabelle 709819/1040

IßT -

Aktivität bei In-vitro-Tests .an Zellkulturen von Hypophysen-Vorderlappen von Ratten

Verbindung

Ν^α-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-proIyI-N-•äthylamid · 1,125 HCl, Solvat mit 2 CHJi)H „

N^-Benzyloxycarbony1-0-benzyl-L-seryl-_L-tryptophyl-_L-seryl-L-tyrosyl- ^-phenylalanyl-J^-leucyljL-arginyl-L-prolin N-äthylamid hydrochlorid -2H₂O

α, Ύ

N -Benzyloxycarbonyl-N benzyl-L-glutaminyl-L,-tryptophyl-L-seryl·=-!,-tyrosyl-^-phenylalanyl-L-leucy l-jL-arginy 1-jL-prolin N- thylamid hydrochlorid · IHCl 2,5H₂O

Molkonz entra ti on

5x10-? IxIO"⁰

LH Wert

5x10

-9

-q 11.16 19; 91 30,85 38« 13

1x10 Vergleich LRF (5x10-10)
Vergleich Salzlösung9jlO

Ixlo'⁸ 9,16

6x10"⁹ 10,95

11,16

19j55 -10

35 2x10-9

1x10"⁹ 6x10"^L0 2,5xlO 1x10"^l0

Vergleich LRF 35xl0"¹⁰ 5^
29,88 36Λ8 38

Vergleich Salzlösung

2x10 1x10 6x10

"⁸

1x10 6x10

-9 -10 l0_r77 ll_y28

15,07 21,76 22_y09 23,66

2,5χΐ0"¹⁰ 1x10"^l0 Vergleich LRF

3,5xl0"¹⁰
Vergleich Salzlösung 8„72

5y3 35,62 30.60 38

prozentuale Hemmung der LH-Fre i s e tzung

95 71 42

23

99 93 93 83 68 50

37 18

92 81 61 60 56

51 20

35

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26491U

Es ist bekannt, daß der das luteinisierende Hormon freisetzende Faktor (LRP) in dem Hypothalmus von Säuretieren gebildet wird, von wo er freigesetzt und über das Hypothalmus-Hypophysen-System (hypothalainic-hypophyseal portal system) zu dem vorderen Hypophysenlappen (anteroir pituitary) transportiert wird, wo er die Sekretion des luteinisierenden Hormons stimuliert. Die Sekretion des luteinisierenden Hormons von dem Hypophysen-Vorderlappen führt wiederum zur Ovulation bei Versuchstieren. So kann LRF angewandt werden, um die Ovulation bei Säugetjeren einzuleiten. (Ein Bericht über die Struktur von LRF, das auch als luteinisierendes Hormon freisetztendes Hormon oder L_-H-RIi bezeichnet wird,und

findet sich m seine biologische Aktivität Science, Band 174, Nr. 4008, Oktober 1971, Seiten 511-512.) Die erfindungsgemäßen Octapeptide sind geeignet zur Steuerung der Ovulation und zur Einschränkung der Fruchtbarkeit.

Die Erfindung wird, durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 I^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-

L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid

a) N^-Benzyloxycarbonyl-D-alanin

Zu einer Lösung von 12,5 g D-Alanin in 70 ml 2n Natriumhydroxid wurden unter Eiskühlung und Rühren gleichzeitig 24 g Benzyloxycarbonylchlorid und 35 ml 4n Natriumhydroxid zugetropft. Der pH-Wert wurde mit einer in das Reaktionsgefäß eintauchenden Elektrode gemessen und auf 10 bis 12 gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde eine v/eitere Stunde bei 4⁰C gerührt und dann mit 100 ml Äthyläther extrahiert und mit konz. Salzsäure

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-^- 26491H

auf einen pH-Wert von 3 angesäuert. Das ausfallende Produkt wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet. Man erhielt ?3,5 g, Fp. 82-85°C; β£ίψ + 14,8° (c 1, 1n Essigsäure). Einzweiter Anteil konnte aus dem Filtrat durch Einengen und Abkühlen erhalten werden.

b) N^-Benzyloxycarbonyl-D-alanyl-L-leucin-methyl-ester

Eine Lösung von 8,92 g N^-Benzyloxycarbonyl-D-alanin, 7,28 g Leucin-methyl-ester-hydrochlorid und 5,4 g 1-Hydroxybenztriazol in 100 ml Dimethylformamid wurde unter Rühren auf -10⁰C gekühlt und mit 5,6 ml Triäthylamin behandelt. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei -10⁰C gerührt und mit 8,6 g Dicyclohexylcarbodiimid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Minuten bei -10⁰C gerührt, auf O⁰C gebracht und 2 Stunden bei 10⁰C gerührt und anschließend über Nacht bei 20⁰C. Das Gemisch wurde auf 50⁰C erwärmt und 2 Stunden gerührt.

Das R.eaktionsgemisch wurde filtriert, mit 20 ml Dimethylformamid gewaschen, das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei 40°C entfernt, wobei ein dickes Öl zurückblieb. Das Öl wurde in 400 ml Äthylacetat gelöst und mit 4x25 ml 5-%iger Natriumbicarbonatlösung, 2-mal mit verdünnter Salzsäure (1n), 2-mal mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und die Lösung über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und bei 40⁰C unter vermindertem Druck zu einem kristallinen Feststoff eingedampft. Der Feststoff wurde mit 40 ml Petroläther bedeckt, 10 ml Äthyläther zugegeben und der Feststoff aufgebrochen und filtriert. Das Produkt schmolz bei 67 bis 70⁰C; ß*J^ -9,9°(c 2,04, Methanol)

c) D-Alanyl-L-leucin-methyle ster-hydrochlorid

Eine Lösung von 7 g N^-Benzyloxycarbonyl-D-alanyl-L-leucin-methylester in 100 ml Methanol und 22 ml 0,95n Chlorwasserstoff in Methanol wurde mit 500 mg 20-^oigem Palladiumauf-Kohle als Katalysator unter Viasserstoff bei einem Druck

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von 2,5 cm Wassersäule behandelt bis die Dünnschichtchromato-'graphie einer Probe eine vollständige Umwandlung zeigte (3 bis 6 Stunden). Die Lösung v/urde zur Entfernung des Katalysators filtriert und zu einem schaumartigen Produkt eingedampft. Beim Lösen in 50 ml Chloroform und Ausfällen mit Äthyläther erhielt man ein Öl, das gesammelt und bei 45⁰C und 1 mm Druck getrocknet v/urde. Das Öl wurde in der nächstai Stufe ohne weitere Reinigung verwendet.

d) N^-Benzyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucin-methylester

Eine Lösung von 8,33 g N^ö-Benzyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid (vgl. Hofmann, J.Am.Chem.Soc., 79, 1636 (1957)) in 160 ml Dimethylformamid wurde auf -20⁰C gekühlt und mit 41 ml 2.,92n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran behandelt. Die Lösung wurde 10 Minuten bei -30⁰C gerührt und mit 3»2 ml Isopentylnitrit behandelt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei -30 bis -10⁰C gerührt, auf -40⁰C abgekühlt und mit 19,6 ml Triäthylamin behandelt. Es v/urde dann 5 Minuten gerührt und eine Lösung von 5,56 g D-Alanyl-L-leucin-methylester-hydrochlorid in 30 ml Dimethylformamid zugegeben und das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei -10⁰C gerührt, erneut auf -40⁰C gekühlt und über Nacht bei 22⁰C stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wurde auf 50⁰C erwärmt während es 3 Stunden gerührt wurde und filtriert. Das Filtrat wurde bei 40⁰C unter vermindertem Druck zu einem Öl eingedampft, das in Äthylacetat aufgenommen, filtriert und mit Äther und Petroläther zu einer gummiartigen Substanz ausgefällt wurde. Bei Behandlung des Gummis mit Methanol und etwas Isopropanol erhielt man einen weißen kristallinen Feststoff, der abfiltriert und an der Luft getrocknet v/urde. Das Produkt schmolz bei 175 bis 180⁰C. Beim Umkristallisieren aus einem Gemisch von Isopropanol, Methanol, Äther und Petroläther erhielt man ein Produkt Fp. 178-181⁰C; ZQlTd^ _4-| ^4° (_c> 1P2, DMF); UV-Spektrum in Methanol 7V_max \ 277 E^j 27,4.

