RU2543634C2

RU2543634C2 - Питание, стимулирующее иммунную систему

Info

Publication number: RU2543634C2
Application number: RU2011100828/15A
Authority: RU
Inventors: 'Т ЛАНД Белинда ПОТАППЕЛ-ВАН; Леон Мэттье Йоханнес КНИППЕЛС; Алма Йилдау НАУТА; Йохан ГАРССЕН
Original assignee: Н.В. Нютрисиа
Priority date: 2008-06-13
Filing date: 2009-06-12
Publication date: 2015-03-10
Also published as: DK2285387T3; AR072141A1; EP2285387B1; EP2293803A1; EP3326633A1; PL2293677T3; CN102065867A; US20170296563A1; CN102123715A; RU2011100828A; RU2011100829A; HUE028390T2; ES2656776T3; US20170173104A1; WO2009151329A1; AR072142A1; ES2558960T3; US10124016B2; US20110117077A1; BRPI0915149A2

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии и касается способа получения препарата, подходящего для применения в питании, включающего в себя стадии a) инкубирования водного субстрата с Bifidobacteria, b) инактивирования Bifidobacteria путем нагревания инкубационной смеси и/или удаления клеток Bifidobacteria из инкубационной смеси с помощью центрифугирования и/или фильтрования, c) объединения композиции, содержащей смесь, полученную на стадии a) непосредственно перед стадией b) или полученную на стадии b), по меньшей мере с двумя различными неперевариваемыми углеводами, выбранными из группы, состоящей из следующих: фруктоолигосахариды и галактоолигосахариды, где Bifidobacteria принадлежит к виду В. breve; препарата, подходящего для применения в питании; пищевой композиции, включающей в себя указанный препарат. Группа изобретений обеспечивает синергическое действие инкубационной смеси и неперевариваемых углеводов на иммунную систему (Th1-ответ и Th2-ответ). 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 7 пр., 3 табл.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к питанию для улучшения ответа иммунной системы и к способу его получения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Иммунная система характеризуется различными возможными путями реагирования на антиген. Решающей стадией для типа иммунного ответа является стимуляция различных субпопуляций T-клеток. Так называемые Th1-клетки, главным образом, продуцируют цитокины, которые стимулируют клеточный иммунный ответ (IFN-y, IL-12, IL-2), например, по отношению к патогенам и вакцинам. Напротив, Th2-клетки, главным образом, продуцируют IL-4, IL-5 и IL-10. Указанные цитокины усиливают IgE-опосредованную аллергическую реакцию и воспаление. Th1- и Th2- связанные цитокины действуют антагонистически, и ответы Th1 и Th2 в нормальных физиологических условиях находятся в хорошо контролируемом равновесии. Не преобладает ни Th1-ответ, ни Th2-ответ. При дисбалансе преобладание Th1- или Th2- иммунного ответа играет роль в нескольких патологических состояниях.

Международные патенты WO 2005/039319 и WO 2006/091103 имеют отношение к лекарственному препарату, включающему в себя Bifidobacterium breve, и к смеси неперевариваемых углеводов для грудных детей на негрудном или частично грудном вскармливании, а также к его применению для лечения или предотвращения иммунных нарушений у грудных детей на негрудном или частично грудном вскармливании. Международный патент WO 2005/039597 относится к применению кислого олигосахарида и нейтрального олигосахарида для усиления иммунной системы и для лечения и/или предотвращения нарушений, связанных с иммунной системой. Международный патент WO 01/642255 имеет отношение к пищевой композиции, включающей в себя пребиотик для усиления иммунного ответа. Международные патенты WO 2004/0938998 и WO 2004/0938999 имеют отношение к иммуномодуляторным продуктам, полученным из культуры Bifidobacterium.

Значительные усилия направлены на обнаружение новых растворов для баланса и стимулирования иммунной системы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что комбинация i) продукта, полученного при инкубировании водного субстрата с бифидобактериями, где субстрат представляет собой один субстрат, выбранный по меньшей мере из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу, и последующего инактивирования бифидобактерий путем нагревания инкубированной смеси и/или путем удаления клеток бифидобактерий из инкубированной смеси путем центрифугирования и/или фильтрации, и ii) по меньшей мере двух различных неперевариваемых углеводов, где по меньшей мере один, предпочтительно два углевода, выбирают из группы, включающей в себя фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, глюкоолигосахариды, арабиноолигосахариды, маннанолигосахариды, ксилоолигосахариды, фукоолигосахариды, арабиногалактоолигосахариды, глюкоманноолигосахариды, галактоманноолигосахариды, рафинозу, лактосахарозу, олигосахариды, содержащие сиаловую кислоту, и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, синергически стимулируют иммунную систему. Обнаружили, что настоящий препарат, т.е. препарат, включающий в себя комбинацию, которая описана выше, уменьшал Th2-ответ и/или увеличивал Th1-ответ. Наблюдаемый эффект был неожиданно выше, чем сумма эффектов отдельных компонентов.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили более сильный эффект в двух различных экспериментальных моделях на животных. Увеличенный ответ в реакции гиперчувствительности замедленного типа, характерной для повышенного Th1-ответа, наблюдали после вакцинации вакциной от гриппа у животных, получавших настоящий препарат, по сравнению с животными, получавшими отдельные компоненты. Комбинация продукта, полученного при инкубировании субстрата с бифидобактериями, и продукта, полученного при инкубировании со стрептококками, с добавлением двух неперевариваемых углеводов давала, в результате, еще более высокий ответ в реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Сниженный ответ в реакции гиперчувствительности немедленного типа, характерный для сниженного Th2-ответа, наблюдали после воздействия аллергена через легкие у животных, получавших настоящий препарат, по сравнению с животными, получавшими отдельные компоненты.

Синергический эффект комбинации инградиентов i) и ii), как описано выше, является неожиданным. Он не может быть объяснен симбиотическим эффектом, при котором неперевариваемые углеводы (ii)) специфически стимулируют рост полезных микроорганизмов, представленных в аналогичном препарате, поскольку живые клетки бифидобактерий не представлены в настоящем препарате. Удаление и/или инактивация живых клеток бифидобактерий характеризуется тем преимуществом, что препарат может быть пастеризован и/или стерилизован, и поэтому снижается возможность загрязнения вредными микроорганизмами. Данное преимущество особенно благоприятно для грудных детей, поскольку младенцы имеют повышенную кишечную проницаемость. Кроме того, поскольку бифидобактерии удаляют или инактивируют, сами они не могут являться причиной инфекций.

Другое преимущество заключается в том, что можно лучше контролировать дозу биологически активных компонентов, получаемых каждым субъектом. Также хранение продукта преимущественно является более простым и менее затратным. Кроме того, преимущественно не происходит постокисления в сохраняемых продуктах, что позволяет избежать побочных эффектов, связанных с коагуляцией белков, и неприятного вкуса. Еще одно преимущество заключается в том, что инактивированные и/или удаленные бифидобактерии больше не расщепляют и не потребляют неперевариваемые углеводы.

Настоящий препарат особенно эффективен для субъектов, демонстрирующих сниженный Th1-ответ по сравнению со здоровыми взрослыми, в особенности для новорожденных детей, пожилых людей, страдающих от старения иммунной системы, для субъектов, страдающих от СПИДа или инфицированных вирусом иммунодефицита человека, и для раковых пациентов, которые подвергаются или подвергались химиотерапии, облучению, и для раковых пациентов с кахексией. Настоящий препарат особенно эффективен для лечения и/или профилактики заболеваний, которые могут быть предотвращены и/или вылечены путем уменьшения Th2-ответа, в особенности для аллергии, атопического дерматита, астмы, пищевой аллергии, аллергического ринита (например, аллергия на пыльцу), аллергии на пылевого клеща и других форм гиперчувствительности, таких как общая анафилактическая реакция и острая крапивница. Настоящий препарат применим для лечения и/или профилактики инфекций и/или для поддержания ответа на вакцинацию до, во время и/или после вакцинации.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение имеет отношение к способу производства препарата, включающему в себя стадии a: инкубирования водного субстрата с бифидобактериями, где субстрат включает в себя по меньшей мере один субстрат, выбранный из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу, для получения инкубационной смеси; b: инактивирование бифидобактерий с помощью нагревания инкубационной смеси и/или удаления клеток бифидобактерий из инкубационной смеси с помощью центрифугирования и/или фильтрования; и c: комбинирование композиции, содержащей смесь, полученную на стадии a, или полученную на стадии b, предпочтительно полученную на стадии b по меньшей мере с двумя различными неперевариваемыми углеводами, где по меньшей мере один, предпочтительно два углевода выбирают из группы, включающей в себя фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, глюкоолигосахариды, арабиноолигосахариды, маннанолигосахариды, ксилоолигосахариды, фукоолигосахариды, арабиногалактоолигосахариды, глюкоманноолигосахариды, галактоманноолигосахариды, раффинозу, лактосахарозу, олигосахариды, содержащие сиаловую кислоту, и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту.

В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к препарату, получаемому по способу, согласно настоящему изобретению. В одном воплощении изобретение имеет отношение к питательной композиции, включающей в себя или состоящей из препарата, полученного по способу, согласно настоящему изобретению.

Изобретение также имеет отношение к способу лечения и/или профилактики заболевания у млекопитающего, указанный способ включает в себя введение настоящего препарата млекопитающему. Изобретение также имеет отношение к способу для предоставления питания для грудного ребенка, указанный способ включает в себя введение настоящего препарата или питательной композиции, содержащей настоящий препарат, грудному ребенку.

Способ, включающий в себя инкубирование субстрата с бифидобактериями

Настоящее изобретение имеет отношение к препарату, получаемому или полученному с помощью инкубирования водного субстрата с бифидобактериями, где водный субстрат включает в себя по меньшей мере один субстрат, выбранный из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу (в дальнейшем обозначаемого как стадия (a)). Инкубационную смесь, полученную или получаемую на стадии (a), подвергают стадии (b), включающей в себя стадию инактивации с помощью тепловой обработки и/или стадию удаления клеток бифидобактерий с помощью центрифугирования и/или фильтрования. Стадию (b) проводят, чтобы уменьшить количество живых бифидобактерий в препарате, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%.

В одном воплощении стадия инкубирования включает в себя стадию ферментации и/или стадию биоконверсии. Во время ферментации водный субстрат ферментируется бифидобактериями. Во время биоконверсии водный субстрат подвергается биоконверсии под действием бифидобактерий.

Препарат, полученный или получаемый с помощью (в дальнейшем в любом месте, где упоминается только "полученный", также подразумевается "получаемый") настоящего способа, предпочтительно включает в себя фрагменты бактериальных клеток, такие как гликопротеины, гликолипиды, пептидогликан, липотейхоевая кислота (LTA), липопротеины, ДНК и/или капсульные полисахариды. Указанные фрагменты вызывают иммунный ответ. Преимуществом является применение продукта, полученного путем инкубирования водного субстрата, содержащего по меньшей мере один субстрат из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу с бифидобактериями и с последующим инакивированием и/или удалением бифидобактерий, поскольку присутствие бифидобактерий будет давать, в результате, более высокую концентрацию фрагментов бактериальных клеток. После инкубирования водного субстрата с бифидобактериями могут образоваться дополнительные биоактивные компоненты, такие как органические кислоты, биологически активные пептиды и/или олигосахариды, которые стимулируют иммунную систему. Если используют коммерческие препараты пробиотиков, пробиотические бактериальные клетки обычно отмывают и выделяют из водной ростовой среды, которая содержит фрагменты бактериальных клеток, тем самым значительно уменьшая или даже удаляя супернатант инкубированного субстрата, содержащий фрагменты бактериальных клеток. В настоящем изобретении указанного уменьшения не происходит. Присутствие интактных клеток (живых или убитых) не является необходимым для иммунного ответа; водный субстрат сам по себе после настоящей стадии инкубирования с бифидобактериями уже обладает положительными эффектами на иммунную систему.

