DE2025718C3 - Verfahren zum Stabilisieren von lyophillsierten Erythrozyten - Google Patents

Description

Dieses Verfahren ist eine weitere Ausgestaltung zum Hauptpatent 18 08 435.

Gemäß Deutschem Patent 18 08 435 werden Erythrozyten für direkte und passive Hämagglutinationsuntersuchungen durch Methylglyoxal und Formaldehyd stabilisiert. Vor oder nach dem Überziehen mit Antigen werden die Erythrozyten potenziert, um den Hämagglutinationstiter zu erhöhen.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Stabilität von mit Aldehyd verarbeiteten Erythrozyten zu verbessern, so daß sie insbesondere zur Lyophilisation geeignet sind. Die Anmeldung betrifft daher ein Verfahren zum Stabilisieren von Erythrozyten durch getrenntes Behandeln von nativen Erythrozyten sowohl mit Methylglyoxa! &'·5 auch mit Formaldehyd in beliebiger Reihenfolge gemäß Deutschem Patent 18 08 435, dadurch gekenn- y> zeichnet, daß dem wäßrigen, für die Lyophilisierung geeigneten Erythrozytenpräparat, enthaltend 0,1 bis 10 VoI.-% an aldehydstabilisie.'ten Erythrozyten 0,2 bis etwa 1 Gew.-% Blutserumalbumin und zusätzlich noch 5 bis 30 Gew.-% eines Zuckers aus der Gruppe Saccharose und Lactose und Mischungen davon hinzugefügt werden.

Nach diesem Verfahren stabilisierte Erythrozyten weisen eine erhöhte Aktivität und stark verbesserte Lagerungsstabilität auf. Weiterhin eignen sich diese -π Erythrozyten für ein Testpräparat für indirekte oder passive Hämagglutinationsuntersuchung mit sehr überlegener Lagerungsstabilität.

Native Erythrozyten und nach bereits bekannten Verfahren behandelte Erythrozyten, die für direkte Vi Hämagglutinationsuntersuchung, beispielsweise Blutgruppenbestimmung, brauchbar sind, haben den Nachteil, daß sie bei der Lagerung schnell verderben, so daß sie für viele Zwecke nach etwa 21 Tagen unbrauchbar sind. Außerdem sind native Zellen für die Gefrierlage· v, rung nur in speziellen Medien geeignet und sind nach der Lyophilisierung und Wiederaufbereitung unbefriedigend. Native Erythrozyten sind außerdem empfindlich im Hinblick auf die lonenzusammensetzung, den pH-Wert und den osmotischen Druck der Suspendierungsmedien, so daß unerwünschte Einschränkungen im Hinblick auf defl Umfang der Tests bestehen, die mit ihnen durchgeführt werden können.

Erythrozyten, die mit bekannten Antigenen überzogen sind, sind in anerkannten Präparaten für die Verwendung als Testmittel für Antikörper enthalten, die im Hinblick auf solche Antigene spezifisch sind. Wenn ein Antisemit! oder ein Serum, das den vermuteten Antikörper enthält, mit den überzogenen Erythrozyten in Kontakt gebracht wird, tritt Agglutination oder Zusammenballung ein, was anzeigt, daß der vermutete Antikörper tatsächlich in dem Serum vorhanden ist. Es ist bereits bekannt, daß derartige Agglutination eine halbquantitative Information hinsichtlich der Anwesenheit und des Auftretens von spezifischen Antikörpern und auch eine brauchbare Information hinsichtlich der Zustände liefert, die für die Anwesenheit solcher Antikörper Anlaß geben.

Bei der Herstellung, der Lagerung und dem Gebrauch solcher überzogener Erythrozyten sind viele Probleme aufgetreten, von denen einige allgemein mit der Stabilität der Erythrozyten unter Lagerungsbedingungen, mit ihrer Empfindlichkeit in ausgewählten passiven Hämagglutinationstests und mit der Reproduzierbarkeit solcher Hämagglutinationsuntersuchungen in Zusammenhang stehen. Die einzelnen Erythrozj-J-.nzellen können sich zusammenballen oder nichtspezifische Hämagglutination, das heißt eine Aktivität zeigen, die die Hämagglutinationsuntersuchung im Hinblick auf einen spezifischen Faktor stört, überzogene Erythrozyten werden gewöhnlich in gefrorenem Zustand gelagert jedoch können beim Auftauen von gefrorenen Präparaten Zusammenballungen auftreten, oder die Zellen können durch Hämolyse zerstört werden. Die Aufbewahrung von gefrorenen Zellen in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis ist teuer und hat einen beträchtlichen Raumbedarf zur Folge. Der Transport ist besonders beschwerlich. Zusätzlich besteht eine Neigung zu einer gewissen Verschlechterung der Zellen bei sehr ausgedehnter Lagerung.

