PT1996621E - Anticorpos contra o péptido beta-amilóide - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS CONTRA O PÉPTIDO BETA-AMILÓIDE"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam ao péptido β-amilóide e, em particular, péptido β-amilóide humano. A presente invenção refere-se, igualmente, a métodos de tratamento de doenças ou distúrbios caracterizados por elevados niveis de β-amilóide ou depósitos de β-amilóide, particularmente doença de Alzheimer, com os referidos anticorpos, composições farmacêuticas compreendendo os referidos anticorpos e métodos de preparação. Outros aspectos da presente invenção irão ser evidentes a partir da descrição abaixo.

Antecedentes da invenção A doença de Alzheimer (AD) é a causa mais comum de declínio cognitivo relacionado com a idade, afectando mais de 12 milhões de indivíduos no mundo inteiro (Citron M (2002) Nat. Neurosci 5, Supl. 1055-1057). Os estádios mais precoces da doença são caracterizados por uma perda progressiva de memória, com declínio cognitivo e défices de linguagem e comportamentais associados. Nos estádios mais tardios da doença, os doentes desenvolvem amnésia global e têm a função motora grandemente reduzida. A morte, tipicamente, ocorre 9 anos após o diagnóstico e é frequentemente associada a outros estados, tipicamente pneumonia (Davis K.L. e Samules S.C. (1998) in Pharmacological 1

Management of Neurological and Psychiatric Disorders ed. Enna S.J. e Coyle J.T. (McGraw-Hill, Nova Iorque pp267-316)). As terapias actuais representam abordagens sintomáticas, centrando-se no alivio da disfunção cognitiva e melhoramento dos sintomas comportamentais associados à etiologia da doença progressiva. Na prática, estes tratamentos proporcionam apenas um beneficio cognitivo de curta vida, com o nivel de disfunção cognitiva referido apenas como durando até 2 anos. É enorme o potencial para uma terapia de modificação de doença que abrande e, possivelmente, interrompa a progressão da doença. Tais abordagens proporcionariam melhoramentos radicais e sustentados da qualidade de vida dos doentes e, facto importante, dos seus cuidadores, assim como a redução dos imensos custos globais dos serviços médicos desta doença. 0 diagnóstico clinico da doença de Alzheimer é baseado numa combinação de testes fisicos e mentais que conduzem a um diagnóstico possível ou provável de doença de Alzheimer. No post mortem, a doença é confirmada por traços distintivos bem caracterizados no cérebro, que incluem a deposição de Αβ em placas parenquimatosas e vasos cerebrais, formação intraneuronal de feixes neurofibrilares, perda sináptica e perda de subpopulações neuronais em regiões específicas do cérebro (Terry, RD (1991) J Neural Trans Suppl 53: 14. 1-145).

Uma pletora de evidência genética, histológica e funcional sugere que o péptido β-amilóide (Αβ) é chave para a progressão da doença de Alzheimer (Selkoe, D. J. (2001) Physiological Reviews 81: 741-766).

Sabe-se que ο Αβ é produzido através da clivagem da proteína precursora de beta-amilóide (igualmente conhecida como 2 APP) por uma enzima aspartil-protease, conhecida como BACE1 (igualmente conhecida como β-secretase, Asp2 ou Memapsina-2) (De Strooper, B. e Konig, G. (1999) Nature 402: 471-472). Adicionalmente à deposição parenquimatosa e vascular, foi postulado que formas oligoméricas solúveis de Αβ contribuem para o começo de AD e podem afectar a função neuronal inicialmente por disfunção da função sináptica (Lambert et al. (1998) Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A. 95: 6448-6453). Embora se verifiquem placas amilóides insolúveis no começo de AD e em MCI, os níveis de agregados de Αβ solúveis (designados por oligómeros ou ligandos difusíveis derivados de Αβ (ADDL)) estão igualmente aumentados nestes indivíduos e os níveis de Αβ solúvel correlacionam-se melhor com degenerescência neurofibrilar e a perda de marcadores sinápticos do que o fazem as placas amilóides (Naslund et al. (2000) J Am Med Assoe 283: 1571-1577, Younkin, S. (2001) Nat. Med. 1: 8-19). Ο Αβ42 altamente amiloidogénico e as formas aminoterminalmente truncadas Αβχ-42 são as espécies predominantes de Αβ verificadas tanto em placas difusas como senis (Iwatsubo, T (1994) Neuron. 13:45-53, Gravina, SA (1995) J. Biol. Chem. 270:7013-7016). Os níveis relativos de Αβ42 parecem ser o regulador chave da agregação de Αβ em placas de amilóide, de facto foi demonstrado que ο Αβ42 se agrega mais facilmente in vitro do que outras formas de Αβ (Jarrett, JT (1993) Biochemistry 32:4693-4697) e, como tal, Αβ42 foi implicada como a molécula de iniciação na patogénese de AD (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289-292). Embora Αβ42 seja um produto menor do metabolismo de APP, pequenos desvios na sua produção estão associados a grandes efeitos sobre a deposição de Αβ, por conseguinte, foi postulado que a redução apenas de Αβ42 pode ser uma forma eficaz de tratamento de AD (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289-292). Em favor disto, foi referido que mutações na 3 proteína precursora de amilóide (APP) e em genes de presenilina aumentam predominantemente os níveis relativos de Αβ42 e, por conseguinte, encurtando o tempo para o começo da doença de Alzheimer (AD) (Selkoe D.J., Podlisny M.B. (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Gemet. 3:67-99). Contudo, deve ser notado que a velocidade de deposição é, igualmente, dependente do catabolismo e eliminação de Αβ.

Foram gerados modelos animais de deposição de amilóide por superexpressão de transgenes humanos mutantes em murganhos. Murganhos superexpressando transgenes únicos de APP humanos tipicamente desenvolvem, desde os 12 meses de idade, depósitos de β-amilóide semelhantes a placa cerebral (Games D. et al., (1995) Nature 373: 523-527; Hsiao K. et al., (1996) Science 274: 99-102)), enquanto murganhos transportando transgenes mutantes humanos tanto de APP como presenilina-1 (PS-1), tipicamente desenvolvem depósitos de β-amilóide semelhantes a placa cerebral, tão cedo quanto 2 meses de idade (Kurt M.A. et al., (2001) Exp. Neurol. 171: 59-71; McGowan E. et al., (1999) Neurolbiol. Dis. 6: 231-244.

Tornou-se cada vez mais evidente que o transporte de Αβ exógeno entre o sistema nervoso central (CNS) e o plasma desempenha um papel na regulação de níveis de amilóide do cérebro (Shibata, et al. (2000) J Clin Invest 106: 1489-1499), com CSF Αβ sendo rapidamente transportado do CSF para o plasma. Por conseguinte, a vacinação activa com péptidos Αβ ou administração passiva de anticorpos específicos de Αβ rapidamente liga Αβ periférico, alterando o equilíbrio dinâmico entre o plasma, CSF e, por fim, o CNS. De facto existe, agora, uma pletora de estudos demonstrando que ambas estas abordagens podem baixar os níveis de Αβ, reduzir a patologia de Αβ e 4 proporcionar benefício cognitivo em diversos modelos transgénicos de amiloidose. Foram, igualmente, conduzidos estudos limitados em espécies superiores. Macacos vervet caribenhos (16-10 anos de idade) foram imunizados com péptido Αβ durante 10 meses. Os níveis de Αβ40 no plasma foram elevados 2-5 vezes, os quais alcançaram um pico a 251 d, enquanto os níveis de CSF de Αβ40 e Αβ42 foram significativamente diminuídos em 100 d e regressaram, a seguir, para a linha base. Esta redução em CSF foi acompanhada de uma redução significativa em carga de placa (Lemere, CA (2004) Am j Pathology 165: 283-297). Foram igualmente detectados aumentos semelhantes nos níveis de Αβ no plasma, após imunização de Macacos Rhesus idosos (15-20 anos de idade) (Gandy. S (2004) Alzheimer Dis Assoe Disord 18: 44:46. A primeira terapia imune visando o amilóide do cérebro foi AN-1792 de Elan/Wyeth, uma vacina activa. Este tratamento foi terminado após o desenvolvimento de sinais clínicos consistentes com meningoencefalite. Análises de subgrupo sugeriram que o tratamento abrandou o declínio da função cognitiva (Nature Clin Pract Neural (2005) 1:84-85). A análise post mortem de doentes mostrou, igualmente, evidência de eliminação de placa (Gilman S. et al., (2005) Neurology 64 (9) 1553-1562). Demonstrou-se que o Bapineuzumab (AAB-001, Elan/Wyeth), uma terapia com MAb passiva, melhora significativamente os resultados de cognição num pequeno estudo de segurança de fase I. São conhecidos na técnica numerosos anticorpos que se ligam a péptidos β-amilóide. Por exemplo, o documento W02004/080419 divulga um anticorpo monoclonal 3D6 que se liga a um epitopo de Amilóide β que se localiza na extremidade N-terminal do péptido. 5 A substituição do primeiro aminoácido do referido péptido resultou em ligação por 3D6 com afinidade reduzida.

Outras doenças ou distúrbios caracterizados por niveis de β-amilóide ou depósitos de β-amilóide elevados incluem disfunção cognitiva moderada (MCI, Blasko I (2006) Neurobiology of aging "Conversion from cognitive health to mild cognitive impairment and Alzheimer's disease: Prediction by plasma amyloid beta 42, medial temporal lobe atrophy and homocysteine" no prelo, publicado electronicamente a 19 de Out de 2006), hemorragia cerebral hereditária com β-amiloidose do tipo Holandês, angiopatia β-amilóide cerebral e diversos tipos de demências degenerativas, tais como aquelas associadas à doença de Parkinson, paralisia supranuclear progressiva, degenerescência basal cortical e doença de Alzheimer do tipo de corpos de Lewis difuso (Mollenhauer B (2007) J Neural Transm) publicado electronicamente a 23 de Fevereiro de 2007, van Oijen, M Lancet Neurol. 2006 5: 655-60) e síndrome de Down (Mehta, PD (2007) J Neural Sei. 254: 22-7).

Sumário da invenção

Numa forma de realização da invenção, é proporcionado um anticorpo terapêutico compreendendo uma cadeia VH tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 26, 28 ou 30 e um domínio VL tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 32.

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um anticorpo terapêutico, anticorpo que compreende uma cadeia pesada tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 34, 36 ou 38 e uma cadeia leve tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 40. 6

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo terapêutico de acordo com invenção. É, igualmente, proporcionado um anticorpo terapêutico de acordo com a invenção para utilização no tratamento de uma doença relacionada com o péptido β-amilóide.

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um processo para a preparação de um anticorpo terapêutico de acordo com invenção, processo que compreende a expressão de polinucleótido codificando o anticorpo numa célula hospedeira.

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um polinucleótido codificando uma cadeia pesada de anticorpo terapêutico, compreendendo uma cadeia VH tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 26, 28 ou 30.

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um polinucleótido codificando uma cadeia leve de anticorpo terapêutico, compreendendo um domínio VL tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 32.

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um polinucleótido codificando uma cadeia pesada de anticorpo terapêutico, tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 34, 36 ou 38.

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um polinucleótido codificando uma cadeia leve de anticorpo terapêutico, tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 40. 7

Numa forma de realização mais particular da invenção, é proporcionado um polinucleótido codificando uma cadeia pesada de anticorpo terapêutico, polinucleótido que compreende a sequência apresentada na SEQ ID N° 35, 37, 39 ou 42.

Noutra forma de realização mais particular da invenção, é proporcionado um polinucleótido codificando uma cadeia leve de anticorpo terapêutico, polinucleótido que compreende a sequência apresentada na SEQ ID N° 41 ou 43.

Numa particular forma de realização, o anticorpo terapêutico, que é um anticorpo ou fragmento e/ou derivado deste, essencialmente carece das funções de a) activação de complemento pela via clássica; e fc>) mediação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo.

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um anticorpo ou um fragmento deste, compreendendo um domínio VH tendo a sequência: SEQ ID N° 17 e um dominio VL tendo a sequência: SEQ ID N° 19.

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um polinucleótido codificando uma cadeia pesada de anticorpo ou um fragmento desta, compreendendo um dominio VH tendo a sequência SEQ ID N° 17, em particular o polinucleótido de SEQ ID N° 18.

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um polinucleótido codificando uma cadeia leve de anticorpo ou um fragmento desta, compreendendo um dominio vL tendo a sequência SEQ ID N° 19, em particular o polinucleótido de SEQ ID N° 20.

Formas de realização preferidas da invenção são abaixo descritas ou são definidas nas sub-reivindicações.

Descrição Detalhada da Invenção 1. Estruturas de Anticorpo 1.1 Anticorpos Intactos

Os anticorpos intactos são, habitualmente, glicoproteinas heteromultiméricas compreendendo, pelo menos, duas cadeias pesadas e duas leves. Além da IgM, os anticorpos intactos são glicoproteinas heterotetraméricas de, aproximadamente, 150 kDa, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Tipicamente, cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfureto covalente, enquanto o número de ligações dissulfureto entre as cadeias pesadas de isótopos de imunoglobulina diferentes varia. Cada cadeia pesada e leve tem, igualmente, pontes dissulfureto intracadeias. Cada cadeia pesada tem, numa extremidade, um domínio variável (VH) seguido de um certo número de regiões constantes. Cada cadeia leve tem um dominio variável (VL) e uma região constante na sua outra extremidade; a região constante da cadeia leve está alinhada com a primeira região constante da cadeia pesada e o dominio variável de cadeia leve está alinhado com o dominio variável da cadeia pesada. Com base na sequência de aminoácidos da região constante, as cadeias leves de anticorpos da maioria das espécies de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos denominados Kappa e Lambda. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante das suas cadeias pesadas, os anticorpos humanos podem ser atribuídos 9 a cinco classes diferentes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgG e IgA podem ser adicionalmente subdivididos em subclasses, IgGl, lgG2, IgG3 e lgG4 e igAl e lgA2. Existem variantes de espécie, com murganho e rato tendo, pelo menos, IgG2a, IgG2b. 0 domínio variável do anticorpo confere especificidade de ligação ao anticorpo, com determinadas regiões exibindo particular variabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR). As porções mais conservadas da região variável são denominadas regiões de estrutura (FR). Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve intactas compreendem, cada, quatro FR ligadas por três CDR. As CDR em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade imediata pelas regiões FR e, com as CDR da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antigénio dos anticorpos. As regiões constantes não estão directamente envolvidas na ligação do anticorpo ao antigénio mas exibem diversas funções efectoras, tais como participação em citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose por meio de ligação a receptor Fcy, razão tempo meia-vida/eliminação por meio de receptor Fc neonatal (FcRn) e citotoxicidade dependente de complemento por meio do componente Clq da cascata de complemento. A região constante de lgG2 humana carece da capacidade para activar o complemento pela via clássica ou para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo. A região constante de IgG4 carece da capacidade para activar o complemento pela via clássica e medeia, apenas fracamente, a citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Anticorpos essencialmente carecendo destas funções efectoras podem ser designados anticorpos "não líticos". 10 1.1.1 Anticorpos humanos

Os anticorpos humanos podem ser produzidos por um certo número de métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. Os anticorpos humanos podem ser preparados pelo método de hibridoma utilizando linhas celulares de mieloma humano ou de heteromieloma murganho-humano, ver Kozbor J. Immunol 133, 3001, (1984) e Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63 (Mareei Dekker Inc, 1987) . Métodos alternativos incluem a utilização de bibliotecas de fagos ou murganhos transgénicos, ambos os quais utilizam repertórios de região V humana (ver Winter G, (1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J. Immunol. methods 231, 11-23).

Estão, agora, disponíveis diversas estirpes de murganhos transgénicos, nas quais os seus loci de imunoglobulina de murganho foram substituídos por segmentos génicos de imunoglobulina humana (ver Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15, 146-156). Após provocação de antigénio, tais murganhos são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, dos quais podem ser seleccionados anticorpos de interesse.

De particular nota e o sistema Trimera (ver Eren R et al., (1998) Immunology 93:154-161) onde linfócitos humanos são transplantados para murganhos irradiados, o Sistema de Anticorpo de Linfócito Seleccionado (SLAM, ver Babcook et al., PNAS (1996) 93:7843-7848), onde linfócitos humanos (ou de outra espécie) são eficazmente submetidos a um processo de geração de anticorpo in vitro agregado massivo, seguido de processo desconvolado de diluição limitante e selecção e o Xenomouse II™ (Abgenix Inc) . 11

