ES2336826T3 - Procedimientos para la produccion de un peptido que presenta una amida c-terminal. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para preparar exenatide que comprende: a) proporcionar aminoácidos, protegidos o no protegidos, unidos en su C terminal a una resina lábil superácida; b) acoplar dicho aminoácido con otro aminoácido, protegido o no protegido, en presencia de un reactivo de acoplamiento; c) repetir la etapa b) para obtener un péptido, en el que el péptido está protegido con por lo menos un grupo protector que permanece en el péptido cuando se escinde la resina; d) escindir dicho péptido protegido de la resina mezclando con una solución ácida moderada; y e) realizar la amidación del péptido protegido obtenido en la etapa d), con una amina apropiada.
Description
Procedimientos para la producción de un péptido
que presenta una amida C-terminal.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para preparar un péptido que es un derivado de amida
C-terminal y a sus productos.
La síntesis peptídica puede consistir en una
síntesis en fase sólida (SPPS) o en una síntesis en fase de solución
y generalmente se lleva a cabo desde el extremo C al extremo N.
Existen diversos grupos de péptidos y de compuestos
peptidomiméticos caracterizados por la derivación en el extremo
carboxilo de la cadena peptídica.
La síntesis de los péptidos derivados se lleva a
cabo generalmente mediante una síntesis peptídica en fase sólida
(SPPS) o una síntesis en fase de solución. La SPPS implica
habitualmente la utilización de una resina sobre la cual se
construye el péptido derivado. La síntesis en fase de solución se
basa habitualmente en la condensación de fragmentos.
La SPPS se describe en BE 841180 y la patente US
nº 4.002.738. Mediante este procedimiento, la prolina que
transporta como grupo bloqueador el sustituyente
t-butiloxi-carbonilo (Boc-) sobre el
grupo amino, es esterificada mediante combinación con un copolímero
estireno-divinilbenceno clorometilado (resina
Merrifield), utilizando el procedimiento descrito por Stewart et
al, en "SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS" (publicado por
Freeman & Company en 1969). La síntesis continúa
secuencialmente en un sintetizador automático, aplicando la química
Boc para la síntesis del nonapéptido deseado. La desprotección del
grupo Boc se realizó por el 4N ácido clorhídrico/dioxano. La
conjugación se llevó a cabo utilizando diciclohexilcarbodiimida en
diclorometano con un exceso de 2,9 veces. Finalmente, la resina
peptídica obtenida por este procedimiento se suspendió en 200 ml de
trietilamina/metanol al 5%, añadiéndose 100 ml de etilamina
destilada. Después de 24 horas, la resina fue eliminada mediante
filtración, evaporándose la solución para obtener un sólido. Éste
se disolvió en ácido acético glacial y se purificó en una columna
de gel de sílice para obtener un nonapéptido
tri-protegido (con grupos protectores de Ser, Tyr y
Arg). La desprotección final se llevó a cabo mediante fluoruro de
hidrógeno anhidro. El producto en bruto se purificó finalmente
mediante cromatografía en una columna Sephadex G-25
(comercializada por Pharmacia Uppsala, Suecia).
Otro ejemplo de SPPS se encuentra en la patente
US nº 4.005.063.
En general, los péptidos pueden prepararse
utilizando la SPPS que se describe por Merrifield en J. Am. Chem.
Soc., 85, 2149 (1963). Más particularmente, la prolina
N-bloqueada es esterificada a un copolímero
estireno-divinilbenceno-clorometilado,
después del desbloqueo, la arginina
N\gamma-bloqueada que transporta un grupo
protector lábil sobre N-imino se conjuga con el
grupo imino, ahora libre, del éster de la prolina y, después del
desbloqueo, esta secuencia de fases de conjugación y desbloqueo se
repite con otros aminoácidos en la secuencia del péptido deseado.
Todos los aminoácidos se utilizan en su forma L, excepto para el
aminoácido identificado como D-aminoácido en la
fórmula. Después de que todos estos aminoácidos se unen en la
secuencia mencionada anteriormente con los grupos protectores que
transportan la arginina, tirosina, serina y opcionalmente,
histidina, el nonapéptido es eliminado de la resina mediante
transesterificación/amonolisis, por lo que el enlace resínico es
reemplazado por el extremo etilamida. El tratamiento siguiente, de
forma conocida, elimina todos los grupos protectores, dando lugar
al péptido en forma sustancialmente pura y con un rendimiento
aceptable.