Bei mikroskopischer Untersuchung der Zellen tut sich eine solche Verschlechterung durch eine Veränderung der Größe, Gestalt und Ebenheit kund. Die verschlechterten Zellen bilden, wenn sie bei den Hämagglutinationsuntersuchungs-Arbeitsweisen Vei"wendung finden, keinen scharf definierten und dichten »Knopf« in der Vertiefung und bewirken leicht, daß der Hämagglutinationstiter unvorhersehbar von Partie zu Partie des lyophilisierten Produktes schwankt.

Durch verbesserte Lyophilisierung der stabilisierten Erythrozyten werden Probleme, wie sie vorstehend angegeben wurden, vermieden.

Somit wird ein stabilisiertes Erythrozytpräparat bereitgestellt, das für die Lyophilisierung besonders geeignet ist. Ferner sind derart hergestellte Erythrozytpräparate, nach der Bereitstellung zur Infusion nicht lyophilisierten, stabilisierten Erythrozyten-Präparationen äquivalent.

Das erfindungsgemäß bereitgestellte Erythrozytpräpara; kann während längerer Zeitspannen gelagert werden, ohne d?ß sich irgendeine Hämolyse oder Zusammenballung der Blutzellen ergibt. Es kann auch bei der Hämagglutinationsuntersuchung eingesetzt werden.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Erythrozytpräparat kann, wie gesagt, wirksam mit verschiedenen Antigenen überzogen werden, wobei die überzogenen Erythrozyten ein Präparat darstellen, das wirkungsvoll verpackt und während längerer Zeitspannen, bis es einer speziellen passiven Hämagglulinatiönsuntersuchung zugeführt wird, gelagert werden kann.

Die Erfindung wird nachfolgend im einzelnen beschrieben,

Native Erythrozyten werden im Gesamtblut von verschiedenen Tieren, wie Kaninchen, Ratten, Tauben,

Schafen und Hühnchen, sowie von Menschen, gesammelt. Die Blutprobe wird mit herkömmlichen isotonischen Antikoagulierungslösungen behandelt, dann werden die Erythrozyten zusammengepreßt, beispielsweise durch Zentrifugieren, und mit verträglichen Pufferlösungen mit einem im wesentlichen neutralen pH gewaschen, um Hämolyse der Erythrozyten zu verhindern und unerwünschte Stoffe zu entfernen, die auf den Erythrozyten aus dem Serum vorliegen können.

Eine Suspension der gewaschenen Erythrozyten wird in der neutralen Pufferlösung in einer geringeren Konzentration von vorzugsweise unter 10% Vol/Vol hergestellt Die Erythrozyten werden mit einer kleineren Menge, bezogen auf das Volumen der Erythrozyten, an Methylglyoxal für eine Zeitspanne behandelt, die ausreicht um den Erythrozyten die erwünschte Stabilität zu verleihen, beispielsweise über Nacht unter Mischen. Im Anschluß an den Behandlungsschritt mit Methylgiyoxal werden die Erythrozyten mehrere Male gewaschen, um überschüssiges Methylglyoxal und etwaige andere Stoile zu entfernen, die aus dem Serum stammen können. Die mit rviethyiglyoxai behandelten Erythrozyten werden dann einer kleineren Menge, bezogen auf das Volumen der Erythrozyten, an Formaldehyd ausgesetzt, und der überschüssige Formaldehyd wird durch mehrere Waschungen mit einer gepufferten Lösung entfernt

Die vorstehenden Behandlungen mit Methylglyoxal und Formaldehyd können zusammen als »doppelte Aldehydbehandlung« bezeichnet werden, um ein »stabi- jn lisiertes Erythrozytpräparat« zu erhalten, vgl. DE-PS 18 08 435. Es ist bei der vorliegenden Ausgestaltung gemäß Deutschem Patent 18 08 435 wesentlich, daß die Behandlung mit Methylglyoxal vor der Behandlung mit Formaldehyd stattfindet, da festgestellt «'orden ist, daß r, bei Erythrozyten bestimmter Individuen eine anfängliche Formaldehydbehandlung zu einer Schädigung solcher Zellen führt, weshalb diese Reihenfolge empfohlen wird. Bei Erythrozyten anderer Individuen kann jedoch eine anfängliche Formaldehydbehandlung nicht als besonders schädlich erscheinen, weshalb bei manchen Verfahrensweisen eine anfängliche Formaldehydbehandlung trotzdem zu vorteilhaften Ergebnissen führen kann.

Wie bereits erwähnt, können erfindungsgemäß vt stabilisierte Erythrozytpräparate für beträchtliche Zeitspannen gelagert werden, ohne daß unerwünschte Hämolyse, Zusammenballung oder andere schädliche Erscheinungen auftreten.

