MXPA01001694A - Terapeutica para barrera hemoencefalica. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a conjugados de farmaco-oligomero anfifilicos capaces de atravesar la barrera hemoencefalica y a metodos para hacer y utilizar dichos conjugados; los conjugados de farmaco-oligomero anfifilicos comprenden un compuesto terapeutico conjugado con un oligomero, caracterizado porque el oligomero comprende una porcion lipofilica acoplada a una porcion hidrofilica; los conjugados de la invencion comprenden ademas agentes terapeuticos como proteinas, peptidos, nucleosidos, nucleotidos, agentes antivirales, agentes antineoplasticos, antibioticos, etc, y profarmacos, precursores, derivados y sus intermediarios, quimicamente acoplados a oligomeros anfifilicos.

Description

TERAPÉUTICA PARA BARRERA HEMOENCEFALICA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a conjugados de oligómeros anfifílicos capaces de atravesar la barrera hemoencefálica ("BBB"), y a métodos para obtener y usar dichos conjugados. Los conjugados de la invención comprenden agentes terapéuticos tales como proteínas, péptidos, nucleósidos, nucleótidos, agentes antivirales, agentes antineoplásicos, antibióticos, etc., y profármacos, precursores, derivados e intermediarios de los mismos, acoplados químicamente a oligómeros anfifílicos.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA En el campo de la invención farmacéutica y terapéutica y el tratamiento de estados de enfermedad y mejora de condiciones fisiológicas asociadas con el SNC, se ha desarrollado una amplia variedad de agentes terapéuticos, incluyendo proteínas, péptidos, nucleósidos, nucleótidos, agentes antivirales, agentes antineoplásicos, antibióticos, etc., y profármacos, precursores, derivados e intermediarios de los mismos.

Además, los muchos péptidos neuroactivos conocidos ofrecen posibilidades adicionales para agentes terapéuticos útiles. Dichos péptidos neuroactivos desempeñan funciones bioquímicas importantes en el SNC, por ejemplo, como neurotransmísores y/o neuromoduiadores. El suministro de esta gama diversa de péptidos al SNC, provee muchas oportunidades para beneficio terapéutico. Por ejemplo, el suministro de péptidos opioides endógenos y sintéticos tales como las encefalinas, se puede usar para efectuar analgesia. Sin embargo, numerosos obstáculos limitan actualmente el uso de muchos compuestos para su uso como agentes terapéuticos del SNC. En primer término, el cerebro está equipado con un sistema de barrera. El sistema de barrera del cerebro tiene dos componentes principales: el plexo coroide y la barrera hemoencefálica (BBB). El plexo coroide separa al fluido cerebroespinal (CSF) de la sangre, y la BBB separa al CSF del cerebro de la sangre. La BBB tiene aproximadamente 1000 veces más área de superficie que el plexo coroide, y es el obstáculo primario para el suministro de compuestos terapéuticos al SNC. La BBB funciona como una división selectiva, regulando el intercambio de sustancias, incluyendo péptidos, entre el SNC y la circulación periférica. La estructura primaria de la BBB es la pared endotelial capilar del cerebro. Las uniones estrechas de las células endoteliales capilares del cerebro evitan que los compuestos circulantes lleguen al SCF del cerebro mediante la vía paracelular. Además, trabajos recientes sugieren la existencia de una barrera fisiológica al nivel de la lámina basal, además de la barrera provista por las uniones estrechas (véase Kroll et al., Neurosurgery, Vol. 42, No. 5, pl. 1083 (Mayo de 1998)). Otras características únicas de la BBB incluyen la falta de fenestraciones intracelulares y vesículas pinocíticas y una carga negativa neta sobre la superficie luminal del endotelio. Los mecanismos mediante los cuales las sustancias pueden atravesar la BBB se pueden dividir generalmente en mecanismos de transporte activos y pasivos. Las moléculas lipofílicas atraviesan fácilmente la BBB mediante transporte pasivo o difusión a través de las membranas plasmáticas endoteliales. En contraste, moléculas hidrofílicas tales como los péptidos, requieren típicamente un sistema de transporte activo para poder atravesar la BBB. Ciertos péptidos más grandes tales como la insulina, tienen receptores sobre la superficie luminal de los capilares del cerebro que funcionan como sistemas de transcitosis activos. La difusión de muchos compuestos terapéuticos tales como los péptidos a través de la BBB, es también inhibida por el tamaño. Por ejemplo, la ciclosporina, la cual tiene un peso molecular de -1200 Daltons (Da), es transportada a través de la BBB a una velocidad mucho menor de lo que su solubilidad en lípidos pronosticaría. Dicha divergencia entre la solubilidad en lípídos y las velocidades de permeación de la BBB, se debe probablemente a obstáculos esféricos, y es común en donde el peso molecular de un compuesto excede los 800-1000 Da.

Una barrera más para el suministro de péptidos hacia el SNC, es la inestabilidad metabólica. En particular, antes de que los péptidos inyectados en la sangre lleguen al SNC, deben sobrevivir al contacto con las enzimas degradadoras de enzimas en la sangre y en el endotelio capilar del cerebro. Las enzimas de la BBB son conocidas por degradar la mayoría de los neuropéptidos que ocurren naturalmente. Los péptidos administrados oralmente enfrentan barreras adicionales descritas más adelante. Los péptidos metabólicamente estabilizados pueden exhibir resistencia incrementada a ciertas enzimas; sin embargo, no ha sido posible proteger a los péptidos de la amplía gama de enzimas degradadoras de péptidos presentes en la sangre y la BBB. Otra dificultad inherente en el suministro de péptidos hacia la BBB, es que la transcitosis exitosa es un proceso complejo que requiere unión en el lado luminal o de la sangre del endotelio capilar del cerebro, movimiento a través del citoplasma endotelial, y exocitosis en el lado abluminal o del cerebro de la BBB. Los péptidos pueden unirse a la membrana luminal del endotelio capilar del cerebro, o sufrir unión y endocitosis en el compartimento endotelial intracelular sin ser transportados en el SNC. En cualquier caso, muchas sustancias de fármaco actualmente existentes, especialmente péptidos, son incapaces de superar estas barreras estructurales y metabólicas para entrar a la BBB en cantidades suficientes para que sean eficaces. Existe por lo tanto la necesidad de composiciones farmacéuticas que puedan (1 ) soportar las enzimas degradadoras en la corriente sanguínea y en la BBB, y (2) que puedan penetrar a través de la BBB en cantidades suficientes y a velocidades suficientes para que sean eficaces. Se han hecho muchos intentos en la técnica por suministrar compuestos terapéuticos tales como péptidos, hacia el SNC con niveles de éxito variables. Dichos intentos se pueden agrupar generalmente en dos categorías: invasivas y farmacológicas. Las estrategias de suministro invasivas incluyen, por ejemplo, procedimientos mecánicos tales como implantación de un catéter intraventícular, seguido de infusión farmacéutica en el compartimento ventricular. Además de consideraciones generales respecto al carácter invasivo de los procedimientos mecánicos, una dificultad importante con los procedimientos mecánicos es la falta de distribución del péptido. Por ejemplo, la inyección de péptidos en el compartimento del SNC da como resultado una distribución muy pobre más allá de la superficie del cerebro. Esta falta de distribución se debe en parte a la salida rápida de péptidos hacia la circulación periférica. Otra estrategia invasiva para el suministro de compuestos terapéuticos hacia el SNC, es la infusión intracarótida de sustancias osmóticamente activas altamente concentradas tales como manitol o arabinosa. Su alta concentración local causa contracciones de las células endoteliales capilares del cerebro, dando como resultado una apertura transitoria de las uniones estrechas que permite que las moléculas atraviesen la BBB. Dichos procedimientos tienen efectos tóxicos considerables, incluyendo inflamación, encefalitis, etc. Además, dichos procedimientos no son selectivos: la apertura de las uniones estrechas de la BBB permite que muchas sustancias indeseables crucen la BBB junto con la molécula terapéuticamente benéfica. Para una revisión reciente de la apertura osmótica y otros medios invasivos para atravesar la BBB, véase Kroll, Robert A. Neurosurgery, Vol. 42, No. 5, Mayo de 1998. Aunque los riesgos implícitos en estos procedimientos invasivos pueden ser justificados por condiciones que ponen en riesgo la vida, son generalmente no aceptables para enfermedades menos dramáticas. Existe por lo tanto la necesidad de medios no invasivos, no mecánicos y más seguros para permitan que compuestos terapéuticos crucen la BBB. Como se indicó anteriormente, las sustancias lipofílicas pueden difundirse por lo general libremente a través de la BBB. Por consiguiente, una estrategia farmacológica común para permitir que los péptidos atraviesen la BBB, es modificar químicamente el péptido de interés para hacerlo liposoluble. Se han derivado sustancias de fármaco hidrofílicas con ácidos grasos de cadena corta o de cadena larga para formar profármacos con carácter lipofílico incrementado. Los profármacos son moléculas biológicamente inertes que requieren uno o más pasos metabólicos para convertirlos en una forma activa. Una dificultad que entraña el procedimiento con profármacos para cruzar la BBB, es que el desdoblamiento necesario para producir un fármaco activo puede no ocurrir con precisión y eficiencia suficientes para producir una cantidad eficaz del fármaco. Existe por lo tanto la necesidad de compuestos terapéuticos estables modificados tales como péptldos, los cuales sean capaces de atravesar la BBB, pero los cuales retengan toda o parte de su eficacia sin requerir pasos metabólicos para convertirlos en una forma activa. Una dificultad más con los profármacos lipidizados, es que entran y salen del SNC tan fácilmente que pueden nunca alcanzar una concentración suficiente en el SNC para lograr su función deseada. Por ejemplo, se han hecho intentos previos por diseñar conjugados de encefalina que puedan atravesar la BBB (véase Partridge, W. M., "Blood-Braín Barrier Transport and Peptide Delivery to the Brain", Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, p. 277 (1995). Sin embargo, estas estrategias requirieron el suministro subcutáneo de dosis frecuentes y masivas de péptidos para inducir analgesia. La dosificación frecuente y/o masiva es inconveniente para el paciente, y puede dar como resultado efectos secundarios serios. Existe por lo tanto la necesidad en la técnica de medios que permitan que agentes terapéuticos tales como péptidos crucen la BBB en forma controlada, lo cual permita la acumulación de cantidades suficientes del agente terapéutico en el cerebro para inducir el efecto terapéutico deseado. Otro método farmacológico útil para suministrar péptidos a través de la BBB, es acoplar covalentemente el péptido de interés a un péptido para el cual existe un sistema de transcitosis específica mediada por receptores. Por ejemplo, teóricamente es posible unir la ß-endorfina, la cual no es normalmente transportada a través de la BBB, a la insulina para ser transportada a través de la BBB mediante transcitosis mediada por receptores de insulina. Después de entrar en el espacio intersticial del cerebro, el péptido activo (ß-endorfina) es liberado entonces del vector de transporte (insulina) para interactuar con su propio receptor. Sin embargo, la dificultad con este sistema es diseñar una molécula quimérica que pueda ser separada después de entrar en el espacio intersticial; para el conocimiento del inventor, esto aún no se ha logrado. Además, la estequiometría pobre del neuropéptido para la molécula vehículo limita la masa del péptido objetivo. Además, los sistemas de transporte celular mediados por receptores tienen típicamente capacidad de transporte fisiológicamente limitada. Este es un factor limitativo de velocidad que puede evitar la entrada de cantidades del péptido farmacéuticamente activo. Existe por lo tanto la necesidad en la técnica de medios que permitan que sustancias terapéuticas tales como péptidos, crucen la BBB mediante difusión para evitar las limitaciones inherentes en el transporte mediado por receptores. Otras estrategias farmacológicas incluyen el uso de un fragmento activo de un péptido nativo; modificación de un péptido nativo para incrementar la actividad de transporte de la barrera homoencefálíca (BBB); y suministro de un gen que codifique para el neuropéptido hacia el cerebro.

