NL9002314A - Immunogene complexen, in het bijzonder iscoms. - Google Patents
Immunogene complexen, in het bijzonder iscoms. Download PDFInfo
- Publication number
- NL9002314A NL9002314A NL9002314A NL9002314A NL9002314A NL 9002314 A NL9002314 A NL 9002314A NL 9002314 A NL9002314 A NL 9002314A NL 9002314 A NL9002314 A NL 9002314A NL 9002314 A NL9002314 A NL 9002314A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- quil
- fractions
- iscom
- immunogenic complex
- saponin
- Prior art date
Links
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 claims abstract description 85
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 38
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims abstract description 25
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 claims abstract description 14
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 6
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 abstract 1
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 42
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 22
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 21
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 16
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 14
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 13
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 11
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 7
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 6
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 6
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 5
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 5
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001092473 Quillaja Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N chlorotrimethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019624 protein content Nutrition 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 3
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 3
- 241001092142 Molina Species 0.000 description 3
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 3
- -1 Quil A lipid Chemical class 0.000 description 3
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 description 3
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- DCERHCFNWRGHLK-UHFFFAOYSA-N C[Si](C)C Chemical compound C[Si](C)C DCERHCFNWRGHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 2
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 2
- MZUSCVCCMHDHDF-UHFFFAOYSA-N P(=O)(=O)[W] Chemical compound P(=O)(=O)[W] MZUSCVCCMHDHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CVBNMWXECPZOLM-UHFFFAOYSA-N Rhamnetin Natural products COc1cc(O)c2C(=O)C(=C(Oc2c1)c3ccc(O)c(O)c3O)O CVBNMWXECPZOLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000001977 collision-induced dissociation tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- FFUAGWLWBBFQJT-UHFFFAOYSA-N hexamethyldisilazane Chemical compound C[Si](C)(C)N[Si](C)(C)C FFUAGWLWBBFQJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZJWDPNRJALLNS-VPUBHVLGSA-N (-)-beta-Sitosterol Natural products O[C@@H]1CC=2[C@@](C)([C@@H]3[C@H]([C@H]4[C@@](C)([C@H]([C@H](CC[C@@H](C(C)C)CC)C)CC4)CC3)CC=2)CC1 KZJWDPNRJALLNS-VPUBHVLGSA-N 0.000 description 1
- BQPPJGMMIYJVBR-UHFFFAOYSA-N (10S)-3c-Acetoxy-4.4.10r.13c.14t-pentamethyl-17c-((R)-1.5-dimethyl-hexen-(4)-yl)-(5tH)-Delta8-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren Natural products CC12CCC(OC(C)=O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C BQPPJGMMIYJVBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSVWWLUMXNHWSU-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-ethyl-5alpha-cholest-22-en-3beta-ol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 CSVWWLUMXNHWSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHGIKSSZNBCNDW-UHFFFAOYSA-N (3beta,5alpha)-4,4-Dimethylcholesta-8,24-dien-3-ol Natural products CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21 CHGIKSSZNBCNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- XYTLYKGXLMKYMV-UHFFFAOYSA-N 14alpha-methylzymosterol Natural products CC12CCC(O)CC1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C XYTLYKGXLMKYMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KYNFOMQIXZUKRK-UHFFFAOYSA-N 2,2'-dithiodiethanol Chemical compound OCCSSCCO KYNFOMQIXZUKRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZYHXKLKJRGJGP-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoro-n,n-bis(trimethylsilyl)acetamide Chemical compound C[Si](C)(C)N([Si](C)(C)C)C(=O)C(F)(F)F RZYHXKLKJRGJGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KLEXDBGYSOIREE-UHFFFAOYSA-N 24xi-n-propylcholesterol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CCC)C(C)C)C1(C)CC2 KLEXDBGYSOIREE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPTJELQXIUUCEY-UHFFFAOYSA-N 3beta-Hydroxy-lanostan Natural products C1CC2C(C)(C)C(O)CCC2(C)C2C1C1(C)CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 FPTJELQXIUUCEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101100322035 Aspergillus aculeatus abnA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282551 Cercopithecus Species 0.000 description 1
- LPZCCMIISIBREI-MTFRKTCUSA-N Citrostadienol Natural products CC=C(CC[C@@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC[C@H]4[C@H](C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)C(C)C LPZCCMIISIBREI-MTFRKTCUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- ARVGMISWLZPBCH-UHFFFAOYSA-N Dehydro-beta-sitosterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)CCC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 ARVGMISWLZPBCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- BKLIAINBCQPSOV-UHFFFAOYSA-N Gluanol Natural products CC(C)CC=CC(C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(O)C(C)(C)C4CC3 BKLIAINBCQPSOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001316290 Gypsophila Species 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- LOPKHWOTGJIQLC-UHFFFAOYSA-N Lanosterol Natural products CC(CCC=C(C)C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(C)(O)C(C)(C)C4CC3 LOPKHWOTGJIQLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- YKFRUJSEPGHZFJ-UHFFFAOYSA-N N-trimethylsilylimidazole Chemical compound C[Si](C)(C)N1C=CN=C1 YKFRUJSEPGHZFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAHGCLMLTWQZNJ-UHFFFAOYSA-N Nerifoliol Natural products CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C CAHGCLMLTWQZNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000287531 Psittacidae Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 238000010266 Sephadex chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N UNPD88870 Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)=CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 125000005037 alkyl phenyl group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 125000000089 arabinosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- MJVXAPPOFPTTCA-UHFFFAOYSA-N beta-Sistosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2C3CC=C4C(C)C(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C MJVXAPPOFPTTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N beta-sitosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2(C)C3CC=C4CC(O)CCC4C3CCC12C)C(C)C NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- QBSJHOGDIUQWTH-UHFFFAOYSA-N dihydrolanosterol Natural products CC(C)CCCC(C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(C)(O)C(C)(C)C4CC3 QBSJHOGDIUQWTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 1
- 108700039708 galantide Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007970 homogeneous dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- CAHGCLMLTWQZNJ-RGEKOYMOSA-N lanosterol Chemical compound C([C@]12C)C[C@@H](O)C(C)(C)[C@H]1CCC1=C2CC[C@]2(C)[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@]21C CAHGCLMLTWQZNJ-RGEKOYMOSA-N 0.000 description 1
- 229940058690 lanosterol Drugs 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-YAPGYIAOSA-N lumisterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@@]2(C)[C@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-YAPGYIAOSA-N 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- TZIHFWKZFHZASV-UHFFFAOYSA-N methyl formate Chemical compound COC=O TZIHFWKZFHZASV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMWKZHPREXJQGR-UHFFFAOYSA-N n-methyl-n-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)decanamide Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)C(O)C(O)C(O)CO UMWKZHPREXJQGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMWKZHPREXJQGR-XOSAIJSUSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]decanamide Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO UMWKZHPREXJQGR-XOSAIJSUSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006353 oxyethylene group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000056 polyoxyethylene ether Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 description 1
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 description 1
- 235000015500 sitosterol Nutrition 0.000 description 1
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 1
- NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N sitosterol Natural products CC=C(/CCC(C)C1CC2C3=CCC4C(C)C(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1)C(C)C NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N stigmasterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N 0.000 description 1
- 235000016831 stigmasterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940032091 stigmasterol Drugs 0.000 description 1
- BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N stigmasterol Natural products CCC(C=CC(C)C1CCCC2C3CC=C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005051 trimethylchlorosilane Substances 0.000 description 1
- 229930182493 triterpene saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/256—Polyterpene radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
- C12N2760/18422—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Immunogene complexen, in het bijzonder iscoms.
De uitvinding heeft betrekking op immunogene complexen zoals tweedimensionale lamellen met honingraatstruktuur en in het bijzonder driedimensionale iscoms, welke opgebouwd zijn uit tenminste een sterol, een saponine en in het geval van een iscom eveneens een fosfolipide alsook eventueel tenminste één, een immuunreactie opwekkend antigeen.
Uit de EP-A- 87.200.035*1 is een werkwijze voor het bereiden van immunogene complexen bekend, waarbij men een antigeen eiwit of peptide in opgeloste of gesolubiliseerde vorm in aanraking brengt met een oplossing, die een detergens, een glycoside met een hydrofoob en een hydrofiel gedeelte, in tenminste de kritische micel-vormende concentratie (CMC), alsmede een sterol bevat, vervolgens het detergens verwijdert en het gevormde immunogene complex zuivert. Indien het gevormde immunogene complex een wiscomM-vorm, d,w.z. een uit subeenheden opgebouwde kooi-achtige structuur met een diameter van ca. 35 nm en groter dient te bezitten, dient zich in de bovenvermelde oplossing van het detergens, glycoside en sterol tevens een fosfolipide te bevinden.