Menschliche Erythrozyten können durch Methylgly- w oxal/Formaldehyd-Behandlung stabilisiert werden, ohne daß eine sichtbare Veränderung bei ihrer Fähigken auftritt, mit Antisera für die Blutgruppenbestimmung zu reagieren. Stabilisierte menschliche Zellen vom Typ A, B oder AB werden spezifisch durch Anti-A- y, oder Anti-B-Serum agglutiniert. Die Empfindlichkeit der Aggiutinationsreaktion unter Verwendung der stabilisierten Zellen ist der Empfindlichkeit bei Verwendung von nativen Zellen gleich oder um ein Mehrfaches höher. Stabilisierte Zellen vom Typ 0 reagieren nicht mit Anti-A- oder Anti-B-Serum. Die obigen Reaktivitäten werden für mehrere Monate beibehalten, wenn die Zellen bei 4° C oder in Gefrierlagerung gelagert werden. Diese stabilisierten Zellpräparate sind als Bezugszellen für die Blutgruppenbestimmung bf auchbar,

Das vorstehend stabilisierte Erythrozytpräparat kann in ein überzogenes stabiles Erythrozytpräparat Umgewandelt werden, indem eine Probe der Aldehyd-behan* delten Erythrozyten mit einem Antigen kontaktiert wird und nachfolgend ein oder mehrere Waschschritte zur Entfernung von überschüssigem Antigen durchgeführt werden. Im allgemeinen werden die stabilisierten Erythrozyten mit Antigenen in einer Lösung überzogen, die auf einen pH unter 7 und erwünschtermaßen auf einen pH von etwa 3,6 bis 6 gepuffert ist Mit Polysaccharidantigenen, wie E. coli-Endotoxin, kann das Oberziehen bei pH 7 durchgeführt werden. Es ergibt sich überlegene Sensibilität, wenn die behandelten Erythrozyten konditioniert werden, indem sie in der gepufferten Lösung vor dem Überziehen mit Antigen etwa 1 Stunde bewegt werden. Der Oberziehungsschritt ist gewöhnlich in etwa 1 Stunde vollständig, jedoch können manche Überziehvorgänge 24 Stunden erfordern. Eine Überziehungstemperatur von 24° C ist bevorzugt, Temperaturen von 50° C oder höher liefern Erythrozytpräparate mit verminderter Empfindlichkeit

Diese vorstehenden Bedingungen können für verschiedene Antigene etwa variieren, der Fachmann kann jedoch leicht die notwendigen Überziehungsbedingungen unter Berücksichtigung des Auftretens der Agglutination mit Reihenverdünnungen eines gewählten Antiserums bestimmen. Beispielsweise können einem Kaninchen verschiedene Mengen an Antigen injiziert werden, das mit dem Antigen identisch ist, das auf dem Erythrozytpräparat adsorbiert ist Es wird eine Serumprobe gesammelt, in der uie Antikörper vorliegen, und Reihenverdünnungen dieses Serums können in Plastikschalen mit V-Boden angesetzt werden, denen ein gleiches Volumen des stabilen, mit Aldehyd behandelten Erythrozytpräparats zugesetzt wird. Eine Reaktionsmischung, die Zellen und Verdünnungsmittel enthält, dient als Vergleich, bei dem die Zeilen am Boden einen »Knopf« bilden, was eine negative Reaktion darstellt. Das Auftreten einer »mattierten Oberfläche« stellt eine positive Agglutinationsreaktion dar, die befriedigendes Überziehen anzeigt Nichtspezifische Agglutination muß sorgfältig unterschieden werden.

Wenn bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung von einem »Antigenw-Überzug gesprochen wird, so soll damit ein Material bezeichnet werden, das ein Antikörper oder ein Antigen sein kann, wenn nicht besonders auf spezielle Antigene oder Antikörper hingewiesen wird.

Zu repräsentativen Antigenen, die erfolgreich zum Überziehen der stabilisierten Erythrozytpräparate verwendet werden können, gehören Proteinantigene, wie Rinderserumalbumin oder BSA, unlöslich gemachtes BSA, Menschenserumalbumin, Kanir.chen-y-Globulin, Menschen-y-Globulin, Streptokokken-M-Protein. Ambrosiapflanzenantigen »E« (ragweed antigen »E«), Polysa^charidantigene, wie E. coli-Endotoxin (ET), acetyliertes ET, succinyliertes ET, entestertes ET, entestertes und bromacetyliertes ET, synthetische Polyglucose, gemische Antigene, wie RNS-Bakteriophag (Ribonuoleinsäure), QS, Entamoeba histolytica-Antigen und andere. Es ist ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß das stabilisierte Erythrozytpräparat für das Überziehen mit einer derartigen Vielzahl von Substanzen mit unterschiedlichen chemischen Zusammensetzungen geeignet ist.