La administración oral es una vía de administración deseable y conveniente; sin embargo, los péptidos suministrados oralmente deben superar una serie de barreras antes de que puedan entrar a la corriente sanguínea. Dichos péptidos deben sobrevivir a la proteolisis y el medio ambiente ácido del estómago, enzimas gástricas y pancreáticas, y exo- y endo- peptidasas en la membrana del borde en cepillo intestinal. Existe por lo tanto la necesidad de péptidos administrados oralmente que puedan resistir también a las enzimas proteolíticas en la sangre y la BBB, y que puedan atravesar la BBB en cantidades suficientes para proveer distribución amplia de fármacos en el parénquima cerebral completo. Metionina-encefalina y leucina-encefalina, son pentapéptidos analgésicos que ocurren naturalmente. Estos péptidos y sus análogos son conocidos por actuar como neurotransmisores o moduladores en la transmisión del dolor. Sus propiedades analgésicas son de corta duración. Cuando se administra mediante inyección intracerebroventricular, la duración de su acción es también transitoria. Estas propiedades hacen que las encefalinas sean compuestos atractivos para su uso como agentes terapéuticos, para mediar la analgesia y proveer una alternativa viable a la morfina. Sin embargo, para suministrar encefalinas a través de la BBB, deben ser protegidas contra la degradación rápida por aminopeptídasas y encefalinasas. Además, puesto que las encefalinas son péptidos hidrofílicos, deben ser modificadas para proveerlas con características lipofílicas modificadas incrementadas antes de que puedan difundirse pasivamente a través de la BBB en el SNC. Las propiedades terapéuticas atractivas de las encefalinas han sido conocidas por algún tiempo, y muchos investigadores han intentado mejorar la capacidad de las encefalinas para atravesar la BBB. Schroder et al., Proc. Int. Symp. Control Reí. Biact. Material, Vol. 23, p. 611 (1996), enseñan que Dalargin, un análogo de leu-encefalina, puede ser incorporado en nanopartículas formadas mediante polimerización de butilanoacrilato. Las partículas son revestidas con polisorbato, un mejorador de penetración. Se obtiene actividad analgésica después de administración intravenosa. Sin embargo, a diferencia de la presente invención, el péptido de Schroder debe ser unido químicamente al material polimérico o al polisorbato. La formulación es por lo tanto una mezcla física de fármaco activo y material polimérico. Tsuzuki eí al., Biochem. Pharm. Vol. 41 , p. R5 (1991 ), enseñan que se pueden derivar análogos de leu-encefalina con una porción de adamantano para obtener encefalina lipofílica que muestra un efecto antinociceptivo después de administración subcutánea. La modificación en el N-terminal suprime la actividad, mientras que el derivado en el C-terminal a través de enlaces éster, retiene su actividad. Se postula que la actividad se obtiene después de desdoblamiento de la porción de adamantano. El derivado es por lo tanto un profármaco, un concepto no consistente con los aspectos de la presente invención, en donde el conjugado terapéutico retiene la actividad del péptido nativo. Prokai-Tatra, J. M. Chem, Vol. 39, p. 4777 (1996), enseñan que se puede modificar un análogo de leucina-encefalina con un sistema de 5 suministro químico el cual está basado en un diseño de fármaco retrometabólico. El análogo de encefalina se deriva con una porción de dihidropiridina en el N-terminal y una porción lipofílica en el C-termínal. Después de administración intravenosa del conjugado, se observa respuesta analgésica. Se postula que la modificación lipofílica en el C-terminal permite la f 10 penetración en el SNC, mientras que la porción de dihidropiridina sufre transformación oxidativa para generar una porción cargada que restringe el flujo de los péptidos en el sistema circulatorio. El desdoblamiento del péptido a partir de esa porción restaura la actividad analgésica observada. El péptido derivado es inactivo, y recupera su actividad sólo después de transformación 15 metabólica. El producto es por lo tanto un profármaco puro, que requiere transformación metabólica para transformarlo en una forma activa. «k La patente de E.U.A. 4,933,324 a Shashoua, enseña que ciertos ácidos grasos naturales pueden ser conjugados con fármacos neuroactivos. Se prefiere particularmente un ácido graso altamente ¡nsaturado de longitud 20 de cadena de veintidós (22) átomos de carbono. La administración del conjugado muestra absorción en el cerebro. Como es el caso con la conjugación de adamantano, este procedimiento requiere transformación metabólica del conjugado de profármaco-encefalina para restaurar la actividad del péptido de encefalina. Existe por lo tanto una necesidad apremiante en la técnica por composiciones terapéuticas/de diagnóstico farmacéuticamente aceptables y efectivas capaces de atravesar la BBB sin pérdida sustancial o disminución de su carácter terapéutico o de diagnóstico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere ampliamente a conjugados de oligómero-fármaco terapéuticos y/o de diagnóstico, en donde una molécula de fármaco se une covalentemente a un oligómero para formar un conjugado anfifílico. En un aspecto, el oligómero comprende por lo menos una porción lipofílica y por lo menos una porción hidrofílica, y el tamaño y la naturaleza de las porciones anfifílíca y lipofílica se seleccionan de esta manera para impartir una naturaleza anfifílíca al conjugado resultante. La presente invención se refiere generalmente a conjugados de fármaco-oligómero anfifílíco capaces de atravesar la BBB, y a métodos para obtener y usar dichos conjugados. En un aspecto, la terapéutica son fármacos neuroactivos, proteínas, péptidos y especialmente análogos de encefalina. Los conjugados son estables en el ambiente de la corriente sanguínea, y resisten la degradación por las enzimas de la BBB y en el SNC. Además, los conjugados atraviesan fácilmente la BBB. En un aspecto, los conjugados de fármaco-oligómero producen su efecto farmacológico deseado sin sufrir desdoblamiento metabólico del oligómero. En otro aspecto, las porciones lipofílica e hidrofílica se unen mediante un enlace lábil hidrolizable. Cuando el enlace es hidrolizado en el SNC, la porción hidrofílica permanece unida al fármaco. Los oligómeros anfifílicos están formados de porciones lipofílicas e hidrofílicas. Las porciones lipofílicas son de preferencia ácidos grasos naturales o cadenas de alquilo. De preferencia, la porción de ácido graso es una molécula de cadena recta que tiene átomos de carbono (saturados o insaturados) y varía adecuadamente de cuatro (4) a veintiséis (26) átomos de carbono. Más preferiblemente, el ácido graso tiene de catorce (14) a veintidós (22) átomos de carbono. Las porciones hidrofílícas son de preferencia segmentos pequeños de polietilenglícol (PEG) que tienen de preferencia de 1 a 7 unidades de PEG, y más preferiblemente de 1 a 5 unidades de PEG. La longitud y composición de las porciones lipofílicas y porciones hidrofílicas se puede ajustar para obtener el carácter anfifílico deseado. En otro aspecto, una porción de colesterol o adamantano es sustituida por una porción de ácido graso de cadena recta de los oligómeros. Ejemplos de oligómeros preferidos son los siguientes: CH3(CH2)n(OC2H4)mOH (fórmula 1 ); en donde n=3 a 25 y m=1 a 7; CH3(CH2)n(OC2H4)mOCH2C?2H (fórmula 2); en donde n=3 a 25 y m=1 a 6; CH3(CH2)nCX(OC2H4)mOH (fórmula 3); en donde n=3 a 25, y m=1 a 7 y X=O; R-(OC2H4)mCH2C02H (fórmula 4); en donde m=0 a 5 y R=colesterol o adamantano; o R-OCO(C2H40)mCH2C02H (fórmula 5); en donde m=0 a 5; CH3(CH^-CH=CH)6(CH2)2CH2(OC2H4)mOH (fórmula 6); en donde m=0 a 7; CH3(CH^-CH=CH)6(CH2)2CX(OC2H4)mOH (fórmula 7); en donde m=1 a 7 y X=N u O. Otras porciones de ácido graso insaturado que se pueden usar de conformidad con la presente invención incluyen oleico, linoleico y lilonéníco. Por ejemplo, en un aspecto, las porciones lipofílicas e hidrofílicas se unen mediante enlaces hidrolizables. Se prefiere proveer enlaces hídrolizables entre el ácido graso y las porciones hidrofílicas. Esto permite que la hidrólisis ocurra después de la penetración en el SNC, liberando de esta manera los péptidos activos con el grupo hidrofílico aún unido al péptído.

Como resultado, el péptido adquiere un carácter más hidrofílico, y se evita de esta manera el flujo hacia el sistema circulatorio. Ejemplos de conjugados que tienen enlaces no hídrolizables son los siguientes: DHA MET-ENCEFALINA-LYS r-yvl— Tyr— Gly— Gly— Phe-Met— Lys— COOH HN^C(0)C :2H4 X 2H4-N-C(0XCH2)^H ;H ;H2-CH=CH-CH2-Cl LINOLEICO MET-ENCEFALINA-LYS H2N— Tyr— Gly— Gly— Phe-Met— Lys— COOH HN-C(0)-OC2H4-OC2H4- (CH2)15-CH3 CETIL MET-ENCEFALINA-LYS En un aspecto, los grupos lipofílicos e hidrofílicos se unen mediante enlaces hidrolizables. Por ejemplo: H2N— Tyr— Gly— Gly— Phe-Met — Lys— C OOH HN C(0)-C H2-(C2H40)2-C H2-C (0)- COLESTEROL MET-ENCEFALINA-LYS H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Lys-COOH HN-C(0)-0-(C2H40)3-C(0)-CH2)14-CH3 PALMITATO-TEG MET-ENCEFALINA-LYS C(0)-0-(OC2H4)3-C(0)-(CH2)14-CH3 HN-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Lys-COOH HN-C(0)-0-(OC2H4)3-C(0)-(CH2)14-CH3 DI-PALMITATO-TEG MET-ENCEFALINA-LYS En un aspecto, el enlace covalente entre el oligómero y el fármaco es de preferencia amida (un grupo carboxi del oligómero se une a un grupo amina del fármaco peptídico) o carbamato (un grupo cloroformiato del oligómero se une al grupo amina del fármaco peptídico). En general, el grupo amina derivable del péptido es la amina del N-terminal o un residuo amino nucleófílo usualmente presente en el residuo amino épsilon de un residuo de lisina. En otro aspecto, se provee un enlace éster (un grupo carboxi del péptido se acopla covalentemente a un grupo hidroxilo del olígómero, o un grupo carboxi del oligómero se acopla covalentemente a un grupo hidroxilo del fármaco), amida (un grupo carboxi del oligómero se une a un grupo amina del fármaco) o carbamato (un grupo cloroformiato del oligómero se une a un grupo amina del fármaco) para fármacos no peptídicos. Para los análogos de encefalina, los péptidos preferidos son leu-encefalina-lisína y met-encefalina-lisína. La cadena lateral amino de la lisina se utiliza de preferencia en la unión. El conjugado de fármaco-oligómero anfifílíco puede comprender oligómeros múltiples de diferentes composiciones. En un aspecto, las porciones de los conjugados de fármaco-oligómero anfifílico están configuradas de la manera siguiente: R—OCH2CH2OCH2C(O)OCH2CH2CH2OCH2CH2CH2NH— encefalina; o R—OCH2CH2OCH2C(O)OCH2CH2NH— encefalina. en donde colesterol o adamantano. En otro aspecto, las porciones de oligómero anfifílíco son porciones de azúcar acopladas a ácidos grasos naturales y segmentos de polietilenglicol. La porción de PEG sirve para incrementar el carácter anfifílíco del azúcar graso. Ejemplos de disposiciones que incluyen porciones de azúcar se proveen en las figuras 1A-1C. En otro aspecto, se usa PEG como grupo separador en el conjugado anfifílico, y la longitud y el número de las porciones de PEG se pueden hacer variar para refinar el carácter anfifílíco del conjugado. El aumento en el número de PEGs aumenta el carácter hidrofílico del conjugado.

En otro aspecto de la invención, se añade una prolina o alanina al N-terminal del péptido. En un aspecto preferido, se añade una prolína o alanina al N-terminal de un péptido de encefalina, y la porción de oligómero es acoplada al N-terminal del residuo de prolina o alanina. Después de la absorción en el sistema nervioso central, los esteres del azúcar graso son hidrolizados, dejando una porción hidrofílica. El flujo es impedido, y las aminopeptidasas del cerebro cortan la porción de prolina o alanina, permitiendo que el péptido recupere otra vez su actividad completa. La invención provee también una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fármaco-oligómero anfifílico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, se provee una composición farmacéutica que comprende (1) una mezcla de un conjugado de encefalina de conformidad con la presente invención, en donde el péptido de encefalina tiene una prolina o alanina añadida a su N-terminal, y un conjugado de encefalina de conformidad con la presente invención, el cual no tiene una prolina o alanina añadidas al N-terminal, y (2) un vehículo farmacéuticamente aceptable. Este aspecto provee una dosis sostenida de encefalina de acción más rápida. La invención provee también métodos para administrar un conjugado de la invención. La invención provee además pruebas, tanto in vitro como in vivo, para poner a prueba la eficacia de los conjugados de la invención.

. Otros objetivos y alcance adicional de la aplicación de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción dada a continuación. Debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indiquen modalidades preferidas de la invención, se dan únicamente a manera de ilustración, puesto que varios cambios y modificaciones serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.