Uma abordagem alternativa está disponível de Morphotek Inc, utilizando a tecnologia Morphodoma™. A tecnologia de apresentação de fago pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos (e fragmentos destes), ver McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990) e Griffiths AD et al. (1994) EMBO 13:3245-3260. De acordo com esta técnica, genes de domínio V de anticorpo são clonados, em fase, num revestimento maior ou menor de gene de proteína de um bacteriófago filamentoso, tais como Ml3 ou fd, e apresentados (habitualmente com o auxílio de um fago auxiliador) como fragmentos de anticorpo funcionais sobre a superfície da partícula de fago. As selecções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo resultam em selecção do gene codificando o anticorpo exibindo aquelas propriedades. A técnica de apresentação de fago pode ser utilizada para seleccionar anticorpos específicos de antigénios de bibliotecas, preparadas a partir de células B humanas retiradas de indivíduos acometidos com uma doença ou um distúrbio descrito anteriormente ou, alternativamente, de dadores humanos não imunizados (ver Marks; J. Mol. Bio. 222, 581-597, 1991) . Se for desejado um anticorpo humano intacto compreendendo um domínio Fc, é necessário reclonar o fragmento derivado de fago, apresentado num vector de expressão de mamífero compreendendo as regiões constantes desejadas e estabelecer linhas celulares de expressão estável. A técnica de maturação de afinidade (Marks; Bio/technol 10, 779-783 (1992)) pode ser utilizada para melhorar a afinidade de ligação, em que a afinidade do anticorpo humano primário é melhorada por substituição sequencial das regiões V de cadeias L e H com variantes de ocorrência natural e seleccionando com base em afinidades de ligação melhoradas. Variantes desta técnica, 12 tal como "impressão de epitopo" estão agora, igualmente, disponíveis, ver o documento WO 93/06213. Ver, igualmente, Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993). 1.2 Anticorpos Humanizados e Quiméricos A utilização de anticorpos intactos não humanos no tratamento de doenças ou distúrbios humanos traz consigo os problemas agora bem estabelecidos de imunogenicidade potencial, especialmente sob administração repetida do anticorpo, isto é, o sistema imunitário do doente pode reconhecer o anticorpo intacto não humano como não próprio e montar uma resposta neutralizante. Adicionalmente ao desenvolvimento de anticorpos totalmente humanos (ver anteriormente), ao longo dos anos foram desenvolvidas diversas técnicas para superar estes problemas e envolvem, em geral, a redução da composição de sequências de aminoácidos não humanas no anticorpo terapêutico intacto retendo, simultaneamente, a facilidade relativa na obtenção de anticorpos não humanos de um animal imunizado, e. g., murganho, rato ou coelho. Em traços largos, foram utilizadas duas abordagens para alcançar isto. A primeira são anticorpos quiméricos, que geralmente compreendem um domínio variável não humano (e. g., roedor, tal como murganho) fundido a uma região constante humana. Em virtude de o sítio de ligação de antigénio de um anticorpo estar localizado dentro das regiões variáveis, o anticorpo quimérico retém a sua afinidade de ligação para o antigénio mas adquire as funções efectoras da região constante humana e é, por conseguinte, capaz de realizar funções efectoras, tais como as descritas supra. Os anticorpos quiméricos são tipicamente produzidos utilizando métodos de ADN recombinante. ADN codificando os anticorpos (e. g., ADNc) é 13 isolado e sequenciado utilizando processos convencionais (e. g., por utilização de sondas oligonucleotidicas que são capazes de se ligar especificamente a genes codificando as regiões variáveis de cadeias H e L do anticorpo da invenção, e. g., ADN de SEQ. ID. N° 18 e 20 descrito supra). As células de hibridoma servem como uma tipica fonte de tal ADN. Uma vez isolado, o adn é colocado dentro de vectores de expressão que são, depois, transfectados para dentro de células hospedeiras, tais como E. coli, células COS, células CHO, células PerC6 ou células de mieloma que, de outro modo, não produzem proteína de imunoglobulina, de modo a obter-se a síntese do anticorpo. O ADN pode ser modificado por substituição da sequência codificante para as cadeias L e H humanas pelas correspondentes regiões constantes H e L não humanas (e. g., murinas) ver, e. g., Morrison; PNAS 81, 6851 (1984) . Deste modo, outra forma de realização da invenção é proporcionar um anticorpo quimérico compreendendo um domínio VH tendo a sequência: SEQ ID N° 17 e um domínio VL tendo a sequência: SEQ ID N° 19 fundidas a uma região constante humana (que pode ser um isótipo de IgG, e. g., IgGl). A segunda abordagem envolve a geração de anticorpos humanizados, em que o conteúdo não humano do anticorpo é reduzido por humanização das regiões variáveis. Duas técnicas para humanização têm ganho popularidade. A primeira é a humanização por enxerto de CDR. As CDR constroem ganchos próximo da extremidade N do anticorpo onde formam uma superfície montada num suporte proporcionado pelas regiões de estrutura. A especificidade de ligação de antigénio do anticorpo é principalmente definida pela topografia e pelas características químicas da sua superfície de CDR. Estas características são, por sua vez, determinadas pela conformação das CDR individuais, pela disposição relativa das CDR e pela natureza e disposição 14 das cadeias laterais dos resíduos compreendendo as CDR. Uma grande diminuição em imunogenicidade pode ser alcançada por enxerto apenas das CDR de anticorpos não humanos (e. g., murinos) (anticorpos "dadores") numa estrutura humana adequada (estrutura "aceitadora") e regiões constantes (ver Jones et al. (1986) Nature 321,522-525 e Verhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536). Contudo, o enxerto de CDR, per se, pode não resultar na retenção completa de propriedades de ligação de antigénio e, frequentemente, verifica-se que alguns resíduos de estrutura do anticorpo dador necessitam ser preservados (por vezes designadas por "retromutações") na molécula humanizada se for para ser recuperada afinidade de ligação de antigénio significativa (ver Queen C et al. (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M et al. (1991) Nature 351, 501-502). Neste caso, as regiões V humanas mostrando a mais elevada homologia de sequência (tipicamente 60% ou superior) para o anticorpo dador não humano, podem ser escolhidas de uma base de dados, de modo a proporcionar a estrutura humana (FR). A selecção de FR humanas pode ser feita quer de anticorpos consenso humanos ou individuais humanos. Onde necessário, resíduos chave do anticorpo dador são substituídos na estrutura aceitadora humana, de modo a preservar conformações de CDR. A modelização informática do anticorpo pode ser utilizada para ajudar a identificar tais resíduos estruturalmente importantes, ver o documento W099/48523.

Alternativamente, a humanização pode ser alcançada por um processo de "folheamento". Uma análise estatística de regiões variáveis únicas de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, humanas e murinas, revelou que os padrões exactos de resíduos expostos são diferentes em anticorpos humanos e murinos e a maioria das posições de superfície individual tem uma forte 15 preferência por um pequeno número de resíduos diferentes (ver Padlan E.A. et al.; (1991) Mol.Immunol. 28, 489-498 e Pedersen J.T. et al. (1994) J.Mol.Biol. 235; 959-. 973). Por conseguinte é possível reduzir a imunogenicidade de um Fv não humano por substituição de resíduos expostos nas suas regiões de estrutura que diferem daqueles habitualmente verificados em anticorpos humanos. Em virtude de a antigenicidade de proteína poder ser correlacionada com acessibilidade de superfície, a substituição dos resíduos de superfície pode ser suficiente para tornar a região variável de murganho "invisível" ao sistema imunitários humano (ver, igualmente, Mark G.E. et al. (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, ppl05-134). Este processo de humanização é designado por "folheamento" porque apenas a superfície do anticorpo é alterada, os resíduos de suporte permanecem não perturbados. Abordagens alternativas adicionais incluem aquelas expostas no documento WO04/006955 e o processo de Humaneering™ (Kalobios) que faz utilização de sistemas de expressão bacteriana e produz anticorpos que, em sequência, estão próximos da linha germinal humana (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics, Janeiro de 2007, San Diego, Califórnia).

Irá ser evidente para os especialistas na técnica que o termo "derivado" pretende definir não apenas a fonte no sentido de a mesma ser a origem física para o material mas, igualmente, definir o material que é estruturalmente idêntico ao material mas não tem origem na fonte de referência. Deste modo, os "resíduos verificados no anticorpo dador" não têm, necessariamente, que ter sido purificados do anticorpo dador. 16 É bem reconhecido na técnica que determinadas substituições de aminoácidos são consideradas como sendo "conservativas". Os aminoácidos são divididos em grupos, com base em propriedades de cadeia lateral comuns e as substituições dentro de grupos que mantêm toda ou substancialmente toda a afinidade de ligação do anticorpo terapêutico da invenção são consideradas como substituições conservativas, ver a seguinte Tabela:

Tabela 1

Cadeia lateral Membros Hidrófoba met, ala, vai, leu, ile hidrófila neutra cys, ser, thr Ácida asp, glu Básica asn, gin, his, lys, arg residuos que influenciam a gly, pro orientação de cadeia aromática trp, tyr, phe 1.3 Anticorpos bi-específicos

Um anticorpo bi-especifico é um derivado de anticorpo tendo especificidades de ligação para, pelo menos, dois epitopos diferentes e, igualmente, forma parte da invenção. Os métodos de preparação de tais anticorpos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos bi-especificos é baseada na co-expressão de dois pares cadeia H-cadeia L de imunoglobulina, onde as duas cadeias H têm especificidades de ligação diferentes, ver Millstein et al.r Nature 305 537-539 (1983), documento WO93/08829 e 17

Traunecker et al. EMBO, 10, 1991, 3655-3659. Em virtude do agrupamento aleatório das cadeias H e L, diferentes é produzida uma mistura potencial de dez estruturas de anticorpo, das quais apenas uma tem a especificidade de ligação desejada. Uma abordagem alternativa envolve a fusão dos domínios variáveis com as especificidades de ligação desejadas para região constante de cadeia pesada compreendendo, pelo menos, parte da região de articulação, regiões CH2 e CH3. É preferido ter a região CHI contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em, pelo menos, uma das fusões. ADN codificando estas fusões e, se desejado, a cadeia L são inseridos em vectores de expressão separados e são, depois, co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Todavia, é possível inserir as sequências codificantes para duas ou todas as três cadeias num vector de expressão. Numa abordagem preferida, o anticorpo bi-específico é composto por uma cadeia H com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par de cadeias H-L, proporcionando uma segunda especificidade de ligação no outro braço, ver o documento W094/04690. Ver, igualmente, Suresh et al. Methods in Enzymology 121, 210, 1986. A distribuição de proteínas terapêuticas no cérebro tem sido impedida pela presença da barreira hematoencefálica (BBB). Se for desejado distribuir um anticorpo da invenção ou fragmento de anticorpo da invenção através da BBB, foram propostas diversas estratégias para estimular tal distribuição onde necessária.

De modo a se obter nutrientes e factores requeridos do sangue, a BBB possui alguns receptores específicos que transportam compostos do sangue em circulação para o cérebro. Estudos indicaram que alguns compostos como a insulina (ver 18

Duffy KR et al. (1989) Brain Res. 420:32-38), transferrina (ver Fishman JB et al. (1987) J.Neurosci 18:299-304) e factores de crescimento 1 e 2 semelhantes à insulina (ver Pardridge WM (1986) Endocrine Rev. 7:314-330 e Duffy KR et al. (1986) Metabolism 37:136-140) atravessam a BBB por meio de transcitose mediada por receptor. Os receptores para estas moléculas proporcionam, deste modo, um meio potencial para anticorpos terapêuticos da invenção para acederem ao cérebro utilizando os denominados anticorpos "vectorizados" (ver Pardridge WM (1999) Advanced Drug Delivery Review 36:299-321). Por exemplo, demonstrou-se que um anticorpo para o receptor de transferrina é dinamicamente transportado para dentro do parênquima cerebral (ver Friden PM et al. (1991) PNAS 88:4771-4775 e Friden PM et al. (1993) Science 259:373-3-77). Deste modo, uma abordagem potencial é produzir um anticorpo bi-especifico ou fragmento bi-especif ico, tal como descrito supra, em que uma primeira especificidade é para e uma segunda especificidade é para um receptor de transporte localizado na BBB, e. g., uma segunda especificidade para o receptor de transporte de transferrina. 1.4 Fragmentos de Anticorpo

Em determinadas formas de realização da invenção é proporcionado anticorpo terapêutico que é um fragmento de ligação de antigénio. Tais fragmentos podem ser fragmentos de ligação de antigénio funcionais de anticorpos intactos e/ou humanizados e/ou quiméricos, tais como fragmentos Fab, Fd, Fab', F{ah')2, Fv, ScFv dos anticorpos descritos supra. Os fragmentos carecendo da região constante carecem da capacidade para activar o complemento pela via clássica ou para mediar a citotoxicidade 19 celular dependente de anticorpo. Tradicionalmente, tais fragmentos são produzidos pela digestão proteolitica de anticorpos intactos por, e. g., digestão por papaína (ver, por exemplo, documento WO 94/29348) mas podem ser produzidos directamente de células hospedeiras transformadas de um modo recombinante. Para a produção de ScFv, ver Bird et al.; (1988) Science, 242, 423-426. Adicionalmente, os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos utilizando uma variedade de técnicas de engenharia, como descritas abaixo.

Os fragmentos Fv parecem ter energia de interacção das suas duas cadeias mais baixa do que os fragmentos Fab. De modo a estabilizar a associação dos domínios VH e VL, os mesmos foram ligados com péptidos (Bird et al., (1988) Science 242, 423-426, Huston at al., PNAS, 85, 5879-5883), pontes dissulfureto (Glockshuber et al., (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) e mutações "knob in hole" (Zhu et al. (1997), Protein Sei., 6, 781-788) . Os fragmentos ScFv podem ser produzidos por métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica, ver Whitlow et al. (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 e Huston et al. (1993) Int.Rev.Immunol 10, 195-217. O ScFv pode ser produzido em células bacterianas, tal como E. Coli, mas é, mais tipicamente, produzido em células eucarióticas. Uma desvantagem de ScFv é a monovalência do produto, que impede uma avidez aumentada, em virtude da ligação polivalente e sua meia-vida curta. Tentativas para superar estes problemas incluem (ScFv')2 bivalente produzido a partir de ScFV contendo uma cisteina C-terminal adicional por ligação química (Adams et al. (1993) Can.Res 53, 4026-4034 e McCartney et al. (1995) Protein Eng. 8, 301-314) ou por dimerização específica de sítio espontânea de ScFv contendo um resíduo de cisteina C-terminal não emparelhado (ver Kipriyanov et al. (1995) Cell. Biophys 26, 20 187-204). Alternativamente, o ScFv pode ser forçado a formar multímeros por encurtamento do péptido adaptador entre 3 a 12 resíduos, de modo a formar "diacorpos", ver Holliger et al. PNAS (1993), 90, 6444-6448. A redução do adaptador ainda pode, adicionalmente, resultar em trímeros de ScFV ("triacorpos", ver Kortt et al. (1997) Protein Eng, 10, 42β-433) e tetrâmeros ("tetracorpos", ver Le Gall et al. (1999) FEBS Lett, 453, 164-168). A construção de moléculas de ScFv bivalentes pode ser, igualmente, alcançada por fusão genética com motivos de dimerização de proteína, de modo a formar "minianticorpos" (ver Pack et al. (1992) Biochemistry 31, 1579-1584) e "minicorpos" (ver Hu et al. (1996), Câncer Res. 56, 3055-3061). Séries de ScFv-Sc-Fv ((ScFV)2) podem ser, igualmente, produzidas por ligação de duas unidades de ScFv por um terceiro adaptador peptídico, ver Kurucz et al. (1995) J.Immol. 154, 4576-4582. Diacorpos bi-específicos podem ser produzidos através da associação não covalente de dois produtos de fusão de cadeia única, consistindo em domínio VH de um anticorpo ligado por um curto adaptador ao domínio VL de outro anticorpo, ver Kipriyanov et al. (1998), Int. J. Can 77, 763-772. A estabilidade de tais diacorpos bi-específicos pode ser melhorada pela introdução de pontes de dissulfureto ou mutações "knob in hole", como descrito supra ou pela formação de diacorpos de cadeia única (ScDb), em que dois fragmentos de ScFv híbridos são ligados através de um adaptador peptídico, ver Kontermann et al. (1999) J. Immunol. Methods, 226 179-188. As moléculas bi-específicas tetravalentes estão disponíveis por, e. g., fusão de um fragmento ScFv ao domínio CH3 de uma molécula IgG ou a um fragmento Fab através da região de articulação, ver Coloma et al. (1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163. Alternativamente, as moléculas bi-específicas tetravalentes foram criadas pela fusão de diacorpos de cadeia única bi-específicos (ver Alt et al., (1999) 21 FEBS Lett 454, 90-94. Moléculas bi-específicas tetravalentes mais pequenas podem ser, igualmente, formadas pela dimerização quer de séries de ScFv-ScFv com um adaptador contendo um motivo de hélice-gancho-hélice (minianticorpos DiBi, ver Muller et al. (1998) FEBS Lett 432, 45-49) ou de uma molécula de cadeia única compreendendo quatro domínios variáveis de anticorpo (vH e vL), numa orientação impedindo o emparelhamento intramolecular (diacorpo em série, ver Kipriyanov et al., (1999) J.Mol.Biol. 293, 41-56). Fragmentos F(ab')2 bi-específicos podem ser criados por ligação química de fragmentos Fab' ou por heterodimerização através de fechos de leucina (ver Shalaby et al., (1992) J.Exp.Med. 175, 217-225 e Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553) . Estão, igualmente, disponíveis domínios isolados VH e VL, ver os documentos US 6248516; US 6291158; US 6172197. 1.5 Anticorpos heteroconjugados

Os anticorpos heteroconjugados são derivados que formam, igualmente, uma forma de realização da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos covalentemente ligados, formados utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Ver o documento US 4676980. 1.6 Outras Modificações

Pensa-se que a interacção entre a região Fc de um anticorpo e diversos receptores Fc (FcyR) medeia as funções efectoras do anticorpo, as quais incluem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fixação de complemento, 22 fagocitose e meia-vida/eliminação do anticorpo. Dependendo da propriedade efectora desejada, podem ser efectuadas diversas modificações na região Fc de anticorpos da invenção. Em particular, regiões constantes humanas que essencialmente carecem das funções de a) activação de complemento pela via clássica; e b) mediação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo, incluem a região constante de IgG4, a região constante de IgG2 e as regiões constantes de IgGl contendo mutações especificas contendo mutações especificas como, por exemplo, mutações nas posições 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e/ou 322 divulgadas nos documentos EP 0307434 (WO 8807089), EP 0629240 (WO 9317105) e WO 2004/014953. Foi separadamente descrito que as mutações nos resíduos 235 ou 237 dentro do domínio CH2 da região constante de cadeia pesada (numeração de Kabat; sistema de índice EU) reduzem a ligação a FcyRI, FcyRII e ligação de FcyRIII e, por conseguinte, reduzem a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (Duncan et al.

Nature 1988; 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton e

Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;l-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168) . Além disso, alguns relatórios descreveram, igualmente, o envolvimento de alguns destes resíduos no recrutamento ou mediação de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) (Morgan et al., 1995; Xu et al., Cell.

Immunol. 2000; 200:16-26; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). Os resíduos 235 e 237 fora, por conseguinte, mutados para resíduos de alanina (Brett et al. Immunology 1997, 91; 346-353; Bartholomew et al. immunology 1995, 85; 41-48; e documento WO 9958679), de modo a reduzir os efeitos mediados tanto por complemento como mediados por FcyR. 23

Os anticorpos compreendendo estas regiões constantes podem ser designados anticorpos 'não líticos'.

De modo a aumentar a meia-vida sérica, pode incorporar-se um epitopo de ligação de receptor de salvamento dentro do anticorpo, ver o documento US 5739277.

Existem cinco receptores Fcy humanos actualmente reconhecidos, FcyR (I), FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa e FcRn neonatal. Shields et al., (2001) j.Biol.Chem 276, 6591-6604 demonstraram que um conjunto comum de resíduos de IgGl está envolvido na ligação de todos os FcyRs, enquanto FcyRII e FcyRIII utilizam sítios distintos fora deste conjunto comum. Um grupo de resíduos de IgGl reduziu a ligação a todos os FcyRs quando alterado para alanina: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 e Pro-239. Todos estão no domínio IgG CH2 e agrupados próximo da junção de articulação CHI e CH2. Enquanto FcyRI utiliza apenas o conjunto comum de resíduos de IgGl para ligação, FcyRII e FcyRIII interagem com resíduos distintos adicionalmente ao conjunto comum. A alteração de alguns resíduos reduziu a ligação apenas a FcyRII (e. g., Arg-292) ou FcyRIII (e. g., Glu-293) . Alguns variantes mostraram ligação melhorada a FcyRII ou FcyRIII mas não afectou a ligação ao outro receptor (e. g., Ser-267Ala melhorou a ligação a FcgRII mas a ligação a FcyRIII não foi afectada). Outros variantes exibiram ligação melhorada a FcyRII ou FcyRIII, com redução na ligação ao outro receptor (e. g., Ser-298Ala melhorou a ligação a FcyRIII e reduziu a ligação a FcgRII). Para FcyRIIIa, os melhores variantes de IgGl de ligação tinham combinado substituições de alanina a Ser-298, Glu-333 e Lys-334. Pensa-se que o receptor FcRn neonatal está envolvido ma protecção de moléculas de IgG da degradação e, deste modo, melhora a meia-vida sérica e a transcitose através de tecidos 24 (ver Junghans R. P (1997) Immunol Res 16. 29-57 e Ghetie et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766). Resíduos de igGl humanas determinados como interagindo directamente com FcRn humano incluem IIe253, Ser254, Lys288, Thr307, Glen311, Asn434 e His435. 0 anticorpo terapêutico da invenção pode incorporar qualquer das modificações de região constante anteriores.

Numa particular forma de realização, o anticorpo terapêutico essencialmente carece das funções de a) activação de complemento pela via clássica; e b) mediação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Numa forma de realização mais particular, a presente invenção proporciona anticorpos terapêuticos da invenção tendo qualquer uma (ou mais) das alterações de resíduo detalhadas anteriormente, de modo a modificar a meia-vida/eliminação e/ou funções efectoras, tais como ADCC e/ou citotoxicidade dependente de complemento e/ou lise de complemento.

Num aspecto adicional da presente invenção, o anticorpo terapêutico tem uma região constante de isótipo de igGl humana com substituições de alanina (ou outra disrupção) nas posições 235 (e. g., L235A) e 237 (e. g., G237A) (numeração de acordo com o esquema EU delineado em Kabat).