La solicitud de patente europea EP 0 518 656 A2
describe una SPPS de la secuencia Goserelin sobre una resina
mediante un ligamento que es lábil a la hidrazina. La escisión del
péptido a partir de la resina da lugar al derivado de la hidrazina,
que puede convertirse en el residuo aza-Gly
terminal. La protección de las cadenas laterales se obtiene
utilizando los siguientes grupos protectores: BrZ para Tyr, Fmoc
para His, y tBu para D-Ser en la posición 6,
evitando la protección del Ser en la posición 4.
Otra solicitud de patente europea, EP 0 518 655
A2, describe una SPPS que empieza con una resina precargada con la
unidad de construcción AzaGly. No se utilizó protección para las
cadenas laterales de Ser y Tyr de la posición 4. El péptido final
se trató con hidrazina para hidrolizar posibles productos laterales
con cadenas laterales aminoácidas aciladas que se incorporan en
forma libre.
La solicitud de patente europea EP 1 179 537,
describe una SPPS de una secuencia peptídica que se prepara
secuencialmente utilizando super grupos protectores lábiles
superácidos y otro tipo de super resinas ácido lábiles, de tal
forma que el péptido pudo eliminarse a partir de la resina, mientras
se mantuvieron los grupos protectores de la cadena lateral, que
pueden eliminarse después mediante otro tratamiento ácido. El grupo
C-terminal tal como aza-glicina o
etilamina se une a la cadena peptídica protegida mediante un
procedimiento regular de formación amídica. La principal desventaja
de este procedimiento es la necesidad de aplicar estrategias de
protección caras y únicas.
Otra metodología es una síntesis en fase de
solución, basada en la condensación de fragmentos, tal como se
describe mediante la publicación de la patente internacional WO
99/07874. Mediante este procedimiento, el péptido requerido puede
obtenerse haciendo reaccionar un fragmento peptídico representado
por la fórmula general siguiente
pGlu-His-Trp-OR_{1}
(en la que R_{1} representa un grupo alquilo inferior) con otro
fragmento peptídico representado por la fórmula general:
H-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y,
en presencia de quimiotripsina o una enzima tipo quimotripsina.
Otra variación en el procedimiento de
condensación de los fragmentos se da a conocer en la patente US nº
4.008.209. En esta patente, se produce un derivado de amida
nonapeptídico mediante un procedimiento en el que un reactivo (A)-
ácido L-piroglutámico o un fragmento peptídico que
tiene una unidad de ácido L-piroglutámico (es decir,
(Pyr)Glu) en su extremo N-terminal, y que al
mismo tiempo, comprende la secuencia aminoácida deseada -se condensa
con un reactivo (B)- un componente amínico que corresponde al
equilibrio del derivado amídico nonapéptido-, estando los dos
reactivos (A) y (B) protegidos opcionalmente mediante un grupo o
grupos protectores, y entonces, el grupo o grupos protectores, si
existe alguno, son eliminados.
En otro ejemplo del mismo enfoque sintético en
la fase de solución (solicitud de patente rusa RU 2074191), la
síntesis se lleva a cabo según un esquema de fragmentación 2+
(2+(4+1)], aplicando la química Cbz y un residuo Arg desprotegido
de cadena lateral.
En otro ejemplo (publicación de patente
internacional WO 97/48726), la cadena peptídica se construye
mediante una estrategia 2+4+3 de acoplamiento de fragmentos. Se
aplica la química Cbz de protección y uno de los productos
intermedios se purifica mediante cristalización, mientras que el
péptido final se purifica mediante cromatografía de intercambio
iónico.
La patente US nº 4.100.274 describe un
procedimiento para obtener Goserelin mediante la condensación de
tres fragmentos preformados que contienen -NO_{2} como grupo
protector para la arginina y -Bzl como grupo protector para la
tirosina, los dos cuales son lábiles a la hidrogenólisis. En este
procedimiento, el residuo azaglicina se introduce en el tripéptido
C-terminal, que se une entonces a
Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-N_{3,}
para dar lugar a un fragmento que, una vez se elimina el grupo Z,
se une a
Pyr-His-Trp-Ser-N_{3}
para dar lugar a Goserelin. Esta última reacción se lleva a cabo
con la totalidad de las cadenas laterales no protegidas, con la
excepción de la que pertenece a D-Ser (tBu).
En una forma de realización, la presente
invención proporciona un procedimiento para preparar exenatide, que
comprende: proporcionar aminoácidos, protegidos o no, unidos en su C
terminal a una resina lábil superácida, protegida o no, en
presencia de un reactivo de unión; repetir la etapa de unión para
obtener un péptido, en la que el péptido está protegido con por lo
menos un grupo protector que permanece en el péptido después de su
escisión de la resina; escisión de dicho péptido protegido de la
resina, mezclándolo con una solución ácida moderada; y amidando el
péptido protegido obtenido con una amina apropiada.
