DD202178A5 - Verfahren und reagens zur untersuchung von antigen-antikoerper-reaktionen - Google Patents

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DD202178A5 DD82239478A DD23947882A DD202178A5 DD 202178 A5 DD202178 A5 DD 202178A5 DD 82239478 A DD82239478 A DD 82239478A DD 23947882 A DD23947882 A DD 23947882A DD 202178 A5 DD202178 A5 DD 202178A5
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Abstract

Es werden ein Verfahren zur Untersuchung bzw. Bestimmung von Antigenen oder Antikoerpern in einem Reaktionsmedium, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine die zu bestimmenden Antigene oder Antikoerper enthaltende Probe mit einem in dem Reaktionsmedium loeslichen Polyanion behandelt und die in dieser Weise behandelte Probe zur Durchfuehrung der Antigen-Antikoerper-Reaktion verwendet wird, und ein Reagens zur Untersuchung von Antigen-Antikoerper-Reaktionen, welches ein Polyanion und ein Reaktionsmedium enthaelt, beschrieben.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Untersuchung von Antigen-Antikörper-Reaktionen, bei dem das zu bestimmende Antigen oder der zu bestimmende Antikörper in einer Reaktionsmischung mit dem entsprechenden Antikörper bzw. Antigen umgesetzt wird, sowie ein hierfür geeignetes Reagens.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:
Zur Zeit finden viele in vivo-Reaktionen im Hinblick auf ihre Beziehung zu Antigen-Antikörper-Reaktionen Interesse, insbesondere auf dem Gebiet der Medizin und der Hygienewissenschaft und werden mit der Absicht, die Volksgesundheit zu bessern, Krankheiten zu behandeln und dergleichen untersucht. Weiterhin werden im Hinblick auf in vitro-Reaktionen immunochemische Untersuchungen in intensivem Maßstab auf der Grundlage von Proben durchgeführt, welche den in vivo-Zustand erkennen lassen, wobei diese Methoden zum Teil bereits für medizinische Routineuntersuchungen in der Praxis angewandt werden. Typische Untersuchungsmethoden, die als hochempfindliche Untersu- . chungssysteme oder Analysensysteme bekannt sind, schließen den Radioimmuoassay (RIA), den Latexagglutinationsassay mit turbidimetrischer Messung im nahen Infrarotbereich (LPIA), den Enzymimmunoassay (EIA), den Fluoroimmunoassay und die Nephelometrie, die die Lichtstreuung anwendet, ein. Bislang wurden viele immunologische Reaktionen in der Weise durchgeführt, daß in Proben vorhandene Antigene oder Antikörper mit einem Reagens nachgewiesen werden, welches neben der flüssigen Phase eine Trägermatrix, wie biologische Träger, beispielsweise Erythrozyten oder Bakterien und Latexteilchen eines synthetischen organischen Polymerträgers, die mit einem geeig-
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neten Antikörper oder Antigen sensibilisiert werden können, enthalten.
Immunologische Reaktionen sind äußerst spezifisch, indem die Reaktionen strikt und selektiv ablaufen, was eines ihrer herausragenden Merkmale ist, und stellen daher wichtige medizinische Untersuchungsmethoden dar.
Andererseits besitzen Körperflüssigkeiten, die die Aktivität von in vivo-Bedingungen widerspiegeln, eine große Vielfalt in ihrer Zusammensetzung und in ihren physikalischen Eigenschaften. Aus diesem,Grund konnten viele immunologische Reaktionen nicht vollständig von nichtspezifischen Reaktionen befreit werden, von denen gesagt werden kann, daß sie von der Antigen-Antikörper-Reaktion unabhängige Nebenreaktionen darstellen. Als Gegenmaßnahme gegen solche nichtspezifischen Reaktionen werden in vielen Fällen Maßnahmen, wie die Zugabe von Kaolin oder eines ähnlichen Adsorbens oder eine Extraktion angewandt, um die relevanten nichtspezifischen Faktoren zu entfernen oder zu neutralisieren. Wenngleich manche dieser Maßnahmen wirksam sind, ist es erforderlich, bezüglich jeder Antigen-Antikörper-Reaktion eine detaillierte Untersuchung durchzuführen und darüber hinaus bereiten sie in ihrer praktisehen Anwendung viele Schwierigkeiten.