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e) L-Seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucin-methylesterhydrochlorid

Eine Lösung von 3 g N fr-Benzyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucin-methylester in 100 ml Methanol, enthaltend 3,7 ml 1,35n Chlorwasserstoff in Methanol, wurde mit 200 mg 20-%igem Palladium-auf-Kohle unter einem Druck von 2,54 cm Wassersäule 3 Stunden gerührt. Die Dünnschichtchromatographie einer Probe*der Lösung zeigte ein Verschwinden der Ausgangssubstanz innerhalb von ungefähr 2 Stunden. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um den Katalysator zu entfernen und das Filtrat bei 30 bis 40⁰C eingedampft. Man erhielt ein schaumförmiges Produkt, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.

f) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucin-methylester

Das in Stufe e) erhaltene Produkt wurde mit 1,7 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophan, 25 ml Dimethylformamid und 680 mg 1-Hydroxybenztriazol behandelt. Das Gemisch wurde bis zur Lösung gerührt, auf -10°C gekühlt und mit 0,7 ml Triäthylamin behandelt, 15 Minuten gerührt und 1,2 Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei -10 bis -5°C und über Nacht bei -5 bis 20°C gerührt und anschließend 1 Stunde bei 60 bis -30°C und filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand in 30 ml Methanol und etwas Äthylacetat gelöst. Bei Zugabe von Äthyläther schied sich ein Öl aus, das erneut mit Äthyläther und Petroläther aus Methanol ausgefällt wurde. Das Öl wurde durch Dekantieren abgetrennt und in Äthylacetat und etwas Äthanol aufgenommen. Beim Stehen schied sich ein Feststoff ab, und es wurde weiteres Äthylacetat zugegeben, um die'^: Kristallisation zu beschleunigen. Das Produkt wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet. Weiteres Material erhielt man durch Ausfällen aus den Mutterlaugen. Die Reinigung wurde durch teilweises Lösen in abs. Äthanol unter Rühren, Filtrieren und Eindampfen des Äthanolfiltrats zu einem Schaum. und Rühren mit Äthylacetat erreicht. Der so er-

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2S491H

haitene weiße Feststoff schmolz bei 144 Ms 147°C. Das Produkt wurde über Silicagel in Chloroform Chromatographiert und das Produkt aus den ersten Eluaten erhalten. Es wurde aus einer kleinen Menge Äthylacetat zu einem Gel kristallisiert und dann aus Methanol; Fp. 115-120⁰C; β>βψ -22,3° (c 0,99, Methanol).

g) L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucinmethylester-hydrochlorid

Eine Lösung von 1,58 g N^Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyi-D-alanyl-L-leucin-methylester in 100 ml Methanol mit 1,6 ml 1,3n Chlorwasserstoff in Methanol wurde mit 150 mg Palladium-auf-Kohle unter einem Druck von 2,54 cm Wassersäule 2,5 Stunden gerührt. Die Dünnschichtchromatographie von Proben der Lösung zeigte ein Verschwinden der Ausgangssubstanz innerhalb von ungefähr 2 Stunden. Der Katalysator wurde abfiltriert und das FiItrat bei 40⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung verwendet.

h) N^a-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl~L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucin-methylester

Das unter g) erhaltene Produkt, 560 mg N°<-Benzyloxycarbonyl-L-glutamin und 270 mg 1-Hydroxybenztriazol wurden langsam in 20 ml' Dimethylformamid bei 25⁰C gelöst. Die Lösung wurde auf -10⁰C gekühlt und 0,28 ml Triäthylamin zugegeben. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und mit 570 mg Dicyclohexylcarbodiimid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 1,5 Stunden bei 40 bis -5°C und über Nacht bei -5 bis 20⁰C gerührt und anschließend 2 Stunden bei 30 bis 45°C, abgekühlt, filtriert ( mit etwas Dimethylformamid gewaschen) und das Filtrai? bei 40⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. Bei Behandlung des Rückstandes mit Methanol erhielt man ein Gel, das aufgebrochen und filtriert wurde. Das Produkt wurde dann in 20 ml Methylformamid unter Erwärmen aufgenommen, 20 ml Methanol zugegeben, die Lösung mit Aktivkohle behandelt und filtriert.

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Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit Methanol unter Bildung eines Gels behandelt, das filtriert, mit etwas Methanol und etwas wasserfreiem Äther gewaschen wurde. Der Feststoff kann in trockenem Äther gerührt, filtriert und bei 55⁰C unter vermindertem Druck getrocknet werden. Er schmilzt bei 233 bis 235°C; ß*J^ -36° (c 1,03, DMF).

i) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-hydrazid

Eine Lösung von 1,57 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucin-methylester in 20 ml Dimethylformamid und 20 ml Methanol wurde mit 1,5 ml Hydrazinhydrat behandelt und 72 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Es schied sich ein gelartiger Feststoff ab. Das Lösungsmittel wurde abdekantiert und der Rückstand mit 15 ml Methanol gerührt und filtriert. Der Rückstand wurde mit Methanol und Äther verrührt und filtriert. Das Produkt wurde bei 50⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 1,58 g; Fp. 235-240⁰C.

j) N^-Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-prolin-methylesterhydrochlorid

Ein Gemisch von 25 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-arginin, 13,5 g L-Prolin-methylester-hydrochlorid und 11 g 1-Hydroxybenztriazol in 200 ml Dimethylformamid wurde langsam unter Rühren innerhalb von einer Stunde gelöst. Das Gemisch wurde auf O⁰C abgekühlt, mit 1.7 g Dicyclohexylcarbodiimid behandelt und einige Stunden unter Kühlung und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde dann unter Rühren 2 Stunden auf 30 bis 50⁰C erwärmt und über Wacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gemisch wurde filtriert, mit etwas Dimethylformamid gewaschen und das Filtrat bei 40°C unter vermindertem Druck zu einem Öl eingedampft. Das Öl wurde in einer kleinen Menge Methanol gelöst und langsam zu 500 ml Äthyläther unter heftigem Rühren zugegeben. Die dispergierten

../20

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Tröpfchen verfestigten sich und wurden aufgebrochen und abfiltriert. Das Produkt wurde weiter gereinigt durch Lösen in heißem Methanol und Zugabe von Äthylacetat bis zum Auftreten einer Trübung und dann von Äther bis zur vollständigen Trübung. Die Lösung wurde angeimpft und zur Kristallisa-

geschwenkt

tion leicht (swirled) und zur vollständigen Kristallisation gekühlt. Das Produkt wurde abfiltriert. Es schmolz bei 125 bis 130⁰C. Bei 2-maligem Umkristallisieren aus Methanol-Äthylacetat-Äther stieg der Schmelzpunkt auf 130 bis 135⁰C; JSU^ -66° (c 1,01, Methanol); UV-Spektrum in'Methanol λ_» 251 E_-1 4,5. Beim Umkristallisieren aus Chloroform erhielt man ein Produkt Fj>. 165-167 C; ßxj ^

-63° (c 1,02.Methanol); UV-Spektrum in Methanol Λ „„. /ι ' lnax

257 E^ 4,7.

k) NQf-Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamidhydrochlorid

Zu einer kalten Lösung von 9,7 g Äthylamin in 50 ml Methanol wurden.2 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-prolinmethylester-hydrochlorid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in einer verschlossenen Druckflasche bei Raumtemperatur stehengelassen und dann gelegentlich innerhalb von 8 Tagen auf 40 bis 45°C erwärmt. Es wurde dann unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingedampft. Die restliche Lösung wurde unter Rühren in Äthyläther getropft, wobei ein etv/as klebriger weißer Feststoff ausfiel., der unter vermindertem Druck getrocknet wurde; £CxJq -53° (c 1,02,

Methanol); UV-Spektrum in Methanol λ „, 257 κ] 4,2.

max ι

1) L-Arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrochlorid

Eine Lösung von 8,7 g N°^-Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydroChlorid in 100 ml Methanol wurde mit 500 mg 20-%igem Palladium-auf-Kohle unter einem Wasserstoff druck von 2,54 cm Viassersäule 3 Stunden behandelt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat unter vermin-' dertem Druck bei 35 bis 40⁰C eingedampft. Das verbleibende

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schaumartige Produkt wurde ohne v/eitere Reinigung verwendet.

m) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid

Eine Lösung von 2,455 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-hydrazid in 40 ml Dimethylformamid wurde auf -20⁰C abgekühlt und mit 6,15 ml 2,56n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran behandelt. Die Lösung wurde unter Rühren auf -25°C innerhalb von 10 Minuten abgekühlt und 0,45 ml Isopentylnitrit zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden bei -35 bis -20°C gerührt und 2,2 ml Triäthylamin zugegeben und anschließend 1,44 g L-Arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrochlorid und 0,42 ml Triäthylamin. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden bei -30 bis 15⁰C und über Nacht bei 20°C gerührt.

Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei 30 bis 50⁰C gerührt, im Eisbad gekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde bei 50⁰C unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit 40 ml Methanol und 1 ml 2,56n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran behandelt. Die Lösung wurde erneut unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man ein Öl erhielt, das in 30 ml Methanol aufgenommen wurde und 75 ml Äthylacetat zugegeben, um das TriäthylaminhydroChlorid auszufällen. Das Filtrat wurde abgetrennt und mit Äthylacetat unter Bildung eines lohfarbenen Niederschlags behandelt. Der Feststoff wurde nach dem Abkühlen abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet«, Er verflüssigte sich bei 154 bis 157°C unter Schaumbildung.

Das Produkt wurde weiter gereinigt durch Chromatographie über Silicagel unter Verwendung von 20 bis 33 % Methanol in Chloroform zum Eluieren. Die Dünnschichtchromatographie wurde angewandt, um die Fraktionen des Eluats zu untersuchen und die nur ein einzelnes Produkt enthaltenen Fraktionen zusammengegeben und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml Wasser aufgenommen,

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durch ein feines Glasfilter filtriert und zu einem weißen Feststoff lyophilisiert. Das Produkt wurde dann aus Methanol-Chloroform als gelartiger Niederschlag von N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrochlorid ausgeschieden, das "beim Erwärmen und Stehen körnig wurde und abfiltriert und nach dem Lösen in Wasser und Filtrieren lyophilisiert wurde; UV-Spektrum in Methanol > 280 Ej 58,0; £*3ψ -53° (c 1,0, Methanol); /OcJ^ -29,6^§ (c 0,908, V/o CH₃COOH).