Der Hämagglutinationstiter entweder des stabilisier' ten oder des überzögerten Erythfözytpraparates kann dadurch erhöht werden, daß die Temperatur des Präparates auf etwa —190°C erniedrigt und dann bei einem Temperaturwert, der mehrere Grade unterhalb der Gefräertemperatur liegt, vorzugsweise bei einem

gleichmäßig eingehaltenen Temperaturwert und bei etwa -2O⁰C während eines Zeitraums von etwa 16 Wochen gehalten wird. Andererseits ergibt sich eine gleichermaßen wirksame Potenzierung auch innerhalb von etwa 6 Wochen, indem die Temperatur der stabilisierten oder überzogenen Erythrozyten periodisch für mehrere Stunden und ohne Bewegung, vorzugsweise in Intervallen von etwa 6 oder 7 Tagen auf 24° C erhöht wird.

Erythrozyten können auch durch Behandlung mit einer verdünnten Lösung eines Oxidationsmittels potenziert werden, wobei Natriumperjodat ein geeignetes Reagens ist.

Ein potenziertes, stabilisiertes Erythrozytpräparat kann hergestellt werden, indem dessen Zellen vor dem Überziehen mit dem Antigen mit Fibrinogen überzogen werden. Rinderfibrinogen ist ein geeignetes Potenzierungsmittel.

Zu diesen Verfahrensmaßnahmen vgl. auch die Ausführungen in DT-PS 18 08 4J5. Das potenzierte. ₂n stabilisierte oder überzogene Erythrozytp.äparat kann im lyophilisiertem Zustand oder bei einer Temperatur von etwa -190⁰C gelagert werden, bis es für Hämagglutinationstests benötigt wird. Verbesserte Ergebnisse bei der Herrichtung zur Infusion werden erzielt, wenn die Zellen in einer wäßrigen Saccharoseoder Lactose-Lösung, die eine geringe Menge Blutserumalbumin enthält, lyophilisiert werden. Die Zellenmenge in der Lösung ist nicht kritisch und kann von etwa '/io% bis zu etwa 10% oder mehr des Gesamtvolumens des Präparates variieren. Ausgezeichnete Ergebnisse werden bei einer Konzentration zwischen 0,5% und 5% erzielt; die bevorzugte Konzentration beträgt 1 %.

Zur Infusion hergerichtete Erythrozyten von gleichmäßig hoher Güte erhält man, wenn die Zuckerkonzentration vor der Lyophilisierung von mehr als 5 Gew.-% bis zu etwa 30 Gew.-% der Lösung reicht. Gute Ergebnisse erzielt man in einem Konzentrationsbereich von etwa 10% bis zu etwa 20%, und der bevorzugte Bereich geht von etwa 15% bis zu etwa 20%. Die Verwendung von Zucker bei einer Konzentration von weniger als 5% bietet nichtsdestoweniger eine gewisse Verbesserung gegenüber einer Zusammensetzung, in der Z'icker abwesend ist. Zuckerkonzentrationen oberhalb etwa 30% sind weniger erwünscht, weil übermäßig viel Zeit benötigt wird, um die Erythrozyten nach der Lyophilisierung zur Infusion herzurichten.

Blutserumalbumin von verschiedenen Tieren ist verwendbar; das von Kaninchen, Hühnern und Rindvieh führt ⁷U guten Ergebnissen. Mindestens etwa 0.1 Gew.-% werden verwendet, um die gewünschten Eigenschaften in den zur Infusion hergerichteten Erythrozyten tu erhalten. Bessere Ergebnisse werden erzielt, wenn die Zusammensetzung etwa 0,3% enthält, und eine bevorzugte Zusammensetzung enthält 0,5% Blutserumalbumin. Bis zu 1% können verwendet werden, jedoch wird eine geringere Menge gewöhnlich bevorzugt, weil das Blutserumalbumin verhältnismäßig teuer ist. Von der vorliegenden Erfindung umfaßt sa werden auch die lyophilisierten Erythrozytpräparate, deren Zusammensetzung gemäß der Zusammensetzung der Suspension, aus der sie herstammen, variiert. Der Zucker und das Blutserumalbumin sind auf Gewichtsba* »is zugegen und erleiden beim Lyophilisieren praktisch keinen Verlust. Die Erythrozytfraktion, die auf Volumenbasis als wäßrige Suspension mit einer Dichte, die sich eine annähert, vorhanden ist, verliert etwa 85% ihres Gewichtes, wenn sie lyophilisier» wird. So enthält eine repräsentative Erythrozytsuspension, die aus 0,1% Zellen, 0,2% Blutserumalbumin und 5% Lactose besteht, nach dem Lyophilisieren etwa 0,3 Gew.-% Zellen, 3,8 Gew.-% Blutserumalbumin und 96 Gew.-% Lactose. In ähnlicher Weise enthält eine Erythrozytsuspension, die aus 10% Zellen, 1% Blutserumalbumin und 5% Saccharose besteht, nach dem Lyophilisieren etwa 20% Zellen, 133% Blutserumalbumin und 66,5% Saccharose. In gleicher Weise liefern Suspensionen von 10% Zellen und 1% Blutserumalbumin in 30%iger Zuckerlösung und von 0,1% Zellen und 0,2% Blutserumalbumin in 30%iger Zuckerlösung nach dem Lyophilisieren 4,6% Zellen, 3,1% Blutserumalbumin und 923% Zucker bzw. 0,05% Zellen, 0,7% Blutserumalbumin und 99% Zucker.