En todavía otra forma de realización, la
presente invención proporciona Acetato de exenatide con una pureza
de por lo menos, alrededor del 99,0%, determinada mediante el método
HPLC.
En una forma de realización, la presente
invención proporciona una composición farmacéutica que comprende
Acetato de exenatide preparado mediante uno de los procedimientos de
la presente invención, con por lo menos un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona un procedimiento para preparar una formulación
farmacéutica que comprende la combinación de Acetato de exenatide
preparado mediante uno de los procedimientos de la presente
invención, con, por lo menos, un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
En todavía otra forma de realización, la
presente invención proporciona la utilización de Acetato de
exenatide preparado mediante uno de los procedimientos de la
presente invención, para preparar una composición farmacéutica.
En una forma de realización, la presente
invención proporciona un procedimiento para preparar Acetato de
exenatide, que comprende la obtención de exenatide según el
procedimiento de la presente invención, y la conversión del
exenatide obtenido en Acetato de exenatide.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "ACN" se refiere a acetonitrilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "Boc" se refiere a
t-Butiloxicarbonilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "Bzl" se refiere a bencilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "Cbz" se refiere a benciloxicarbonilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "DCM" se refiere a diclorometano.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "DIEA" se refiere a diisopropiletilamina.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "DMF" se refiere a dimetilformamida.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "EDT" se refiere a etanoditiol.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "Fmoc" se refiere a
9-fluorenilmetoxicarbonilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "HBTU" se refiere a
2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
hexafluorofosfato.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "HOBt" se refiere a
N-hidroxibenzotriazol.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "Pbf" se refiere al
pentametildihidrobenzofuransulfonil.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término " SPPS" se refiere a síntesis peptídica en fase
sólida.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "TBTU" se refiere a
2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluroniote
trafluoroborato.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "tBu" se refiere a terc-butilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "TFA" se refiere a ácido trifluoroacético.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "TlS" se refiere triisopropilsilano.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "Trt" se refiere a tritilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "RT" o "temperatura ambiente" se refiere a una
temperatura de aproximadamente 18-25ºC,
preferentemente de aproximadamente 20-22ºC.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "solución ácida moderada" se refiere a una solución
que comprende un ácido en un disolvente orgánico inerte, en una
concentración tal, que durante la escisión del péptido a partir de
la resina, los grupos protectores permanecen en el péptido.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "reactivo de unión " se refiere a cualquier producto
que active el grupo carboxilo del fragmento peptídico protegido.
La invención se refiere a un procedimiento para
preparar exenatide que comprende una combinación de una síntesis en
fase sólida (SPPS), que utiliza una resina como soporte sólido para
obtener un péptido protegido con un extremo-C
carboxílico, y una síntesis en fase de solución para la amidación
del extremo C. La invención se refiere además a precursores
peptídicos protegidos y a acetatos peptídicos que poseen una pureza,
por lo menos, de aproximadamente 99,0%, determinada mediante el
procedimiento de HPLC.
Todos los estadios en el procedimiento de la
presente invención se llevan a cabo bajo condiciones moderadas,
proporcionando por lo tanto un bajo contenido en productos de
desecho, un alto rendimiento y una gran pureza del producto final.
Además, los procedimientos de la presente invención requieren
aminoácidos regulares protegidos comercializados.
La presente invención proporciona un
procedimiento para preparar exenatide que comprende: proporcionar un
aminoácido, protegido o no, unido en su C-terminal
a una resina super ácida lábil; uniendo dicho aminoácido, con otro
aminoácido, protegido o no, en presencia de un reactivo de unión;
repitiendo la etapa de unión para obtener un péptido, en la que el
péptido es protegido con, por lo menos, un grupo protector que
permanece en el péptido después de su escisión a partir de la
resina; llevando a cabo la escisión de dicho péptido protegido a
partir de la resina mezclando con una solución ácida moderada; y
realizando la amidación del péptido protegido obtenido con una
amina apropiada.
La etapa de amidación comprende la adición de
una base. Preferentemente, la base es diisopropilmetilamina.
La resina lábil superácida es seleccionada de
entre el grupo constituido por: resina clorotritilo, resina ácida
Rink, resina NovaSyn TGT, y resina HMPB-AM.
El reactivo de unión es
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3
tetrametiluronio tetrafluoroborato (TB-TU).
La solución ácida moderada es una solución que
comprende aproximadamente de 0,1% a aproximadamente 5% de TFA en un
disolvente orgánico inerte o en una mezcla de ácido acético con
trifluoroetanol y DCM.