Bij de werkwijze volgens deze EP-A past men als glycoside met voordeel saponinen toe, zoals saponinen uit Quillaja saponaria Molina. Aescuius hippocastanum of Gypsophilia struthium. Bij voorkeur past men het produkt "Quil A" toe, zijnde een wateroplosbaar extract uit de bast van Quillaja saponaria Molina (K. Dalsgaard: Saponin Adjuvants III, Archiv für die gesamte Virusforschung 44, 243-254 (1974)). Meer in het bijzonder is Quil A een mengsel van saponinen van de triterpeenklasse. Alhoewel Quil A lipide-complexen e.d. als effectieve antigeen-adjuvan-tia, in hoofdzaak voor amfifatische antigenen worden beschouwd, wordt de wijze van toediening van dergelijke complexen sterk door de toxiciteit van Quil A beperkt. In dit verband wordt naar voren gebracht, dat namelijk de toxiciteit van Quil A-houdende immunogene complexen bij toediening via o.a. de intraperitoneale (i.p.) route ongewenst hoog wordt geacht. Deze aan Quil A verbonden toxiciteit is naar alle waarschijnlijkheid tot de hemolytische aktiviteit van dit produkt terug te voeren.
Uit WO 9Ο/Ο3184 zijn iscom-matrices met een immunomodulerende aktiviteit bekend. Meer in het bijzonder heeft deze WO-aanvrage betrekking op matrices, welke uit tenminste één lipide en tenminste één saponine zijn opgebouwd. Met voordeel wordt cholesterol als lipide toegepast. Voorbeelden van saponinen zijn in het bijzonder triterpeen-saponines, bij voorkeur Quil A of een of meer componenten van Quil A, welke met de aanduidingen B4B, B2 en B3 worden aangegeven. Ten aanzien van de bovenvermelde drie Quil A componenten wordt in de WO 90/03184 vermeldt, dat B4B, dat een molgewicht van 1862 bezit, weliswaar met cholesterol iscom-structuren kan vormen maar evenwel geen adjuvans-akti-viteit bezit, terwijl de B2- en B3~componenten, (molgewichten 1988 resp. 2150) welke wel een adjuvans-aktiviteit bezitten, met cholesterol wel een binding aangaan, maar daarmee geen iscom-achtige structuur vormen; onder adjuvans-aktiviteit wordt verstaan, dat het middel de antilichaam-respons en/of celgemedieerde immuunrespons bevordert. Derhalve dient volgens deze WO 90/03184 voor het bereiden van een iscom-structuur met cholesterol, welke een adjuvans-activiteit bezit, hetzij totaal Quil A hetzij zowel B4B als B2 of B3 te worden toegepast.
Daar, zoals bovenstaand reeds vermeld, Quil A een zekere toxische aktiviteit bezit en de uit WO 90/03184 bekende Quil A componenten niet zowel een iscom-structuur met cholesterol kunnen vormen als een adjuvans-activiteit bezitten heeft aanvraagster naar andere saponinen gezocht, welke een ten opzichte van Quil A sterk afgenomen toxiciteit bezitten alsook een iscom-structuur met adjuvans-activiteit kunnen vormen.
Verrassenderwijs heeft aanvraagster gevonden, dat ondanks de ontmoedigende gegevens van WO 90/03184 er bepaalde Quil A componenten zijn welke aan de bovenbeschreven eisen voldoen.
De uitvinding heeft derhalve betrekking op immunogene complexen zoals tweedimensionale lamellen en in het bijzonder driedimensionale iscoms, welke een adjuvans-aktiviteit bezitten en opgebouwd zijn uit tenminste een sterol, tenminste een Quil A component zoals onderstaand gedefinieerd en in het geval van een iscom eveneens een fosfolipide alsook eventueel tenminste een, een immuunreaktie opwekkend antigeen. Van de onderstaand vermelde Quil A componenten bezit de met QA3 aangeduide Quil A-component de voorkeur, omdat deze zowel een ten opzichte van Quil A sterk verminderde toxiciteit ofwel sterk verminderde hemo-lytische aktiviteit bezit alsook in staat is met de uit de stand der techniek bekende algemene bereidingstechnieken de bovenaangeduide tweedimensionale lamellen en iscom-structuren met een adjuvans-aktiviteit te vormen.
In het kader van de uitvinding worden duidelijkheidshalve onder (a) een tweedimensionale lamel een tweedimensionale struktuur met een honingraatopbouw verstaan, welke ten minste opgebouwd is uit een sterol, een saponine en eventueel een antigeen en onder (b) een iscom een driedimensionale bolvormige kooiachtige struktuur met een diameter van 35~200 nm, welke ten minste opgebouwd is uit een sterol, een saponine, een fosfolipide en eventueel een antigeen.
Bij het aan de uitvinding ten grondslag liggende onderzoek van aanvraagster is uitgegaan van gelyofiliseerd Quil A van de firma Iscotec AB, Lulea, Zweden. Dit produkt is op semi-preparatieve schaal in een 23-tal frakties gescheiden. Bij de toegepaste chromatografische methodiek werden de meer lipofiele componenten later in het chromatogram geëlueerd. In het kader van het onderzoek werden deze frakties op hun hemolytische aktiviteit, suikersamenstelling, adjuvans-werking en de capaciteit voor het vormen van "lege” iscoms onderzocht. Tevens werd de adjuvans-werking van PIC3~iscoms (PIC3 = porie-eiwit I van de Neisseria gonorrhoeae stam C3) of PIC3~iscom-achtige structuren met een of meer Quil A frakties volgens de uitvinding bepaald.
Uit het onderzoek kwam naar voren, dat de 23 Quil A frakties een stabiel chromatografisch gedrag bezaten. Alhoewel in alle gevallen een enkele hoofdpiek werd verkregen, bleek bij een opnieuw uitgevoerde chromatografische bepaling in een analytische kolom met de aanvankelijk toegepaste stationaire fase/mobiele fase uit de piekvorm, dat in nagenoeg alle frakties waarschijnlijk een of meer bijcomponenten aanwezig waren.
Met betrekking tot het uitgevoerde chromatografische onderzoek wordt naar voren gebracht, dat de polaire verbindingen, welke bij het begin van de scheiding elueren en slechts een gering percentage van het totaal vormen, een sterk afwijkend UV-spectrum bezaten ten opzichte van de voornaamste pieken. Derhalve is geen verder onderzoek gepleegd naar de frakties, welke door deze pieken werden aangegeven.
De suikers amenstelling alsook het aglycongedeelte van de Quil A frakties vertonen geen belangrijke verschillen. Anderzijds varieert de relatieve hemolytische aktiviteit sterk. Zoals onderstaand zal blijken varieert deze van 5% tot 150# vergeleken met het totale Quil A produkt.
De adjuvans-aktiviteit van de Quil A frakties vertoont geen verband met de polariteit of met de suikersamens telling. Alle frakties bezitten een adjuvans-aktiviteit. De laagste (QA7) en de hoogste (QA6) waarden van de adjuvans-werking verschillen bijna met een faktor 5.
Wanneer in zijn algemeenheid vaccins parenteraal worden toegediend bestaan deze bij voorkeur uit colloidale deeltjes, d.w.z. deeltjes met een grootte van minder dan 200 nm. Met deeltjes van een dergelijke grootte is op het einde van het produktieproces op relatief eenvoudige wijze een steriele filtratietrap uitvoerbaar. Bovendien zijn dergelijke suspensies stabiel, zodat een reproduceerbaar effekt kan worden gegarandeerd. Met de algemeen bekende standaard-iscom-bereidingsprocedures worden veelal complexen met een gemiddelde grootte van minder dan 200 nm bereid. Verscheidene preparaten met QA-frakties volgens de uitvinding zijn heterogeen, zoals bepaald door elektronenmicroscopie en dynamische lichtverstrooiing, maar al deze preparaten bezaten kleine complexen met een grootte van 50-200 nm. Hieruit kan worden afgeleid, dat het op relatief eenvoudige wijze mogelijk zal zijn meer homogene dispersies met kleine complexen te produceren wanneer het bereidingsproces zelve of de lipidecompositie worden gevarieerd of twee of meer Quil A componenten volgens de uitvinding worden toegepast.
De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op de Quil A component QA3, die een zeer lage hemolytische aktiviteit bezit en daarenboven met sterolen en fosfolipiden in staat is iscoms te vormen. Dergelijke iscoms bezitten een lage hemolytische aktiviteit en de immunogeniteit ervan is vergelijkbaar met die van conventionele iscoms (d.w.z. totaal Quil A iscoms).
Zoals uit de stand der techniek kan worden afgeleid dienen de saponinen bij de werkwijze volgens de uitvinding in tenminste de kritische micelvormende concentratie (CMC) te worden gebruikt. Aangenomen wordt dat deze concentratie voor Quil A-componenten niet sterk afwijkt van de CMC van Quil A, zijnde ca. 0,03 gew.Ji.
