DE4446698C2

DE4446698C2 - Mikrotiterplatte mit einem Mittel zur Anzeige des Befüllungszustandes, Herstellung einer Mikrotiterplatte und Verwendung eines pH-Indikators

Info

Publication number: DE4446698C2
Application number: DE19944446698
Authority: DE
Inventors: Klaus-Dieter Dr Nothacker
Original assignee: Medac Gesellschaft fuer Klinische Spezialpraeparate mbH
Current assignee: Medac Gesellschaft fuer Klinische Spezialpraeparate mbH
Priority date: 1994-12-14
Filing date: 1994-12-14
Publication date: 1998-07-23
Anticipated expiration: 2014-12-15
Also published as: DE4446698A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Mikrotiterplatte zur Aufnahme von zu analysierenden Flüssigkeiten mit einem Mittel zur Anzeige des Befüllungszustandes. Die Erfindung betrifft ferner die Her stellung einer Mikrotiterplatte sowie die Verwendung eines pH-In dikators.

Bei der Durchführung von Flüssigkeitsanalysen werden je nach eingesetztem Analysenverfahren unterschiedliche Analysengefäße verwendet. Bei immunologischen Tests werden zum Beispiel Mikrotiterplatten mit festphasengebundener immunreaktiver Komponente verwendet. Bei Mikrotiterplatten handelt es sich in der Regel um Kunststoffplatten mit einer Vielzahl von Ver tiefungen oder Näpfen. Gängige Mikrotiterplatten haben zum Beispiel insgesamt 96 Vertiefungen mit einem Fassungsvermögen von jeweils 300 bis 400 µl. Sie werden insbesondere für die ver schiedensten mikrobiologischen und immunologischen Arbeitsgänge, wie zum Beispiel ELISA, eingesetzt. Mit immunreaktiver Komponente beschichtete Mikrotiterplatten sind z. B. aus der DE 42 29 904 C1 bekannt.

Der ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) wird heutzutage in großem Umfang zur Bestimmung verschiedenster Analyte in Körper flüssigkeiten, wie zum Beispiel Blutserum, Liquor, Urin, Speichel und Sekreten, verwendet. Als zu analysierende Materialien kommen jedoch auch solche. nicht-humanen oder nicht-animalen Ursprungs, wie Grundwasser, in Frage. Dieses läßt sich mittels ELISA zum Beispiel auf Pestizidrückstände untersuchen.

Allgemein ist es bei der Durchführung von Enzymimmunoassays wünschenswert, nicht-modifizierte Originalproben einzusetzen, da dadurch vor allem bei einer großen Anzahl an Untersuchungen eine sehr aufwendige Vorverdünnung entfallen kann. Weiter wird angestrebt, daß die Menge an erforderlichem Probenvolumen sehr klein ist, da damit häufig notwendige Wiederholungsmessungen und weitere erforderliche Untersuchungen überhaupt erst ermöglicht werden. So ist es z. B. bei Seren von Säuglingen wichtig, daß auch schon geringe Abnahmemengen für die Durchführung des Tests ausreichen.

Die Verwendung von kleinen Probenvolumina hat aber gerade bei ELISA-Tests mit einer Mikrotiterplatte als Analysengefäß den Nachteil, daß die zumeist farblosen oder transparenten Proben nach Einpipettierung in die Näpfe der Platte kaum noch zu erkennen sind. Demzufolge kann es auch sehr leicht zu Fehlpipet tierungen durch unterbliebene oder doppelte Probenzugabe kommen, was zu falsch-negativen bzw. falsch-positiven Ergebnissen führen wurde.

Aus der GB 2 177 508 A ist ein Testelement zur Untersuchung des pH-Wertes von Bodenproben bekannt. Die EP 251 471 A1 beschreibt ein nasogastrisches Intubationssystem, bei dem eine pH-empfindli che Beschichtung zur Bestimmung der Position des in den Patienten eingeführten Tubus dient. In der US 5,320,807 werden transparente Behälter beschrieben, die einen pH-Indikator zur Untersuchung von Kompostproben und damit Indizierung des Stadiums der Kompostie rung aufweisen. Die DE 35 06 365 A1 beschreibt einen Reagenz streifen, auf dem zur Bestimmung des pH-Wertes von Körper flüssigkeit ein pH-Indikator aufgebracht ist. Schließlich beschreibt die US 4,935,347 ebenfalls Mikrotiterplatten, die mit einer Beschichtung aus Antibiotika und einer filmbildenden Substanz, wie z. B. Gelatine, versehen sind.