Antes de llevar a cabo la amidación, el péptido
protegido se aísla. Preferentemente, el aislamiento se verifica
mediante precipitación, cristalización, extracción o cromatografía.
Más preferentemente, el aislamiento se lleva a cabo mediante
precipitación.
El péptido obtenido después de la escisión a
partir de la resina es un precursor protegido del exenatide formado
por aminoácidos que poseen la secuencia
de:Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu-(tBu)-Trp-
Leu-Lys-(Boc)-Asp(tBu)-Gly-Gly-Pro-Ser-(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-OH (SEC. ID. nº31). Preferentemente, llevar a cabo la amidación comprende el tratamiento del precursor protegido del exenatide con un reactivo de unión en presencia de amoníaco en DMF, para obtener exenatide protegido formado por aminoácidos que tienen la secuencia de Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu-(tBu)-Trp-Leu-Lys-(Boc)-Asp(tBu)-
Gly-Gly-Pro-Ser-(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-NH_{2}. (SEC. ID. nº31). Preferentemente, después de la amidación, el procedimiento comprende además: hacer reaccionar el exenatide con una composición ácida que incluye una solución TFA que contiene agua, TlS y EDT; añadir éter para obtener un precipitado de exenatide formado por aminoácidos que tienen la secuencia de H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH_{2} (SEC ID nº:31), y aislando el exenatide.
Leu-Lys-(Boc)-Asp(tBu)-Gly-Gly-Pro-Ser-(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-OH (SEC. ID. nº31). Preferentemente, llevar a cabo la amidación comprende el tratamiento del precursor protegido del exenatide con un reactivo de unión en presencia de amoníaco en DMF, para obtener exenatide protegido formado por aminoácidos que tienen la secuencia de Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu-(tBu)-Trp-Leu-Lys-(Boc)-Asp(tBu)-
Gly-Gly-Pro-Ser-(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-NH_{2}. (SEC. ID. nº31). Preferentemente, después de la amidación, el procedimiento comprende además: hacer reaccionar el exenatide con una composición ácida que incluye una solución TFA que contiene agua, TlS y EDT; añadir éter para obtener un precipitado de exenatide formado por aminoácidos que tienen la secuencia de H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH_{2} (SEC ID nº:31), y aislando el exenatide.
El aislamiento de los péptidos se lleva a cabo
mediante precipitación.
La precipitación se realiza a partir de un
disolvente seleccionado de entre el grupo constituido por
metil-terc-butil-éter (MTBE), éter
dietilo, diisopropiléter y sus mezclas. Preferentemente, el
disolvente se mezcla con metanol, etanol o acetonitrilo.
La presente invención proporciona Acetato de
exenatide con una pureza de por lo menos 99,0%, que se determina
mediante el método de HPLC.
La presente invención proporciona una
composición farmacéutica que comprende Acetato de exenatide
preparado mediante uno de los procedimientos de la presente
invención y, por lo menos, un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
La presente invención proporciona un
procedimiento para preparar una formulación farmacéutica que
comprende la combinación de Acetato de exenatide, preparado
mediante uno de los procedimientos de la presente invención, con,
por lo menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona la utilización
de Acetato de exenatide mediante uno de los procedimientos de la
presente invención para la preparación de una composición
farmacéutica.
La presente invención proporciona un
procedimiento para preparar Acetato de exenatide que comprende la
obtención de exenatide según el procedimiento de la presente
invención, y la conversión del exenatide en Acetato de
exenatide.
La presente invención proporciona un
procedimiento para preparar una formulación farmacéutica que
comprende la combinación del Acetato de exenatide obtenido según
los procedimientos de la presente invención con por lo menos un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los procedimientos de administración de una
composición farmacéutica de la presente invención, pueden llevarse
a cabo en varias preparaciones que dependen de la edad, sexo y
síntomas del paciente. Las composiciones farmacéuticas pueden
administrarse, por ejemplo, en comprimidos, grageas, polvos,
líquidos, suspensiones, emulsiones, gránulos, cápsulas,
supositorios, preparaciones inyectables (soluciones y suspensiones)
y similares.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden mezclarse opcionalmente con Acetato de exenatide
que se obtiene en la presente invención, y otros principios activos.
Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención
pueden contener ingredientes inactivos tales como diluyentes,
portadores, rellenos, agentes de hinchamiento, aglomerantes,
desintegrantes, inhibidores de la desintegración, aceleradores de la
absorción, agentes de humedecimiento, lubricantes, deslizantes,
agentes superficiales activos, agentes saborizantes, y
similares.