De sterolen, die in de immunogene complexen volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt, zijn de bekende sterolen van dierlijke of plantaardige oorsprong zoals cholesterol, lanosterol, lumisterol, stigma-sterol en sitosterol. Bij voorkeur wordt volgens de uitvinding cholesterol als sterol toegepast.
Als fosfolipiden, die bij de bereiding van iscoms worden toegepast, kunnen fosfatidinezuur en esters daarvan worden gebruikt, zoals fosfatidylcholine en in het bijzonder fosfatidylethanolamine.
Voor de vorming van immunogene complexen, welke van een antigeen eiwit of peptide zijn voorzien, dient dit antigene eiwit of peptide in water te worden opgelost of daarin te worden gesolubiliseerd. In het algemeen kan men hiervoor niet-ionische, ionische of zwitterionische detertentia toepassen. Met voordeel kan men als detergens octylglucoside en MEGA-10 (decanoyl-N-methylglucamide) gebruiken, doch ook alkylfenyl-polyoxyethyleenethers zijn geschikt, in het bijzonder een polyethyleen-glycol p-isooctylfenylether met 9 a 10 oxyethyleengroepen, dat bijvoorbeeld onder de merknaam Triton X-100^ in de handel is.
In de immunogene complexen volgens de uitvinding kunnen willekeurige antigene eiwitten of peptiden worden opgenomen. Deze eiwitten of peptiden kunnen membraaneiwitten of membraanpeptiden zijn, geïsoleerd uit virussen, bacteria, mycoplasma's, parasieten of dierlijke cellen. De eiwitten of peptiden kunnen ook synthetisch of met behulp van recombinant DNA-technieken bereid zijn en kunnen ook in gezuiverde vorm. in de immunogene complexen worden ingebouwd. Voor de zuivering van een anti-geen eiwit of peptide van natuurlijke oorsprong wordt gewoonlijk naast een ultracentrifugering of dialyse een verdere zuiveringstrap uitgevoerd, bijvoorbeeld een chromatografische zuiveringstrap, zoals op een kolom met DEAE-Sephadex of door middel van immunoaffiniteitschromato-grafie. Indien de antigene eiwitten of peptiden geen hydrofobe delen bevatten, dienen deze chemisch gekoppeld te worden aan een verbinding met een hydrofoob gedeelte, zoals bijvoorbeeld een lipide e.d..
De bereiding van de immuogene complexen volgens de uitvinding wordt in zijn algemeenheid op zodanige wijze uitgevoerd, dat het opgeloste of gesolubiliseerde antigeen in aanraking wordt gebracht met een oplossing, die het saponine in tenminste de kritische micelvormende concentratie, een sterol en in het geval van een iscom eveneens een fosfolipide bevat. Daarna wordt het detergens verwijderd en het gevormde immunogene complex gezuiverd.
Voor het verwijderen van het detergens kan men in het algemeen de bekende methoden toepassen, zoals dialyse, gradiëntcentrifugering of chromatografie. Bij toepassing van gradiëntcentrifugering en chromatografische methoden, bijvoorbeeld gelfiltratie voor het verwijderen van het detergens, wordt het immunogene complex tevens verregaand van andere stoffen bevrijd, zoals overmaat glycoside en sterol. In het algemeen is een dialyse niet voldoende voor het zuiveren van de immunogene complexen, hoewel door verwijdering van het detergens door dialyse de immunogene complexen wel worden gevormd.
De verkregen oplossingen van de immunogene complexen kunnen desgewenst worden gelyofiliseerd bij aanwezigheid van een cryoprotectant zoals trehalose of lactose. De gelyofiliseerde preparaten kunnen dan voor gebruik door toevoeging van water weer worden gereconstitueerd.
De uitvinding heeft voorts betrekking op farmaceutische preparaten, welke met behulp van de onderhavige uitvinding verkregen immunogene complexen bevatten. Deze preparaten kunnen worden verkregen door de immunogene complexen in een voor parenterale of orale toediening geschikte vorm te brengen. In het algemeen bevatten farmaceutische preparaten, welke parenteraal zullen worden toegediend, de immunogene complexen in een waterig, fysiologisch aanvaardbaar milieu, dat desgewenst een buffer en/of een zout, zoals natriumchloride bevat, ter aanpassing van de osmotische druk.
De farmaceutische preparaten volgens de uitvinding vertonen, in het bijzonder bij het toepassen van QA 3 als saponine, een sterk verminderde hemolytische aktiviteit ten opzichte van de bekende farmaceutische preparaten, waarin het totale Quil A als component aanwezig is.
LEGENDA
Fig. 1: Chromatogram van de semi-preparatieve scheiding van Quil A op
Supelcone LC-18 semi-prep-kolom. Hierbij stellen de cijfers 1-23 de 23 QA-componenten voor Quil A voor. De aan QA1 voorafgaande pieken worden als verontreinigingen beschouwd. De in deze figuur aangeduide letters A, B, C en D stellen de componenten QA3 (A), QA20 (B) en een tweetal verontreinigingen (C,D) voor; van deze vier componenten worden in Fig. 2a-d het UV-spectrum geïllustreerd.
Fig.2a-d: UV-spectra van de in Fig.l weergegeven componenten A, B, C en D.
Fig. 3: Gaschromatogram van het gemethanolyseerde, gesilyleerde QA3” cholesterolmengsel in een CP Sil SCB-kolom (17 m x 0,25 m) (Chrompack, Nederland).
Fig. 4s Massaspectrum van piek bij 21 min. 6 sec. weergegeven in Fig.3*
Fig. 5: CAD-MS/MS-spectrum van de voornaamste component in de gemethanolyseerde, gesilyleerde QA3-fraktie. Het geselecteerde ion is het geprotoneerde moleculaire ion van de overeenkomstige verbinding in de GC-piek bij 21 min. 6 sec.
Fig. 6: Massaspectrum van de piek met een retentietijd van 20 min. 51 sec. weergegeven in Fig.3.
De uitvinding wordt aan de hand van het onderstaand beschreven onderzoek nader toegelicht.
MATERIALEN EN METHODEN Scheidingsprocedure
Gelyofiliseerd Quil A (Iscotec AB, Lulea, Zweden) werd in water (50 mg/ml) gesolubiliseerd. Het mengsel werd op een Supelcosil LC-18 semi prep kolom (Supelco, Belief on te, PA) (250 x 10 mm) gescheiden. De mobiele fase bestond uit acetonitril in water, dat gebufferd was met 10 mM ammoniumacetaat, pH 6,0. De ace toni trilconcentratie nam in 60 min. van 24 tot 44 vol.# toe. Het debiet bedroeg 2,5 ml/min. De pieken werden bij 206 nm gedetecteerd en automatisch met een Frac 100 fraktie-collector (Pharmacia LKB, Uppsala, Zweden) verzameld. De monstergrootte bedroeg 500μ1. Er werden ongeveer 40 scheidingen uitgevoerd, waarbij de overeenkomstige pieken werden verzameld en gevriesdroogd. Het water-gehalte van 2 gelyofiliseerde frakties werd met een MCI model VA-05 (Mitsubishi) bepaald. Voor het nagaan van de zuiverheid en stabiliteit van de verzamelde frakties werden alle preparaten opnieuw op een analytische (150 x 4,6 mm) Supelcosil LC-18 kolom gechromatografeerd met dezelfde mobiele fase.
Suikersamenstelling
De algemene suikersamenstelling werd op de in Kamerling J.P. c.s., 1989» Carbohydrates, blz. 175“263» A.M. Lawson (ed.), Clin. Biochem. 1, Mass Spectrometry, W. de Gruyter, New York, beschreven wijze bepaald. . Ongeveer 0,5 mg monster werd in 0,5 ml 1,0 M HC1 in droge methanol gedurende de nacht bij 85°C gemethanoliseerd. Aan alle monsters werd 100 nmol mannitol als interne standaard toegevoegd. Na de methanolyse werden de monsters met Ag2C0^ geneutraliseerd en werd 4θ μΐ azijnzuuranhydride aan de monsters toegevoegd om mogelijk aanwezige N-gedeacetyleerde carbohydraten opnieuw te N-acetyleren. Na 24 uur staan bij kamertemperatuur, waarbij deze van licht afgeschermd waren, werden de monsters gecentrifugeerd, de supernatanten gewonnen en de Ag2C02~pellet twee maal met methanol gewassen. De methanol werd in een Rotavap-des-tilleerinrichting onder een waterstraalpomp-vacuum bij 35°C verwijderd en de residuen werden gedurende een nacht onder een waterstraalpomp-vacuum bij aanwezigheid van P2O5 gedroogd. De suikers werden gesilyleerd door het toevoegen van ΙΟΟμΙ pyridine:hexamethyldisilazaan:chloortri-methylsilaan = 5ï1!1 (v/v/v) gedurende een half uur voor de analyse. De monsters werden op een SE 30 WC0T fused-silica capillaire kolom (25 m x 0,32 mm) geanalyseerd. Er werd een vlamionisatie-detector toegepast en als draaggas werd stikstof gebruikt. De in jectiepoorttemperatuur en detectortemperatuur bedroegen 210°C resp. 230eC. De oventemperatuur nam van 130eC tot 220°C met een snelheid van 4°C/min. toe. Een standaardmengsel van bekende concentratie werd toegepast voor het bepalen van de aanpassingsfactoren, welke voor de partiële destructie van de suikers corrigeren.