Бифидобактерии

Бифидобактерии, применяемые в настоящем способе, предпочтительно предоставлены в виде моно- или смешанной культуры. Бифидобактерии представляют собой грамположительные, анаэробные, палочковидные, продуцирующие молочную кислоту бактерии. Настоящие виды Bifidobacterium предпочтительно характеризуются по меньшей мере 95% идентичности последовательности 16 S рРНК при сравнении с типовым штаммом соответствующих видов Bifidobacterium, более предпочтительно по меньшей мере 97% идентичности, как описано в руководствах по данному вопросу, например Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor (N.Y.) Laboratory Press. Используемые предпочтительно бифидобактерии также описаны Scardovi, V. Genus Bifidobacterium, p.1418-p.1434. В: Bergey's manual of systematic Bacteriology. Vol.2. Sneath, P.H.A., N.S. Mair, M.E. Sharpe and J.G. Holt (ed.). Balti более: Williams & Wilkins. 1986. 635 p. Предпочтительно бифидобактерии, используемые для получения настоящего препарата, представляют собой по меньшей мере один вид Bifidobacterium, выбранный из группы, включающей в себя B. breve, B. infantis, B. bifidum, B. catenulatum, B. adolescentis, B. thermophilum, B. gallicum, B. animalis или lactis, B. angulatum, B. pseudocatenulatum, B. thermacidophilum и B. longum, более предпочтительно B. breve, B. infantis, B. bifidum, B. catenulatum, B. longum, более предпочтительно B. longum и B. breve, еще более предпочтительно B. breve, наиболее предпочтительно B. breve 1-2219, депонированный в CNCM в Париже, Франция. B. breve CNCM 1-2219 депонирован в рамках Будапештского соглашения в Национальную коллекцию микроорганизмов Института Пастера, Париж, Франция, 31 мая 1999 компанией Gervais Danone. Данный штамм описан в международной патентной заявке WO 2004/093899.

Предпочтительно композиция также включает в себя продукт, полученный с помощью инкубирования водного субстрата, включающего в себя по меньшей мере один субстрат, выбранный из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, казеин, гидролизат казеина и лактозу, предпочтительно из группы молочной сыворотки и лактозы, со стрептококками, и предпочтительно с помощью последующего инактивирования и/или удаления стрептококков. Стрептококки представляют собой грамположительные, анаэробные, сферической формы бактерии, продуцирующие молочную кислоту. Виды Streptococcus предпочтительно характеризуются по меньшей мере 95% идентичности последовательности рРНК 16 S при сравнении с типовым штаммом соответствующих видов Streptococcus, более предпочтительно по меньшей мере 97% идентичности, как определено в руководствах по данному вопросу, например, Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor (N.Y.) Laboratory Press. Предпочтительно производство продукта, получаемого путем инкубирования водного субстрата со стрептококками с последующим инактивированием стрептококков выполняют с видами Streptococcus, выбранными из группы, включающей в себя S. salivarius и S. thermophilus, более предпочтительно S. thermophilus, еще более предпочтительно штамм S. thermophilus CNCM 1-1620 или штамм CNCM 1-1470, наиболее предпочтительно штамм CNCN 1-1620. S. thermophilus CNCM 1-1620 и 1-1470 успешно продуцируют в больших количествах бета-галактозидазу. S. thermophilus CNCM 1-1620 депонирован в рамках Будапештского соглашения в Национальную коллекцию микроорганизмов Института Пастера, Париж, Франция 23 августа 1995 компанией Gervais Danone. S. thermophilus CNCM 1-1470 депонирован в рамках Будапештского соглашения в Национальную коллекцию микроорганизмов Института Пастера, Париж, Франция 25 августа 1994 компанией Gervais Danone. Указанные штаммы описаны в европейской патентной заявке EP 778885.

Стадия процесса a) инкубирование водного субстрата

Стадию (a) предпочтительно осуществляют с помощью:

a1 посева бифидобактерий в водный субстрат в количестве от 1×10² до 1×10¹¹ КОЕ бифидобактерий/мл, указанный водный субстрат характеризуется значением pH от 4 до 8 и включает в себя по меньшей мере один субстрат, выбранный из группы, включающей в себя молоко, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу,

a2 инкубирования указанных бифидобактерий в указанной водной среде, в аэробных или анаэробных условиях и при температуре от 20°C до 50°C в течение по меньшей мере 2 часов.

Водный субстрат, который инкубируют с бифидобактериями, включает в себя по меньшей мере один, более предпочтительно по меньшей мере два субстрата, выбранные из группы, включающей в себя молоко, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу. Предпочтительно субстрат не содержит интактный казеин. Обнаружили, что образовывались менее иммуностимулирующие субстанции, если водный субстрат содержал в больших количествах интактный казеин. Таким образом, водный субстрат включает в себя предпочтительно менее 25 г/л казеина, более предпочтительно менее 15 г/л, еще более предпочтительно менее 5 г/л, наиболее предпочтительно менее 1 г/л интактного казеина. Водный субстрат, таким образом, еще более предпочтительно включает в себя молочную сыворотку и/или белок молочной сыворотки, и/или гидролизат белка молочной сыворотки.

Молоко может представлять собой цельное молоко, полуобезжиренное молоко и/или обезжиренное молоко. Предпочтительно используют обезжиренное молоко. Молочная сыворотка может представлять собой сладкую молочную сыворотку, кислую молочную сыворотку или молочную сыворотку, из которой удален казеин, например, с помощью фильтрования, или пермеат молочной сыворотки. Предпочтительно молочная сыворотка представлена в концентрации 3-80 г сухого веса на литр (л) водного субстрата, более предпочтительно 40-60 г на л. Предпочтительно используют концентрат белка молочной сыворотки. Предпочтительно используют гидролизат белка молочной сыворотки, который представлен в количестве 2-80 г сухого веса на л водного субстрата, более предпочтительно 5-15 г/л. Предпочтительно лактоза представлена в количестве 5-50 г сухого веса на л водного субстрата, более предпочтительно 1-30 г/л. Предпочтительно водный субстрат включает в себя буферные соли, чтобы обеспечить значение pH в пределах желаемого диапазона. Предпочтительно в качестве буферной соли используют дигидрофосфат натрия или калия, предпочтительно в количестве от 0,5 до 5 г/л, более предпочтительно от 1,5 до 3 г на литр. Предпочтительно, водный субстрат включает в себя цистеин в количестве от 0,1 до 0,5 г на литр водного субстрата, более предпочтительно от 0,2 до 0,4 г/л. Присутствие цистеина дает в результате низкий окислительно-восстановительный потенциал субстрата, который благоприятен для активности бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в частности для бифидобактерий. Предпочтительно водный субстрат включает в себя дрожжевой экстракт в количестве от 0,5 до 5 г/л водного субстрата, более предпочтительно от 1,5 до 3 г/л. Дрожжевой экстракт является богатым источником кофакторов ферментов и факторов роста для бактерий, продуцирующих молочную кислоту. Присутствие дрожжевого экстракта усиливает биоконверсию и/или фермантацию с помощью бифидобактерий.

Предпочтительно водный субстрат, который инкубируют, включает в себя высокую концентрацию твердых частиц, предпочтительно больше 20% масс. твердых частиц на основании объема, более предпочтительно больше 40% масс. твердых частиц. Высокая концентрация эффективна при выполнении дальнейших стадий обработки, таких как, например, сушка распылением, центрифугирование или фильтрование.

Соответственно, водный субстрат пастеризуют перед стадией инкубирования, чтобы устранить присутствие нежелательных живых бактерий. Продукт пастеризуют после инкубации, чтобы инактивировать ферменты. Инактивация ферментов соответственно происходит при 75°C в течение 1 мин. Соответственно, инактивация ферментов проходит при 75°C в течение 3 мин. Соответственно, водный субстрат гомогенизируют до и/или после стадии инкубирования. Гомогенизация дает в результате более стабильный продукт, особенно в присутствии жира (липидов).

Плотность инокуляции составляет предпочтительно 1×10²-1×10¹¹, предпочтительно 1×10⁴-1×10¹⁰ КОЕ бифидобактерий на мл водного субстрата, более предпочтительно 1×10⁷-1×10⁹ КОЕ бифидобактерий/мл водного субстрата. Способы получения концентрированной стартовой культуры бифидобактерий, которую инокулируют в водный субстрат, известны в данной области техники. Конечная плотность бифидобактерий после инкубации составляет предпочтительно от 1×10³ до 1×10¹¹, более предпочтительно от 1×10⁴ до 1×10⁹ КОЕ/мл водного субстрата.

Инкубацию с бифидобактериями предпочтительно осуществляют при температуре приблизительно от 20°C до 50°C, более предпочтительно от 30°C до 45°C, еще более предпочтительно приблизительно от 37°C до 42°C. Оптимальная температура для роста и/или активности бифидобактерий составляет 37°C-42C.

Инкубация с бифидобактериями происходит предпочтительно в анаэробных условиях, поскольку рост бифидобактерий и ферментативная активность многих ферментов бифидобактерий уменьшается в аэробных условиях. Однако ацидификация не всегда желательна. Таким образом, в одном воплощении стадия инкубирования соответственно происходит в аэробных условиях.

Инкубацию с бифидобактериями предпочтительно осуществляют при значении pH от 4 до 8, более предпочтительно от 5,6 до 7,5, еще более предпочтительно от 6 до 7,5. Указанное значение pH не вызывает осаждения белка и/или неприятного вкуса, в то же время бифидобактерии могут взаимодействовать с водным субстратом.

Время инкубации составляет предпочтительно по меньшей мере 2 часа, предпочтительно от 4 до 48 часов, более предпочтительно от 6 до 24 часов, еще более предпочтительно от 6 до 15 часов. Достаточно длительное время инкубации обеспечивает взаимодействие между бифидобактериями и водным субстратом и/или продукцию клеточных фрагментов, таких как гликопротеины, гликолипиды, пептидогликан, липотейхоевая кислота (LTA), липопротеины, ДНК и/или капсульные полисахариды, которые происходят в большом объеме, хотя время инкубации не должно быть чрезмерно большим по экономическим причинам.

Способы инактивации и/или физического удаления живых клеток бифидобактерий

На стадии (b) настоящего способа живые клетки бифидобактерий после инкубирования на стадии a) предпочтительно в основном все элиминируют, например, путем инактивации с помощью тепловой обработки и/или физического удаления. Клетки предпочтительно инактивируют с помощью тепловой обработки. Предпочтительно бифидобактерии убивают нагреванием после стадии инкубирования a). Предпочтительными способами теплового уничтожения являются пастеризация, стерилизация, ультравысокотемпературная обработка, варка распылением и/или сушка распылением при таких температурах, что бифидобактерии не выживают.Тепловую обработку предпочтительно осуществляют по меньшей мере при 50°C, более предпочтительно по меньшей мере при 65°C. Тепловую обработку предпочтительно осуществляют по меньшей мере в течение 5 минут, более предпочтительно по меньшей мере в течение 10 минут. Тепловую обработку предпочтительно осуществляют по меньшей мере в течение 5 минут, по меньшей мере при 50°C, более предпочтительно по меньшей мере в течение 10 минут, по меньшей мере при 65°C. Тепловую обработку предпочтительно осуществляют по меньшей мере в течение 1 минуты при 75°C, более предпочтительно по меньшей мере в течение 3 минут при 75°C.