Eine Lösung von 100 mg N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrochlorid in einer mögliehst geringen Menge V/asser, 40 bis 50 ml, wurde auf eine Säule von Dowex 1x2 (Acetatform) von 1,2x37 cm gegeben. Das Produkt wurde dann mit 150 ml V/asser eluiert und die Fraktionen lyophilisiert und das N^Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-essigsäure-salz durch das UV-Spektrum in Methanol ( \_ax 280 E^j 56,3) untersucht sowie auf Chlorid geprüf-Die Anatyse zeigte ein Acetatsalz mit 2 CH^COOH und 5 H₂O pro Molekül.

Beispiel 2 N^ö-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-

• L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid

a) L-Seryl-L-tyrosin-methylester-hydrochlorid

Zu einem Gemisch von 8,328 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosin-methylester (vgl. Fischer und Whetstone, JoAm.Chem.Soc., 76, 5076 (1954)) und 500 mg 20-%igem Palladiumauf -Kphle wurden 70 ml Methanol, enthaltend 6,67 ml 3n-Chlorwass'.erstoff in Tetrahydrofuran gegeben und das Gemisch 3 Stunden unter Wasserstoff mit einem Druck von 2,54 cm Wassersäule gerührt. Das Gemisch wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne

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eingedampft. Man erhielt einen Rückstand von L-Seryl-L-tyrosinmethylester-hydrochlorid, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.

b) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosinme thiole st er

Das unter a) erhaltene Produkt und 11,7 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophan-pentachlorphenyl-ester (vgl. Kovacs et al., J.Org.Chem., 32, 3696 (1967)) wurden in 60 ml Dimethylformamid gelöst, unter Rühren auf -10⁰C abgekühlt und mit 28 ml Triäthylamin behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden bei -10⁰C gerührt und unter Rühren über Nacht auf Raumtemperatur erwärmt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat bei 50⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde 2-mal in Methanol gelöst und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt« Der Rückstand wurde dann erneut in 30 ml Methanol aufgenommen und durch Zugabe von 300 ml Äther und 100 ml Petroläther ausgefällt. Das abgeschiedene Öl wurde erhalten durch Abdekantieren und Verrühren mit 30 ml heißem Äthylacetat. Das Produkt wurde erhalten durch Abkühlen und Ausfällen durch Zugabe von Äther und Petroläther. Es wurde weiter gereinigt durch wiederholtes Ausfällen aus Methanol mit Petroläther. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und das Öl bei 50⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Das so erhaltene Produkt war ein lohfarbener Schaum , der aus Methanol, Äther und Petroläther unter Animpfen auskristallisiert werden konnte; Fp. 149-152⁰C; /Ö_7Jp -1,8° (c 1,00, Methanol); UV-Spektrum in Methanol, T^_3x 289,5 E^J 92, ^_013x 280 E^j 122.

c) L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-methylester-hydrochlorid

Zu einem Gemisch von 3,Tg N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-methylester und 200 mg 20%igern Palladium-auf-Kohle wurden 75 ml Methanol, enthaltend 1,7 ml 3n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran, gegeben und das Reaktionsgemisch unter Wasserstoffatmosphäre 2,5 Stunden ge-

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rührt. Das Gemisch wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhielt einen Rückstand von L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-methylester-hydrochlorid, der ohne v/eitere Reinigung verwendet wurde.

d) N^Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-methylester

Ein Gemisch des unter c) erhaltenen Produktes, 1,4 g N^-Benzyloxycartjonyl-L-glutamin, 670 mg 1-Hydroxybenztriazol und 50 ml Dimethylformamid wurde gerührt und auf -10⁰C abgekühlt und 0,7 ml Triäthylamin zugegben. Nach 15 Minuten wurde es mit 1,2 g Dicyclohexylcarbodiimid behandelt und einige Stunden bei -10⁰C und dann 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt und schließlich weitere 3 Tage stehengelassen. Die Lösung wurde filtriert·und das Filtrat unter vermindertem Druck bei 50⁰C eingedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol mit V/asser zur Ausfällung gebracht und dann 3-mal aus Methanol umkristal lisiert; Fp. 245-248°C; β>θψ -4,4° (c 1, DMF); UV-Spektrum in Methanol, ^_x 290 e] 75,7; ^_x 280 E^j 100.

e) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrpsyl-hydrazid

Eine Lösung von 1,6 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-methylester in 17 ml Dimethylformamid wurde auf 30⁰C gekühlt und mit 3 ml Hydrazinhydrat behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 0,5 Stunden auf 30⁰C gehalten, die Lösung filtriert und das Filtrat 10 Minuten auf 50 bis 60°C erwärmt und über Nacht bei 25°C stehengelassen. Der Feststoff wurde abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Der feuchte Feststoff wurde in 25 ml Methanol zum Sieden erhitzt, abgekühlt, filtriert und mit Methanol und Äther gewaschen. Das Produkt wurde bei 50°C unter vermindertem Druck getrocknet; Fp. 260-270⁰C; βθψ -10,0° (c 1, DMF); UV-Spektrum in Methanol ^_x 289,7 E^ 77,2; ^_x 279 Ej 102.

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f) N^Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-ä thylami d-hydrο chiο rid

Eine Lösung von 18,6 g L-Arginyl-L-prolyl-N-äthylamidhydrochlorid (Beispiel 1, 1) und 7,2 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucin-p-nitrophenylester in 30 ml Dimethylformamid wurde 4 Tage stehengelassen, 0,5 Stunden auf 50⁰C erv/ärmt und unter vermindertem Druck bei 40°C unter Bildung eines Öls eingedampft. Ein festes Produkt wurde erhalten durch Chromatographieren über Silicagel, Eluieren mit Chloroform mit zunehmenden Mengen Methanol. Die Auswahl der Fraktionen wurde aufgrund analytischer Dünnschichtchromatographie durchgeführt und das erhaltene Produkt durch Ausfällen aus Methanol mit Äthylacetat und anschließend durch Eintropfen einer Methanollösung in Äthyläther als Feststoff erhalten. Der Feststoff wurde bei 40⁰C unter vermindertem Druck getrocknet; /7*7ip -68,4° (c 1, Methanol); UV-Spektrum in Methanol

²⁵⁷ A ³'⁵·

g) L-Leucyl-L-arginyl-L-prolyl-W-äthylamid-hydrochlorid

Ce

Zu einer Lösung von 1,8 g N -Benzyloxycarbonyl-L-

leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrochlorid in 100 ml Methanol wurden 400 mg 20-^iges Palladium-auf-Kohle gegeben und das Gemisch 4 Stunden unter Wasserstoffatmosphäre gerührt. Das Verschwinden des Ausgangsmaterials wurde durch Dünnschichtchromatographie von Proben der Lösung festgestellt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.

h) N^-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrοchlorid

Ein Gemisch des unter g) erhaltenen Produktes, 900mg M^-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanin (vgl. Yajima and Kubo, J.Am.Chem.Soc, 87, 2039 (1965)) und 400 mg 1-Hydroxybenztri azol wurden in 40 ml Dimethylformamid gelöst, dann abgekühlt

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und mit 700 mg Dicyclohexylcarbodiimid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Tage bei 23°C gerührt, filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck bei 50⁰C eingedampft. Der Rückstand wurde als Feststoff erhalten durch wiederholtes Ausfällen aus Methanol mit Hilfe von Äther und durch Äthylacetat und Äther. Er verflüssigte sich bei 130-135⁰C; /prjjf _6₉o (_c 1,02, Methanol); UV-Spektrum in Methanol

*max ²^ A 5,8.

i) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L~p r ο Iy 1-N-ei. thy larni d

Eine Lösung von 3,75 g N^-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylarnid-hydrochlorid in 100 ml Methanol wurd mit 500 mg 20-%igem Palladiumauf-Kohle gerührt und unter Wasserstoffatmosphäre 3 Stunden bei Raumtemperatur reduziert. Das Verschwinden der Ausgangssubstanz wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat bei 40⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 30 ml Dimethylformamid gelöst und in der folgenden Azidkupplungsreaktion angewandt.

Eine Suspension von 4,16 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid in 90 ml Dimethylformamid wurde durch Zugabe von 16,4 ml 2,08n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran bei 10⁰C unter Rühren gelöst. Die Lösung wurde auf -25⁰C gekühlt und mit 0,88 ml Isopentylnitrit 3 Stunden bei -10 bis -20°C und dann bei -40⁰C mit 4,8 ml Triäthylamin behandelt. Die so erhaltene Azidlösung wurde mit der oben angegebenen Lösung von D-Phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamidhyd-rochlorid mit Hilfe von 10 ml Dimethylformamid zum Ausspülen des Kolbens behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 2 Stunden bei -10 bis 5⁰C und 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat bei 50⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. · '

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2643ΊΗ

Das verbleibende Produkt wurde in 30 ml warmem Methanol gelöst und 30 ml Äthylacetat langsam unter Bewegen zugegeben. Dann wurden 200 ml trockener Diäthyläther in einzelnen Anteilen unter Bewegen zugegeben bis das gesamte Öl abgeschieden war. Die Ätherlösung wurde von dem Öl abdekantiert und das Öl dann mit 100 ml trockenem Äther behandelt bis es sich in einen hell lohfarbenen Feststoff verwandelt hatte, der abfiltriert, mit trockenem Äther gewaschen und an der Luft getrocknet wurde. Man erhielt 8,8 g. Dieser Feststoff wurde in 15 ml Methanol unter Erwärmen gelöst und 20 ml Äthylacetat und 5 ml trockener Diäthyläther zugegeben. Es fiel eine geringe Menge eines grauen Feststoffes aus, der abfiltriert und mit einem Gemisch aus 5 ml Äthylacetat und 5 ml Methanol gespült wurde. Zu dem Filtrat und den Waschflüssigkeiten wurden 10 ml trockener Äther zugegeben bis die Lösung grade wolkig wurde und das Gemisch erwärmt und bei 20⁰C stehengelassen bis sich ein Feststoff abschied und anschließend in Eiswasser gekühlt. Der Feststoff wurde abfiltriert, mit einem Gemisch aus 10 ml Methanol, 10 ml Äthylacetat und 10 ml Äther gewaschen und bei 50⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhielt 2,1 g (1. Anteil).

Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden mit 150 ml Äthylacetat unter Bewegen verdünnt, wobei ein halbfestes Öl sich abschied, das durch Abdekantieren des Lösungsmittels abgetrennt wurde."Das Öl wurde in einer möglichst geringen Menge warmem Methanol gelöst, auf Raumtemperatur abgekühlt und über Nacht stehengelassen und der Feststoff abfiltriert und unter vermindertem Druck bei 50⁰C getrocknet. Man erhielt 4,11 g. Der Feststoff wurde in 75 ml Methanol durch Erwärmen auf dem Dampfbad gelöst und die klare Lösung mit Hilfe eines Stroms warmer Luft auf 50 ml eingeengt und eilige Stunden bei 25°C .stehengelassen und dann im Eisbad gekühlt und der Feststoff abfiltriert (2. Anteil).

Die Anteile 1 und 2 wurden zusammengegeben und in 75 ml ,Methanol gerührt und über Nacht bei 20⁰C stehengelassen, in •Eis gekühlt, der Feststoff abfiltriert und mit einem Gemisch

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aus 15 ml Methanol, 15 ml Äthylacetat und 10 ml Äthyläther ge-• spült und bei 50⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhielt 4,4 g. Dieser Feststoff wurde in 200 ml heißem Methanol gelöst, die Lösung filtriert und das klare Filtrat mit einem Strom v/armer filtrierter Luft auf 75 ml eingeengt und 5 Stunden bei 20⁰C stehengelassen. Der Feststoff wurde abfiltriert und mit einem Gemisch aus 15 ml Methanol, 15 ml Äthylacetat und 10 ml Äther gespült und teilweise getrocknet. Der Feststoff wurde erneut mit 50 ml warmem Methanol verrührt und über Nacht bei 25°C stehengelassen, im Eisbad gekühlt, filtriert und mit 40 ml Lösungsmittelgemisch gewaschen . und bei 50 C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 3102 g N^Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrochlorid £ÖrJ^ -71° (c 1,004, Methanol); UV-Spektrum in Methanol a_v 289,5 E^j 44,3; "K_n^ 280 έ\ 57,8; /öL?D -2.7,4° (c 1,03, DMF).

Eine Lösung von 300 mg N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrochlorid in 100 ml Methanol wurde auf eine Säule von Dowex 1x2 (Acetatform) von 1,8 χ 23 cm gegeben und die Substanz mit Methanol eluiert, wobei Fraktionen von 40 ml aufgefangen wurden. Die Fraktionen 2 bis 5 ergaben beim Stehen ein unlösliches Produkt. Sie wurden zusammengegeben und filtriert und das Filtrat auf 30 ml eingeengt und mit 150 ml Äther verdünnt. Das ausfallende Produkt wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und bei 50°C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt InA-B enzyl oxy carbonyl- L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-acetat [J³CIj? -29° (.ο 1,00, DMF); ^_x 289,5 E^ 41,7 ^_x 280 E^ 54,3.

Beispiel 3 N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-

L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid

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a ) N^-tert. -Butoxycarbonyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrochlorid

Eine Lösung von 1,2 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrochlorid (Beispiel 2, f) in 50 ml Methanol wurde mit 200 mg 2O-?6igem Palladium-auf-Kohle behandelt und unter Wasserstoffatmosphäre 3 Stunden ge rührt. Das Verschwinden der Ausgangssubstanz wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft und der Rückstand mit 0,608 g Filtert.-Butoxycarbonyl-D-tryptophan und 275 mg 1-Hydroxybenztriazol in 30 ml Dimethylformamid behandelt. Die Lösung wurde auf -10⁰C abgekühlt und mit 500 mg Dicy.clohexylcarbodiimid behandelt. Das Gemisch v/urde 1 Stunde bei -10⁰C und dann 24 Stunden bei 20 bis 30°C behandelt. Die Lösung wurde filtriert und mit etwas Dimethylformamid gespült. Das Filtrat v/urde unter vermindertem Druck bei 40⁰C eingedampft. Der Rückstand wurde gereinigt durch Lösen in Methanol und Äthylacetat und Einrühren in Äther. Der Feststoff wurde erneut aus Methanol mit Äther ausgefällt und bei 40⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Er zersetzte

sich bei 160-165⁰C; UV-Spektrum in Methanol λ _ 290 έ]

λ λ max ι

^{281 Ε}ι ⁶⁸'^5; Vx²⁷³ A

b) D-Tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylami d-dihydrο chlo rid

Die tert.-Butoxycarbony!-Schutzgruppe wurde von dem unter a) erhaltenen Produkt entfernt durch Lösen von 1,3 g in 14 ml Methanol und Behandlung mit 14 ml 2n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran. Nach 30 Minuten wurde die Lösung unter vermindertem Druck bei 30⁰C eingedampft. Der Rückstand wurde aus 15 ml Methanol durch Eintropfen der Lösung in 100 ml trockenen Äther unter Rühren ausgefällt und der Feststoff abfiltriert, mit Äther gewaschen und bei 50⁰C unter vermindertem Druck getrocknet.

../30 709819/1040

26491H

c) N^a-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid

Eine Suspension von 1,46 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid (Beispiel 2, e) in 30 ml Dimethylformamid wurde unter Rühren auf 0°C gekühlt und mit 3,3 ml 3,64n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran behandelt. Der Feststoff ging in Lösung. Die Lösung wurde dann auf -25°C gekühlt und mit 0,31 ml Isopentylnitrit "behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 2,5 Stunden bei Ό bis -21⁰C gerührt und dann mit 1,96 ml Triäthylamin und mit 1,27 g des oben angegebenen Dihydrochloride von D-Tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid als Feststoff mit 12 ml Dimethylformamid gespült behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei -25°C gerührt und dann nach und nach innerhalb einer Stunde auf 0° und 24 Stunden auf Raumtemperatur erwärmt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat bei 50⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 25 ml warmem Methanol gelöst und 15 ml warmes Äthylacetat langsam zugegeben bis die Lösung trüb wurde dann wurde Methanol zugegeben, um die Lösung wieder klar zu machen und 5 ml trockener Diäthyläther und die Lösung erneut mit etwas Methanol geklärt. Beim Stehen über Nacht schied sich ein hellbrauner Feststoff ab, der abfiltriert und mit etwas kaltem Methanol gewaschen wurde. Der Feststoff wurde in 40 ml heißem Methanol gelöst, die Lösung mit 0,5 g Aktivkohle behandelt, über feinporiges Filterpapiert filtriert und das Filtrat mit Hilfe eines Luftstroms bei 40⁰C auf 15 ml eingeengt. Es schied sich eine kleine Menge (15 mg) eines gefärbten Feststoffs ab, der abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde 2 Tage stehengelassen, wobei es bei 20⁰C langsam auf ein kleines Volumen von 5 ml eingeengt wurde und der sich ansammelnde Feststoff wurde abfiltriert und mit 10 ml kaltem Methanol gewaschen und bei 50°C unter

', vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 280 mg .;' li^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-' ' tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthyl-

709819/10A0

../31

amid-hydrochlorid, £<*J^ -18,2° (c 1,02, DMF); UV-Spektrum

in Methanol A_max 290 I^ 80; ^_x 280,5 Ji] 98,0.

Die gesammelten Filtrate und Waschflüssigkeiten des oben angegebenen Verfahrens wurden zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 25 ml Methanol, 10 ml Äthylacetat, 5 ml Äther und 15 ml Chloroform gelöst und über eine Säule von 50 g Silicagel (zubereitet in 20 % Methanol und 80 % Chloroform) chromatographiert und die Säule mit Methanol-Chloroform 20:80 eluiert und die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wie durch Dünnschichtchromatographie gezeigt wurde,zus'ammengegeben, auf ein kleines Volumen eingeengt und das Produkt durch Zugabe von Äther als Feststoff ausgefällt. Der Feststoff wurde in Methanol gelöst, mit Luft auf ein kleineres Volumen eingeengt und stehengelassen. Der ausfallende Feststoff wurde abfiltriert und das Verfahren wiederholt. Der B'eststoff wurde unter vermindertem Druck bei 50⁰C eingeengt. Man erhielt 450 g des gleichen Produktes wie oben; ßxj²^? -17,9° (c 1,015, DMF) UV-Spektrum in Methanol

Anax ²⁸⁹>⁵ 4 ⁸¹·^{5 7}W ^{280 E}1 ⁹⁹'⁵·

Beispiel 4 N -Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-

L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid

a) N -Benzyloxycarbonyl-D-leucyl-L-leucin-methylester

Eine Lösung von 2,65 g N^-Benzyloxycarbonyl-D-leucin (hergestellt nach dem Verfahren von Grassman und Wünsch, Ber. 91, 462 (1968) für DL-Leucin und für L-Leucin s. Losse und Demuth, Ber. 94, 1762 (1961). Die Substanz war ein Öl, wie für das iiQ'-Benzyloxycarbonyl-L-leucin-Enantiomer angegeben. S. auch Farthing, J.Chem.Soc. 1950, 3213 und Bergmann, J. Biol. Chem., 115, 593 (1936).) in 50 ml Dimethylformamid wurde''mit 1,98 g L-Leucin-methylester-hydrochlorid behandelt und im Eisbad gekühlt. Die Lösung wurde mit 1,4 ml Triäthylamin und dann mit 1,5 g 1-Hydroxybenztriazol und schließlich mit 2,26 g Dicyclohexylcarbodiimid behandelt. Das Reaktions-