Winnen van het PIC3-eiwit. (PIC3 = porie-eiwit I van de Neisseria Gonorrhoea stam C3).
Op gebruikelijke wijze werd de Neisseria gonorrhoea stam C3 gekweekt. De culturen werden door verwarmen op 56°C gedurende 30 minuten geïnactiveerd. Na centrifugeren werden de geïnactiveerde bacteriën gelyofiliseerd. De isoleringsprocedure voor het porie-eiwit I (PI) was gebaseerd op de procedure, welke door Blake en Gotschlich voor de isolering van porie-eiwit II is gebruikt (J. Exp. Med. 159, blz. 452-462, 1984). De gelyofiliseerde bacteriën werden geëxtraheerd met 2,5 g 3~{N-tetradecyl-N,N-dimethyl-ammonium)-1-propaansulfonaat (Z 3“l4) in 0,5 M. CaCl2 bij pH = 4,0. Na een uur werden intacte cellen en fragmenten door centrifugeren verwijderd (20 min., 20.000 x g). Aan de bovenstaande vloeistof werd ethanol toegevoegd tot een concentratie van 202· Na 30 minuten werd het neergeslagen materiaal door centrifugeren (20 min., 10.000 x g) verwijderd. De bovenstaande vloeistof werd geconcentreerd door ultrafiltratie (Amicon-holle-vezel-patroon H 10x50); er werd 50 mM Tris. HC1 10 mM EDTA, 0,052 (gew/vol.) Z 3“l4, pH = 8,0 (Buffer A) toegevoegd en het volume werd tot de helft gereduceerd. Deze procedure werd vijf maal herhaald om het calciumchloride en de ethanol volledig te verwijderen. Daarna werd de eiwitoplossing op een met buffer A geëquili-breerde kolom van DEAE-Sepharose gebracht. De eiwitten werden geëlueerd met een lineaire gradiënt van 0,0 tot 0,6 M NaCl in buffer A. De frakties werden geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE en de PI bevattende frakties werden samengevoegd. Het gedeeltelijk gezuiverde PI werd op een vooraf met 50 mM Tris. HC1, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,052 (gew/vol.) Z 3-14, pH = 7.2 geëquilibreerde Sephacryl S-300 kolom gebracht. De PI-bevattende frakties werden samengevoegd. Het verkregen produkt werd als gezuiverd PI aangeduid.
Bereiding van immunogene complexen
Voor het opnemen van PI in iscoms werd de volgende procedure toegepast. Een mengsel van fosfatidylethanolamine type III-A (=PE) (Sigma) en cholesterol in chloroform (gew.verhouding PE:cholesterol = 1:1) werd onder stikstof gedroogd en de verkregen lipidefilm werd vervolgens in een TN-buffer (Tris/NaCl; 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH = 7,4) met 136 mM octylglucoside gesolubiliseerd. Daarna werd PI in de TN-buffer met 136 mM octylglucoside toegevoegd. De verhouding van lipide (PE + cholesterol) tot proteine (PI) bedroeg 5:1 (gew/gew). Vervolgens werden totaal Quil A (Iscotec AB, Lulea, Zweden) of de QA-fraktie(s) volgens de uitvinding als een 10#'s oplossing (gew/vol) in water toegevoegd. De verhouding van lipide (PE + cholesterol) tot Quil A of QA-fraktie bedroeg 1:2 (gew/gew). De lipideconcentratie bedroeg ca. 1 mg/ml. De iscoms werden gevormd door dialyse tegen twee overgangen met een liter TN-buffer gedurende tenminste 24 uur bij 4°C. De iscoms werden van de niet-opgenomen componenten afgescheiden door centrifugeren door een 10 tot 60% sucrosegradiënt in TN-buffer (18 uur, 50.000 x g). Hierbij werd de verkregen iscom-band verwijderd.
Voor het bereiden van "lege” iscoms, d.w.z. geen PI-bevattende iscoms, werd de bovenstaande procedure gevolgd, maar met het verschil dat er TN-buffer met 136 mM octylglucoside in plaats van de oplossing van PI in TN-buffer met 136 mM octylglucoside werd toegevoegd.
Electronenmicroscoop
Er werd een negatieve kontrastkleuring uitgevoerd met 2% fosfo-wolfraamzuur (Hg [P(Wg0^o)43) ♦ dat met Κ0Η op een pH van 5.2 was ingesteld.
Proteinegehaltebepaling
De proteinegehalten van de iscoms werden via een Bradford-proteine-assay (Bradford M.M., 1976, Anal. Biochem. J2, blz. 248-254) bepaald. Het proteine werd door ethanolprecipitatie uit de iscoms afgescheiden. Het PIC3 werd in 2% octylglucoside (Sigma Chemical Co..Rockford, 111, USA) gesolubiliseerd voordat de proef werd uitgevoerd.
Quil A-gehalte-bepaling
Quil A en Quil A-frakties werden chromatografisch op een Hypersil 0DS 5 U analysekolom (150 x 4,6 mm) (Shandon, Runcorn, UK) bepaald. De acetonitril-concentratie veranderde van 32/1» tot 40# in met ammonium-acetaat gebufferd water gedurende de analyse. De pieken werden bij 208 nm gedetecteerd. Een quantificatie werd bereikt door het meten van de piekhoogte of hoogte van de drie voornaamste pieken in het geval van (Sigma) en cholesterol in chloroform (gew.verhouding PE:cholesterol = 1:1) werd onder stikstof gedroogd en de verkregen lipidefilm werd vervolgens in een TN-buffer (Tris/NaCl; 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH = 7,4) met 136 mM octylglucoside gesolubiliseerd. Daarna werd PI in de TN-buffer met 136 mM octylglucoside toegevoegd. De verhouding van lipide (PE + cholesterol) tot proteine (PI) bedroeg 5:1 (gew/gew). Vervolgens werden totaal Quil A (Iscotec AB, Lulea, Zweden) of de QA-fraktie(s) volgens de uitvinding als een 10#'s oplossing (gew/vol) in water toegevoegd. De verhouding van lipide (PE + cholesterol) tot Quil A of QA-fraktie bedroeg 1:2 (gew/gew). De lipideconcentratie bedroeg ca. 1 mg/ml. De iscoms werden gevormd door dialyse tegen twee overgangen met een liter TN-buffer gedurende tenminste 24 uur bij 4°C. De iscoms werden van de niet-opgenomen componenten afgescheiden door centrifugeren door een 10 tot 60% sucrosegradiënt in TN-buffer (18 uur, 50.000 x g). Hierbij werd de verkregen iscom-band verwijderd.
Voor het bereiden van "lege” iscoms, d.w.z. geen PI-bevattende iscoms, werd de bovenstaande procedure gevolgd, maar met het verschil dat er TN-buffer met 136 mM octylglucoside in plaats van de oplossing van PI in TN-buffer met 136 mM octylglucoside werd toegevoegd.
Electronenmicroscoop
Er werd een negatieve kontrastkleuring uitgevoerd met 2% fosfo-wolfraamzuur (Hg [P(Wg0^o)43) ♦ dat met Κ0Η op een pH van 5.2 was ingesteld.
Proteinegehaltebepaling
De proteinegehalten van de iscoms werden via een Bradford-proteine-assay (Bradford M.M., 1976, Anal. Biochem. J2, blz. 248-254) bepaald. Het proteine werd door ethanolprecipitatie uit de iscoms afgescheiden. Het PIC3 werd in 2% octylglucoside (Sigma Chemical Co..Rockford, 111, USA) gesolubiliseerd voordat de proef werd uitgevoerd.
Quil A-gehalte-bepaling
Quil A en Quil A-frakties werden chromatografisch op een Hypersil 0DS 5 U analysekolom (150 x 4,6 mm) (Shandon, Runcorn, UK) bepaald. De acetonitril-concentratie veranderde van 32/1» tot 40# in met ammonium-acetaat gebufferd water gedurende de analyse. De pieken werden bij 208 nm gedetecteerd. Een quantificatie werd bereikt door het meten van de piekhoogte of hoogte van de drie voornaamste pieken in het geval van
Quil A. Er werden standaardkrommen opgezet voor calibratiedoeleinden. Hydrodynamische deeltjesgrootten
Deze deeltjesgrootte werd bepaald door verstrooiing in mono-chromatisch licht met een System 4600 size analyzer (Malvem Instruments Ltd., Worcestershire, UK).