Die Art und Weise der Durchführung von Hämagglutinationstests ist dem Fachmann geläufig. Im allgemeinen wird eine Tierserumprobe mit dem vermuteten Antikörper mit dem nichtüberzofien oder überzogenen Erythrozyt in einem flüssige!¹ Trägermittel vereinigt, um zu bestimmen, ob eine Agglutination auftritt. Ebenso können die stabilisierten Erythrozytpräparate mit einem spezifischen Antikörper überzogen werden, so daß bei nachfolgender Hämagglutinationsuntersuchutig die Erythrozyten in Gegenwart eines freien spezifischen Antigens agglutinieren. Andere Variationen und Modifikationen des Hämagglutinationsuntersuchungsverfahrens liegen für der. Fachmann auf der Hand, und alle derartigen Tests können vorteilhaft mit den verbesserten stabilen und überzogenen Erythrozytpräparaten durchgeführt werden.

Der passive Hämagglutinationstest kann dazu verwendet werden, die Anwesenheit von y-Globulin auf den Zeilen festzustellen, wie irn Coornb Test, für die Entdeckung von bakterieller Infektion, wie in Anwesenheit von Endotoxinantigen, für die Entdeckung von Virusinfektion, für die Bestimmung der Gewebeverträglichkeit, für die Entdeckung von Autoimmunitatskrankheiten und von anderen Phänomenen dieses Typs. Die überzogenen und stabilen Erythrozytpräparate können auch als Testreagens in chemischen Analysen verwendet werden, um das Vorliegen von Antigen in quantitativer oder halbquantitativer Weise festzustellen.

Die folgenden Beispiele werden gebrach», um die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung zu zeigen. Obwohl diese Ausführungsformen die besten Methoden einschließen, die zur Zeit für die praktische Durchführung der Erfindung in Betracht kommen, versteht es sich jedoch, daß sie nicht ausschließliche Ausführungsforrnen darstellen. Sie schließen auch nicht notwendigerweise diejenigen Ausführungsformen ein, die möglicherweise in Zukunft den Vorzug finden werden.

Beispiel 1

Herstellung eines stabilen, mit Aldehyd behandelten Erythrozytpräparates

Eine 20-ml-Probe an Gesamtblut wird einem 2 bis 3 kg schweren Kaninchen durch Herzpunktion entnommen, und die Probe wird in einer' Spritze gesammelt, die ein gleiches Volumen an steriier Alsever-Lösung enthält. Diese Lösung ist im allgemeinen isotonisch und enthält ein Natriiimcitratantikoagulans, Natriumchlorid, Dextrose und destilliertes Wasser. Die abgezogene Probe wird über Nacht bei etwa 4°C stehen gelassen und dann mit 1500 Upm 10 Minuten zentrifugiert, wobei etwa 10 ml zusammengepreßte Kaninchenerythrozyten

erhalten Werden. Die zusammengepreßten Erythrozyten werden dann mit 10 Volumina einer 0,11 molaren Phosphatpufferlösung mit pH 7,2 vereinigt. Diese gepufferte Lösung v/ird aus Monokaliumphosphat und Dinalriumphosphat durch wirbelndes Mischen hergestellt. Die Mischung aus Erythrozyt und Pufferlösung wird zentrifugiert und dann 5 getrennten Waschvorgängen mit 10 Volumina der oben genannten gepufferten Lösuiig unterworfen, um Serumprotein und etwaige andere Serumstoffe zu entfernen. Die gewaschenen Erythrozyten werden dann wieder in der obenerwähnten gepufferten Lösung suspendiert, um eine Kaninchenerythrozytsuspension mit 8% Vol/Vol zu erhalten.

In einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben werden 125 ml der mit Phosphat gepufferten Lösung, die 3% Vol/Vol Methylglyoxal enthält, und 125 ml der vorstehenden 8%igen Erythrozytsuspension eingebracht und die Mischung wird etwa 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Die Mischung wird dann durch ein Gazekissen filtriert, um etwaige große Stücke zu entfernen, und die Erythrozyten werden dann bei 5 getrennten Gelegenheiten mit dem lOfachen ihres Volumens an mit Phosphat gepufferter Lösung gewaschen. Das mit Methylglyoxal behandelte Erythrozytpräparat wird dann wieder in der obenerwähnten gepufferten Lösung in einer Konzentration von 10% Vol/Vol suspendiert.

