극저온 전자 현미경

극저온 전자 현미경(Cryo-EM)은 극저온으로 냉각되고 유리수 환경에 내장되는 검체에 적용되는 극저온 전자 현미경 기법이다. 수용성 샘플 용액은 액체 에탄의 격자-메쉬 및 덤핑-얼음화 또는 액체 에탄과 프로판의 혼합물에 적용된다.^[2] 1970년대에 이 기술의 개발이 시작된 반면, 최근의 검출기 기술과 소프트웨어 알고리즘의 발전은 거의 원자 분해능에서 생체 분자 구조를 결정할 수 있게 했다.^[3] 이는 결정화 필요 없이 고분자 구조 결정을 위한 X선 결정학 또는 NMR 분광학 대안으로 접근 방식에 큰 관심을 끌었다.

2017년 노벨 화학상은 '용액 내 생체분자의 고해상도 구조 결정을 위한 극저온 전자 현미경 연구'^[4]를 개발한 공로로 자크 두보체트, 요아힘 프랭크, 리처드 헨더슨에게 수여됐다. 네이처 메서드는 2015년 크라이오-EM을 '올해의 방법'으로 선정하기도 했다.^[5]

전송전자 극저온도법

극저온전송전자현미경(cryo-TEM)은 구조생물학 및 재료과학에 사용되는 전송전자현미경기법이다.

• 샘플이 기울어질 때 이미징되는 특수 응용 프로그램인 극저온 전자단층촬영(Cryo-ET)
• 전자 결정학, TEM을 사용하여 고형분 원자의 배열을 결정하는 방법
• MicroED,^[6] 3D^[7][8][9] 결정체에서 전자 회절을 이용하여 단백질, 펩타이드, 유기 분자, 무기 화합물의 구조를 결정하는 방법
• 단일 입자 분석 크라이오-EM, 단일 입자 샘플에서^[10] 단백질 구조를 결정하는 평균 방법

• 

  50000배 배율의 비정형 얼음에서 매달린 GroEL의 극저온 영상

• 미디어 재생

  크라이오-TEM에 의한 피치아 목회자의 알코올 산화제 구조

• 

  Iron Mountain 바이오 필름에서 온전한 ARMAN 셀의 극저온 전송 전자 현미경(cryoTEM) 이미지. 이미지 폭은 576 nm이다.

역사

초기개발

1960년대에는 높은 에너지 전자 빔에 의한 방사선 손상으로 인해 구조 결정 방법에 대한 전송 전자 현미경 사용이 제한되었다. 과학자들은 저온에서 시료를 검사하면 빔에 의한 방사선 피해를 줄일 수 있다는 가설을 세웠다.^[11] 액체 헬륨(-269 °C 또는 4 K 또는 -452.2 °F)과 액체 질소(-195.79 °C 또는 77 K 또는 -320 °F) 모두 크라이오균으로 간주되었다. 1980년에 Erwin Knapek와 Jacques Dubochet은 극저온에서 빔 손상에 대한 논평을 발표하여 다음과 같은 관찰 결과를 공유하였다.

탄소 필름에 장착된 얇은 결정들은 실온보다 4K에서 30배에서 300배 더 보에 강한 것으로 밝혀졌다... 우리 결과의 대부분은 4K 지역의 극저온제가 온도에 크게 의존한다고 가정함으로써 설명할 수 있다.^[12]

그러나 이러한 결과는 재현할 수 없었으며 불과 2년 후 네이처에 수정 사항이 발표되어 빔 저항이 처음에 예상했던 것보다 덜 유의미하다는 것을 알 수 있었다. 4K에서 얻은 보호장치는 "L-발렌 표준 샘플의 10배"^[13]에 더 가까웠다.

1981년, 유럽 분자생물학 연구소의 과학자인 알래스카 맥도왈과 자크 두보체트는 크라이오-EM의 첫 번째 성공적인 구현을 보고했다.^[14] 맥도왈과 두보체트는 극저온(액체 프로판이나 액체 에탄은 77K로 냉각)으로 급강하한 친수성 탄소 필름에 뿌려 순수를 얇은 필름으로 유리화시켰다. 아모르퍼스 얼음의 얇은 층은 두께가 1µm 미만이었고 전자 회절 패턴은 아모르퍼스/바이터러스 얼음의 존재를 확인했다. 1984년 두보체트 그룹은 유리화 아데노바이러스 타입 2, T4 박테리오파지, 셈리키 포레스트 바이러스, 박테리오파지 CbK, 베스피컬-스토마티스바이러스 등의 분석으로 구조생물학에서 크라이오-EM의 위력을 입증했다.^[15]

2017년 노벨 화학상

2017년에는 자크 두보체트, 요아힘 프랭크, 리처드 헨더슨 등 3명의 과학자가 생체분자를 이미지화하는 기술을 개발해 노벨 화학상을 받았다.^[4]

X선 결정학에 대한 잠재적 라이벌

2020년 10월 27일 현재, 생물학적 샘플 150,494개를 이미지화하는 데 X선 결정학이 사용되어 왔으며, 생물학적 현미경 검사에서는 크라이오-EM이 6016으로 크게 뒤처져 있다.^[16]

그러나 네이처에 따르면 케임브리지^[17] 대학의 직접 전자 검출기(직접 검출 장치 또는 DDD라고도 함)의 발달과 SPT labtech에^[18] 의한 샘플 생산 자동화로 생물 분야에서의 이용이 증가하여 크라이오-EM이 잠재적 경쟁자가 되었다.^[19]

X선 결정술의 분해능은 결정 순도에 의해 제한되며,^[20] 이러한 샘플을 만드는 데는 최대 몇 달 또는 심지어 몇 년이 걸릴 정도로 매우 많은 시간이 소요된다.^[19] 또한, 어떤 단백질은 결정화되기 어렵다.^[19][21] 크라이오-EM에 대한 샘플 준비는 여전히 힘들지만,^[22] 샘플을 "원래 상태"^[21]에서 관찰하기 때문에 이러한 문제가 없다.

Proteopedia 중간 수준의 해상도 X선 결정학(5월 19일 2019년의로)에 의해 단백질 자료 뱅크에에 의하면 이것은 전일 대비 2.05Å,[20]과 가장 높은 해상도 기록(10월 27일 2020년으로)의 있0.48 Å.[표창 필요한]2020년 현재, 단백질은 구조 Cryo-EM에 의해 결정되는 대다수의 3–4 Å의 더 낮은 해상도에 있다.[23] 그러나 최고 수준의 크라이오-EM 해상도는 1.5 approaching에 육박하고 ^[22]있어 경우에 따라 해상도 면에서 공정한 경쟁자가 되고 있다.

상관식 조명 Cryo-TEM과 Cryo-ET

2019년에는 신경세포 내 튜닝 나노튜브(TNT)를 관찰하기 위해 상관성 광선 크라이오-TEM과 크라이오-ET를 사용했다.^[24]

전자 극저온 검사법

전자 극저온증(cryoSEM) 스캐닝 전자 현미경(cryoSEM)은 극저온실에서 스캐닝 전자 현미경 냉단 단계를 갖는 스캐닝 전자 현미경 기법이다.

참고 항목

• 크라이오픽션
• 전자단층촬영(ET)

참조