Outros derivados da invenção incluem variantes de glicosilação dos anticorpos da invenção. Sabe-se que a glicosilação de anticorpos em posições conservadas nas suas regiões constantes tem um efeito profundo sobre a função de anticorpo, particularmente o funcionamento efector, tais como aqueles anteriormente descritos, ver por exemplo, Boyd et al. 25 (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. Estão contemplados variantes de glicosilação dos anticorpos terapêuticos da presente invenção, em que um ou mais grupos de hidratos de carbono são adicionados, substituídos, delecionados ou modificados. A introdução de um motivo de asparagina-X-serina ou asparagina-x-treonina cria um sítio potencial para conjugação enzimática de grupos de hidratos de carbono e pode, por conseguinte, ser utilizado para manipular a glicosilação de um anticorpo. Em Raju et al. (2001) Biochemistry 40, 8868-8876, a sialiação terminal de uma imunoadesina TNFR-lgG foi aumentada através de um processo de regalactosilação e/ou ressialilação utilizando beta-1,4-galactosiltransferase e/ou alfa,2,3 sialiltransferase. Pensa-se que aumentando a sialilação terminal aumenta a meia-vida da imunoglobulina. Os anticorpos, em comum com a maioria das glicoproteínas, são, tipicamente, produzidos na natureza como uma mistura de glicoformas. Esta mistura é particularmente evidente quando os anticorpos são produzidos em células eucarióticas, particularmente de mamífero. Foi desenvolvida uma variedade de métodos para preparar glicoformas definidas , ver Zhang et al. Science (2004), 303, 371, Sears et al., Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al. (2002) Science, 298 1790, Davis et al. (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al. (2001) Acc.Chem.Res 34, 727. Deste modo, a invenção refere-se a uma pluralidade de anticorpos terapêuticos (que podem ser do isótipo igG, e. g., IgGl), como aqui se descrevem, compreendendo um número definido (e. g., 7 ou inferior, por exemplo, 5 ou inferior, tal como duas ou uma única) de glicoforma(s) dos referidos anticorpos.

Derivados de acordo com a invenção incluem, igualmente, anticorpos terapêuticos da invenção ligados a um polímero não proteináceo, tal como polietilenoglicol (PEG), 26 polipropilenoglicol ou polioxialquileno. A conjugação de proteínas ao PEG é uma técnica estabelecida para o aumento da meia-vida de proteínas, assim como redução da antigenicidade e imunogenicidade de proteínas. A utilização de de PEGilação com estilos (lineares ou ramificados) e pesos moleculares diferentes foi investigada com anticorpos intactos, assim como com fragmentos Fab', ver Koumenis I.L. et al. (2000) Int.J.Pharmaceut. 198:83-95. Uma particular forma de realização compreende um fragmento de ligação de antigénio da invenção, sem as funções efectoras de a) activação de complemento pela via clássica; e b) mediação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo; (tal como um fragmento Fab ou um scFv) conjugado a PEG. 2. Métodos de Produção

Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos em organismos transgénicos, tais como cabras (ver Pollock et al. (1999), J.Immunol. Methods 231: 147-157), galinhas (ver Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55), murganhos (ver Pollock et al. ibid) ou plantas (ver Doran PM, (2000) Curr. Opinion

Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4; 601- -606, Baez J et al., BioPharm ( 2000) 13: 50- -54, Stoger E et al.} (2000) Plant Mol . Biol. 42: 583- 590) . Os anticorpos podem ser, igualmente, produzidos por síntese química. Contudo, os anticorpos da invenção são tipicamente produzidos utilizando tecnologia de cultura de célula recombinante, bem conhecida dos especialistas na técnica. Um polinucleótido codificando o anticorpo é isolado e inserido num vector replicável, tal como um plasmídeo para propagação ou expressão adicional numa célula hospedeira. Um sistema de expressão útil é um sistema de 27 glutamato sintetase (tal como comercializado por Lonza Biologics), particularmente se a célula hospedeira for CHO ou NSO (ver abaixo). 0 polinucleótido codificando o anticorpo é facilmente isolado e sequenciado utilizando processos convencionais (e. g., sondas oligonucleotidicas). Vectores que podem ser utilizados incluem plasmideo, virus, fago, transposões, minicromossomas, dos quais os plasmideos são uma forma de realização tipica. Em geral, tais vectores, adicionalmente, incluem uma sequência sinal, origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento estimulador, um promotor e sequências de terminação de transcrição ligadas de um modo operativo ao polinucleótido de cadeia leve e/ou pesada, de modo a facilitar a expressão. 0 polinucleótido codificando as cadeias leve e pesada pode ser inserido em vectores separados e introduzido (e. g., por transformação, transfecção, electroporação ou transdução) na mesma célula hospedeira, concorrentemente ou sequencialmente ou, se desejado, tanto a cadeia pesada como a cadeia leve podem ser inseridas no mesmo vector antes de tal introdução.

Irá ser imediatamente evidente para os especialistas na técnica que, em virtude da redundância do código genético, estão igualmente disponíveis polinucleótidos alternativos àqueles aqui divulgados, os quais irão codificar os polipéptidos da invenção. 2.1 Sequências sinal

Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos como uma proteína de fusão com uma sequência sinal heteróloga, tendo um sítio de clivagem específico na extremidade N da proteína madura. A sequência sinal deve ser reconhecida e 28 processada pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas, a sequência sinal pode ser uma fosfatase alcalina, penicilinase ou lideres de endotoxina II estável. Para secreção em levedura, as sequências sinal podem ser um lider de invertase de levedura, um lider de factor α ou lideres de fosfatase ácida ver, e. g., documento wo 90/13646. Em sistemas de células de mamífero, estão disponíveis líderes secretórios virais, tais como sequências sinal gD de herpes simplex e imunoglobulina nativa (tal como cadeia pesada de Ig humana). Tipicamente, a sequência sinal é ligada em fase de leitura ao polinucleótido codificando o anticorpo da invenção. 2,2 Origem de replicação

As origens de replicação são bem conhecidas na técnica, com pBR322 adequado para a maioria das bactérias gram-negativas, plasmídeo 2μ para a maioria das leveduras e diversas origens virais, tais como SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV para a maioria das células de mamífero. Em geral, o componente de origem de replicação de SV40 não é necessário para vectores de expressão de mamífero integrados. Contudo, a ori de SV40 pode ser incluída, visto conter o promotor precoce. 2.3 Marcador de seleccção

Genes de selecção típicos codificam proteínas que conferem (a) resistência a antibióticos ou outras toxinas, e. g., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina ou (b) deficiências auxotróficas de complemento ou fornecimento de nutrientes não disponíveis nos meios complexos ou (c) 29 combinações de ambos. 0 esquema de selecção pode envolver a interrupção do crescimento das células hospedeiras que não contêm qualquer vector ou vectores. As células que foram transformadas com sucesso com os genes codificando o anticorpo terapêutico da presente invenção, sobrevivem em virtude da, e. g., resistência ao fármaco conferida pelo marcador de selecção co-distribuido. Um exemplo é o sistema de selecção DHFR, em que os transf ormantes são gerados em estirpes hospedeiras negativas para DHFR (e. g., ver Page e Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68). Neste sistema, o gene DHFR é co-distribuido com sequências polinucleotidicas de anticorpo da invenção e células positivas para DHFR são, depois, seleccionadas por remoção de nucleósido. Se requerido, o inibidor de DHFR metotrexato é igualmente empregue para seleccionar para transformantes com amplificação de gene DHFR. Por ligação, de um modo operativo, do gene DHFR às sequências codificando o anticorpo da invenção ou seus derivados funcionais, a amplificação de gene DHFR resulta na amplificação concomitante das sequências de anticorpo desejadas de interesse. As células CHO são uma linha celular particularmente útil para esta selecção de DHFR/metotrexato e os métodos de amplificação e selecção de células hospedeiras utilizando o sistema DHFR estão bem estabelecidos na técnica, ver Kaufman R.J. et al. J. Mol. Biol. (1982) 159, 601-621, para revisão, ver Werner RG, Noe W, Kopp K, Schluter M, "Appropriate mammalian expression Systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, Agosto de 1998. Um exemplo adicional é o sistema de expressão de glutamato sintetase (Bebbington et al. Biotechnology 1992 Vol 10 pl69) . Um gene de selecção adequado para utilização em levedura é o gene trpl; ver Stinchcomb et al. Nature 282, 38, 1979. 30 2.4 Promotores

Os promotores adequados para expressão de anticorpos da invenção são ligados, de um modo operativo, a ADN/polinucleótido codificando o anticorpo. Os promotores para hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, sistemas promotores de Beta-lactamase e lactose, promotores de fosfatase alcalina, triptofano e híbridos, tal como Tac. Os promotores adequados para expressão em células de levedura incluem 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicoliticas, e. g., enolase, gliceraldeido 3 fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutocinase, glicose 6 fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase e glicocinase. Promotores de levedura indutiveis incluem álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, metalotioneina e enzimas responsáveis pelo metabolismo de azoto ou pela utilização de maltose/galactose. Promotores para expressão em sistemas de células de mamifero incluem promotores de ARN polimerase II, incluindo promotores virais, tais como polioma, vírus da varíola aviária e adenovírus (e. g., adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do

sarcoma aviário, citomegalovírus (em particular o promotor do gene precoce imediato), retrovírus, vírus da hepatite B, actina, promotor do vírus do sarcoma de rous (RSV) e o vírus símio precoce ou tardio 40, e promotores não virais, tal como EF-lalfa (Mizushima e Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322. A escolha do promotor pode basear-se na compatibilidade adequada com a célula hospedeira utilizada para expressão. 31 2.5 Elemento estimulador

Se apropriado, e. g., para expressão em eucariotas superiores, podem ser incluídos elementos estimuladores adicionais, em vez ou, assim como, aqueles verificados localizados nos promotores anteriormente descritos. Sequências estimuladoras de mamífero adequadas incluem elementos estimuladores de globina, elastase, albumina, fetoproteína, metalotionina e insulina. Alternativamente, pode utilizar-se um elemento estimulador de um vírus de célula eucariótica, tal como estimulador de SV40, estimulador de promotor precoce de citomegalovírus, estimulador de polioma, estimulador baculoviral ou lócus IgG2a murino (ver o documento WO 04/009823). Embora tais estimuladores estejam tipicamente localizados no vector num sítio a montante do promotor os mesmos podem estar, igualmente, localizados noutro local, e. g., dentro da região não traduzida ou a jusante do sinal de poliadenilação. A escolha e posição do estimulador pode basear-se na compatibilidade adequada com a célula hospedeira utilizada para expressão. 2.6 Poliadenilação/Terminação

Em sistemas eucarióticos, os sinais de poliadenilação são ligados, de um modo operativo, ao polinucleótido codificando o anticorpo desta invenção. Tais sinais são tipicamente colocados a 3' da fase de leitura aberta. Em sistemas de mamífero, sinais exemplificativos não limitantes incluem aqueles derivados de hormonas de crescimento, factor-l-alfa de alongamento e genes virais (e. g., SV40) ou repetições terminais longas retrovirais. Em sistemas de levedura, exemplos não limitantes de sinais de poliadenilação/terminação incluem aqueles derivados dos genes de 32 fosfoglicerato cinase (PGK) e a álcool desidrogenase 1 (ADH). Em sistema procariótico, os sinais de poliadenilação, tipicamente, não são requeridos e, em vez disso, é habitual empregar sequências terminadoras mais curtas e mais definidas. A escolha de sequências de poliadenilação/terminação pode ser baseada na compatibilidade adequada com a célula hospedeira utilizada para expressão. 2.7 Outros métodos/elementos para rendimentos melhorados

Adicionalmente ao acima, outras caracteristicas que podem ser empregues para melhorar rendimentos incluem elementos de remodelação de cromatina, intrões e modificação de codão especifica de célula hospedeira. A utilização de codão do anticorpo desta invenção pode ser modificada para acomodar a distorção de codão da célula hospedeira, de modo a aumentar o rendimento de transcrito e/ou produto (e. g., Hoekema A et al. Mol Cell Biol, 1987 7(8):2914-24). A escolha de codões pode ser baseada na compatibilidade adequada com a célula hospedeira utilizada para expressão. 2.8 Células hospedeiras

As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vectores codificando anticorpos da invenção são células procarióticas, de levedura ou eucarióticas superiores. Células procarióticas adequadas incluem eubactérias, e. g., enterobacteriaceae, tal como Escherichia, e. g., E. Coli (por exemplo, ATCC 31446; 31537; 27325), Enterobacter, Erwinia,

Klebsiella Proteus, Salmonela, e. g., Salmonella typhimurium, 33

Serratia, e. g., Serratia marcescans e Shigela, assim como Bacilli, tais como B.subtilis e B.licheniformis (ver o documento DD 266 710), Pseudomonas, tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Das células hospedeiras de levedura, Saccharomyces cerevisiae, schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (e. g., ATCC 16045; 12424; 24178; 56500), yarrowia (documento EP 402226), Pichia Pastoris (documento EP 183070, ver, igualmente, Peng et al. J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Trichoderma reesia (documento EP 244234), hospedeiros de Penicillin, Tolypocladium e Aspergillus, tais como A. nidulans e A. niger estão, igualmente, contempladas.

Embora as células hospedeiras procarióticas e de levedura estejam especificamente contempladas pela invenção, tipicamente contudo, as células hospedeiras da presente invenção são células de vertebrado. Células hospedeiras de vertebrado adequadas incluem células de mamífero, tais como COS-1 (ATCC N° CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), linha de rim embriónico humano 293, PerC6 (Crucell), linhas de rim de hamster bebé (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC N° CRL 10314), 293 (ATCC N° CRL 1573), células CHO de ovário de hamster chinês (e. g., CHO-Kl, ATCC N° CCL 61, linha celular DHFR minus CHO, tal como DG44 (Urlaub et al., Somat Cell Mol Genet. (1986) Vol 12 pp555-566), particularmente aquelas linhas celulares CHO adaptadas para cultura em suspensão, células sertoli de murganho, células renais de macaco, células renais de macaco verde africano (ATCC CRL-1587), células HELA, células renais caninas (ATCC CCL 34), células pulmonares humanas (ATCC CCL 75), células Hep G2 e de mieloma ou de linfoma, e. g., NSO (ver o documento US 5807715), Sp2/0, Y0.

Deste modo, numa forma de realização da invenção, é proporcionada uma célula hospedeira transformada de um modo 34 estável, compreendendo um vector codificando uma cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo terapêutico, como aqui se descreve. Tipicamente, tais células hospedeiras compreendem um primeiro vector codificando a cadeia leve e um segundo vector codificando a referida cadeia pesada.

Tais células hospedeiras, igualmente, podem ser adicionalmente manipuladas ou adaptadas para modificar a qualidade, função e/ou rendimento do anticorpo desta invenção. Exemplos não limitantes incluem expressão de enzimas modificadoras especificas (e. g., glicosilação) e chaperones enroladores de proteína. 2.9 Métodos de Cultura Celular.

As células hospedeiras transformadas com vectores codificando os anticorpos terapêuticos da invenção podem ser cultivadas por qualquer método conhecido dos especialistas na técnica. As células hospedeiras podem ser cultivadas em frascos rotativos, frascos agitados, frascos de rolamento, reactores de onda (e. g., System 1000 de wavebiotech.com) ou sistemas de fibra oca mas, para produção em grande escala, prefere-se que sejam utilizados reactores de tanque agitado ou reactores de saco (e. g., Wave Biotech, Somerset, Nova Jérsia, EUA), particularmente para culturas em suspensão. Tipicamente, os tanques agitados são adaptados para arejamento utilizando, e. g., aspersores, deflectores ou propulsores de baixo cisalhamento. Para colunas de borbulhadores e reactores de agitação pneumática pode ser utilizado o arejamento directo com ar ou bolhas de oxigénio. Se as células hospedeiras forem cultivadas num meio de cultura isento de soro, este pode ser 35 suplementado com um agente protector celular, tal como pluronic F-68, de modo a ajudar a prevenir o dano celular, como resultado do processo de arejamento. Dependendo das características da célula hospedeira, ou os microveiculos podem ser utilizados como substratos de crescimento para linhas celulares dependentes de ancoragem ou as células podem ser adaptadas para cultura em suspensão (que é típico). A cultura de células hospedeiras, particularmente células hospedeiras de vertebrado pode utilizar uma variedade de modos operacionais, tais como processamento em contínuo, semi-contínuo, contínuo repetido (ver Drapeau et al. (1994) cytotechnology 15: 103-109), processo em contínuo prolongado ou cultura em perfusão. Embora as células hospedeiras de mamífero transformadas de um modo recombinante possam ser cultivadas em meios contendo soro, tais como meios compreendendo soro de vitelo fetal (FCS), prefere-se que tais células hospedeiras sejam cultivadas em meios isentos de soro, tais como divulgados em Keen et al. (1995) Cytotechnology 17:153-163, ou meios comercialmente disponíveis, tais como ProCHO-CDM ou UltraCHO (Cambrex NJ, EUA), suplementados onde necessário com uma fonte de energia, tal como glucose e factores de crescimento sintéticos, tal como insulina recombinante. A cultura isenta de soro de células hospedeiras pode requerer que aquelas células sejam adaptadas para crescerem em condições isentas de soro. Uma abordagem de adaptação é cultivar tais células hospedeiras em meios contendo soro e, repetidamente, trocar 80% do meio de cultura por meios isentos de soro, de modo que as células hospedeiras aprendam a adaptar-se em condições isentas de soro (ver, e. g., Scharfenberg K et al. (1995) In Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. et al. eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers). 36

Os anticorpos da invenção, segregados no meio podem ser recuperados e purificados do meio utilizando uma variedade de técnicas, de modo a proporcionar um grau de purificação adequado para a utilização pretendida. Por exemplo, a utilização de anticorpos terapêuticos da invenção para o tratamento de doentes humanos, tipicamente, exige, pelo menos, 95% de pureza, como determinada por SDS-PAGE redutor, mais tipicamente 98% ou 99% de pureza, quando comparada com os meios de cultura compreendendo os anticorpos terapêuticos. No primeiro caso, os detritos celulares dos meios de cultura são, tipicamente, removidos utilizando centrifugação, seguida de uma etapa de clarificação do sobrenadante utilizando, e. g., microfiltração, ultrafiltração e/ou filtração profunda. Alternativamente, o anticorpo pode ser recolhido por microfiltração, ultrafiltração ou filtração profunda, sem centrifugação anterior. Está disponível uma variedade de outras técnicas, tais como diálise e electroforese em gel e técnicas cromatográficas, tais como hidroxiapatite (HA), cromatografia de afinidade (opcionalmente envolvendo um sistema de marcação de afinidade, tal como poli-histidina) e/ou cromatografia de interacção hidrófoba (HIC, ver documento US 5429746). Numa forma de realização, os anticorpos da invenção, após diversas etapas de clarificação, são capturados utilizando cromatografia de afinidade de Proteína A ou G, seguida por etapas adicionais de cromatografia, tais como cromatografia de permuta iónica e/ou HA, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia de exclusão de tamanho e precipitação por sulfato de amónio. Tipicamente, são igualmente empregues diversas etapas de remoção de vírus (e. g., nanofiltração utilizando, e. g., um filtro DV-20). Após estas diversas etapas, uma preparação purificada (tipicamente monoclonal) compreendendo, pelo menos, 10 mg/mL ou mais, e. g., 100 mg/mL ou mais, do anticorpo da 37 invenção é proporcionada e, por conseguinte, forma uma forma de realização da invenção. Concentração até 100 mg/mL ou superior pode ser gerada por ultracentrifugação. Adequadamente, tais preparações são substancialmente isentas de formas agregadas de anticorpos da invenção.

