DE1943881B2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Thrombinaktivität in Blutplasma und dessen Fraktionen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Thrombinaktivität in Blutplasma und Fraktionen desselben, durch Umsetzung von ungeronnenem Fibrinogen mit einer unbekannten Probe von Thrombin enthaltendem Blutplasma, oder einer Fraktion desselben für eine vorherbestimmte Dauer.

Die Blutgerinnung ist von entscheidender biologischer Bedeutung. Sie erfordert einen komplexen Mechanismus und hängt ab von der Anwesenheit und Aktivität einer Anzahl von Plasmaproteinen. Von diesen Proteinen sind Fibrinogen und Thrombin besonders wichtig, da ein wesentliches Merkmal des Gerinnungssystems die Umwandlung einer Fibrinogenlösung in ein festes, unlösliches Fibringerinsel ist; diese Umwandlung erfolgt normalerweise durch die gegenseitige Wirkung von Fibrinogen und Thrombin.

Bekannte Verfahren zur Bestimmung der Thrombinaktivität verwenden gewöhnlich eine Reaktion im sogenannten »Naß-System«, wie es z. B. von Jorpes et al, J. Pharm. and Pharmacol., Bd. 10, Seite 561-73 (1958) beschrieben ist.

Bei diesen bekannten Verfahren muß für jeden

Versuch zur Bestimmung der Thrombinaktivität jeweils eine frische Lösung von Fibrinogen bekannter Konzentration hergestellt werden. Diese Verfahren sind daher zeitraubend und für z. B. Krankenhäuser, Laboratorien usw., die ständig Thrombinaktivitätsbestimmungen durchführen müssen, unbefriedigend.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher ein vereinfachtes Verfahren zu schaffen, bei dem die jeweilige Hersteilung der frischen Fibrinogenlösungen überflüssig wird und welches den Krankenhäusern, Laboratorien usw. eine rasche und einfache Durchführung der Thrombinaktivitätsbestimmungen eimöglicht.

Diese Aufgabe wird ausgehend von einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß man die Umsetzung in einem stabilen Gelmedium durchführt und den Durchmesser der dabei gebildeten undurchsichtigen radialen Diffusionszone des Reaktionsproduktes mißt und mit Kontrollproben bekannter Thrombinaktivität vergleicht.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß die das ungeronnene Fibrinogen enthaltenden Gelplatten mit einer Schutzmembran bedeckt und verpackt werden und so in zweckmäßiger Weise für die anschließende sofortige Verwendung bei der Bestimmung der Thrombinaktivität durch Krankenhäuser, Laboratorien usw. verfügbar gemacht werden können, wo eine vereinfachte, doch genaue Bestimmung der Thrombinaktivität in Blutplasmaproben durchgeführt werden kann, ohne vorher die Fibrinogenlösungen selbst herstellen zu müssen.

Erfindungsgemäß wird als Reaktionsmedium für das Gerinnungssystem zwecks Bestimmung der Thrombinaktivität ein stabiles Gel gebildet. Ungeronnenes Fibrinogen wird homogen im Gel suspendiert und mit einer unbekannten Probe von Blutplasma oder einer Fraktion desselben, die Thrombin enthält, für eine vorherbestimmte Zeit reagieren gelassen, wodurch man an der Zwischenfläche zwischen der unbekannten Probe und dem Gel eine undurchsichtige radiale Diffusionszone des Reaktionsproduktes erhält. Der Durchmesser der radialen Diffusionszone ist direkt proportional zum Logarithmus der Thrombinaktivität in der getesteten Probe. Die Thrombinaktivität einer unbekannten Probe wird bestimmt durch den Vergleich mit Kontrollproben einer bekannten Thrombinaktivität.

Die hier zur Definition eines Gels verwendete Bezeichnung »stabil« bedeutet, daß das Gel inert oder mit der im Gel suspendierten Fibrinogenkomponente chemisch nicht-reaktionsfähig ist.

Bei der Herstellung des Gelmediums werden etwa 1,0 bis 10,0 Gew.-% eines Gelierungsmittels in einem erhitzten Puffersystem gelöst und dann mit einer vorherbestimmten Menge ungeronnenem Fibrinogen gemischt. Gewöhnlich werden etwa 10 mg% bis etwa 2 g%, vorzugsweise etwa 130 mg%, Fibrinogen im erhitzten Puffersystem verwendet. Diese Mischung wird in heißem Zustand in einen flachen Aufnahme-

_b0 behälter mit niedrigem Rand (im folgenden als »Platte« bezeichnet) in einer Menge eingegossen, die etwa der Größe des Behälters entspricht. Die Mischung wird gelieren gelassen und dann werden zylindrische Löcher von etwa 1 bis 10 mm Durchmesser in das Gel gestanzt oder anderweitig gebildet.