Предпочтительно интактные клетки бифидобактерий убирают из инкубированного продукта путем физического удаления, такого как фильтрация и/или центрифугирование, например центрифугирование в течение 1 часа при 3000 g, при этом интактные клетки остаются в осадке или в ретентате и продукт, полученный при инкубировании молока и/или субстрата, полученного из молока, с бифидобактериями и последующем инактивировании клеточных фрагментов бифидобактерий, остается в супернатанте и/или фильтрате, соответственно. Тепловая инактивация и/или физическое удаление живых клеток являются такими, что количество живых бифидобактерий после обработки является ниже предела обнаружения, используемого в общепринятых методах пластинчатого посева, известных в данной области техники. Указанный предел обнаружения составляет менее 10⁴ КОЕ живых клеток бифидобактерий, исходя из г сухого веса композиции, более предпочтительно менее 10³ КОЕ/г.Предпочтительно стадия тепловой инактивации и/или удаления представляет собой такую стадию, что по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 99% клеток, представленных в инкубационной смеси после стадии a), устраняется.

Требование инактивации живых клеток обладает тем преимуществом, что после получения конечная питательная композиция может быть пастеризована и/или стерилизована, и, следовательно, уменьшается вероятность заражения вредными микроорганизмами. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет жидкую, готовую к применению композицию, которую можно приготовить и хранить при комнатной температуре. Кроме того, проще контролировать дозу биоактивных компонентов, получаемых каждым субъектом, поскольку не происходит дальнейшего роста ни в жидком продукте, ни в кишечнике человека. Последнее из названного является переменным фактором, зависящим от кишечной среды субъекта, и, таким образом, приводит к изменениям в степени выраженности полезных эффектов у отдельных субъектов. Еще одно преимущество заключается в том, что инактивированные и/или удаленные бифидобактерии и стрептококки уже не могут расщеплять и потреблять неперевариваемые углеводы.

Дополнительные преимущества заключаются в том, что хранение питательной композиции является более простым и менее затратным, поскольку не нужно предпринимать специальных мер предосторожности для поддержания жизнеспособности бифидобактерий на приемлемом уровне. Данное утверждение особенно верно для продуктов с водной активностью выше 0,3. Также не происходит пост-окисления в сохраняемых продуктах с высокой водной активностью и/или в порошкообразных пищевых композициях в период после восстановления водой и перед употреблением. Таким способом избегают неблагоприятных эффектов, имеющих отношение к коагуляции белков и неприятному вкусу.

Внесение дополнительных компонентов и другие дополнительные стадии способа

По желанию одна или более нижеследующих стадий могут следовать за упомянутой выше стадией способа b):

i) Ультрафильтрование продукта после инкубации через фильтрующие мембраны, характеризующиеся порогом отсечения 100 - 300 кДа, для получения концентрированного ретентата. Мембраны представляют собой предпочтительно полиэфирсульфоновые мембраны, и фильтрование осуществляют предпочтительно при температуре ниже 60°C.

ii) Отмывание концентрированного ретентата водой.

iii) Дегидрирование концентрированного ретентата, предпочтительно, с помощью лиофилизации.

iv) Растворение дегидрированного ретентата в буфере, предпочтительно в Трис-буфере со значением pH 6-8.

v) Проведение эксклюзионной гель-хроматографии раствора ретентата на колонке, характеризующейся порогом исключения 600 кДа, предпочтительно на колонке с декстраном или агарозой, такой как Superdex^®200.

vi) Восстановление отфильтрованной или исключенной фракции в конце хроматографии.

vii) Обессоливание продукта с помощью мембраны с пороговым значением 10 кДа. Восстановление исключенной фракции в конце хроматографии.

Указанные стадии предпочтительно выполняют в стерильных условиях. Дополнительные ингредиенты, которые могут быть полезны для получения желаемой заключительной питательной композиции, могут быть добавлены после стадии способа a), предпочтительно непосредственно перед стадией b) или после стадии b) способа. Предпочтительно ингредиенты добавляют после стадии b). В отношении композиции детского молока могут быть добавлены такие ингредиенты, как обезжиренное молоко, молочная сыворотка, лактоза, растительный жир, микроэлементы, витамины, которые известны в данной области техники.

Предпочтительно, водный субстрат, включающий в себя молочную сыворотку, белок молочной сыворотки и/или гидролизат белка молочной сыворотки, пастеризуют, охлаждают и инкубируют с одним или более штаммами Bifidobacterium, предпочтительно со штаммом B. breve CNCM 1-2219, после чего инкубированный продукт подвергают термообработке и сохраняют. По желанию инкубированный продукт смешивают с другими компонентами, составляя питательную композицию. Жировой компонент может быть включен или не включен в состав, но предпочтительно жировой компонент не включают в состав на данной стадии. Предпочтительно, смесь предварительно нагревают и затем добавляют жир (также в описании используют термин "липиды") в одной линии, гомогенизируют, подвергают термообработке и высушивают.

Другой предпочтительный способ получения инкубированного продукта настоящего изобретения раскрыт в международном патенте WO 01/01785, более конкретно - в примерах 1 и 2. Другой предпочтительный способ получения инкубированного продукта по настоящему изобретению описан в международном патенте WO 2004/093899, более конкретно - в примере 1.

Предпочтительно конечная питательная композиция включает в себя от 5 до 100% масс., исходя из сухого веса препарата, полученного на стадии b, более предпочтительно от 5 до 99,5% масс., более предпочтительно от 5 до 95% масс., еще более предпочтительно от 5 до 80% масс., еще более предпочтительно от 5 до 40% масс., наиболее предпочтительно от 10 до 40% масс. Предпочтительно, конечная питательная композиция включает в себя от 0,5 до 20% масс. продукта, полученного на стадии b, на 100 мл, более предпочтительно от 0,5 до 14% масс., более предпочтительно от 1 до 10% масс., еще более предпочтительно от 1 до 5% масс. на 100 мл.

Предпочтительно настоящая конечная питательная композиция включает в себя инактивированные бифидобактерии и/или бактериальные фрагменты бифидобактерий, полученные более чем из 1×10³ КОЕ бифидобактерий на г исходя из сухого веса конечной композиции, более предпочтительно более чем из 1×10⁴ КОЕ, еще более предпочтительно более чем из 1×10⁵ КОЕ. Предпочтительно инактивированные бифидобактерии и/или бактериальные фрагменты бифидобактерий получают менее чем из 1×10¹¹ КОЕ бифидобактерии на г, исходя из сухого веса конечной композиции, более предпочтительно менее чем из 1×10¹⁰ КОЕ, еще более предпочтительно менее чем из 1×10⁹ КОЕ. Указанные значения могут быть рассчитаны путем определения количества бифидобактерий в смеси после инкубации как количество бифидобактерий на стадии a) и перед стадией b), с последующим пересчетом на количество грамм настоящего препарата, представленного в конечной композиции, исходя из ее сухого веса.

Дополнительные ингредиенты, которые могут быть полезны для получения желаемой конечной питательной композиции, могут быть добавлены после стадии a) или b) способа. Предпочтительно дополнительные ингредиенты добавляют после стадии a). В отношении композиции детского молока, могут быть добавлены такие ингредиенты, как обезжиренное молоко, молочная сыворотка, лактоза, растительный жир, микроэлементы, витамины, которые известны в данной области техники. Предпочтительно способ включает в себя дополнительные стадии

d: инкубирование субстрата с Streptococcus thermophilus, предпочтительно со штаммом S. thermophilus CNCM 1-1620 или со штаммом CNCM 1-1470, где субстрат выбран из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, казеин, гидролизат казеина и лактозу для получения инкубационной смеси, и

e: инактивирование S. thermophilus с помощью нагревания инкубационной смеси стадии e и/или удаления клеток S. thermophilus из инкубационной смеси стадии e с помощью центрифугирования и/или фильтрации. Стадию e и b предпочтительно осуществляют одновременно. Предпочтительно интактные клетки стрептококков удаляют из инкубированного продукта путем физического удаления, такого как фильтрация и/или центрифугирование, например центрифугирование в течение 1 часа при 3000 g, при этом интактные клетки остаются в осадке или в ретентате, и продукт, полученный при инкубировании молока и/или субстрата, полученного из молока, со стрептококками и последующем инактивировании клеточных фрагментов стрептококков, остается в супернатанте и/или фильтрате соответственно.

Тепловая инактивация и/или физическое удаление живых клеток являются такими, что количество живых стрептококков после обработки является ниже предела обнаружения, используемого в общепринятых методах пластинчатого посева, известных в данной области техники. Указанный предел обнаружения составляет менее 10⁴ КОЕ живых клеток стрептококков, исходя из г сухого веса композиции, более предпочтительно меньше 10³ КОЕ/г. Таким образом, предпочтительно в одном воплощении согласно изобретению препарат после стадии e включает в себя меньше 10³ КОЕ живых стрептококков на г сухого веса препарата. Предпочтительно стадия тепловой инактивации и/или удаления является такой стадией, что по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 99% клеток, представленных в инкубационной смеси после стадии d), устраняется.

Другой предпочтительный способ получения инкубированного продукта со штаммами S. thermophilus по настоящему изобретению раскрыт в европейской патентной заявке EP 0778885, более конкретно - в примерах 5 и 6. Другой предпочтительный способ получения инкубированного продукта со штаммами S. thermophilus по настоящему изобретению раскрыт в патентной заявке FR2723960, в примерах 2-6.

Предпочтительно, водный субстрат, включающий в себя молочную сыворотку, белок молочной сыворотки и/или гидролизат белка молочной сыворотки, пастеризуют, охлаждают и инкубируют с одним или более штаммами Bifidobacterium, предпочтительно со штаммом B. breve CNCM 1-2219, после чего инкубированный продукт подвергают тепловой обработке и сохраняют. Предпочтительно второй водный субстрат, включающий в себя молочную сыворотку и/или лактозу, инкубируют с S. thermophilus, предпочтительно со штаммом CNCM 1-1620 или со штаммом CNCM 1-1470. Затем два инкубированных продукта предпочтительно смешивают друг с другом и смешивают с другими компонентами, дополняющими питательную композицию. Жировой компонент может быть включен или не включен в состав, но предпочтительно жировой компонент еще не включают в состав на данной стадии. Предпочтительно, смесь предварительно нагревают и затем добавляют жир (также в описании используют термин “липиды”) на одной линии, гомогенизируют, подвергают тепловой обработке и высушивают.