Definiciones Como se usa en la presente, el término "lipofílico" significa la capacidad para disolverse en lípidos y/o la capacidad para penetrar, interactuar con y/o atravesar, membranas biológicas. Como se usa en la presente, el término "porción lipofílica" o "lipófila"-significa una porción que es lipofílica y/o la cual, cuando se une a otra entidad química, aumenta el carácter lipofílico de dicha entidad química, por ejemplo, ácido graso, colesterol. Como se usa en la presente, el término "hidrofílico" significa la capacidad para disolverse en agua. Como se usa en la presente, el término "porción hidrofílíca" o "hidrófila" se refiere a una porción la cual es hidrofílica y/o la cual, cuando se une a otra entidad química, aumenta el carácter hidrofílico de dicha entidad química, por ejemplo, azúcares, PEG.

Como se usa en la presente, el término "anfifílico" significa la capacidad para disolverse en agua y lípidos. Como se usa en la presente, el término "porción anfifílica" significa una porción que es anfifílica y/o la cual, cuando se une a un fármaco 5 peptídico o no peptídíco, aumenta el carácter anfifílico del conjugado resultante, por ejemplo, oligómero de PEG-ácido graso, oligómero de azúcar- ácido graso. Como se usa en la presente, el término "fármaco neuroactivo" se usa ampliamente para abarcar cualquier péptido u otro fármaco que tenga una • 10 actividad dentro del SNC, por ejemplo, encefalina, análogos de encefalina. Como se usa en la presente, se pretende que el término "péptido" sea construido ampliamente incluyendo los polipéptidos per se que tengan pesos moleculares de hasta aproximadamente 10,000, así como también proteínas que tengan pesos moleculares mayores de 15 aproximadamente 10,000. Como se usa en la presente, el término "acoplado covalentemente" significa que las porciones especificadas se unen • directamente en forma covalente a alguna otra, o también se unen indirectamente en forma covalente a alguna otra mediante una porción o 20 porciones participantes, tales como un puente, separador o porción o porciones de enlace. Como se usa en la presente, el término "fármaco" significa una sustancia destinada para su uso en el diagnóstico, caracterización, cura, mitigación, tratamiento, prevención o demora del inicio de una enfermedad, estado de enfermedad u otra condición fisiológica, o para mejorar el funcionamiento fisiológico normal en humanos y/o en animales no humanos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURAS 1A-1C: Fórmulas 8-10: oligómeros anfifílicos de la presente invención, en donde el oligómero lipofílico es un azúcar. En 1b y 1c, PEG se usa como grupo separador. En 1A-1C se añade un residuo de prolina en el N-terminal del péptido de encefalina. FIGURA 2: Compara la estabilidad del conjugado de cetil-PEG2-encefalina-lys (no hidrolizable) con la de encefalina no conjugada en homogeneizado de cerebro de rata. FIGURA 3: Compara la estabilidad del conjugado de cetil-PEG3-encefalina (no hidrolizable) con la de encefalina no conjugada en homogeneizado de cerebro de rata. FIGURA 4: Compara el conjugado de palmitato-PEG3-encefalina (hidrolizable) con encefalina no conjugada en homogeneizado de cerebro de rata. FIGURAS 5a-5d: Datos de CLAR que muestran la extracción del conjugado a partir de cerebro de rata homogeneizado.

FIGURA 6: Gráfica que demuestra la unión competitiva entre el conjugado de cetil-PEG2-encefalina y naloxona, un agonista del receptor opioíde µ. FIGURA 7: Comparación gráfica del efecto analgésico de cetil-PEG2-encefalina con clonídina (un sustituto de morfina). FIGURA 8: Cuadro que muestra los resultados de pruebas de unión a receptor para varios conjugados de conformidad con la presente invención. FIGURA 9: Ejemplo de esquema de síntesis para un oligómero de conformidad con la presente invención. FIGURA 10: Ejemplo de esquema de síntesis que muestra la unión de un oligómero a un péptido de encefalina de conformidad con la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para facilitar la descripción, y no a manera de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en la subsecciones siguientes. La presente invención se refiere generalmente a conjugados de fármaco-oligómero anfifílico capaces de atravesar la BBB, y a métodos para obtener y usar dichos conjugados. Los fármacos son de preferencia fármacos neuroactivos, proteínas, péptidos y especialmente análogos de encefalína. Los conjugados son estables en el medio ambiente de la corriente sanguínea, y resisten a la degradación por la BBB. Los conjugados atraviesan fácilmente la BBB. En un aspecto, los conjugados producen su efecto farmacológico deseado sin requerir desdoblamiento metabólico del oligómero. Cuando el • 5 desdoblamiento del oligómero ocurre, el fármaco retiene su actividad. Los oligómeros anfifílicos están formados de porciones lipofílicas e hidrofílicas. Las porciones lipofílícas son de preferencia cadenas de alquilo o ácidos grasos naturales. Las porciones lipofílicas son de preferencia segmentos pequeños de PEG, que tienen de 1 a 7 porciones de PEG, y de 10 preferencia tienen de 1 a 5 porciones de PEG. La longitud y composición de las porciones lipofílícas y las porciones hidrofílicas se pueden ajustar para obtener el carácter anfifílíco deseado. Por ejemplo, las cadenas de carbono de las porciones de alquilo o de ácido graso se pueden alargar para incrementar el carácter lipofílico, mientras que las porciones de PEG se pueden alargar 15 para incrementar el carácter hidrofílico. De preferencia, la porción de ácido graso es una molécula de cadena recta que tiene carbonos saturados e insaturados, y varía de cuatro • (4) a veintiséis (26) átomos de carbono. Más preferiblemente, el ácido graso tiene de catorce (14) a veintidós (22) átomos de carbono. 20 Una porción de colesterol o adamantano puede sustituir al ácido graso de cadena recta como la porción lipofílica de los oligómeros. Ejemplos de oligómeros preferidos son los siguientes: CH3(CH2)n(OC2H4)mOH (fórmula 1 ); en donde n=3 a 25 y m=1 a 7; CH3(CH2)n(OC2H4)mOCH2C02H (fórmula 2); en donde n=3 a 25 y m=1 a 6; CH3(CH2)nCO(OC2H4)mOH (fórmula 3); en donde n=3 a 25, y m=1 a 7; R-(OC2H4)mCH2C02H (fórmula 4); en donde m=0 a 5 y R=colesterol o adamantano; o R-OCO(C2H40)mCH2C02H (fórmula 5); en donde m=0 a 5; CH3(CH^-CH=CH)6(CH2)2CH2(OC2H4)mOH (fórmula 6); en donde m=0 a 7; CH3(CH;^H=CH)6(CH2)2CO(OC2H4)mOH (fórmula 7); en donde m=1 a 7. Otras porciones de ácido graso ¡nsaturado que se pueden usar de conformidad con la presente invención incluyen oleico, linoleico y lilonéníco. En ciertos casos, se prefiere proveer enlaces hidrolizables entre el polietílenglicol y las porciones de ácido graso. Esto permite que la hidrólisis ocurra después de la penetración en el sistema nervioso central, liberando de esta manera los péptidos activos con el grupo polietilenglicol unido aún al péptido. Los péptidos adquieren un carácter más hidrofílico, y se impide de esta manera el flujo hacia el sistema circulatorio.

El enlace covalente entre el oligómero y el fármaco es de preferencia amida (un grupo carboxi del oligómero se une a un grupo amina del péptído) o carbamato (un grupo cloroformiato del oligómero se une a un grupo amina del péptido). Para fármacos no peptídicos, el enlace es de preferencia éster (un grupo carboxi del péptido se acopla covalentemente a un grupo hidroxilo del oligómero, o un grupo carboxi del oligómero se acopla covalentemente a un grupo hidroxilo del fármaco), amida (un grupo carboxi del oligómero se une a un grupo amina del fármaco) o carbamato (un grupo cloroformiato del oligómero se une a un grupo amina del fármaco). Para análogos de encefalina, los péptidos preferidos son leu-encefalina lisína y met-encefalina lisina. El residuo amino de la lisina se utiliza de preferencia en la unión. Otras porciones anfifílicas preferidas son porciones de azúcar, acopladas a ácidos grasos naturales y segmentos de polietilenglicol. La porción de PEG sirve para incrementar el carácter anfifílico del azúcar graso. La longitud y el número de las porciones de PEG se pueden hacer variar para refinar el carácter anfífílico del conjugado. El incremento en el número de PEGs incrementa el carácter hidrofílíco del oligómero resultante. En ciertos casos, se prefiere modificar el N-terminal de una encefalina con prolina o alanina antes de su unión al oligómero. Después de la absorción en el sistema nervioso central, los esteres del azúcar graso son hidrolizados, dejando la porción hidrofílica. El flujo fácil es impedido, y las aminopeptídasas del cerebro desdoblan la porción de prolina o alanína, dejando que el péptido recupere otra vez su actividad total. Cuando la porción hídrofílica es un azúcar, se prefiere que el azúcar sea un monosacárido. El azúcar puede ser un amino azúcar o un no amino azúcar. En otro aspecto, el oligómero se une al C-terminal del fármaco peptídico. Por ejemplo: R—OCH2CH2OCH2C(0)OCH2CH2CH2OCH2CH2CH2NH— encefalina; o R— OCH2CH2OCH2C(0)OCH2CH2NH— encefalina. en donde R=alquilo .26, colesterol o adamantano. En otro aspecto, el olígómero se une al N-terminal del fármaco peptídico. Por ejemplo: O R— OCCH2OCH2CH2OCH2CH2CH2NH-Encefalina Será apreciado por los expertos en la técnica que los oligómeros pueden estar unidos en el carboxí terminal o en un constituyente de una cadena lateral de aminoácidos, tal como en el grupo amino de la lisina.