Dann werden in die offenen Löcher im Gel bekannte bzw. unbekannte Proben aus Thrombin enthaltendem Blutplasma oder einer Fraktion desselben

durch Verwendung einer Kapillarpipette oder ähnlichen Vorrichtung zugegeben, und die Platte wird eine vorherbestimmte Zeit bei etwa 20 bis 60° C, vorzugsweise etwa 37° C bebrütet. Während dieser Inkubation erfolgt eine Gerinnungsreaktion, wenn das Material in den Löchern nach außen in das Gelmedium diffundiert und eine undurchsichtige radiale Diffusionszone des Reaktionsproduktes bildet.

Nach der Inkubationszeit wird das Gel visuell, vorzugsweise mit einem beleuchteten Vergrößerungsglas mit einer Skala zum Messen des Durchmessers der radialen Diffusionszone, untersucht. Durch Vergleich des Durchmessers der während der Inkubationszeit durch die Gerinnungsreaktion im Gel in bekannten und unbekannten Proben gebildeten undurchsichtigen radialen Diffusionszone kann die Thrombinaktivität in der unbekannten Probe leicht bestimmt werden.

Bei der Herstellung des Gelmediums kann jedes übliche Gelierungsmittel verwendet werden, wie z. B. Gelantine, Pektin, Kieselsäuregel, Stärke, Polysaccharide von Seegras, wie Agar, Algin und Carrageen, synthetische polymere Gelierungsmittel, wie z. B. die vernetzten Polyacrylamide der US-Patentschrift 3046201 und ähnliche Materialien. Das Gelierungsmittel hat vorzugsweise die physikalischen Eigenschaften von Agar-Agar, indem es in Wasser leicht dispergierbar ist und ein praktisch klares Hydrogel ausreichender Härte bilden kann, so daß der Behälter oder die Platte, die das Gel enthält, ohne die Gefahr eines Herausfallens des Gels umgedreht werden kann.

Das erfindungsgemäß bevorzugte Gelierungsmittel ist eine gereinigte Agarose. Agarose ist das neutrale Galactosepolymerisat, das durch übliches Verfahren von der Agaropectinfraktion von Agar abgetrennt worden ist (vgl. z. B. die US-Patentschriften 3281409, 3335127 und 3362884). Das Gelierungsmittel wird vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 2,5 Gew.-% des Gelmediums verwendet.

Das im allgemeinen im Gel verwendete Puffersystem hat einen pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5, vorzugsweise etwa 7,3. Ein bevorzugtes Puffersystem umfaßt 0,154 Mol Natriumchlorid, 0,04 Mol Imidazol und 0,02 Mol Äthylendiamintetraacetat. Andere geeignete Puffer sind z. B. Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Phosphat- und Barbitalpuffer.

Die das ungeronnene Fibrinogen enthaltende Gelplatte kann mit einer Schutzmembran bedeckt, durch verschiedene Verfahren verpackt und so in zweckmäßiger Weise für die anschließende Verwendung bei der Bestimmung von Thrombinaktivität durch Krankenhäuser, Laboratorien usw. verfügbar gemacht werden, wo eine vereinfachte, doch genaue Bestimmung der Thrombinaktivität in Blutplasmaproben gefordert wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung. Falls nicht anders angegeben, sind alle Teile und Prozentabgaben Gew.-Teile und Gew.-%.

Beispiel

Wie folgt wurde eine Agarosegelplatte hergestellt: Herstellung der Reagenzien:

A) Agarosegelplatten-Puffer - 0,154 Mol Natriumchlorid, 0,04 Mol Imidazol und 0,02 Mol Äthylendiamintetraacetat; pH-Wert = 7,3;

B) zitratisierte Glyinsalzlösung - 0,123 Mol Natriumchlorid, 0,020 Mol Natriumeitrat und 0,1 Mol Glycin.

Verfahren

Wie folgt wurde eine hochgradig gereinigte Fibrinogenlösung hergestellt:

Kombiniertes menschliches Blutplasma wurde eingefroren und dann langsam auf 4° C aufgetaut. Der Cryoniederschlag wurde abzentrifugiert und in ' Z₁₀ des ursprünglichen Plasmavolumens an Glycincitratsalzlösung gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1, ON-Essigsäure auf 6,50 eingestellt. Zur obigen Lösung wurden dann langsam 3,5 g% Polyäthylenglykol 4000 (Molekulargewicht etwa 4000) zugegeben und die Ausfällung durch 15 Minuten langes Rühren bei Zimmertemperatur bewirkt. Der erhaltene Nieder-