Hemolytische aktiviteit
De hemolytische aktiviteit van Quil A-frakties en iscoms werd bepaald op de in Kersten et al., On the Structure of Immune-stimulating Saponin-lipid Complexes (iscoms), Aangeboden ter publikatie). V-gevorm-de putjes van een microtiterplaat werden met 100 μΐ 0,5% (v/v) erythro-cyten van Cercopithecus aureus in Mcllvain buffer met een pH van 7*2 (13,1 mM citroenzuur, 173*8 mM Na2HP0^) gevuld. Daarna werd 100 μΐ van het monster of de QA-standaard (concentratie oplopend van 0,5 tot 8,0 pg/ml) toegevoegd. Na een incubatie gedurende 3 uur bij 37*C werd de plaat gedurende 5 min· hij 2000 rpm (Hettich Rotixa IKS, Tuttlingen, BRD) gecentrifugeerd en werd 100 μΐ supernatant in een platbodem-micro-titerplaat overgebracht. De extinctie bij 405 nm werd met een microti terplaatlezer (Titertek Multiskan MCC, Flow Laboratories, Herts., UK) bepaald.
Adjuvans-activiteit
De adjuvans-activiteit werd in muizen met de gezuiverde porie proteine I van Neisseria gonorrhoeae (stam C3) (PIC3) als model antigeen onderzocht. PIC3 werd op de hierboven beschreven wijze gezuiverd met de volgende modificaties: vast fenylmethylsulfonylfluoride (Serva, Heidelberg, FRG) werd aan de extractiebuffer toegevoegd, er werd een extra klaringsstap door filtratie met een 1,2 pm filter (RA Milli-pore, Bedford, MA) voor de CaCl2 verwijderingsprocedure uitgevoerd en een tweede filtratie (0,45 μω) werd voor de DEAE Sephadex chroraatografie uitgevoerd. De gelfiltratietrap werd overgeslagen. Mannelijke NIH-muizen (4 of 8 per groep) werden subcutaan met 2,5 pg PIC3 en 20 pg gezuiverd Quil A of 2,5 pg P1C3 in iscoms geïmmuniseerd. Het PIC3 werd als een suspensie gebruikt, welke verkregen was na ethanolprecipitatie en suspenderen van de gedroogde pellet in Tris (10 mM) gebufferde zoutoplossing, pH 7.4, met behulp van een korte ultrasonische behandeling. Vier weken na de primer-immunisatie werden bloedmonsters verzameld en de muizen kregen een booster-injectie. Twee weken na de booster werden de muizen gedood en werd de relatieve IgG spiegel in de sera met behulp van ELISA met PIC3 als antigeen-bekleding bepaald.
Molecuulmassa's
De molecuulmassa's werden met behulp van een positieve FAB-MS (fast atom bombardment-massa spectrometry) bepaald. De metingen werden I uitgevoerd met 2-hydroxyethyldisulfide als matrix en xenon als ioniserende atomen.
RESULTATEN Quil A zuivering ) In Fig.l wordt het chromatogram van de bovenaangeduide semi-prepa- ratieve scheiding van Quil A geïllustreerd. Initiële proeven lieten zien, dat de pieken in het begin van het chromatogram een zeer gering massapercentage vertegenwoordigden. Derhalve werd dit gedeelte niet meer bij het verdere onderzoek van aanvraagster meegenomen, i De eerste piek, welke een aanzienlijke hoeveelheid massa bevatte werd QA 1 genoemd. In totaal werden 23 pieken en piekgroepen geïdentificeerd en verzameld. De daaraan voorafgaande verontreinigingen werden in Fig.l niet nader aangeduid.
De frakties QA 1 - QA 23 werden gevriesdroogd, wat in alle geval-) len resulteerde in een wit, sneeuwachtig poeder. Het restwatergehalte van QA 20 en QA 22 bedroeg 4,2# resp. 4,4#. Van deze restwatergehalten werd aangenomen, dat deze representatief waren voor alle gevriesdroogde monsters. Uit alle frakties werd een oplossing van 1# of 10# (w/v) in water bereid. De oplossingen werden bij -20°C opgeslagen; de gelyo-) filiseerde preparaten werden bij 4°C opgeslagen.
Bij opnieuw chromatograferen van de 23 QA-frakties was er altijd slechts één hoofdpiek aanwezig, welke soms van een schouder of een kleine voorafgaande piek vergezeld was.
) UV-spectra
De spectra van Quil A-frakties (QA), zoals opgenomen met een diode array detector, waren identiek (190-370 nm). De frakties absorberen slechts bij korte golflengten en zijn boven ongeveer 240 nm transparant. De meeste pieken, welke aan QA 1 voorafgaan, bezitten een totaal ver-) schillend spectrum met maxima bij 200 nm en 280 nm of 310 nm.
In de bijgaande Fig. 2a-d worden de UV-spectra van QA 3 (Fig.2a), QA 20 (Fig.2b) en van de verontreinigingen C [in Fig.l aangeduid] (Fig.2c) en D [in Fig.l aangeduid] (Fig.2d) weergegeven.
)
Suikersamenstelling
Er zijn geen belangrijke verschillen in suikersamenstelling van de 23 Quil A-frakties, zoals deze door aanvraagster zijn verzameld (zie Tabel A) vastgesteld. Suikers welke in alle frakties voorkomen zijn rhamnose, fucose, xylose, glucuronzuur en galactose. Bovendien worden in bepaalde frakties arabinose en/of glucose waargenomen. De molverhoudingen variëren vaak van 0, 1 of 2. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door verontreiniging met andere componenten, zoals kan worden afgeleid van de piekvormen of door de aanwezigheid van suikers met een identiek gaschromatografisch gedrag. Voorts wordt in dit verband naar voren gebracht, dat geringe hoeveelheden van bijvoorbeeld hemi-cellulose niet geheel kan worden uitgesloten.
TABEL A
Suikersamenstelling (in molverhouding) van Quil A-frakties 1-23 en Quil A totaal
Quil A- ara1) rham^) fuc^) xyl^) glca^) gal^) glc?) fraktie piek 1 0,2 2,3 1,1 1,7 1,0 1,0 1,0 2 0,2 2,3 1,1 1,6 1,0 1,0 0,5 3 0,2 2,3 1,1 1,7 1,0 1,0 1,0 4 0,2 2,4 1,1 1,7 1,0 1,0 0,3 5 0,2 1,8 1,1 1,6 1,0 1,0 1,4 6 0,1 2,0 1,1 1,6 1,0 1,0 0,8 7 0,2 1,7 1,1 1,7 1,0 1,0 1,0 8 0,3 1,6 1,1 1,0 1,0 1,0 1,1 9 0,5 1,8 1,1 1,1 1,0 1,0 1,0 10 0,3 2,3 1,1 1,8 1,0 1,0 0,9 11 0,3 2,2 1,1 1,7 1,0 1,0 0,4 12 0,4 2,0 1,1 1,7 1,0 1,0 0,9 13 0,6 1,7 2,1 1,0 1,0 1,0 1,0 14 0,3 1,8 1,1 1,2 1,0 1,0 0,7 15 0,4 1,7 1,1 1,7 1,0 1,0 1,0 16 0,7 1,8 1,1 1,9 1,0 1,0 0,8 17 1,1 2,3 1,1 1,8 1,0 1,0 1,1 18 0,7 1,6 1,1 1,7 1,0 1,0 0,7 19 0,5 1,5 1,0 1,5 1,0 1,0 0,9 20 1,1 1,7 1,1 1,7 1,0 1,0 0,9 21 0,8 1,4 1,1 2,0 1,0 1,0 0,6 22 1,1 1,5 1,1 1,8 1,0 1,0 0,1 23 0,7 1,4 0,9 1,2 1,0 1,0 0,4 QA totaal 0,8 1,7 1,0 1,5 0,9 1,0 0,8 1) ara = arabinose of een zich als arabinose gedragende suiker 2) rham = rhamnose of een zich als rhamnose gedragende suiker 3) fuc = fucose of een zich als fucose gedragende suiker 4) xyl = xylose of een zich als xylose gedragende suiker 5) glca = glucuronzuur 6) gal = galactose = 1,0 gedefinieerd 7) glc = glucose of een zich als glucose gedragende suiker
Hemolytische aktiviteit
De hemolytische aktiviteit van de QA 1 t/m QA 23-frakties wordt in Tabel B weergegeven. Uit deze tabel kan worden afgeleid, dat de hemolytische aktiviteit toeneemt met een afnemende polariteit, d.w.z. de komponenten met langere retentietij den. De frakties met de kortste retentietijd bezitten hemolytische aktiviteiten, welke 10 tot 20 maal geringer zijn dan die van Quil A.