La presente invención se refiere ampliamente a conjugados terapéuticos y/o de diagnóstico, en donde la molécula terapéutica y/o de diagnóstico se une covalentemente a un oligómero para formar un conjugado anfifílico. En un aspecto, el oligómero comprende por lo menos una porción lipofílica y por lo menos una porción hidrofílica, y el tamaño y la naturaleza de las dos porciones se seleccionan para impartir una naturaleza anfifílíca al conjugado resultante. Ejemplos de olígómeros de conformidad con la presente invención son los siguientes: CH3(CH2CH=CH)6(CH2)2CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 7; CH3(CH2CH=CH)6(CH2)2CO(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 7; CH3(CH2CH=CH)6(CH2)2CONHCH2CH2(OCH2H4)mOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2CH=CH)6(CH2)3(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2CH=CH)6(CH2)2CO(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 7; CH3(CH2)7CH=CH)(CH2)7CO(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 7; CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CONHCH2CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO(OC2H4)mOCH2CH2OH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CO(OC2H4)mOH, 10 en donde m=1 a 7; CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CONHCH2CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CO(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; 15 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CH2(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7CH2(OC2H4)mOH. en donde m=1 a 7; CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7CO(OC2H4)mOH, 20 en donde m=1 a 7; CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7CONHCH2CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2CH=CH3(CH2)7CO(OC2H4)mOCH2COOH. en donde m=1 a 6; CH3(CH2CH=CH3(CH2)7CH2(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; Compuestos terapéuticos La invención comprende de esta manera varias composiciones para aplicación terapéutica (in vivo), en donde el componente peptídico del complejo de péptido conjugado es un péptído fisiológicamente activo o bioactivo. En dichas composiciones que contienen péptído, la conjugación del componente peptídico con el oligómero puede ser mediante enlace covalente directo o enlace indirecto (a través de grupos separadores apropiados), y las porciones hidrofílicas y lipofílícas pueden estar también dispuestas estructuralmente en el oligómero en cualquier forma adecuada que implique enlace covalente directo o indirecto, respecto a algún otro. Una amplia variedad de especies de péptido pueden ser acomodadas en la práctica amplia de la presente invención, según sea necesario o deseable en una aplicación terapéutica determinada para uso final. Aunque la descripción está dirigida principalmente e ilustrativamente hacia el uso de encefalina como un componente peptídico en varias composiciones y formulaciones de la invención, se apreciará que la utilidad de la invención no es limitada de esta manera, sino más bien se extiende a cualquier especie de péptido que sea capaz de conjugarse con los oligómeros descritos en la presente, o los cuales sean capaces de ser modificados, tal como por ejemplo mediante la incorporación de un residuo de prolina, para permitir que el péptido sea conjugado con los oligómeros descritos en la presente. Por consiguiente, péptidos apropiados incluyen, pero no están limitados a: hormona adrenocorticotrópica, adenosin desaminasa ribonucleasa, fosfatasa alcalina, angiotensina, anticuerpos, arginasa, arginina desaminasa, asparaginasa, caeruleína, calcitonina, quimotripsina, colecistocinina, factores de coagulación, dinorfinas, endorfinas, encefalinas, eritropoyetina, péptido liberador de gastrina, glucagon, hemoglobina, factores de liberación hipotalámicos, ¡nterferón, katacalcina, motilina, neuropéptido Y, neurotensina, opioides que no ocurren naturalmente, oxitocina, papaína, hormona paratiroidea, prolactina, CD-4 soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, superóxido dismutasa, hormona estimulante de la tiroides, activador de plasminógeno en tejidos, tripsina, vasopresina, y análogos de dichos péptidos, así como también otras enzimas solubles, hormonas, proteínas, polipéptidos, conjugados de enzima-proteína, conjugados de anticuerpo-hapteno, epítopes vírales, etc. En otro aspecto, los péptidos terapéuticos de los conjugados de fármaco-oligómero anfifílico son como se describen en la patente de E.U.A. 5,641 ,861 , incorporada en la presente como referencia, en tanto cualquiera de dichos péptídos contengan un residuo de lisína. Ejemplos de péptidos descritos en la presente ¡ncluyen: Ac-Phe-Arg-Trp-Trp-Tyr-Lys — NH2; Ac-Arg-Trp-lle-Gly-Trp-Lys — NH2; Trp-Pro-Lys-His-Xaa — NH2, en donde Xaa puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos que ocurren naturalmente, o Trp-Trp-Pro-Xaa — NH2, en donde Xaa es Lys o Arg; Tyr-Pro-Phe-Gly-Phe-Xaa — NH2, en donde Xaa puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos que ocurren naturalmente; (D)lle-(D)Met-(D)-Ser-(D)frp-(D)Trp-Glyn-Xaa— NH2, en donde Xaa es Gly o la forma D de un aminoácido que ocurre naturalmente y n es 0 ó 1 : los péptidos de esta fórmula pueden ser hexapéptidos cuando Gly está ausente (n es 0), y heptapéptidos cuando Gly está presente (n es 1); (D)lle-(D)Met-(D)Thr-(D)Trp-Gly-Xaa— NH2, en donde Xaa es Gly o la forma D de un aminoácido que ocurre naturalmente; Tyr-A1-B2-C3 — NH2, en donde A1 es (D)Nve o (D)NIe, B2 es Gly, Phe o Trp, y C3 es Trp o Nap; Pm y red {MexHyN-Tyr-(Nme)z-Tyr-Xaaz — NH2}, en donde x e y son independientemente 0, 1 ó 2, y z es 0 ó 1 , y en donde Xaa es PheD-Phe o NHBzl. En otro aspecto, los péptidos terapéuticos de los conjugados de fármaco-oligómero anfifílico, son como se describen en la patente de E.U.A. 5,602,099, incorporada en la presente como referencia, con la condición de que la conjugación sólo pueda ocurrir donde existe un carboxilo libre o N-terminal libre. Ejemplos de péptidos incluyen: H-Tyr-Tic-Phe-Phe-OH; H-Tyr-Tic-Phe-Phe-NH2; Tyr(NaMe)-Tic-Phe-Phe-OH; Tyr(NaCpm)-Tíc-Phe-Phe-OH; Tyr(NaHex)-Tic-Phe-Phe-OH; Tyr(NaEt2)-Tíc-Phe-Phe-OH; H-Dmt-Tic-Phe-Phe-OH; H-Dmt-Tic-Phe-Phe-NH2; H-Tyr(3-F)-Tic-Phe-Phe-OH; H-Tyr(3-CI)-Tic-Phe-Phe-OH; H-Tyr(3-Br)-Tic-Phe-Phe-OH; H-Dmt-Tic?[CH2— NH]Phe-Phe-OH; H-Dmt-Tic?[CH2— NH]Phe-Phe-NH2; H-Tyr-Tic?[CH2— NCH3]Phe-Phe-OH; H-Tyr-Tic-?[CH2— NH]Hfe-Phe-OH; Tyr(Nme)-Tic?[CH2— NH]Hfe-Phe-OH; H-Tyr-Tic-Phg-Phe-OH; H-Tyr-Tic-Trp-Phe-OH; H-Tyr-Tic-TRp-Phe-NH2; H-Tyr-Tic-His-Phe-OH; H-Tyr-Tic-2-Nal-Phe-OH; H-Tyr-Tic-Atc-Phe-OH; H-Tyr-Tic-Phe-Phe(pN02)-OH; H-Tyr-Tic-Trp-Phe(pN02)-OH; H-Tyr-Tic-Phe-Trp-NH2; H-Tyr-Tic-Phe-Phe-Val-Val-Gly-NH2; H-Tyr-Tic-Phe-Phe-Tyr-Pro-Ser-NH2; H-Tyr-Tic-Trp-Phe-Tyr-Pro-Ser-NH2; H-Tyr-Tic-Trp- Phe(pN02)-Tyr-Pro-Ser-NH2 y H-Tyr-Tic-Phe-Phe-Leu-Nle-Asp-NH2. Las abreviaturas en los péptidos mencionados anteriormente de la patente de E.U.A. 5,602,099, se pueden interpretar de la manera siguiente: Aib= ácido a-aminoisobutírico; Atc= ácido 2-aminotetralin-2-carboxílico; Boc= ter-butoxicarbonilo; Cpm= ciclopropilmetílo; DCC= diciclohexil-carbodiimida; DIEA= diisopropiletilamina; Dmt= 2,6-dimetiltirosina; Et= etilo; Hex= hexilo; Hfe= homofenilalanina; HOBt= 1 -hidroxibenzotriazol; MVD= vasos deferentes de ratón; 1-Nal= 3-(r-naftil)alanina; 2-Nal= 3-(2'-naftil)alanina; Phe(pNO2)= 4-nitrofenilalanina; Phg= fenílglicína; Tic= ácido 1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico; TIP= H-Tyr-Tic-Phe-OH; TIP-NH2= H-Tyr-Tic-Phe-NH2; TIP(?)= H-Tyr-Tic?[CH2-NH]Phe-OH; TIPP= H-Tyr-Tic-Phe-Phe-OH; TlPP-NH2= H -Tyr-Tic-Phe-Phe-NH2; TIPP(?)= H-Tyr-Tic?[CH2-NH]Phe-Phe-OH; Tyr(3-Br)= 3-bromotirosina; Tyr(3-CI)= 3-clorotirosina; Tyr(3-F)= 3-fluorotirosina; y Tyr(N Me)= Na-metiltirosina. En otro aspecto, los péptidos son como se describen en la patente de E.U.A. número 5,545,719, que se incorpora en la presente como referencia.

Otros ejemplos de péptidos incluyen, por ejemplo los péptidos relacionados con ACTH para inducir la regeneración neural, ciclosporina para el tratamiento de infecciones, análogos de encefalina para el tratamiento de dolor y la farmacodependencia, MIF-1 para tratar la depresión, neurotensina • 5 para aliviar el dolor y péptido T para tratar la demencia asociada con SIDA. La hormona adrenocorticotrófica (ACTH) y se sabe también que sus péptidos análogos restauran el aprendizaje de evitación ocasionados por la remoción de la glándula pituitaria y también pueden usarse para tratar condiciones de evitación pasiva. 10 Los péptidos que se prefieren especialmente son los péptidos opioides endógenos y sintéticos como las encefalinas. Un opioide que se prefiere particularmente es [Met5]Encefalina (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met). Los péptídos de conformidad con la presente invención pueden sintetizarse de conformidad con cualquier método de síntesis conocido en la 15 técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a técnicas de síntesis química y técnicas de expresión de ADN recombinante. Los compuestos terapéuticos de la presente invención pueden • modificarse para facilitar el acoplamiento a oligómero anfifílico. Un grupo funcional puede añadirse al péptido terminal C o terminal N o a una cadena 20 lateral del péptido para proveer un punto de unión para el oligómero. Alternativamente, aminoácidos específicos pueden insertarse dentro de la cadena de aminoácidos del péptido terapéutico, o pueden reemplazar un aminoácido del terapéutico o pueden añadirse a la terminal C o terminal N del péptido para facilitar la unión del oligómero en donde tal modificación no elimina la actividad del péptido. Por ejemplo, un residuo de prolina o alanina puede añadirse a la terminal N del péptido terapéutico, como una encefalina, por ejemplo [met5]encefalina, para facilitar la unión al olígómero anfifílíco. Un experto en la técnica sabrá que uno o más aminoácidos dentro de los péptidos ejemplificado puede modificarse o sustituirse, por ejemplo, mediante una sustitución conservadora de aminoácidos de uno o más de los aminoácidos específicos que se muestran en los péptidos ejemplificados. Un cambio de sustitución de aminoácido conservadora puede incluir, por ejemplo la sustitución de un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido, de un aminoácido hidrófobo por otro aminoácido hidrófobo u otras sustituciones conservadoras conocidas en la técnica, incluyendo el uso de aminoácidos que no se presentan en la naturaleza, por ejemplo NIe por Leu u omitina (Orn) u homoArginina (homoArg) por Arg. Además de los tipos mencionados de modificaciones o sustituciones también puede usarse un mimético de un o más aminoácidos, conocidos también como un péptido mimético o peptidomimético. Como se usa en la presente, el término "mimético" significa un aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene ias mismas características funcionales o similares de un aminoácido. De esta manera, por ejemplo, un análogo de (D)arginina puede ser un mimétíco de (D)arginína si el análogo contiene una cadena lateral que tiene una carga positiva a un pH fisiológico, ya que es característico de la cadena lateral de guanidínio del grupo de reacción de arginina. Un péptido mimético o peptidomimético es una molécula orgánica que retiene grupos farmacóforos de cadena péptida similares como los que están presentes en el péptido correspondiente. '# 5 La sustitución de aminoácidos por aminoácidos que no se presentan naturalmente y péptidos miméticos como se describió en párrafos anteriores puede mejorar la actividad general o las propiedades de un péptido individual con base en las modificaciones en las funcionalidades de la cadena lateral. Por ejemplo, estos tipos de alteraciones pueden emplearse junto con 10 oligómeros anfifílicos de la presente invención para mejorar adicionalmente la estabilidad del péptido a la degradación enzimática e incrementa la actividad biológica. Un experto en la técnica puede sintetizar fácilmente los péptidos para usarse como terapéuticos en esta invención. Los procedimientos 15 estándares para preparar péptidos sintéticos ya se conocen en la técnica. Los péptidos pueden sintetizarse usando el método de la síntesis de péptidos de fase sólida (SPPS) de Merrifield (J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1964), que se incorpora en la presente como referencia) o usando métodos de solución estándares ya conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Bodanzsky, M., K 20 Principies of Peptide Synthesis Tra edición revisada (Springer-Verlag, 1988 y 1993), que se incorpora en la presente como referencia). Alternativamente, pueden usarse las técnicas de síntesis simultánea de péptidos múltiples (SMPS) ya conocidas en la técnica. Los péptidos preparados por el método de Merrifield pueden sintetizarse usando un sintetizador de péptidos automatizado, como el sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A-01 (Mountain View, California) o usar las técnicas de síntesis de péptidos manuales descritas por Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci., E.U.A. 82:5131 (1985), que se incorpora en la presente como referencia. Los péptidos pueden sintetizarse usando aminoácidos o análogos de aminoácidos, los grupos activos de los cuales se protegen si es necesario usando, por ejemplo, un grupo t-butildicarbonato (t-BOC) o un grupo fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC). Los aminoácidos y análogos de aminoácidos pueden obtenerse comercialmente (Sigma Chemical Co.; Advanced Chemtec) o sintetizarse usando los métodos conocidos en la técnica. Los péptídos sintetizados usando el método de fase sólida pueden unirse a resinas incluyendo 4-metilencidrilamina (MBHA), 4-(oximetil)-fenilacetamidometilo y 4-(hidroximetil)fenoximetil-copoli(estireno-1% divinilbenceno) (resina Wang), todas están disponibles comercialmente, o al polímero p-nitroenzofenona oxima (resina oxime), que puede sintetizarse como lo describe De Grado y Kaiser, J. Org. Chem. 47:3258 (1982), que se incorpora en la presente como referencia. Un péptido recién sintetizado puede purificarse usando un método como cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) u otros métodos de separación con base en el tamaño o carga del péptido. Adicionalmente, el péptido purificado puede ser caracterizado usando . estos y otros métodos ya conocidos como el análisis de aminoácidos y espectrometría de masa.