Sistemas bacterianos são particularmente adequados para a expressão de fragmentos de anticorpo. Tais fragmentos estão localizados intracelularmente ou dentro do periplasma. As proteínas periplásmicas insolúveis podem ser extraídas e reenroladas para formarem proteínas activas de acordo com métodos conhecidos dos especialistas na técnica, ver Sanchez et al. (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20 e Cupit PM et al. (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277. 3. Composições Farmacêuticas

Preparações purificadas de anticorpos da invenção (particularmente preparações monoclonais), como descritas supra, podem ser incorporadas em composições farmacêuticas para utilização no tratamento de doenças ou distúrbios humanos, tais como aquelas delineadas anteriormente. Tipicamente, tais composições adicionalmente compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável (i. e., inerte) como conhecido e denominado pela prática farmacêutica aceitável, ver, e. g., Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16a ed, (1980), Mack Publishing Co. Exemplos de tais veículos incluem veículo esterilizado, tal como solução salina, solução de Ringer ou solução de dextrose, tamponada com tampões adequados, tal como acetato de sódio tri-hidratado, a um pH farmaceuticamente aceitável, tal como um pH dentro de uma gama de 5 a 8. 38

Composições farmacêuticas para injecção (e. g., por injecção intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intraportal) ou infusão contínua estão adequadamente isentas de matéria particulada e podem compreender de 1 mg a 10 g de anticorpo terapêutico, tipicamente 5 mg a 1 g, de um modo mais específico, 5 mg a 25 mg ou 50 mg de anticorpo. Os métodos para a preparação de tais composições farmacêuticas são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Numa forma de realização, as composições farmacêuticas compreendem de 1 mg a 10 g de anticorpos terapêuticos da invenção, na forma de dosagem unitária, opcionalmente juntamente com instruções para utilização. As composições farmacêuticas da invenção podem ser liofilizadas (secas por congelamento) para reconstituição antes de administração de acordo com métodos bem conhecidos ou evidentes para os especialistas na técnica. Se as formas de realização da invenção compreenderem anticorpos da invenção com um isótipo IgGl, um quelante de iões metálicos, incluindo cobre, tal como citrato (e. g., citrato de sódio) ou EDTA ou histidina, pode ser adicionado à composição farmacêutica, de modo a reduzir o grau de degradação mediada por metal de anticorpos deste isótipo, ver o documento E P0612251. As composições farmacêuticas podem compreender, igualmente, um solubilizante, tal como arginina, base, um agente detergente/anti-agregação, tal como polissorbato 80 e um gás inerte, tal como azoto, para substituir o oxigénio do espaço livre do frasquinho.

As doses e regimes de tratamento eficazes para administração do anticorpo da invenção são, em geral, determinados empiricamente e são dependentes de factores, tais como a idade, peso e estado de saúde do doente e doença ou distúrbio a ser tratado. Tais factores estão dentro da competência do médico assistente. Orientações na selecção de 39 doses apropriadas podem ser consultadas em, e. g., Smith et al. (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, Nova Iorque mas irão, em geral, ser 1 mg a 10 g. Numa forma de realização, o regime de dosagem para o tratamento de um doente humano é de 1 mg a 1 g de anticorpo terapêutico da invenção, administrado subcutaneamente, uma vez por semana ou de duas em duas semanas, ou por infusão intravenosa a cada 1 ou 2 meses. Uma tal dosagem corresponde a 0,014-140 mg/kg, tal como 0,014-14 mg/kg. As composições da presente invenção podem ser, igualmente, utilizadas de um modo profiláctico. 4. Utilizações clínicas.

Será entendido que as doenças caracterizadas por níveis de β-amilóide ou depósitos de β-amilóide elevados incluem a doença de Alzheimer, disfunção cognitiva moderada, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com β-amiloidose do tipo holandês, angiopatia β-amilóide cerebral e diversos tipos de demências degenerativas, tais como aquelas associadas à doença de Parkinson, paralisia supranuclear progressiva, degenerescência basal cortical e tipo de corpo de Lewis difuso da doença de Alzheimer.

De um modo muito preferido, a doença caracterizada por níveis de β-amilóide ou depósitos de β-amilóide elevados é a doença de Alzheimer.

Embora a presente invenção tenha sido descrita principalmente em relação ao tratamento de doenças ou distúrbios humanos, a presente invenção pode ter, igualmente, aplicações no 40 tratamento de doenças ou distúrbios semelhantes em mamíferos não humanos.

Exemplos Métodos . tm . , ,

Biacore /Biacore um dispositivo que permite a medição da 3000 cinética em tempo real de interacçoes moleculares utilizando SPR SPR (ressonância de plasmónio de superfície) fenómeno físico empregue pela Biacore™ Instruments para a medição de alterações de massa no chip sensor CM5 chip sensor da Biacore™ com superfície de utilização geral, revestida com uma matriz de dextrano carboximetilado ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática SRU Tecnologia de Biossensor SRU BIND™ permitindo monitorizar interacçoes bioquímicas sem marca Integra CL1000 Mini-biorreactores comercializados pela IBS Integra Biosciences FMA Tecnologia de ensaio de microvolume fluorométrico (Applied Biosystems) ABÍ8200 Sistema de detecção celular macroconfocal de fluorescência Applied Biosystems 8200 para FMAT FPLC Cromatografia líquida de proteína rápida 41

ProSepA HiTrap Colunas de Proteína A para FPLC, comercializadas pela GE Healthcare Materiais DMSO dimetilssulfóxido HEPES N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanossulfónico) EDTA ácido etilenodiaminotetraacético Tris HC1 cloridrato de tris-(hidroximetil)aminometano NaCl cloreto de sódio Tween-20 monolaurato de polioxietilenosorbitano BSA albumina de soro bovino PBS solução salina tamponada com fosfatos PFA paraformaldeído IMS álcool metilado industrial DAB 3,3'diaminobenzidina DMEM meio de Eagle modificado por Dulbecco FCS soro de vitelo fetal Opti-MEM meio baseado em meio de Eagle modificado da Invitrogen/Gibco Lipofectamine agente de transfecção celular baseado em lípido catiónico comercializado pela Invitrogen/Gibco Transfast agente de transfecção lipossomal comercializado pela Promega 42

Verseno agente quelante de ião metálico (ácido etilenodiaminotetraacético)

Glutamax forma estável de glutamina adicionada a meio de cultura (suplemento de dipéptido L-Ananil-L-Glutamina)

Histoclear agente de limpeza de tecido tampao HBS-EP Tampao Biacore de utilização geral, contendo HEPES a 0,01 M, pH 7,4, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM, Surfactante P20 a 0,005%

Geração de anticorpo monoclonal de murganho 2E7 O anticorpo monoclonal de murganho 2E7 foi gerado de uma imunização convencional de murganhos. Os murganhos foram imunizados com β-amilóide 1-40 e 1-42, solúvel ou agregado, formulado em adjuvante de Freund. Após reforço final sem adjuvante, os esplenócitos foram fundidos com células de mieloma. As células fundidas foram cultivadas em placas de 96 poços, a partir das quais sobrenadantes de hibridoma foram rastreados para potenciais sondas. O anticorpo 2E7 seleccionado, que foi obtido da imunização com β-amilóide 1-40 solúvel, era de isótipo IgG2a murino e tinha actividade de ligação de beta-amilóide no ensaio de efluxo, descrito abaixo e uma afinidade de 36,1 pM para beta-amilóide 1-40, quando medido por Biacore™, Método A(i) (Tabela 10A) . 43

Mapeamento de Epitopo de 2E7

De modo a finamente mapear a ligação de anticorpo 2E7 ao péptido β-amilóide, foi utilizado um conjunto de péptidos (A). 0 conjunto de péptidos (A) consistia num conjunto de 31 péptidos de sobreposição de 12-meros cobrindo a sequência completa do péptido β-amilóide 1-42. Cada péptido sequencial foi iniciado no aminoácido sequencial dentro do péptido β-amilóide, deslocando deste modo a sequência abrangida entre péptidos sequenciaispor um único aminoácido. Todos os péptidos no conjunto (A) continham um adaptador C-terminal de 3 aminoácidos (glicina-serina-glicina) e um resíduo de lisina biotinilada terminal. Adicionalmente, todos os péptidos excepto O péptido Αβί DAEFRHDSGYEVGSGK-biotina (SEQ ID N° 15) foram N-terminalmente acetilados. Um segundo conjunto de péptidos (conjunto (B)) consistia em deleções N-terminais de um aminoácido sequenciais de um péptido contendo os aminoácidos 1 a 10 da sequência β-amilóide. Todos os péptidos no conjunto (B) continham um adaptador C-terminal de 3 aminoácidos (glicina-serina-glicina) e um resíduo de lisina biotinilada terminal, mas com resíduos adicionais de glicina e serina para substituir os aminoácidos β-amilóide delecionados (Tabela 2) . Deste modo, todos os péptidos no conjunto (B) são do mesmo comprimento. 44

Tabela 2

Sequências de péptidos biotinilados (conjunto (B)) que continham fragmentos N-terminais truncados de β-amilóide (SEQ ID N° 7) (SEQ ID N° 8) (SEQ ID N° 9) (SEQ ID N° 10) (SEQ ID N° 11) (SEQ ID N° 12) (SEQ ID N° 13) (SEQ ID N° 14) DAEFRHDSGYGSGGSK-biotina DAEFRHDSG—GSGSGSK-biotina DAEFRHDS—GSGGSGGK-biotina DAEFRHD—GSGGSGGSK-biotina DAEFRH—GSGGSGGSGK-biotina DAEFR—GSGGSGGSGSK-biotina DAEF—GSGGSGGSGGSK-biotina DAE—GSGGSGGSGGSGK-biotina

Monitorização da ligação de 2E7 a péptidos derivados de β-amilóide utilizando Biossensores Ópticos

Placas de 96 poços revestidas com estreptavidina SRU Bind™ (SRU Biosystems) foram lavadas com PBS contendo 1% de DMSO, de modo a remover glicerol e conservante. Um volume de 50 pL/poço foi deixado equilibrar, à temperatura ambiente, de modo a proporcionar uma linha de base constante. Os péptidos biotinilados foram diluídos para, aproximadamente, 0,3 pg/mL em PBS contendo 1% de DMSO e 50 pL de cada foram adicionados aos poços e incubados durante, aproximadamente, 1 h. Os poços replicados foram preparados utilizando sectores diferentes da placa e, pelo menos, um poço de controlo sem péptido foi utilizado em cada sector para subtrair a referência dos dados. Após captura de péptido, a placa foi lavada com PBS contendo 45 1% de DMSO, deixando 50 pL de tampão fresco por poço, de modo a proporcionar uma linha de base nova no leitor. Não foi verificado qualquer decaimento de péptido da superfície. O tampão foi, depois, substituído com 40 pL de tampão/poço contendo anticorpo de teste a 20-64 nM, durante 2 horas. Verificou-se que o anticorpo 2E7 apenas se ligou no péptido abrangendo os aminoácidos 1-12 do péptido β-amilóide no conjunto de péptidos (A) (péptido Αβί, SEQ ID N° 15). Este resultado implica que o ácido aspártico no resíduo 1 é crítico para a ligação a este péptido.

De modo a caracterizar adicionalmente o sítio de ligação de anticorpo 2E7, foi utilizado o conjunto de péptidos (B) . Utilizando metodologia de biossensor SRU BIND™, o anticorpo 2E7 mostrou ligação desprezível aos péptidos abrangendo os aminoácidos 1-3 e 1-4 do péptido β-amilóide (SEQ ID N° 14 e 13). A ligação a um péptido abrangendo os aminoácidos 1-7 do péptido β-amilóide (SEQ ID N° 10) foi comparável ao péptido abrangendo os aminoácidos 1-12 do péptido β-amilóide (do conjunto de péptidos (A)). A ligação a péptidos abrangendo os aminoácidos 1-5 ou 1-6 do péptido β-amilóide (SEQ ID N° 12 ou 11) foi observada mas foi mais fraca (como medida por estabilidade após uma etapa de lavagem adicional) do que a ligação ao péptido abrangendo os aminoácidos 1-7 do péptido β-amilóide (SEQ ID N° 10).

Deste modo, demonstrou-se que apenas os resíduos 1-7 do péptido β-amilóide são requeridos para ligação total, como medida utilizando esta metodologia. 46

Ensaio de Ressonância de Plasmónio de Superfície

Adicionalmente às experiencias descritas anteriormente, o biossensor óptico Biacore 3000™ foi utilizado para monitorizar a ligação de anticorpo 2E7 aos péptidos derivados de sequência β-amilóide seleccionados. A ligação foi medida por injecção de anticorpos de teste a até 64 nM, durante 5 minutos, sobre péptidos capturados em superfícies de chip de estreptavidina separadas (130-230 RU (unidades de ressonância)). Um tampão de corrida (HBS-EP), contendo HEPES a 0,01 M, pH 7,4, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM e Surfactante P20™ a 0,005%, a 25 °C, foi utilizado a um caudal de 20 pL/min. Todas as corridas foram duplamente referenciadas contra uma superfície de estreptavidina de branco e injecções de branco. A análise foi efectuada utilizando o software de analise de Biacore BIAevaluation , versão 4.1. Os resultados de péptidos seleccionados no conjunto (A) confirmaram adicionalmente os dados derivados de SRU BIND , indicando que ο 2E7 se ligou apenas ao péptido abrangendo os aminoácidos 1-12 (SEQ ID N° 15) do péptido β-amilóide, com uma constante de equilíbrio aparente, KD, de, aproximadamente, 50 pM. Sob as mesmas condições, ο 2E7 não se ligou ao péptido contendo os aminoácidos 2-13 do péptido β-amilóide. Péptido Αβ2-13 AEFRHDSGYEVHGSGK-biotina (SEQ ID N° 44) O método e as condições experimentais utilizados permitiram a detecção de moléculas de afinidade alta mas, igualmente, mais baixa - na mesma configuração experimental, em contraste com 2E7, demonstrou-se que outro anticorpo reconhecendo um epitopo N-terminal do péptido β-amilóide se liga ao péptido 2-13 47 (SEQ ID N° 44), com uma KD aparente de 7 nM. Ο 2E7 não se ligou a uma selecção de péptidos no conjunto (A) das regiões centrais do péptido β-amilóide. Numa experiência separada, o péptido β-amilóide 1-40 foi capturado por meio do seu resíduo de ácido aspártico N-terminal que havia sido biotinilado. Este péptido foi capturado sobre um chip revestido com estreptavidina Biacore™, como anteriormente descrito. O anticorpo 2E7, injectado a 66 nM, durante 1 minuto, não se pôde ligar a este péptido. Por conseguinte, conclui-se que o sitio de ligação N-terminal anteriormente descrito foi mascarado pelo adaptador e método de captura confirmando, deste modo, adicionalmente, a extremidade N-terminal como contendo o sitio de ligação nuclear.

Ligação a Proteína Precursora de Amilóide (APP) Expressa em Célula O β-amilóide é composto por péptidos formados por clivagem proteolítica de uma proteína precursora transmembranar de tipo I, denominada proteína precursora de amilóide (APP). Como a APP tem um domínio extracelular de grandes dimensões, a ligação a esta proteína poderia potencialmente iniciar uma reacção de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

De modo a caracterizar a ligação de anticorpo a APP de comprimento completo de superfície celular, foi utilizado um ensaio baseado em FMAT™ ABI8200. 48

Transfecção de células HEK293T com ADN de APP de tipo selvagem Células HEK293T são mantidas em meio DMEM F12, contendo 10% (v/v) de FCS e lx Glutamax. As células são semeadas em frascos de cultura de tecidos de 75 cm2 e cultivadas até confluência de 60-80% (18-24 h), antes da transfecção. Para transfecção, 9 pg de ADN, (quer de ADN de APP de tipo selvagem (em vector PCDNA3.1 (Invitrogen)) ou controlos de apenas

vector), são misturados com 0,3 mL de meios Opti-MEM™. 30 μΐ de agente de transfecção Lipofectamine™ são misturados com 0,3 mL de meios Opti-MEM™ e as duas misturas agregadas. As misturas agregadas são incubadas, à temperatura ambiente, durante 30 min, antes da adição de 4,8 mL adicionais de meios Opti-MEM™. A mistura final é adicionada às células (após lavagem com meios OptiMEM™), durante 5 h, e 6 mL de soro de vitelo recém-nascido a 10% (v/v) em DMEM, são depois adicionados. 48 horas após a transfecção, o sobrenadante é removido e a monocamada lavada em verseno e, depois, 3 mL de agente quelante Versene™ são adicionados a cada frasco, incubados durante 5 min, a 37 °C e as células desprendidas sedimentadas a 200 g, durante 5 min. O sedimento celular resultante é cuidadosamente ressuspenso em 1 mL de tampão de ensaio (2% de soro tratado com calor, BSA a 0,5%, NaN3 a 0,1% em PBS, pH 7,4, filtrado através de um filtro de 0,2 pm), de modo a criar uma suspensão de célula única.

Ensaio baseado em FMAT™ ABI8200

Anticorpos de teste (IgG de murganho 2E7, LN27 (Zymed) para dominio extracelular de APP, como um controlo positivo e um anticorpo G210 que reconhece a forma x-40 do péptido β-amilóide, 49 como um controlo negativo) foram diluídos para 10 pg/mL em tampão de ensaio filtrado estéril (2% de soro tratado com calor, BSA a 0,5%, NaN3 a 0,1% em PBS, pH 7,2) numa placa de polipropileno e, depois, foram realizadas seis diluições seriais adicionais 1:1 na placa. O tampão de ensaio apenas foi utilizado como um branco. 50 pL de uma suspensão de células HEK293T transfectadas com ADN de APP de tipo selvagem (Experiência 1: 10000 células; Experiência 2: 20000 células) foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços, às quais foram adicionados 5 pL de cada uma das soluções de anticorpo a poços em duplicado. 50 pL/poço de stock de IgG anti-murganho azul F-MAT™, (o anticorpo é marcado utilizando o kit de corante reactivo monofuncional azul F-MAT™ da ABI, 4328408), diluído 1:500 (Experiência 1) e 1:1000 (Experiência 2) em tampão de ensaio, foi depois adicionado a cada poço e a placa brevemente agitada e deixada sedimentar, durante 1 h. A placa foi, depois, lida utilizando o sistema de detecção celular macroconfocal de fluorescência ABI 8200 (Applied Biosystems).

Os dados de contagens derivados foram, depois, interpretados utilizando o software de folha de cálculo Excel™. Resumidamente, as contagens de transfectado falso foram subtraídas das contagens de células transfectadas com APP de comprimento completo, de modo a obter-se um sinal específico para cada anticorpo. Duas concentrações de anticorpo que estavam na parte linear da curva foram escolhidas (1,25 e 0,63 pg/mL) e as contagens derivadas corrigidas de fundo nestas concentrações expressas como a percentagem da ligação de anticorpo LN27 e tomadas as médias sobre as duas concentrações de anticorpo. Os dados resultantes são descritos na Tabela 3 (% de ligação de LN27 ±SE). 50

Deste modo, dentro deste sistema de ensaio, a ligação de 2E7 a APP de superfície celular é indistinguível daquela do anticorpo de controlo negativo G210 .