Стадия инкубирования d может быть осуществлена одновременно со стадией инкубирования с бифидобактериями на стадии a. Предпочтительно инкубацию с S. thermophilus осуществляют на стадии способа отдельно от инкубации с бифидобактериями. Раздельное инкубирование обеспечивает оптимальные условия для каждого вида различных бактерий и/или предотвращает нежелательное взаимодействие различных бактерий с высвобождаемыми иммуностимулирующими компонентами. Предпочтительно инкубационную смесь, полученную после инкубации субстрата со стрептококками, добавляют к смеси, полученной на стадии a, стадии b или стадии c, более предпочтительно после стадии a). Улучшенный эффект на реакцию гиперчувствительности замедленного типа наблюдают, если настоящая композиция содержит также смесь, полученную после инкубирования с S. thermophilus. Таким образом, в одном воплощении способ в соответствии с изобретением включает в себя дополнительную стадию: f: объединение инкубационной смеси, полученной на стадии d или e, предпочтительно стадии d, с инкубационной смесью, полученной на стадии a, b или c, предпочтительно на стадии a. В одном воплощении инкубационную смесь, полученную на стадии d, соединяют с инкубационной смесью, полученной на стадии a, и стадии b и e осуществляют одновременно.

Предпочтительно конечная питательная композиция включает в себя от 2 до 94,5% исходя из сухого веса препарата, полученного с помощью стадии d, более предпочтительно от 5 до 80% масс., еще более предпочтительно от 5 до 40% масс. Предпочтительно, конечная питательная композиция включает в себя от 0,2 до 20% масс. продукта, полученного с помощью стадии d, на 100 мл, более предпочтительно от 0,5 до 14% масс., более предпочтительно от 1 до 10% масс., еще более предпочтительно от 1 до 5% масс. на 100 мл.

Неперевариваемые углеводы

Препарат, полученный с помощью настоящего способа, включает в себя по меньшей мере два различных неперевариваемых углевода. Указанные неперевариваемые углеводы добавляют на стадии способа c). Неперевариваемые углеводы эффективно стимулируют иммунную систему. Указанная стимуляция может происходить путем улучшения кишечной микробиоты и/или путем непосредственного воздействия на иммунную систему. Присутствие двух различных неперевариваемых углеводов синергически улучшает кишечную флору и/или синергически стимулирует иммунную систему.

Присутствие двух неперевариваемых углеводов и продукта, полученного при инкубировании водного субстрата с бифидобактериями и последующего инактивирования и/или удаления бифидобактерий, оказывает синергическое воздействие на иммунный ответ. Неожиданно комбинация синергически дает, в результате, более высокий Th1-ответ, более низкий Th2-ответ и/или увеличенное отношение ответов Th1/Th2. Комбинация синергически увеличивает ответ на вакцинацию, синергически улучшает аллергическию реакцию и/или увеличивает устойчивость к инфекциям. Синергический эффект двух указанных соединений являлся неожиданным и не мог быть объяснен с помощью симбиотического эффекта, при котором неперевариваемые углеводы специфически стимулируют рост полезных микроорганизмов, представленных в том же препарате, поскольку живые бифидобактерии не представлены в инкубированном молоке и/или продукте, полученном из молока.

Термин "олигосахарид", который используют в настоящем изобретении, относится к углеводам со степенью полимеризации (DP) от 2 до 250, предпочтительно от DP 2 до 100, более предпочтительно от 2 до 60, еще более предпочтительно от 2 до 10. Если олигосахарид с DP от 2 до 100 включают в состав настоящего препарата, он включает в себя композиции, которые содержат олигосахариды со DP от 2 до 5, DP от 50 до 70 и DP от 7 до 60. Термин "неперевариваемый углевод", который используют в настоящем изобретении, относится к углеводам, которые не перевариваются в кишечнике под действием кислот или пищеварительных ферментов, представленных в верхней части пищеварительного тракта человека (тонкий кишечник и желудок), но которые предпочтительно ферментируются кишечной микробиотой человека. Например, сахарозу, лактозу, мальтозу и мальтодекстрины рассматривают как перевариваемые углеводы.

Предпочтительно настоящий неперевариваемый углевод является растворимым. Термин "растворимый", который используют в описании, в отношении углевода означает, что углевод растворим в соответствии с методом, описанным L. Prosky et al, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 1017-1023 (1988).

Различные неперевариваемые углеводы в настоящем изобретении относятся к неперевариваемым углеводам, отличающимся по составу моносахаридных единиц, или по степени полимеризации (DP), или по обоим показателям. Два неперевариваемых углевода отличаются по моносахаридному составу, если различие составляет по меньшей мере 30% мол., более предпочтительно по меньшей мере 50% мол. различия в моносахаридном составе, исходя из общего числа моль моносахаридных единиц. Например, галактоолигосахариды со средним составом GIu-GaI₃ и фруктоолигосахариды со средним составом GIu-FrU₃ отличаются на 75% мол. Два неперевариваемых углевода отличаются по DP, если среднее значение DP двух углеводов отличается более чем на 5 моносахаридных единиц, предпочтительно более чем на 10 единиц, еще более предпочтительно более чем на 15 единиц. Например, гидролизованный инулин со средней DP 4 и длинноцепочечный инулин со средней DP 25 отличаются по DP на 21 единиц.

Неперевариваемые углеводы представляют собой по меньшей мере один, более предпочтительно по меньшей мере два углевода, выбранных из группы, включающей в себя фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, глюкоолигосахариды, арабиноолигосахариды, маннанолигосахариды, ксилоолигосахариды, фукоолигосахариды, арабиногалактоолигосахариды, глюкоманноолигосахариды, галактоманноолигосахариды, олигосахариды, содержащие сиаловую кислоту, и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту. Предпочтительно настоящий препарат включает в себя фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды и/или олигосахариды, содержащие галактуроновую кислоту, более предпочтительно галактоолигосахариды, наиболее предпочтительно бета-галактоолигосахариды. Группа фруктоолигосахаридов включает в себя инулин, группа галактоолигосахаридов включает в себя трансгалактоолигосахариды или бетагалактоолигосахариды. Группа глюкоолигосахаридов включает в себя гентио-, нигеро- и циклодекстрин-олигосахариды и полидекстрозу, группа арабиногалактоолигосахаридов включает в себя гуммиарабик, и группа галактоманноолигосахаридов включает в себя частично гидролизованную гуаровую камедь.

Для дальнейшего улучшения настоящие неперевариваемые углеводы предпочтительно имеют в своем составе относительно высокое содержание короткоцепочечных олигосахаридов, поскольку указанные олигосахариды значительно стимулируют рост бифидобактерий. Таким образом, предпочтительно по меньшей мере 10% масс. неперевариваемых углеводов в настоящем препарате имеет DP 2-5 (т.е. 2, 3, 4 и/или 5) и по меньшей мере 5% масс. имеет DP 10-60. Предпочтительно, по меньшей мере 50% масс., более предпочтительно по меньшей мере 75% масс. неперевариваемых углеводов имеет DP 2-9 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и/или 9).

Более предпочтительно препарат, полученный с помощью настоящего способа, включает в себя галактоолигосахариды. Галактоолигосахариды предпочтительно выбирают из группы, включающей в себя бета-галактоолигосахариды, лакто-N-тетраозу (LNT), лакто-N-неотетраозу (нео-LNT), фукозил-лактозу, фукозилированную LNT и фукозилированную нео-LNT. В особенно предпочтительном воплощении настоящий препарат включает в себя бета-галактоолигосахариды. Бета-галактоолигосахариды, которые используют в настоящем изобретении, относятся к олигосахаридам, состоящим из более чем 50%, предпочтительно более чем 65% галактозных единиц исходя из мономерных субъединиц со степенью полимеризации (DP) от 2 до 20, в которых по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% галактозных единиц соединены друг с другом бета-гликозидной связью, предпочтительно бета-1,4-гликозидной связью. Бета-связи также преобладают в олигосахаридах женского молока. Среднее значение DP предпочтительно находится в диапазоне от 3 до 6. Глюкозная единица может быть представлена на восстанавливающем конце цепочки галактозных единиц. Бета-галактоолигосахариды также иногда называют трансгалактоолигосахаридами (TOS). Подходящим источником бета-галактоолигосахаридов является Vivinal®GOS (коммерчески доступный в Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Netherlands). Другими подходящими источниками являются Oligomate (Yakult), Cupoligo, (Nissin) и Bi2muno (Classado). Обнаружено, что бета-галактоолигосахариды стимулируют рост бактерий, продуцирующих молочную кислоту, особенно бифидобактерий.

Предпочтительно препарат, полученный с помощью настоящего способа, включает в себя фруктоолигосахариды. Фруктоолигосахариды, которые используют в настоящем изобретении, относятся к углеводам, включающим в себя более 50%, предпочтительно более 65% фруктозных единиц, исходя из мономерных субъединиц, в которых по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% фруктозных единиц соединены друг с другом бета-гликозидной связью, предпочтительно бета-2,1-гликозидной связью. Глюкозная единица может быть представлена на восстанавливающем конце цепочки фруктозных единиц. Предпочтительно фруктоолигосахарид имеет DP или среднее значение DP в диапазоне от 2 до 250, более предпочтительно от 2 до 100, еще более предпочтительно от 10 до 60. Фруктоолигосахарид включает в себя леван, гидролизованный леван, инулин, гидролизованный инулин и синтезированные фруктоолигосахариды. Предпочтительно препарат включает в себя короткоцепочечные фруктоолигосахариды со средней степенью полимеризации (DP) от 3 до 6, более предпочтительно гидролизованный инулин или синтетический фруктоолигосахарид. Предпочтительно препарат включает в себя длинноцепочечные фруктоолигосахариды со средним значением DP свыше 20. Предпочтительно препарат включает в себя как короткоцепочечные, так и длинноцепочечные фруктоолигосахариды. Фруктоолигосахарид, подходящий для применения в способе изобретения, также является коммерчески доступным, например, RaftilineHP (Orafti). Более предпочтительно препарат, полученный с помощью способа в соответствии с изобретением, включает в себя комбинацию галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов, более предпочтительно длинноцепочечных фруктоолигосахаридов. Указанная смесь синергически стимулирует рост полезной кишечной микробиоты, в особенности бифидобактерии.

Препарат, полученный с помощью способа, в соответствии с изобретением, предпочтительно включает в себя олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, более предпочтительно маннуроновую кислоту и/или олигосахариды, содержащие галактуроновую кислоту, еще более предпочтительно галактуроновую кислоту. Термин “олигосахарид, содержащий уроновую кислоту”, который используют в настоящем изобретении, относится к олигосахариду, в котором по меньшей мере 50% моносахаридных единиц, представленных в олигосахариде, являются уроновой кислотой. Термин “олигосахарид, содержащий галактуроновую кислоту”, который используют в настоящем изобретении, относится к олигосахариду, в котором по меньшей мере 50% моносахаридных единиц, представленных в олигосахариде, представляют собой галактуроновую кислоту. Содержащие галактуроновую кислоту олигосахариды, используемые в изобретении, предпочтительно получают в результате деградации пектина, пектата и/или полигалактуроновой кислоты. Предпочтительно деградированный пектин получают путем гидролиза и/или бета-отщепления из пектинов фруктов и/или овощей, более предпочтительно из пектина яблок, цитрусовых и/или сахарной свеклы, еще более предпочтительно из пектина яблок, цитрусовых и/или сахарной свеклы, деградированного по меньшей мере с помощью одной лиазы. В предпочтительном воплощении по меньшей мере одна из концевых единиц галактуроновой кислоты олигосахарида, содержащего галактуроновую кислоту, имеет двойную связь. Двойная связь эффективно защищает против присоединения патогенных бактерий к эпителиальным клеткам кишечника. Предпочтительно одна из терминальных единиц галактуроновой кислоты включает в себя двойную связь C4-C5. Олигосахарид, содержащий галактуроновую кислоту, может образовывать производные. Олигосахарид, содержащий галактуроновую кислоту, может быть метоксилирован и/или амидирован. Предпочтительно олигосахариды, содержащие галактуроновую кислоту, характеризуются степенью метоксилирования выше 20%, предпочтительно выше 50%, еще более предпочтительно выше 70%. Олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, успешно уменьшают адгезию патогенных микроорганизмов к эпителиальным клеткам кишечника. Кроме того, олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, стимулируют иммунную систему с помощью увеличения Th1-ответа.