Der Erfindung liegt demgemäß die Aufgabe zugrunde, eine Mikroti terplatte zur Aufnahme von zu analysierenden Flüssigkeiten und ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Mikrotiterplatte anzugeben, welche mit Mitteln zur Anzeige des Befüllungszustandes ausgestattet ist, die selbst bei kleinen Probenvolumina sicher anzeigen, ob sich bereits zu analysierende Flüssigkeit in der Mikrotiterplatte befindet. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines pH-Indikators als Mittel zur Anzeige des Befüllungszustandes einer Mikrotiterplatte.

Die angegebene Aufgabe wird durch eine Mikrotiterplatte mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 und durch ein Herstellungsver fahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 4 gelöst. Weiterbil dungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Die erfindungsgemäße Mikrotiterplatte zur Aufnahme von zu analysierenden Flüssigkeiten ist mit immunreaktiver Komponente beschichtet, wobei als Mittel zur Anzeige des Befüllungszustandes ein pH-Indikator auf zumindest Teilen ihrer Oberflächen, welche mit den Flüssigkeiten in Kontakt kommen, aufgebracht ist und wobei der pH-Indikator in Kombination mit einem Zucker und/oder Zuckeralkohol als Matrixsubstanz vorhanden ist, welche an den Oberflächen der Mikrotiterplatte haftet.

Bevorzugte pH-Indikatoren sind solche, die bei dem pH-Wert der zu analysierenden Flüssigkeiten farbig sind und insbesondere solche, die im pH-Bereich von 6,5 bis 7,5 farbig sind. Besonders bevorzugte pH-Indikatoren sind Bromkresolpurpur, Bromphenolrot, Kresolrot, p-Nitrophenol, Phenolrot und/oder Neutralrot.

Zur Gewährleistung der Haftung des pH-Indikators auf den Ober flächen des Analysengefäßes wird der pH-Indikator in Kombination mit einem Zucker und/oder einem Zuckeralkohol als einer an den Oberflächen haftenden Matrixsubstanz eingesetzt. Diese Matrixsub stanz ist so beschaffen, daß sie zumindest teilweise in den zu analysierenden Flüssigkeiten löslich ist. Eine bevorzugte Matrixsubstanz ist Sorbit. Die Zucker und Zuckeralkohole lösen sich leicht in Wasser und setzen daher bei Kontakt mit wäßrigen Flüssigkeiten den in sie eingebundenen pH-Indikator schnell frei. Der pH-Indikator zeigt dann durch Farbumschlag den pH-Wert der zu analysierenden Flüssigkeit und damit deren Gegenwart an.

Die erfindungsgemäße Mikrotiterplatte ist besonders dann von Vorteil, wenn es um die Analyse einer Vielzahl von kleinen Probenmengen, wie zum Beispiel bei immunologischen Reihenunter suchungen, geht.

Die Herstellung der Mikrotiterplatte erfolgt in der Weise, daß man

(a) die Oberflächen der Mikrotiterplatte, welche mit zu analy sierender Flüssigkeit in Kontakt kommen, zumindest teilweise mit einer Lösung behandelt, die den pH-Indikator und Zucker und/oder Zuckeralkohol als Matrixsubstanz enthält,
(b) die Lösung im wesentlichen entfernt und
(c) die Mikrotiterplatte trocknet.

Gegebenenfalls kann die Mikrotiterplatte vor Durchführung der Stufe (a) mit zum Beispiel Wasser oder Pufferlösung gewaschen werden.

Zur Durchführung der Stufe (a) wird vorzugsweise ein Volumen an Lösung in die Mikrotiterplatte eingebracht, welches größer als das Volumen der zu analysierenden Flüssigkeit ist. Die Behandlung der Mikrotiterplatte mit der Lösung erfolgt vorzugsweise während einer Dauer von 0,5 bis 16 Stunden. Der pH-Indikator wird in der Lösung in einer Menge von vorzugsweise 200 bis 5000 µg/ml, insbesondere 850 bis 2500 µg/ml, eingesetzt.