Los diluyentes aumentan el volumen de una
composición farmacéutica sólida, y pueden propiciar que ésta
contenga una forma de dosificación que sea facilitadora y más
manejable para el paciente. Los diluyentes para las composiciones
sólidas incluyen, por ejemplo, celulosa microcristalina (por
ejemplo, Avicel^{R}, celulosa microfina, lactosa, almidón,
almidón pregelatinizado, carbonato cálcico, sulfato cálcico, azúcar,
dextratos, dextrina, dextrosa, dihidrato fosfato cálcico dibásico,
fosfato cálcico tribásico, caolín, carbonato magnésico, óxido de
magnesio, maltodextrina, manitol, polimetacrilatos (por ejemplo
Eudragit®, cloruro de potasio, celulosa en polvo, cloruro sódico,
sorbitol y talco.
Las composiciones farmacéuticas sólidas que
están compactadas en una forma de dosificación, tal como un
comprimido, pueden incluir excipientes, cuyas funciones incluyen
ayudar a unir conjuntamente el principio activo y otros excipientes
después de la compresión. Los aglomerantes para las composiciones
farmacéuticas sólidas incluyen acacia, ácido algínico, carbómero
(por ejemplo, carbopol), carboximetilcelulosa sódica, dextrina, etil
celulosa, gelatina, goma guar, aceite vegetal hidrogenado,
hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa (por ejemplo, Klucel®),
hidroxipropilmetilcelulosa (por ejemplo, Methocel®), glucosa
líquida, silicato alumínico de magnesio, maltodextrin,
metilcelulosa, polimetacrilatos, povidona (por ejemplo, Kollidon®,
Plasdone®), almidón pregelatinizado, alginato sódico y almidón.
La tasa de disolución de una composición
farmacéutica sólida compactada en el estómago del paciente puede
aumentar añadiendo un desintegrante a la composición. Los
desintegrantes incluyen ácido algínico, carboximetilcelulosa
cálcica, carboximetilcelulosa sódica (por ejemplo,
Ac-Di-Sol®, Primellose®), dióxido de
silicio coloidal, croscarmelosa sódica, crospividona (por ejemplo,
Kollidon®, Polyplasdone®), goma de guar, silicato alumínico de
magnesio, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polacrilin
potásico, celulosa en polvo, almidón pregelatinizado, alginato
sódico, glicolato sódico de almidón (por ejemplo, Explotab®) y
almidón.
Los deslizantes pueden añadirse para mejorar la
fluidez de una composición sólida no compactada y mejorar la
exactitud de la dosis. Los excipientes que pueden funcionar como
deslizantes incluyen dióxido de silicio coloidal, trisilicato
magnésico, celulosa en polvo, almidón, talco y fosfato cálcico
tribásico.
Cuando una forma de dosificación tal como un
comprimido se prepara mediante la compactación de una composición
pulverulenta, la composición se somete a presión a partir de una
prensa punzonadora y un colorante. Algunos excipientes y principios
activos tienden a adherirse a las superficies del punzón y del
colorante, que pueden causar que el producto presente poros de
corrosión y otras irregularidades superficiales. Puede añadirse un
lubricante a la composición para reducir la adhesión y facilitar la
liberación del producto a partir del colorante. Los lubricantes
incluyen el estearato de magnesio, el estearato cálcico, el
monoestearato de glicerilo, el palmitoestearato de glicerilo, el
aceite hidrogenado de castor, aceites hidrogenados vegetales, aceite
mineral, polietilenglicol, benzoato sódico, sulfato lauril sódico,
fumarato estearil sódico, ácido esteárico, talco y estearato de
zinc.
Los agentes saborizantes y los potenciadores del
sabor hacen que la forma de dosificación sea más agradable para el
paciente. Los agentes saborizantes y los potenciadores del sabor
para los productos farmacéuticos que pueden incluirse en la
composición de la presente invención incluyen maltol, vainillina,
etil vainillina, mentol, ácido cítrico, ácido fumárico, etil maltol
y ácido tartárico.
Las composiciones sólidas y líquidas pueden
también colorearse utilizando colorantes farmacéuticamente
aceptables para mejorar su apariencia y/o facilitar la
identificación por parte del paciente, del producto y del nivel de
la dosis unitaria.
En composiciones farmacéuticas líquidas de la
presente invención, el acetato peptídico y cualesquiera otros
excipientes sólidos se disuelven o suspenden en un líquido portador
tal como el agua, aceite vegetal, alcohol, polietilenglicol,
propilenglicol, o glicerina.