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gemisch wurde über Nacht gerührt, anfangs unter Eiskühlung und nach und nach unter Erwärmen auf Raumtemperatur und dann weitere Zk Stunden bei Raumtemperatur. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 1n Salzsäure, gesättigter Natriumchlor idlö sung, 5-/oiger Natriumbicarbonatlösung und erneut mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die Äthylacetatlösung wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand kristallisierte aus und wurde aus Isopropyläther umkristallisiert; focjr? -5,3° (c 2,06, Methanol), Fp. 80-82⁰C.

b) D-Leucyl-L-leucin-methylester-hydrochlorid

Eine Lösung von 1,95 g N^-Benzyloxycarbonyl-D-leucyl-L-leucin-niethylester in 50 ml abs. Methanol, enthaltend 2,08 ml 2,3Sn Chlorwasserstoff in Methanol wurde mit 250 mg 10-%igem Palladium-auf-Kohle behandelt und unter Wasserstoffatmosphäre geschüttelt bis die Dünnschichtchromatographie von Proben der Lösung eine vollständige Reaktion zeigte. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde onne weitere Reinigung verwendet.

c) N'^:;^Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L^leucin-methylester

Eine Lösung von 2,85 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid (Beispiel 2, e) in 80ml Dimethylformamid wurde auf -20⁰C gekühlt und mit 6 Äquivalent 8,85 ml 2,645n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran behandelt. Die Lösung wurde dann mit 0,81 ml Isopentylnitrit behandelt und 30 Minuten bei -20⁰C gerührt, anschließend auf -25⁰C abgekühlt und mit 3,8 ml₍ 7 Äquivalent ,Triäthylamin und dann mit 1,3 g'D-Leucyl-L-leucin-methylester-hydrochlorid in 10 ml Dimethylformamid behandelt und auf 5⁰C gekühlt. Der Kolben wurde mit etwas Dimethylformamid ausgespült, das zu dem

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Reaktionsgemisch zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann 30 Minuten bei -20⁰C 3 Stunden in einem Eis-Salz-Bad gerührt und über Nacht im Kühlschrank bei 3 bis 5⁰C stehengelassen. Das Gemisch wurde dann filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit Tetrahydrofuran verrieben und dekantiert. Das unlösliche Material wurde in Dichlormethan suspendiert und mit 1n Salzsäure geschüttelt und filtriert. Der Feststoff wurde mit Dichlormethan gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet;

²Q -22,6° (c 1,01, DMF); UV-Spektrum in Methanol: *max ²⁸9>5 A ,57,7; *_max 280 e] 75,8.

d) N^-L-Glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-hydrazid

Eine Lösung von 3,6 g N^-L-Glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucin-methylester in 60 ml Dimethylformamid und 20 ml Methanol wurde mit 3,6 ml Hydrazinhydrat behandelt und 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Das ausgefallene Gel wurde aufgebrochen und das Gemisch filtriert. Der Feststoff wurde mit Methanol gewaschen, dann in 200 ml Äther 3 Stunden suspendiert, abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet; /Jrjjf -14,3° (c 1,0, DMF);

UV-Spektrum in Methanol: *_max 289,5 e!J 56,5; A_103x 280 E^j 74,0.

e) N -Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl—L—prolyl-N-äthylamid

Eine Lösung von 2,2 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-hydrazid in 80 ml Dimethylformamid wurde auf -20°C gekühlt und mit 5,94 ml 2,28n-,Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran behandelt. Die Lösung wurde dann mit 0,49 ml Isopentylnitrit behandelt und 30 Minuten bei -20°C gerührt und 5z5°C gekühlt und mit 1,88 ml Triäthylamin und dann mit 835 mg L-Arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrochlorid (Beispiel 1, l) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -20°C und dann 3 Stunden in

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einem Eis-Salz-Bad gerührt und dann über Nacht bei O bis 5⁰C stehengelassen. Das Gemisch wurde dann filtriert und unter vermindertem Druck bei A-O bis 50⁰C eingedampft. Der Rückstand wurde mit 150 ml Tetrahydrofuran verrieben, dekantiert und der Rückstand in 30 ml Methanol gelöst und zu 250 ml Äthylacetat unter Rühren zugetropft. Das Gemisch wurde 3 Tage bei 0 bis 5°C stehengelassen und dann filtriert. Das feste Produkt wurde in 200 ml Äther suspendiert, 2 Stunden gerührt und abfiltriert. Man erhielt ein weißes Pulver, das durch Chromatographie über Silicagel in Chloroform: Methanol:Wasser'(60:45:5) gereinigt wurde, wobei die Fraktionen durch Dünnschichtchromatographie analysiert wurden. Ein im wesentlichen homogenes Material fand sich nach einigen wenigen Fraktionen Eluat. Die ausgewählten Fraktionen wurden mit 100 ml Wasser gerührt, 4n Salzsäure bis zur saueren Reaktion von Testpapier zugegeben und anschließend 30 ml Methanol. Das Gemisch wurde teilweise unter vermindertem Druck eingedampft, um Methanol zu entfernen und lyophilisiert. Man erhielt N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-N-äthylamid-hydrochlorid; [OQtP -31,4°

(c 1,029, DMF); UV-Spektrum in Methanol: λ 289,5 is] 44,6; λ max ι

*max ²⁸⁰ A ⁵?>⁴·

Beispiel 5 lA-tert.-Butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-

■ tryptophyl-L-seryl-Li-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid

a) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-serin-methylester

5 g L-Serin-methylester-hydrochlorid wurden in 75 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung im Eisbad gekühlt. Dann wurden 4,9. ml Triäthylamin zugegeben und anschließend 11,9 g N^Benzyloxycarbonyl-L-.tryptophan, 5,25 g 1-Hydroxybenztriazol und schließlich 8,0 g Dicyclohexylcarbodiimid. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Eiskühlung gerührt, wobei die Temperatur auf Raumtemperatur steigen konnte und dann weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur. Das Gemisch.

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wurde filtriert und der Feststoff mit Dimethylformamid gewaschen. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand in Äthylacetat gelöst und mit verdünnter Salzsäure, gesättigter Salzlösung 3-mal mit 5-%iger Natriumbicarbonatlösung, mit gesättigter Salzlösung und schließlich mit Wasser gewaschen. Die Äthylacetatlösung wurde dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde aus 250 ml Benzol und dann aus Äthylacetat und Petroläther umkristallisiert. Man erhielt 12,5 g; Fp. 133-135°C; ^³

-12,4° (c 2, Methanol); UV-Spektrum in Methanol Λ 290 λ λ λ max

^E1 ¹¹⁵' *max²?¹ A W> \ax ^{274 E}1 ¹²²'

b) N^-Benzyloxycarboriyl-L-tryptophyl-L-seryl-hydrazid

12,3 g des Methylesters wurden in 180 ml Methanol gelöst und mit 8 ml Hydrazinhydrat behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Wacht bei Raumtemperatur stehengelassen und filtriert. Das feste Produkt wurde mit kaltem Methanol gewaschen, mit 400 ml Methanol zum Sieden erhitzt und heiß filtriert. Man erhielt 8,33 g; "Fp. 176-178°C; £ptj^ -18° (c 2,Z₇DMF); UV-Spektrum in Methanol ^_x 290 E^j 117; 281 ü] 134; ^_3x 274 E^ 125.

c) NQf-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosinmethylester

9,9 g (22,5 mMol) N°<-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-hydrazid wurden in I50 ml Dimethylformamid zur Spektroskopie gelöst und auf -20⁰C gekühlt. Die kalte Lösung wurde mit 51 ml 2,34n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran und mit 4,7 ml Isopentylnitrit (90 %) behandelt und 30 Minuten bei -20⁰C gerührt, anschließend auf -25⁰C abgekühlt und mit 20,45 ml Triäthylamin und mit 5,74 g L-Tyrosinmethylester-hydrochlorid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -20⁰C, 15 Minuten bei -20 bis -10°C und 3 Stunden bei 0°C gerührt und anschließend über Nacht bei 0 bis 5⁰C stehengelassen und filtriert. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst, mit 0,1n Salzsäure, gesättigter

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Salzlösung, 5-%iger Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Salzlösung gewaschen, das Äthylacetat getrocknet und eingedampft» Der Rückstand wurde in Äthanol aufgenommen und die Kristallisation erreicht durch Abkühlen und Ankratzen innerhalb von 48 Stunden. Das Produkt wurde auf einem Filter abge trennt und mit- Äthanol gewaschen. Man erhielt 8 g. Die äthanolischen Flüssigkeiten ergaben eine zweite Menge von 1,95 g; ββ'ψ -5,8° (c 1,04, DMF); UV-Spektrum in Methanol