Tabela 3

Anticorpo Experiência 1 Experiência 2 LN27 100,0 ± 7, 1 100,0 ± 4,7 G210 5,5 ± 1,3 2,0 ± 1,6 2E7 9,9 ± 3,7 2,2 ± 1,4

Ligação a Péptido Derivado de Proteína Precursora de Amilóide

Os estudos de mapeamento de epitopo anteriormente descritos mostraram que o anticorpo 2E7 se liga à extremidade N-terminal do péptido β-amilóide, com o resíduo de ácido aspártico na posição 1 sendo essencial para a ligação. Isto sugere que o anticorpo reconhece um 'neo' epitopo formado pela clivagem de APP no sítio de β-secretase. Esta observação sugeriria que o anticorpo 2E7 não deveria reconhecer a sequência peptídica de APP adjacente. De modo a testar esta hipótese, foi sintetizado um péptido de APP (Péptido APPl, SEQ ID N° 16) que incluía os resíduos 1-7 do péptido β-amilóide e os cinco aminoácidos derivados de APP adjacentes. Deste modo, o péptido APPl continha aminoácidos contíguos da posição 5, N-terminal ao sítio de clivagem BACE-1, à posição 7, C-terminal ao sítio de clivagem BACE-1, e estava N-terminalmente acetilado. A capacidade de o anticorpo 2E7 se ligar ao péptido derivado de APP, APPl e ao péptido β-amilóide 1-12 (péptido Αβί) foi comparada utilizando a 51 metodologia Biacore™ (como anteriormente descrito para o mapeamento de epitopo). O anticorpo 2E7 mostrou ligação de elevada afinidade ao péptido β-amilóide Αβ-l, que contém o epitopo básico 1-7. Contudo, não foi observada qualquer ligação ao péptido APPl que contém igualmente a sequência 1-7 derivada de β-amilóide básico. Péptido Αβί DAEFRHDSGYEVGSGK-biotina SEQ ID N° 15 APPl AcNH-SEVKMDAEFRHDGSGK-biotina SEQ ID N° 16

Foi utilizada uma combinação de ligação celular baseada em FMAT™ e mapeamento peptidico baseado em Biacore™ para mostrar que, nestes formatos, ο 2E7 não tem qualquer afinidade de ligação para a proteína APP de comprimento completo. Dado que o resíduo de ácido aspártico na posição 1 do péptido β-amilóide é requerido para ligação, conclui-se que ο 2E7 apenas reconhece a 'neo' extremidade N de β-amilóide e, por este motivo, não se deve ligar a APP expressa em superfície celular.

Actividade Biológica In vivo Modelo de Efluxo de I125 β-Amilóide

Um número de estudos publicados mostrou que os anticorpos β-amilóide podem formar complexos com péptido β-amilóide na corrente sanguínea. É argumentado que este sequestro de β-amilóide periférico permite o efluxo adicional de amilóide de CNS para dentro da corrente sanguínea (DeMattos RB, PNAS (2001), 52 98(15); 8850-8855). Foi desenvolvido um modelo farmacodinâmico agudo para rastrear anticorpos para a sua capacidade para se complexarem com o péptido β-amilóide derivado de cérebro na corrente sanguínea.

Anestesia (isoflurano a 4%) foi induzida em murganhos macho C57/BL6J e mantida (isoflurano a 1,5%) em oxigénio a 100%. Os animais foram, depois, colocados num suporte estereotáxico. Após incisão na linha média ao longo da sutura sagital, um orifício foi perfurado através do crânio e uma cânula guia foi inserida no ventrículo cerebral lateral (coordenadas anterioposterior (AP) -0,5 mM, lateral (L) +0,7 mM, ventral (V) -2,5 mM) . Dois orifícios adicionais foram perfurados através do crânio, dentro dos quais foram colocados parafusos corticais. A cânula foi ancorada no lugar por gel de cianoacrilato e a incisão foi suturada em torno da tampa de cabeça de gel de cianoacrilato. Pós-operatoriamente, os murganhos receberam 0,3 mL de solução salina subcutaneamente e foram colocados num ambiente quente, de modo a recuperarem da anestesia. Após recuperação do reflexo direito, os murganhos foram alojados individualmente e receberam cuidado pós-operatório padrão de 5 dias. Não foram permitidos quaisquer processos durante 5 dias adicionais ou até que o peso corporal pós-operatório fosse readquirido. Após a recuperação, a colocação da cânula foi verificada por resposta de bebida de angiotensina II. Cada murganho recebeu uma administração intracerebroventricular (ICV) (5 pL) de 100 ng de angiotensina II (AII) (preparada em solução salina a 0,9%). Após a administração de AII, a ingestão de água foi observada durante 15 minutos. Os murganhos com uma resposta dipsogénica positiva à AII (bebida sustentada) foram incluídos nos estudos, que começaram não antes de cinco dias após a injecção de AII. 53

No dia de estudo, os murganhos foram colocados 5-10 minutos num ambiente quente, de modo a induzir a vasodilatação, necessária para facilitar a injecção dentro da veia da cauda. Anticorpo de teste (600 pg) ou veiculo de PBS (volume de dose não superior a 10 mL por kg de peso corporal) foi injectado via veia da cauda e, após injecção, os murganhos foram restituídos às suas gaiolas individuais. Exactamente uma hora após a injecção na veia da cauda, os murganhos foram lentamente injectados ICV (2 pL por minuto) com 2 ng (1 pCi) de I125 beta-amilóide 1-40 (Amersham Biosciences, UK) num volume de dose de 5 pL. Exactamente quatro horas após a dose ICV, 50 pL de sangue de tronco foram recolhidos e o nível de radioactividade medido num contador de cintilação.

Os murganhos que haviam sido injectados na veia da cauda com 2E7 (n=6 por grupo de tratamento) mostraram um aumento estatisticamente significativo no sinal radioactivo (contagens por minuto CPM) em 50 pL de sangue de tronco, em comparação com o sinal de CPM detectado em murganhos injectados com veículo - (CPM - veículo: 1339,7 ± 496,2 vs. 2E7 4387,9 ± 980,3; ANOVArF(2, 13) = 4,97, p<0,05. Post-hoc LSD: p=0,01 2E7 vs. veículo [post-hoc Duncans: p=0,02 2E7 vs., veículo]).

Em dois estudos adicionais com 2E7, conduzidos com o protocolo idêntico, foram observados aumentos semelhantes em efluxo de amilóide para dentro do sangue quando comparados com controlos injectados com veículo (sangue CPM: Veículo 352 +/- 113 versus 2E7 2397 +/- 353, e Veículo 1281 +/-312 versus 2E7 5291 +/- 885; ANOVA com teste post-hoc LSD p<0,001 vs. veículo). 54

Modelos de Descida de β-Amilóide de CNS Transgénico 1. Carqa de β-Amilóide após dosagem de 4 semanas de murganhos TASTPM de 2 meses de idade

Murganhos macho e fêmea transgénicos TASTPM (mutante duplo APPswe x PS1.M146V, Howlett DR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130-136), com idades entre 61 e 65 dias no inicio do estudo, e individualmente alojados. Foi atribuído um número igual de murganhos a cada grupo de tratamento (N=12 por grupo) e foram separados aleatoriamente de acordo com sexo e idade. Os grupos de tratamento compreenderam os seguintes: A: MOPC21 (anticorpo com especificidade desconhecida, Holton et al. (1987) J.lmmunol 139(9) 3041-3049, controlo negativo), B: 2E7 (anticorpo de teste). Todos os anticorpos foram dissolvidos em PBS e foram dosados pela via intraperitoneal. Independentemente do peso do animal, foram administrados 300 pg de anticorpo. Os animais foram doseados duas vezes semanalmente, durante quatro semanas. Um dia após a dose final, os animais foram eutanasiados por sobredosagem com pentobarbital sódico. Os cérebros foram dissecados e hemiseccionados. As amostras de cérebro hemiseccionado foram recolhidas em tubos Eppendorf™ de 2 mL pré-pesados e rapidamente congelados. As amostras foram subsequentemente descongeladas, repesadas e 1 mL de guanidina HC1 a 5 M, contendo pastilhas de Complete protease inhibitor™ (Boehringer Mannheim) adicionado, antes de as amostras serem homogeneizadas e incubadas a 4 °C, durante >90 min, com agitação constante.

As amostras foram, depois, diluídas 1 em 10 em tampão de ensaio (Tris HC1 a 50 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, Tween-20 a 0,05% + BSA a 1%), agitadas e centrifugadas a 20000 G, durante 55 20 mins, a 4 °C. O sobrenadante foi removido e adicionado como amostras em triplicado à placa de ensaio.

Os niveis de A640 e A1342 foram medidos utilizando um imunoensaio electroquimioluminescente baseado em placa sensível (BioVeris™), empregando anticorpos de β-amilóide específicos C-terminais (para Αβ40 ou Αβ42), marcados com a marca especifica Oritag , de modo a facilitar a detecção (BioVeris™), utilizados para captura quer de Αβ40 ou Αβ42, juntamente com um anticorpo Αβ especifico N-terminal biotinilado. Os complexos de anticorpo-Αβ foram capturados com esférulas revestidas com estreptavidina que se ligam a anticorpos biotinilados (Dynabeads™, Dynal) incubados, de um dia para o outro, à temperatura ambiente, com agitação vigorosa e ensaiados num fotodetector BioVeris™ M8. As curvas padrão foram construídas utilizando péptidos Αβ40 e Αβ42 humanos em tampão de ensaio, contendo a concentração requerida de Guanidina HC1. Os dados foram analisados utilizando o software de análise estatística Excel Robosage™ e os níveis de Αβ expressos como pMol/g de tecido.

Neste paradigma, o tratamento com anticorpo 2E7 reduziu a carga de CNS Αβ40 em 37% (p<0,001) e CNS Αβ40 em 23% (p<0,001).

Em estudos subsequentes sob condições experimentais semelhantes, o anticorpo 2E7 reduziu a carga de CNS Αβ40 em 38% (Estudo 1, machos apenas), 22% (Estudo 2, não significativo) e 39% (Estudo 3, machos, p=0,001) e 13% (Estudo 3, fêmeas, não significativo), quando comparado com animais tratados com PBS. Nestes estudos, ο 2E7 reduziu, igualmente, o CNS Αβ40 em 18% (Estudo 3, machos, p=0,017) e ofereceu uma redução não significativa em CNS Αβ40 em 25% (Estudo 1, machos apenas), 56 < 1% (Estudo 2) e um aumento não significativo de 3% (Estudo 3, fêmeas), quando comparado com animais tratados com PBS. 2. Carga de β-Amilóide após dosagem de 4 meses de murganhos tastpm de 4 meses de idade

Resumidamente, murganhos transgénicos TASTPM de 4 meses de idade foram doseados com 300 pg de anticorpo, uma vez ou duas vezes por semana, por meio de uma via intraperitoneal (i.p.)· Após 4 meses de dosagem, os níveis de CNS β-amilóide foram medidos por ELISA e a carga de placa foi medida por imunohistoquímica. Entre as idades de 4 e 8 meses, a carga de CNS β-amilóide aumenta exponencialmente e, consequentemente, a patologia de placa desenvolve-se rapidamente (Howlett DR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130-136).

Os murganhos tinham idades entre 120 e 128 dias no início do estudo e foram individualmente alojados. Um número semelhante de murganhos foi atribuído a cada grupo de tratamento (N=20 ou 21 por grupo) e foram separados aleatoriamente de acordo com o sexo e idade. Os grupos de tratamento compreenderam os seguintes: A: PBS (veículo) doseados duas vezes por semana, B: 2E7 doseados uma vez por semana, C: 2E7 doseados duas vezes por semana, D: PBS doseados uma vez por semana. Uma dose de 300 microgramas (volume de 79 microlitros) de 2E7 foi administrada por meio da via intraperitoneal. Os animais tratados com veículo receberam o mesmo volume de PBS. Os animais foram doseados durante dezoito semanas. Os murganhos tastpm são propensos a sofrerem de convulsões espontâneas e, como resultado, um certo número de animais morreu durante o decurso do estudo. Os números finais foram como se segue A: 4 fêmeas, 57 9 machos; B: 5 fêmeas, 8 machos; C: 4 fêmeas, 9 machos; D: 2 fêmeas, 9 machos. Dois ou quatro dias após a dose final (igual número por grupo), os animais foram eutanasiados por sobredosagem com pentobarbital sódico. Uma amostra da ponta da cauda de cada murganho foi retirada para confirmação do genótipo. Os cérebros foram dissecados e hemiseccionados. 0 hemisfério direito foi fixado por imersão em paraformaldeído a 4% e processado para histologia. 0 hemisfério esquerdo foi recolhido para dentro de tubos Eppendorf™ de 2 mL pré-pesados, congelado sobre gelo seco e armazenado a -80 °C, para análise subsequente de teor de amilóide. Antes da análise, as amostras foram descongeladas, repesadas e 1 mL de guanidina HC1 a 5M, contendo pastilhas de Complete protease inhibitor™ (Boehringer Mannheim), adicionado, antes de as amostras serem homogeneizadas e incubadas a 4 °C, durante >90 min, com agitação constante. AS amostras foram, depois , diluídas 1 em 10 em tampão de ensaio (Tris HC1 a 50 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, Tween-20 a 0,05% + BSA a 1% ), agitadas e centrifugadas a 20000 G, durante 20 mins, a 4 °C. Os sobrenadantes foram diluídos a 1:1000 adicional e adicionados como amostras em triplicado à placa de ensaio.

Os níveis de Αβ40 e Αβ42 foram medidos como para o estudo de dosagem de 4 semanas.

Uma análise de variância foi utilizada com tratamento, sexo e programa de dosagem incluídos no modelo como efeitos fixos. Todas as interacções entre os três factores foram igualmente incluídas. Não existiram diferenças significativas entre os dois programas de dosagem (uma vez ou duas vezes por semana) . Com esta concepção experimental, em primeiro lugar pôde avaliar-se 58 se existiram quaisquer diferenças significativas entre os programas de dosagem e, em segundo lugar, como não existiram tais diferenças significativas, os dados dos dois programas de dosagem puderam combinar-se aumentando, deste modo, a potência da experiência por duplicação do número de murganhos na análise.

Neste paradigma, o tratamento com anticorpo 2E7 reduziu a carga de CNS Αβ42 em 22,5% (p=0,0152). Os níveis de CNS Αβ40 foram, igualmente, reduzidos em 12,1%, porém este número não alcançou significância estatística (p=0,118).

Foi realizada uma análise imunohistoquímica complexa destas amostras, de modo a definir a área de tecido cerebral mostrando patologia de placa. As secções foram retiradas do córtex ao nível do caudado e do córtex ao nível do hipocampo. As secções adjacentes foram coradas quer com um anticorpo específico para Αβ40 ou Αβ42 ou, alternativamente, com o corante amilóide Vermelho Congo. Utilizando o software de análise de imagem, a área da secção corada para placa foi expressa como uma percentagem da área de secção total.

Após fixação, as metades cerebrais imersas em PFA foram coronalmente cortadas numa matriz cerebral em 6 secções de espessura de 6 x 2 mm. Estas secções de 6 x 2 mm irão ser designadas por secções A a F, A sendo a mais rostral e F a mais caudal. As secções A, B&CeD, E&F foram colocadas em cassetes de embebimento separadas numeradas para cada animal. As cassetes foram mantidas em PFA até prontas para processamento e embebimento. 59 0 embebimento foi realizado num processador de tecido Citadel™ 1000 (Shandon). Todos os tecidos receberam o seguinte regime de processamento: IMS a 70% - 1 h IMS a 100% - 3 x 1 h Etanol a 100% - 2 h Álcool isobutilico a 100%; 1x2 hr; 1 x 1,5 h Histoclear™ - 2 x 1,5 h Cera de parafina - 2 x 2 h

Após conclusão do ciclo de processamento, as secções de tecido impregnadas com cera foram transferidas para moldes de base cheios com cera de parafina fundida e embebidas utilizando um sistema de embebimento de parafina Histocentre™ (Shandon). O tecido foi embebido, de modo a que as secções A, B & C fossem para um molde; D, E & F para um segundo molde. Isto foi efectuado para todos os conjuntos de secções, i. e., cada cérebro hemiseccionado resultou em dois blocos de cera de três secções cada. As secções foram colocadas em moldes, de modo a que a superfície caudal de cada peça se tornasse a superfície de corte futura. Foi tido cuidado, de modo a garantir que cada secção fosse empurrada bem para baixo no molde, de modo que a microtomia de cada pudesse ocorrer em paralelo. A cassete de processamento perfurada foi, depois, cuidadosamente colocada sobre cada molde que foi, depois, sobrerevestido com cera fundida. Os blocos embebidos foram, depois, arrefecidos sobre a placa refrigerada até que pudessem ser removidos dos moldes. Os blocos foram armazenados, à temperatura ambiente, até serem requeridos para microtomia. Os blocos foram cortados aleatoriamente e secções de 5 micrómetros foram flutuadas sobre 60 lâminas revestidas com gelatina, pré-marcadas (Superfrost™, Erie Scientific Company). Duas secções foram flutuadas sobre cada lâmina. Sempre que possível, secções consecutivas foram montadas e as lâminas foram numeradas consecutivamente, de 1 a 25. Cinquenta secções (25 lâminas) foram retiradas de cada bloco. As lâminas foram secas sobre uma placa quente e, depois, armazenadas à temperatura ambiente, até serem requeridas. A imuno-histoquímica foi realizada em conjuntos de 30 lâminas. Sobre cada lâmina, a secção de topo foi marcada com um anticorpo Αβ40 (G30, policlonal de coelho reconhecendo x-40 β-amilóide), a secção inferior com o anticorpo Αβ42, 20G10, anticorpo monoclonal reconhecendo x-42 β-amilóide. Foi marcado um mínimo de 5 secções por bloco. A marcação foi efectuada como se segue. Após remoção de cera através de Histoclear e álcoois graduados, as secções foram imersas em ácido fórmico a 85%, durante 8 minutos e, depois, bloqueadas em peróxido de hidrogénio a 0,3%, durante 30 minutos, de modo a bloquear peroxidases endógenas. Os anticorpos G30 e 20G10 foram ambos aplicados, de um dia para o outro, em diluições de 1:1000, sendo as secções deixadas a 4 °C. A revelação das secções foi com os respectivos secundários anti-coelho e anti-murganho biotinilados. A revelação de cor foi realizada com um kit de coloração de tetracloridrato de diaminobenzidina (DAB™, Vector Labs). As secções foram brevemente contrastadas com hematoxilina de Mayer, antes de serem desidratadas, limpas e cobertas com lamelas.

As secções foram deixadas secar durante, pelo menos, 48 horas antes da microscopia. As imagens foram capturadas num microscópio Leica DMRB™ equipado com câmara digital. As imagens 61 foram analisadas utilizando o software Qwin™ (Leica) e os resultados apresentados como % da área de secção que foi marcada pelo anticorpo Αβ.

Uma análise de variância foi utilizada com tratamento, sexo e programa de dosagem incluídos no modelo como efeitos fixos. Todas as interacções entre os três factores foram, igualmente, incluídas. Não existiram diferenças significativas entre os dois programas de dosagem (uma vez ou duas vezes por semana) . Com esta concepção experimental, em primeiro lugar pôde avaliar-se se existiram quaisquer diferenças significativas entre os programas de dosagem e, em segundo lugar, como não existiram quaisquer diferenças significativas, os dados dos dois programas de dosagem puderam se combinados aumentando, deste modo, a potência da experiência por duplicação do número de murganhos na análise.