125 ml der vorstehenden mit Methylglyoxal liehaudelten Suspension werden auf 8% verdünnt und mit 125 ml der mit Phosphat gepufferten Lösung gemischt, die 3% Vol/Vol Formaldehyd enthält. Die Mischung wird über Nacht mit einem Magnetrührer bei Raumtemperatur gerührt und dann durch ein Gazekissen filtriert um etwa mögliche Bruchstücke zu entfernen. Die mit Methylglyoxal und Formaldehyd behandelten Erythrozyten werden dann bei 5 verschiedenen Gelegenheiten mit dem lOfachen ihres Volumens der vorstehenden gepufferten Lösung gewaschen. Das mit Aldehyd behandelte Erythrozytpräparat wird dann in einer Konzentration von 10% wieder in der vorstehenden gepufferten Lösung suspendiert und in Glasbehälter überführt und zur Lagerung verschlossen. Das vorstehende mit Aldehyd behandelte Erythrozytpräparat ist für mindestens 2 Monate bei verminderten Temperaturen von 4° C oder für unbegrenzte Zeitspannen stabil, wenn es in flüssigem Stickstoff gefroren ist.

Das stabilisierte Erythrozytpräparat kann potenziert werden, jedoch wird bei dem bevorzugten Verfahren der Potenzierungsschritt erst durchgeführt, nachdem die Erythrozyten überzogen worden sind.

Das nach dem erfincungsgemäßen Verfahren hergestellte stabilisierte Erythrozytpräparat besitzt die meisten, wenn nicht alle der verbindenden Stellen, die auf dem nätiven Erythrozyten vorliegen, wobei mit verbindenden Stellen speziell die Stellen bezeichnet werden, die mit einem Antikörper oder Virus reagieren können.

Beispiel 2

Potenzierung eines stabilisierten
Erythrozytpräparates

Dieses Beispiel veranschaulicht die Zunahme des Hämagglutinationstiters, die erreicht wird, indem Fibrinogen mit den Zellen des stabilisierten Erythrozytpräparats verbunden wird. Rinderfibrinogen wird bei einer Konzentration von 1 Mikrogramm pro Milliliter in 0,1 molarer mit Acetat gepufferter Lösung mit pH 4,0 1 Stunde lang auf 60°G erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Eine 10%ige Suspension der der doppelten Aldehydbehandlung unterworfenen Erythrozyten, die nach dem Verfahren von Beispiel 1 erhalten wird* wird zu der Fibrinogenlösung gegeben und es wird 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Die potenzierten stabilisierten Erythrozyten werden mit einer Phosphatpufferlösung mit pH 7,2 gewaschen Und die Erythrozy!konzentration wird auf 10% Vol/Vol eingestellt. Diese Zellen werden später mit hervorragenden Ergebnissen für Blutgruppenbestimmungen verwendet.

Beispiel 3

Überziehen eines potenzierten stabilisierten
Frythrozytpräparates

1 ml der 10%igen Suspension des potenzierten stabilisierten Erythrozytpräparates, die nach dem Verfahren von Beispiel 2 erhalten wird, wird mit einer 0,1 molaren Acetatpufferlösung mit pH 4,0 gewaschen und in 9 ml der Acetatpufferlösung mit 24°C wieder suspendiert. I- ml der Acetatpufferlösung, die 1 mg Rinderserumalbumin enthält, wird zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lang

gerührt und dann 5mal mit eine Überschuß an mit Phosphat gepufferter Lösung mit pH 7,2 gewaschen. Diese Zellen werden später für passive Hämagglutinationsreaktionen verwendet.

Beispiel 4

Überziehen eines stabilisierten
Erythrozytpräparates mit Antigen

In ein konisches 12 ml Zentrifugenröhrchen wird bei 24° C 1 ml der 10%igen Suspension des mit Aldehyd behandelten Erythrozytpräparats gegeben, die nach den Verfahrensschritten von Beispiel 1 erhalten wird. Diese Probe wird dann mit einer 0,1 molaren Acetatpufferlösung mit pH 4,0 gewaschen. Die stabilisierten Erythrozyten werden bei diesem erniedrigten pH-Wert nicht hämolysiert und ballen sich nicht zusammen. Die gewaschenen Erythrozytpräparatzellen werden in 9 ml der mit Acetat gepufferten Lösung mit pH 4,0 bei 24° C wieder suspendiert und es wird bei diesem pH und bei dieser Temperatur 1 Stunde lang gerührt Dann wird 1 ml der Acetatpufferlösung, die 1 mg Rinderserumalbumin enthält zugegeben. Die Mischung von Antigen und stabilen mit Aldehyd behandelten Erythrozyten wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lang rotieren gelassen und dann 5 getrennten Waschvorgängen mit überschüssigen Volummengen einer mit Phosphat gepufferten Lösung mit pH 7,2 unterworfen. Die mit Rinderserumalbumin überzogenen stabilen Erythrozyten werden in dem vorstehenden Phosphatpuffer in einer Konzentration von 0,5% Vol/Vol wieder suspendiert und es werden aliquote Teile dieser Suspension mit 10 ml in 20 ml Glaskölbchen verpackt und verschlossen. Die verpackte vorbestimmte Menge des überzogenen stabilen mit Aldehyd behandelten Erythrozytpräparats wird dann in einer Gefriereinrichtung mit flüssigem Stickstoff rasch gefroren und — 20° C gelagert