TABEL B
Relatieve hemolytische activiteit van Quil A-frakties 1-23 (Quil A totaal = 100j£)
Quil A Hemolytische activiteit fraktie ten aanzien van
Quil A totaal (%) ï 5 2 8 3 8 4 14 5 4 6 5 7 5 8 14 9 16 10 16 11 22 12 33 13 38 14 31 15 15 16 56 17 65 18 36 19 72 20 108 21 108 22 147 23 103
Ad.iuvans-aktiviteit van de Quil A-frakties 1-23
Uit deze tabel kan worden afgeleid, dat alle frakties een adju-vans-aktiviteit bezitten.
TABEL C
Ad juvans-aktivitext van Quil A-frakties 1-23 en Quil A totaal
Quil A IgG respons fraktie Serum verdunning bij A450 = 0,4
in ELISA
primer x 10^ booster x 10^ ï 2JT.
2 4,6 4,6 3 6,9 5,5 4 6,6 3,5 5 2,6 2,8 6 1,2 5,6 7 < 1,0 1,2 8 4,6 2,6 9 1,9 2,0 10 1,6 1,6 11 2,3 2,5 12 8,0 2,7 13 3,9 2,0 14 3,0 4,0 15 3,9 1,6 16 2,9 1,4 17 5,0 1,5 18 1,6 2,2 19 3,5 3,4 20 2,7 1,6 21 2,3 4,5 22 2,7 2,7 23 2,9 1,8 QA totaal 1,8 2,9 geen adjuv. < 1,0 0,2
Adjuvans-aktiviteit werd in muizen bepaald met porie-eiwit I van Neisseria gonorrhoeae stam C als antigeen; adjuvans dosis: 20pg.
Per groep werden vier muizen gebruikt
Vorming van immunogene complexen
Voor een aantal QA-frakties was het niet direkt mogelijk lipide-QA-komplexen met dimensies te bereiden, welke die van standaard-iscoms, waarbij totale Quil A-monsters zijn toegepast (Tabel D) benaderen.
In de meeste gevallen werd een turbide dispersie verkregen onder toepassing van de bovenvermelde standaard iscom-formatieprocedure. Uit electronenmicroscoop-onderzoek bleek echter altijd, dat zich deeltjes met de typische honingraatstructuur hadden gevormd, zoals waargenomen in iscoms. Voorts waren er vaak veel deeltjes met een iscom-grootte aanwezig (Fig.3). De "lege" iscoms, bereid uit de frakties QA 1, 3, 5, 6, 9, 12-14, 18 en 23 vertoonden een gemiddelde deeltjesgrootte beneden 200 nm.
TABEL D
Deeltjesgrootte van proteinvrije structuren, gevormd na een iscom-bereidingsprocedure
Quil A Gemiddelde deeltjesgrootte fraktie lege iscom-structuur (nm) ï Ï5Ö 2 > 1000 3 1^5 4 > 1000 5 148 6 160 7 > 1000 8 > 1000 9 95 10 > 1000 11 > 1000 12 124 13 106 14 166 15 > 1000 16 > 1000 17 > 1000 18 97 19 > 1000 20 > 1000 21 > 1000 22 838 23 67 QA totaal 53 PIC3~bevattende iscoms werden met een zestal Quil A-frakties (QA 3, 17» 18. 20, 22 en 23) bereid. Na een gradiënt-purificatie en analyse (zie Tabel E) werd de immunogeniteit ervan vastgesteld. In dit verband was het zeer verrassend, dat PIC3“iscoms met de Quil A-fraktie QA 3 uitmuntende resultaten te zien gaf.
TABEL E
Analyse en immunogeniciteit van PIC3 bevattende iscom-achtige structuren, bereid met 6 Quil A frakties.
Preparaat Proteine Quil A Hemolytische Grootte IgG respons^) (mg/ml) (mg/ml) aktiviteit (nm) Serum dilutie overeenkomend bij A450 =0,4
met x mg/ml vrij in ELISA
Quil A totaal primer xlO^ booster xlO^ QA 3 iscom 32 299 ÏÖ ΪΠ 1^6 19^2 QA 17 iscom 122 1070 9 >1000 1,6 6,4 QA 18 iscom 43 430 13 >1000 0,9 4,5 QA 20 iscom 50 775 171 >1000 1,3 17,9 QA 22 iscom 92 2150 339 >1000 1,6 7,3 QA 23 iscom 52 883 H >1000 0,6 22,3 QA totaal iscom 28 470 168 65 0,5 19,2 1) acht muizen per groep Molecuulmassa * s
In de onderstaande Tabel F worden de molecuulmassa's van de MH+ ionen van het overgrote deel van de QA-frakties volgens de uitvinding weergegeven. Deze bepaling van de molecuulmassa werd uitgevoerd met een positieve FAB-MS-methode. Door aanvraagster wordt aangenomen, dat er een natriumion is ingesloten in het suikerdeel, gebonden aan het koolstof-atoom 28 van het aglyconskelet. Derhalve dienen met aan zekerheid grenzende waarschijnlijkheid de in Tabel F vermelde waarden met 23 te worden verminderd.
TABEL F
a) In alle frakties, behalve QA 10 en QA 13 is ook MH+ + 14 aanwezig in verschillende verhoudingen met MH+. Dit is de methylester van glucuronzuur.
b) Vele massa's aanwezig.
Gezien de interessante eigenschappen van de Quil A-fraktie, aangeduid met QA 3. is er een massaspectrometische analyse van het voornaamste aglycon uitgevoerd; de saponinen in Quil A zijn glycosiden, welke uit een aglycon en een of meer suikerstaarten zijn opgebouwd.
Het voornaamste aglycon van saponinen, welke verkregen zijn uit de bast van Quillaja saponaria Molina wordt quillajazuur geacht.
Het aglycon-gedeelte van de Quil A-frak tie QA 3 werd met behulp van GC-MS geanalyseerd.
Een mengsel van 0,5 mg gevriesdroogd QA 3 en 0,1 mg cholesterol (Sigma, St.Louis, MO) werd in 0,5 ml droge methanol, dat 1,0 M HC1 bevatte, opgelost. De methanolyse werd 24 uur bij 85 °C uitgevoerd. Het monster werd bij 40°C onder een stroom stikstof gedroogd. Aan het gedroogde residu werd 100 μΐ silyleringsmiddel toegevoegd (bis-(tri-methylsilyl) - tri f luoraceetamide: N-trimethylsilylimidazool: trimethyl-chloorsilaan = 3t3ï2) (gew/gew/gew). Het monster werd grondig gemengd en bij -20 °C in een glazen buis opgeslagen tot de analyse werd uitgevoerd. De suikers en het aglycon werden op een CP Sil SCB-kolom (17 m x 0,25 mm) (Chrompack, Middelburg, Nederland) met een filmdikte van 0,l4 ym gescheiden. De injectortemperatuur bedroeg 275°C en de kolomtempera-tuur nam met 10eC/min. van 70°C tot 310°C toe. Het injectievolume bedroeg 1,0 μΐ. De pieken werden op een Autospec mass spectrometer (VG, Manchester, U.K.) gedetecteerd. De ionisatie vond plaats d.m.v. electron impact (70 eV electronen, ionen-bron temperatuur: 250°C). De "trap"-stroom bedroeg 100 μΑ en de resolutie was 1000 (10# valley). De scan-parameters waren: magnetische scan van 100 tot 1000 massa-eeriheden bij 2 sec/decade. De cyclustijd was 2,5 s. Het gesilyleerde aglycon werd verder geanalyseerd met botsings-geïnduceerde fragmentatie tandem massa spectrometrie (CAD-MS/MS) op een HX110/HX110 massaspectrometer (JE0L, Tokyo, Japan). Positieve FAB werd toegepast voor de desorptie/ionisatie van het monster door toepassing van het JE0L Xe atoom kanon, toegepast bij 6 kV. Het instrument werd bij een 10 kV accelererende potentiaal gebruikt. Als matrix werd glycerol/thio-glycerol (1/1) (gew/gew) toegepast. Hoge energie-botsings geïnduceerde MS/MS spectra werden verkregen door het introduceren van He-gas in de collisiecel bij grondpotentiaal, zodat de ionen-energie in het botsings-gebied 10 keV bedroeg. De druk van het botsingsgas werd zodanig ingesteld, dat de respons van het precursor-ion op de eind-detector werd gereduceerd tot 1/4 van de niet-botsingsgeïnduceerde respons. Het scan-traject bedroeg 55"650 atomaire massa-eenheden en de cyclustijd bedroeg 1 min 52.8 sec.