^{44 279} A

^Z9° ^E1

d) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosylhydrazid ·■

4,5 g des Methylesters wurden in 50 ml Methanol gelöst und mit 4,5 ml Hydrazinhydrat behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 48 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, das ausgefallene Produkt abfiltriert' und mit Methanol gewaschen. Der feuchte Feststoff wurde in 150 ml Äther 2 Stunden suspendiert und filtriert. Man erhielt 4,18 g; Fp. 226-229⁰C; -15,6° (c 1,01, DMF); UV-Spektrum in Methanol ^5E1-92,6; \ax^280E1

e) N^-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methylester

Eine Lösung von 6,65 g N^-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanin (0,022 Mol) und 4,38 g (0,022 Mol) L-Leucin-methyl-. ester-hydrochlorid in 60 ml Dimethylformamid zur Spektroskopie wurde im Eisbad gekühlt und mit 3,0 ml (2,24 g) Triäthylamin behandelt. Dann wurden 3,3 g 1-Hydroxybenztriazol und 5 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur und weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml Äthylaeetat gelöst und mit 0,1n Salzsäure, gesättigter Salzlösung, 5-^iger Natriumbicarbonatlösung, gesättigter Salzlösung und Wasser gewaschen. Die Äthylacetatlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem kristallinen Rückstand eingedampft. Das Produkt wurde 2-mal aus Äthylacetat und Petroläther umkristallisiert. Man erhielt 7,3 g; Fp. 125-126⁰C;

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^ -^2O>3° (c 1,02, Methanol).

f) D-Phenylalanyl-L-leucin-methylester-hydrochlorid

Eine Lösung von 7 g (0,016 Mol) N°£-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methylester in 120 ml Methanol wurde mit 6,12 ml 2,68n Chlorwasserstoff in Methanol behandelt und mit Wasserstoff über 500 mg 10-%igem Palladium-auf-Kohle bei Atmosphärendruck reduziert. Die Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie überwacht. Das Gemisch wurde filtriert, um den Katalysator zu entfernen und die Lösung eingedampft. Man erhielt 5,4 g eines glasartigen Produktes; [PCJj? -82,5° (c 1,02, Methanol).

g) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L—seryl-L—tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methyle ster

Eine Lösung von 8,5 g (0,014 Mol) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid in 150 ml Dimethylformamid wurde auf -20⁰C gekühlt und mit 34,4 ml 2,56n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran und anschließend mit 2,68 ml Isopentylnitrit behandelt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -20⁰C gerührt, auf -25°C abgekühlt, mit 13,73 ml Triethylamin behandelt und 4^90 g D-Phenylalanyl-L-leucin-methylesterhydrochlorid zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -20⁰C, 15 Minuten bei -20 bis -10°C, 3 Stunden im Eis-Salz-Bad und über Nacht bei 0 bis 5°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde über ein Glasfilter filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst und mit 0,5n Salzsäure, gesättigter Salzlösung, 5-/oiger Natriumbicarbonatlösung, gesättigter Salzlösung und schließlich mit Viasser gewaschen. Die Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde aus 125 ml Methanol umkristallisiert. Das Produkt wurde in 200 ml Äther 2 Stunden suspendiert, filtriert und getrocknet. Man erhielt 6,25 g;

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Fp. 221-223°C; ßß^ -21° (c 1,01, DIW); UV-Spektrum in Methanol ⁷W ²⁸⁹'^{5 E}1 ⁶⁶>^5; \ax ^{280 E}1

h) L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucinmethylester

6,0g N^Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methylester wurden in 140 ml abs. Methanol gelöst und 800 mg 20-%igeS Palladium-auf-Kohle zugegeben. Das Gemisch wurde unter Wasserstoffatmosphäre reduziert, wobei· die Reaktion durch Dünnschichtchromatographie überwacht wurde.¹ Der Katalysator wurde unter Verwendung von Filterhilfe (Super-Cel) abfiltriert, das Lösungsmittel eingedampft und der verbleibende Rückstand unter vermindertem Druck getrocknet und ohne weitere Behandlung verwendet.

i) N^-tert.-Butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methylester

1,53 g L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-rnethylester wurden in 35 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung im Eis gekühlt und mit 620 mg N°^-tert.-Butoxycarbonyl-O-benzyl-L-serin, 311 mg 1-Hydroxybenztriazol und 475 mg Dicyclohexylcarbodiimid (iO-%iger Überschuß) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur und weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 500 ml Äthylacetat gelöst, mit 0,1n Salzsäure, gesättigter Salzlösung, 5~/6iger Natriumbicarbonatlösung, gesättigter Salzlösung und Wasser gewaschen. Die Äthylacetatlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der verbleibende Feststoff wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 2,29 g; Fp. 200-202⁰C; ßkj^ -19,5° (c -1,Q3,Methanol); UV-Spektrum in Methanol λ_ΐηβχ 289,5 E^j 52; *max^280E1 ⁶⁸·

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) N^-tert.-Butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-hydrazid

2,1 g des oben angegebenen Methylesters wurden in 35 ml Methanol gelöst und 2 ml Hydrazinhydrat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen, anschließend filtriert und der Feststoff 1 Stunde mit Äther verrieben. Das Produkt wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 1,35 g; Fp. 200-203°C; -11,6° (c 1,0, DMF); UV-Spektrum in Methanol

iax 289,5 Kj 57; \_Αχ 280 E^ 74,5.

k) N^-tert.-Butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid

1,21 g (1,18 mMol) N°i-tert.-Butoxycarbonyl-0-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucylhydrazid wurden in 40 ml Dimethylformamid zur Spektroskopie gelöst, gerührt und auf -20⁰C abgekühlt. Dann wurden 2,89 ml 2,45n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran zugegeben und 0,22 ml Isopentylnitrit (90 %). Die Lösung wurde 30 Minuten bei -20⁰C gerührt, mit 1 ml erneut destilliertem Triäthylamin behandelt und dann mit 435 g L-Arginyl-L-prolin-N-äthylamid-hydrochlorid. Das Reaktionsgemisch wurde 45 Minuten bei -20 bis -15⁰C gerührt und dann bei der Temperatur des Eisbades 3 Stunden und über Nacht im Kühlschrank bei 0 bis 5°C aufbewahrt. Das Reaktionsgemisch v/urde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit 150 ml Tetrahydrofuran verrieben und dann in 20 ml Methanol gelöst und unter Rühren in 200 ml Äthylacetat getropft. Beim Stehen über Nacht bei 0⁰C schieden sich aus dem Gemisch 480 mg eines braunen gummiartigen Produktes ab. Die Lösung, wurde abdekantiert und zu einem weißen Feststoff eingedampft. Das Produkt wurde aus Methanol mit Äther ausgefällt, wobei man 730 mg weiteres Produkt erhielt, das mit den 480 mg zusammengegeben und über Silicagel in Chloroform-Methanol (60:45) chromatographiert wurde. Die Auftrennung

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wurde durch Düimschichtchromatographie überwacht. Die zusammengegebenen Fraktionen wurden in 20 ml Methanol gelöst und mit Aktivkohle entfärbt und unter Verwendung von Filterhilfe filtriert. Das Filtrat wurde auf ungefähr 5 ml eingedampft und mit 100 ml Wasser behandelt. Die Lösung wurde mit 1n Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 gebracht, ausgefroren und lyophilisiert. Man erhielt 960 mg. Analyse für die Verbindung mit 1,5HCl.3H₂O; £qj^ -58° (c 1,02 Methanol); UV-Spektrum in Methanol X_max 289,5 E^ 43,4; \J_X 280 έ\ 56,5.

Beispiel 6 »N^-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-

tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-pheiiylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid

a) N^-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-ser^L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methylester

1,53 g L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-methylester (Beispiel 5, h) wurden in 35 ml Dimethylformamid gelöst.und die Lösung im Eisbad gekühlt. Dann wurden 691 mg N°(-Benzyioxycarbonyl-0-benzyl-L-serin zusammen mit 3TI-mg 1-Hydroxybenztriazol und 475 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur und weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 500 ml Äthylacetat gelöst und mit 0,5n Salzsäure, gesättigter Salzlösung, 5-%iger Natriumbicarbonatlösung, gesättigter Salzlösung und schließlich mit Wasser gewaschen. Die Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 1,92 g;

Rx7^P -13,2° (c 1,03, DMF); UV-Spektrum in Methanol a _v *~ ~" υ j. . max

289,5 E^ 52,5; A_max 280 E^ 69.

../41

709819/1040

b; N -Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-hydrazid

1,75 g des unter a) erhaltenen Methylesters wurden in 40 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2,5 ml Hydrazinhydrat behandelt. Nach 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wurden 15 ml Methanol zugegeben und die Reaktion konnte über Nacht bei Raumtemperatur ablaufen. Das Methanol wurde abgedampft und die Lösung mit 80 ml Isopropanol verdünnt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, der Niederschlag,abfiltriert, mit Äther verrieben und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 1^g; Fp. 240-242°C Zers./TkJ^³ -31,2° (c 0,895, DIv]F); UV-Spektrum in Methanol *max ²⁹° ^E1 52,5; ^280 e] 68,7.

c) N^Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid-hydrochlorid

1,15 g (1,08mMol) N°VBenzyloxycarbonyl-0-benzyl-L-seryl L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucylhydrazid wurden in 45 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf -20⁰C abgekühlt. Dann wurden 6 Äquivalent, 2,64 ml 2,45n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran zugegeben und anschließend 0,22 ml Isopentylnitrit. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -20°C gerührt, auf -25⁰C abgekühlt und mit 0,9 ml (6 Äquivalent) Triäthylamin behandelt und 400 mg L-Arginyl-L-prolin-N-äthylamid-hydrochlorid zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei -20⁰C, 15 Minuten bei -20 bis -1O⁰C, 3 Stunden im Eis-Salz-Bad gerührt und über Nacht bei 0 bis 5⁰C stehengelassen. Das G_emisch wurde filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Ein glasartiger Rückstand wurde mit Tetrahydrofuran 3 Stunden in der Kälte verrieben und das Lösungsmittel abdekantiert. Der Rückstand wurde in 25 ml Methanol gelöst und zu 250 ml Äthylacetat unter Rühren zugetropft. Die Suspension wurde 2 Tage in der Kälte stehengelassen und filtriert. Das Produkt wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 920mg

/42 709819/1040

•Hl.