Danach wird die Lösung in Stufe (b) im wesentlichen entfernt, was vorzugsweise durch Absaugen der Lösung und Ausklopfen der Platte geschieht. Der verbleibende Rest an Lösung bildet nach Trocknung der Mikrotiterplatte in Stufe (c) eine Schicht des pH-Indikators auf den Oberflächen der Mikrotiterplatte. Diese Ausbildung einer Schicht verläuft besonders einfach, da die in Stufe (a) einge setzte Lösung neben dem pH-Indikator auch Zucker und/oder Zuckeralkohol, insbesondere Sorbit, als eine Matrixsubstanz enthält. Die Matrixsubstanz wird in der Lösung vorzugsweise in einer Menge von 16 bis 20 Gew.-% eingesetzt. Die vorzugsweise wäßrige Lösung hat insbesondere einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 9,5.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann dazu eingesetzt werden, bereits mit immunreaktiver Komponente beschichtete Mikrotiter platten mit Mitteln zur Anzeige des Befüllungszustandes in Form eines pH-Indikators auszustatten. Es hat sich auch herausge stellt, daß die Aufbringung des pH-Indikators gleichzeitig mit der Belegung der Mikrotiterplatte mit der immunreaktiven Komponente erfolgen kann. Dies geschieht in einfacher Weise derart, daß in Stufe (a) eine Lösung verwendet wird, die neben dem pH-Indikator auch die immunreaktive Komponente enthält. Auf diese Weise kann bei der Herstellung der fertigen, mit immunreak tiver Komponente beschichteten Mikrotiterplatten ein Verfahrens schritt eingespart werden.

Es ist bevorzugt, daß der eingesetzte pH-Indikator sowie der pH-Wert der Lösung in der Weise ausgewählt werden, daß einerseits die mit dem pH-Iridikator ausgestattete Mikrotiterplatte keine oder nur eine geringe Einfärbung durch den pH-Indikator erfährt, andererseits jedoch bei Zugabe der zu analysierenden Flüssigkeit eine deutliche Farbänderung des pH-Indikators durch den pH-Wert der Flüssigkeit erfolgt.

Bevorzugte Indikatoren für fast pH-neutrale Proben, wie zum Beispiel Seren, sind die pH-Indikatoren Bromphenolrot, Kresolrot oder Neutralrot und insbesondere Bromkresolpurpur. Diese werden vorzugsweise in einer Konzentration von 200 bis 5000 µg/ml Lösung, besonders bevorzugt 850 bis 2500 µg/ml Lösung, verwendet. Der pH-Wert der Lösung wird vorzugsweise mit niedrigmolaren Phosphatpuffer-Stammlösungen auf 5,8 bis 6,2, insbesondere ungefähr 6,0, eingestellt.

Wenn die in Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetz te Lösung zum Beispiel Bromkresolpurpur enthält und einen pH-Wert von 6,0 aufweist, so führt die intensive Gelb/Grünfärbung dieses pH-Indikators bei diesem pH-Wert zu einer leicht gelb/grünen Einfärbung nach Durchführung der weiteren Verfahrensschritte (b) und (c). Diese Einfärbung ist jedoch so schwach, daß im Falle von Mikrotiterplatten diese nach wie vor transparent erscheinen. Nach Einbringen einer Probeflüssigkeit mit einem pH-Wert von ca. 7,0 in die hergestellte Mikrotiterplatte nimmt der unter Auflösung der Matrixsubstanz freigesetzte pH-Indikator wieder seine für einen neutralen pH-Wert typische intensive Blaufärbung an. Diese Verfärbung indiziert in einfacher Weise, daß sich Probenflüssig keit in der Mikrotiterplatte befindet und dient damit als sicheres Mittel zur Anzeige des Befüllungszustandes.