Таким образом, в одном воплощении препарат, полученный с помощью способа в соответствии с изобретением и для применения в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно включает в себя по меньшей мере бета-галактоолигосахариды. В одном воплощении препарат, полученный с помощью способа в соответствии с изобретением и для применения в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно включает в себя по меньшей мере короткоцепочечные фруктоолигосахариды и/или длинноцепочечные фруктоолигосахариды, предпочтительно длинноцепочечные фруктоолигосахариды. В одном воплощении препарат, полученный с помощью способа в соответствии с изобретением и для применения в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно включает в себя по меньшей мере олигосахариды, содержащие уроновую кислоту. В одном воплощении препарат для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает в себя по меньшей мере бета-галактоолигосахариды и по меньшей мере короткоцепочечные фруктоолигосахариды или длинноцепочечные фруктоолигосахариды или оба вида фруктоолигосахаридов. В одном воплощении препарат для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает в себя по меньшей мере бета-галактоолигосахариды и по меньшей мере олигосахариды, содержащие уроновую кислоту. В одном воплощении препарат для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает в себя по меньшей мере короткоцепочечные фруктоолигосахариды и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, или длинноцепочечные фруктоолигосахариды и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту. В одном воплощении препарат для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает в себя по меньшей мере бета-галактоолигосахариды и короткоцепочечные фруктоолигосахариды и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, или по меньшей мере бета-галактоолигосахариды и длинноцепочечные фруктоолигосахариды и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту. Комбинация олигосахаридов, содержащих уроновую кислоту, вместе с комбинацией галактоолигосахаридов и/или фруктоолигосахаридов дает в результате более высокий Th1-ответ, чем олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, или галактоза и/или фруктоолигосахариды сами по себе.

Предпочтительно весовое отношение в смеси двух различных неперевариваемых углеводов, предпочтительно бета-галактоолигосахаридов и фруктоолигосахарида, составляет от 20 до 0,05, более предпочтительно от 20 до 1. Бета-галактоолигосахариды имеют высокую степень сходства с олигосахаридами женского молока. Предпочтительно настоящий препарат включает в себя бета-галактоолигосахариды с DP 2-10 и/или фруктоолигосахариды с DP 2-60. Обнаружили, что указанная комбинация синергически увеличивает количество бифидобактерий и лактобацилл. Присутствие указанных трех неперевариваемых олигосахаридов еще больше стимулирует бифидобактерии. Весовое отношение трансгалактоолигосахарид:фрукто-олигосахарид:олигосахарид, содержащий уроновую кислоту, составляет предпочтительно (от 20 до 2):1: (от 1 до 20), более предпочтительно (от 12 до 7):1:(от 1 до 3).

Предпочтительно, конечная питательная композиция, состоящая из или включающая в себя препарат, полученный с помощью способа в соответствии с изобретением, включает в себя от 80 мг до 2 г неперевариваемых углеводов на 100 мл, более предпочтительно от 150 мг до 1,50 г, еще более предпочтительно от 300 мг до 1 г. Исходя из сухого веса питательная композиция предпочтительно включает в себя от 0,25% масс. до 20% масс., более предпочтительно от 0,5% масс. до 10% масс., еще более предпочтительно от 1,5% масс. до 7,5% масс. неперевариваемых углеводов. Меньшее количество неперевариваемого углевода будет менее эффективным в стимулировании иммунной системы и/или полезных бактерий в микробиоте, тогда как слишком большое количество будет приводить к побочным эффектам вздутия живота и желудочно-кишечного дискомфорта.

Два различных неперевариваемых углевода добавляют (т.е. стадия c) после стадии a) предпочтительно непосредственно перед стадией b) или после стадии b), предпочтительно стадию c) осуществляют после стадии b), предпочтительно стадию c) осуществляют после стадии e), т.е. после инактивации с помощью тепловой обработки и/или удаления бифидобактерий и по желанию S. thermophilus.

Предпочтительно препарат, полученный с помощью способа в соответствии с изобретением, включает в себя водный субстрат, содержащий по меньшей мере один субстрат из группы, выбранный из молока, белка молока, молочной сыворотки, белка молочной сыворотки, гидролизата белка молочной сыворотки и лактозы, инкубированный с B. breve, более предпочтительно со штаммом CNCM 1-2219, и по меньшей мере один, предпочтительно два неперевариваемых углевода из группы, включающей в себя галактоолигосахариды и фруктоолигосахариды.

В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к настоящему способу, где на стадии c добавляют только один неперевариваемый углевод. Особенно предпочтительно, если только один неперевариваемый углевод представляет собой фруктоолигосахарид.

В одном аспекте изобретение имеет отношение к препарату, полученному по способу настоящего изобретения, как описано выше. В одном воплощении конечная питательная композиция, состоящая из или включающая в себя препарат, полученный с помощью настоящего способа, включает в себя от 0,5 до 10 г неперевариваемого углевода, который описан выше, на 100 г сухого веса композиции. В одном воплощении конечная питательная композиция, состоящая из или включающая в себя препарат, полученный с помощью настоящего способа, имеет вязкость от 1 до 60 мПа·с при скорости сдвига 100 с^-1 при 20°C.

Предпочтительно вышеуказанный способ включает в себя стадию высушивания. Стадии высушивания известны в данной области техники. Подходящей стадией высушивания является сушка распылением. Предпочтительно стадию высушивания выполняют таким образом, что высушенный продукт представляет собой порошок, содержащий менее 10% масс. воды, более предпочтительно меньше 5% масс. Предпочтительно стадию высушивания осуществляют после стадии c. Альтернативно, стадия высушивания может быть выполнена после стадии b и/или после стадии e, после которой неперевариваемые олигосахариды смешивают в сухом виде в продукте.

Питание

Обнаружили, что настоящий препарат может быть успешно применен в питании, таком как детское питание и клиническое питание. Настоящий препарат или композицию, включающую в себя настоящий препарат, предпочтительно вводят энтерально, более предпочтительно - перорально. Предпочтительно, композиция представляет собой сбалансированное питание.

Предпочтительно питание применимо для введения грудным детям. Более предпочтительно настоящая питательная композиция представляет собой молочную смесь для грудных детей или для детей старше года. Настоящая композиция может быть успешно применена в качестве сбалансированного питания для грудных детей. Предпочтительно настоящая композиция представляет собой детское питание, содержащее из расчета сухого веса детского питания i) от 0,5 до 10% масс. содержания галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов и ii) от 5 до 99,5% масс. препарата, полученного после стадии b в соответствии с настоящим способом, где бифидобактерии на стадии a принадлежат к виду B. breve, предпочтительно штамм B. breve CNCM 1-2219, iii) и при желании от 2 до 94,5% масс. препарата, полученного после стадии e.

Указанное питание предпочтительно включает в себя липиды, белки и углеводы и предпочтительно вводится в жидкой форме. Термин "жидкое питание", который используют в настоящем изобретении, включает в себя сухое питание (например, порошки), к которому прилагается инструкция, как смешивать указанную сухую питательную смесь с подходящей жидкостью (например, с водой).

Таким образом, пищевая композиция по настоящему изобретению предпочтительно включает в себя от 5 до 60% липидов из расчета общего количества калорий, от 5 до 60% белка из расчета общего количества калорий, от 15 до 90% перевариваемого углевода из расчета общего количества калорий. Предпочтительно, настоящая питательная композиция включает в себя от 5 до 30% липидов из расчета общего количества калорий, от 15 до 40% белка из расчета общего количества калорий и от 25 до 75% перевариваемого углевода из расчета общего количества калорий, если предназначена для взрослых субъектов. Предпочтительно настоящая питательная композиция включает в себя от 30 до 60% липидов из расчета общего количества калорий, от 5 до 15% белков из расчета общего количества калорий и от 25 до 75% перевариваемых углеводов из расчета общего количества калорий, более предпочтительно от 35 до 50% липидов из расчета общего количества калорий, от 7,5 до 12,5% белков из расчета общего количества калорий и от 40 до 55% перевариваемых углеводов из расчета общего количества калорий, если предназначена для грудных детей. При вычислении % белка из расчета общего количества калорий следует учитывать общее количество калорий, обеспечиваемых белками, пептидами и аминокислотами.

Предпочтительно липиды включают в себя растительные масла. Растительный липид представляет собой предпочтительно по меньшей мере липид, выбранный из группы, включающей в себя соевое масло, пальмовое масло, кокосовое масло, сафлоровое масло, подсолнечное масло, кукурузное масло, масло канолы и лецитины. Предпочтительно используют комбинацию растительных липидов и по меньшей мере одно масло, выбранное из группы, включающей в себя рыбий жир и содержащее омега-3 растительное масло, масло водорослей или бактериальное масло. В предпочтительном воплощении настоящий способ далее включает в себя введение длинноцепочечной полиненасыщенной кислоты (LC-PUFA). Поскольку считают, что указанные вещества действуют на иммунную систему с помощью механизма, отличающегося от механизма действия неперевариваемых углеводов и продукта, полученного при инкубировании молока и/или субстрата, полученного из молока, с бифидобактериями и последующем инактивировании бифидобактерий, комбинация настоящего изобретения с LC-PUFA, как считают, действует синергически.

Пищевая композиция по настоящему изобретению предпочтительно включает в себя от 5 до 60% липидов из расчета общего количества калорий, предпочтительно от 5 до 30% липидов из расчета общего количества калорий, если предназначена для взрослых, предпочтительно от 30 до 60% липидов из расчета общего количества калорий, более предпочтительно от 35 до 50% липидов из расчета общего количества калорий, если предназначена для грудных детей.

Белки, используемые в питательном препарате, предпочтительно выбирают из группы белков животного происхождения (таких как белки молока, белки мяса и яичные белки), растительных белков (таких как соевый белок, пшеничный белок, рисовый белок и гороховый белок), их гидролизатов, свободных аминокислот и смесей белков, гидролизатов и свободных аминокислот. Белки коровьего молока, такие как казеин, и белки молочной сыворотки являются особенно предпочтительными. Поскольку настоящую композицию применяют соответственно для уменьшения аллергических реакций, особенно у грудных детей, белок выбирают предпочтительно из группы, включающей в себя гидролизованный белок молока. Предпочтительно настоящая композиция включает в себя гидролизованный казеин и/или гидролизованный белок молочной сыворотки, гидролизованный растительный белок и/или свободные аминокислоты, наиболее предпочтителен гидролизованный белок молочной сыворотки. Применение указанных белков также уменьшало аллергические реакции. Применение указанных гидролизованных белков эффективно улучшает адсорбцию белкового компонента рациона. Данное улучшение является особенно полезным для грудных детей и для субъектов, страдающих от заболевания.