Neste paradigma, o tratamento com o anticorpo 2E7 reduziu a patologia de placa, como medida com um anticorpo reconhecendo Αβ42. A patologia de placa foi reduzida em 27,1% (p=0,0026) no córtex ao nível do hipocampo e em 43% (p<0, 0001) no córtex ao nível do caudado. A patologia de placa foi, igualmente, reduzida quando medida com um anticorpo reconhecendo Αβ40. A patologia de placa foi reduzida em 16,6% (p=0, 0421) no córtex ao nível do hipocampo e em 17,3% (p=0,0342) no córtex ao nível do caudato. Não foi observada evidência de micro-hemorragia (como determinada por Azul da Prússia de Perl) em quaisquer murganhos deste estudo tratados com veículo ou 2E7. Este método visualiza o ferro férrico (o ferro é um constituinte essencial da hemoglobina transportando oxigénio verificada em glóbulos 62 vermelhos) por produção de um composto azul insolúvel. Todos os níveis de cérebro de todos os animais estavam limpos.

Modelos de cognição

Após a dosagem de 4 meses dos murganhos TASTPM de 4 meses de idade, como descrita anteriormente, estes murganhos foram testados em dois modelos de cognição: o ensaio de reconhecimento de objecto e o ensaio de condicionamento de medo.

Ensaio de reconhecimento de objecto 0 ensaio de reconhecimento de objecto explora a propensão natural do animal para explorar novos objectos e baseia-se na capacidade do animal para se lembrar de um objecto que havia sido explorado anteriormente (objecto familiar). Foi referido que os murganhos TASTPM de oito meses de idade demonstram um défice na capacidade para distinguir entre objectos novos e familiares (Howlett et al., 2004), indicando desempenho cognitivo disfuncional nestes animais. Neste estudo, contudo, murganhos TASTPM de 8 meses de idade, tratados com veiculo, fracassaram em demonstrar disfunção cognitiva, i. e., os mesmos foram capazes de distinguir entre objectos novos e familiares. Por conseguinte, não existiu qualquer janela para investigar qualquer efeito terapêutico potencial resultando do tratamento com 2E7. 63

Ensaio de condicionamento de medo 0 modelo de condicionamento de medo foi concebido para testar a capacidade de o animal correlacionar um estimulo doloroso anterior com um sinal contextuai ou sugestivo e lembrar-se disto quando apresentado ao mesmo contexto ou tom, após atraso de X h. Neste estudo, murganhos TASTPM de 8 meses de idade, tratados com veículo (uma ou duas vezes por semana), exibiram um défice na diferenciação contextuai, indicativo de disfunção cognitiva nestes animais. Este défice não foi afectado pelo tratamento com 2E7, quando administrado uma vez ou duas por semana.

Dosagem de 4 meses de murganhos TASTPM de 6 meses de idade

Este estudo envolveu a administração de 2E7 (300 pg, i.p., duas vezes por semana) a murganhos TASTPM, durante 4 meses, começando aos 3 meses de idade. Os animais de controlo receberam IgG2A em PBS. Como descrito anteriormente, os cérebros foram dissecados e hemiseccionados. O hemisfério direito foi fixado por imersão em paraformaldeído a 4% e processado para histologia. O hemisfério esquerdo foi recolhido em tubos Eppendorf™ de 2 mL pré-pesados, congelado sobre gelo seco e armazenado a -80 °C, para análise subsequente de teor de amilóide.

Foi realizada uma análise preliminar de uma única secção de cada de uma selecção aleatória de amostras de cérebro (n=6 veículo, n=7 grupo tratado com 2E7) por IHC utilizando o mesmo protocolo geral como anteriormente. A análise estatística (teste t de Student) mostrou que existiu uma diminuição 64 significativa na carga de placa Αβ42 no tálamo (71,9%, p=0,007) e no tálamo + córtex + hipocampo (54,1%, p=0,022) em murganhos doseados com 2E7 mas sem alteração significativa em Αβ40.

Para medição bioquímica de Αβ40 e Αβ42 de cérebro, as amostras foram processadas e medidas como anteriormente (factor de diluição 1:10000). Ο Αβ42 foi significativamente diminuído (p=0,01) em 29,9% em murganhos doseados com 2E7 (n=12 controlo, n=16 tratado). As concentrações de Αβ40 foram, igualmente, diminuídas (22,6%) mas esta diminuição fracassou no alcance de significância estatística (p=0,052).

Clonagem de Regiões Variáveis de Hibridoma Seguências de Região Variável O ARN total foi extraído de células de hibridoma 2E7 e as sequências de ADNc de domínio variável pesado e leve foram, depois, geradas por transcrição reversa e reacção de polimerização em cadeia (RT-PCR). O iniciador directo para RT-PCR era uma mistura de iniciadores degenerados específicos das sequências líderes génicas de imunoglobulina murina e o iniciador inverso era específico das regiões constantes de anticorpo, neste caso o isótipo IgG2a murino para a cadeia pesada e capa murino para a cadeia leve. Os iniciadores foram concebidos de acordo com a estratégia descrita por Jones e

Bendig (Bio/Technology 9:88, 1991). O RT-PCR foi efectuado em duplicado para ambas as sequências de região v, de modo a permitir a verificação subsequente das sequências de região V correctas. Os produtos de região V gerados por RT-PCR foram 65 clonados (Invitrogen TA Cloning Kit) e obtidos os dados de sequência.

Sequência de Aminoácidos de 2E7 VH (SEQ ID N2 17)

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAVSGFTFSDNGMAWVRQAPRKGPEWIAFISNLA

YSIDYADTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCVSGTWFAYWGQGTLV

TVSA

Sequência de ADN de 2E7 VH (SEQ ID N2 18)

GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCC T G AAACT CT CCTGTG CAGT CT CTGG ATT CACTTT CAGT G ACAACGGAAT GGCGT GGGTT CG ACAGGCT CCAAGG AAGGGGCCT GAGT GG AT AGCGTT CATT AGTAAT TTGGCAT AT AGT AT CGACT ACGCAG ACACT GT G ACGGGCCG ATT CACCAT CT CT AG AGAT AATGCCAAGAAT ACCCT GTACCT GG AAAT G AGCAGT CT GAGGT CT G AG GACACGGCCATGTACTATTGTGTAAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAA GGG ACT CT GGT C ACT GTCTCTGC A

Sequência de Aminoácidos de 2E7 VL (SEQ ID N2 19)

DWLTQTPLSLPVSLGDQASISCRVSQSLLHSNGYTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVS

NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQTRHVPYTFGGGTKLEIK

Sequência de ADN de 2E7 VL (SEQ ID N2 20)

G AT GTT GT GCT GACCCAAACT CCACT CTCCCT GCCTGT CAGT CTT GG AG AT CAA GCCTCCATCTCTTGCAGAGTTAGTCAGAGCCTTTTACACAGTAATGGATACACCT ATTTACATT GG1ACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCT CCAAAGCT CCT GAT CTACA AAGTTT CCAACCG ATTTT CTGGGGT CCCAGACAGGTT CAGTGG CAGTGG ATCAG G G AC AG ATTT CACACTCAAG AT CAGCAGAGT G G AGGCT G AGG AT CTGGG AGTT T ATTT CT GCT CTCAAACTAGACAT GTT CCGTACACGTT CGGAGGGGGG ACCAAG CTGGAAATAAAA

Nas sequências de aminoácidos, as Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) estão sublinhadas. 66

Clonagem e Expressão de Quimera 2E7

Foi gerado um anticorpo 2E7 quimérico (2E7c), consistindo nas regiões V murinas parentais enxertadas em IgGl humanas (Fc mutado (L235A, G237A)) para as regiões de cadeia pesada ou capa C humanas para a cadeia leve, com o fim de expressar material de anticorpo recombinante que pudesse ser utilizado para confirmar a clonagem correcta de regiões V murinas funcionais. ADN codificando regiões V de cadeias pesada e leve murinas de 2E7 e de sequências sinal murinas endógenas foi clonado, em fase, dentro dos vectores de expressão em mamífero RLD-bshe (para a cadeia pesada) e RLN-bshe (para a cadeia leve), já contendo as regiões constantes humanas (IgGl Fc mutado (L235A, G237A) ou capa C humanas, respectivamente).

Elementos de vector de expressão RLD-bshe para expressão de cadeia pesada:

Pares de Bases Descrição de segmento de ADN 0 - 1014 Promotor (SV40/RSV) 1015 - 2442 Cadeia pesada de anticorpo 2443 - 2765 Poli A 2766 - 3142 Promotor BG 3239 - 3802 DHFR 3803 - 4162 Poli A 4163 - 6322 Estrutura total 5077 - 5937 (cadeia Beta lactamase complementar) 67 (a posição de elementos e tamanho global de vector dados anteriormente são apenas para fins de ilustração e irão depender do tamanho do inserto de cadeia de anticorpo)

Elementos de vector de expressão RLN-bshe para expressão de cadeia leve:

Pares de Bases Descrição de segmento de ADN 0 - 1014 Promotor (SV40/RSV) 1015 - 1731 Cadeia leve de anticorpo 1732 - 2051 Poli A 2388 - 2764 Promotor BG 2774 - 3568 Neomicina 3569 - 3876 Poli A 3877 - 6063 Estrutura total 5077 - 5937 (cadeia Beta lactamase complementar) (a posição de elementos e tamanho global de vector dados anteriormente são apenas para fins de ilustração e irão depender do tamanho do inserto de cadeia de anticorpo)

Foram identificados os clones com sequências VH e VL correctamente clonadas e os plasmídeos preparados para expressão em células CHO em cultura de suspensão. 0 anticorpo 2E7C expresso foi purificado do sobrenadante de cultura celular por cromatografia de proteína A num sistema FPLC e, depois, testado para ligação a Αβ por ELISA e SPR, utilizando a tecnologia 68

Biacore™. Os resultados indicaram que as regiões V de murganho de 2E7 correctas foram clonadas e expressas, resultando num anticorpo funcional, com características semelhantes às do anticorpo murino parental 2E7.

Humanização de Cadeia Leve

Uma sequência aceitadora humana, com o Genpept ID CAA51135 (SEQ ID N° 24) e Acesso Genbank N° X72467, que tinha 77% de identidade ao nivel de aminoácido (incluindo CDR) foi seleccionada como a estrutura aceitadora. A construção LI é um enxerto de CDR murinas do dominio 2E7 VL nesta estrutura aceitadora.

Humanização de Cadeia Pesada A sequência humana de N° de Acesso Genbank M99675 (SEQ ID N° 21), um alelo do gene νΗβ-48, com 74% de identidade ao nivel de aminoácido (incluindo as CDR 1 e 2) com a região pesada variável de murganho de 2E7, foi seleccionada como a estrutura aceitadora de cadeia pesada humana, juntamente com o minigene. Três variantes de cadeia pesada variável humanizados foram concebidos com base na sequência M99675 e JH4. O Hl é um enxerto das CDR murinas utilizando a definição de Kabat, com duas retromutações de estrutura adicionais nas posições 93 e 94. H2 e H3 foram ambos derivados de Hl, mas incorporaram uma mutação de estrutura adicional que era diferente em cada construção; (posições 24 e 48, respectivamente; ver a Tabela 4). 69

Tabela 4

Construção Estruturas Resíduo Humano Murganho molde (Kabat N2) Hl M99675 e 93, 94 A e R, V e S, JH4 respectivamente respectivamente H2 Hl 24 A V H3 Hl 48 V I

Construção de ADN de Cadeias Pesada e Leve Humanizado

As regiões V humanizadas foram sintetizadas, de novo, por construção de oligos de sobreposição e amplificação por PCR. Foram incluídos os sitios de restrição para clonagem dentro de vectores de expressão de mamífero, RLD-bshe e RLN-bshe e as sequências sinal de imunoglobulinas humanas derivadas das estruturas aceitadoras humanas escolhidas. Os ADNs codificando as regiões V humanizadas (Hl (SEQ ID N° 27), H2 (SEQ ID N° 29), H3 (SEQ ID N° 31), Ll (SEQ ID N0° 33)) juntamente com sequências sinal e sitios de restrição foram, depois, clonados, em fase, dentro de vectores de expressão de mamífero: Hl, H2 e H3 em RLD-bshe para gerar ADN codificando três cadeias pesadas mutadas IgGl Fc humanas, de comprimento completo, cada uma contendo as mutações L235A e G237A, Hl de comprimento completo (SEQ ID N° 35), H2 de comprimento completo (SEQ ID N° 37) e H3 de comprimento completo (SEQ ID N° 39); o Ll foi clonado, em fase, dentro de RLN-bshe contendo o ADN codificando a região constante capa humana, de modo a gerar ADN codificando uma cadeia leve capa humana de comprimento completo (SEQ ID N° 41). 70

Exemplos Representativos de Expressão de Combinações de Anticorpos de Cadeias Leve e Pesada Humanizados

As células CH0K1 foram transientemente transfectadas em pequena escala com todas as combinações de construções de ADN de cadeias leve e pesada humanizadas: Ll+Hl, L1+H2, L1+H3 (SEQ ID Nos 35 + 41, 37 + 41, 39 + 41) em placas de 6 poços. As células CH0K1 passadas em DMEM F12, com soro bovino fetal de IgG ultra baixo a 5% e glutamina a 2 mM, foram cultivadas até confluência em placas de 6 poços. As células confluentes foram transfectadas com um total de 7,5 pg de ADN: 30 pg de lipido Transfast (Promega) em meio Optimem Glutamax (Invitrogen). As células transfectadas foram incubadas, a 37 °C, com C02 a 5%. Às 72 horas, os sobrenadantes foram recolhidos e ensaiados para concentração de anticorpo e, depois, testados para ligação a Αβ humano por ELISA. O Ll humanizado, combinado com as três cadeias pesadas humanizadas, expressaram todos o anticorpo completo que se ligou a Αβ humano.

Os anticorpos humanizados foram, igualmente, expressos em transfecções de células CHOKl transientes, de grande escala, utilizando distribuição lipossomal de ADN (e. g., TransFast (Promega)) e expressão em frascos de cultura. Para optimização de niveis de expressão em transfecções transientes foi utilizada uma razão de ADN de vector de expressão de cadeia pesada para leve de 1:6. O material da transfecção transiente foi purificado utilizando colunas ProSepA ou FPLC com colunas ProSepA HiTrap. 71

Avaliação de Variantes Humanizados de 2E7, HlLl, H2L1 e H3L1 em ELISA de Ligação de β-amilóide

Os variantes humanizados de 2E7, HlLl, H2L1 e H3L1 foram avaliados para ligação a péptido Αβ (1-40) humano biotinilado na extremidade C. Ο 2E7 quimérico foi utilizado como referência. As tabelas 5-7 mostram os resultados com diversos lotes de material purificado de transfecções transientes de grande escala.

Tabela 5 ELISA MAb ECso (ug/mL) Erro Padrão Ligação de Αβ Quimera 2E7c 0, 033 0,00144 HlLl 0, 035 0,00142 H2L1 0,048 0,00202 H3L1 0, 044 0,00105

Tabela 6 ELISA MAb ECso (ug/mL) Erro Padrão Ligação de Αβ Quimera 2E7c 0,043 0,00183 HlLl 0,051 0,00164 H2Ll 0,044 0,00191 H3L1 0,055 0,00094 72

Tabela 7 ELISA MAb ECso (ug/mL) Erro Padrão Ligação de Αβ Quimera 2E7c 0,044 0,00169 HlLl 0,047 0,00265 H2L1 0,041 0,00174 H3L1 0,040 0,00116

Estes resultados indicaram perfis de ligação de Αβ muito semelhantes para cada um dos variantes humanizados derivados de 2E7. A comparação dos valores de EC50 com 2E7c mostrou que pouca perda de actividade de ligação de Αβ tinha sido incorrida através do processo de humanização.

Comparação de Variantes Humanizados de 2E7 por ELISA de Competição

Os anticorpos quiméricos 2E7c e humanizados, HlLl, H2L1 e H3L1 foram avaliados quanto à sua capacidade de inibir a ligação entre o péptido Αβ humano e o MAb 2E7 de murganho parental num ELISA de competição.

De modo a comparar a actividade de ligação de Αβ dos três variantes humanizados comparados com o anticorpo quimérico 2E7, foram estabelecidos dois tipos de ELISA de competição. 1) β-amilóide imobilizado·, o péptido Αβ (1-40) humano biotinilado foi imobilizado através de Estreptavidina sobre placas de ELISA. O anticorpo 2E7 de murganho foi adicionado a uma concentração constante, juntamente com uma série de diluições de anticorpos variantes humanizados derivados de 2E7. 73 0 MAb 2Ε7 de murganho ligado foi, depois, detectado com conjugado de IgG anti-murganho. A Tabela 8 mostra os resultados de dois ensaios.

Tabela 8 MAb Competidor Experiência Experiência 1 2 IC5o (ug/mL) Erro Padrão IC50 (ug/mL) Erro Padrão Quimera 2E7c 1,31 0,20 1,29 0,13 H1L1 1,62 0, 40 1, 76 0,21 H2L1 1,28 0,26 1, 66 0,28 H3L1 1,53 0,16 1,39 0,23 2) β-amilóide em solução·, uma concentração constante de β-amilóide foi pré-incubada com uma série de diluições de variantes de anticorpo 2E7 humanizado - a mistura incluindo amilóide complexado e livre foi adicionada durante um curto tempo aos poços contendo MAb 2E7 de murganho imobilizado. A quantidade de β-amilóide livre que estava ainda disponível para ligação ao MAb 2E7 parental imobilizado foi, depois, detectada. A Tabela 9 mostra os resultados de dois ensaios. 74

Tabela 9 MAb Competidor Experiência Experiência 1 2 IC50 (ug/mL) Erro ICso (ug/mL) Erro Padrão Padrão Quimera 2E7c 0,052 0,006 - - HlLl 0,114 0,014 0,140 0, 024 H2L1 0,075 0,009 0,119 0, 014 H3L1 0,069 0,004 0,115 0,013 Todas os variantes de anticorpo humanizados inibiram ligação de MAb 2E7 de murganho a β-amilóide com um perfil muito semelhante. Os valores de IC50 gerados para os variantes H2L1 e H3L1 eram consistentemente próximos daqueles para a quimera 2E7c (se utilizado), que teve a mais elevada actividade inibitória em ambos os ensaios. Contudo, o variante H1L1 mostrou uma actividade inibitória um tanto reduzida em ambos os ensaios, indicando uma possível afinidade por β-amilóide ligeiramente inferior.

Análise SPR Biacore™ de 2E7, 2E7c, HlLl, H2L1, H3L1

Os parâmetros cinéticos de ligação de MAb 2E7 de murganho recombinante, 2E7c quimérico e os variantes humanizados HlLl, H2L1 e H3L1 aos péptidos beta-amilóides (1-40) e (1-42) humanos foram avaliados utilizando analise de Biacore num Biacore™ 3000. Foram utilizados dois formatos de ensaio diferentes. 75

Método A (i) Resumidamente, <20 unidades de ressonância de péptido beta-amilóide 1-40 (biotinilado na extremidade C) foram capturadas num chip de biossensor de estreptavidina (como utilizado para a Tabela 10A). Os anticorpos foram diluídos em tampão HBS-EP e passados sobre a superfície de estreptavidina/beta-amilóide em concentrações variando entre 0,001 nM - 8 nM (para a Tabela 10A). Foram realizadas duas corridas em separado; cada corrida foi efectuada numa nova superfície de estreptavidina/beta-amilóide. As Corridas 1 e 2 foram essencialmente as mesmas, embora houvesse algumas diferenças nos parâmetros utilizados; A Corrida 1 foi efectuada utilizando uma superfície de chip sobre a qual 16 RU de beta-amilóide foram capturados, e foram utilizadas concentrações de anticorpo de 0,001 nM - 8 nM, um tempo de associação de 4 minutos e um tempo de dissociação de 20 minutos foram utilizados a um caudal de 50 pL por minuto. Para a Corrida 2, foram capturadas menos de 0 RU's de beta-amilóide e foram utilizadas concentrações de anticorpo de 0, 003125 nM - 8 nM. O caudal e tempos de associação foram os mesmos aos da Corrida 1, contudo o tempo de dissociação foi reduzido para 15 minutos. (ii) Beta amilóide (1-40) e (1-42) foram amino-conjugados sobre superfícies diferentes de um chip de biossensor CM5, a um nível de <20 unidades de ressonância (como utilizado na Tabela 10B). Os anticorpos foram diluídos em tampão HBS-EP e passados sobre a superfície de biossensor/beta-amilóide, a concentrações variando entre 1 nM - 64 nM (como utilizadas na Tabela 10B). 76

Método B

No segundo caso, o ensaio foi invertido, na medida em que os anticorpos foram, primeiro, capturados até um nível de 1000-2500 unidades de ressonância, sobre uma superfície de anticorpo policlonal de igG anti-murganho (para MAb 2E7 de murganho recombinante) ou uma superfície de proteína A (para H2L1 humanizado), de um chip de biossensor CM5. Beta-amilóide (1-40) ou (1-42) recém-preparado foi diluído em tampão HBS-EP e passado sobre a superfície de anticorpo capturado em concentrações variando entre 4-500 nM (Tabelas 10C e 10D).