Las composiciones farmacéuticas líquidas pueden
contener agentes emulsificantes para dispersar uniformemente a
través de la composición, un principio activo u otro excipiente que
no es soluble en el líquido portador. Los agentes emulsificantes
que pueden ser útiles en composiciones líquidas de la presente
invención incluyen, por ejemplo, gelatina, yema de huevo, caseína,
colesterol, acacia, tragacanto, condrus, pectina, metilcelulosa,
carbomer, alcohol cetoestearilo y alcohol cetilo.
Las composiciones farmacéuticas líquidas de la
presente invención pueden también contener un agente que potencie
la viscosidad para mejorar el sabor del producto en la boca y/o
tapizar el revestimiento del tracto gastrointestinal. Dichos
agentes incluyen acacia, ácido algínico bentonita, carbomer,
carboximetilcelulosa cálcica o sódica, alcohol cetoestearilo,
metilcelulosa, etilcelulosa, gelatina goma guar,
hidroxietilcelulosa, hidroxopropilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, maltodextrina, alcohol de polivinilo,
povidona, carbonato de propileno, propilenglicol alginato, alginato
sódico, glicolato sódico de almidón, almidón tragacanto y goma
xantán.
Los agentes edulcorantes tales como sorbitol,
sacarina, sacarina sódica, sacarosa, aspartano, fructosa, manitol y
azúcar invertida pueden añadirse para mejorar el sabor.
Los agentes conservantes y quelantes tales como
alcohol, benzoato sódico, hidroxi tolueno butilado, hidroxianisol
butilado y ácido tetraacético etilendiamina pueden añadirse a
niveles seguros para la ingestión, para mejorar la estabilidad del
almacenamiento.
Según la presente invención, una composición
líquida puede contener asimismo un tampón tal como ácido glucónico,
ácido láctico, ácido cítrico o ácido acético, gluconato sódico,
lactato sódico, citrato sódico o acetato sódico. La selección de
excipientes y las cantidades utilizadas pueden determinarse
fácilmente mediante la formulación científica basada en la
experiencia y en la consideración de los procedimientos estándares y
en los trabajos de referencia en el campo.
Cuando se preparan composiciones farmacéuticas
inyectables (parenterales), las soluciones y suspensiones se
esterilizan y resultan preferentemente isotónicas con la sangre. La
preparación de las inyecciones puede utilizar portadores que se
conocen habitualmente en la técnica. Por ejemplo, los portadores
para las preparaciones inyectables incluyen, pero no se limitan a
agua, alcohol etílico, propilenglicol, alcohol isoestereárilico
etoxilado, alcohol isoestearílico polioxilado y ésteres de ácidos
grasos de polioxietilensobrbitano. Un experto en la materia puede
determinar fácilmente con una escasa experimentación o con ninguna,
la cantidad de cloruro sódico, glucosa o glicerina necesaria para
hacer que la preparación inyectable sea isotónica. Pueden añadirse
Ingredientes adicionales, tales como agentes disolventes, agentes
tampón y agentes analgésicos.
Las composiciones sólidas de la presente
invención incluyen polvos, granulados, agregados y composiciones
compactadas. Las dosis incluyen dosis apropiadas para la
administración oral, bucal, rectal, parenteral (que incluye la
subcutánea, intramuscular e intravenosa), inhalante y oftálmica.
Aunque la administración muy apropiada en cada caso dado, dependerá
de la naturaleza y gravedad (de la situación de la que) está siendo
tratada, constituye la vía muy preferida de tratamiento, la vía más
preferida de la presente invención, es la oral. Las dosis pueden
presentarse convenientemente en formas de dosificación única y
prepararse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en
las técnicas farmacéuticas.
Las formas de dosificación incluyen formas
sólidas de dosificación, tales como comprimidos, polvos, cápsulas,
supositorios, saquitos, pastillas para chupar, pastillas, así como
jarabes líquidos, suspensiones y elixires.
La forma de dosificación de la presente
invención puede consistir en una cápsula que contiene la
composición, preferentemente una composición pulverulenta o
granulada sólida de la invención, en el interior de una cáscara (o
cubierta) dura o blanda. La cáscara puede estar realizada en
gelatina y contener opcionalmente contener un plastificante como
glicerina y sorbitol, y un agente opacificante o colorante.
El principio activo y el excipiente pueden
formularse en composiciones y formas de dosificación según los
procedimientos que se conocen en la técnica.
Una composición para formar comprimidos o
rellenar cápsulas puede prepararse mediante granulación húmeda. En
la granulación húmeda, algunos o la totalidad de los principios
activos y excipientes en forma pulverulenta, se mezclan, y se
mezclan entonces posteriormente en presencia de un líquido,
típicamente agua, que provoca que el polvo se amontone en gránulos.