Пищевая композиция по настоящему изобретению предпочтительно включает в себя от 5 до 60% белка из расчета общего количества калорий, предпочтительно от 15 до 40% белка из расчета общего количества калорий, если предназначена для взрослых, и предпочтительно от 5 до 15% белка из расчета общего количества калорий и более предпочтительно от 7,5 до 12,5% белков из расчета общего количества калорий, если предназначена для грудных детей. При вычислении % белка из расчета общего количества калорий следует учитывать общее количество калорий, обеспечиваемых белками, пептидами и аминокислотами.

Источник перевариваемого углевода может быть добавлен в питательную композицию. Может быть использован любой подходящий (источник) перевариваемого углевода, например сахароза, лактоза, глюкоза, фруктоза, сухая кукурузная патока и мальтодекстрины и их смеси. Таким образом, пищевая композиция по настоящему изобретению предпочтительно включает в себя от 15 до 90% углеводов из расчета общего количества калорий, более предпочтительно от 25 до 75% углеводов из расчета общего количества калорий, еще более предпочтительно от 40 до 55% углеводов из расчета общего количества калорий.

Пищевая композиция по настоящему изобретению предпочтительно находится в жидкой форме. Пищевая композиция предпочтительно характеризуется ограниченной вязкостью. Обнаружили, что настоящий способ предоставляет жидкое питание с достаточно низкой вязкостью, поэтому питание может быть использовано, например, в качестве жидких детских продуктов питания и жидкого клинического питания, которым можно кормить посредством соски, трубки или соломинки, сохраняя низкую вязкость. В предпочтительном воплощении настоящая композиция обладает вязкостью менее 600 мПа·с, предпочтительно менее 250 мПа·с, более предпочтительно менее 60 мПа·с, еще более предпочтительно менее 35 мПа·с, более предпочтительно менее 6 мПа·с при скорости сдвига 100 с^-1 при 20°C. Термин “вязкость”, используемый в настоящем документе, относится к физическому параметру, который определяют согласно следующему методу: вязкость может быть определена с применением реометра Carri-Med CSL. Используемая форма имеет вид конуса (акриловый конус 6 см, 2 градуса), и зазор между пластиной и формой устанавливается на 55 мкм. Линейная непрерывная наклонная скорость сдвига используется от 0 до 150 с^-1 за 20 секунд. Следует отметить, что композиция в порошкообразной форме с инструкцией по приготовлению водного раствора, например, путем добавления воды в определенном отношении, что, таким образом, дает, в результате, указанную вязкость, также охватывается настоящим изобретением.

Нарушения стула (например, твердый стул, недостаточный объем стула, диарея) являются основной проблемой у многих маленьких детей и у больных субъектов, которые получают жидкое питание. Обнаружили, что проблемы со стулом могут быть уменьшены при введении настоящего препарата в жидкое питание, которое имеет осмоляльность от 50 до 500 мОсм/кг, более предпочтительно от 100 до 400 мОсм/кг.

В связи с вышеуказанным важно также, чтобы жидкое питание не имело избыточной калорийной плотности, однако все же обеспечивало достаточное количество калорий для питания субъекта. Следовательно, жидкое питание предпочтительно имеет калорийную плотность от 0,1 до 2,5 ккал/мл, более предпочтительно, калорийную плотность от 0,5 до 1,5 ккал/мл. При использовании в качестве детской смеси калорийная плотность составляет наиболее предпочтительно от 0,6 до 0,8 ккал/мл.

Применение

Обнаружили, что настоящий препарат, полученный с помощью настоящего способа, синергически стимулирует иммунную систему. В частности Th2-ответ снижался и/или Th1-ответ возрастал. Эффект комбинации указанных двух компонентов является выше, чем сумма эффектов отдельных компонентов.

Настоящий препарат может быть успешно использован в лечении и/или профилактике заболевания, и, таким образом, изобретение имеет отношение к способу лечения и/или профилактики заболевания млекопитающего, указанный способ включает в себя введение настоящего препарата млекопитающему. Иначе говоря, изобретение также имеет отношение к применению препарата согласно настоящему изобретению для получения композиции, предпочтительно пищевой композиции, для лечения и/или профилактики заболевания. Иначе говоря, изобретение имеет отношение к препарату или к пищевой композиции, включающей в себя препарат по настоящему изобретению, для применения в лечении и/или профилактике заболевания. Предпочтительно млекопитающее является человеком, еще более предпочтительно ребенком. Таким образом, изобретение также имеет отношение к применению препарата, согласно настоящему изобретению, для получения композиции, предпочтительно питательному препарату для лечения и/или профилактики заболевания у ребенка. Или, другими словами, изобретение имеет отношение к препарату или к пищевой композиции, включающей в себя препарат, согласно настоящему изобретению, для применения в лечении и/или профилактике заболевания ребенка. В контексте данного изобретения ребенок находится в возрасте 0-6 лет, предпочтительно в возрасте 0-4 лет, предпочтительно в возрасте 0-2 лет, предпочтительно в возрасте 0-1 года.

Изобретение также имеет отношение к способу предоставления питания грудному ребенку, указанный способ включает в себя введение настоящего препарата или питательной композиции грудному ребенку. Другими словами, изобретение также имеет отношение к применению препарата, согласно настоящему изобретению, для получения пищевой композиции для предоставления питания грудному ребенку. То есть изобретение имеет отношение к препарату или к пищевой композиции, включающей в себя препарат согласно настоящему изобретению для применения в предоставлении питания грудному ребенку.

Настоящий препарат может быть успешно использован для увеличения Th1-ответа, уменьшения Th2-ответа, восстановления баланса Th1/Th2-ответов, поддержания благоприятного Thl/Th2 баланса и/или для лечения и профилактики нарушений, которые ассоциированы с Th1/Th2-дисбалансом. Таким образом, композиции, которые заявлены, например, для стимуляции созревания иммунной системы, увеличения устойчивости к патогенам с помощью усиления иммунной системы и/или для поддержания иммунной системы, являются частью настоящего изобретения. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения и/или профилактики нарушения иммунной системы, указанный способ включает в себя введение указанному млекопитающему композиции, включающей в себя терапевтически эффективное количество настоящего препарата. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ усиления иммунного ответа млекопитающего, указанный способ включает в себя введение млекопитающему настоящего препарата.

Иммунная система новорожденных детей характеризуется превышением Th2-ответа. Во время созревания иммунной системы Th1-ответ возрастает и баланс Th1/Th2 сдвигается к значениям, наблюдаемым у здоровых взрослых людей. Таким образом, настоящий препарат особенно полезен для грудных детей. Настоящее изобретение способствует созреванию иммунной системы грудных детей. В другом воплощении способ изобретения относится к введению настоящего препарата субъектам в возрасте от 0 до 6 лет, предпочтительно в возрасте от 0 до 4 лет, предпочтительно в возрасте от 0 до 2 лет, более предпочтительно в возрасте от 0 до 1 года. В предпочтительном воплощении настоящий способ относится к стимуляции созревания иммунной системы субъектов в возрасте 0-6 лет, предпочтительно в возрасте от 0 до 4 лет, предпочтительно в возрасте от 0 до 2 лет, более предпочтительно в возрасте от 0 до 1 года.

Избыточный Th2-ответ приводит к чрезмерной чувствительности в отношении чужеродных компонентов, которые не должны вызывать какой-либо аллергической реакции, например аллергий и связанных заболеваний, таких как атопический дерматит, астма, пищевая аллергия, аллергический ринит (например, аллергия на пыльцу), аллергия на пылевого клеща и другие формы гиперчувствительности, такие как общая анафилактическая реакция и острая крапивница. Таким образом, настоящий препарат особенно полезен для лечения и/или профилактики нарушения, выбранного из группы, включающей в себя аллергию, пищевую аллергию, атопический дерматит, астму, аллергический ринит, аллергию напылевого клеща и крапивницу. Настоящее изобретение снижает Th2-ответ.

Увеличение Th1-ответа приводит к увеличению ответа против патогенных бактерий и/или вирусов. Таким образом, настоящий препарат применим для лечения и/или профилактики инфекций. Настоящий препарат может быть эффективно использован для лечения и/или профилактики кишечных инфекций, системных инфекций и/или инфекций дыхательных путей.

Обнаружили также, что настоящий препарат может быть использован соответственно для поддержания процессов вакцинации, например усиления эффектов процесса вакцинации. Настоящий препарат применим для поддержания ответа на вакцинацию до, во время и/или после вакцинации. В частности, могут быть соответственно усилены действия вакцин дифтерийно-столбнячной, противококлюшной, полиовакцины, вакцины против кори/паротита/краснухи, пневмококковой конъюгированной вакцины, конъюгированной вакцины против гемофильной инфекции типа b, вакцин против гепатита B, гепатита A, ветрянки, гриппа. Таким образом, настоящие препараты успешно используют в лечении и/или профилактике инфекций и/или для усиления ответа на вакцинацию.

В контексте настоящего изобретения “профилактика” заболевания или определенного нарушения также означает “лечение субъекта с повышенным риском” заболевания или определенного нарушения.

Таким образом, настоящий препарат полезен для субъектов, страдающих иммунными дефицитами, в частности для пожилых людей, страдающих от "старения" иммунной системы, людей, страдающих от СПИДа или инфицированных вирусом иммунодефицита человека, и раковых пациентов, более конкретно - раковых пациентов, которые подвергаются или подвергались химиотерапии, облучению, и раковых пациентов с кахексией, пациентов, страдающих от хронического обструктивного заболевания легких, и/или пациентов, страдающих от диабета.

Пример 1. Получение инкубационной смеси с применением B. breve

Пастеризованное обезжиренное коровье молоко концентрировали выпариванием до 43% масс. сухого вещества на основе веса обезжиренного коровьего молока. Концентрат, охлажденный до 37°C, затем инокулировали 10% (об/масс.) культурой B. breve CNCM 1-2219, содержащей 3×10 КОЕ на мл. Указанный инокулят получали, как описано ниже. Начальное значение pH составляло 6-6,1. После инкубации в течение 8 часов при 37°C в резервуаре с периодическим перемешиванием в течение 10 минут каждые 2 часа значение pH сохранялось между 6-6,1, и популяция B. breve составляла 10 бактерий/мл (стадия (a)). Концентрат пастеризовали (стадия b) и затем высушивали распылением и обозначали как BbC50cf.

Инокулят получали следующим образом: стартовую культуру в форме концентрированных осадков добавляли в пастеризованное обезжиренное молоко и инкубировали в течение 8 часов при 37°C в анаэробных условиях. Во время процесса число клеток B. breve увеличивалось приблизительно до 3×10⁹ КОЕ на мл, и происходила ацидификация от значения pH 6,7 до значения pH 4,5-5,0. Соответственно присутствовал цистеин в количестве 0,1-0,5 г на л и/или дрожжевой экстракт в количестве 0,5-5 г/л водного субстрата.