Síntesis Un esquema de síntesis general para los oligómeros de la presente invención se provee en la figura 9, y un esquema de síntesis general para unir tal oligómero a los péptidos terapéuticos de la presente invención se provee en la figura 10. Diversos métodos para modificar ácidos grasos y lograr el oligómero deseado se analizarán con mayor detalle con las ilustraciones estructurales. En la síntesis de oligómeros que contienen ácidos grasos y polietilenglicoles, donde el etilenglicol se conecta al ácido graso y un enlace de éster hidrolizable, es deseable iniciar con cloruro ácido del ácido graso o su anhídrido ácido. Un polietilenglicol deseado que tiene dos hidroxilos libres en las terminales entonces se trata en un solvente inerte con un equivalente molar igual de cloruro ácido o anhídrido ácido. La unidad glicol primero se disuelve en solvente inerte y se trata con una base orgánica antes de la adición de dicloruro de ácido o anhídrido ácido. El producto se extrae del medio de reacción y se purifica adicionalmente usando cromatografía de columna: CH3(CH2)nCOCI + HOCH2CH2(OC2H4)mOH Piridina CH3(CH2)nCO (OC2H4)mOH En algunos casos se desea crear oligómeros que tengan un enlace hídrolizable más fuerte como amida. El cloruro ácido o el anhídrido ácido del ácido graso seleccionado se trata con un derivado amino de polietilenglicol en una condición de reacción controlada para que tenga efecto únicamente en el residuo amino y no la porción hidroxilo. Otras condiciones que aseguran la selectividad es mediante la conversión del ácido graso en el éster de N-hidroxisuccinimida y haciéndolo reaccionar con el residuo amino del polietilenglicol.

CH3(CH2)nCOCI + NH2CH2CH2(OC2H4)mOH Piridina CH3(CH2)nCONHCH2CH2 (OC2H4)mOH CH3(CH2)nCOONSU + NH2CH2CH2(OC2H4)mOH CH3(CH2)nCONHCH2CH2 (OC2H4)mOH El acoplamiento del oligómero al fármaco de péptido se realiza mediante la conversión de la porción de hidroxilo libre del oligómero a éster N-hidroxisuccinimida (NSU). El grupo N-hidroxisuccinimida reacciona fácilmente con el residuo amino nucleófilo del péptido. CH3(CH2)nCOONSU + Péptido CH3(CH2)nCO-Péptido En la síntesis de oligómeros en donde la porción lipofílica de los oligómeros se conecta a la porción hidrófila mediante enlace de éter, el polietilenglicol deseado (hidrófilo) primero se protege. Uno de los dos hidroxilos libres en la terminal se protege con un grupo trifilo en piridina usando un mol de cloruro de tritilo. El polietilenglicol protegido se disuelve en un solvente inerte adecuado y se trata con hidruro de sodio. El bromo o derivado de tosílato de la porción lipofílica se disuelve en un solvente inerte y se añade a la solución del polietilenglicol protegido. El producto es tratado con una solución de ácido para-toluensulfónico en un solvente inerte anhidro a temperatura ambiente. El producto deseado se extrae en solvente inerte y se purifica por cromatografía de columna. Las estructuras de la transformación se ¡lustran a continuación: CH3(CH2)nBr+HO(C2H40)mTritilo CH3(CH2)n(OC2H4)OmTritilo CH3(CH2)n(OC2H4)mOH La porción lipofílica puede ser porciones alquilo, colesterilo, adamantilo. En la síntesis de oligómeros, en donde la porción lipofílica del oligómero se conecta a la porción hidrófila en un enlace de éter y los extremos terminales en la porción de ácido carboxílico, es deseable proteger el grupo carboxílico. Se selecciona el polietílenglicol que tiene un grupo hidroxilo libre en un extremo y grupo carboxilo en el otro extremo. El grupo carboxílico se protege por esterificación. Se disuelve polietilenglicol protegido en un solvente inerte adecuado y se trata con hidruro de sodio. Los derivados de bromo o tosilato de la porción lipofílica se disuelven en un solvente inerte y se añaden a la solución del polietilenglicol protegido. Entonces el producto se trata con solución de hidróxido de sodio para liberar el ácido libre. El producto deseado se extrae en solvente inerte y se purifica mediante cromatografía de columna. Las estructuras de la transformación se describen a continuación.

CH3(CH2)nBr + HO(C2H40)mCH2C02C2H5 CH3(CH2)n(OC2H4)mOCH2C02C2H5 CH3(CH2)n(OC2H4)mOCH2C02H La porción lipofílica puede ser porciones alquilo, colesterilo o adamaltilo. Este grupo de oligómeros ácidos puede acoplarse a fármacos de péptidos haciendo reaccionar primero el grupo carboxílico con N-hidroxisuccinimida (NSU) para formar un grupo separable fácilmente. Una solución de los oligómeros activados en el solvente inerte se trata con el fármaco de péptido deseado dísuelto en un solvente adecuado. Puede seleccionarse la adición inversa.

CH3(CH2)n(OC2H4)mOCH2COH2 + NSU CH3(CH2)n(OC2H4)mOCHC02NSU peptídico CH3(CH2)n(OC2H4)OCH2CO-Peptido Algunas veces es deseable reemplazar la porción lipofílica con azúcares lipófílicos. La porción de azúcar se esterifica primero con cloruro de ácido graso deseado para obtener la acilación selectiva o parcial. El producto se trata en un solvente inerte con cloruro diácido del derivado de ácido dicarboxílico deseado de polietilenglicol. La reacción se realiza con un equivalente molar de cada porción de reacción. Esta reacción deja un extremo del cloruro de ácido que contiene la porción hidrófila, que se convierte adicionalmente a éster N-hidroxisuccinimida. El éster activado se hace reaccionar con el fármaco de péptido en un solvente inerte adecuado.

Fármaco peptídico peptídico en donde R = ácido graso, alquilo ?_26, colesterol y adamantano.

Métodos terapéuticos La invención provee métodos de tratamiento y prevención mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un conjugado fármaco-oligómero anfifílico de la presente invención. Una modalidad de la invención provee métodos para administrar una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva terapéuticamente de un conjugado fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la presente invención. Los métodos de introducción incluyen pero no se limitan a las rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los conjugados pueden administrarse por cualquier ruta adecuada, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de los recubrimientos mucocutáneos o epiteliales (por ejemplo, mucosa oral, rectal y mucosa intestinal, etc) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. En algunas circunstancias, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención directamente en el sistema nervioso central por cualquier ruta adecuada, incluyendo intraventricular e inyección intratecal; la inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter ¡ntraventricular, por ejemplo, unido a un receptáculo como un receptáculo de Ommaya. La administración pulmonar o nasal también puede emplearse, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y la formulación con un agente pulverizante. En otra modalidad, los conjugados pueden suministrarse en un sistema de liberación controlado. En una modalidad, puede usarse una bomba (véase Lange, ya mencionado, Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (19987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980), Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321 :574 (1989)). En otra modalidad más, un sistema de liberación controlada puede colocarse cerca al objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, requiriendo de esta manera únicamente una fracción de la dosis sistémica (véase por ejemplo Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, ya mencionado, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)). El sujeto preferiblemente es un animal, incluyendo, sin limitarse a animales como vacas, cerdos, caballos, gallinas, gatos, perros, etc., y preferiblemente un mamífero, y mucho muy preferiblemente un humano.

Composiciones farmacéuticas Entre los medios de administración por ejemplo se incluye la administración oral, parenteral, rectal, tópica, sublingual, mucosa, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, espinal, intratecal, intra-articular, intra-arterial, sub-aracnoidea, bronquial, linfática e intrauterina. La presente invención contempla el uso de formulaciones farmacéuticas para uso médico en humanos que comprenden estructuras de vector de la presente invención como ingredientes terapéuticos. Tales formulaciones farmacéuticas pueden incluir vehículos efectivos farmacéuticamente, y opcionalmente, pueden incluir otros ingredientes terapéuticos. El vehículo o vehículos pueden ser farmacéuticamente aceptables en el sentido de ser compatibles con los ingredientes terapéuticos y no dañinos para el receptor. El ingrediente terapéutico o ingredientes se proveen en una cantidad necesaria para lograr el efecto terapéutico deseado que se describe posteriormente. En otro aspecto, se provee una composición farmacéutica que comprende (1 ) una mezcla de un conjugado de encefalina de conformidad con la presente invención, en donde el péptido de encefalina tiene prolina o alanina añadida en su terminal N y un conjugado de encefalina de conformidad con la presente invención que no tiene prolina o alanina añadida a la terminal N, y (2) un vehículo farmacéutico. Diversos sistemas de suministro se conocen y pueden usarse para administrar un conjugado de la invención, por ejemplo, microcápsulas de encapsulación.

Como se usa en la presente, el término "aceptable farmacéuticamente" significa que ha sido aprobado por una agencia normativa del gobierno federal o estatal o está incluida en la farmacopea de E.U.A. u otras farmacopeas reconocidas en general para el uso en animales, y particularmente en humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, auxiliar, excipiente o vehículo en el que se administra el conjugado. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluyendo aquéllos que tienen origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también pueden emplearse como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, greda, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición, se así se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes reguladores de pH. Las composiciones pueden tener la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio con aglutinantes tradicionales y vehículos como triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir vehículos estándares como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad efectiva terapéuticamente de conjugado fármaco-oligómero, preferiblemente en forma purificada junto con una cantidad adecuada de vehículo, de manera que provea la forma de administración adecuada al paciente. La formulación debe ajustarse al modo de administración. El modo de administración y formas de dosificación, desde luego, afectarán las cantidades terapéuticas de los compuestos que sean deseables y eficaces para la aplicación de tratamiento dado. Una cantidad efectiva terapéuticamente es una cantidad necesaria para evitar, retardar o reducir la gravedad del inicio de la enfermedad, o una cantidad necesaria para detener o reducir la gravedad de una enfermedad en curso. Será evidente para el experto en la técnica que esta cantidad variará con base en factores como el peso y estado de salud del receptor, el tipo de células transformadas el modo de administración de las composiciones presentes y el tipo de trastorno médico tratado.

La dosificación puede presentarse en forma de tabletas, jarabes, trociscos, elixires, suspensiones y/o emulsiones. Los ingredientes adicionales pueden incluir, sin limitación diluyentes, reguladores de pH, agentes saborizantes, desintegrantes, agentes 5 tensioactivos, espesantes, lubricantes, conservadores y/o antioxidantes. En una modalidad que se prefiere, la composición está formulada de conformidad con procedimientos de rutina como composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para la administración intravenosa son • 10 soluciones en un regulador de pH acuoso isotérmico estéril. Cuando es necesario, la composición también puede incluir una agente solubilizante y un anastésico local como lignocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Generalmente, los ingredientes se proveen ya sea por separado o mezclados en una forma de dosificación por unidad, por ejemplo, como un 15 polvo liofllizado seco o un concentrado libre de agua en un contenedor sellado herméticamente como una ampolleta o saquito indicando la cantidad del agente activo. • En donde la composición se administrará por infusión, puede suministrarse con una botella de infusión que contiene agua o solución salina 20 con grado farmacéutico. En donde la composición se administrará por inyección puede suministrarse medíante una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina puede proveerse de manera que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

Los conjugados de la invención pueden formularse como formas neutras o de sal. Las sales aceptables farmacéuticamente incluyen aquéllas formadas con grupos amino libres como los derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc, y aquéllos formados con grupos carboxilos libres, como aquéllos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc. La cantidad del conjugado de la invención que será efectivo terapéuticamente en el tratamiento de un trastorno o condición particular dependerá de la naturaleza del trastorno o condición, y puede estar determinada por técnicas clínicas estándares. Además, las pruebas in vivo y/o in vitro puede emplearse opcionalmente para ayudar a identificar las escalas de dosificación óptimas. Por ejemplo, las dosis adecuadas de un conjugado de encefalina para analgesia generalmente se encontrarán en una escala de 1 mg/kg a 20 mg/kg, preferiblemente 3 mg/kg a 15 mg/kg, muy preferiblemente 5 mg/kg a 7 mg/kg. Las dosis efectivas pueden extrapolarse de las curvas dosis-respuesta derivadas de los sistemas de prueba de modelo animal o in vitro. Los supositorios generalmente contienen ingrediente activo en una escala de 0.5% a 10% en peso; las formulaciones orales preferiblemente contienen ingrediente activo del 10 al 95%.

La invención también provee un paquete farmacéutico o equipo que comprende uno o más contenedores llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente, anexo a tal contenedor(es) puede encontrarse información en la forma prescrita por una agencia gubernamental normativa de la manufactura, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, dicha información refleja la aprobación de la agencia de elaboración, uso o venta para administración a humanos. La presente invención no debe limitarse al alcance de las modalidades específicas descritas en la presente. De hecho, diversas modificaciones a la invención, además de aquellas descritas en el presente documento, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción en curso y figuras anexas. Tales modificaciones tienen la intención de encontrarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS Síntesis Ester trietilenglicol monohexadecílíco Se disolvió anhídrido palmítico (5.00 g; 10.104 mmol) en THF seco (20 ml) y 3 moles de exceso de piridina seca y la solución se agitó a temperatura ambiente. A la solución agitada, se añadió lentamente trietilenglicol (1.5 g; 10.104 mmoles) después de agitar durante 1 hora se eliminó THF bajo presión reducida a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se vertió en ácido sulfúrico al 10% enfriado con hielo. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (30 ml x 3). La capa orgánica combinada se lavó secuencialmente con agua, salmuera y se secó sobre MgS0 y se filtró. Después de la evaporación se obtuvo un producto puro, mancha sencilla en TLC.