Ziel der Erfindung:
Bei Anwendung des Verfahrens und des Reagens der vorliegenden Erfindung wird es im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden möglich, die Gewinnung der nachzuweisenden Substanz zu verbessern .und die Genauigkeit der Untersuchung zu steigern.
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— ο ""
Darlegung des Wesens der Erfindung:
Die dem Anmeldungsgegenstand zugrunde liegende Aufgabe besteht somit darin, ein Verfahren und ein Reagens zur Untersuchung bzw. zur Bestimmung von Antigen-Antikörper-Reaktionen anzugeben, mit denen es gelingt, die Nachteile der herkömmlichen Methoden zur Untersuchung von Antigen-Antikörper-Reaktionen zu überwinden, deren praktische Anwendung zu vereinfachen und ihre Genauigkeit zu verbessern.
Diese Aufgabe wird nun gelöst durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung oder Bestimmung oder zur Analyse von Antigen-Antikörper-Reaktionen, bei dem das zu bestimmende Antigen oder der zu bestimmende Antikörper in einer Reaktionsmischung mit dem entsprechenden Antikörper bzw. Antigen umgesetzt wird und das dadurch gekennzeichnet ist, daß die das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper enthaltende Probe mit einem in dem Reaktionsmedium löslichen Polyanion behandelt wird und die behandelte Probe zur Durchführung der Reaktion verwendet wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein für die Durchführung dieses Verfahrens, d. h. zur Untersuchung von Antigen-Antikörper-Reaktionen geeignetes Reagens, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein Polyanion und ein Reaktionsmedium enthält.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man als PoIyanionen Substanzen verwenden, wie natürliche oder synthetische Polymere, wie Polysaccharide oder Polystyrol, die eine Vielzahl von Anionen, wie Sulfonylanionen oder Carbojxylanionen tragen und welche Materialien in dem für die Äntigen-Antikörper-Reaktion verwendeten Reaktionsmedium ilöslicli sind.
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Spezifische Beispiele für diese Polyanionen sind Dextransulfat, Heparin, Polystyrolsulfonsäure, Cellulosephthalatacetat, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat und dergleichen
5
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper enthaltende Probe mit dem Polyanion behandelt und dann mit dem entsprechenden Antikörper bzw. Antigen in dem Reaktionsmedium der Antigeh-Antikörper-Reaktion unterworfen.
Die Behandlung mit dem Polyanion kann in der Weise durchgeführt werden, daß man (i) die Antigen-Antikörper-Reaktion in dem Medium durchführt, in das das Polyanion eingebracht worden ist, oder (ii) die Probe vor der Durchführung der Antigen-Antikörper-Reaktion mit einer das Polyanion enthaltenden festen oder flüssigen Phase behandelt, (wobei in letzterem Fall die in dieser Weise behandelte antigen- oder antikörperhaltige Probe der Antigen-Antikörper-Reaktion unterworfen werden kann, nachdem man das Polyanion entfernt hat, wenngleich sie normalerweise in Gegenwart des Polyanions der Reaktion unterworfen wird).
Die für die Antigen-Antikörper-Reaktion geeigneten Reaktionsmedien sind wäßrige Medien, wie beispielsweise Wasser, Salzlösungen und Pufferlösungen, die einen oder mehrere Hilfsstoffe, wie Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Chelatbildner, oberflächenaktive Mittel etc. enthal-
30 ten können.
Als Pufferlösung kann man Glycinpuffer, Phosphorsäurepuffer, Zitronensäurepuffer, Barbitursäurepuffer, Boratpuffer, Tris/TrisihydroxymethylJ-aminomethany-Chlorwasserstoffsäure-Puffer, Tris-Malatpuffer, Ammoniakpuffer und
23 9 A 78 1 dergleichen verwenden.