Beispiel 5 Potenzierung des überzogenen, stabilen ErytFirozytpräparats

Behandelte Erythrozyten, die wie in Beispiel 4, jedoch bei einem pH Wert von 3.6, überzogen und bei — 196°C gefroren und 6 Tage lang bei -20°C gelagert worden sind, werden ohne Bewegen auf Raumtemperatur von 24°C aufgetaut, 2 Stunden bei 24° C gehalten und π ich dem Wiedereinfrieren bei -196°C wieder auf -20⁰C gebracht. Das Verfahren wird einmal οίΌ Woche 6 Wochen lang wiederholt.

Die potenzierten, überzogenen Erythrozyten werden dann bei - 196" C gefroren und bei dieser Temperatur gelagert, bis sie für den Hämagglutinationstest benötigt werden. Alternativ kann die Suspension der potenzierten, überzogenen Zellen lyophilisiert und durch Zugabe von Wasser vor der Verwendung zur Infusion hergprichtet werden.

Diese Arbeitsweise erhöht den Titer 30fach, wobei der nicht spezifische Hämagglutinationstiter lediglich verdoppelt wird, was eine praktisch unbedeutende Zunahme darstellt Weitere wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen führen zu einer weiteren Erhöhung des Hämagglutinationstiters, rufen jedoch auch eine gleichzeitige bedeutende Erhöhung des nicht spezifischen Hämagglutinationstilers hervor, so daß aus der verlängerten Bearbeitung wenig Vorteile gezogen werden.

Die optimale Zahl der Gefrier-Auftau Zyklen steht in Verbindung mit dem speziellen überzogenen Zellpräparat; der Fachmann weiß jedoch, daß das Optimum bei demjenigen Zyklus liegt, über den hinaus die Erhöhung des Hämagglutinationstiters von einer merklichen Erhöhung des nichtspezifischen Hämagglutinationstiters begleitet ist. Ein überzogenes Zellpräparat, das für das Standardserum optimal ist, ist auch für andere Antisera als optimal befunden worden. Somit können aufeinanderfolgende Standard-Sera gegen das ursprünglich gewählte Antiserum standardisiert werden.

Beispiel 6 Potenzieren eines stabilisierten Erythrozytpräparates

Dieses Beispiel veranschaulicht eine weitere Ausführungsform des Potenzierungsmittels der vorliegenden Erfindung. Human-Erythrozyten werden gemäß der Arbeitsweise des Beispiels 1 verarbeitet, um stabilisierte Hur an-Erythrozyten, suspendiert in einer mit Phosphat gepufferten Lösung (pH 7,2), zu erhalten. Die stabilisierten Human-Erythrozyten werden dann bei 24°C 15 Minuten lang mit 0,00035 molarer Natriumperjodatiösung behandelt und dann mittels phosphatgepufferter Lösung (pH 7,2) von diesem Reagens frei gewaschen.

Als die stabilisierten Zellen der direkten Hämagglutinationsreaktion gegen Ratten-Antiserum unterworfen wurden, ergaben sie bei einer Verdünnung von 1 :100 eine Reaktion, während die mit der Oxidationsreaktion potenzierten, stabilisierten Zellen Hämagglutination bei einer Verdünnung von 1 :2000 zeigten.

Das folgende Beispiel veranschaulicht die Lyophilisierung von Erythrozyten zur Bereitstellung von zur Infusion hergerichteten Zellen von hoher Qualität.

Vergleichsversuch

Eine Lösung von stabilisierten Erythrozyten, die mit Rinderserumalbumin (BSA) überzogen und gemäß der Arbeitsweise des Beispiels 4 hergestellt waren, wurde bei einer Konzentration von 1% in einer 0,11 molaren, mit Phosphat gepufferten Lösung mit Saccharose und Kaninchenserumalbumin derart suspendiert, daß sich in der endgültigen Lösung eine Konzentration von 15% bzw. 0,5% ergab. Die Lösung wurde nach Standard-Arbeitsweisen lyophylisiert und mehrere Tage lang in lyophilisiertem Zustand gelagert Die lyophilisierten Erythrozyten wurden dann mit Wasser zur Infusion hergerichtet und bei einer Hämagglutinationsreaktion gegen Anti-BSA-Serum Nr. 8 verwendet Die Ergebnisse werden als Versuch b, in Tabelle I zusammen mit den als Versuch a, bezeichneten Ergebnissen eines Vergleiches gezeigt der mit nicht-Iyophilisierten Zellen durchgeführt wurde.

Lösungen wurden auch mit verschiedenen anderen Konzentrationen von Saccharose und Lactose für die Lyophilisierung gemäß der Arbeitsweise des Vergleichsversuches hergestellt Die Ergebnisse der Harnagglutinationsreaktionen mit den zur Infusion hergerichteten Erythrozyten werden in der Tabelle I als Versuche c bis k dargestellt Es ist zu bemerken, daß Zellen, die mit 0,5%igem Kaninchenserumalbumin und 20% Lactose lyophilisiert worden waren, in ihrer Wirkungsweise von Zellen, die nicht iyophilisiert worden waren, nicht unterschiedbar waren. Der Ersatz der Lactose durch Saccharose in einer Menge von etwa 15 bis etwa 20% führte zu ähnlichen Ergebnissen. Bei geringfügig niedrigeren Konzentrationen von Zucker und Kaninchenserumalbumin wurde eine Erhöhung des Hämagglutinationstiters beobachtet; die Wirkungsweise war jedoch trotzdem vortrefflich.

Die gemäß dieser Arbeitsweise lyophilisierten. Zellen können zur Infusion hergerichtet und wiederholt ohne nachteilige Wirkungen lyophilisiert werden.

Die wünschenswerten Eigenschaften, weiche bei den lyophilisierten und zur Infusion hergerichteten, lyophilisierten Zellen festgestellt werden, ergeben sich allein aufgrund der Verwendung des Blutserumalbumins in Kombination mit Lactose oder Saccharose. Ein Präparat, das demjenigen des Versuchs c ähnlich war, aber kein Blutserumalbumin enthielt, rief einen Hämagglutinationstiter von 1 280 000 und KontrolI-»Knöpfe« von schiechter Qualität hervor. In gleicher Weise unbefriedigende Ergebnisse wurden bei Versuchen aufgezeichnet bei denen ein ähnliches Präparat wie das des Versuches c, das aber keine Saccharose oder Lactose enthielt verwendet wurde.

Ein Präparat das 10% Saccharose und 4% normales Kaninchenserum enthielt, ergab einen Hämagglutinationstiter von 1 280 000 und KontrolI-»Knöpfe« von schlechter Qualität Es ist daher klar, daß die Anwesenheit von Saccharose oder Lactose zusammen mit Biutserumaibumin für die erfolgreiche Durchführung der vorliegenden Erfindung kritisch ist

Tabelle I

Lyophilisierte, stabilisierte, mit Rinderserumalbumin überzogene Zellen; Hämagglutinationstiter gegen Anti-BSA-Serum Nummer 8.

Beispiel	S''spendierungsmedien, enthaltend	Hämagglutinations	Qualität der
	0,11 molaren Phosphatpuffer Plus	titer, Reziprok	Kontroll-»Knöpfe<(
a	nichtlyophilisiert	160 000	ausgezeichnet
b	15% Saccharose—0,5% RSA»)	160 000	ausgezeichnet
C	20% Saccharose-0,5% RSA	160 000	ausgezeichnet
d	20% Lactose-0,5% RSA	160 000	ausgezeichnet
e	10% Saccharose-0.5% RSA	320 000	ausgezeichnet
f	20% Saccharose—0,2% RSA	320 000	äüsgezeichriel
g	10% Laclöse-^0,5% RSA	320 000	ausgezeichnet
h	15% Lactose—0,5% RSA	320 000	ausgezeichnet
i	5% Lactose-0,5% RSA	640 000	ausgezeichnet
k	ίθ% Saccharose—0,1% RSA	640 000	ausgezeichnet

= K.anincnenserumaiDumin.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zum Stabilisieren von Erythrozyten durch getrenntes Behandeln von nativen Erythrozyten sowohl mit Methylglyoxal als auch mit Formaldehyd in beliebiger Reihenfolge gemäß Deutschem Patent 18 08 435, dadurch gekennzeichnet, daß dem wäßrigen, für die Lyophilisierung geeigneten Erythrozytpräparai, enthaltend 0,1 bis 10 Vol.-% an aldehydstabilisierten Erythrozyten, 0,2 bis etwa 1 Gew.-% Blutserumalbumin und zusätzlich 5 bis 30 Gew.-% eines Zuckers aus der Gruppe Saccharose und Lactose und Mischungen davon hinzugefügt werden.