Ester monohexadecílíco de succínimidíl trietilenglicol A una solución agitada de teg-palmitato (1 g; 2.57 mmoles), dimetilaminopiridina (0.313 g; 2.57 mmoles) en THF seco se añadió carbonato de N.N'-disuccínídil (0.691 g) en una porción. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El solvente orgánico se eliminó bajo presión reducida y la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con ácido clorhídrico 1 N (10 ml x 2), agua y salmuera. El solvente se secó sobre MgS04, se filtró y evaporó para dar un sólido blanco.

Determinación de actividad La reactividad del succinidilo se determinó conjugándolo con insulina y se encontró que es del 67%. Éter monohexadecílico de succínímidil trietilenglicol A una solución agitada fría de fosgene (10.0 ml; solución en tolueno al 20%) bajo nitrógeno, se añadió una solución de éter monohexadecílico de trietilenglicol (1.5 g; 4.00 mmoles) en díclorometano seco (4 ml). La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 2 horas a temperatura ambiente. Se destiló el exceso de fosgene usando un aspirador de agua pasándolo a través de una solución fría de NaOH diluido. El matraz de reacción se enfrío en baño con hielo y una cantidad equimolar de trietilamina y una solución de hidrosuccínimida disueltas en una cantidad mínima de THF se añadió lentamente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. El solvente se eliminó por completo a 25°C y el residuo se volvió a disolver en acetato de etilo, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgSO4 y se evaporó para dar el derivado de succínímidilo puro.

Determinación de actividad La reactividad del succínidilo se determinó conjugándolo con insulina y se encontró que es del 62.5%.

Conjugación del compuesto 2 y 4 con met-encefalina Procedimiento general para la conjugación Esguema NH2-Tyr....Met-enk + Palm-teg-NSU o Cetyl-Teg-NSU Palm-Teg-NH...Met-enk o Cetyl-Teg-NH enk • 10 Procedimiento General A una solución agitada de met-encefalina (0.130 g; 0.1854 mmoles) en 5 ml de DMF-DCM (2:1) se añadió TEA (25 µL). La mezcla de 15 reacción se enfrió a 10° C y una solución de palmitilo-teg-nsu o cetil-teg-nsu disuelta en 1 ml de DCM se añadió en una porción. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a 10° C. El solvente se eliminó bajo presión reducida y • el residuo se volvió a disolver en acetato de etilo seco. Después de la evaporación del solvente se obtuvo 0.310 g de encefalina conjugada. HPLC 20 mostró el mono y diconjugado en una relación de 3.1.

Síntesis de CETYL-PEG?, su activación y conjugación con (BOC) LEUENC protegido A una suspensión de NaH (4.00 g: 0.1 mol) en THF seco (300 ml) a 10° C se añadió dietilenglicol en una porción. El baño de enfriamiento se retiró y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Al final, la mezcla de reacción se enfrió a 10°C y se añadió bromohexadecano (29 g, .095 mol) en una porción. El baño de enfriamiento se eliminó y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El solvente se removió bajo presión reducida y se mezcló crudo con agua y se extrajo con acetato de etilo (30 ml x 3). El extracto orgánico combinado se lavó secuencialmente con agua, salmuera, se secó sobre MgS04 y se evaporó para dejar un polvo sólido blanco, de una sola mancha sobre TLC y un pico iónico molecular único.

CETYL-PEG?-NSU A una solución agitada fría de fosgene (10.0 ml; solución al 20 % en tolueno) bajo nitrógeno se añadió una solución de cetil-PEG2-OH (1.3g; 4.00 mmoles) en diclorometano seco (5 ml). La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante una hora y dos horas a temperatura ambiente. El exceso de fosgene se destiló usando un aspirador de agua, pasando a través de una solución fría de NaOH diluido. El matraz de reacción se enfrió en un baño de hielo y una cantidad equimolar de trietilamina y una solución de hidroxisuccinimida, . disuelta en una cantidad mínima de THF se añadió lentamente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. El solvente se eliminó por completo a 25° C y el residuo se volvió a disolver en acetato de etilo, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgS04 y se evaporó para dar el derivado de succinimidilo puro.

Determinación de actividad La reactividad del succinimidilo se determinó conjugándolo con insulina y se encontró que es del 83.5 %.

Conjugación de Succinimídilo CET1L-PEG2 CON BOC-LEU...ENC...LYS-OH Se disolvió Boc-Leu...enc...Lys-OH (100 mg; 0.125 mmol) en 5 ml de DMF:DCM (1 :1) y se agitó a 10°C bajo nitrógeno. A está solución clara de TEA (17.5 µL) se añadió una solución de succinimidílo cetil-PEG2, disuelta en Iml de DCM. Después de 1.5 h (TLC mostró un producto único) el solvente se eliminó bajo presión reducida a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se mezcló con agua y se extrajo con acetato de etilo (10 ml x 3). El extracto orgánico se lavó secuencialmente con agua, salmuera, y se secó y evaporó a un sólido.

Purificación de BOC-LEU...ENC...LYS-OH derivado sobre una columna de gel de sílice La encefalina bloqueada derivada se purificó sobre columna de gel de sílice usando una mezcla de metanol- oroformo (5 % de metanol-cloroformo) como un solvente eluyente. Después de la evaporación de la fracción deseada se obtuvo 100 mg del compuesto puro. Se obtuvo una producción del 100 mg después de la remoción del solvente.

Desbloqueo del grupo Butiloxicarbonilo de LEU...ENC derivado Se trató Boc-Leu...enc derivado (100 mg; 0.0866 mmoles) con 0.4 ml de TFA-DCM (1 :1) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El solvente se eliminó bajo presión reducida. El sólido se volvió a disolver en 2 ml de metanol, se filtró y evaporó; se obtuvo 80 mg del producto puro.

Síntesis de conjugados de oligómero anfifílico-encefalina Un esguema general para la síntesis de conjugados no hidrolizables e hídrolizables Cien miligramos de encefalina (100 mg; 0.142 mmoles) se disolvieron en dimetilformamida seca (5 ml) a temperatura ambiente. Se disolvió P-nitrofenol o N-hidroxisuccinimida activada (carbonato o éter) de oligómero anfifílico (1.1 equivalente molar) en 1 ml de tetrahidrofurano y se añadió la solución anterior y se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas. El grado de la reacción se monitoreo mediante HPLC (C-18) de fase inversa usando un sistema de gradiente isopropanol/agua (0.1 % de ácido trifluoroacético). La mezcla de reacción se evaporó bajo presión reducida y el contenido se disolvió en una mezcla de isopropanol-agua. Esta mezcla se purificó sobre una columna de HPLC de preparación de 22 mm (C-8) con un sistema de gradiente solvente elaborado de ya sea ¡sopropanol/agua (ácido trifluoroacético a 0.1 %) o acetonitrilo/agua (0.1 % de ácido trifluoroacético para dar encefalina monoconjugadas y diconjugadas puras). El solvente se evaporó a temperatura baja (<20° C) para dar un producto seco. La pureza del producto se analizó mediante HPLC analítico de fase inversa, y la información de peso molecular se obtuvo por la técnica espectro de masa MALDI (TOF).

Síntesis del oligómero anfifílico hidrolizable Colesterol-PEG? Se disolvió PEG2 diácido (diácido 3,6,9-trioxaundecanoíco, 10 g) en cloroformo seco (50 ml) y se añadió gota a gota a cloruro de oxalilo a temperatura ambiente bajo condiciones secas en presencia de una cantidad catalítica de dimetil formamida. La reacción se agitó durante 6 horas y el solvente y exceso de reactivo se separó para dar un residuo oleoso. El residuo anterior se disolvió en cloroformo (50 ml) y a éstos se añadió colesterol (1.05 equivalente molar) en cloroformo (50 ml) y trietilamina (1 equivalente molar) durante 30 minutos a 5° C. La reacción se agitó a 15° C durante 2 horas. A esto se añadió N-hidroxisuccinimida (1 equivalente molar) en cloroformo (50 ml) y seguido por trietilamina (1 equivalente) a 5° C y se dejó agitar durante la noche. El solvente se separó y el producto se extrajo con acetato de etilo. El producto crudo se purificó sobre una columna de gel de sílice con un sistema de solvente de 1 :10 metanol/cloroformo para obtener el oligómero anfifílico activado en una producción del 80%.

Información de peso molecular de los conjugados de encefalina obtenidos por MALDI (TOF)-MS Estos resultados demuestran que las reacciones se obtuvieron monoconjugados, es decir, cada péptido se acoplo únicamente a un oligómero. Es importante observar que un solo conjugado es suficiente para impartir las propiedades anfifílicas.

Estabilidad de MET Encefalina-LYS (Encefalína) y sus conjugados de oligómeros anfifílicos en cerebro de rata homogeneizado Met encefalina-lys y sus conjugados (Cetil-PEG2, Cetil-PEG3 y Palmitato-PEG3) se incubaron en un homogenado de cerebro de rata al 2 %.

Las muestras se extrajeron en intervalos de tiempo y la cantidad de la sustancia remanente se midió por el método HPLC. El siguiente procedimiento experimental se usó para el estudio.

Procedimiento: un homogenado del cerebro de rata al 2% se preparó mediante homogeneización de un cerebro de rata recién inundado en un regulador de pH PBS (pH 7.4). Dos alícuotas de 3 ml del homogenado se equilibraron a 37°C en un baño de agua. Se añadió a una encefalina sin modificación y se añadió a otra modificada (conjugada), dando como resultado una concentración final de 60ug/ml del péptido. A los 0, 1 , 2, 3, 5, 15, 30 y 60 minutos, se separó 200 ul de alícuota y se extinguió con 200 ul del agente extintor (ácido trifluoroacético al 1 % en acetonitrilo/isopropanol ó 1% de ácido tricloroacético en agua). Las soluciones muestra se sometieron a acción de remolino y se centrifugaron a 7000RPM. El sobrenadante se analizó mediante un método HPLC usando un gradiente de 10 a 100% de isopropanol/agua (0.1% de ácido trifluoroacético) sobre una columna C-18. La figura 2 muestra la estabilidad del conjugado de cetil-PEG2-encefalina en comparación con met-encefalina-lys. La figura 3 muestra la estabilidad de cetil-PEG3-encefalina en comparación con met-encefalina-lysina. La figura 4 muestra el conjugado de palmitato-PEG3-encefalina (hidrolizable) en comparación con met-encefalina-enc.

Extracción y detección de conjugados de encefalina del cerebro de las ratas dosificadas Procedimiento El siguiente procedimiento se usó para identificar la presencia del conjugado en la muestra de cerebro de los animales dosificados con 5 mg/kg cetil-PEG2-encefaIína. Después de 10 minutos de dosificación, el cerebro de los animales se inundó con 1.5% de ácido trifluoroacético en una solución de PBS, y el cerebro se retiró y congeló a -70°C. El cerebro se homogeneizó con 1ml de ácido trifluoroacético al 1.5% en una solución de PBS y el homogenado se extrajo con una solución de acetonitrilo/isopropanol. El extracto se trató con una solución de cloruro de sodio saturada y se congeló a -20°C durante 2 horas. La capa orgánica se aisló y se centrifugó a 4000RPM. El sobrenadante se evaporó y el residuo resultante se reconstituyó en una mezcla de acetonitrilo/isopropanol/agua. La solución reconstituida se analizó mediante HPLC usando un gradiente de 10 a 100% de isopropanol/agua (0.1% trifluoroacético) en una columna de C-18. La presencia y concentración del conjugado de cetíl-PEG2-encefalina en el extracto se midió por comparación del tiempo de retención y el área pico de la solución estándar bajo la misma condición analítica. Los resultados se representan en las figuras 5A a 5D.

Resultados Los resultados demostraron que los monoconjugados se aislaron del tejido de cerebro. La figura 5A muestra un pico producido por cetil- encefalína estándar, aunque 5B muestra un pico correspondiente • demostrando que cetil-encefalina se presentó realmente en el extracto del cerebro. El contraste, ningún vehículo (figura 5C) ni la encefalina no conjugada (figura 5D) mostraron un pico correspondiente.