Weiteres Produkt wurde aus den Mutterlaugen der Ausfällung erhalten durch Eindampfen und erneutes Ausfällen in Äther. Man erhielt 550mg. Das Produkt wurde weiter gereinigt durch Chromatographie über Silicagel in Chloroform-Methanol (60:45). Die Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie (Kieselsäure in Chloroform-Methanol-Wasser (60:45:10)) untersucht. Die vereinigten Fraktionen wurden in 20 ml Methanol gelöst, mit 450 mg Aktivkohle entfärbt und die Lösung auf 5 ml eingedampft und mit 75 ml Wasser verdünnt. Die Lösung wurde gefroren und lyophilisiert. Man erhielt 840 mg N^C-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid-hydro-

chlorid; die Analyse zeigte; 1,5 HC1.2H₂0; ßxj^ -56,2

(c 1,0, Methanol); UV-Spektrum in Methanol Tl₁₀ 290 e\ 42,1; * ^{280 E}1

Beispiel 7 N -Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-threo-phenylseryl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid

a) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-threo-phenylserin-cyclohexylester

D-threo-Phenylserin-cyclohexylester wurde hergestellt durch Auftrennen von DL-threo-Phenylserin-cyclohexylester durch fraktionierte Kristallisation von Pyroglutaminsäuresalz (Alberti et. al_o, Gazz. chim. Ital. 83, 930 (1953)).,

3,0 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid (Pulver) (Beispiel 2, e) wurden in 80 ml Dimethylformamid suspendiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wurde auf -20⁰C gekühlt und mit 8,64 ml 2,85n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran behandelt und 30 Minuten gerührt. Dann wurden 0,86 ml Isopentylnitrit zugegeben und das Gemisch bei -20°C bis zur Lösung (1 Stunde) gerührt. Dann wurden 3,43 ml Triäthylamin zugegeben und 1 g D-threo-Phenylserin-cyclohexylester. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -20⁰C und

../43 709819/1040

26491U . Vk.

3 Stunden bei der Temperatur des Eisbades gerührt und über Nacht bei O⁰C stehengelassen. Das Gemisch wurde filtriert und das FiItrat unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhielt 3,59 g eines Feststoffes; ßxj^* -15,5° (c 1,01, Methanol); UV-Spektrum in Methanol JN_1113x 289,5 e]J 56,8; 280 ü] 74,6.

b) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-threo-phenylseryl-hydrazid

3,25 g des unter a) erhaltenen Esters wurden in 30 ml Dirnethylformamiei gelöst und mit 3 ml Hydrazinhydrat behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht stehengelassen, mit einem gleichen Volumen Äthanol verdünnt und erneut über Nacht stehengelassen. Das Gemisch wurde filtriert, der Feststoff 3 Stunden mit Äther verrieben und filtriert. Man erhielt 2,75 g; Fp. 226-227°C; ßtJ^ -2,8° (c 1,01, DMF);

UV-Spektrum in Methanol *_nv 289,5 E^ 59,1; X„_nv 280 ε]

max ι max ι

c) N~-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-threo-phenylseryl-L-leucinmethylester

2,67 g des unter b) erhaltenen Hydrazids wurden in 80 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf -20°C gekühlt. Dann wurden 6,55 ml,6 Äquivalent _r 2,735n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran zugegeben und anschließend 0,63 ml Isopentylnitrit. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -20⁰C gerührt, - auf -25⁰C abgekühlt und mit 2,91 ml (7 Äquivalent) Triäthylamin und anschließend mit 0,66 g L-Leucin-methylester-hydrochlorid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -20⁰C^ Stunden im Eis-Salz-Bad gerührt und über Nacht bei 0 bis 5⁰C stehengelassen. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml Dichlormethan suspendiert und in der Kälte

stehengelassen. Die Suspension wurde mit ungefähr 70 ml Wasser geschüttelt und über eine Glasfritte filtriert.

709819/1040 ../44

Der Feststoff wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 2,55 g als Monohydrat; Fp. 228-235°C; ßxj^ -4,4°

(c 1, DMF); UV-Spektrum in Methanol * 289,5 ε] 57,5; Anax ²⁸⁰ A 75.2·

d) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-threo-phenylseryl-L-leucyl-hydrazid

2,45 g des unter c) erhaltenen Methylesters wurden in 25 ml Dimethylformamid gelöst, mit 2,4 ml Hydrazinhydrat behandelt und 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand mit 50 ml abs. Methanol verrieben, einige Stunden gekühlt und filtriert. Der Feststoff wurde dann mit 150 ml Äther verrieben, filtriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 1,66 g. Ein zweiter Anteil von 0,51 g v/urde aus den'Methanolflüssigkeiten durch Eindampfen des Lösungsmittels und Verreiben des Rückstandes mit Äthanol und dann mit Äther erhalten. Die vereinigten Produkte wurden mit 50 ml abs. Methanol zum Sieden erhitzt, abgekühlt und filtriert. Man erhielt 1,82 g;

/Of7n³ -5 »3° (c 1,015, DMB¹); UV-Spektrum in Methanol ?v _v •U y] λ max

289,5 E₁ ¹ 56,0; ^_x 280 Tb\ 73,2.

e) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-threo-phenylseryl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid

1»7 g (1,7 mMol) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-threo-phenylseryl-L-leucylhydrazid wurden in 80 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf -20⁰C abgekühlt. Dann wurden 6 Äquivalent^ 3,76 ml₍2,53n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran zugegeben und anschließend 0,33 ml Isopentylnitrit. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -20⁰C gerührt, auf -25°C abgekühlt und mit 1,33 ml (6 Äquivalent) Triäthylamin behandelt. Dann wurden 580 mg (1,7 mMol) L-Arginyl-L-prolin-N-äthylamid-hydrochlorid zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei -20⁰C, 15 Minuten bei -20 bis -10⁰C und 3 Stunden im Eis-Salz-Bad gerührt und über Nacht bei 0 bis 5⁰C stehengelassen ,

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Das Gemisch wurde filtriert und das Piltrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit 150 ml Tetrahydrofuran 2 Stunden in der Kälte verrieben und das Lösungsmittel abdekantiert. Der Rückstand wurde in 20 ml Methanol gelöst und zu 200 ml Äthylacetat unter Rühren zugetropft. Das Gemisch wurde einige Tage in der Kälte stehengelassen und filtriert. Das Produkt wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 2,11 g, die über Silicagel in Chloroform-Methanol (60:45) chromatographiert wurden. Die Fraktionen des Eluats wurden durch Dünnschichtchromatographie über Kieselsäure mit einem Chlorofomj-Methanol-Viasser-Gemisch (60:45:10) überwacht. Die vereinigten Fraktionen wurden zu 1,8 g Produkt eingeengt. Das Produkt wurde in 30 ml Methanol gelöst und durch Eintropfen in 250 ml Äthylacetat ausgefällt. Das Gemisch wurde über Nacht in der Kälte stehengelassen, filtriert und das feste Produkt unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhielt. 1,2 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-threo-phenylseryl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-M-äthylamid-hydrochlorid; die Analyse ergab 1,5HCl.3 HpO; Πχ7?? -17,2°(c 1,03, DMF); UV-Spektrum in Methanol λ 289,5 E^ 40,6; ^ 280 Έ\ 53,0.

Beispiel 8 N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-

, L-seryl-L-tyrosyl-D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid

a) N^'-tert. -Butoxycarbonyl-D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid-hydrochlorid

N^-tert.-Butoxycarbonyl-D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid-hydrochlorid wurde erhalten aus 3,8 g (6,5 mMol) N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid-hydrochlorid durch Entfernung der Schutzgruppe durch das in Beispiel 2 beschriebene Hydrierverfahren. Man erhielt 2,9 g (6,5 mMol) L-Leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid-dihydrochlorid als glasartigen Feststoff. Dieses Produkt wurde 25 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2,2 g (6,5 mMol) N^-tert.-Butoxycarbonyl-D-valin-p-nitro-phenylester behandelt.

../46 709819/104G

Das Reaktionsgemisch wurde 4 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen und dann unter vermindertem Druck zurTrockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml Methanol gelöst und das Produkt durch Zugabe von 500 ml wasserfreiem Äther ausgefällt. Das feste Produkt wurde gereinigt durch Chromatographie über Silicagel mit Toluol-Methanol (70:30); 1,1 g; ßxj²^ -53,5° (c 1,0, Methanol).