Em ambos os métodos, a regeneração foi por meio de um pulso de H3PO4 a 100 mM e para a Tabela 10A os dados foram, igualmente, seguidos de um pulso de NaOH a 50 mM. Mostrou-se que a superfície é estável e não é afectada pela regeneração. Todas as corridas foram duplamente referenciadas contra injecções de branco de tampão. A análise foi efectuada utilizando o software de análise de Biacore™ BIAevaluation, versão 4.1.

Resultados O método A(i) foi utilizado para classificar os anticorpos por dados de cinética de ligação a beta-amilóide. Os dados obtidos são mostrados na Tabela 10A. Estes mostram que o Mab 2E7 parental tem uma KD de 36,1 pM para a beta-amilóide capturada por estreptavidina. O anticorpo humano-murganho quimérico mostrou uma KD ligeiramente reduzida de 45,8 pM e as construções humanizadas variam entre 54 (H2L1) e 93,6 pM (Hl Ll). Em conclusão, isto demonstra que o processo de humanização foi muito bem-sucedido e foi perdida muito pouca afinidade. As 77 retromutações adicionais introduzidas para H2 e H3 tiveram um pequeno mas benéfico efeito, embora as diferenças entre as construções H2 e H3 estejam dentro dos desvios padrão para estas experiências.

Tabela 10Ά

Anticorpo ka kd KD (pm) 2E7 Corrida 1 1,61e6 6,17e-5 38,3 Corrida 2 1,69e6 5,72e-5 33,8 Média (SD) 1,65e6 5,97e-5 36,1 (3,2) c2E7 Corrida 1 1,34e6 6,44e-5 48,1 Corrida 2 l,3e6 5,65e-5 43,5 Média (SD) 1,32e6 6,10e-5 45,8(3,3) HlLl Corrida 1 5,60e5 5,32e-5 95,0 Corrida 2 6,37e5 5,87e-5 92,2 Média (SD) 5,99e5 5,60e-5 93,6 (2,0) H2L1 Corrida 1 9,91e5 5,76e-5 58,1 Corrida 2 1, le6 5,49e-5 49,8 Média (SD) 1,05e6 5,63e-5 54,0(5,9) H3L1 Corrida 1 8,24e5 6,26e-5 76,0 Corrida 2 8,3e5 4,75e-5 57, 2 Média (SD) 8,27e5 5,47e-5 66,6(13,3) 78 0 método A(ii) foi utilizado para confirmar que os dois residuos de aminoácido adicionais na extremidade C de beta-amilóide (1-42), comparados com beta-amilóide (1-40) não alteraram significativamente as propriedades de ligação de 2E7 e H2L1. Os dados obtidos são mostrados na Tabela 10B e confirmaram isto.

Tabela 10B

Anticorpo Beta-amilóide ka (Ms-1) kd (s_1) KD (pM) 2E7 1-40 4,05e5 1,28e-4 317 1-42 3,82e5 1,51e-4 394 H2L1 1-40 3,33e5 1,22e-4 366 1-42 3,40e5 1,55e-4 456 O método B foi utilizado para invalidar efeitos de avidez potencialmente verificados no formato do primeiro ensaio. Os efeitos de avidez, utilizados por ambos os domínios Fab de uma única molécula de anticorpo ligando-se ao mesmo tempo a duas moléculas beta-amilóide adjacentes sobre a superfície de biossensor (ou nas formas multiméricas de beta-amilóide), aumentariam a afinidade aparente de ligação. As medições de afinidade utilizando o Método B são mostradas na Tabela 10C. 79

Tabela 10C

Anticorpo ka (Ms *) kd (s_1) KD (nM) Com Desvio Padrão n=3 2E7 2,83e5 ±0,54e5 4,28e-4 ± 0,65e-4 1,58 ± 0,55 H2L1 l,06e5 ±0,27e5 7,50e-4 0,50 7,32 ± 1,64 A evidência de que este ensaio proporcionou afinidades de ligação 1:1 verdadeiras foi obtida quando os fragmentos de Fab de H2L1, obtidos por digestão com papaina, se ligaram a beta-amilóide (1-40) capturado por estreptavidina por um método semelhante ao Método A(i), com uma KD estimada de 2,4 nM. O método B foi, igualmente, utilizado para confirmar que os dois residuos de aminoácido adicionais na extremidade C de beta-amilóide (1-42), comparados com beta-amilóide (1-40) não alteraram significativamente as propriedades de ligação de um clone de sequência idêntico ao MAb 2E7 de murganho, denominado 2F11. Os dados obtidos são mostrados na Tabela 10D.

Tabela 10D

Anticorpo Beta-amilóide ka (Ms-1) kd (s_1) KD (nM) 2F11 1-42 2,39e5 2,74e-4 1,14 2F11 1-40 2,99e5 3,92e-4 1,31 80

Num estudo semelhante ao estudo de mapeamento de epitopo sobre 2E7 utilizando o ensaio de ressonância de plasmónio de superfície descrito anteriormente, o H2L1 comportou-se de um modo semelhante a 2E7 na ligação ao péptido abrangendo os aminoácidos 1-12 (A31, SEQ ID N° 15) do péptido β-amilóide e não ao péptido abrangendo os aminoácidos 2-13 do péptido β-amilóide (Αβ2-13, SEQ ID N° 44).

Actividade de H2L1 no Modelo de Efluxo de I125 β-Amilóide

De modo a funcionalmente comparar o H2L1 humanizado com o 2E7 monoclonal de murganho parental, ambos foram testados no 1 oc mesmo dia no modelo de efluxo de I β-amiloide anteriormente descrito.

Tanto H2L1 como 2E7 significativamente aumentaram as contagens por minuto (C PM) no sangue, em comparação com veículo de controlo. A CPM de radioactividade no sangue foi como se segue (Veículo: 1940 ± 166; 2E7: 10065 ± 1386; H2L1: 10913 + 1535). A estatística utilizada foi a ANOVA com teste post-hoc LSD. n=7 veículo, n=6 2E7, n=6 H2L1, (P< 0,001 para cada composto de teste vs. veículo).

Estes dados proporcionam evidência adicional de que o anticorpo H2L1 humanizado reteve as propriedades funcionais mostradas com a molécula 2E7 de murganho. 81

Investigação da Farmacocinética de H2L1 e 2E7

Foi investigada a meia-vida terminal de anticorpo de teste em murganhos. 0 anticorpo de teste foi administrado por uma infusão intravenosa de 1 h a 4 murganhos, de modo a alcançar uma dose alvo de 400 pg por murganho. Amostras de sangue seriais foram retiradas de cada murganho até 5 dias após a dosagem (um murganho do grupo 2E7 não completou o estudo e um do grupo H2L1 foi removido da análise subsequente, em virtude de ter ficado evidente que a dose não tinha sido administrada i.v.). Os niveis de anticorpo foram medidos utilizando um ELISA de captura de β-amilóide. A análise dos dados indica que o anticorpo humanizado H2L1 tem uma meia-vida terminal de cerca de 82 horas em murganhos (Tabela 11), a qual é comparável com aquela do anticorpo monoclonal de murganho parental 2E7 (cerca de 75 horas).

Tabela 11

Parâmetro Média ± SD (n=3) Cmáx (pg/mL) 291 ± 43 Tmáx (h) # 2,0 (1,1-2,1) CLp (mL/h/kg) 0,9 ± 0,1 tH (h) 82 ± 4 Vss (mL/kg) 94 ± 12 N° mediana e gama

Cmáx Concentração plasmática máxima observada. 82

Tmáx Tempo da concentração plasmática máxima observada CLp Eliminação plasmática total; Dose/AUC(0-inf) · th A meia-vida de fase terminal foi determinada como a razão de ln2/z, onde z é a constante de velocidade de fase terminal; calculada utilizando a análise de regressão linear não ponderada (após transformação log) sobre aqueles pares de concentração-tempo ocorrendo após o começo visualmente avaliado da fase log-linear terminal.

Vss Volume de distribuição no estado estacionário; CLp X MRTo-inf

Efeito de H2L1 sobre a carqa amilóide periférica em primatas não humanos idosos

Foi conduzido um estudo em macacos Cynomolgus idosos (aproximadamente 15 anos de idade), de modo a investigar a relação de resposta à exposição com respeito à formação e eliminação do complexo amilóide/H2Ll e aos efeitos subsequentes sobre os níveis de amilóide em CSF e CNS. Amostras de CSF lombar e sangue semanais (retiradas sob sedação com cetamina) foram recolhidas 3 semanas antes da Ia dose de H2L1. Imediatamente após a amostragem na semana 3, os animais receberam placebo (n=10), 0,1 mg/kg (n=5), 1 mg/kg (n=5) ou 10 mg/kg (n=10) de H2L1 e, depois, de 2 em 2 semanas, durante 12 semanas. Amostras de sangue para análise em plasma de H2L1 e Αβ42 total foram retiradas semanalmente. As amostras de CSF para quantificação de Αβ40/42 foram recolhidas de 2 em 2 semanas. Após a conclusão do 83 período de dosagem, os animais foram eutanasiados para efeitos de quantificação de beta-amilóide cerebral por análises bioquímicas, como descrito anteriormente e para investigação de micro-hemorragia. No grupo de dosagem mais baixa (0,1 mg/kg), os animais foram eutanasiados num modo escalonado, de modo a avaliar o efeito potencial do decurso de tempo nos níveis cerebrais, como uma consequência da terminação da dosagem e, por este motivo, a saturação do agregado de amilóide plasmático.

Antes de se iniciar a fase experimental, este estudo foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de MACCINE Pte Ltd, ou "Maccine". O número de protocolo IACUC foi N° 08-2006. O GSK realizou uma visita local de Maccine e reexaminou o seu processo de avaliação ética e considerou-o aceitável.

As amostras plasmáticas foram serialmente diluídas 1:10 a 1:50000 e adicionadas a placas de ELISA revestidas com Αβ40. Foram criadas curvas padrão variando entre 0-10μ g/mL de H2L1 em diluente. Após uma incubação, de um dia para o outro, a 4 °C, o H2L1 foi visualizado utilizando IgG anti-humana conjugada com peroxidase de rábano (Amersham - diluída 1:2000 em diluente) e sistema de detecção de tetrametilbenzidina. Após administração única e repetida de bólus, i.v., os níveis plasmáticos de H2L1 pareceram aumentar num modo dose-dependente. Não existiu evidência de não linearidades graves na farmacocinética indicando que, para a maior parte do intervalo de dosagem, foram alcançadas concentrações molares em excesso de H2L1 no plasma, em comparação com os níveis de amilóide livre. 84 Αβ42 total foi medido em plasma puro utilizando um kit (Innogenetics) ELISA de Αβ1-42 comercialmente disponível, de acordo com as instruções do fabricante, com curvas padrão variando entre 500-7 pg/mL criadas no diluente do kit. As amostras e padrões são incubados, de um dia para o outro, a 4 °C, antes do ensaio em duplicado de acordo com as instruções do kit. Deve ser notado que, em virtude da interferência do anticorpo de detecção proporcionado com o ensaio de Αβ42, este kit não pode ser utilizado para medir os níveis de Αβ42 livre mas mede ο Αβ42 aparente 'total'. Existiu um aumento dependente de dose e de concentração em Αβ42 (com níveis de patamar de, aproximadamente, 300, 125 e 25 pg/mL detectados após 10,1 ou 0,1 mg/kg de H2L1, respectivamente).

Da análise, o aumento no "Αβ42 total" deve-se, provavelmente, ao resultado de um efluxo significativo de amilóide do exterior do agregado plasma, que pareceu dependente das concentrações de H2L1 >1 pg/mL, e não pareceu ser um resultado da ausência de eliminação do complexo. Isto foi evidenciado pela taxa de eliminação do Αβ42 total, assim como da flutuação nos níveis totais ao longo de um intervalo de dosagem.

Até à data, apenas a análise de plasma foi completada e totalmente analisada. Contudo, a análise preliminar indica que existiu uma tendência na direcção da redução em CSF e aumento no nível hipocampal de Αβ42 'total' (medido como descrito, em geral, anteriormente), após tratamento com 10 mg/kg de H2L1.

Em algumas secções de cérebro, foram detectadas pequenas áreas de micro-hemorragia, como mostradas pelo método de coloração com Azul da Prússia de Perl. Este método visualiza ferro férrico (o ferro é um constituinte essencial da 85 hemoglobina veículoa de oxigénio verificada em glóbulos vermelhas) por produção de um composto azul insolúvel. Contudo, não existiu qualquer diferença na incidência entre animais tratados com veiculo e com fármaco.

Análises em Macacos Cynomoloqus Idosos para placas de beta-amilóide no cérebro e beta-amilóide total no plasma

Os parâmetros de fluido espinal (CSF) e tecido de AD humana foram exibidos no macaco Cynomolgus. Demonstrou-se que o macaco Cynomolgus idoso tem evidência de deposição de amilóide. (Covance, The cynomolgus monkey as a model for Alzheimer's disease. Em: Buse E, Habermann G, Friderichs-Gromoll S,

Kaspereit J, Nowak P e Niggemann K, editores. Póster apresentado no 44th Annual Meeting of the Society of Toxicology, Nova Orleães, Louisiana, 6 a 10 de Março de 2005) . O potencial de o H2L1 deduzir uma resposta inapropriada (tal como encefalite) num cérebro idoso foi investigado em macacos fêmea ex-procriadores, de ca. de 20 anos de idade. Adicionalmente, segurança, micro-hemorragia relacionada com o tratamento, neutralização/eliminação de material de teste, hipersensibilidade e doença complexa imunitária foram, igualmente, investigados após administração intravenosa, durante 8 semanas, em intervalos de duas semanas. Adicionalmente, as amostras de CNS e sangue foram analisadas para níveis de Αβ4ο/42· 86

Concepção de Estudo

Grupos de 5 (grupo 1), 9 (grupo 2) ou 10 (grupo 3) macacos fêmea Cynomolgus geriátricas receberam 0 (veiculo), 50 ou 100 mg/kg/dia de dosagem de H2L1 em veiculo (4 mL/kg), a cada duas semanas, durante 8 semanas, intravenosamente, por administração lenta de bólus. O veiculo consistiu em acetato de sódio tri-hidratado a 6,81 mg/mL, edetato dissódico desidratado a 0,0186 mg/mL, polissorbato 80 a 0,2 mg/mL e L-Arginina base a 10 mg/mL, o pH era de 5,5. Os niveis de dose foram escolhidos, de modo a investigar niveis de dose que fossem 5 e 10 vezes os niveis de dose clínicos pretendidos.

As seguintes avaliações foram realizadas pré-dose, diariamente (sinais clínicos, peso corporal, consumo de alimento), semana 4 e a semana antes de necropsia: observações de animal em vida, peso corporal, temperatura corporal, hematologia, química clínica (incluindo análise de fluido cerebrospinal [CSF]), urinálise e determinação de citocina em CSF. Após necropsia, pesos de órgãos, observações macroscópicas e observações microscópicas do cérebro, medula espinal cervical e lesões grosseiras foram conduzidas em todos os animais. A avaliação toxicocinética foi realizada após cada dosagem.

Resultados Não existiram mortes não programadas e não existiram sinais que indicassem uma influência do item de teste sobre o estado geral dos animais nas doses administradas. As únicas observações assinaláveis em patologia clínica (hematologia e química sérica) 87 foram concluídas como estando relacionadas com a idade e não com o artigo de teste. A exposição sistémica a H2L1 (como medida por AUC0-t e Cmáx) aumentou aproximadamente em proporção à dose. Para ambos os grupos de dose, não existiu uma alteração marcante (á2 vezes) na exposição sistémica entre os períodos de amostragem da Ia dose e da 4a dose. Não existiram sinais de reacções inflamatórias no cérebro detectadas por análise de CSF e não existiram verificações macroscópicas ou microscópicas na necropsia que sugerissem uma influência de item de teste, especificamente nenhuma micro-hemorragia ou encefalite.

Este estudo foi conduzido em conformidade com as Good Laboratory Practice Regulations, como descritas em German Chemical Law, anexos 1 e 2 até §19a, Chemikalien Gesetz, Junho de 2002, os OECD Principies of Good Laboratory Practice (revistos em 1997, publicados em Janeiro de 1998) ENV/MC/CHEM (98) 17, o Consensus Document "The Application of the OECD Principies of GLP to the Organisation and Management of Multi-Site Studies" ENV/JM/MONO (2002)9. Estudos conduzidos em conformidade com as regulações e padrões anteriores foram considerados aceitáveis para as autoridades reguladoras da US FDA. 88

Análise de carga de Placa no CNS

Os hemisférios cerebrais esquerdos dos macacos Cynomologus macaque tratados com veiculo do estudo anterior foram analisados por imunohistoquímica. Uma secção coronal, ao nível do sulco temporal médio contendo porções da circunvolução denteada e hipocampo, foi processada em cera, como descrito anteriormente. Para a imunohistoquímica, as secções foram marcadas com um anticorpo pan-Αβ (1E8, anticorpo monoclonal deduzido contra Αβ 13-27), ou com o anticorpo Αβ42, (20G10, anticorpo monoclonal reconhecendo Αβ x-42) e a marcação foi revelada como anteriormente. Foi realizada uma contagem visual do número de placas para cada secção. Tecido de todos os cinco macacos Cynomolgus tratados com veículo mostrou evidência de placas de Αβ parenquimatoso. Existiu, igualmente, evidência de Αβ marcado cerebrovascular e Αβ intraneuronal.

Análise de complexos de beta amilóide/anticorpo em plasma A análise bioquímica foi efectuada em amostras plasmáticas de dois intervalos de tempo (no final das semanas 4 e 8 após o início da dosagem) de animais doseados com 50 mg/kg (n=9) ou 100 mg/kg (n=10) de H2L1, ou de controlos doseados com veículo (n=5) . As amostras em duplicado de 100 pL foram analisadas utilizando o kit de ELISA de Αβ1-42 comercialmente disponível da Innogenetics, incubadas de um dia para o outro, a 4 °C. As amostras de controlo foram analisadas tanto puras como em diluição de 1:10 (utilizando o diluente fornecido), enquanto as amostras de animais doseados foram testadas puras e a 1:25. Foram analisados os valores de absorvência subsequentes, com os valores de absorvência desconhecidos retro-calculados para 89 valores de pg/mL, utilizando curvas padrão e, depois, corrigidos para qualquer diluição de ensaio. Os niveis de plasma total de Αβ42 derivados destas amostras são mostrados na Tabela 12 abaixo (números em pg/mL ± SE); todas as amostras de animais tratados com H2L1 continham niveis significativamente mais elevados de Αβ42 (p < 0,001 pelo teste t de Student) do que em grupos de controlo.