El granulado se rastrea y/o muele, se seca y rastrea entonces y/o se
muele hasta el tamaño deseado de partícula. El granulado puede
entonces marcarse, o pueden añadirse otros excipientes antes de
formar los comprimidos, tal como un deslizante y/o un
lubricante.
Una composición de comprimidos puede prepararse
convencionalmente mediante mezclado seco. Por ejemplo, la
composición mezclada con los principios activos y los excipientes
puede compactarse en un (fragmento de) metal, o en una lámina y
entonces, triturar en gránulos compactos. Los gránulos compactados
pueden a continuación comprimirse (formando) un comprimido.
Alternativamente a la granulación en seco, una
composición mezclada puede comprimirse directamente en una forma de
dosificación compactada, utilizando técnicas directas de compresión.
La compresión directa produce una comprimido más uniforme sin
gránulos. Los excipientes que están particularmente preparados para
la formación de los gránulos mediante compresión directa, incluyen
la celulosa microcristalina, pulverización de lactosa seca,
dihidrato de fosfato dicálcico y sílice coloidal. La utilización
apropiada de estos y otros excipientes en la obtención de
comprimidos mediante compresión directa, es conocida por los
expertos en la materia que poseen experiencia y habilidad en los
intentos de formulación particular de la obtención de comprimidos
mediante compresión
directa.
directa.
Un rellenado de cápsulas de la presente
invención puede comprender cualquiera de las mezclas mencionadas
anteriormente y los granulados que se describieron haciendo
referencia a la obtención de comprimidos, no estando sometido, sin
embargo, a una etapa final de obtención de comprimidos. Las
composiciones sólidas de la presente invención incluyen polvos,
granulados, agregados y composiciones compactas. Las dosis incluyen
dosis apropiadas para la administración oral, bucal, rectal,
parenteral, (que incluye subcutánea, intramuscular e intravenosa),
por inhalación y oftálmica. Aunque la vía más apropiada en cualquier
caso dado, dependerá de la naturaleza y gravedad de la situación
que se trate, la vía más preferida de la presente invención es la
oral. Las dosis pueden presentarse convenientemente en forma de
dosificación unitaria y prepararse mediante cualquiera de los
procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica.
Mientras que la presente invención se describe
con respecto a ejemplos particulares y formas de realización
particulares, se debe entender que la presente invención no se
limita a estos ejemplos y formas de realización. Pueden así
introducirse en la presente invención, tal como se reivindica,
variaciones de los ejemplos particulares y de las formas de
realización preferidas que se describen en la presente memoria, como
apreciará el experto en la materia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos de HPLC siguientes son según
la Farmacopea Europea.
La síntesis del péptido se lleva a cabo mediante
un procedimiento SPPS de paso regular Fmoc que empieza a partir de
la resina cloruro de 2-Cl-Trt. El
primer aminoácido (Fmoc-Ser(tBu)) se carga en
la resina tal como se describe en los ejemplos anteriores para
obtener una carga de aproximadamente 0,7 mmol/g de
aminoácido/resina. Después del lavado de la resina y de la remoción
del grupo Fmoc mediante tratamiento con piperidina/DMF, el segundo
aminoácido (Fmoc-Pro) se introduce para continuar el
alargamiento de la secuencia. Los aminoácidos protegidos por Fmoc
se activan in situ utilizando TBTU/HOBt y se unen a
continuación a la resina durante aproximadamente 50 minutos. La
diisopropiletilamina o colidina se utiliza durante la conjugación
como una base orgánica. El cumplimiento de la conjugación se indica
mediante el ensayo de la ninhidrina. Después del lavado de la
resina, el grupo protector Fmoc sobre la
\alpha-amina es eliminado con piperidina al 20% en
DMF durante 20 minutos. Estas etapas se repiten cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos que
se utilizan están protegidos con Fmoc-N\alpha,
excepto el último aminoácido, que se protege con Boc. Los
aminoácidos trifuncionales constituyen cadenas literales protegidas
de la forma siguiente: Ser(tBu), Thr(tBu),
Glu(tBu), Gln(Trt), His(Trt), Arg(Pbf) y
Asp(tBu). En las reacciones de unión se utilizan tres
equivalentes de los aminoácidos activados. Al final de la síntesis,
la resina peptídica se lava con DMF, seguido por DCM, y se seca al
vacío para obtener una resina peptídica seca.