N"-tert.-Butoxycarbonyl-D-valin-p-nitrophenylester, erhalten aus 5 g (24 mMol) N^-tert.-Butoxycarbonyl-D-valin, 4,8 g (24 mMol) »Dicyclohexylcarbodiimid und 3,4 g (24 mMol)

wurde gelöst

p-Nitrophenol, in 25 ml Dimethylformamid? und die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Feststoffe wurden abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Das verbleibende Öl wurde gereinigt durch Chromatographie über Silicagel in Methanol-Benzol (5:95) 5 g; ßxj²^ +21° (c 1,0, Methanol); UV-Spektrum in Methanol 7^_&χ 270 E^j 204.

b) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid-hydrοchiοrid

1>3 g 0,7 mMol) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid (Beispiel 2, e) wurden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf -20⁰C gekühlt. Dann wurden 4 ml (10 mMol) 2,5n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran zugegeben und anschließend 0,2 g(1,8 mMol) Isopentylnitrit. Das Gemisch wurde bei -10 bis -15°C 1 Stunde gerührt und anschließend die Temperatur auf -60⁰C herabgesetzt. Dann wurden 1,2 g (11 mMol) Triäthylamin zugegeben und anschließend D-Valyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamiddihydrochlorid (erhalten durch Behandlung von 1,1 g des entsprech'enden N^-tert. -Butoxycarbonyl-D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid-hydrochlorids mit 4n Chlorwasserstoff in 10 ml Dioxan innerhalb einer Stunde und Ausfällung des Hydrochlorids mit Äther, das mit Äther gespült und ohne

../47 703819/104G

26491U

v/eitere Reinigung verwendet wurde) in 5 ml Dimethylformamid.

Das Gemisch wurde 19 Stunden in der Kälte (O⁰C) stehengelassen, anschließend filtriert und die Feststoffe mit 10 ml Dimethylformamid gespült. Beim Eindampfen der Filtrate unter vermindertem Druck erhielt man das rohe Produkt als braunes gummiartiges Produkt. Der Gummi wurde in 5 ml Methanol gelöst und zu 500 ml Äthylacetat-Äther (1:1) unter Rühren zugetropft. Der Feststoff wurde abfiltriert und mit Äther gespült. Die Ausfällung wurde insgesamt 3-mal wiederholt. Die Dünnschichtchromatographie über Kieselsäure mit Chloroform-Methanol-32%Essigsäure (60:30:10) zeigte, daß das Produkt von zwei hauptsächlichen Verunreinigungen begJLeitet war. Es wurde weiter gereinigt durch Chromatographie über eine Silicagelsäule mit Chloroform-Methanol-32%iger Essigsäure (70:30:5). Wiederholtes Chromatographie war erforderlich, um das Produkt abzutrennen; ³ -38,6° (c 1,01, Methanol); die Analyse zeigte 1,5 HCl.

3,5 HpO; UV-Spektrum in Methanol \_ax 289 E.]J 46,8; 280 Ε] 59,8.

Beispiel 9 N^-Benzyloxycarbonyl-N^benzyl-L-glutaminyl-

L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid

a) N^-Benzyloxycarbonyl-H^benzyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methylestar

"l>53 g L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methylester (Beispiel 5, h) wurden in 35 ml Dimethylformamid zur Spektroskopie gelöst und die Lösung im Eisbad gekühlt. Dann wurden 777 mg N^-Benzyloxycarbonjrl-N'fc-benzyl-L-glutamin, 311 mg 1-Hydroxybenztriazol und 475 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit 300 ml Äthylacetat und 0,1n Salzsäure geschüttelt. Der Feststoff wurde abfiltriert, mit V/asser gewaschen und an der Luft unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 1,68 g; föfjr? -14

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D ../48

26491U

(c 1,035, DMF); UV-Spektrum in Methanol· X_nov 289,5 ^ 51,4; ' \ ^{280 E}1 ⁶⁷·

N -Benzyl·oxycarbonyl·-N<^^-benzyl·-L-gl·utamin wurde erhal·- ten nach Gibian und Klieger, Ann., 640, 145 (1961).

b) N^ί^-Benzyl·oxycarbonyl·~l^ί^■benzyl·-L-gl·utaminyl·-L-tryptophyl·- L-seryl·-L-tyrosyl·-D-phenyl·al·anyl·-L-l·eucyl·-hydrazid

2,3 g des Methyiesters wurden in 35 ml· Diinethyiformamid ge^st und mit 2,0 ml· Hydrazinhydrat behandeit. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengeiassen, mit 35 ml· abs. Methanol· verdünnt und 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengeiassen. Die Lösung wurde zur Entfernung von Methanol· eingedampft, die vertreibende Dimethyiformamidiosung mit 35 ml· l·sopropanol· behände^ und 5 Stunden bei Raumtemperatur stehengeiassen. Der Niederschiag wurde abfiitriert, mit Äther verrieben, abfiitriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhieit 1,78 g al·s Monohydrat; Fp. 245-249⁰C; £p(J^ -14,9° (c 1,035,DIvIF); UV-Spektrum in Methanol· A_max 289,5 E^j 50,5; >_max 280 E^ 66,0.

c) N"-Benzyl·oxycarbonyl·-N^benzyl·-L-gl·utaminyl·-L-tryptophyl·- L-seryl·-L-tyrosyl·-D-phenyl·al·anyl·-L-l·eucyl·-L-arginyl·-L-proiin-N-äthyl·amid

1,64 g (1,63 mMol·) N^(:^-Benzyl·oxycarbonyl·-I^f2^·benzyl·-L-gl·utaminyl·-L-tryptophyl·-L-seryl·-L-tyrosyl·-D-phenyl·al·anyl·-L-ieucyl·-hydrazid vmrden in 40 ml· Dimethyiformamid zur Spektroskopie geiöst und die Lösung auf -20⁰C abgekühit. Dann vmrden 6 Aquivaient, 3,65 ml·. 2,45n C^orwasserstoff in Tetrahydrofuran zugegeben und anschließend 0,3 ml· Isopentyl·- nitrit. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -20⁰C gerührt, auf -25°C abgekühit und mit 1,25 ml· Triäthyiamin und anschließend mit 500 mg
hydrochiorid behandeit. Das Reaktionsgemisch wurde 45 Minuten bei -20 bis -15⁰C₁, 3 Stunden im Eis-Saiz-Bad gerührt und überNacht bei 0 bis 5⁰C aufbewahrt. Das Reaktionsgemisch wurde

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filtriert- und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft, Der Rückstand wurde mit 150 ml Tetrahydrofuran verrieben und das Lösungsmittel abdekantiert. Der Feststoff wurde in 20 ml Methanol gelöst und in 200 ml Äthylacetat getropft. Das Gemisch wurde über Nacht gekühlt und filtriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Plan erhielt 1,81 g. Das Produkt wurde weiter gereinigt durch Suspendieren in 200 ml Wasser und Schütteln mit 200 ml Äthylacetat. Das Gemisch wurde filtriert und der Feststoff in 250 ml heißem Methanol gelöst. Die Lösung wurde mit Aktivkohle- entfärbt und zu einem weißen Feststoff eingedampft, der unter vermindertem Druck getrocknet wurde. Man erhielt 1,1 g N^-Benzyloxycarbonyl-NT^-benzyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid-hydrochlorid; die

Analyse zeigte 1 HCl.2,5 Η_£0; βθψ -22,8° (c 1,02, DMF); UV-Spektrum in Methanol ^_x 289,5 E^j 40,3; 7[_aQJZ 280 E^j 52,6.

800 mg des oben angegebenen Hydrochlorids v/urden mit 15 ml 1n Essigsäure, 10 ml 4n Essigsäure und 35 ml Methanol behandelt. Es wurde ein Ionenaustauscherharz (Dowex 1x2) in Acetatform zugegeben, das Gemisch geschüttelt und über eine Glasfritte filtriert. Das Filtrat wurde zur Entfernung von Methanol eingedämpft und der Rückstand gefroren und lyophilisiert. Man erhielt 650 mg N^-Benzyloxycarbonyl-N··^ benzyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N-äthylamid-essigsäuresalz; die Analyse zeigte 1 CH₃COOH. 3 H₂O; ß*J^ "*30^o (c 1,015, DIiF); UV-Spektrum in Methanol a _v 289,5 E^ 39,4;

7l. 280 Ei 51,6; es v/ar kein ionisches Chlor vorhanden, max ι

.. /Patentansprüche

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Claims (2)

1. Patentansprüche

   Octapeptide der Formel

   R^Trp-Ser-Tyr-R^Leu-Arg-Pro-R^

   und deren Salze, wobei IL=Z-G-In, Z-GIn (bzl), Bhoc-Gln, Boc-His (bzl),' Z-His (bzl), Boc-Ser (bzl), Boc-Pro, Z-Leu, Boc-Leu, Z-Tyr (bzl), Z-IIe, Boc-Cys (bzl), Z-Phe oder Z-Ser (bzl), R₂ = D-Phe, D-AIa, D-Leu, D-Trp, D-Tyr, D-Tyr (Me), D-Ser, D-Met, D-Arg, D-VaI, D-His, D-GIn, D-Phs, D-Thr, D-Pro oder D-Asn und R = ITO₂, NH-(nieder Alkyl), N=(nieder Alkyl)_£, NH-Benzyl, I¹IHCH₂CH₂N= (nieder Alkyl)₂ oder S0₂I\iH-Benzyl.
2. 2.

   Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach

   Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet man ein Azid der Formel

   daß

   X-N₃
   mit einer Verbindung der Formel

   Y_p_ro-R

   wobei X = R₁-Trp-Ser-Tyr-, R^Trp-Ser-Tyr-R^ oder P^-Trp-Ser-Tyr-R₂-Leu7 Y = Arg, Leu-Arg oder R₂~Leu-Arg bedeuten und R., R₂ und R, die oben angegebene Bedeutung haben^ unter der Voraussetzung, daß Arg in Form eines Salzes einer starken Säure vorliegt, in einem nicht reagierenden Lösungsmittel umsetzt und das Produkt in Form der freien Base oder eines Salzes isoliert.

   "L-

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   709819/1OAO