Prueba de pata de rata en placa caliente 10 Anímales Ratas Sprague-Dawley macho adultas con un peso de 150-175 g se obtuvieron de Charles River Breeding Laboratories (Raleígh, NC) y se usaron para estudios anímales. Las ratas se alojaron y se manejaron en cajas 15 de alambre en un vivario equipado con un ciclo de luz:oscuridad 12:12 y la humedad se mantuvo entre 45-65% con una temperatura de 72±2°C. Las ratas recibieron alimento para roedores de Purina y agua corriente a voluntad.

• Métodos 20 Se evaluaron met-encefalina-lys y los derivados de met- encefalina-lys para encontrar la actividad analgésica mediante la prueba de pata de rata en placa caliente. Las ratas recibieron una inyección de naloxona en 0.5 mg/kg (s.c.) posteriormente se les administró una dosis única de cetil- encefalina en la vena de la cola 10 minutos después en una dosis de 5.0 mg/kg. Los resultados, como se muestran gráficamente en la figura 6, demuestran que naloxona, un antagonista receptor-µ evita las inhibiciones competitivamente de unión a cetil-PEG2-encefalina, de esta manera demostrando que por lo menos una parte de la actividad de cetil-PEG2-encefalina es atribuible a la unión en el receptor-µ opioide. En un estudio separado, las ratas recibieron cetil-encefalina (5.0 mg/kg, í.v.) o clonidina (0.125 mg/kg, i.v.). La latencia de separación de la pata de la rata de la placa caliente se midió en un medidor de analgesia en placa caliente (Harvard Apparatus Ltd., Kent, Englan). La temperatura de la placa caliente se estableció y calibró a 52°C y las ratas se retiraron del estimulo de calor 36 segundos después de colocarlas. Las pruebas de latencia terminaron cuando el animal comenzó a lamerse una pata trasera o comenzó a brincar de la placa. Las mediciones de base se recolectaron 1 hora antes de la administración del fármaco y en diversos momentos posteriores a la inyección, dependiendo del estudio realizado. Todas las pruebas en placa caliente se determinaron aproximadamente en 1 hora después de la dosificación del fármaco.

Resultados Los resultados se muestran en los siguientes cuadros y en la gráfica de la figura 6. Los resultados demuestran que una dosis de 20 mg/kg de encefalina sola tiene un efecto analgésico de 0% en comparación con la morfina como base, los conjugados de encefalina de la presente invención presentaron fuertes efectos analgésicos y un conjugado, DHA-PEG-encefalina, presentó el 130% de efecto analgésico de la morfina. La gráfica de la figura 7 muestra que cetil-PEG-encefalina produce una respuesta y duración comparable a la de clonídina, un agonista de receptor- adrenérgico Unión de r [35SI GTP?S estimulada por agonistas en secciones del cerebro Materiales Se compraron ratas Sprague-Dawley macho (200 g) de Zivic-Miller (Zelienople, PA). Se compró [35S]GTP?S (1250 Ci/mmol) de New England Nuclear Corp. (Boston, MA). [D-Ala2, N-Me-Phe4,Gly5-ol] encefalina (DAMGO), adenosina deaminasa, y GDP se obtuvieron de Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO). Una película de autorradiografía Reflections® se compró de New England Nuclear Corp. (Boston, MA). Todos los demás químicos con grado de reactivo se obtuvieron de Sigma chemical Co. o Fisher.

Unión de I" SI GTP?S estimulada por agonistas en secciones del cerebro Se realizó una autorradiografía de [35S]GTP?S estimulada por agonistas como lo describe Sim et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 1992 Páginas 7242-7246. Los animales se sacrificaron por decapitación y los cerebros se retiraron y congelaron en isopentano a -30°C. Se cortaron secciones cerebrales coronal y horizontal en un criostato mantenido -20°C. Se incubaron las secciones en un regulador de pH de prueba (Tris-HCl 50 mM, MgCI2 3 mM, NaCI 0.2 mM, pH 7.4) a 25°C durante 10 minutos. Entonces las secciones se incubaron en un regulador de pH de prueba que contenía GDP2 mM, un cóctel de inhibidor de proteasa (10 µl/ml de una solución de que contenía 0.2 mg/ml de cada uno de vestatina, leupeptina, pepstatina A y aprotinínas), y adenosina de aminasa (9.5 mU/ml) a 25°C durante 15 minutos. Las secciones entonces se incubaron en un regulador de pH de prueba con GDP, [35S]GTP?S 0.04 nM y el agonista adecuado a 25°C durante 2 horas. Los agonistas fueron DAMGO10 µM, cetil-encefalina 10 µM y cetil-TEG-encefalina 10 µM. La unión de base se evaluó en ausencia del agonista. Se enjuagaron los portaobjetos 2 veces durante 2 minutos en un regulador de pH tris (Tris-HCl 50 mM, pH 7.4) y una vez en H20 desionizada. Los portaobjetos se secaron durante la noche y se expusieron a una película durante 72 horas. Las películas se dígitalizaron con una cámara de vídeo XC-77 de Sony y se analizaron usando el programa NIH IMAGE de computadoras Macintosh.

Resultados Los resultados muestran que cetil-TEG-encefalina estimula la unión de [35S]GTP?S. La distribución anatómica de la unión es consistente con aquella de los receptores-µ opioides. Estos resultados demuestran que cetil-TEG-encefalina no simplemente une al receptor, también activa al receptor, ocasionando que el receptor se una a la G-proteína. Esta activación provee una evidencia adicional que corrobora que cetil-TEG-encefalina estimula directamente la analgesia.

Claims (72)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un conjugado de fármaco-oligómero anfifílico que comprende un compuesto terapéutico conjugado con un oligómero, caracterizado porque el oligómero comprende una porción lipofílica acoplada a una porción hidrofílica.

2.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho conjugado muestra actividad sin el desdoblamiento del compuesto terapéutico del oligómero.

3.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho compuesto terapéutico no muestra actividad sin el desdoblamiento del compuesto terapéutico del oligómero.

4.- El conjugado de fármaco-oligómero anfífílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un péptido o proteína.

5.- El conjugado de fármaco-olígómero anfifílíco de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un péptido o proteína seleccionado del grupo que consiste de: encefalína, hormona adrenocorticotrópica, adenosin desaminasa ribonucleasa, fosfatasa alcalina, angiotensina, anticuerpos, arginasa, arginina desaminasa, asparaginasa, caeruieína, calcitonina, quimotripsina, colecistocinina, factores de coagulación, dinorfinas, endorfinas, encefalinas, eritropoyetinas, péptido de liberación de gastrina, glucagon, hemoglobina, factores de liberación hipotalámicos, interferón, katacalcina, motilina, neuropéptido Y, neurotensina, opioides que no ocurren naturalmente, oxitocina, papaína, hormona paratiroidea, prolactina de péptidos, CD-4 soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, superóxído dismutasa, hormona estimulante de la tiroides, activador de plasminógeno en tejidos, tripsina, vasopresina y sus análogos y fragmentos activos.

6.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un agonista, antagonista o agonista parcial/antagonista parcial receptor de opioide.

7.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto terapéutico es [met^encefalina.

8.- El conjugado de fármaco-oiigómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción lipofílica se acopla a la porción hidrofílica por un enlace hidrolizable.

9.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción lipofílica se acopla a la porción hidrofílica por un enlace no hidrolizable.

10.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción lipofílica se acopla a la porción hidrofíllca por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: enlace de amida, enlace de carbamato, enlace de carbonato y enlace de éster.

11.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción de oligómero se acopla a la porción de fármaco por un enlace seleccionado del grupo que consiste de enlace de amida, enlace de carbamato, enlace de carbonato y enlace de éster.

12.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción lipofílica se selecciona del grupo que consiste de ácidos grasos, alquilos de C?_26, colesterol y adamantano.

13.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción hidrofílica se selecciona del grupo que consiste de azúcares y PEG?_ .

14.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción hidrofílica comprende un azúcar y el azúcar se selecciona del grupo que consiste de: amino azúcares.

15.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el oligómero se selecciona del grupo que consiste de: CH3(CH2)n(OC H4)mOH (Fórmula 1 ), en donde n=3 a 25 y m=1 a 6; CH3(CH2)n(OC2H4)mOCH2CO2H (fórmula 2), en donde n=3 a 25 y m=1 a 7; CH3(CH2)nCX(OC2H4)mOH (fórmula 3), en donde n=3 a 25, m=1 a 7 y X=0 o N; R-(OC2H4)mCH2C02H (fórmula 4), en donde m=0 a 5 y R=colesterol o adamantano; R-OCO(C2H40)mCH2C02H (fórmula 5), en donde m=0 a 5; CH3(CH2— CH=CH)6(CH2)2CH2(OC2H4)mOH (fórmula 6), en donde m=0 a 7; y CH3(CH^-CH=CH)6(CH2)2Cx(OC2H4)mOH (fórmula 7), en donde m=1 a 7 y X=N o O.

16.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción hidrofílica comprende un azúcar y el azúcar se selecciona del grupo que consiste de no amino azúcares.

17.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción hidrofílica comprende un monosacárido.

18.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el olígómero se selecciona del grupo que consiste de: CH3(CH2CH=CH)6(CH2)2CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 7; CH3(CH2CH=CH)6(CH2)2CO(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 7; CH3(CH2CH=CH)6(CH2)2CONHCH2CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2CH=CH)6(CH2)3(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2CH=CH)6(CH2)2CO(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 7; CH3(CH2)7CH=CH)(CH2)7CO(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 7; CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CONHCH2CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO(OC2H4)mOCH2CH2OH. en donde m=1 a 6; CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 6, CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CO(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 7; CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CONHCH2CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CO(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CH2(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 7; CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7CO(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 7; CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7CONHCH2CH2(OC2H4)mOH, en donde m=1 a 6; CH3(CH2CH=CH3(CH2)7CO(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6; y CH3(CH2CH=CH3(CH2)7CH2(OC2H4)mOCH2COOH, en donde m=1 a 6.

19.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un péptido que tiene un residuo N-terminal añadido seleccionado del grupo que consiste de prolina o alanina.

20.- Un conjugado de oligómero-encefalina anfifílico seleccionado del grupo que consiste de: H2N-Tyr-Gly-GIy-Phe- et-Lys-C00H HN C(0)-CHC2H4-OC2H4-N-C(0)CH2)7-CH=CH-CH2-CH=Crr-CH2-CH3; H2N-Tyr-Gly-Gly-P e-Met-Lys-COOH Hlil-C(0)-0-(C2H40)3-C(0)-(CH2)14-CH3 ; y C(0)-0-(OC2H4)3-C(0)-(CH2)14-CH3 HN-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Lys-COOH HN-C(0)-O-(0C2H4)3-C(0)-(CH2)14-CH3

21.- Un conjugado de oligómero-encefalina anfifílico caracterizado además porque el oligómero está compuesto por un lípófilo y un hidrófilo y el lipófilo se acopla con el hidrófilo por un enlace hidrolízable siendo dicho conjugado seleccionado del grupo que consiste de: H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Lys-CÓÓH HN C(0)-0-C2H4-OC2H4-N-C(0)CH2)7-CH=CH-CH2CH=CH-CH2-CH3; H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Lys-COOH HN-C(0)-0C2H4-OC2H4-O-(CH2)15-CH3

22.- Un conjugado de oligómero-encefalína anfifílico, caracterizado además porque el oligómero está compuesto de un lipófilo y un hidrófilo y el hipófilo se acopla con el hidrófilo por un enlace no hidrolizable, siendo dicho conjugado seleccionado del grupo que consiste de: H2N-Tyr-Gly-Gly-P e- et-Lys-COOH H -C(0)-0-(C2H40)3-C(0)-{CH2)14-CH3 ! y C(0)-0-(0C2H4)3-C(0)-{CH2)14-CH3 HN-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Lys-COOH HN-C(0)-0-(OC2H4)3-C(0)-(CH2)14-CH3