AIs Stabilisatoren kann man beispielsweise Aminosäuren, Polypeptide, Proteine und dergleichen, die an der betreffenden immunologischen Reaktion nicht teilnehmen, verwenden, wobei diese Materialien üblicherweise in Konzentrationen von 0,001 bis 1 % und vorzugsweise von 0,05 bis 0,6 % vorhanden sind.
Bevorzugte Beispiele für Konservierungsmittel sind Natriumazid und Merthiolate.
Bevorzugte Beispiele für Chelatbildner umfassen Äthylendiamintetraessigsäure, Nitrilotriessigsäure, Cyclohexandiamintetraessigsäure und dergleichen.
Als oberflächenaktive Mittel sind im allgemeinen nichtionische oberflächenaktive Mittel bevorzugt.
Der pH-Wert des Reaktionsmediums sollte in dem üblichen pH-Bereich liegen, der für Antigen-Antikörper-Reaktionen geeignet ist, so daß im allgemeinen ein pH-Wert von etwa 5 bis 10 angewandt wird.
Die Konzentration des Polyanions in dem Reaktionsmedium ist im allgemeinen nicht größer als 5 Gew.-% und liegt vorzugsweise im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew.-%. Bei höheren Konzentrationen kann die Reaktion im Fall bestimmter Untersuchungssysteme instabil werden, während bei einer niedrigeren Konzentration die inhibierende Wirkung gegen die sogenannten nichtspezifischen Reaktionen,
die die Untersuchungsmethode stören und es unmöglich ma chen, genaue Analysenwerte zu erzielen, vermindert wird als Folge eines erhöhten inhibierenden Effekts von Faktoren in der Serumprobe, die von denen verschieden sind,
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die bei der Reaktion mit dem entsprechenden Antigen be nötigt worden, was eine verminderte Genauigkeit der Unter suchung smethode zur Folge hätte.
Die als zu bestimmende Substanz und als Reaktionsteilnehmer zu verwendenden Antigene schließen verschiedene Materialien ein, beispielsweise Proteine, Polypeptide, Steroide, Polysaccharide, Lipide, Pollen, Staub und Haptene. Die Antikörper umfassen beispielsweise jene Proteine, die Antikörper für die oben angesprochenen Antigene darstellen.
Die Untersuchung von Antigen-Antikörper-Reaktionen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann nach irgendwelchen an sich bekannten Untersuchungssystemen erfolgen. Somit kann das Verfahren entweder auf die sogenannten Lösungssysteme angewandt werden, bei denen sowohl die zu bestimmende Substanz als auch das Reagens in dem Reaktionsmedium löslich sind oder kann auch in sogenannten Trägersystemen durchgeführt werden, bei denen der Reaktionsteilnehmer auf einem teilchenförmigen Träger vorliegt, welcher im wesentlichen in dem Reaktionsmedium unlöslich ist, was bedeutet, daß der teilchenförmige Träger mit dem Reaktionsteilnehmer sensibilisiert ist. Spezifische Beispiele für Antigen-Antigenkörper-Reaktionen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden können, schließen jene Reaktionen ein, die in dem Radioimmunoassay, bei der Latexagglutination unter Anwendung der Turbidimetrie (oder Trübungsmeßtechnik) im nahen Infrarotbereich, dem Enzymimmunoassay, dem Fluoroimmunoassay, der Immunonephelometrie unter Anwendung der Lichtstreuung, der Erythrozytenagglutination, der Latexagglutination und dergleichen auftreten. Vorzugsweise wendet man das erfindungsgemäße Verfahren auf ein Untersuchungssystem, wie die Latexagglutination mit einer turbidimetrischen Bestimmung im
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nahen Infrarotbereich an, bei dem beispielsweise eine umgekehrte passive Agglutination ausgenützt werden kann.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können nichtspezifische Reaktionen, die bei Antigen-Antikörper-Reaktionen ablaufen können, verhindert werden, so daß genauere Untersuchungsergebnisse erhalten werden können.