Auf diese Weise können mittels der erfindungsgemäßen Mikrotiter platte die gerade bei Reihenuntersuchungen von kleinen Volumina farbloser Proben häufig vorkommenden Fehlpipettierungen in sicherer Weise ausgeschlossen werden. Damit ermöglicht die erfin dungsgemäße Mikrotiterplatte den Aufbau einer photometrisch kontrollierten In-Prozeß-Kontrolle der Probenzugabe. Sie dient demzufolge als wichtiger Beitrag zur Qualitätssicherung zum Beispiel bei Blutbanken und Laborpraxen.

Bei Mikrotiterplatten mit immunreaktiver Komponente hat es sich als besonderer Vorteil erwiesen, wenn Sorbit als Matrixsubstanz eingesetzt wird, da dieser Zuckeralkohol die Mikrotiterplatte zudem konserviert.

Nachstehend wird die Herstellung und Verwendung erfindungsgemäßer Mikrotiterplatten anhand von Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Es wird das nachträgliche Auftragen des pH-Indikators auf Mikrotiterplatten beschrieben, auf die zuvor bereits eine immunreaktive Komponente aufgebracht wurde.

Zuerst wurden Maxisorb-Flachboden-Mikrotiterplatten der Firma Nunc, Wiesbaden-Biebrich, Deutschland, mit 75 µl Immunglobulin M-Rheumafaktor in geeigneter Verdünnung beschichtet. Dann wurden die Platten zweimal mit jeweils 200 µl wäßriger Tris(hydrox ymethylaminomethan)-Pufferlösung (pH 7,0) gewaschen, welche 0,05 Vol.-% Tween® 20 enthielt. Dann wurden die Platten dreimal auf mehreren Lagen Zellstoff ausgeklopft und waren damit für das Aufbringen des pH-Indikators vorbereitet.

Dieses erfolgte durch Einpipettieren von 100 µl/Napf von einer wäßrigen Lösung, die die folgende Zusammensetzung hatte:

1 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 6,0)
18 Gew.-% Sorbit
850 µg/ml Bromkresolpurpur.

Diese Lösung hatte eine intensive gelb/grüne Farbe.

Die befüllten Mikrotiterplatten wurden anschließend 1 Stunde lang bei 2 bis 8°C inkubiert. Danach wurde die Indikatorlösung abgesaugt, die Platten wurden dreimal auf einigen Lagen Zellstoff ausgeklopft und im Trockenschrank 3 Stunden lang bei 37°C getrocknet. Es lagen damit Mikrotiterplatten vor, die ohne Vorwaschung im ELISA eingesetzt werden konnten. Durch Ein schweißung unter Vakuum in passende Aluminiumbeutel waren sie über einen längeren Zeitraum stabil.

Bei Durchführung eines ELISA-Tests mit diesen Mikrotiterplatten zur Bestimmung von Immunglobulin G-Antikörpern gegen das Cytomegalie-Virus (CMV) wurden mit 3 Kontrollseren die in der nachstehenden Tabelle aufgeführten Extinktions-Werte ermittelt. Trotz des Vorhandenseins des pH-Indikator unterschieden sich die Meßwerte der erfindungsgemäßen Platte mit pH-Indikator nicht signifikant von denen einer herkömmlichen Platte ohne pH-In dikator.

Tabelle I

Die in Mengen von jeweils 10 µl eingesetzten, farblosen Kontroll seren führten bei der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte stets zu einer deutlichen Blaufärbung.

Beispiel 2

Es wird die gleichzeitige Beschichtung einer Mikrotiterplatte mit der immunreaktiven Komponente und dem pH-Indikator beschrieben. Aufgrund dieser Verfahrensweise muß die Platte nur einmal mit Lösung inkubiert werden.

Es wurden Maxisorb-Rundboden-Mikrotiterplatten der Firma Nunc, Wiesbaden-Biebrich, Deutschland, mit 75 µl/Napf einer Lösung der folgenden Zusammensetzung befüllt:

5 mmol wäßriger Phosphatpuffer (pH-Wert 6,0)
18 Gew.-% Sorbit
Rheumafaktor-Präparation
20 µg/ml bovines Serumalbumin (BSA)
850 µg/ml Bromkresolpurpur.