El péptido, preparado tal como se describe
anteriormente, se escinde de la resina a temperatura ambiente (RT)
utilizando un TFA al 1% en solución DCM mediante tres lavados
repetidos (de 15 minutos cada uno). La solución peptídica ácida es
neutralizada mediante DlPEA. El producto se precipita añadiendo 10
volúmenes de agua, y se filtra y se seca al vacío para obtener
polvos del péptido en bruto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo reaccionar el péptido en bruto
(preparado tal como se describe en el ejemplo 1) con amoníaco
disuelto en DMF. La activación del grupo carboxilo del péptido se
lleva a cabo in situ añadiendo TBTU/HOBt a la mezcla reactiva. Se
utiliza la diisopropiletil amina como una base orgánica. El
cumplimiento de la reacción se controla mediante análisis HPLC. Al
final de la reacción, se añade la solución DMF lentamente al agua, y
se precipita el péptido en bruto protegido como un sólido de color
hueso. El péptido se separa mediante filtración, y entonces se
seca.
El péptido anterior protegido se trata con un
"cóctel" que contiene TFA al 95%, TlS al 2,5%, EDT al 2,5%
durante 2 horas a temperatura ambiente. El producto se precipita
añadiendo 10 volúmenes de éter, se filtra, y se seca al vacío para
obtener el péptido en bruto. El péptido en bruto se purifica en una
columna preparativa C18 RP-HPLC, para obtener
fracciones que contienen solución peptídica con una pureza mayor del
98,5%. Después del intercambio del contraión con acetato (en
RP-HPLC), las fracciones se recuperaron y
liofilizaron para obtener el péptido seco final con una pureza
superior al 99,0%.
Claims (13)
1. Procedimiento para preparar exenatide que
comprende:
- a)
- proporcionar aminoácidos, protegidos o no protegidos, unidos en su C terminal a una resina lábil superácida;
- b)
- acoplar dicho aminoácido con otro aminoácido, protegido o no protegido, en presencia de un reactivo de acoplamiento;
- c)
- repetir la etapa b) para obtener un péptido, en el que el péptido está protegido con por lo menos un grupo protector que permanece en el péptido cuando se escinde la resina;
- d)
- escindir dicho péptido protegido de la resina mezclando con una solución ácida moderada; y
- e)
- realizar la amidación del péptido protegido obtenido en la etapa d), con una amina apropiada.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la amidación en la etapa e) se lleva a cabo en presencia de
una base, preferentemente la diisopropiletilamina.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la resina lábil superácida
se selecciona de entre el grupo constituido por: resina
clorotritilo, resina ácida Rink, resina NovaSyn TGT, y
resina
HMPB-AM.
HMPB-AM.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el reactivo de acoplamiento
es el tetrafluoroborato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluronio
(TB-TU).
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la solución ligeramente ácida
en la etapa d) es una solución que comprende aproximadamente 0,1% y
aproximadamente 5% de TFA en un disolvente orgánico inerte o una
mezcla de ácido acético con trifluoroetanol y DCM.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el péptido protegido con la
resina obtenida en la etapa d) se aísla antes de la etapa e).
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que el aislamiento es mediante precipitación, cristalización,
extracción, o cromatografía, siendo preferentemente el aislamiento
mediante precipitación.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el péptido protegido obtenido después de la escisión de la
resina, es un precursor de exenatide protegido, constituido por
aminoácidos que presenta la secuencia de
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu-(tBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asp(tBu)-Gly-Gly-Pro-Ser-(tBu)-
Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-OH (SEC. ID. nº31).
Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-OH (SEC. ID. nº31).
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que la amidación comprende el tratamiento de un precursor de
exenatide protegido con un reactivo de acoplamiento en presencia de
amoníaco en DMF, para obtener un precursor de exenatide protegido
constituido por aminoácidos que presenta la secuencia
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asp(tBu)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-NH_{2}
(SEC. ID. nº:31).
10. Procedimiento según la reivindicación 9, que
comprende además después de la amidación, la reacción del exenatide
protegido con una composición ácida que comprende una solución de
TFA que contiene agua, TlS y EDT: añadir éter para obtener un
precipitado de exenatide constituido por aminoácidos que presentan
la secuencia de:
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH_{2}
(SEC ID nº:31) y aislar el exenatide.
11. Procedimiento para preparar acetato de
exenatide que comprende obtener exenatide según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, y convertir el exenatide obtenido en
acetato de exenatide.
12. Composición farmacéutica que comprende
acetato de exenatide preparado según la reivindicación 11 y por lo
menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. Acetato de exenatide que presenta una pureza
de por lo menos aproximadamente 99,0%, como se ha determinado
mediante el procedimiento HPLC.
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