Tabela 12

Semana 4 (pg/mL) Semana S (pg/mL) Controlo (1:10) 104,1 ± 30,4 29,8 ± 7,9 50 mg/kg (1:25) 830,5 ± 79,1 615,8 ± 50,2 100 mg/kg (1:25) 1020,5 ± 84,4 492,7 ± 46,3

Os dados referidos foram obtidos de amostras diluídas. Os resultados das amostras puras não foram utilizados, visto que muitos pontos de dados eram quer superiores ao padrão de topo, ou em virtude da limitação de volume de amostra, apenas ensaiados como um único ponto.

Processo de produção

Vectores de expressão codificando H2L1 e operativamente ligados a marcadores de selecção amplificáveis, tais como DHFR ou glutamina sintétase, podem ser utilizados para transfectar ou transduzir linhas de células CHO parentais apropriadas (e. g., CHODG44 ou CHOK 1), de modo a produzir linhas celulares manipuladas, adequadas para a produção de anticorpo monoclonal 90 em grande escala (para revisão ver Bebbington e Hentschel, DNA Cloning Volume III; A practlcal approach (editado por Glover DM) (Oxford IRL Press, 1987). De modo a aumentar os níveis de expressão, a sequência codificante pode ser codão-optimizada, com o fim de se evitarem os motivos de sequência actuando em cis e o teor de GC extremos (alto ou baixo) . SEQ. id N° 42 e N° 43 exemplificam uma tal sequência codificante para cadeia pesada H2 e cadeia leve Ll. A produção em grande escala pode ser em biorreatores de tanque agitado, utilizando meio isento de componente derivado de animal, seguido de purificação. Esta pode compreender clarificação da colheita, seguida de cromatografia de afinidade de Proteína A e purificação adicional utilizando operações unitárias de cromatografia de permuta iónica (e. g., catião) e modo misto (e. g., hidroxiapatite cerâmica). Uma nanofiltração de remoção de vírus é seguida de uma etapa de ultrafiltração/diafiltração final que permite formulação adequada para a via de administração pretendida.

Exemplo de Formulação Farmacêutica

Quantidade (por mL) 50 mg 6,81 mg 0,20 mg 10.00 mg 3.00 mg 0,0186 mg qs para conferir pH 5,5

Ingrediente H2L1

Acetato de sódio tri-hidratado

Polissorbato 80

Arginina base

Cloreto de sódio

Edetato dissódico di-hidratado Ácido clorídrico 91 Água para Injectáveis

Para preparar 1,0 mL

Azoto

Para preencher o espaço livre

Sequências de Aminoácidos de Regiões V de Estruturas Aceitadoras e Variantes Humanizados

Região V de estrutura aceitadora de cadeia pesada M99675, sequência de aminoácidos (SEQ ID Ns 21)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSS

STIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR ADN de região v de estrutura aceitadora de cadeia pesada M99675 (SEQ ID Na 22)

G AGGTGCAGCT GGT GGAGT CTGGGGG AGGCTT GGTACAGCCT GGGGGGT CCC TG AGACT CT CCT GT GCAGCCT CTGGATT CACCTTCAGTAGCTATAGCAT GAACT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGT AGTAGTAGT ACCATAT ACTACG CAGACT CT GT G AAGGG CCGATT CACCAT CTCC AG AG AC AATGCC AAG AACT CACT GTAT CT GCAAAT G AACAG CCT G AG AGCCG AG GACACGGCT GT GTATTACT GT GCGAGAGA

Região V de estrutura aceitadora de cadeia leve CAA51135, sequência de aminoácidos (SEQ ID Na 24)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGS

NRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPWTFGQGTKVEIK ADN de região V de estrutura aceitadora de cadeia leve CAA51135 (SEQ ID Na 25)

GAT ATTGT G AT GACT CAGT CTCCACT CT CCCT GCCCGT CACCCCT GG AG AGCCG GCCTCCAT CTCCT GCAGGT CT AGTCAG AGCCT CCT GCAT AGT AATGGAT ACAAC T ATTT G G ATTGGT ACCTG C AG AAG CC AGGG CAGT CT CC AC AG CTCCT GAT CT AT TTGGGTT CT AAT CGGGCCTCCGGGGT CCCTGACAGGTT CAGTGGCAGTGGATC AGGCACAGATTTT ACACT GAAAAT CAGC AG AGT GG AGGCT G AGGAT GTT GGGG TTT ATTACT GCAT GCAAGCT CTACAAACT CCGTGG ACGTT CGGCCAAGGGACCA AGGTGGAAATCAAA 92

Variante Hl de região v de cadeia pesada humanizada, sequência de aminoácidos (SEQ ID N2 26)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNL

AYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTL

VTVSS

Sequência codificante de ADN de variante Hl de região V de cadeia pesada humanizada (SEQ ID N2 27)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC T G AG ACT CT CCT GT GC AG CCT CTGG ATT CACCTT CAGT G ACAACGGAAT GGCGT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATTCATTAGTAAT TTGGCAT AT AGT AT CGACT ACGC AG ACACT GT GACGGGCCGATT CACCAT CT CC AG AG ACAATGCC AAG AACT CACT GTAT CT GCAAAT GAACAGCCT GAGAGCCGAG G ACACG GCT GT GT ATT ACT GT GT CAGCGGGACCT GGTTT GCTT ACT GGGGCCA G GGCACACTAGTCACAGTCTC CTCA

Variante H2 de região V de cadeia pesada humanizada, sequência de aminoácidos (SEQ ID N2 28)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNL

AYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTL

VTVSS ADN de variante H2 de região V de cadeia pesada humanizada (SEQ ID N2 29)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC T G AG ACT CTCCT GT G CAGTCT CT GG ATT CACCTT CAGT GACAACGG AATGGCGT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATTCATTAGTAAT TTGGCAT AT AGT AT CGACT ACGC AG AC ACT GTG AC GG G CCG ATT C AC C ATCTCC AG AG ACAATGCC AAG AACTCACT GT AT CTGCAAATGAACAGCCT GAGAGCCGAG G ACACGG CT GTGT ATT ACT GT GT CAG CGGGACCT GGTTT GCTT ACT GGGGCCA GGG CACACTAGTCACAGTCTCCTCA

Variante H3 de região V de cadeia pesada humanizada, sequência de aminoácidos (SEQ ID N2 30)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWISFISNLA

YSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTLV

TVSS 93 ADN de variante H3 de região V de cadeia pesada humanizada (SEQ ID N2 31)

GAGGT GCAGCT GGT GG AGTCTGGGGGAGGCTT GGTACAGCCT GGGGGGT CCC T GAGACT CT CCT GTGCAG CCT CT GG ATT CACCTT CAGT G AC AACGG AATGGCGT GGGT CCGCCAGGCT CCAGGG AAGGGGCT G G AGT GG ATCT CATT CATTAGTAAT TTGGCATAT AGTAT CGACT ACG CAG ACACT GT G ACGGGCCG ATT C ACC AT CTCC AGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAG GACACGGCTGTGTATTACTGTGTCAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCA GGGCACACT AGT CACAGT CT CCT CA

Variante LI de região V de cadeia leve humanizada, sequência de aminoácidos (SEQ ID N2 32)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRVSQSLLHSNGYTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVS

NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTRHVPYTFGGGTKVEIK ADN de variante LI de região V de cadeia leve humanizada (SEQ ID N2 33)

G AT ATT GTG ATG ACT CAGT CT CCACT CTCCCT GCCCGTCACCCCT GG AG AGCCG GCCTCCATCTCCTGCAGAGTTAGTCAGAGCCTTTTACACAGTAATGGATACACC T ATTT ACATT GGT ACCT GCAG AAGCCAGGGCAGT CTCCACAGCT CCTGAT CTAT AAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCA

GGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTT T ATT ACT GCTCT C AAACT AG AC AT GTTCCGT AC ACGTT CG GCGG AGGG ACCAAG GTGGAAATCAAA

Sequência de aminoácidos de cadeia pesada Hl madura (dupla mutação de Fc mutado em negrito) (SEQ ID N2 34)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWVSF1SNL

AYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTL

VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

CPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDG

VEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT

PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 94 ADN de comprimento completo Hl (SEQ ID N2 35)

GAGGT GCAGCTGGT GGAGT CT GG

GGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTG GATT CACCTT CAGT GACAACGGAATGG

CGTGGGT CCG CCAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGTTT CATTCATTAGT AATTT GGC AT AT AGTATCG ACTAC G C A

G ACACT GTGACGGGCCGATT CACCAT CT CCAGAG ACAATGCCAAGAACT CACTG TATCTG C AAATG AAC AG CCTG AG AG C

CGAGGAC ACGGCTGT GT ATT ACT GT GT CAGCGGGACCT GGTTTGCTTACT GGG GCCAGGG CACACT AGTCACAGT CT CCT

C AGCCT CC ACCAAGGGCCCAT CGGT CTT CCCCCT GG C ACCCT CCTC CAAG AG C ACCT CT GGGGGCACAGCGGCCCT GGGC

T GCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGG CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT

CCCGGCT GTCCT AC AGT CCT CAGG ACT CTACT CCCT C AGCAGCGT GGT G ACCG T GCCCT CCAGCAGCTT GGGCACCCAGA

CCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAA GTT G AG CCCAAAT CTT GT G AC AAAACT

CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCT GAACT CGCGGGGGCACCGT CAGTCTT CCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGG ACAC

CCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGT C AAGTT CAACT

GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGA GCAGT ACAACAGCACGT ACCGTGT GGT C

AGCGT CCT CACCGT CCTGCACCAGGACT GGCT GAATGGCAAGGAGT ACAAGTG CAAG GTCTCC AAC AAAGCCCTCCCAGC

CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG

TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATG

AGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACAT CGCCGT GGAGT GGGAGAGC

AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGA CGGCT CCTT CTT CCT CT AC AGCAAGCT

CACCGTGG ACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGT CTT CT CAT GCT CCGT GA T G CAT GAGGCT CT GC ACAACCACTAC A CGCAGAAGAGCCT CT CCCT GT CT CCGGGTAAA 95

Sequência de aminoácidos de cadeia pesada H2 madura (dupla mutação de Fc mutado em negrito) (SEQ ID N2 36)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWVSF1SNL

AYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTL

VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

CPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDG

VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK adn de comprimento completo H2 (SEQ ID N2 37)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC

TGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATT

CACCTT CAGT GACAACGGAAT GGCGTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGG CTGGAGTGG GTTT C ATT C ATT AGT AATT

TGGCATATAGTATCGACTACGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCA GAG ACAATGCCAAG AACT CACT GTAT

CTGCAAAT G AAC AGCCT G AG AGCCG AGGACACGGCT GT GTATTACT GT GTCAG CGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCA

GGG CACACT AGT CACAGT CT CCT CAGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGT CTTCC CCCTG GC ACCCTCCT CCAAGAGC ACCT

CT GGGGGC ACAGCGGCCCT GGGCTGCCTGGT C AAGGACT ACTT CCCCG AACC GGTGACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCC

CTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA 96

CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC

CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA GCAACACCAAGGTGGACAAG AAAGTT G

AGCCCAAAT CTTGTG AC AAAACT CAC ACATGCCC ACCGTGCCC AGCACCT GAAC TCGCGGGGGCACCGT C AGT CTT CCTC

TT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT CAT GAT CT CCCGGACCCCT G AGGT CACA TGCGT GGT GGTGGACGTGAGCCACGA

AG ACCCT GAGGT CAAGTT CAACTGGTACGT GGACGGCGT GGAGGTGCAT AAT G CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT

ACAACAGCACGTACCGT GTGGT CAGCGT CCT CACCGTCCT GCACCAGGACTGG CT G AAT GGCAAGGAGT ACAAGT GCAAG

GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCG AGAACCACAGGT GT A

CACCCT GCCCCCATCCCGGGAT GAGCT GACCAAGAACCAGGT CAGCCT G ACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCG

ACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGAC

CACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC

TCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG GAAC GTCTTCTCATGCTCCGT GAT G C A

T GAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT CTCCCTGT CTCCGGGTA AA

Sequência de aminoácidos de cadeia pesada H3 madura (dupla mutação de Fc mutado em negrito) (SEQ ID Ns 38)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWISFISNLA

YSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTLV

TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

CPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDG

VEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT

PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ADN de comprimento completo H3 (SEQ ID N2 39)

GAGGTGCAGCT GGT GGAGT CT GGGGG AGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGT CCC TG AGACT CT CCTGTG CAG CCT CT GG ATT C ACCTT CAGT G ACAACGG AATGG CGT GGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGG CT GGAGT GGAT CT CATT CATTAGTAAT TTGGCATATAGTATCGACTACGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCC 97

AG AG ACAAT GCCAAG AACT C ACT GTAT CTGCAAAT G AACAGCCT G AG AG CCG AG GACACGGCT GTGTATTACT GT GT CAGCGGGACCT GGTTT GCTT ACT GGGGCCA GGGCACACT AGT CACAGT CT CCT CAGCCTCCACC AAGGGCCC ATCGGT CTT CC CCCT GGCACCCT CCTCCAAGAGCACCT CT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT G CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCG CCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC T ACTCCCT C AGCAGCGT GGT G ACCGT GCCCT CCAGC AGCTT GGGCACCCAG AC CT ACAT CTGCAACGT G AAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGT GG ACAAGAAAGT TGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGA ACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC G AAG ACCCT GAGGT CAAGTTCAACT GGT ACGTGGACGGCGTGG AGGT G CAT AA TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA GCGTCCT CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCT GAATGGCAAGGAGT ACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGA GCT G ACCAAGAACCAGGT CAGCCT GAC CTGCCTGGT CAAAGGCTT CT ATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAA GACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGC TCACCGTGG AC AAGAGCAGGT GGCAGCAGGGG AACGT CTT CT CAT GCT CCGT G

AT GCAT G AGGCT CT GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CTCCG GGTAAA

Sequência de aminoácidos de cadeia leve madura (SEQ ID N2 40)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRVSQSLLHSNGYTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVS

NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTRHVPYTFGGGTKVEIKR

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT

EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ADN de comprimento completo Ll (SEQ ID N2 41)

G AT ATT GT G AT GACT CAGT CT CCACT CTCCCTGCCCGT C ACCCCT GG AG AGCCG GCCT CC AT CTCCTG C AG AGTTAGT C AGAGCCTTTTACACAGT AAT GG AT ACACC TATTT ACATT GGTACCT GCAGAAGCCAGGGCAGTCT CCACAGCT CCT GAT CTAT AAAGTTTCCAACCGATTTT CTGGGGT CCCT GACAGGTT CAGT GGCAGTGGAT CA GGCACAGATTTT ACACT GAAAAT CAGCAGAGTGGAGGCT GAGGAT GTT GGGGTT T ATTACT GCT CTCAAACTAGACAT GTT CCGTACACGTT CGGCGG AGGG ACCAAG GT GGAAAT C AAACGTACGGT GGCT GCACCAT CTGT CTT CAT CTT CCCGCCAT CT GAT G AGCAGTT G AAAT CT GGAACTGCCT CTGTTGTGTGCCTGCT GAATAACTT C 98

TATCCCAGAGAGGCCAMGTACAGTGGMGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGG TAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCC T CAGC AGCACCCT G ACG CT GAGC AAAG CAGACTACG AG AAACACAAAGT CT AC GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAA CAGGGGAGAGTGT ADN de cadeia pesada H2 optimizado (SEQ ID Ns 42)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCC

TGAGACT GAGCT GT GCCGT GT CCGGCTT CACCTT CAGCGACAACGGCATGGCC

TGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCTTCATCAGCA

ACCT GGCCT ACAGCAT CGACT ACGCCGACACCGT GACCGGCAGATT CACCAT C

AGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGC

CG AGG AC ACCG CC GTGTACT ACTGT GT GAGCGGCACCT GGTT CGCCTACT GGG

GCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGT

GTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTG

GGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAG

CGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGC

GGCCTGT ACAGCCT GAGCAGCGT GGT GACCGT GCCCAGCAGCAGCCT GGGCA

CCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC

AAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCC

TGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTA

AGG ACACCCT G AT GAT CAGCAG AACCCCCG AGGT GACCT GT GT GGTGGT GGAT

GTGAGCCACGAGGACCCT G AGGT G AAGTT CAACTGGT ACGT GG ACG GCGT GGA

GGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACC

GGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGA

GT AC AAGT GT AAGGT GT CC AACAAGGC C CT G CCTGCCCCT AT CG AG AAAACCAT

CAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCT

AGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGG

CTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAG

AACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG

TACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAG

CT GCT CCGT GAT G CACG AGGCCCT G C ACAAT CACT ACACCCAGAAG AGCCTG A

GCCT GT CCCCT GGCAAG ADN de cadeia leve LI optimizado (SEQ ID N2 43)

GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGA GCCCGCCAGCATCAGCTGTAGAGTGAGCCAGAGCCTGCTGCACAGCAACG GCT ACACCT ACCTGCACTGGT ATCTGCAGAAGCCTGGCCAG AGCCCTCAG 99

CTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCTGATAGATTC

AGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGA

GGCCGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTCCCAGACCAGACACGTGCCTT

ACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCC

CCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCAC

CGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGG

TGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAG

CGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCC

TGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAG

GTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGG

CGAGTGC

Lisboa, 1 de Março de 2010 100

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo terapêutico compreendendo uma cadeia VH tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 26 e um domínio VL tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 32.
2. 2. Anticorpo terapêutico compreendendo uma cadeia VH tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 28 e um domínio VL tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° N° 32.
3. 3. Anticorpo terapêutico compreendendo uma cadeia VH tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 30 e um domínio VL tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° N° 32.
4. 4. Anticorpo terapêutico de acordo com qualquer reivindicação anterior que é de isótipo igGl.
5. 5. Anticorpo terapêutico de acordo com qualquer reivindicação anterior que carece das funções de a) activação de complemento pela via clássica; e b) mediação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo.
6. 6. Anticorpo terapêutico de acordo com a reivindicação 4, no qual os resíduos 235 e 237 foram mutados para alanina.
7. 7. Anticorpo terapêutico de acordo com a reivindicação 1, anticorpo que compreende uma cadeia pesada tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 34, 36 ou 38 e uma cadeia leve tendo a sequência apresentada na SEQ ID N° 40. 1
8. 8. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo terapêutico de acordo com qualquer reivindicação anterior.
9. 9. Anticorpo terapêutico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, para utilização no tratamento de uma doença relacionada com o péptido β-amilóide.
10. 10. Anticorpo terapêutico de acordo com a reivindicação 9, em que doença relacionada com o péptido β-amilóide é a doença de Alzheimer.
11. 11. Anticorpo ou fragmento deste compreendendo um domínio VH tendo a sequência: SEQ ID N° 17 e um domínio VL tendo a sequência: SEQ ID N° 19.
12. 12. Polinucleótido codificando uma cadeia pesada de anticorpo terapêutico, em que o polinucleótido compreende a sequência apresentada na SEQ ID N° 35, 37, 39 ou 42.
13. 13. Polinucleótido codificando uma cadeia leve de anticorpo terapêutico, em que o polinucleótido compreende a sequência apresentada na SEQ ID N° 41 ou 43.
14. 14. Processo para a preparação de um anticorpo terapêutico, como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o referido processo compreende a expressão de polinucleótido codificando o referido anticorpo numa célula hospedeira. Lisboa, 1 de Março de 2010 2