Die befüllten Platten wurden 5 Tage lang bei 2 bis 8°C inkubiert und nach Absaugen der Lösung und Ausklopfen auf Zellstoff 3 Stunden lang bei 37°C im Trockenschrank getrocknet. Die Platten wurden für eine gute Langzeitstabilität in passende Aluminiumbeutel eingeschweißt.

Ein ELISA-Test der in Beispiel 1 beschriebenen Art mit 3 Kon trollseren ergab die in der nachstehenden Tabelle II aufgeführten Extinktionswerte. Zum Vergleich sind ebenfalls die mit einer herkömmlichen Platte ohne pH-Indikator erhaltenen Werte angege ben.

Tabelle II

Es zeigt sich, daß die bei gleichzeitiger Inkubation mit pH-In dikator und immunreaktiver Komponente hergestellten Platten nach wie vor eine sehr gute Differenzierung zwischen den 3 Kontrollseren gestatten, auch wenn sie nicht die gleiche Leistungsfähigkeit wie herkömmliche Platten ohne pH-Indikator oder die erfindungsgemäßen, nachträglich mit pH-Indikator beschichteten Platten gemäß Beispiel 1 haben.

In allen Fällen führte die Zugabe der Seren jedoch zu einer gut erkennbaren Blaufärbung des pH-Indikators.

Beispiel 3

Es wurden Flachboden-Mikrotiterplatten in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise hergestellt und getestet, wobei jedoch die Konzentration von Bromkresolpurpur von 850 auf 270 µg/ml reduziert wurde.

Die mit derart hergestellten Platten erhaltenen Extinktions-Werte sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Trotz weiterer Einbußen der Leistungsfähigkeit im ELISA gegenüber herkömmlichen Platten ergab die Probenzugabe in die einzelnen Näpfe auch bei der reduzierten Bromkresolpurpurkonzentration noch eine deutliche Blaufärbung.

Claims

1. Mikrotiterplatte zur Aufnahme von zu analysierenden Flüs sigkeiten, wobei

- die Mikrotiterplatte mit immunreaktiver Komponente be schichtet ist, wobei
- als Mittel zur Anzeige des Befüllungszustandes ein pH-In dikator auf zumindest Teilen ihrer Oberflächen, wel che mit den Flüssigkeiten in Kontakt kommen, aufge bracht ist und wobei
- der pH-Indikator in Kombination mit einem Zucker und/oder einem Zuckeralkohol als Matrixsubstanz vorhanden ist, welche an den Oberflächen der Mikrotiterplatte haftet.

2. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Indikator Bromkresolpurpur, Bromphenolrot, Kre solrot, p-Nitrophenol, Phenolrot und/oder Neutralrot ist.

3. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß der Zuckeralkohol Sorbit ist.

4. Verfahren zur Herstellung einer Mikrotiterplatte mit den Merkmalen eines der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß man

(a) die Oberflächen der Mikrotiterplatte, welche mit zu analysierender Flüssigkeit in Kontakt kommen, zumindest teilweise mit einer Lösung behandelt, die den pH-Indi kator und Zucker und/oder Zuckeralkohol als Matrixsub stanz enthält,
(b) die Lösung im wesentlichen entfernt und
(c) die Mikrotiterplatte trocknet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 5-9,5 ein setzt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung einsetzt, die 16 bis 20 Gew.-% Zucker und/oder Zuckeralkohol enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, daß man in Stufe (a) eine bereits mit immunreakti ver Komponente beschichtete Mikrotiterplatte einsetzt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, daß man in Stufe (a) eine Lösung verwendet, die die immunreaktive Komponente enthält.

9. Verwendung eines pH-Indikators als Mittel zur Anzeige des Befüllungszustandes einer mit immunreaktiver Komponente beschichteten Mikrotiterplatte, wobei der pH-Indikator in Kombination mit einem Zucker und/oder einem Zuckeralkohol als Matrixsubstanz auf zumindest Teilen der Oberflächen der Mikrotiterplatte aufgebracht wird, welche mit den zu analy sierenden Flüssigkeiten in Kontakt kommen.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei als pH-Indikator Bromkre solpurpur, Bromphenolrot, Kresolrot, p-Nitrophenol, Phenol rot und/oder Neutralrot eingesetzt wird.

11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei als Zuckeralkohol Sorbit eingesetzt wird.