23.-Un método para activar un receptor que comprende poner dicho receptor en contacto con un conjugado de fármaco-oligómero anfifílico que comprende un compuesto terapéutico conjugado con un oligómero, caracterizado además porque el oligómero comprende una porción lípofílica acoplada con una porción hidrofílica.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho conjugado muestra actividad sin la desdoblamiento del compuesto terapéutico del oligómero.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el receptor es un receptor acoplado a una proteína G.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el receptor es un receptor opioide.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el receptor es un receptor opioide; seleccionado del grupo que consiste de receptores d, µ, y K.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la porción hidrofílica se selecciona del grupo que consiste de azúcar y PEG1.7.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la porción hidrofílica se selecciona del grupo que consiste de ácidos grasos, alquilo de 1-26, colesterol y adamantano.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un péptido que tiene un residuo N-terminal añadido seleccionado del grupo que consiste de prolina y alanina.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un péptido o proteína.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un péptido, y el péptido o proteína se selecciona del grupo que consiste de: encefalina, hormona adrenocorticotrópica, adenosin desaminasa ribonucleasa, fosfatasa alcalina, angiotensina, anticuerpos, arginasa, argínina desaminasa, asparaginasa, caeruleína, calcitonina, quimotripsína, colecistocinina, factores de coagulación, dinorfinas, endorfinas, encefalinas, eritropoyetinas, péptído de liberación de gastrina, glucagon, hemoglobina, factores de liberación hipotalámicos, ¡nterferón, katacalcína, motilína, neuropéptido Y, neurotensina, opíoides que no ocurren naturalmente, oxítocina, papaína, hormona paratiroidea, prolactina de péptidos, CD-4 soluble, somatomedina, somatostatína, somatotropina, superóxido dismutasa, hormona estimulante de la tiroides, activador de plasminógeno en tejidos, tripsina, vasopresina y sus análogos y fragmentos activos.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el oligómero anfifílico se selecciona del grupo que consiste de: CH3(CH2)n(OC2H4)mOH (Fórmula 1), en donde n=3 a 25 y m=1 a 6; CH3(CH2)n(OC2H4)mOCH2C02H (Fórmula 2), en donde n=3 a 25 y m=1 a 7; CH3(CH2)nCX(OC2H4)mOH (Fórmula 3), en donde n=3 a 25, m=1 a 7 y X=0 o N; R-(OC2H4)mCH2C02H (Fórmula 4), en donde m=0 a 5 y R=colesterol o adamantano; o R-OCO(C2H40)mCH2C02H (Fórmula 5), en donde m=0 a 5; CH3(CH2--CH=CH)6(CH2)2 CH2 (OC2H4)mOH (Fórmula 6), en donde m=0 a 7; y CH3(CH2-CH=CH)6(CH2)2C?(OC2H4)mOH (Fórmula 7), en donde m=1 a 7 y X=N o O.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la porción hidrofílica se acopla a la porción hidrofóbica por un enlace hidrolizable.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la porción hidrofílica se acopla a la porción hidrofóbica por un enlace no hidrolizable.

36.- Un método para suministrar un compuesto terapéutico a través de la barrera hemoencefálica que comprende administrar a un sujeto un conjugado de fármaco-oligómero anfífílico que comprende un compuesto terapéutico conjugado con un oligómero, caracterizado además porque el oligómero comprende una porción lipofílica acoplada a una porción hidrofílica.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un péptido o proteína.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un péptido o proteína seleccionado del grupo que consiste de: encefalina, hormona adrenocorticotrópíca, adenosin desaminasa ribonucleasa, fosfatasa alcalina, angiotensina, anticuerpos, arginasa, arginina desaminasa, asparaginasa, caeruleína, calcítonina, quimotripsina, colecistocinina, factores de coagulación, dinorfinas, endorflnas, encefalinas, eritropoyetinas, péptido de liberación de gastrina, glucagon, hemoglobina, factores de liberación hipotalámicos, interferón, katacalcina, motilina, neuropéptido Y, neurotensina, opioides que no ocurren naturalmente, oxitocina, papaína, hormona paratiroidea, prolactina de péptidos, CD-4 soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, superóxido dismutasa, hormona estimulante de la tiroides, activador de plasminógeno en tejidos, tripsina, vasopresina y sus análogos y fragmentos activos de dichos péptidos.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es una encefalina.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la porción lipofílica se acopla a la porción hidrofílica por un enlace hídrolizable.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la porción iipofílica se acopla con la porción hidrofílíca por un enlace no hídrolizable.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la porción lipofílica se acopla con la porción hidrofílíca por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: enlace de amida, enlace de carbamato, enlace de carbonato y enlace de éster.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la porción de oligómero se acopla a la porción de fármaco por un enlace seleccionado del grupo que consiste de enlace de amida, enlace de carbamato, enlace de carbonato y enlace de éster.

44.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la porción lipofílica se selecciona del grupo que consiste de ácidos grasos, alquilos de C?-26, y colesterol.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la porción hidrofílica se selecciona del grupo que consiste de azúcares y PEG?_7.

46.- Un método para inducir analgesia en un sujeto que la necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de fármaco-oligómero anfifílico que comprende una encefalina conjugada con un oligómero, caracterizado además porque el oligómero comprende una porción lipofílíca acoplada a una porción hidrofílica.

47.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es encefalina.

48.- Ei método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque la porción lipofílica se selecciona del grupo que consiste de ácidos grasos, alquilos de C?-26 y colesterol.

49.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque una o más funciones hidrofílícas se seleccionan del grupo que consiste de azúcares y PEG.

50.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque la porción hidrofílica comprende un azúcar y el azúcar se selecciona del grupo que consiste de amino azúcares y no amino azúcares.

51.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque el oligómero se selecciona del grupo que consiste de: CH3(CH2)n(OC2H )mOH (Fórmula 1 ), en donde n=3 a 25 y m=1 a 6; CH3(CH2)n(OC2H4)mOCH2C02H (Fórmula 2), en donde n=3 a 25 y m=1 a 7; CH3(CH2)nCX(0C2H4)m0H (Fórmula 3), en donde n=3 a 25, m=1 a 7 y X=0 o N; R-(OC2H )mCH2C02H (Fórmula 4), en donde m=0 a 5 y R=colesterol o adamantano; o R-OCO(C2H O)mCH2CO2H (Fórmula 5), en donde m=0 a 4 y R=colesterol o adamantano; CH3(CH2-CH=CH)6(CH2)2CH2(OC2H4)mOH (Fórmula 6), en donde m=0 a 7; y CH3(CH2-CH=CH)6(CH2)2Cx(OC2H4)mOH (Fórmula 7), en donde m=1 a 7 y X=N o O.

52.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque el conjugado de oligómero-encefalina anfifílico se selecciona del grupo que consiste de: H2N-Tyr-GIy-Gly-Phe-Met-Lys-COOH H C(0)-0-C2H4-OC2H4-N-C(0)CH2)7-CH=CH-CH2CH=CH-CH2-CH3; H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Lys-COOH HN-C(0)-0-{C2H40)3-C(0)-(CH2)14-CH3 C(0)-0- OC2H4)3-C(0)-(CH2)14-CH3 HN-Tyr-Gly-Gly-Phe- et-Lys-COOH HN-C(0)-0-(OC2H4)3-C(0)-{CH2)14-CH3

53.- Un método para alterar la afinidad de unión de un péptido o proteína a su receptor que comprende conjugar el péptido con un oligómero anfifílico que comprende una porción lipofílíca acoplada a una porción hidrofílica.

54.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque la afinidad de unión se incrementa.

55.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque la afinidad de unión se reduce.

56.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque el péptido o proteína es una encefalina.

57.- El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque el péptido o proteína se selecciona del grupo que consiste de: encefalína, hormona adrenocorticotrópica, adenosin desaminasa ribonucleasa, fosfatasa alcalina, angiotensina, anticuerpos, arginasa, arginina desaminasa, asparaginasa, caeruleína, calcitonina, quimotripsina, colecistocinina, factores de coagulación, dinorfinas, endorfinas, encefalinas, eritropoyetinas, péptido de liberación de gastrina, glucagon, hemoglobina, factores de liberación hipotalámicos, interferón, katacalcina, motilina, neuropéptido Y, neurotensina, opioides que no ocurren naturalmente, oxitocina, papaína, hormona paratiroidea, prolactina de péptidos, CD-4 soluble, somatomedina, somatostatína, somatotropina, superóxído dismutasa, hormona estimulante de la tiroides, activador de plasminógeno en tejidos, tripsina, vasopresina y sus análogos y fragmentos activos de dichos péptidos.

58.- El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque el péptído es una encefalina.

59.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque la porción lipofílica se selecciona del grupo que consiste de ácidos grasos, alquilos de C?_26 y colesterol.

60.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque la porción hidrofílica se selecciona del grupo que consiste de azúcares o PEG 1. .

61.- El método de conformidad con la reivindicación 53 caracterizado además porque el oligómero se selecciona del grupo que consiste de: CH3(CH2)n(OC2H )mOH (Fórmula 1), en donde n=3 a 25 y m=1 a 6; CH3(CH2)n(OC2H4)mOCH2C02H (Fórmula 2), en donde n=3 a 25 y m=1 a 7; CH3(CH2)nCX(OC2H4)mOH (Fórmula 3), en donde n=3 a 25, m=1 a 7 y X=0 o N; R-(OC2H4)mCH2C02H (Fórmula 4), en donde m=0 a 5 y R=colesterol o adamantano; o R-OCO(C2H4O)mCH2CO2H (Fórmula 5), en donde m=0 a 5; CH3(CH^-CH=CH)6(CH2)2CH2(OC2H4)mOH (Fórmula 6), en donde m=0 a 7; y CH3(CH^-CH=CH)6(CH2)2Cx(OC2H4)mOH (Fórmula 7), en donde m=1 a 7 y X=N o O.

62.- El conjugado oligómero-fármaco anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un péptido seleccionado del grupo que consiste de: Ac-Phe-Arg-Trp-Trp-Tyr-Lys— NH2; Ac-Arg-Trp-lle-Gly-Trp-Lys— NH2; Trp-Trp-Pro-Lys-His-Xaa — NH , en donde Xaa es un aminoácido que ocurre naturalmente; Trp-Trp-Pro-Xaa — NH2, en donde Xaa es Lys o Arg; Tyr-Pro-Phe-Gly-Phe-Xaa — NH2, en donde Xaa es un aminoácido que ocurre naturalmente; (D)lle-(D)Met- (D)Ser-(D)Trp-(D)Trp-Glyn-Xaa — NH2, en donde n es 0 ó 1 y en donde Xaa es Gly o la forma D de un aminoácido que ocurre naturalmente; (D)lle-(D)Met-(D)Thr-(D)Trp-Gly-Xaa — NH2, en donde Xaa es Gly o la forma D de un aminoácido que ocurre naturalmente; Try-A1-B2-C3 — NH2, en donde A1 es (D)Nve o (D)Nle, B2 es Gly, Phe, o Trp, y C3 es Trp o Nap; Pm y red{MexHy-Tyr-(Nme)z-Tyr-Xaaz — NH2}, x es 0, 1 , ó 2, y es 0,1 , ó 2, y z es 0 ó 1 , y en donde Xaa es Phe, (D)Phe, o NHBzl, con la condición de que x e y juntas nunca sean mayor que 2; y Trp-Trp-Pro-D4-Hisz-Xaaz — NH2; en donde z es 0 ó 1 , en donde D4 es Lys o Arg, y en donde Xaa es un aminoácido que ocurre naturalmente.

63.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un péptido seleccionado del grupo que consiste de: Ac-Phe-Arg-Trp-Tyr-Lys — NH2; Ac-Arg-Trp-lle-Gly-Trp-Lys — NH2; Trp-Trp-Pro-Lys-His-Xaa — NH2; en donde Xaa es un aminoácido que ocurre naturalmente; Trp-Trp-Pro-Xaa — NH2, en donde Xaa es Lys o Arg; Tyr-Pro-Phe-Gly-Phe-Xaa — NH2, en donde Xaa es un aminoácido que ocurre naturalmente; (D)lle-(D)Met-(D)Ser-(D)Trp-(D)Trp-Glyn-Xaa — NH2, en donde n es 0 ó 1 y en donde Xaa es Gly o la forma D de un aminoácido que ocurre naturalmente; (D)lle-(D)Met-(D)Thr-(D)Trp-Gly-Xaa — NH2, en donde Xaa es Gly o la forma D de un aminoácido que ocurre naturalmente; Tyr-A1 -B2-C3— NH2, en donde A1 es (D)Nve o (D)Nle, B2 es Gly, Phe, o Trp, y C3 es Trp o Nap; Pm y red {MexHy-Tyr-(Nme)z-Tyr-Xaaz — NH2), X es 0,1 , ó 2, Y es 0, 1 , ó 2, y Z es 0 ó 1 , y en donde Xaa es Phe, (D)Phe, (D)Phe, o NHBzl con la condición de que x e y juntas nunca sean mayor que 2; Trp-Trp-Pro-D4-Hísz-Xaaz — NH2, en donde z es 0 ó 1 , en donde D4 es Lys o Arg, y en donde Xaa es un aminoácido que ocurre naturalmente.

64.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un opioíde.

65.- El conjugado de fármaco-oligómero anfifílico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto terapéutico es una encefalina.

66.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es una agonista, antagonista o agonista parcial/antagonista parcial receptor de opioide.

67.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es una encefalina.

68.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un agonista, antagonista o agonista parcial/antagonista parcial receptor de opioíde.

69.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es una encefalina.

70.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es un opioide.

71.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque el compuesto terapéutico es una encefalina.

72.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque el receptor es un receptor de opioide.