Ter bevestiging van het monsterpreparaat en de GC-MS-analyse werd een in de handel verkrijgbaar saponine β-esceine (Sigma), met een bekende chemische structuur geanalyseerd. Volgens het label was het produkt 90-95# zuiver. Het gaschromatogram van gemethanolyseerd, gesilyleerd β-esceïne vertoonde verscheidene pieken met retentietijden, welke langer waren dan die van cholesterol. De massa van de component in de hoofdpiek werd op 488 berekend (dit is zonder de TMS (trimethylsilyl) groepen). Dit is de gerapporteerde massa van de lactonvorm van het aglycon van β-esceine.
Het gaschromatogram van het QA 3”cholesterol-mengsel wordt in Fig. 3 weergegeven. De piek met de retentie tijd van 17 min. 45 sec. is cholesterol (massaspectrum niet geïllustreerd). De pieken, welke cholesterol voorafgaan, zijn suikerderivaten. Het massaspectrum van de piek bij 21 min. 6 sec. wordt in Fig. 4 geïllustreerd. Het moleculaire ion heeft een m/z van 644,3· He moleculaire isotoopcluster geeft de aanwezigheid van 2 TMS-groepen aan. De exacte massa van de MH+ion is 645,4371±0,0028 atomaire massa-eenheden. De elementsamenstelling, welke het beste met deze massa overeenkomt is 037^505812» aannemende dat slechts C,H,0 en 2 Si atomen in het molecuul aanwezig zijn. De berekende massa van 037^505812 is 645.4370 atomaire massa-eenheden. Het mol-gewicht van het molecuul zonder de 2 TMS groepen is 644-(2 x 72) = 500 atomaire massa-eenheden (03^305). Quillajazuur (¢30^^05) bezit een molecuulgewicht van 486. Daar het aglycon door methanolyse verkregen wordt kan de verbinding met de massa van 500 de methylester van quillajazuur zijn. Dit wordt bevestigd door een tandem-massaspectro-metrische analyse van het gesilyleerde aglucon (Fig. 5). wat het verlies van methanol illustreert (Tabel G).
TABEL G
Interpretatie van het MS/MS spectrum van gemethanoliseerd gesilyleerd QA 3. met MS 2 op 645 atomaire massa-eenheden.
m/z interpretatie 645 MH+ 615 “30 (formaldehyde) 613 -32 (methanol) 601 -44 (ethanol of propaan) 585 “60 (methylester van mierezuur) 569 -44-32 555 -90 (HOTMS) 541 -60-44 523 -32-90 511 -44-90
De estervorming verklaart ook waarom slechts 2 TMS-groepen na de silylering aanwezig zijn. Het GC-MS-spectrum (Fig.4) toont het verlies van 117 atomaire massa-eenheden, wat een COOTMS-groep (Tabel H) kan voorstellen.
TABEL H
Interpretatie van het massa-spectrum in Fig. 4 m/z interpretatie
644 M
629 M-15 15 = ch3 586 M-58 58 = Si(CH3)2 554 M-90 90 = HO-TMS1
527 M-117 117 = COOTMS
496 M-(90 + 58) 464 M-(2 x 90) 437 M-(117 + 90) 1) TMS = Si(CH3)3
Dit is onverenigbaar met de methylestervorm van quillajazuur. Het fragment wordt niet in het MS/MS-spectrum gedetecteerd. Mogelijkerwijs is de aanwezigheid van een co-eluerende verontreiniging de oorzaak.
M/z 305 is een welbekend OTMS-fragment van sacchariden. Het stelt het OTMS-derivaatfragment bij C2-C3-C/j voor. Het is echter onwaarschijnlijk, dat in dit geval m/z 305 van een suikerdeel afkomstig is. Waarschijnlijk stelt het fragment een deel van het aglucon voor.
Een vergelijking van de GC-piek bij 21 min. 6 sec. met een spectrum van de smalle voorafgaande GC-piek bij 20 min. 56 sec. vertoont een opmerkelijke overeenkomst (Fig.6). De spectra zijn soortgelijk vanaf m/z 629, wat een grote overeenkomst in beide verbindingen aangeeft. Het verschil is slechts in het moleculaire ion-gebied gelegen; dit bedraagt 74 atomaire massa-eenheden. Het verschil kan worden verklaard door aan te nemen, dat een C=0 groep in de verbinding van de hoofdpiek tot een OH-groep is gereduceerd in de verbinding van de smallere piek, waarbij 2 amu in molgewicht wordt gewonnen. Deze OH-groep is omgezet in een O-TMS-groep tijdens de derivisatie-procedure, waarbij 72 atomaire massa-eenheden extra wordt gewonnen. Derhalve is het waarschijnlijk, dat de GC-pieken bij 20 min. 56 sec. en 21 min. 6 sec. twee verbindingen weergeven, waarbij de ene de gereduceerde vorm van de andere is.
Claims (11)
1. Immunogeen complex, in het bijzonder een iscom, opgebouwd uit ten minste een sterol, een saponine, en in het geval van een iscom eveneens een fosfolipide, gekenmerkt doordat het saponine tenminste een of meer door middel van hydrofobe interaktie-chromatografie van Quil A afgeleide frakties met de aanduidingen QA 1 t/m 23 is, zoals weergegeven in Fig.l met de cijfers 1 t/m 23.
2. Immunogeen complex, in het bijzonder een iscom volgens conclusie 1, gekenmerkt doordat het saponine tenminste een of meer van Quil A afgeleide frakties met de aanduidingen QA 1 t/m 20 en 23 is.
3. Immunogeen complex, in het bijzonder een iscom volgens conclusie 2, gekenmerkt doordat het saponine tenminste een of meer van Quil A afgeleide frakties met de aanduidingen QA 1, 3. 5. 6, 9, 12, 13. 14, 18, 20 en 23 is.
4. Immunogeen complex, in het bijzonder een iscom volgens conclusie 3. gekenmerkt doordat het saponine tenminste een of meer van Quil A afgeleide frakties met de aanduidingen QA 3. 17, 18, 20 en 23 is.
5. Immunogeen complex, in het bijzonder een iscom volgens conclusie 4, gekenmerkt doordat het saponine tenminste de van Quil A afgeleide fraktie met de aanduiding QA 3 en/of QA 23 is.
6. Immunogeen complex, in het bijzonder een iscom volgens een of meer der conclusies 1-5, gekenmerkt doordat het immunogene complex tevens tenminste een antigeen eiwit of peptide met een al dan niet kunstmatig aangebracht hydrofoob gedeelte bevat.
7. Immunogeen complex, in het bijzonder een iscom volgens conclusie 6, gekenmerkt doordat het antigeen eiwit of peptide, membraan-eiwitten of membraanpeptiden zijn, welke uit virussen, bacteriën, mycoplasma's, parasieten of diercellen zijn geïsoleerd dan wel gesynthetiseerde peptiden.
8. Werkwijze voor het bereiden van QA-frakties uit Quil A, geschikt voor gebruik bij de bereiding van een immunogeen complex, in het bijzonder een iscom volgens een of meer der conclusies 1-7, met het kenmerk, dat men - Quil A oplost in water; - het Quil A in de verkregen oplossing in een semi-preparatieve hydrofobe interaktiekolom scheidt met als mobiele fase een aceto-nitril/water-oplossing, gebufferd op een pH van 6; en - de gescheiden frakties wint.
9. Quil A-fraktie met de aanduiding QA 3» welke een via FAB/MS bepaald MH+-gewicht van 1887 bezit.
10. Vaccin, ten minste omvattende een immunogeen complex, in het bijzonder een iscom volgens conclusie 6 of 7·
11. Kit, ten minste omvattende enerzijds een immunogeen complex, in het bijzonder een iscom volgens een of meer der conclusies 1-5 en anderzijds een of meer antigene eiwitten of peptiden met een al dan niet kunstmatig aangebracht hydrofoob gedeelte.