Ausführungsbeispiele; 10
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne diese jedoch einzuschränken.
Die angegebenen Prozentsätze sind dabei auf das Gewicht bezogen.
Beispiel 1
Dieses Beispiel verdeutlicht die Latexagglutination unter Anwendung einer turbidimetrischen Messung im nahen Infrarotbereich.
Zu 50 μΐ normalen Humanserums, welches nicht mehr als 2 ng/ ml (X.-Fetoprotein (AFP) enthält, gibt man zur Bildung der Testlösung 50 μΐ einer 1 μg/ml AFP enthaltenden Lösung und dann 100 μΐ einer Rinderserumalbumin-Salzlösung, welche Dextransulfat enthält. Zu 50 μΐ der Testlösung gibt man 50 μΐ eines mit Anti-AFP-Antikörpern sensibilisierten Latexreagens und 200 μΐ einer Pufferlösung und mißt die Änderung der Trübung im nahen Infrarotbereich bei 94 0 nm unter Rühren. Der gemessene Wert der Probe wird auf einer Eichkurve abgelesen und es wird der Erfassungsprozentsatz berechnet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I im Vergleich zu einem polyanionenfreien Kontroll-Reaktionssystem angegeben.
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Wie aus der Tabelle I zu erkennen ist, wird durch die Zugabe von Dextransulfat (bei einer Endkonzentration von 0,1 %) eine signifikante Verbesserung des Erfassungsprozentsatzes (P <0,01) erreicht, wobei auch eine deutliehe Verbesserung des Varianzkoeffizienten (CV) erreicht wird. Dabei entspricht der Erfassungsprozentsatz dem relativen Wert der Erfassung bezogen auf normalem gepooltem Serum von zehn klaren, trübungsfreien Proben, deren Wert als 100 angesetzt wird
10
Beispiel 2
Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 1 mit dem Unterschied, daß man als Polyanion Polystyrolsulfonsäure mit einer Endkonzentration von 0,2 % verwendet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle I angegeben, aus der zu erkennen ist, daß eine deutliche Verbesserung des Varianzkoeffizienten erreicht wird.
20Beispiel3
Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 1 mit dem Unterschied, daß man als Polyanion Heparin in einer Endkonzentration von 0,1 % anwendet. Wie in der Tabelle I angegeben ist, ist auch hier eine Verbesserung der Erfassung festzustellen.
Beispiel 4
Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 1 mit dem Unterschied, daß als Polyanion Cellulosephthalatacetat in einer Endkonzentration von 0,1 % angewandt wird. Wie aus der Tabelle I hervorgeht, wird eine Verbesserung der Erfassung erreicht.
TABELLE I
m- >atz Ir. Prol Hämo- lysis De Trü bung Kontrolle Kein PoIy- anion Eri Beispiel Dextran- sulfat ,4 :as 1 sungprozentsat Beispiel 2 Polystyrol sulf onsäure ,9 ζ (%) Beispiel 3 Heparin 2 Beispiel 4 Cellulose- phthalatacetat 3
1 ++ + 93,7 101 ,8 93 ,2 96, 9 98, 9
2 - + + + 86,8 88 ,8 88 ,2· 88, 2 88, 9
3 - + + + 83,8 105 ,5 80 ,0 87, 2 82, 2
4 + + ++ + 88,0 96 ,6 ! 90 ,3 92, 3 93, 2
5 - ++ + 76,7 86 ,1 ,2 82, 8 85, 2
6 - + 84,6 98 ,3 ,4 87, 5 91, 5
7 - + 90,7 103 ,0 80 ,8 93, 9 98, 7
8 - + „ — 85,9 103 ,2 85 ,0 85, 4 91, 7
9 + 72,9 96 ,6 93 82, 8 91, 7
O -' + 100,6 100 ,4 ,9 99, 2 101 , 2
1 - + 105,1 100 ,0 ,3 100, 0 111, 4
2 + + + 92,7 101 ,1 86 ,8 102, 0 98, 2
3 + + 96,5 99 ,5 85 ,2 100, 0 101 , 2
4 + + 92,4 97 ,2 100 ,5 99, 0 101 , 5
5 j - + 100,0 100 ,1 89 ,4 102, 0 101 , 4