Пример 2. Получение инкубационной смеси с применением S. thermophilics

Предварительно прогретый инокулят получали из культуры S. thermophilus CNCM 1-1620 путем выдерживания замороженного инокулята в течение приблизительно 7 часов при 40°C. Пастеризованный раствор лактозы (350-450 г/л) охлаждали приблизительно до 45-55°C и затем инокулировали предварительно прогретым инокулятом 10% (об/масс.) S. thermophilus CNCM 1-1620, содержащим приблизительно 3×10⁹ КОЕ на мл. Начальное значение pH составляло приблизительно pH 6. После инкубации в течение 7 часов при 50°C в резервуаре с периодическим перемешиванием в течение 10 минут каждые 2 часа значение pH поддерживали постоянным между 6 и 8 и популяция S. thermophilus составляла приблизительно 10⁶ бактерий/мл (стадия (d)). Концентрат пастеризовали (стадия e) и затем высушивали распылением и обозначали как StO65cf.

Пример 3. Синергическое действие инкубационной смеси и неперевариваемых углеводов на увеличение Th1-ответа

Способы

Действие рационов питания, включающих в себя (a) BbC50cf, приготовленные в соответствии с примером 1; (b) комбинацию галактоолигосахаридов (Elixor) и фруктоолигосахаридов (Raftilin HP); и (c) комбинацию (a) и (b), т.е. включающую в себя стадию c) настоящего способа, тестировали в мышиной модели, где ответ на антиген измеряли с помощью реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTH). Указанный DTH-ответ в ушах после местного введения антигена, представленного в вакцине, является показателем Th1-клеточной пролиферации. Во время ответа на инфекцию и/или вакцинацию Th1-клетки пролиферируют в ответ на введение антигена. Указанные Th1-клетки инфильтрируют ухо, если затем при контрольном заражении антиген вводят в ухо, и вызывают отек. Инфильтрация Th1-клетками уха занимает приблизительно 24 часа, и, следовательно, развитие отека происходит с задержкой. Чем больше Th1-клеток пролиферировало во время начальной вакцинации и/или инфекции, тем более сильную реакцию DTH наблюдают после контрольного введения антигена. BbC50cf лиофилизировали и использовали в рационе мышей в конечной концентрации 3% масс. Смесь неперевариваемых олигосахаридов (GF), включающую в себя трансгалактоолигосахариды (GOS) (источник Vivinal-GOS (Borculo Domo Ingredients, Netherlands)) и фруктоолигосахарид (FPS) (источник RaftilineHP, Orafti, Tiense, Belgium), использовали в весовом отношении GOS:FPS 9:1. Тестировали рационы питания, включающие в себя 1% масс. GF на основе общего веса рациона питания мыши. Эффекты комбинации неперевариваемых олигосахаридов и инкубационной смеси B. breve (GF плюс BbC50cf) тестировали в рационе, содержащем 1% масс. GF и 3% масс. BbC50cf на основе общего веса рациона.

Самок мышей C57B1/6 в возрасте 6 недель (Harlan Nederland BV, Horst, the Netherlands) содержали группами в условиях регулярного режима света/темноты по 12 ч. Размер групп составлял 10 животных на группу и 3 животных в группах отрицательного контроля. Животным давали полусинтетический рацион (Research Diet Services, Wijk bij Duurstede, the Netherlands). Контрольные рационы готовили в соответствии со спецификацией AIN93G (Reeves et al (1993) J Nutrition 123 (11): 1923-31), рационы с добавлением олигосахаридов были основаны на этих спецификациях. Вакцинацию начинали после периода 20 дней адаптации к новым условиям содержания и рационам. В 0-й день образец крови брали перед вакцинацией. В 1-й день первую вакцинацию проводили подкожно. После трех недель проводили вторичную вакцинацию (день 22). Через 9 дней после инъекции вторичной вакцинации (день 31) исходную толщину уха измеряли наружным микрометром (Mitutoyo, Veenendaal, the Netherlands) и реакцию гиперчувствительности замедленного типа (DTH) вызывали в/к (внутрикожной) инъекцией раствора антигена в ушные козелки. Через 24 ч (день 32) измеряли реакцию DTH, брали образец крови и умерщвляли мышей. Реакцию DTH измеряли как разность толщины уха через 24 часа после пробы и толщины уха в момент времени t=0.

Вакцинации состояли из 100 мкл в/к (внутрикожных) инъекций смеси 1:1 раствора антигена и адъюванта Stimune (Specol, Cedi-diagnostics BV, Lelystad, the Netherlands). Раствор антигена представлял собой разведение 1:100 Influvac 2002/2003 (Solvay Pharmaceuticals, Weesp, the Netherlands) в PBS. Influvac представляет собой трехвалентную белковую вакцину, содержащую 3×30 мкг/мл гемагглютинина трех различных штаммов гриппа. Для реакции DTH мышам вводили в/к 25 мкл диализированной вакцины Influvac в оба уха в качестве провокационной пробы DTH.

Результаты

Рационы, включающие в себя дозы 1% масс. GF или 3% масс. BbC50cf, - оба вызывали небольшое статистически незначимое увеличение ответа DTH. Комбинация 1% масс. GF и 3% масс. BbC50cf вызывала статистически значимое увеличение реакции DTH на 89% (см. таблицу 1). Поскольку указанный эффект значительно выше, чем реакции DTH при рационах, содержащих только олигосахариды, и также значительно выше, чем аддитивный эффект GF и BbC50cf, который может быть рассчитан как 49% увеличение DTH, указанные результаты свидетельствуют о синергическом эффекте, обеспечиваемом введением неперевариваемых олигосахаридов и BbC50cf, на увеличение Th1-ответа. Наблюдаемый эффект является показателем успешного применения комбинации по меньшей мере двух различных неперевариваемых углеводов и продукта, полученного при инкубации водного субстрата с бифидобактериями, с последующим нагреванием инкубационной смеси и/или удалением клеток бифидобактерий с помощью центрифугирования и/или центрифугирования в настоящих применениях.

Таблица 1
Реакция DTH
Группа	Среднее значение DTH, мкм (Ст.ошибка)	ΔDTH, мкм	Относительное значение DTH
Симуляция	-1,7(4,6)	0	0
Плацебо	67,6 (14,9)	69,3	1,00
GF	73,55 (8,6)	75,25	1,09
BbC50cf	95,55 (5,5)	97,25	1,40
GF+BbC50cf	129,4* (17,1)	131,1	1,89
GF+BbC50cf теоретически	101,50	103,2	1,49
Достоверно отличается от контроля (P<0,01).

Результаты данного эксперимента являются свидетельством того, что настоящее изобретение может быть успешно использовано для поддержки ответа на вакцинацию. Результаты данного эксперимента также являются свидетельством того, что настоящее изобретение может быть успешно использовано у субъектов с низким Th1-ответом, в особенности, у грудных детей. Результаты данного эксперимента также являются свидетельством того, что настоящее изобретение может быть успешно использовано у субъектов с низким Th1-ответом, в особенности у пожилых, страдающих или имеющих высокий риск развития "старения" иммунной системы, пациентов с HIV, пациентов со СПИДом и/или раковых пациентов, которые подвергались или подвергаются химиотерапии и/или облучению, или пациентов с кахексией, пациентов, страдающих от COPD, и/или пациентов, страдающих от диабета. Указанная модель показывает основные иммунологические изменения, которые могут быть благоприятны при всех нарушениях в случае дисфункции иммунной системы. Известно, что иммунная система грудных детей, пожилых людей, инфицированных HIV субъектов, раковых пациентов, пациентов с COPD и/или пациентов с диабетом не функционирует в полную силу. Для всех перечисленных субъектов указанное выше является дополнительной помощью с возможным полезным действием.

Пример 4. Улучшенное действие инкубационных смесей, полученных с B. breve и S. Thermophilus, и неперевариваемых углеводов на увеличение Th1-ответа

Методы

Эффект рационов, содержащих (a) BbC50cf (3% масс.), полученного в соответствии с примером 1, и комбинации галактоолигосахаридов (Elixor) и фруктоолигосахаридов (Raftilin HP); (b) BbC50cf (3% масс.), полученного в соответствии с примером 1, и StO65cf (3% масс.), полученного в соответствии с примером 2 и (c) комбинации BbC50 (3% масс.), StO65f (3% масс.) и галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов, проверяли в отдельном эксперименте с использованием такой же мышиной модели, как в примере 3. Галактоолигосахариды (Elixor) и фруктоолигосахариды (Raftilin HP) (GF) представлены в весовом отношении 9:1 и составляют 1% масс. исходя из общего веса рациона.

Результаты

Рационы, содержащие комбинацию 1% масс. GF и 3% масс. BbC 50cf вызывали статистически значимое увеличение на 100% реакции DTH (см. таблицу 2).

Комбинация BbC50cf и StO65cf также вызывала статистически значимое увеличение на 112% реакции DTH.

К удивлению авторов изобретения комбинация всех трех ингредиентов показала наиболее сильное увеличение реакции на 192%.

Указанные результаты свидетельствуют об улучшенном действии, обеспечиваемом введением неперевариваемых олигосахаридов плюс BbC50cf и StO65cf, на увеличение Th1-ответа. Наблюдаемый эффект является показателем успешного применения комбинации i) по меньшей мере двух различных неперевариваемых углеводов, ii) продукта, полученного при инкубировании водного субстрата с бифидобактериями с последующим инактивированием с помощью нагревания инкубационной смеси и/или удаления клеток бифидобактерий с помощью центрифугирования и/или центрифугирования и iii) продукта, полученного при инкубировании водного субстрата со стрептококками с последующим инактивированием с помощью нагревания инкубационной смеси и/или удаления клеток стрептококков с помощью центрифугирования и/или центрифугирования согласно настоящему изобретению.

Таблица 2
Реакция DTH
Группа	Среднее значение DTH, мкм (Ст.ошибка)	ΔDTH, мкм	Относительное значение DTH
Симуляция	24,3 (0,6)	0	0
Плацебо	66,5 (0,3)	42,2	1,00
BbC50cf+GF	108,9(0,3)*	84,6	2,00
BbC50cf+StO65cf	113,6(0,3)*	89,3	2,12
BbC50cf+GF+StO65cf	147,6 (0,2)*^a	123,2	2,92
*p<0,05 по сравнению с плацебо ap<0,05 по сравнению с Bbc50f+GF и с Bbc50f+StO65cf

Пример 5. Синергическое действие инкубированного продукта и непервариваемых углеводов на снижение Th2-ответа

Методы

Эффект рационов, содержащих (a) BbC50cf, полученный в соответствии с примером 1; (b) комбинации неперевариваемых углеводов (GF), содержащих галактоолигосахариды (Elixor) и фруктоолигосахариды (Raftilin HP); и (c) комбинацию (a) и (b), т.е. включающих в себя стадию c) настоящего способа проверяли на мышиной модели, в которой ответ на аллерген оценивают с помощью реакции гиперчувствительности немедленного типа (ITH). Указанная реакция ITH в ушах после контрольного введения аллергена в легкие является показателем увеличения Th2-ответа. Во время реакции на аллерген в легких тучные клетки практически немедленно дегранулируют системно, включая уши. Указанные реакции вовлекают IgE, который, в свою очередь, требует Th2-ответа во время развития хелперной Т-клетки. Поэтому усиленная реакция ITH является показателем увеличения IgE и, таким образом, увеличения Th2-ответа. Свободных от особых патогенов самцов мышей породы BALB/c получали от Charles River (Maastricht, the Netherlands). Пищу и воду предоставляли ad libitum и в эксперименте участвовали мыши в возрасте 6-9 недель. Яичный альбумин (категория V) и ацетил-β-метилхолина хлорид (метахолин) приобретали в Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Гидроксид алюминия (Alumlmject) приобретали в Pierce (Rockford, IL, USA). Аналогичные рационы, как в примере 2, тестировали в течение 14 дней перед сенсибилизацией OVA до конца эксперимента. Мышей сенсибилизировали двумя в/к инъекциями 10 мкг яичного альбумина, адсорбированного на 2,25 мг гидроксида алюминия в 100 мкл физиологического раствора, или вводили только физиологический раствор в дни 0 и 7. Мышам вводили провокационную пробу в дни 35, 38 и 41 с помощью ингаляции аэрозоля яичного альбумина в плексигласовой камере для воздействия в течение 20 минут. Аэрозоли создавали путем распыления раствора яичного альбумина (10 мг/мл) в физиологическом растворе с использованием аэрозольного аппарата Pari LC Star (Pari respiratory Equipment, Richmond, VA, USA). Реакцию ITH оценивали через 1 час после провокационной пробы с аллергеном яичным альбумином.