schlag wurde abzentrifugiert und in V₁₀ des ursprünglichen Plasmavolumens der Glyincitratsalzlösung gelöst. Dann wurde der pH-Wert der Lösung mit 1,0 N-Natriumhydroxyd auf 6,88 eingestellt und die Lösung auf 9° C abgekühlt. Zur Lösung wurde langsam Glycin auf eine endgültige Glycinkonzentration von 1,8MoI zugegeben; die Ausfällung erfolgte durch 45 Minuten langes Rühren bei 5 ° C. Der erhaltene Niederschlag wurde abzentrifugiert und zur Bildung einer Konzentration von etwa 2,5 g% Fibrinogen in normaler physiologischer Salzlösung gelöst. Dann wurde die Fibrinogenlösung 3 mal mit 5 g% Darco G-60 Tierkohle behandelt. Jede Adsorption erfolgt über 30 Minuten bei Zimmertemperatur, wobei die feste Tierkohle nach jedem Verfahren durch Zentrif ugieren entfernt wurde. Die endgültige Lösung wurde durch entsprechende Verdünnung mit normaler physiologischer Salzlösung auf 260 mg% Fibrinogen eingestellt. Dann wurde die Lösung in gefrorenem Zustand gelagert.

Wie folgt wurde eine Agaroselösung hergestellt: 2,5 g% Agarose wurden vollständig im oben beschriebenen Agarosegelplatten-Puffer gelöst.

Dann wurde, wie folgt, eine nicht-geronnenes Fibrinogen enthaltende Agarosegelplatte hergestellt:

AO Die oben hergestellte Agaroselösung wurde auf 53 bis56° C gebracht,und 1 Volumen der Lösung wurde homogen mit 1 Volumen der oben beschriebenen, hochgradig gereinigten, auf Zimmertemperatur gebrachten Fibrinogenlösung gemischt. Dann wurde die Mischung in eine Platte von etwa 7,5 cm X 2,5 cm X 6 mm Tiefe gegossen und sich verfestigen gelassen. Anschließend wurden 6 Löcher mit jeweils einem Durchmesser von 2 mm in gleichem Abstand voneinander in das Gel der ungeronnenen Platte gestanzt. Dann wurde die Platte mit einer Schutzmembran abgedeckt, verpackt und bei 2 bis 8° C gelagert.

Die das ungeronnene Fibrinogen enthaltende Agarosegelplatte wurde mit Plasma oder entsprechenden Plasmaformulierungen zur Durchführung der quantitativen Thrombinbestimmung wie folgt verwendet:

Es wurde eine Standard-Thrombinkontrollprobe in drei Konzentration hergestellt; die erste enthielt 1 N.I.H. (National Institutes of Health) Einheit pro ecm, die zweite 0,5 N.I.H. Einheit/ccm und die dritte 0,2 N.I.H. Einheit/ccm. Ein Aliquot von jeder Konzentration wurde in ein getrenntes Loch in der Agaroseplatte gegeben. Dann wurde die unbekannte, zu bestimmtende Plasmaprobe in 3 Konzentrationen von 100, 50 bzw. 20 Vol.-% Plasma in der unbekannten Probe hergestellt. Ein Aliquot von jeder Konzentration wurde in ein getrenntes Loch der Agarosegel-

platte gegeben. Dann wurde die Platte, vorcugsweise in einer Feuchtigkeitskammer, bei 37° C etwa 2,5 Stunden oder bis zum Erscheinen undurchsichtiger Reaktionszonen für alle Kontrollprobenkonzentrationen bebrütet. Der Durchmesser jeder Reaktionszone wurde unter einem Hyland »Immuno-Plate« Mikroskop oder einem Präpariermikroskop mit Stufenmikrometer oder Fadennetz gemessen. Es wurde der Logarithmus der Kontrollprobenlconzentrationen gegen den Durchmesser der Reaktionszonen der entsprechenden Kontrollproben aufgetragen. Dann wurde die Thrombinaktivität der unbekannten Probe durch Bezug auf die durch die Kontrollproben gebildete Kurve bestimmt.

Claims (7)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Thrombinaktivität in Blutplasma und Fraktionen desselben, durch Umsetzung von ungeronnenem Fibrinogen mit einer unbekannten Probe von Thrombin enthaltendem Blutplasma oder einer Fraktion desselben für eine vorherbestimmte Dauer, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem stabilen Gelmedium durchführt und den Durchmesser der dabei gebildeten undurchsichtigen radialen Diffusionszone des Reaktionsproduktes mißt und mit Kontrollproben bekannter Thrombinaktivität vergleicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gelmedium etwa 1,0-10 Gew.-% eines Gelierungsmittels enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gelierungsmittel Agarose ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gelmedium 2,5 Gew.-% Agarose enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das ungeronnene Fibrinogen mit dem Gelmedium vermischt und die Thrombin enthaltende Probe in durch die Geloberfläche gestanzte Löcher eingebracht wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gelmedium etwa 10 mg% bis etwa 2 g% Fibrinogen enthält.

7. Gelplatte zur quantitativen Bestimmung der Thrombinaktivität in Blutplasma oder Fraktionen desselben, bestehend aus ungeronnenes Fibrinogen enthaltendem Agarosegelmedium.