6 + + 79,6 93 ,1 94 ,5 85, 4 88, 9
7 - - 95,6 100 ,2 i 97 ,5 99, 5 100, 5
8 + - 81,1 93 95 85, 93,
97
80
95
87
TABELLE I (Fortsetzung)
to-. satz ir. Pro Hämo- lysis be Trü bung E r Kontrolle Kein PoIy- anion E a s s u η Beispiel 1 Dextransul- fat g s ρ r ο ζ e Beispiel 2 Polystyrol- sulfonsäure η t s a t ζ Beispiel 3 Heparin ( % ) Beispiel 4 Cellulose- phthalatacetat
19 20 + + + - 82,6 92,0 85,5 105,1 83,7 97,2 87,0 102,0 86,0 98,0
)urchschnittswert itandardabweichung CV (%) 89,07 ± 8,39 9,42 97,78 +_ 5,76 5,89 90,1 _+ 6,33 7,02 92,92 J1 7,21 7,76 95,18 + 7,07 7,43
239478 1
Beispiel
- 11 -
Dieses Beispiel verdeutlicht den Effekt der Zugabe von Dextransulfat auf die Erythrozyten-Agglutination, die bei manchen Proben von einer Pseudo-Reaktion begleitet werden kann, die zu falschen Analysenwerten führt.
Man verdünnt eine AFP enthaltende Probe mit einer Lösung von Dextransulfat in einem'Phosphatpuffer (pH =6,4), die so eingestellt ist, daß die Endkonzentration des Dextransulf ats 0,001 % beträgt um den Faktor 20 und gibt 100 μΐ der verdünnten Probe zu einer Suspension von Schaf-Erythrozyten, die mit Anti-AFP-Antikörpern sensibilisiert worden sind. Man läßt die Mischung während 2 Stunden stehen. Die Proben, die nicht mehr als 50 ng/ml AFP enthalten, zeigen eine ringförmige Agglutination, während jene Proben, die nicht weniger als 100 ng/ml AFP enthalten, entweder eine offensichtlich größere ringförmige oder matte Agglutination zeigen. Wenn man die gleiche Untersuchung mit Proben bekannter Konzentration wiederholt, so treten selbst im Fall von stark trüben Proben, die die Bewertung erleichtern, weniger Pseudo-Reaktionen auf.

Claims (8)

  1. Erfindungsanspruch:
    1. Verfahren zur Untersuchung von Antigen-Antikörper-Reaktionen, bei dem das zu bestimmende Antigen oder der zu bestimmende Antikörper in einer Reaktionsmischung mit dem entsprechenden Antikörper bzw. Antigen umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper enthaltende Probe mit einem in dem Reaktionsmedium löslichen Polyänion behandelt wird und die behandelte Probe zur Durchführung der Reaktion verwendet wird.s
  2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Reaktion in Gegenwart
    15 des Polyanions durchgeführt wird.
  3. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß als Polyänion Dextransulfat verwendet wird.
  4. 4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Antigen-Antikörper-Reaktion eine Agglutinationsreaktion ist.
  5. 5. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet , daß die Agglutinationsreaktion eine umgekehrte passive Agglutinationsreaktion ist.
  6. 6. Reagens zur Untersuchung von Antigen-Antikörper-Reaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polyänion und ein Reaktionsmedium für die Antigen-Antikörper-Reaktion enthält.
  7. 7. Reagens nach Punkt 6, dadurch g e -
    kennzeichnet, daß es als Reaktionsmedium ein
    239478 1
    wäßriges Medium enthält.
    - 13 -
  8. 8. Reagens nach Punkt 6, dadurch gekenn zeichnet , daß es als Reaktionsmedium eine Pufferlösung enthält.
DD82239478A 1981-05-02 1982-04-30 Verfahren und reagens zur untersuchung von antigen-antikoerper-reaktionen DD202178A5 (de)

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