Результаты

Результаты ITH представлены в таблице 3.

Таблица 3
Реакция ITH
Группа	Среднее значение ITH, мкм (Ст.ошибка)	ΔITH, мкм	Относительное значение ITH
Контроль	104,3 (3,8)	0	0
Placebo	184,7(8,7)	80,4	1
GF	159,8(17,9)*	55,5	0,69
BbC50cf	173,1 (20,3)	68,8	0,86
GF+BbC50cf	136,6(14,4)**	32,3	0,40
GF+BbC50cf теоретически	151,7	47,4	0,59
достоверно отличается от контроля (P<0,05 и **P<0,01).

Рационы, содержащие дозы 1% масс. GF или 3% масс. BbC50cf, - оба вызывали небольшое увеличение реакции ITH. Комбинация 1% масс. GF и 3% масс. BbC50cf вызывала статистически достоверное снижение приблизительно на 60% реакции ITH (см. таблицу 3). Поскольку указанный эффект значительно выше, чем реакции FTH при рационах, содержащих только олигосахариды, и также значительно выше, чем аддитивный эффект GF и BbC50cf, который может быть рассчитан как 40%-ное снижение ITH, указанные результаты свидетельствуют о синергическом эффекте, обеспечиваемом введением неперевариваемых олигосахаридов и BbC50cf, на уменьшение Th2-ответа.

Наблюдаемый эффект свидетельствует об эффективном использовании комбинации неперевариваемых углеводов и продукта, полученного путем инкубирования субстрата с бифидобактериями и последующего инактивирования и/или удаления бифидобактерий в настоящих применениях. Результаты указанного эксперимента показывают, что настоящее изобретение может быть успешно использовано для профилактики и/или лечения, в частности, астмы, аллергии, атопического дерматита, аллергического конъюнктивита, аллергии на пылевого клеща, крапивницы и аллергического ринита.

Пример 6. Молочная смесь для детского питания

Молочную смесь для детского питания получали путем смешивания следующих ингредиентов: деминерализованной молочной сыворотки, растительного жира, лактозы, обезжиренного молока, неперевариваемых углеводов, концентрата молочного белка, рыбьего жира, микроэлементов, витаминов.

Обезжиренное молоко предварительно инкубируют таким же образом, как описано в примере 1.

Концентрация препарата, полученного с помощью инкубирования с Bifidobacterium breve на стадиях a) и b), составляла 15,6% масс. исходя из сухого веса детской смеси. В конечном продукте живые бифидобактерии не обнаружены.

Конечная композиция детской смеси включала в себя на 100 мл:

- 66 ккал

- 1,3 г белок молока (казеин и белок молочной сыворотки)

- 7,3 г перевариваемые углеводы (преимущественно лактоза)

- 35 г жиры (преимущественно растительные жиры)

- 0,8 г транс-галактолигосахариды (источник Vivinal GOS) и полифруктоза (источник raftilinHP)

элементы, содержащиеся в небольших количествах, микроэлементы, витамины и другие питательные микроэлементы, которые известны в данной области техники.

Молочная смесь для детского питания, как заявлено, усиливает иммунную систему и/или снижает частоту возникновения атопической экземы, и/или уменьшает частоту возникновения инфекций, и/или уменьшает частоту возникновения аллергии.

Пример 7. Молочная смесь для детского питания

Пастеризованное обезжиренное коровье молоко концентрировали выпариванием приблизительно до 43% масс. сухого вещества исходя из веса обезжиренного коровьего молока. Концентрат охлаждали приблизительно до 37°C, затем инокулировали 10% (об/масс.) B. breve CNCM 1-2219 культурой, содержащей 3×10 КОЕ на мл. Указанный инокулят получали, как известно в данной области техники. Начальное значение pH составляло 6-7,1. После инкубации в течение 8 часов при 37°C в резервуаре с периодическим перемешиванием в течение 10 минут каждые 2 часа значение pH сохранялось между 6 и 7,1, и популяция B. breve составляла 10⁶ бактерий/мл (стадия (a)).

Предварительно прогретый инокулят получали из культуры S. thermophilus CNCM 1-1620, выдерживая замороженный инокулят в течение 7 часов при температуре приблизительно 40°C. Пастеризованный раствор лактозы (от 350 до 450 г/л) охлаждали приблизительно до 45-55°C и затем инокулировали предварительно прогретым инокулятом 10% (об/масс.) S. thermophilus CNCM 1-1620, содержащим 3×10 КОЕ на мл. Исходное значение pH составляло 6. После инкубации в течение приблизительно 7 часов при 50°C в резервуаре с периодическим перемешиванием в течение 10 минут каждые 2 часа значение pH поддерживали постоянным между 6 и 8, популяция S. thermophilus составляла 10⁶ бактерий/мл (стадия (d)).

Смешивали оба инкубированных препарата, обезжиренное молоко, растительный жир, мальтодекстрин, трансгалактоолигосахариды и фруктоолигосахариды и другие ингредиенты, хорошо известные для молочной смеси для детского питания (такие как витамины, микроэлементы, элементы, содержащиеся в небольших количествах) (стадия c, f). Смесь пастеризовали (стадия b, e) и затем высушивали распылением.

- 68 ккал

- 1,45 г белок (казеин и белок молочной сыворотки, частично гидролизованный)

- 8,6 г перевариваемые углеводы (преимущественно лактоза и мальтодекстрин)

- 3,1 г жиры (преимущественно растительные жиры)

- 0,8 г транс-галактоолигосахариды (источник VivinalGOS) и полифруктоза (источник raftilinHP)

- элементы, содержащиеся в небольших количествах, микроэлементы, витамины и другие питательные микроэлементы (таурин, холин, инозитол, нуклеотиды, карнитин), которые известны в данной области техники.

Claims

1. Способ получения препарата, подходящего для применения в питании, включающий в себя стадии:
- a: инкубирования водного субстрата с Bifidobacteria, где субстрат включает в себя по меньшей мере один субстрат, выбранный из группы, состоящей из следующих: молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу для получения инкубационной смеси;
- b: инактивирование Bifidobacteria путем нагревания инкубационной смеси и/или удаления клеток Bifidobacteria из инкубационной смеси с помощью центрифугирования и/или фильтрования;
- c: объединение композиции, содержащей смесь, полученную на стадии a непосредственно перед стадией b или полученную на стадии b, по меньшей мере с двумя различными неперевариваемыми углеводами, выбранными из группы, состоящей из следующих: фруктоолигосахариды и галактоолигосахариды, где Bifidobacteria принадлежит к виду В. breve.

2. Способ по п.1, где Bifidobacteria принадлежат к виду В. breve CNCM 1-2219.

3. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий в себя стадии:
d: инкубирование субстрата с Streptococcus thermophilus, предпочтительно штамм S. thermophilus CNCM 1-1620, где субстрат выбран из группы, состоящей из следующих: молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, казеин, гидролизат казеина и лактозу, для получения инкубационной смеси, и
e: инактивирование S. thermophilus путем нагревания инкубационной смеси стадии d и/или удаления клеток S. thermophilus из инкубационной смеси стадии d с помощью центрифугирования и/или фильтрования,
f: объединение инкубационной смеси, полученной на стадии d или e, предпочтительно на стадии d, с инкубационной смесью, полученной на стадии a, b или c, предпочтительно на стадии а.

4. Способ по п.1, где препарат после стадии b содержит менее 10³ КОЕ живых Bifidobacteria на г сухого веса препарата.

5. Способ по п.1, где на стадии a субстрат инокулируют с помощью Bifidobacteria в количестве от 1×10² до 1×10¹¹ КОЕ на мл субстрата, где субстрат характеризуется значением pH от 4 до 8 и где инкубация происходит при температуре от 20°C до 50°C по меньшей мере в течение 2 часов.

6. Способ по п.1, где стадия b включает в себя удаление клеток Bifidobacteria с помощью центрифугирования и/или фильтрования.

7. Способ по п.1, где стадия b включает в себя инактивацию с помощью тепловой обработки в течение по меньшей мере 5 минут при температуре выше 50°C.

8. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя стадию высушивания.

9. Способ по п.1, где на стадии a субстрат одновременно инкубируют с Streptococcus thermophilus.

10. Способ по п.3, где на стадии d субстрат инокулируют с помощью Streptococci в количестве от 1×10² до 1×10¹¹ КОЕ на мл субстрата, где субстрат характеризуется значением pH от 4 до 8 и где инкубация происходит при температуре от 20°C до 50°C по меньшей мере в течение 2 часов.

11. Способ по п.3, где стадия е включает в себя удаление клеток Bifidobacteria и/или Streptococci с помощью центрифугирования и/или фильтрования.

12. Способ по п.3, где стадия е включает в себя инактивацию с помощью тепловой обработки в течение по меньшей мере 5 минут при температуре выше 50°C.

13. Препарат, подходящий для применения в питании, полученный способом по любому из предшествующих пунктов.

14. Пищевая композиция, включающая в себя или состоящая из препарата по п.13.

15. Композиция по п.14, включающая в себя от 0,5 до 10 г неперевариваемого углевода на 100 г сухого веса композиции.

16. Композиция по любому из пп.14 или 15, характеризующаяся вязкостью от 1 до 60 мПа·с при скорости сдвига 100 с^-1 при 20°C.

17. Композиция детского питания, содержащая исходя из сухого веса детского питания
a. от 0,5 до 10% масс. суммарного количества галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов, и
b. от 5 до 99,5% масс. препарата, полученного после стадий a) и b) в соответствии с любым из пп.1, 2, 4-9, где Bifidobacteria на стадии а принадлежат к виду В. breve,
c. и необязательно от 2 до 94,5% масс. препарата, полученного после стадий d) и e) в соответствии с любым из пп.3, 10-12.

18. Применение композиции по любому из пп.14 или 17 в обеспечении питания для грудного ребенка.

19. Применение композиции по любому из пп.14 или 17 в увеличении Th1-ответа, уменьшении Тh2-ответа, улучшении баланса Th1/Th2-ответов или лечении и/или профилактики нарушений, которые ассоциированы с Th1/Th2-дисбалансом.

20. Применение композиции по любому из пп.14 или 17 для одного из следующих:
- увеличение Th1-ответа,
- уменьшение Th2-ответа,
- улучшение Th1/Th2-баланса,
в лечении и/или профилактики нарушений, которые ассоциированы с Th1/Th2-дисбалансом, у ребенка.