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9002314A NL9002314A (nl) | 1990-10-23 | 1990-10-23 | Immunogene complexen, in het bijzonder iscoms. |
| EP91918619A EP0555276B1 (en) | 1990-10-23 | 1991-10-23 | Immunogenic complexes, in particular iscoms |
| PCT/NL1991/000211 WO1992006710A1 (en) | 1990-10-23 | 1991-10-23 | Immunogenic complexes, in particular iscoms |
| DE69112634T DE69112634T2 (de) | 1990-10-23 | 1991-10-23 | Immunogene komplexe, insbesondere iscoms. |
| ES91918619T ES2075964T3 (es) | 1990-10-23 | 1991-10-23 | Complejos inmunogenos, en particular iscomes. |
| AT91918619T ATE127024T1 (de) | 1990-10-23 | 1991-10-23 | Immunogene komplexe, insbesondere iscoms. |
| DK91918619.7T DK0555276T3 (da) | 1990-10-23 | 1991-10-23 | Immunogene komplekser, især iscomer |
| CA002094600A CA2094600C (en) | 1990-10-23 | 1991-10-23 | Immunogenic complexes, in particular iscoms |
| US08/039,294 US5620690A (en) | 1990-10-23 | 1991-10-23 | Immunogenic complexes |
| GR950402880T GR3017778T3 (en) | 1990-10-23 | 1995-10-18 | Immunogenic complexes, in particular iscoms. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9002314A NL9002314A (nl) | 1990-10-23 | 1990-10-23 | Immunogene complexen, in het bijzonder iscoms. |
| NL9002314 | 1990-10-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9002314A true NL9002314A (nl) | 1992-05-18 |
Family
ID=19857870
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9002314A NL9002314A (nl) | 1990-10-23 | 1990-10-23 | Immunogene complexen, in het bijzonder iscoms. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5620690A (nl) |
| EP (1) | EP0555276B1 (nl) |
| AT (1) | ATE127024T1 (nl) |
| CA (1) | CA2094600C (nl) |
| DE (1) | DE69112634T2 (nl) |
| DK (1) | DK0555276T3 (nl) |
| ES (1) | ES2075964T3 (nl) |
| GR (1) | GR3017778T3 (nl) |
| NL (1) | NL9002314A (nl) |
| WO (1) | WO1992006710A1 (nl) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994010291A1 (en) * | 1992-10-30 | 1994-05-11 | Seed Capital Investment (Sci) B.V. | CULTURE CELLS OF $i(QUILLAJA SP.) |
| NL9301690A (nl) * | 1993-08-12 | 1995-04-18 | Seed Capital Investments | Verbindingen met adjuvans-activiteit. |
| AU1077795A (en) * | 1993-09-30 | 1995-04-18 | Seed Capital Investments (Sci) B.V. | Compounds with adjuvant activity |
| AUPM500494A0 (en) * | 1994-04-12 | 1994-05-05 | Minister For Agriculture & Rural Affairs For The State Of New South Wales, The | Composition for use in increasing mucosal immunity |
| AUPM873294A0 (en) * | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
| UA56132C2 (uk) * | 1995-04-25 | 2003-05-15 | Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. | Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини |
| GB9620795D0 (en) * | 1996-10-05 | 1996-11-20 | Smithkline Beecham Plc | Vaccines |
| SE9600648D0 (sv) * | 1996-02-21 | 1996-02-21 | Bror Morein | Receptorbimdande enhet |
| AUPO517897A0 (en) * | 1997-02-19 | 1997-04-11 | Csl Limited | Chelating immunostimulating complexes |
| ES2327693T3 (es) * | 1997-08-29 | 2009-11-02 | Antigenics Inc. | Composiciones que comprenden el adyvante qs-21 y polisorbato o ciclodextrina excipiente. |
| GB9817052D0 (en) | 1998-08-05 | 1998-09-30 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| DE60229118D1 (de) | 2001-04-04 | 2008-11-13 | Nordic Vaccine Technology As | Polynukleotide-bindende komplexe die sterolen und saponine enthalten |
| US7713942B2 (en) | 2001-04-04 | 2010-05-11 | Nordic Vaccine Technology A/S | Cage-like microparticle complexes comprising sterols and saponins for delivery of polynucleotides |
| SE0202110D0 (sv) * | 2002-07-05 | 2002-07-05 | Isconova Ab | Iscom preparation and use thereof |
| DK1545605T3 (da) * | 2002-10-02 | 2010-04-12 | Nordic Vaccine As | Komposition til vaccination |
| SE0300795D0 (sv) | 2003-03-24 | 2003-03-24 | Isconova Ab | Composition comprising iscom particles and live micro-organisms |
| SE0301998D0 (sv) * | 2003-07-07 | 2003-07-07 | Isconova Ab | Quil A fraction with low toxicity and use thereof |
| WO2006078213A1 (en) * | 2005-01-20 | 2006-07-27 | Isconova Ab | Vaccine composition comprisinga fibronectin binding protein or a fibronectin binding peptide |
| JP4957547B2 (ja) * | 2005-04-14 | 2012-06-20 | パナソニック株式会社 | ヘモグロビン誘導体の測定方法、それに用いる試薬組成物、測定キット、分析デバイス、及び分析システム |
| KR20110117654A (ko) | 2009-01-13 | 2011-10-27 | 트랜스진 에스.에이. | 면역 자극에 있어서의 사카로미세스 세레비지아에 미토콘드리아 핵산 분획물의 용도 |
| US10047116B2 (en) * | 2011-10-03 | 2018-08-14 | Mx Adjuvac Ab | Nanoparticles, process for preparation and use thereof as carrier for amphipatic and hydrophobic molecules in fields of medicine including cancer treatment and food related compounds |
| IL303336A (en) | 2015-09-03 | 2023-08-01 | Novavax Inc | Immune compositions with improved stability and immunogenicity |
| JP7317796B2 (ja) | 2017-07-24 | 2023-07-31 | ノババックス，インコーポレイテッド | 呼吸器疾患を治療するための方法および組成物 |
| WO2019183063A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Novavax, Inc. | Multivalent influenza nanoparticle vaccines |
| US10953089B1 (en) | 2020-01-27 | 2021-03-23 | Novavax, Inc. | Coronavirus vaccine formulations |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8205892D0 (sv) * | 1982-10-18 | 1982-10-18 | Bror Morein | Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin |
| SE8405493D0 (sv) * | 1984-11-01 | 1984-11-01 | Bror Morein | Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel |
| ATE71303T1 (de) * | 1986-01-14 | 1992-01-15 | Nederlanden Staat | Verfahren zur herstellung immunologischer komplexe und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzung. |
| US5057540A (en) * | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| CA1331443C (en) * | 1987-05-29 | 1994-08-16 | Charlotte A. Kensil | Saponin adjuvant |
| NZ230747A (en) * | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
| US4981684A (en) * | 1989-10-24 | 1991-01-01 | Coopers Animal Health Limited | Formation of adjuvant complexes |
| US5273965A (en) * | 1992-07-02 | 1993-12-28 | Cambridge Biotech Corporation | Methods for enhancing drug delivery with modified saponins |
-
1990
- 1990-10-23 NL NL9002314A patent/NL9002314A/nl not_active Application Discontinuation
-
1991
- 1991-10-23 US US08/039,294 patent/US5620690A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-23 ES ES91918619T patent/ES2075964T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-23 WO PCT/NL1991/000211 patent/WO1992006710A1/en active IP Right Grant
- 1991-10-23 AT AT91918619T patent/ATE127024T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-23 DK DK91918619.7T patent/DK0555276T3/da active
- 1991-10-23 CA CA002094600A patent/CA2094600C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-23 DE DE69112634T patent/DE69112634T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-23 EP EP91918619A patent/EP0555276B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-18 GR GR950402880T patent/GR3017778T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0555276A1 (en) | 1993-08-18 |
| DE69112634D1 (de) | 1995-10-05 |
| CA2094600A1 (en) | 1992-04-24 |
| WO1992006710A1 (en) | 1992-04-30 |
| ATE127024T1 (de) | 1995-09-15 |
| US5620690A (en) | 1997-04-15 |
| DK0555276T3 (da) | 1995-09-18 |
| DE69112634T2 (de) | 1996-02-08 |
| EP0555276B1 (en) | 1995-08-30 |
| CA2094600C (en) | 1998-12-08 |
| ES2075964T3 (es) | 1995-10-16 |
| GR3017778T3 (en) | 1996-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL9002314A (nl) | Immunogene complexen, in het bijzonder iscoms. | |
| CA1338888C (en) | Matrix with immunomodulating activity | |
| FI80600B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av immunogent protein- eller peptidkomplex. | |
| JP2703528B2 (ja) | 免疫原性複合体を含有するワクチン | |
| CA1275246C (en) | Process for preparing immunogenic complex | |
| EP0606317B1 (en) | Saponin-antigen conjugates and the use thereof | |
| JP2761809B2 (ja) | クイラヤ サポニンアジュバントおよびこれを含むワクチン製剤 | |
| CA2647060C (en) | Synthetic archaeal glycolipid adjuvants | |
| Rönnberg et al. | Effects of carbohydrate modification of Quillaja saponaria Molina QH-B fraction on adjuvant activity, cholesterol-binding capacity and toxicity | |
| CA2954740C (en) | Sulfated-glycolipids as adjuvants for vaccines | |
| Mizushiri et al. | Chemical characterization of lipopolysaccharides from Proteus strains used in Weil-Felix test | |
| EP0952771B1 (en) | Novel saponin compositions and uses thereof | |
| JPS5857321A (ja) | 抗癌剤 | |
| Bergers et al. | Reconstituted membranes of tumour cells (proteoliposomes) induce specific protection to murine lymphoma cells | |
| FI86597B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av immunkomplex. | |
| Tebogo | Separation and characterization of saponins from the bark extract of the South American soap bark tree; Quillaja saponaria Molina:(potential immuno-adjuvant active compounds) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |