KR20230052289A - Egfr 양성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Egfr 양성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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줄윤 오
한 쉬
칼 알렉산더 캄
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에이투 바이오쎄라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 제1 활성화제 수용체 및 제2 억제 수용체를 포함하는 면역 세포, 및 암의 치료를 위해 이를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.

Description

EGFR 양성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 2020년 8월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 63/068,249; 2020년 10월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 63/105,639; 및 2021년 8월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 63/230,632에 대한 우선권을 주장하고, 각각의 내용은 전체가 참조로 본원에 포함된다.
기술 분야
본 출원은 일반적으로 세포 요법 적용에 사용하기 위한 조작된 수용체 및 상기 수용체를 포함하는 면역 세포 조성물에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
서열 목록 단락 출원서는 EFS-WEB를 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 포함하며 이로써 전체가 참조로 포함된다. 2021년 8월 17일에 생성된 상기 ASCII 본의 이름은 A2BI_021_02WO_SeqList_ST25.txt이고 675 KB 크기이다.
세포 요법은 다양한 질병, 특히 암 치료를 위한 강력한 도구이다. 기존의 입양 세포 요법에서, 면역 세포는 특정 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 조작되며, 이는 수용체와 표적 세포에 의해 발현되는 리간드의 상호작용을 통해 면역 세포의 활성을 세포 표적으로 유도한다. 많은 표적이 정상 조직에서 발현되기 때문에 적합한 표적 분자를 식별하는 것은 여전히 어려운 일이다. 이 발현은 이식된 세포가 표적 분자를 발현하는 정상 조직을 표적으로 할 때 독성을 유발할 수 있다. 따라서, 입양 세포 요법에 의한 질환, 특히 암의 치료에 유용한 조성물 및 방법이 당업계에 필요하다.
본 개시내용은 입양 세포 요법에 사용되는 면역 세포의 특이성을 증가시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시내용은 표적 항원을 발현하는 표적 세포에 대해 면역 세포의 특이성을 증가시키는 2-수용체 시스템을 포함하는 면역 세포를 제공한다. 면역 세포는 표적 항원에 의한 제1 수용체의 결합에 반응하여 면역 세포를 활성화시키는 제1 활성화제 수용체를 포함한다. 면역 세포는 비-표적 항원에 특이적인 제2 억제 수용체를 추가로 포함한다. 이 제2 수용체는 제1 수용체가 표적 항원과 결합하더라도 제2 수용체가 비-표적 항원과 결합하면 면역세포의 활성화를 억제한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 a.) 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 수용체; 및 b.) 이형접합성의 소실로 인해 EGFR+ 암에서 소실된 비-표적 항원에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 수용체를 포함하는 면역 세포를 제공하며, 여기서 제1 수용체는 EGFR에 반응하는 활성화제 수용체이고; 여기서 제2 수용체는 비-표적 항원에 반응하는 억제 수용체이다.
일부 구현예에서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 MHC 단백질의 대립형질 변이체에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C 단백질의 대립형질 변이체에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 HLA-A*02에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*11, HLA-C*07, 또는 HLA-B*07에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 표 5에 개시된 바와 같은 상보성 결정 영역 (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3; 또는 표 5의 CDR에 비해 최대 1, 2 또는 3개의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 CDR 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 101-106 또는 서열 번호 106-112의 상보성 결정 영역 (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3; 또는 표 5의 CDR에 비해 최대 1, 2 또는 3개의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 CDR 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 표 4에 개시된 폴리펩티드 서열로부터 선택된 폴리펩티드 서열; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 89-100 중 하나; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 표 3에 제시된 서열 그룹으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 (HC-CDR) 세트를 포함하는 가변 중쇄 (VH) 부분; 및/또는 표 3에 제시된 서열 그룹의 경쇄 상보성 결정 영역 (LC-CDR) 세트를 포함하는 가변 경쇄 (VL) 부분; 또는 각각의 CDR에서 최대 1, 2, 3, 4개의 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 CDR 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 표 2에 제시된 VH 서열로부터 선택된 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH) 부분; 및/또는 표 2에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 부분; 또는 이에 대해 적어도 70%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 표 1에 제시된 서열 그룹으로부터 선택된 서열; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 9-18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 scFv 서열; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 수용체는 LILRB1 세포 내 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 LILRB1 세포 내 도메인은 서열 번호 129에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한, 또는 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 133에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 수용체는 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 LILRB1 힌지 도메인은 서열 번호 132, 서열 번호 125, 서열 번호 126에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 수용체는 LILRB1 세포 내 도메인, LILRB1 막관통 도메인, LILRB1 힌지 도메인, 이들 중 임의의 것의 기능적 변이체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 LILRB1 세포 내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인은 서열 번호 128 또는 서열 번호 128에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 EGFR+ 암 세포는 폐암 세포, 소세포 폐암 세포, 비-소세포 폐암 세포, 췌관 암종 세포, 결장직장암 세포, 두경부암 세포, 식도 및 위 선암종 세포, 난소암 세포, 다형성 교모세포종 세포, 자궁경부 편평 세포 암종 세포, 신장암 세포, 유두상 신장암 세포, 신장 투명 세포 암종 세포, 방광암 세포, 유방암 세포, 담관암 세포, 간암 세포, 전립선암 세포, 육종 세포, 갑상선암 세포, 흉선암 세포, 위암 세포, 또는 자궁암 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 EGFR+ 암 세포는 HLA-A*02를 발현하지 않는 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포; 또는 HLA-A*02를 발현하지 않는 HLA-A*02+ 개체로부터 유래된 암 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포는 HLA-A*02의 소실을 야기하는 HLA-A에서의 이형접합성의 소실에 의해 EGFR+/HLA-A*02+ 세포로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체 및 제2 수용체는 함께 이형접합성을 소실한 EGFR/HLA-A*02- 암 세포의 존재 하에 면역 세포를 특이적으로 활성화시킨다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체 및 제2 수용체는 함께 이형접합성 소실에 의해 HLA-A*02를 소실하지 않은 EGFR+ 세포의 존재 하에 면역 세포를 특이적으로 활성화시키지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 T 세포, 대식세포, NK 세포, iNKT 세포, 또는 감마 델타 T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 CD8+ CD4- T 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 MHC 클래스 I 유전자의 감소된 또는 제거된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 MHC 클래스 I 유전자는 베타-2-마이크로글로불린 (B2M)이다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 간섭 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 간섭 RNA는 B2M mRNA의 서열 (서열 번호 172)에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 간섭 RNA는 B2M mRNA의 RNAi-매개 분해를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 간섭 RNA는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)이다. 일부 구현예에서, 상기 shRNA는 a.) 5' 말단에서 3' 말단으로 B2M mRNA의 서열에 상보적인 서열을 갖는 제1 서열; 및 b.) 5' 말단에서 3' 말단으로 제1 서열에 상보적인 서열을 갖는 제2 서열을 포함하고, 여기서 제1 서열 및 제2 서열은 shRNA를 형성한다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 B2M을 암호화하는 서열 (서열 번호 170)에 대한 하나 이상의 변형을 포함하며, 여기서 하나 이상의 변형은 B2M의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 제거한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 B2M을 암호화하는 내인성 유전자의 하나 이상의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 불활성화 돌연변이는 결실, 삽입, 치환 또는 프레임이동 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 불활성화 돌연변이는 B2M을 암호화하는 내인성 유전자의 서열 (서열 번호 170)을 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 핵산 (gNA)과의 복합체에서 핵산 유도 엔도뉴클레아제와 함께 도입된다.
일부 구현예에서, 상기 MHC 클래스 I 유전자는 HLA-A*02이다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 HLA-A*02 mRNA의 서열 (서열 번호 171)에 상보적인 서열을 포함하는 간섭 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 간섭 RNA는 HLA-A*02 mRNA의 RNA 간섭 (RNAi)-매개 분해를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 간섭 RNA는 a.) 5' 말단에서 3' 말단으로 HLA-A*02 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 갖는 제1 서열; 및 b.) 5' 말단에서 3' 말단으로 제1 서열에 상보적인 서열을 갖는 제2 서열을 포함하는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)이고, 여기서 제1 서열 및 제2 서열은 shRNA를 형성한다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 HLA-A*02을 암호화하는 내인성 유전자의 서열 (서열 번호 169)에 대해 하나 이상의 변형을 포함하고, 여기서 하나 이상의 변형은 HLA-A*02의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 제거한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 HLA-A*02를 암호화하는 유전자의 하나 이상의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 불활성화 돌연변이는 결실, 삽입, 치환 또는 프레임이동 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 불활성화 돌연변이는 HLA-A*02를 암호화하는 내인성 유전자의 서열을 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 핵산 (gNA)과의 복합체에서 핵산 유도 엔도뉴클레아제와 함께 도입된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체는 서열 번호 177, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 174 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체는 서열 번호 177, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체는 서열 번호 175, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 174, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체는 서열 번호 175, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체는 서열 번호 176, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 수용체는 서열 번호 176, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 T2A 자가 절단 펩티드를 추가로 포함하고, 여기서 T2A 자가 절단 펩티드는 서열 번호 178, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 간섭 RNA를 추가로 포함하고, 여기서 간섭 RNA는 서열 번호 179, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 자가 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 동종이계이다.
한 양태에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 본원에 기재된 면역 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 제1 수용체 및 제2 수용체 모두를 발현한다. 일부 구현예에서, 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 면역 세포가 제1 수용체 및 제2 수용체 모두를 발현한다. 일부 구현예에서, 적어도 90%의 면역 세포가 제1 수용체 및 제2 수용체 모두를 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학 조성물은 EGFR+ 암의 치료에서 약제로 사용하기 위한 것이다.
한 양태에서, 본 개시내용은 다음을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템을 제공하며: a.) 내피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 수용체; 및 b.) 이형접합성의 소실로 인해 EGFR+ 암 세포에서 소실된 비-표적 항원에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 수용체, 여기서 제1 수용체는 EGFR+ 암세포 상의 EGFR에 반응하는 활성화제 수용체이고; 여기서 제2 수용체는 비표적 항원에 반응하는 억제 수용체이다.
한 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 면역 세포를 생성하는데 사용하기 위한 제1 수용체 및 제2 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템을 제공한다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템의 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 B2M에 특이적인 shRNA를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체, 제2 수용체, 및 B2M에 특이적인 shRNA를 암호화하는 서열은 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
한 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 유효량의 본원에 기재된 면역 세포 또는 본원에 기재된 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, MHC 클래스 I 유전자좌에서 이형접합성이 소실된 EGFR+ 암 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 EGFR+ 암 세포는 폐암 세포, 소세포 폐암 세포, 비-소세포 폐암 세포, 췌관 암종 세포, 결장직장암 세포, 두경부암 세포, 식도 및 위 선암종 세포, 난소암 세포, 다형성 교모세포종 세포, 자궁경부 편평 세포 암종 세포, 신장암 세포, 유두상 신장암 세포, 신장 투명 세포 암종 세포, 방광암 세포, 유방암 세포, 담관암 세포, 간암 세포, 전립선암 세포, 육종 세포, 갑상선암 세포, 흉선암 세포, 위암 세포, 또는 자궁암 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR+ 암 세포는 폐암 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 EGFR+ 암 세포는 HLA-A*02를 발현하지 않는 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포; 또는 HLA-A*02를 발현하지 않는 HLA-A*02+ 개체로부터 유래된 암 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포는 HLA-A*02의 소실을 야기하는 HLA-A에서 이형접합성의 소실로 인해 EGFR+/HLA-A*02+ 세포로부터 유래된다.
한 양태에서, 본 개시내용은 유효량의 본원에 기재된 면역 세포 또는 본원에 기재된 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 비-표적 항원을 암호화하는 유전자좌에서 이형접합성의 소실을 갖는 EGFR+ 종양을 갖는 대상체에서 EGFR+ 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 EGFR을 발현하고 HLA-A*02 발현을 상실한 악성종양을 갖는 이형접합 HLA-A*02 환자이다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 EGFR을 발현하고 HLA-A*02 발현을 상실한 재발성 절제 불가능 또는 전이성 고형 종양을 갖는 이형접합 HLA-A*02 환자이다.
한 양태에서, 본 개시내용은 다음 단계를 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다: a.) 대상체의 비-악성 세포 및 암 세포에서 비-표적 항원의 유전자형 또는 발현 수준을 결정하는 단계; b.) 대상체의 암 세포에서 EGFR의 발현 수준을 결정하는 단계; 및 c.) 비-악성 세포가 비-표적 항원을 발현하고 암 세포가 비-표적 항원을 발현하지 않고, 암세포는 EGFR 양성이면 유효량의 본원에 기재된 면역 세포 또는 본원에 기재된 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역 세포 또는 본원에 기재된 약학 조성물의 투여는 대상체에서 종양의 크기를 감소시킨다.
일부 구현예에서, 상기 종양은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 종양은 제거된다.
일부 구현예에서, 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여는 대상체에서 종양의 성장을 정지시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역 세포 또는 본원에 기재된 약학 조성물의 투여는 대상체에서 종양의 수를 감소시킨다.
일부 구현예에서, 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여는 암 세포를 선택적으로 사멸시키지만 대상체에서 정상 세포는 사멸시키지 않는다. 일부 구현예에서, 사멸된 세포의 적어도 약 60%는 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 65%는 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 70%는 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 75%는 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 80%는 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 85%는 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 90%는 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 95%는 암세포이고, 또는 사멸된 세포의 약 100%가 암세포이다.
일부 구현예에서, 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여는 대상체의 암 세포의 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 전부를 사멸시킨다. 일부 구현예에서, 상기 암 세포는 폐암 세포, 소세포 폐암 세포, 비-소세포 폐암 세포, 췌관 암종 세포, 결장직장암 세포, 두경부암 세포, 식도 및 위 선암종 세포, 난소암 세포, 다형성 교모세포종 세포, 자궁경부 편평 세포 암종 세포, 신장암 세포, 유두상 신장암 세포, 신장 투명 세포 암종 세포, 방광암 세포, 유방암 세포, 담관암 세포, 간암 세포, 전립선암 세포, 육종 세포, 갑상선암 세포, 흉선암 세포, 위암 세포, 또는 자궁암 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여는 제1 활성화제 수용체를 포함하지만 제2 억제 수용체를 포함하지 않는 다른 동등한 면역 세포의 투여보다 대상체에 대해 더 적은 부작용을 초래한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 a.) 다수의 면역 세포를 제공하는 단계, 및 b.) 다수의 면역 세포를 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 시스템, 또는 본원에 기재된 벡터로 형질전환시키는 단계를 포함하는, 다수의 면역 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 면역 세포 또는 본원에 기재된 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 사용 설명서를 추가로 포함한다.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 실행된 도면이 적어도 하나 포함되어 있다. 컬러 드로잉(들)이 포함된 이 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 사무소에서 제공된다.
도 1a는 EGFR CAR 활성화제 및 HLA-A*02 LIR-1 차단제를 발현하는 저캇 세포가 EGFR+/HLA-A*02- HeLa 표적 세포에 의해 활성화되지만 EGFR+/HLA-A*02+ HeLa 표적 세포에 의해 활성화되지 않음을 나타내는 플롯이다.
도 1b는 저캇 세포 상의 활성화제 (CT479) 및 차단제 (C1765) 수용체의 발현을 나타내는 한 쌍의 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 플롯이다.
도 1c는 HeLa 세포 상의 활성화제 항원 (EGFR) 및 차단제 항원 (HLA-A*02)의 발현을 나타내는 한 쌍의 플롯이다. HLA-A*02 발현은 BB7.2 항체를 사용하여 검출하였다.
도 2a는 HLA-A*02, 및 HCT116 세포로 형질도입된 HeLa 세포 상의 HLA-A*02의 발현을 나타낸다. HeLa 및 HCT1116 세포는 항-HLA-A2 항체 BB7.2로 표지되고 FAC 분류하였다. 녹색: 표지되지 않은 HeLa; 주황색: 표지되지 않은 HCT116; 파란색: BB7.2로 표지된 야생형 HCT116; 빨간색: HLA-A*02로 형질도입되고 BB7.2로 표지된 HeLa 세포.
도 2b는 HeLa 세포 및 HCT116 세포 상의 EGFR의 발현을 나타낸다. HeLa 및 HCT1116 세포는 항-EGFR 항체로 표지되었다. 녹색: 표지되지 않은 HeLa; 주황색: 표지되지 않은 HCT1116; 파란색: 항-EGFR로 표지된 야생형 HCT116; 빨간색: HLA-A*02로 형질도입되고 항-EGFR로 표지된 HeLa 세포.
도 3a는 HCT116 표적 세포를 공동 배양할 때, EGFR CAR을 발현하는 저캇 세포의 EGFR CAR 활성화를 나타낸다.
도 3b는 저캇 세포의 EGFR CAR 활성화가 HLA-A*02 LIR-1 억제 수용체에 의해 차단될 수 있음을 보여준다. 저캇 세포에 의한 EGFR CAR 및 HLA-A*02 LIR-1 억제 수용체의 공동 발현은 저캇 세포가 EGFR 및 HLA-A*02를 발현하는 HCT116 표적 세포와 함께 제시될 때 대략 1.8x의 CAR EMAX 이동을 유도한다.
도 3c는 HeLa 표적 세포와 함께 공동-배양될 때, EGFR CAR를 발현하는 저캇 세포의 EGFR CAR 활성화를 나타낸다.
도 3d는 저캇 세포의 EGFR CAR 활성화가 HLA-A*02 LIR-1 억제 수용체에 의해 차단될 수 있음을 보여준다. 저캇 세포에 의한 EGFR CAR 및 HLA-A*02 LIR-1 억제 수용체의 공동 발현은 저캇 세포가 EGFR 및 HLA-A*02를 발현하는 HeLa 표적 세포와 함께 제시될 때 대략 5.4x의 CAR EMAX 이동을 유도한다.
도 4a는 활성화제 항원의 최적량을 결정하기 위한 비드 기반 검정에서 활성화제 항원의 적정을 보여준다.
도 4b는 활성화제 대 차단제 항원의 최적 비율을 결정하기 위한 비드 기반 검정에서 차단제 항원의 적정을 보여준다.
도 5는 HLA-A*02 scFv LIR1 억제제가 1차 T 세포에서 상이한 EGFR scFv CAR 활성화제와 함께 사용될 때 상이한 차단 정도가 관찰됨을 보여주는 일련의 플롯 및 표이다.
도 6a는 2개의 상이한 HLA-A*02 scFv LIR1 억제제가 1차 T 세포에서 상이한 EGFR scFv CAR 활성화제와 함께 사용될 때 상이한 차단 정도가 관찰됨을 보여주는 일련의 플롯이다.
도 6b는 상이한 쌍의 활성화 및 억제 수용체가 공동-발현될 때 활성화 및 억제 수용체의 민감도를 나타내는 일련의 플롯이다. 활성화제 또는 비-표적 항원의 양은 mRNA 적정에 의해 표적 세포에서 다양하다.
도 6c는 EGFR 표적화 활성화제 수용체 및 인간화 억제 수용체 또는 마우스 억제 수용체를 발현하는 세포에 의한 표적 세포의 최대 특이적 사멸 (%)을 나타내는 일련의 차트이다. 표적 종양 세포 대 정상 세포의 선택성 비율은 또한 활성화제 및 억제 수용체의 각 쌍에 대해 나타낸다.
도 7은 HeLa 세포와 1:1 비율로 공동 배양된 EGFR scFv CAR, 또는 EGFR scFv Car 및 HLA-A*02 scFv LIR1 억제 수용체를 발현하는 T 세포의 세포독성을 나타내는 일련의 플롯이다. A 종양 세포: HLA-A*02가 아닌 EGFR를 발현하는 HeLa 세포; AB 정상 세포: HeLa 세포 발현 EGFR 및 HLA-A*02; A-B- 정상 세포: EGFR 또는 HLA-A*02를 발현하지 않는 HeLa 세포; B 정상 세포: EGFR이 아닌 HLA-A*02를 발현하는 HeLa 세포. Y 축은 분석에서 건강한 HeLa 세포에 비례하는 녹색 영역을 나타낸다. UTD: 형질도입되지 않음.
도 8은 차단제 및 활성화제 수용체를 발현하는 1차 T 세포의 농축 (상단 열), EGFR scFv CAR, 또는 EGFR scFv CAR 및 HLA-A*02 scFv LIR1 억제 수용체를 발현하는 이들 T 세포의 세포독성 활성을 나타내는 일련의 플롯이고, EGFR (표적 A), 또는 EGFR 및 HLA-A*02 (표적 AB)를 발현하는 HeLa 세포와 1:1로 혼합했다.
도 9는 EGFR scFv CAR, 또는 EGFR scFv CAR 및 HLA-A*02 scFv LIR1 억제 수용체를 발현하는 T 세포의 세포독성을 보여주는 일련의 플롯이며, 이는 EGFR, HLA-A*02, 또는 둘 다 발현하는 HeLa 세포와 1:1로 혼합되었다. A 종양 세포: HLA-A*02가 아닌 EGFR을 발현하는 HeLa 세포; AB 정상 세포: EGFR 및 HLA-A*02를 발현하는 HeLa 세포; B 정상 세포: EGFR이 아닌 HLA-A*02를 발현하는 HeLa 세포. Y축은 분석에서 건강한 HeLa 세포에 비례하는 녹색 영역을 나타낸다. UTD: 형질도입되지 않음.
도 10은 EGFR scFv CAR, 또는 EGFR scFv CAR 및 HLA-A*02 scFv LIR1 억제 수용체를 발현하는 T 세포의 세포독성을 보여주는 일련의 플롯이며, 이는 EGFR (표적 A) 또는 EGFR 및 HLA-A*02 (표적 AB)를 발현하는 HCT.116 세포와 1:1로 혼합되었다.
도 11a는 상이한 EGFR scFv CAR 및 HLA-A*02 scFv LIR1 억제제를 발현하는 T 세포와 EGFR 활성화제 단독 (표적 A), 억제제 표적 단독 (표적 B) 또는 활성화제 및 억제제 표적 (표적 AB)을 발현하는 HeLa 세포의 배양 후 T 세포에 의한 EGFR scFv CAR 활성화제 수용체의 발현을 나타내는 일련의 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 플롯이다.
도 11b는 표적 세포에 노출되기 전, 및 활성화제 리간드 단독 발현하는 표적 세포 (표적 A), 또는 활성화제 및 차단제 리간드를 모두 발현하는 표적 세포 (표적 AB)와의 공동 배양 120시간 후 정량 활성화제 수용체 발현을 나타내는 플롯이다.
도 12a는 EGFR (표적 A), HLA-A*02 (표적 B)를 발현하는 HeLa 세포의 집단, 동일한 세포 상의 EGFR 및 HLA-A*02의 조합 (표적 AB), 상이한 세포 상에 표적 A 및 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단, 또는 상이한 세포 상에 표적 B 및 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단과의 공동 배양 후 EGFR scFv CAR (CT-482) 활성화제 및 HLA-A*02 scFv LIR1 억제제 (C1765)를 발현하는 T 세포 상의 활성화제 수용체의 세포 표면 발현을 나타내는 플롯이다.
도 12b는 EGFR (표적 A), HLA-A*02 (표적 B)를 발현하는 HeLa 세포의 집단, 동일한 세포 상의 EGFR 및 HLA-A*02의 집단 (표적 AB), 상이한 세포 상에 표적 A 및 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단, 또는 상이한 세포 상에 표적 B 및 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단과의 공동 배양 후 EGFR scFv CAR (CT-482) 활성화제 및 HLA-A*02 scFv LIR1 억제제 (C1765)를 발현하는 T 세포 상의 억제 수용체의 세포 표면 발현을 나타내는 플롯이다.
도 13은 T 세포에 의한 세포독성 또는 차단 활성이 가역적인지 알아보기 위한 실험도이다.
도 14a는 세포독성 및 차단 활성이 가역적이고 활성화제 표면 발현에 상응함을 보여주는 일련의 플롯이다. T 세포는 1 라운드에서 EGFR+/HLA-A2+ 표적 세포와 공동 배양된 다음, 다음 라운드에서 교대 표적 세포로 전환했다. 상단: T 세포에 의한 표적 HeLa 세포의 사멸 퍼센트가 표시된다. 하단: FACS에 의해 분석된 활성화제 및 억제 수용체 발현.
도 14b는 세포독성 및 차단 활성이 가역적이고 활성화제 표면 발현에 상응함을 보여주는 일련의 플롯이다. T 세포는 1 라운드에서 EGFR+/HLA-A2- 표적 세포와 공동 배양한 다음, 다음 라운드에서 교대 표적 세포로 전환했다. 상단: T 세포에 의한 표적 HeLa 세포의 사멸 퍼센트가 표시된다. 하단: FACS에 의해 분석된 활성화제 및 억제 수용체 발현.
도 15a는 세포 표면 상의 EGFR 활성화제 CAR의 발현이 활성화제 및 억제제 리간드를 모두 발현하는 표적 세포의 존재에 의해 가역적으로 하향 조절됨을 보여주는 플롯이다.
도 15b는 활성화제만 표적 세포가 존재하거나, 활성화제 및 차단제 표적을 발현하는 표적 세포가 존재하지 않을 때 세포 표면 상의 EGFR 활성화제 CAR 발현이 신속하게 회복됨을 보여주는 일련의 플롯이다.
도 16은 비드 기반 검정을 사용하여 EGFR scFv CAR을 발현하는 저캇 세포의 활성화가 활성화제 및 억제제 항원이 시스로 비드 상에 존재하지만, 활성화제 및 억제제 항원이 트랜스로 비드 상에 존재하지 않을 때 pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체에 의해 차단될 수 있음을 보여준다.
도 17a는 EGFR scFv CAR에 의한 저캇 세포의 활성화가 HLA-A*02를 발현하지 않는 SiHa 세포 (SiHa WT)에 의해서가 아니라, HLA-A*02를 발현하는 SiHa 표적 세포 (SiHa A02)를 사용하여 pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체에 의해 차단될 수 있음을 보여준다.
도 17b는 EGFR scFv CAR에 의한 저캇 세포의 활성화가 HLA-A*02를 발현하지 않는 HeLa 세포 (HeLa WT)에 의해서가 아니라, HLA-A*02를 발현하는 HeLa 표적 세포 (HeLa A02)를 사용하여 pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체에 의해 차단될 수 있음을 보여준다.
도 18은 잠재적인 비-표적 항원 후보 유전자를 확인하기 위해 사용되는 생물정보학 검색 과정을 나타낸 도면이다.
도 19는 생체 내 활성화제 수용체 및 억제 수용체를 표적으로 하는 EGFR을 발현하는 면역 세포의 효능 및 선택성을 결정하기 위한 실험 설계를 나타내는 도면이다.
도 20a는 HLA-A*11을 암호화하는 mRNA로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하는 mRNA 적정 검정에서 저캇 NFAT 루시퍼라제 (JNL) 세포 억제를 나타내는 플롯이다. HeLa 세포는 연속 희석된 HLA-A*11 mRNA로 형질감염되었고, JNL 세포는 scFv HLA-A*11 #4와 함께 EGFR 활성화 CAR +/- HLA-A*11 억제 수용체로 일시적으로 형질감염되었다. 기능적 반응은 6시간 공동 배양 후 평가되었다.
도 20b는 HLA-A*11 #4를 사용한 억제 수용체의 분자/세포 민감도 (IC50)를 나타낸다.
도 21은 HLA-B*07-scFv-LIR1 억제 수용체가 공동-발현된 EGFR 표적화 활성화제 수용체에 의해 매개되는 면역 세포 활성화를 억제한다는 것을 보여주는 플롯이다.
도 22는 본원에 개시된 벡터를 포함하는 1차 T 세포에서 EGFR 활성화제 수용체 (EGFR-CAR 단독) 및 EGFR 활성화제/HLA-A 억제 수용체 쌍의 발현을 나타내는 일련의 플롯이다. 하나 또는 두 개의 수용체를 발현하는 세포의 백분율은 농축 전 (전 농축)과 농축 후 (후 농축)로 표시되며 농축은 수용체를 발현하는 세포를 선택한다. 수용체 쌍은 두 개의 개별 벡터 (이중 벡터) 또는 하나의 벡터 (단일 벡터)로 표현된다.
도 23a는 EGFR 활성화제 수용체 및 HLA-A*02 scFv LIR1 억제제 수용체를 발현하는 면역 세포에 의한 HeLa 표적 세포 또는 HCT116 표적 세포의 특이적 사멸 백분율을 나타내는 일련의 플롯이다. 표적 세포는 EGFR 항원 (A)을 발현하거나, EGFR 항원 및 HLA-A*02 비-표적 항원 (B) 모두 발현한다. 활성화제/억제제 수용체 쌍을 발현하는 면역 세포를 1:1 비율로 표적 세포와 함께 배양하였다.
도 23b는 암 세포 및 정상 세포의 혼합 배양물에서 EGFR 활성화제 수용체 및 HLA-A*02 scFv LIR1 억제제 수용체를 발현하는 면역 세포에 의한 표적 세포의 특이적 선택적 사멸을 보여주는 플롯 및 일련의 이미지이다. UTD = 활성화제 또는 억제제 수용체가 없는 면역 세포; CAR = 활성화제 수용체만을 발현하는 면역 세포; Tmod = 활성화제 및 억제제 수용체를 모두 발현하는 면역 세포. 오른쪽 이미지에서: 녹색 = 정상 세포; 빨간색 = 종양 세포.
도 24는 EGFR 활성화제 수용체 (CAR) 또는 EGFR 활성화제 수용체 및 HLA-A*02 억제제 수용체 (Tmod)를 발현하는 저캇 세포 (효과기)에서 선택적 세포 활성화를 나타내는 차트이다. 저캇 세포는 EGFR 발현 유무에 관계없이 HLA-A*02를 발현하는 표적 세포주의 패널과 함께 배양되었다. Tmod 저캇 효과기 세포는 HLA-A*02를 발현하는 세포의 EGFR.을 발현하지 않는 표적 세포와 공동 배양했을 때 오프-타겟 활성화를 나타내지 않았다.
암과 정상 세포 사이의 리간드의 유전자 발현 차이에 반응하는 2개의 수용체 시스템을 포함하는 면역 세포를 사용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 발현의 이러한 차이는 암 세포의 이형접합성 소실로 인한 것일 수 있다. 대안적으로, 발현의 차이는 유전자 발현이 암세포에서 발현되지 않거나 정상 세포보다 낮은 수준으로 암세포에서 발현되기 때문일 수 있다. 2-수용체 시스템은 면역 세포, 예를 들어 입양 세포 요법에 사용되는 면역 세포에서 발현되며, 이형접합성의 소실 또는 발현 차이를 나타내는 암세포에 대한 이들 면역 세포의 활성을 표적으로 한다. 이 2개의 수용체 시스템에서, 제1 수용체 (활성화제 수용체, 때때로 여기에서 A 모듈로 언급됨)는 면역 세포의 활성화 또는 활성화를 촉진하는 반면, 제2 수용체 (억제 수용체, 때때로 여기에서 차단제, 또는 억제제 수용체, 또는 B 모듈로 언급됨)는 제1 수용체에 의한 면역 세포의 활성화를 억제하는 작용을 한다. 각각의 수용체는 특정 리간드에 결합하는 리간드 결합 도메인 (LBD)을 함유한다. 리간드 결합 시 두 수용체로부터의 신호는 면역 세포에 의해 통합된다. 예를 들어, 암 세포에서 억제 리간드를 암호화하는 유전자좌의 이형접합성 소실 또는 전사 수준의 차이를 통해, 암 및 정상 세포에서 제1 및 제2 수용체에 대한 리간드의 차등적 발현은 제1 활성화제 리간드를 발현하지만 제2 억제 리간드를 발현하지 않는 표적 암 세포에 의한 면역 세포의 활성화를 매개한다.
본원에 제공된 조성물 및 방법의 특정 구현예에서, 본원에 기재된 2개의 수용체 시스템을 포함하는 면역 세포를 사용하여 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 양성 암을 치료한다. 이는 폐암, 교모세포종, 유방암, 두경부암 및 대장암을 포함한다. EGFR-양성 암의 경우, 활성화제 수용체의 표적 항원은 EGFR 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와 복합체에서, 이의 펩티드 항원이다. EGFR은 상피 조직, 간엽 조직, 신경 조직 등 다양한 정상 조직에서 발현되며, 세포 증식 및 분화, 뿐만 아니라 발달과 같은 정상 세포 과정에 중요한 역할을 한다. 특정 종양에서의 발현 때문에, EGFR은 이들 암 세포가 적절한 치료제로 특이적으로 표적화될 수 있다면 EGFR+ 종양의 선택적인 살상을 매개할 수 있는 매력적인 종양 특이적 항원이다. 그러나, 비-암 (비-표적) 세포에서의 정상 EGFR 발현은 입양 세포 요법과 같은 표적 요법을 위한 EGFR의 효과적인 사용을 방해했다. 피부 및 위장 독성은 EGFR 양성 암에서 EGFR의 효과적인 표적화를 방해했다. EGFR 활성화제 수용체를 억제 수용체와 페어링함으로써, 본원에서 제공되는 방법은 EGFR 표적 입양 세포 요법의 특이성을 증가시키고 용량 제한 독성과 같은 이러한 요법과 관련된 유해 효과를 감소시킨다.
일부 구현예에서, 활성화제에 대한 리간드는 MHC 클래스 I과 복합된 EGFR 펩티드이다. 본원에 기술된 방법에서, 이 EGFR 표적 활성화제 수용체는 억제 수용체와 쌍을 이루며, 정상 EGFR-양성 조직에서 세포 용해 효과를 차단함으로써 활성화제의 안전 창을 증가시킨다. 그러나, 활성화제 수용체는 종양 세포가 억제제, 또는 차단제, 수용체에 대한 리간드를 발현하지 않기 때문에, 2-수용체 시스템을 포함하는 면역 세포에 의한 종양 세포의 표적 사멸을 지시한다. 제2, 억제 수용체에 대한 표적은 상피 조직과 같은 EGFR 양성 조직에서 발현되지만, 암 세포에서는 발현되지 않으며, 억제 수용체는 이 "비-표적 항원"을 억제 자극으로 인식한다. 제2 억제 수용체에 대한 예시적인 표적은 폐 상피 조직에 의해 발현되고, 이형접합성 (LOH)으로 인해 EGFR 양성 암 세포에서 소실되어, 억제 수용체 상의 대립유전자 특이적 리간드 결합 도메인을 통해 다른 대립유전자와 구별될 수 있는 암 세포에서 단일 대립유전자 형태를 남긴다. 억제 수용체의 예시적인 표적은 인간 백혈구 항원 A (HLA-A), HLA-B, HLA-C, 및 다른 HLA와 같은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. HLA는 변이 유전자, 예를 들어 HLA-A*01., HLA-A*02, HLA*A03, HLA-C*07, 및 기타에 의해 암호화되고, 이형접합성의 소실을 통해 EGFR 양성 암 세포에서 소실될 수 있다. 대안적으로, 억제 수용체의 추가의 예시적인 표적은 콜렉틴 서브패밀리 구성원 12 COLEC12, APC 하향 조절 1 (APCDD1) 및 C-X-C 모티프 케모카인 리간드 16 (CXCL16)을 포함한다. 이들 각각은 항체에 접근할 수 있는 세포외 도메인의 아미노산 변경이 있는 일반적인 비동의 변이 형태를 가지고 있으며, 이는 EGFR 양성 암 환자를 EGFR 또는 EGFR pMHC 반응 활성화제 수용체와 같은 활성화제 수용체에 의해 활성화되는 조작된 T 세포로 안전하게 치료하도록 설계된 세포 통합체의 B 모듈 표적으로 사용될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 정상 조직에 의한 EGFR의 발현에 의해 유발되는 DLT를 감소시키거나 제거할 수 있다. 본 개시내용은 제2 리간드 (EGFR 이외의 리간드, "비-표적 항원"이라고 함)의 존재 하에 입양 면역 세포의 활성화를 차단하는 제2 억제 수용체를 첨가함으로써 입양 세포 요법을 사용하여 EGFR 양성 암을 치료하기 위해 암 세포에서 EGFR을 표적으로 하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여, EGFR을 발현하는 종양 세포는 이들 종양 세포가 활성화제 리간드, EGFR만을 발현하기 때문에 2 수용체를 발현하는 입양 면역 세포에 의해 공격받는다. 대조적으로, EGFR 플러스 비-표적 항원 (대안적으로 "차단제 항원"이라고 함)을 발현하는 정상 세포는 입양 면역 세포로부터 보호된다. 정상 세포의 비-표적 항원에 대한 억제 수용체 반응은 그렇게 함으로써 EGFR-표적화 활성화제 수용체에 의한 면역 세포의 활성화를 방지한다. 이 이중 표적 접근법은 EGFR-양성 암 환자에서 EGFR 지시 세포 요법을 안전하고 효과적으로 투약할 수 있는 치료 창을 만든다.
본 개시내용은 온-타겟 독성을 유도하는 강력한 EGFR CAR 및 TCR의 사용을 가능하게 하는 방법 및 조성물을 제공하고, 이들 EGFR 표적 수용체를 이들의 독성을 완화함으로써 치료제로서 유용하게 만든다.
변형으로, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 표적 세포를 사멸시키고/거나 비-표적 항원의 발현이 부분 유전자 결실, 후생적 침묵, 점 돌연변이, 절단을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 이형접합성의 소실 이외의 원인에 의해 부분적으로 또는 완전히 감소된 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
정의
본 개시내용을 보다 상세하게 설명하기 전에, 본원에서 사용되는 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 이를 이해하는 데 도움이 될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 특정 구현예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 조성물, 방법 및 재료의 바람직한 구현예가 본원에 기술되어 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 다음 용어는 아래에 정의된다. 추가적인 정의는 본 개시내용 전반에 걸쳐 제시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 만큼 변하는 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 한 구현예에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, 또는 ± 1% 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 범위를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 본래의 상태에서 일반적으로 동반하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 의미한다. 특정 구현예에서, 용어 "수득된" 또는 "유래된"은 단리된 것과 동의어로 사용된다.
용어 "대상체," "환자" 및 "개체"는 본원에서 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 조직, 세포, 및 생체 내에서 얻거나 시험관 내에서 배양한 생물학적 독립체의 자손도 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "대상체," "환자" 또는 "개체"는 본원에서 고려되는 벡터, 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 통증을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체 (예를 들어, 환자)는 실험동물 (예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 기니피그), 농장 동물 및 가축 또는 애완동물 (예를 들어 고양이 또는 개)을 포함한다. 비인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자가 포함된다.
본원에서 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은 임의의 유익하거나 바람직한 효과를 포함하며, 심지어 증상의 최소한의 개선도 포함할 수 있다. "치료"는 반드시 질환이나 병태 또는 관련 증상의 완전한 박멸이나 치유를 의미하지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "예방하다," 및 "예방된," "예방하는" 등과 같은 유사한 단어는 질환 증상의 가능성을 예방, 억제 또는 감소시키기 위한 접근법을 나타낸다. 또한, 질환 또는 병태의 발병 또는 재발을 지연시키거나 질환 증상의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "예방" 및 유사한 단어는 또한 개시 또는 재발 전에 질환의 강도, 영향, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "양"은 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 예방 또는 치료 결과를 달성하기 위한 바이러스의 "유효한 양" 또는 "유효량"을 지칭한다.
바이러스 또는 세포의 "치료적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 바이러스 또는 세포가 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 바이러스 또는 세포의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 더 큰 양이다. 용어 "치료적 유효량"은 대상체 (예를 들어, 환자)를 "치료"하는 데 효과적인 양을 포함한다.
예를 들어, 전기생리학적 활성 또는 세포 활성과 같은 생리학적 반응의 "증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 양이며, 처리되지 않은 세포의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상 (예를 들어, 500, 1000배) (1 이상의 모든 정수 및 소수점 포함, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등) 활성 수준 증가를 포함할 수 있다.
예를 들어, 전기생리학적 활성 또는 세포 활성과 같은 생리학적 반응의 "감소된" 또는 "줄어든" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 양이며, 처리되지 않은 세포의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상 (예를 들어, 500, 1000배) (1 이상의 모든 정수 및 소수점 포함, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등) 활성 수준 감소를 포함할 수 있다.
"유지하다," 또는 "보존하다," 또는 "유지," 또는 "변화없음," 또는 "실질적인 변화없음," 또는 "실질적인 감소 없음"은 일반적으로 두 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 의해 유발된 반응에 비교 가능한 생리학적 반응을 지칭한다. 비교 가능한 반응은 기준 반응과 크게 다르지 않거나 측정 가능한 차이가 없는 반응이다.
일반적으로, "서열 동일성" 또는 "서열 상동성"은 각각 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 지칭한다. 전형적으로, 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 결정 및/또는 그에 의해 암호화된 아미노산 서열 결정, 및 이들 서열을 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 이들의 "퍼센트 동일성"을 결정하여 비교할 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열이든, 두 서열의 퍼센트 동일성은 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 2개의 정렬된 서열 간의 정확한 일치 수이다. 퍼센트 동일성은 또한, 예를 들어, 국립보건연구원에서 구할 수 있는 버전 2.2.9를 포함한 고급 BLAST 컴퓨터 프로그램을 사용하는 서열 정보를 비교함으로써 결정할 수 있다. BLAST 프로그램은 Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)의 정렬 방법에 기초하고 Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin And Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993); 및 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)에서 논의된 바와 같다. 간략하게, BLAST 프로그램은 동일하게 정렬된 기호 (일반적으로 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 두 서열 중 더 짧은 기호의 총 수로 나눈 것으로 동일성을 정의한다. 이 프로그램은 비교되는 단백질의 전체 길이에 걸쳐 퍼센트 동일성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, blastp 프로그램에서 짧은 쿼리 시퀀스로 검색을 최적화하기 위해 기본 매개변수가 제공된다. 이 프로그램은 또한 Wootton and Federhen, Computers and Chemistry 17:149-163 (1993)의 SEG 프로그램에 의해 결정된 바와 같이 쿼리 시퀀스의 세그먼트를 마스크-오프하기 위해 SEG 필터의 사용을 허용한다. 원하는 정도의 서열 동일성의 범위는 약 80% 내지 100%이고 그 사이의 정수 값이다. 전형적으로, 개시된 서열과 청구된 서열 사이의 퍼센트 동일성은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드 시스템"은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 특정 적용을 위해 협력하여 작동하도록 또는 원하는 형질전환된 세포를 생성하도록 설계될 수 있다.
용어 "외인성"은 본원에서 유기체 외부로부터 기원하는 핵산, 단백질 또는 펩티드, 소분자 화합물 등을 포함하는 임의의 분자를 지칭하는 데 사용된다. 대조적으로, 용어 "내인성"은 유기체 내부로부터 기원하는 (즉, 유기체에 의해 자연적으로 생성되는) 임의의 분자를 지칭한다.
용어 "MOI"는 감염 다중도를 지칭하는 데 사용되고, 이는 감염 표적 (예를 들어 세포)에 대한 작용제 (예를 들어 바이러스 입자)의 비율이다.
본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 명시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수 값 및 적절한 경우 그의 분수 (예를 들어 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "표적 세포"는 입양 세포 요법에 의해 표적화된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 표적 세포는 입양 세포 요법의 이식된 T 세포에 의해 사멸될 수 있는 암 세포일 수 있다. 본 개시내용의 표적 세포는 본원에 기재된 바와 같이 표적 항원을 발현하고, 비-표적 항원을 발현하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비-표적 세포"는 입양 세포 요법에 의해 표적화되지 않는 세포를 지칭한다. 예를 들어, 암 세포를 표적으로 하는 입양 세포에서, 정상, 건강한 비암성 세포는 비표적 세포이다. 대상체의 일부 또는 모든 비표적 세포는 표적 항원과 비표적 항원을 모두 발현할 수 있다. 대상체의 비-표적 세포는 이러한 세포가 또한 표적 항원을 발현하는지에 관계없이 비표적 항원을 발현할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "표적 항원"은 항원이라는 용어를 사용하든 특정 항원의 이름을 사용하든 암 세포와 같은 표적 세포에 의해 발현되는 항원을 지칭한다. 표적 항원의 발현은 표적 세포에 국한되지 않는다. 표적 항원은 대상체에서 암 세포 및 정상, 비-암 세포 모두에 의해 발현될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비-표적 항원" (또는 "차단제 항원")은 항원이라는 용어를 사용하든 특정 항원의 이름을 사용하든 정상, 비-암 세포에서 발현되고 암 세포에서 발현되지 않는 항원을 지칭한다. 이러한 발현의 차이는 억제 수용체가 비표적 세포의 존재 하에서 면역 세포 활성화를 억제하도록 하지만 표적 세포의 존재 하에서는 그렇지 않다.
다형성은 모집단에서 뉴클레오티드 서열의 두 개 이상의 변이체의 존재를 지칭한다. 다형성은 하나 이상의 염기 변화, 삽입, 반복 또는 결실을 포함할 수 있다. 다형성은 예를 들어 단순 서열 반복 (SSR) 및 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함하고, 이는 아데닌 (A), 티민 (T), 시토신 (C) 또는 구아닌 (G)의 단일 뉴클레오티드가 변경될 때 발생하는 변이이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "친화도"는 수용체, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 수용체의 항원 결합 도메인에 대한 항원 상의 단일 리간드 결합 부위에 대한 리간드의 결합 강도를 지칭한다. 리간드 결합 도메인은 리간드와 더 약한 상호작용 (낮은 친화도) 또는 더 강한 상호작용 (높은 친화도)을 가질 수 있다.
Kd, 또는 해리 상수는 예를 들어, 수용체와 동족 리간드를 포함하는 거대분자 복합체가 리간드와 수용체로 분리되는 경우와 같이 더 작은 성분으로 가역적으로 분리되는 더 큰 물체의 성향을 측정하는 평형 상수의 한 유형이다. Kd 가 높다는 것은 수용체를 점유하기 위해서는 고농도의 리간드가 필요하고 리간드에 대한 수용체의 친화력이 낮다는 것을 의미한다. 반대로, 낮은 Kd는 리간드가 수용체에 대해 높은 친화도를 갖는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "반응하는" 또는 "에 반응하는" 수용체는 리간드 (즉 항원)에 의해 결합될 때 세포 내 도메인의 알려진 기능에 해당하는 신호를 생성하는 세포 내 도메인을 포함하는 수용체를 지칭한다. 표적 항원에 결합된 활성화제 수용체는 활성화제 수용체를 발현하는 면역 세포의 활성화를 유발하는 신호를 생성한다. 비-표적 항원에 결합된 억제 수용체는 활성화제 수용체를 발현하는 면역 세포의 활성화를 방지하거나 감소시키는 억제 신호를 생성할 수 있다. 수용체의 반응성 및 수용체를 발현하는 면역 세포를 활성화 또는 억제하는 능력은 리포터 분석 및 세포독성 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지되고 본원에 기술된 임의의 수단에 의해 분석될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 면역 세포의 "활성화" 또는 "활성화된" 면역 세포는 면역 반응의 특징적인 하나 이상의 기능을 수행할 수 있는 면역 세포이다. 이러한 기능에는 증식, 사이토카인 방출 및 세포독성, 즉 표적 세포의 사멸이 포함된다. 활성화된 면역 세포는 당업자에게 명백할 마커를 발현한다. 예를 들어, 활성화된 T 세포는 CD69, CD71, CD25 및 HLA-DR 중 하나 이상을 발현할 수 있다. 활성화제 수용체 (예를 들어 EGFR CAR)를 발현하는 면역 세포는 표적 항원 (예를 들어 EGFR)의 결합에 반응하게 될 때 활성화제 수용체에 의해 활성화될 수 있다. "표적 항원"은 또한 "활성화제 항원"으로 지칭될 수 있고 표적 세포에 의해 단리되거나 발현될 수 있다. 억제 수용체를 발현하는 면역 세포의 활성화는 억제 수용체가 비-표적 항원 (예를 들어 HLA-A*02)의 결합에 반응하게 될 때, 활성화제 수용체가 활성화제 리간드에 결합된 경우에도 감소되거나 예방될 수 있다. "비-표적 항원"은 또한 "억제 리간드" 또는 "차단제"로 지칭될 수 있고, 표적 세포에 의해 단리되거나 발현될 수 있다.
면역 세포 상의 수용체 발현은 본원에 기술된 활성화제 수용체 및 억제 수용체의 존재를 보고하는 검정에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포 집단은 표지된 분자 (예를 들어 형광단 표지된 수용체-특이적 항체 또는 형광단 표지된 수용체-특이적 리간드)로 염색될 수 있고, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 유세포 분석을 사용하여 정량화했다. 이 방법은 활성화제 수용체, 억제 수용체, 또는 수용체 모두를 발현하는 것을 특징으로 하는 면역 세포의 집단에서 면역 세포의 백분율을 허용한다. 본원에 기술된 면역 세포에 의해 발현되는 활성화제 수용체 및 억제 수용체의 비율은 예를 들어, 디지털 액적 PCR에 의해 결정될 수 있다. 이들 접근법은 본원에 기술된 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트의 생산 및 제조를 위한 세포 집단을 특성화하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 면역 세포, 약학 조성물 및 키트의 경우, 활성화제 수용체 및 억제 수용체 모두를 발현하는 면역 세포의 적합한 백분율은 본원에 기술된 방법에 대해 구체적으로 결정되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 활성화제 수용체 및 억제 수용체를 모두를 발현하는 면역 세포의 적합한 백분율은 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%일 수 있다. 예를 들어, 활성화제 수용체 및 억제 수용체를 모두를 발현하는 면역 세포의 적합한 백분율은 최대 50%, 최대 55%, 최대 60%, 최대 65%, 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%일 수 있다. 예를 들어, 면역 세포에서 활성화제 수용체와 억제 수용체의 적합한 비율은 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 또는 약 1:5일 수 있다. 본원에 기술된 면역 세포, 약학 조성물 및 키트에 대한 적합한 값을 충족시키기 위해 면역 세포 집단에 정제, 농축 및/또는 고갈 단계를 사용할 수 있음을 이해한다.
본원에 기재된 면역 세포에 의해 발현되는 반응성 수용체는 수용체의 세포 내 도메인에 의해 생성될 것으로 예상되는 신호의 생성을 측정하는 검정에 의해 검증될 수 있다. 저캇-루시퍼라제 NFAT 세포 (저캇 세포)와 같은 수용체 세포주는 반응성 수용체를 특성화하는 데 사용할 수 있다. 저캇 세포 T 세포로부터 유래되고 활성화된 T-세포 (NFAT)-유도성 루시퍼라제 리포터 시스템의 안정적으로 통합된 핵 인자를 포함한다. NFAT는 면역 세포 활성화에 필요한 전사 인자 계열이며, 그의 활성화는 T 세포 활성화에 대한 신호 마커로 사용될 수 있다. 저캇 세포는 본원에 기술된 활성화제 수용체 및/또는 억제 수용체로 형질도입되거나 형질감염될 수 있다. 활성화제 수용체는 저캇 세포가 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 경우 리간드의 결합에 반응하며, 반응성 수준은 리포터 유전자 발현 수준에 의해 결정될 수 있다. 루시퍼라제의 존재는 루시페린과 같은 임의의 공지된 루시퍼라제 검출 시약을 사용하여 결정할 수 있다. 억제 수용체는 저캇 세포에서 활성화제 수용체와 함께 발현될 때, 정상적으로 반응하는 면역 세포가 활성제 수용체에 대한 반응으로 루시퍼라제를 발현하는 것을 방지하는 경우 리간드의 결합에 반응한다. 예를 들어, 억제 수용체의 반응성은 다음을 관찰함으로써 활성제와 억제제 모두를 발현하는 저캇 세포에서 결정되고 정량화될 수 있다: 1) 저캇 세포는 활성화제 수용체 리간드의 존재 및 억제 수용체 리간드의 부재 하에 루시퍼라제를 발현한다; 및 2) 저캇 세포에서 루시퍼라제 발현은 활성화제 수용체 리간드 및 억제 수용체 리간드 둘 다의 존재 하에 감소되거나 제거된다. 이 접근법은 활성화제 수용체 및 활성화제 수용체와 억제 수용체의 특정 쌍의 민감도, 효능 및 선택성을 결정하는 데 사용할 수 있다. 민감도, 효능 및 선택성은 활성화제 수용체 리간드 및/또는 억제 수용체 리간드가 활성화제 수용체 또는 활성화제와 억제 수용체의 특정 쌍을 발현하는 저캇 세포의 배양물로 적정되는, 용량 반응 실험을 사용하여 EC50 또는 IC50 값으로 정량화될 수 있다. 대안적으로, EC50 및 IC50 값은 활성화제 수용체 또는 활성화제와 억제 수용체의 특정 쌍을 발현하는 면역 세포 (예를 들어 저캇 세포 또는 1차 면역 세포) 및 증가하는 양의 활성화제 리간드 또는 억제제 리간드를 발현하는 표적 세포의 공동 배양물에서 결정될 수 있다. 증가하는 양의 활성화제 리간드 또는 억제제 리간드는 예를 들어, mRNA를 표적 세포로 암호화하는 활성화제 리간드 또는 억제제 리간드의 적정, 또는 상이한 수준의 표적 리간드를 자연적으로 발현하는 표적 세포의 사용에 의해 표적 세포에서 달성될 수 있다. 다양한 양의 표적 및 비-표적 리간드를 발현하는 사용된 표적 세포로 결정된 활성화제 및 억제 수용체에 대한 예시적인 적합한 EC50 및 IC50 값은 활성화제 수용체에 대해 260 백만당 전사체 (TPM) 이하 EC50, 예를 들어 10 내지 260 TPM의 EC50, 및 억제 수용체에 대해 10 TPM 이하의 IC50, 예를 들어 1-5 TPM의 IC50를 포함한다.
활성화제 수용체 또는 활성화제와 억제 수용체의 특정 쌍을 발현하는 본원에 기재된 면역 세포의 활성화는 상기 면역 세포와의 공동 배양 후 표적 세포의 생존력을 측정하는 검정에 의해 추가로 결정될 수 있다. 때때로 효과기 세포로 지칭되는, 면역 세포는 활성화제 수용체 리간드, 억제 수용체 리간드, 또는 활성화제 및 억제 수용체 리간드를 모두 발현하는 표적 세포와 공동 배양된다. 공동 배양 후, 표적 세포의 생존력은 세포 배양물에서 생존력을 측정하기 위한 임의의 방법을 사용하여 측정한다. 예를 들어, 활성 미토콘드리아 효소를 측정하기 위해 테트라졸륨 염 기질을 사용하는 미토콘드리아 기능 분석을 사용하여 생존력을 결정할 수 있다. 생존력은 이미징 기반 방법을 사용하여 결정할 수도 있다. 표적 세포는 녹색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질과 같은 형광 단백질을 발현할 수 있다. 전체 세포 형광의 감소는 표적 세포의 생존력 감소를 나타낸다. 활성화제 수용체 또는 활성화제와 억제 수용체의 특정 쌍을 발현하는 면역 세포와의 배양 후 표적 세포의 생존력 감소는 면역 세포의 표적 세포-매개 활성화로 해석된다. 면역 세포의 선택성의 척도는 또한 이 접근법을 사용하여 결정될 수 있다. 활성화제와 억제 수용체 쌍을 발현하는 면역 세포는 다음이 관찰되는 경우 선택적이다: 1) 억제 수용체 리간드가 아닌 활성화제 수용체 리간드를 발현하는 표적 세포에서 생존력이 감소된다; 2) 활성화제 수용체 리간드 및 억제 수용체 리간드를 모두 발현하는 표적 세포에서 생존력이 감소하지 않는다. 이들 측정으로부터, 음성 대조군 (활성화제 수용체를 발현하지 않는 면역 세포)의 백분율로서 표적 세포의 생존력 감소에 기초하여 면역 세포 활성화의 백분율을 정량화하는 "특이적 사멸" 값이 도출될 수 있다. 추가로, 이러한 측정으로부터 활성화제 수용체 리간드 및 억제 수용체 리간드를 모두 발현하는 표적 세포에서 관찰된 특이적 사멸에 대해 억제 수용체 리간드의 부재 하에 활성화제 수용체 리간드를 발현하는 표적 세포에서 관찰된 특이적 사멸의 비율을 나타내는 "선택성 비율" 값이 도출될 수 있다. 이 접근법은 본원에 기술된 면역 세포, 약학 조성물 및 키트의 생산 및 제조를 위한 세포 집단을 특성화하는 데 사용될 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물 및 키트에 대해 적합한 특이적 사멸 값은 예를 들어 다음 기준일 수 있다: 1) 면역 세포와 억제 수용체 리간드의 부재 하에 활성화제 수용체 리간드를 발현하는 표적 세포의 48시간 공동-배양 후 적어도 50% 특이적 사멸; 2) 활성화제 수용체 리간드 및 억제 수용체 리간드를 모두 발현하는 표적 세포의 20% 이하의 특이적 사멸. 추가 예로서, 면역 세포가 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 54시간, 또는 60시간의 기간에 걸쳐 억제제 리간드가 아닌 활성화제 리간드를 발현하는 표적 세포의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99%를 사멸시킬 수 있는 동안, 동일한 기간 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만 또는 1% 미만의 활성화제 및 억제제 리간드를 발현하는 표적 세포를 사멸시킨다.
면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대한 억제 리간드 값의 부재 하에 활성화제 리간드를 발현하는 표적 세포의 적합한 특이적 사멸 값은 예를 들어, 적어도 약 50% 내지 적어도 약 95%일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대한 억제 리간드 값의 부재 하에 활성화제 리간드를 발현하는 표적 세포에 대해 적합한 특이적 사멸 값은 예를 들어, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대한 억제 리간드 값의 부재 하에 활성화제 리간드를 발현하는 표적 세포의 적합한 특이적 사멸 값은 예를 들어, 최대 약 50%, 최대 약 55%, 최대 약 60%, 최대 약 65%, 최대 약 70%, 최대 약 75%, 최대 약 80%, 최대 약 85%, 최대 약 90%, 또는 최대 약 95%일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대한 활성화제 수용체 리간드 및 억제 수용체 리간드를 모두 발현하는 표적 세포의 적합한 특이적 사멸 값은 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대해 적합한 특이적 사멸 값은 표적 세포와 면역 세포의 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 54시간, 약 60시간, 약 66시간, 또는 약 72시간 공동-배양 후 결정될 수 있다.
면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대한 억제 리간드 값의 부재 하에 활성화제 리간드를 발현하는 표적 세포의 적합한 특이적 사멸 값은 예를 들어, 적어도 약 50% 내지 적어도 약 95%일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대한 억제 리간드 값의 부재 하에 활성화제 리간드를 발현하는 표적 세포의 적합한 특이적 사멸 값은 예를 들어, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대한 억제 리간드 값의 부재 하에 활성화제 리간드를 발현하는 표적 세포의 적합한 특이적 사멸 값은 예를 들어, 최대 약 50%, 최대 약 55%, 최대 약 60%, 최대 약 65%, 최대 약 70%, 최대 약 75%, 최대 약 80%, 최대 약 85%, 최대 약 90%, 또는 최대 약 95%일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대해 활성화제 수용체 리간드 및 억제 수용체 리간드를 모두 발현하는 표적 세포의 적합한 특이적 사멸 값은 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대해 적합한 특이적 사멸 값은 표적 세포와 면역 세포의 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 54시간, 약 60시간, 약 66시간, 또는 약 72시간의 공동-배양 후 결정될 수 있다.
면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대한 억제 리간드 값의 부재 하에 활성화제 리간드를 발현하는 표적 세포의 적합한 특이적 사멸 값은 예를 들어, 적어도 약 50% 내지 적어도 약 95%일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대한 억제 리간드 값의 부재 하에 활성화제 리간드를 발현하는 표적 세포의 적합한 특이적 사멸 값은 예를 들어, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대한 억제 리간드 값의 부재 하에 활성화제 리간드를 발현하는 표적 세포의 적합한 특이적 사멸 값은 예를 들어, 최대 약 50%, 최대 약 55%, 최대 약 60%, 최대 약 65%, 최대 약 70%, 최대 약 75%, 최대 약 80%, 최대 약 85%, 최대 약 90%, 또는 최대 약 95%일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대해 활성화제 수용체 리간드 및 억제 수용체 리간드를 모두 발현하는 표적 세포의 적합한 특이적 사멸 값은 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만일 수 있다. 면역 세포, 약학 조성물, 및 키트에 대해 적합한 특이적 사멸 값은 표적 세포와 면역 세포의 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 54시간, 약 60시간, 약 66시간, 또는 약 72시간의 공동-배양 후 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기능적 변이체"는 모 단백질과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖고, 모 단백질의 하나 이상의 원하는 활성을 유지하는 단백질을 지칭한다. 기능적 변이체는 모체 단백질의 하나 이상의 원하는 활성을 유지하는 단백질의 단편 (즉 N- 및/또는 C-말단 결실을 갖는 변이체)일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비-표적 대립형질 변이체"는 그 산물이 비-표적 세포에 의해 발현되지만 표적 세포에 의해 발현되지 않는 유전자의 대립유전자를 지칭한다. 예를 들어, 비-표적 대립형질 변이체는 대상체의 정상, 비- 세포에 의해 발현되지만, 대상체의 암 세포에 의해 발현되지 않는 유전자의 대립유전자이다. 비-표적 대립형질 변이체의 발현은 이형접합성의 소실, 돌연변이, 또는 비-표적 대립형질 변이체를 암호화하는 유전자의 후성적 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 메커니즘에 의해 암 세포에서 소실될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 리간드 결합 도메인, 예를 들어 항원 결합 도메인과 관련하여 사용될 때"에 특이적" 또는 "에 특이적으로 결합하는"은 명명된 표적에 대해 높은 특이성을 갖는 리간드 결합 도메인을 지칭한다. 항체 특이성은 리간드 결합 도메인과 상응하는 리간드 사이의 적합도, 또는 리간드 결합 도메인이 유사하거나 유사하지 않은 리간드를 구별하는 능력의 척도로 볼 수 있다. 특이성과 비교하여, 친화도는 리간드 결합 도메인과 리간드 사이의 결합 강도의 척도로서, 저-친화도 리간드 결합 도메인은 약하게 결합하고 고-친화도 리간드 결합 도메인은 견고하게 결합한다.　표적 대립유전자에 특이적인 리간드 결합 도메인은 유전자의 상이한 대립유전자를 구별할 수 있는 것이다. 예를 들어, HLA-A*02에 특이적인 리간드 결합 도메인은 HLA-A*01 또는 HLA-A*03과 같은 다른 HLA-A 대립 유전자에 결합하지 않거나 약하게만 결합한다. 본원에 기술된 활성화제 및 억제 수용체와 관련하여, 리간드 결합 도메인은 면역 세포 반응의 특정 활성화 또는 억제를 매개한다. 당업자는 리간드 결합 도메인이 특정 표적에 특이적이라고 말할 수 있고, 본원에 기술된 수용체 시스템에서 그의 기능에 영향을 미치지 않는 하나 이상의 추가 표적에 여전히 낮은 수준의 결합을 갖는다는 것을 이해할 것이다.
본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되는 것처럼 전체적으로 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 본원의 모든 정의를 포함하여 본 출원이 우선한다. 그러나, 본원에 인용된 모든 참조, 기사, 간행물, 특허, 특허 공개 및 특허 출원에 대한 언급은 그들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 세계 어느 국가에서나 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하거나 어떤 형태의 제안으로 간주해서는 안 된다.
활성화제 수용체
본 개시내용은 암 세포 특이적 항원, 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체에서 이의 펩티드 항원을 포함하는 표적 항원에 특이적인 제1 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 수용체를 제공한다. 제1 수용체는 활성화제 수용체이고, 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인에 의한 표적 항원 결합 시 제1 수용체를 발현하는 면역 세포의 활성화를 매개한다. 제1 수용체는 표적 항원 (즉 활성화제 리간드)에 반응성이다. 예를 들어, 표적 항원이 제1 수용체에 결합하거나 접촉할 때, 제1 반응성이 있고 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인에 의한 표적 항원의 결합 시 제1 수용체를 발현하는 면역 세포를 활성화한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 T 세포 수용체 (TCR)이다.
일부 구현예에서, 제1 수용체는 인간화된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "인간화"는 비-인간 종으로부터 단리되거나 유도된 이식유전자 내의 서열 또는 하위서열을 상동적이거나 기능적으로 동등한 인간 서열로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 인간화 항체는 마우스 CDR을 인간 프레임워크 서열에 이식한 다음, 특정 인간 프레임워크 잔기를 공급원 항체의 해당 마우스 잔기로 역치환하여 생성할 수 있다.
활성화제 표적
본 개시내용에 따르면, 제1 수용체에 대한 표적 항원은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체에서 EGFR의 펩티드 항원이다.
주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)은 면역 체계의 세포에 항원을 표시하여 면역 반응을 유발하는 단백질 복합체이다. MHC-I에 해당하는 인간 백혈구 항원 (HLA)은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C이다.
HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G 중 하나를 포함하는 암 세포 특이적 pMHC 항원은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 암 세포 특이적 항원은 HLA-A를 포함한다. HLA-A 수용체는 무거운 α 사슬과 더 작은 β 사슬로 구성된 이종이량체이다. α 사슬은 HLA-A의 변이체에 의해 암호화되는 반면, β 사슬 (β2-마이크로글로불린)은 불변이다. 수천 개의 변이 HLA-A 유전자가 있으며, 이들 모두는 본 개시내용의 범위 내에 속한다. 일부 구현예에서, MHC-I는 인간 백혈구 항원 A*02 대립유전자 (HLA-A*02)를 포함한다.
일부 구현예에서, 암 세포 특이적 항원은 HLA-B를 포함한다. HLA-B　유전자의 수백 가지 버전 (대립유전자)이 알려져 있으며, 각 버전에는 특정 번호가 부여된다 (예를 들어 HLA-B27).
일부 구현예에서, 암 세포 특이적 항원은 HLA-C를 포함한다. HLA-C는 HLA 클래스 I 중쇄 파라로그에 속한다. 이 클래스 I 분자는 중쇄 및 경쇄 (베타-2 마이크로글로불린)로 구성된 이종이량체이다. 100개가 넘는 HLA-C 대립유전자가 당업계에 알려져 있다.
일부 구현예에서, 암 세포 특이적 항원은 폐암 항원, 교모세포종 항원, 유방암 항원, 두경부암 항원 또는 결장직장암 항원이다. 일부 구현예에서, 암 세포 특이적 항원은 결장직장암 항원이다. 일부 구현예에서, 암 세포 특이적 항원은 EGFR 또는 이의 펩티드 항원이다.
일부 구현예에서, 암 세포 특이적 항원은 EGFR, 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체에서 이의 펩티드 항원이다. EGFR은 세포외 단백질 리간드의 표피 성장 인자 (EGF) 계열의 수용체 형태 구성원인 막관통 단백질이다. EGFR은 중간엽 조직, 상피 조직 및 신경 조직과 같은 정상 조직에서 광범위하게 발현되며, 세포 증식, 분화 및 발달에 중요한 역할을 한다. EGFR은 또한 다양한 고형 종양에서 높게 발현되며, EGFR 발현은 종양 진행, 화학 요법에 대한 내성 및 불량한 예후와 관련이 있다.
EGFR의 모든 이소형 및 EGFR의 임상적으로 관련된 돌연변이 (예를 들어 EGFRvIII, S468/492R)는 본 개시내용의 암 세포 특이적 항원으로 생각된다. EGFR 이소형 a는 NCBI 기록 번호 NP_005219.2에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, EGFR는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV
61 VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIP LENLQIIRGN MYYENSYALA
121 VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF
181 QNHLGSCQKC DPSCPNGSCW GAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC
241 TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV
301 VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK
361 NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAW PENRTDLHAF
421 ENLEIIRGRT KQHGQFSLAV VSLNITSLGL RSLKEISDGD VIISGNKNLC YANTINWKKL
481 FGTSGQKTKI ISNRGENSCK ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRNVS RGRECVDKCN
541 LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAMNIT CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM
601 GENNTLVWKY ADAGHVCHLC HPNCTYGCTG PGLEGCPTNG PKIPSIATGM VGALLLLLVV
661 ALGIGLFMRR RHIVRKRTLR RLLQERELVE PLTPSGEAPN QALLRILKET EFKKIKVLGS
721 GAFGTVYKGL WIPEGEKVKI PVAIKELREA TSPKANKEIL DEAYVMASVD NPHVCRLLGI
781 CLTSTVQLIT QLMPFGCLLD YVREHKDNIG SQYLLNWCVQ IAKGMNYLED RRLVHRDLAA
841 RNVLVKTPQH VKITDFGLAK LLGAEEKEYH AEGGKVPIKW MALESILHRI YTHQSDVWSY
901 GVTVWELMTF GSKPYDGIPA SEISSILEKG ERLPQPPICT IDVYMIMVKC WMIDADSRPK
961 FRELIIEFSK MARDPQRYLV IQGDERMHLP SPTDSNFYRA LMDEEDMDDV VDADEYLIPQ
1021 QGFFSSPSTS RTPLLSSLSA TSNNSTVACI DRNGLQSCPI KEDSFLQRYS SDPTGALTED
1081 SIDDTFLPVP EYINQSVPKR PAGSVQNPVY HNQPLNPAPS RDPHYQDPHS TAVGNPEYLN
1141 TVQPTCVNST FDSPAHWAQK GSHQISLDNP DYQQDFFPKE AKPNGIFKGS TAENAEYLRV
1201 APQSSEFIGA (서열 번호 1).
EGFR 이소형 b는 NCBI 기록 번호 NP_958439.1에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, EGFR은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV
61 VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIP LENLQIIRGN MYYENSYALA
121 VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF
181 QNHLGSCQKC DPSCPNGSCW GAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC
241 TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV
301 VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK
361 NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAW PENRTDLHAF
421 ENLEIIRGRT KQHGQFSLAV VSLNITSLGL RSLKEISDGD VIISGNKNLC YANTINWKKL
481 FGTSGQKTKI ISNRGENSCK ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRNVS RGRECVDKCN
541 LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAMNIT CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM
601 GENNTLVWKY ADAGHVCHLC HPNCTYGS (서열 번호 2).
EGFR 이소형 c는 NCBI 기록 번호 NP_958440.1에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, EGFR은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV
61 VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIP LENLQIIRGN MYYENSYALA
121 VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF
181 QNHLGSCQKC DPSCPNGSCW GAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC
241 TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV
301 VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK
361 NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGLS (서열 번호 3).
EGFR 이소형 d는 NCBI 기록 번호 NP_958441.1에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, EGFR은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV
61 VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIP LENLQIIRGN MYYENSYALA
121 VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF
181 QNHLGSCQKC DPSCPNGSCW GAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC
241 TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV
301 VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK
361 NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAW PENRTDLHAF
421 ENLEIIRGRT KQHGQFSLAV VSLNITSLGL RSLKEISDGD VIISGNKNLC YANTINWKKL
481 FGTSGQKTKI ISNRGENSCK ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRNVS RGRECVDKCN
541 LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAMNIT CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM
601 GENNTLVWKY ADAGHVCHLC HPNCTYGPGN ESLKAMLFCL FKLSSCNQSN DGSVSHQSGS
661 PAAQESCLGW IPSLLPSEFQ LGWGGCSHLH AWPSASVIIT ASSCH (서열 번호 4).
EGFR 이소형 e는 NCBI 기록 번호 NP_001333826.1에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, EGFR은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV
61 VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIP LENLQIIRGN MYYENSYALA
121 VLSNYDANKT GLKELPMRNL QGQKCDPSCP NGSCWGAGEE NCQKLTKIIC AQQCSGRCRG
181 KSPSDCCHNQ CAAGCTGPRE SDCLVCRKFR DEATCKDTCP PLMLYNPTTY QMDVNPEGKY
241 SFGATCVKKC PRNYVVTDHG SCVRACGADS YEMEEDGVRK CKKCEGPCRK VCNGIGIGEF
301 KDSLSINATN IKHFKNCTSI SGDLHILPVA FRGDSFTHTP PLDPQELDIL KTVKEITGFL
361 LIQAWPENRT DLHAFENLEI IRGRTKQHGQ FSLAVVSLNI TSLGLRSLKE ISDGDVIISG
421 NKNLCYANTI NWKKLFGTSG QKTKIISNRG ENSCKATGQV CHALCSPEGC WGPEPRDCVS
481 CRNVSRGREC VDKCNLLEGE PREFVENSEC IQCHPECLPQ AMNITCTGRG PDNCIQCAHY
541 IDGPHCVKTC PAGVMGENNT LVWKYADAGH VCHLCHPNCT YGCTGPGLEG CPTNGPKIPS
601 IATGMVGALL LLLVVALGIG LFMRRRHIVR KRTLRRLLQE RELVEPLTPS GEAPNQALLR
661 ILKETEFKKI KVLGSGAFGT VYKGLWIPEG EKVKIPVAIK ELREATSPKA NKEILDEAYV
721 MASVDNPHVC RLLGICLTST VQLITQLMPF GCLLDYVREH KDNIGSQYLL NWCVQIAKGM
781 NYLEDRRLVH RDLAARNVLV KTPQHVKITD FGLAKLLGAE EKEYHAEGGK VPIKWMALES
841 ILHRIYTHQS DVWSYGVTVW ELMTFGSKPY DGIPASEISS ILEKGERLPQ PPICTIDVYM
901 IMVKCWMIDA DSRPKFRELI IEFSKMARDP QRYLVIQGDE RMHLPSPTDS NFYRALMDEE
961 DMDDVVDADE YLIPQQGFFS SPSTSRTPLL SSLSATSNNS TVACIDRNGL QSCPIKEDSF
1021 LQRYSSDPTG ALTEDSIDDT FLPVPGEWLV WKQSCSSTSS THSAAASLQC PSQVLPPASP
1081 EGETVADLQT Q (서열 번호 5).
EGFR 이소형 f는 NCBI 기록 번호 NP_001333827.1에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, EGFR은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV
61 VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIP LENLQIIRGN MYYENSYALA
121 VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF
181 QNHLGSCQKC DPSCPNGSCW GAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC
241 TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV
301 VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK
361 NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAW PENRTDLHAF
421 ENLEIIRGRT KQHGQFSLAV VSLNITSLGL RSLKEISDGD VIISGNKNLC YANTINWKKL
481 FGTSGQKTKI ISNRGENSCK ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRNVS RGRECVDKCN
541 LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAMNIT CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM
601 GENNTLVWKY ADAGHVCHLC HPNCTYGCTG PGLEGCPTNG PKIPSIATGM VGALLLLLVV
661 ALGIGLFMRR RHIVRKRTLR RLLQERELVE PLTPSGEAPN QALLRILKET EFKKIKVLGS
721 GAFGTVYKGL WIPEGEKVKI PVAIKELREA TSPKANKEIL DEAYVMASVD NPHVCRLLGI
781 CLTSTVQLIT QLMPFGCLLD YVREHKDNIG SQYLLNWCVQ IAKGMNYLED RRLVHRDLAA
841 RNVLVKTPQH VKITDFGLAK LLGAEEKEYH AEGGKVPIKW MALESILHRI YTHQSDVWSY
901 GVTVWELMTF GSKPYDGIPA SEISSILEKG ERLPQPPICT IDVYMIMVKC WMIDADSRPK
961 FRELIIEFSK MARDPQRYLV IQGDERMHLP SPTDSNFYRA LMDEEDMDDV VDADEYLIPQ
1021 QGFFSSPSTS RTPLLSSLSA TSNNSTVACI DRNGLQSCPI KEDSFLQRYS SDPTGALTED
1081 SIDDTFLPVP GEWLVWKQSC SSTSSTHSAA ASLQCPSQVL PPASPEGETV ADLQTQ (서열 번호 6).
EGFR 이소형 h는 NCBI 기록 번호 NP_001333829.1에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, EGFR은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 MFNNCEVVLG NLEITYVQRN YDLSFLKTIQ EVAGYVLIAL NTVERIPLEN LQIIRGNMYY
61 ENSYALAVLS NYDANKTGLK ELPMRNLQEI LHGAVRFSNN PALCNVESIQ WRDIVSSDFL
121 SNMSMDFQNH LGSCQKCDPS CPNGSCWGAG EENCQKLTKI ICAQQCSGRC RGKSPSDCCH
181 NQCAAGCTGP RESDCLVCRK FRDEATCKDT CPPLMLYNPT TYQMDVNPEG KYSFGATCVK
241 KCPRNYVVTD HGSCVRACGA DSYEMEEDGV RKCKKCEGPC RKVCNGIGIG EFKDSLSINA
301 TNIKHFKNCT SISGDLHILP VAFRGDSFTH TPPLDPQELD ILKTVKEITG FLLIQAWPEN
361 RTDLHAFENL EIIRGRTKQH GQFSLAVVSL NITSLGLRSL KEISDGDVII SGNKNLCYAN
421 TINWKKLFGT SGQKTKIISN RGENSCKATG QVCHALCSPE GCWGPEPRDC VSCRNVSRGR
481 ECVDKCNLLE GEPREFVENS ECIQCHPECL PQAMNITCTG RGPDNCIQCA HYIDGPHCVK
541 TCPAGVMGEN NTLVWKYADA GHVCHLCHPN CTYGCTGPGL EGCPTNGPKI PSIATGMVGA
601 LLLLLVVALG IGLFMRRRHI VRKRTLRRLL QERELVEPLT PSGEAPNQAL LRILKETEFK
661 KIKVLGSGAF GTVYKGLWIP EGEKVKIPVA IKELREATSP KANKEILDEA YVMASVDNPH
721 VCRLLGICLT STVQLITQLM PFGCLLDYVR EHKDNIGSQY LLNWCVQIAK GMNYLEDRRL
781 VHRDLAARNV LVKTPQHVKI TDFGLAKLLG AEEKEYHAEG GKVPIKWMAL ESILHRIYTH
841 QSDVWSYGVT VWELMTFGSK PYDGIPASEI SSILEKGERL PQPPICTIDV YMIMVKCWMI
901 DADSRPKFRE LIIEFSKMAR DPQRYLVIQG DERMHLPSPT DSNFYRALMD EEDMDDVVDA
961 DEYLIPQQGF FSSPSTSRTP LLSSLSATSN NSTVACIDRN GLQSCPIKED SFLQRYSSDP
1021 TGALTEDSID DTFLPVPEYI NQSVPKRPAG SVQNPVYHNQ PLNPAPSRDP HYQDPHSTAV
1081 GNPEYLNTVQ PTCVNSTFDS PAHWAQKGSH QISLDNPDYQ QDFFPKEAKP NGIFKGSTAE
1141 NAEYLRVAPQ SSEFIGA (서열 번호 7).
EGFR 이소형 i는 NCBI 기록 번호 NP_001333870.1에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, EGFR은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKG NYVVTDHGSC VRACGADSYE MEEDGVRKCK
61 KCEGPCRKVC NGIGIGEFKD SLSINATNIK HFKNCTSISG DLHILPVAFR GDSFTHTPPL
121 DPQELDILKT VKEITGFLLI QAWPENRTDL HAFENLEIIR GRTKQHGQFS LAVVSLNITS
181 LGLRSLKEIS DGDVIISGNK NLCYANTINW KKLFGTSGQK TKIISNRGEN SCKATGQVCH
241 ALCSPEGCWG PEPRDCVSCR NVSRGRECVD KCNLLEGEPR EFVENSECIQ CHPECLPQAM
301 NITCTGRGPD NCIQCAHYID GPHCVKTCPA GVMGENNTLV WKYADAGHVC HLCHPNCTYG
361 CTGPGLEGCP TNGPKIPSIA TGMVGALLLL LVVALGIGLF MRRRHIVRKR TLRRLLQERE
421 LVEPLTPSGE APNQALLRIL KETEFKKIKV LGSGAFGTVY KGLWIPEGEK VKIPVAIKEL
481 REATSPKANK EILDEAYVMA SVDNPHVCRL LGICLTSTVQ LITQLMPFGC LLDYVREHKD
541 NIGSQYLLNW CVQIAKGMNY LEDRRLVHRD LAARNVLVKT PQHVKITDFG LAKLLGAEEK
601 EYHAEGGKVP IKWMALESIL HRIYTHQSDV WSYGVTVWEL MTFGSKPYDG IPASEISSIL
661 EKGERLPQPP ICTIDVYMIM VKCWMIDADS RPKFRELIIE FSKMARDPQR YLVIQGDERM
721 HLPSPTDSNF YRALMDEEDM DDVVDADEYL IPQQGFFSSP STSRTPLLSS LSATSNNSTV
781 ACIDRNGLQS CPIKEDSFLQ RYSSDPTGAL TEDSIDDTFL PVPEYINQSV PKRPAGSVQN
841 PVYHNQPLNP APSRDPHYQD PHSTAVGNPE YLNTVQPTCV NSTFDSPAHW AQKGSHQISL
901 DNPDYQQDFF PKEAKPNGIF KGSTAENAEY LRVAPQSSEF IGA (서열 번호 8).
일부 구현예에서, 암 세포 특이적 항원은 EGFR에서 유래된 펩티드 항원이다. 일부 구현예에서, 펩티드 항원은 서열 번호 1-8 중 어느 하나의 서열 또는 하위서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 항원은 서열 번호 1-8 또는 서열 번호 918-919 중 어느 하나의 하위서열과 동일한 서열을 포함한다.
세포외 리간드 결합 도메인
본 개시내용은 표적 항원에 특이적인 제1 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 수용체를 제공한다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 암 세포 특이적 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 암 세포 특이적 항원은 EGFR 또는 MHC-I과 복합된 EGFR-유래 펩티드 항원이고, 제1 수용체의 리간드 결합 도메인은 EGFR 항원을 인식하고 결합한다. 일부 구현예에서, 암 세포 특이적 항원은 EGFR의 임상적으로 관련된 돌연변이체이다. 예를 들어, EGFR의 돌연변이 변이체는 치환 돌연변이 (예를 들어 엑손 21의 L858R), 결실 돌연변이 (예를 들어 EGFRvIII 또는 엑손 19 또는 엑손 23의 결실), 또는 EGFR 유전자에 대한 증폭 돌연변이일 수 있다.
리간드 의존적 방식으로 수용체의 활성을 조절할 수 있는 임의의 유형의 리간드 결합 도메인은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 생각된다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 항원 결합 도메인이다. 예시적인 항원 결합 도메인은 특히, scFv, SdAb, Vβ-단독 도메인, 및 TCR α 및 β 사슬 가변 도메인으로부터 유도된 TCR 항원 결합 도메인을 포함한다.
임의의 유형의 항원 결합 도메인은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 생각된다.
예를 들어, 제1 세포외 리간드 결합 도메인은 예를 들어, 마우스, 인간화 또는 인간 항체로부터 유래된 Vβ 단독 도메인, 단일 도메인 항체 단편 (sdAb) 또는 중쇄 항체 HCAb, 단쇄 항체 (scFv)를 포함하는 연속 폴리펩티드 사슬의 일부일 수 있다 (Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). 일부 양태에서, 제1 세포외 리간드 결합 도메인은 항체 단편을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 추가 양태에서, 제1 세포외 리간드 결합 도메인은 scFv 또는 sdAb를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 기원의 온전한 면역글로불린, 또는 이의 단편일 수 있고 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
용어 "항체 단편" 또는 "항체 결합 도메인"은 항원 결합 도메인, 즉, 항원 및 이의 정의된 에피토프와 같은 표적에 대한 항체 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하기에 충분한 온전한 항체의 항원성 결정 가변 영역을 함유하는 항체, 또는 이의 재조합 변이체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 단일 사슬 (sc)Fv ("scFv") 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체 (약칭 "sdAb") (VL 또는 VH), 낙타류 VHH 도메인, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하고, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 짧은 유연한 폴리펩티드 링커를 통해 연속적으로 연결되고, 단일 폴리펩티드 사슬로 발현될 수 있으며, 여기서 scFv는 그것이 유래된 온전한 항체의 특이성을 유지한다.
항체와 관련하여 "중쇄 가변 영역" 또는 "VH" (또는, 단일 도메인 항체의 경우, 예를 들어, 나노바디, "VHH")는 프레임워크 영역으로 알려진 플랭킹 스트레치 사이에 개재된 개의 CDR을 포함하는 중쇄의 단편을 지칭하고, 이러한 프레임워크 영역은 일반적으로 CDR보다 더 많이 보존되며 CDR을 지지하는 스캐폴드를 형성한다.
명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이 scFv는 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단과 관련하여, 순서대로 VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있으며, scFv VL-링커-VH를 포함하거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 활성화제 및/또는 억제 수용체의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 링커에 의해 연결된 VL 및 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신 세린 링커, 예를 들어 GGGGSGGGGSGGGGSGG (서열 번호 136)를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 scFv의 N 말단에서 신호 서열을 추가로 포함한다. 예시적인 신호 서열은 MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC (서열 번호 137)를 포함하고, 이는 ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT (서열 번호 138) 또는 ATGGATATGAGAGTGCCTGCCCAGCTGCTCGGACTGCTCCTTCTGTGGTTGAGAGGAGCTCGGTGC (서열 번호 917)에 의해 암호화된다.
용어 "항체 경쇄"는 항체 분자에 자연적으로 발생하는 형태로 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파 ("κ") 및 람다 ("λ") 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 아이소타입을 지칭한다.
용어 "재조합 항체"는 예를 들어, 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 지칭한다. 용어는 또한, 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질을 발현하는 항체 또는 항체를 지정하는 아미노산 서열을 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 이용 가능하고 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된다.
용어 "Vβ 도메인", "Vβ-단독 도메인", "β 사슬 가변 도메인" 또는 "단일 가변 도메인 TCR (svd-TCR)"은 제2 TCR 가변 도메인의 부재 하에 항원에 특이적으로 결합하는 단일 T 세포 수용체 (TCR) 베타 가변 도메인으로 본질적으로 구성된 항원 결합 도메인을 지칭한다. Vβ-단독 도메인은 상보성 결정 영역 (CDR)을 사용하여 항원과 결합한다. 각각의 Vβ-단독 도메인은 3개의 보체 결정 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 함유한다. 추가 요소는 Vβ 도메인이 제2 TCR 가변 도메인이 없을 때 에피토프에 결합하도록 구성된다면 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 단쇄 Fv 항체 단편 (scFv), 또는 β 사슬 가변 도메인 (Vβ)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 TCR α 사슬 가변 도메인 및 TCR β 사슬 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 scFv 항원 결합 도메인을 포함한다. 예시적인 EGFR scFv는 하기 표 1에 나타낸다.
표 1. EGFR scFv 도메인
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 구현예에서, 활성화제 리간드는 EGFR 또는 이의 펩티드 항원이고, 활성화제 리간드 결합 도메인은 EGFR 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 scFv 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 9-18 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 9-18 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 표 1의 서열 그룹으로부터 선택된 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 표 1의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. EGFR에 결합하는 본 개시내용의 scFv 도메인은 EGFR의 하나 이상의 변이체와 교차 반응할 수 있음이 이해된다. 예를 들어, scFv는 적어도 하나의 정상 EGFR, EGFR의 변이체, 또는 돌연변이 EGFR (예를 들어 EGFRvIII)에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 9-18 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 scFv 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 9-18 중 어느 하나의 서열을 포함하는 ScFv 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 9-18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 본질적으로 이루어진다.
표 2. EGFR 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인
Figure pct00005
일부 구현예에서, 활성화제 리간드는 EGFR 또는 이의 펩티드 항원이고, 활성화제 리간드 결합 도메인은 EGFR 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 결합 도메인은 표 2에 개시된 그룹으로부터 선택된 VH 및/또는 VL 도메인 또는 이에 대해 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 19-24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 19-24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 25-30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 25-30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
표 3. EGFR 항원 결합 도메인 CDR.
Figure pct00006
일부 구현예에서, 활성화제 리간드는 EGFR 또는 이의 펩티드 항원이고, 활성화제 리간드 결합 도메인은 EGFR 리간드 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, EGFR 결합 도메인은 표 3에 개시된 CDR 그룹에서 선택된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 표 3에 개시된 CDR에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 31-65로부터 선택된 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 31-36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 CDR 1 (CDR H1)을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 37-42로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 CDR 2 (CDR H2)를 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 43-48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 CDR 3 (CDR H3)을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 49-54로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 CDR 1 (CDR L1)을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 55-59로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 CDR 2 (CDR L2)을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 60-65로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 CDR 3 (CDR L3)을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 31-36으로부터 선택된 CDR H1, 서열 번호 37-42로부터 선택된 CDR H2, 서열 번호 43-48로부터 선택된 CDR H3, 서열 번호 49-54로부터 선택된 CDR L1, 서열 번호 55-59로부터 선택된 CDR L2, 및 서열 번호 60-65로부터 선택된 CDR L3을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 도메인의 CDR에서 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6) 아미노산 잔기는 또 다른 아미노산으로 치환된다. 치환은 동일한 패밀리의 아미노산 내의 치환이라는 의미에서 "보존적"일 수 있다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 다음 4가지 패밀리로 나눌 수 있으며 이러한 패밀리 내에서 보존적 치환이 일어날 것이다: (1) 염기성 측쇄를 갖는 아미노산: 라이신, 아르기닌, 히스티딘; (2) 산성 측쇄를 갖는 아미노산: 아스파르트산, 글루탐산; (3) 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신; 및 (4) 비극성 측쇄를 갖는 아미노산: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인. 항체의 CDR의 아미노산 서열을 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 변화시킴으로써, 표적 항원에 대한 결합 친화력 증가와 같은 다양한 효과를 얻을 수 있다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
본 개시내용은 제1, 활성화제 수용체 및 이를 포함하는 면역세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 키메라 항원 수용체이다.
일부 구현예에서, 제1 수용체는 서열 번호 175, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 서열 번호 176, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 서열 번호 177, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체 (CAR)"는 T-세포 수용체로부터 유래된 인공 수용체를 지칭할 수 있고 인공 특이성을 특정 면역 효과기 세포에 이식하는 조작된 수용체를 포함한다. CAR은 단일클론 항체의 특이성을 T 세포에 부여하여, 예를 들어, 입양 세포 요법에 사용하기 위해 많은 수의 특정 T 세포가 생성되도록 하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 예를 들어 종양 관련 항원에 대한 세포의 특이성을 지시한다. 예시적인 CAR은 세포 내 활성화 도메인, 막관통 도메인, 및 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 특정 양태에서, CAR은 CD3 막관통 도메인 및 엔도도메인에 융합되는, 단일클론 항체로부터 유도된 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 다른 CAR 디자인의 특이성은 수용체의 리간드 (예를 들어, 펩티드)에서 파생될 수 있다. 특정 경우에, CAR은 추가적인 공동자극 신호전달을 위한 도메인, 예를 들어 CD3, 4-1BB, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10, 및/또는 OX40을 포함한다. 일부 경우에, 공동자극 분자, 영상화를 위한 리포터 유전자, 전구약물 첨가 시 T 세포를 조건부로 제거하는 유전자 산물, 귀소 수용체, 사이토카인 및 사이토카인 수용체를 포함하는 분자가 CAR과 함께 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 CAR의 세포외 도메인에 융합된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 세포외 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역의 통합은 CAR-T 세포의 사이토카인 생산에 영향을 미치고 생체 내 CAR-T 세포의 확장을 향상시킬 수 있다. 예시적인 힌지는 IgD 및 CD8 도메인, 예를 들어 IgG1로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지는 CD8α 또는 CD28로부터 단리되거나 유래된다.
일부 구현예에서, 힌지는 CD8α 또는 CD28로부터 단리되거나 유래된다. 일부 구현예에서, CD8α 힌지는 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (서열 번호 66)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD8α 힌지는 서열 번호 66을 포함한다. 일부 구현예에서, CD8α 힌지는 서열 번호 66으로 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, CD8α 힌지는 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (서열 번호 67)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD8α 힌지는 서열 번호 67에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, CD28 힌지는 CTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열 번호 68)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD28 힌지는 서열 번호 68을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, CD28 힌지는 TGTACCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC (서열 번호 69)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD28 힌지는 서열 번호 69에 의해 암호화된다.
본 개시내용의 CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합되는 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR의 도메인 중 하나와 자연적으로 연관된 막관통 도메인이 사용된다. 예를 들어, CD28 공동 자극 도메인을 포함하는 CAR은 또한 CD28 막관통 도메인을 사용할 수 있다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 막 결합 단백질 또는 막관통 단백질에서 유래될 수 있다. 막관통 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 입실론, CD45,　CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 또는 IgG4와 같은 면역글로불린의 적어도 막관통 영역(들)로부터 단리되거나 유래될 수 있다 (즉 포함한다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우 그것은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 임의로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이가 막관통 도메인과 CAR의 세포질 신호전달 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 특히 적합한 링커를 제공한다.
본 개시내용의 CAR의 일부 구현예에서, CAR은 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD28 막관통 도메인은 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (서열 번호 70)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD28 막관통 도메인은 서열 번호 70을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, CD28 막관통 도메인은 TTCTGGGTGCTGGTCGTTGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTG (서열 번호 71)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD28 막관통 도메인은 서열 번호 71에 의해 암호화된다.
본 개시내용의 CAR의 일부 구현예에서, CAR은 IL-2R베타 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2R베타 막관통 도메인은 IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI (서열 번호 72)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2R베타 막관통 도메인은 서열 번호 72을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, IL-2R베타 막관통 도메인은 ATTCCGTGGC TCGGCCACCT CCTCGTGGGC CTCAGCGGGG CTTTTGGCTT CATCATCTTA GTGTACTTGC TGATC (서열 번호 73)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, IL-2R베타 막관통 도메인은 서열 번호 73에 의해 암호화된다.
본 개시내용의 CAR의 세포질 도메인 또는 그렇지 않으면 세포 내 신호전달 도메인은 AR이 배치된 면역 세포의 정상 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "효과기 기능"은 세포의 특화된 기능을 지칭한다. 따라서 용어 "세포 내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 변환하고 세포가 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질 부분을 지칭한다. 일반적으로 전체 세포 내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 도메인을 사용할 필요는 없다. 세포 내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 한, 이러한 절단된 부분은 효과기 기능 신호를 변환하는 한 온전한 사슬 대신에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 다수의 세포 내 도메인은 도메인이 조합되어 본 개시내용의 CAR-T 세포의 원하는 기능을 달성할 수 있다. 용어 세포 내 신호전달 도메인은 따라서 전달하기에 충분한 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
본 개시내용의 CAR에 사용하기 위한 세포 내 신호전달 도메인의 예는 T 세포 수용체 (TCR) 및 항원 수용체 후 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 공동-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
따라서, 본 개시내용의 CAR의 세포 내 도메인은 적어도 하나의 세포질 활성화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 활성화 도메인은 CAR T-세포의 효과기 기능을 활성화하는 데 필요한 T-세포 수용체 (TCR) 신호전달이 있음을 보장한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 세포질 활성화는 CD247 분자 (CD3ζ) 활성화 도메인, 자극 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) KIR2DS2 활성화 도메인, 또는 12 kDa의 DNAX-활성화 단백질 (DAP12) 활성화 도메인이다.
일부 구현예에서, CD3ζ 활성화 도메인은 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열 번호 74)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3ζ 활성화 도메인은 서열 번호 74를 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, CD3ζ 활성화 도메인은 AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGCGTAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGACTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (서열 번호 75)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD3ζ 활성화 도메인은 서열 번호 75에 의해 암호화된다.
TCR 단독으로 생성된 신호는 종종 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하며 2차 또는 공동 자극 신호도 필요하다는 것이 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포질 신호 서열의 2가지 별개 부류에 의해 매개된다고 말할 수 있다: TCR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 서열 (1차 세포질 신호전달 서열) 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공동 자극 신호를 제공하는 서열 (2차 세포질 신호전달 서열).
1차 세포질 신호전달 서열은 자극 방식 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진, 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, ITAM은 류신 또는 이소류신으로부터 임의의 2개의 다른 아미노산 (YxxL/I) (서열 번호 157)에 의해 분리된 티로신을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포질 도메인은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 ITAM을 함유한다. 세포질 도메인을 함유하는 예시적인 ITAM은 CD3ζ 활성화 도메인이다. 본 개시내용의 CAR에 사용될 수 있는 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 추가 예는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일 ITAM을 포함하는 CD3ζ 활성화 도메인은 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR (서열 번호 76)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3ζ 활성화 도메인은 서열 번호 76을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 ITAM을 포함하는 CD3ζ 활성화 도메인은 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR (서열 번호 76)의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 단일 ITAM을 포함하는 CD3ζ 활성화 도메인은
AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGACGCC CCCGCGTACC AGCAGGGCCA GAACCAGCTC
TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG GAGTACGATG TTTTGCACAT GCAGGCCCTG
CCCCCTCGC (서열 번호 77)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD3ζ 활성화 도메인은 서열 번호 77에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, CAR의 세포질 도메인은 그 자체로 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하거나 본 개시내용의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ 사슬 부분 및 공동 자극 도메인을 포함할 수 있다. 공동 자극 도메인은 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 IL-2Rβ, Fc 수용체 감마 (FcRγ), Fc 수용체 베타 (FcRβ), CD3g 분자 감마 (CD3γ), CD3δ, CD3ε, CD5 분자 (CD5), CD22 분자 (CD22), CD79a 분자 (CD79a), CD79b 분자 (CD79b), 암 배아 항원 관련 세포 부착 분자 3 (CD66d), CD27 분자 (CD27), CD28 분자 (CD28), TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 9 (4-1BB), TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 4 (OX40), TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 8 (CD30), CD40 분자 (CD40), 프로그램된 세포 사멸 1 (PD-1), 유도성 T 세포 공동자극 (ICOS), 림프구 기능 관련 항원-1 (LFA-1), CD2 분자 (CD2), CD7 분자 (CD7), TNF 수퍼패밀리 구성원 14 (LIGHT), 킬러 세포 렉틴 유사 수용체 C2 (NKG2C) 및 CD276 분자 (B7-H3) c-자극 도메인, 또는 이의 기능적 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공동 자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 CAR의 세포 내 도메인은 적어도 하나의 공동 자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동 자극 도메인은 CD28로부터 단리되거나 유래된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 CAR의 세포 내 도메인은 적어도 하나의 공동 자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동 자극 도메인은 CD28 로부터 단리되거나 유래된다. 일부 구현예에서, CD28 공동 자극 도메인은 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열 번호 78)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD28 공동 자극 도메인은 서열 번호 78을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, CD28 공동 자극 도메인은 AGGAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGAGGCCTGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCTCCCAGGGATTTCGCCGCCTACCGGAGC (서열 번호 79)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD28 공동 자극 도메인은 서열 번호 79에 의해 암호화된다. 본 개시내용의 CAR의 세포질 신호전달 부분 내 세포질 도메인은 무작위 또는 지정된 순서로 서로 연결될 수 있다. 임의로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산 길이는 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 적합한 예시를 제공한다.
일부 구현예에서, 공동 자극 도메인은 4-1BB로부터 단리되거나 유래된다. 일부 구현예에서, 4-1BB 공동 자극 도메인은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (서열 번호 159)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 4-1BB 공동 자극 도메인은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (서열 번호 159)를 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 4-1BB 공동 자극 도메인은 aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgaggccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg (서열 번호 160)의 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, CAR의 세포 내 도메인은 CD28 공동 자극 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, 및 CD3ζ 활성화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서 CAR의 세포 내 도메인은 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열 번호 158)의 서열, 또는 이에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 개시내용의 CAR의 세포질 신호전달 부분 내 세포질 도메인은 무작위 또는 지정된 순서로 서로 연결될 수 있다. 임의로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산 길이는 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 적합한 예시를 제공한다. 예시적인 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGG (서열 번호 136)의 서열을 포함한다.
본 개시내용의 CAR의 세포질 신호전달 부분 내 세포질 도메인은 무작위 또는 지정된 순서로 서로 연결될 수 있다. 임의로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산 길이는 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 적합한 예시를 제공한다.
T 세포 수용체 (TCR)
본 개시내용은 제1, 활성화제 수용체 및 이를 포함하는 면역 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 T 세포 수용체 (TCR)이다.
본 개시내용에서 사용하기 위한 세포 내 도메인을 포함하는 예시적인 TCR은 2020년 9월 6일에 출원된 PCT/US2020/045250에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 때때로 "TCR 복합체" 또는 "TCR/CD3 복합체"라고도 하는 "TCR"은 TCR 알파 사슬, TCR 베타 사슬, 및 때때로 서브유닛으로 지칭되는, 불변 CD3 사슬 (제타, 감마, 델타 및 입실론) 중 하나 이상을 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다. TCR 알파 및 베타 사슬은 펩티드-MHC 복합체에 결합하는 이종이량체로서 기능하도록 이황화 연결될 수 있다. TCR 알파/베타 이종이량체가 펩티드-MHC와 결합하면, 관련 불변 CD3 서브유닛에서 TCR 복합체의 구조적 변화가 유도되어, 인산화 및 다운스트림 단백질과의 결합을 유도하여 1차 자극 신호를 전달한다. 예시적인 TCR 복합체에서, TCR 알파 및 TCR 베타 폴리펩티드는 이종이량체를 형성하고, CD3 입실론 및 CD3 델타는 이종이량체를 형성하고, CD3 입실론 및 CD3 감마는 이종이량체를 형성하고, 2개의 CD3 제타는 동종이량체를 형성한다.
임의의 적합한 리간드 결합 도메인은 본원에 기재된 TCR의 세포외 도메인, 힌지 도메인 또는 막관통에 융합될 수 있다. 예를 들어, 리간드 결합 도메인은 항체 또는 TCR의 항원 결합 도메인이거나, 항체 단편, Vβ 단독 도메인, 선형 항체, 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 또는 단일 도메인 항체 (sdAb)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 TCR 서브유닛의 하나 이상의 세포외 도메인 또는 막관통 도메인에 융합된다. TCR 서브유닛은 TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 입실론, CD3 감마 또는 CD3 제타일 수 있다. 예를 들어, 리간드 결합 도메인은 TCR 알파, 또는 TCR 베타에 융합될 수 있거나, 리간드 결합의 일부는 2개의 서브유닛에 융합될 수 있으며, 예를 들어 리간드 결합 도메인의 일부는 TCR 알파 및 TCR 베타 모두에 융합될 수 있다.
TCR 서브유닛은 TCR 알파, TCR 베타, CD3 제타, CD3 델타, CD3 감마 및 CD3 입실론을 포함한다. TCR 알파, TCR 베타 사슬, CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, 또는 CD3 제타, 또는 이의 단편 또는 유도체 중 임의의 하나 이상은 본 개시내용의 자극 신호를 제공할 수 있는 하나 이상의 도메인에 융합될 수 있으며, 이로써 TCR 기능 및 활동을 향상시킨다.
임의의 공급원으로부터 단리되거나 유래된 TCR 막관통 도메인은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 막관통 도메인은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막 결합 단백질 또는 막관통 단백질에서 파생될 수 있다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 TCR 복합체가 표적에 결합할 때마다 세포 내 도메인(들)에 신호 전달할 수 있다. 본 개시내용의 특정 용도의 막관통 도메인은 적어도 예를 들어, TCR의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD3 델타, CD3 입실론 또는 CD3 감마, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 힌지, 예를 들어, 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 TCR의 폴리펩티드의 세포외 영역, 예를 들어, TCR 알파 또는 베타 사슬의 항원 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 힌지는 인간 면역글로불린 (Ig) 힌지, 예를 들어, IgG4 힌지, 또는 CD8a 힌지일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지는 CD8α 또는 CD28로부터 단리되거나 유래된다.
일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 TCR의 하나 이상의 막관통 도메인에 부착된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 TCR 알파 막관통 도메인, TCR 베타 막관통 도메인, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통은 CD3 제타 막관통 도메인을 포함한다.
막관통 도메인 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가 아미노산, 예를 들어, 막관통이 유래된 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 최대 15개 아미노산) 및/또는 막관통이 유래된 단백질의 세포 내 영역과 관련된 하나 이상의 아미노산 (세포 내 영역의 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 최대 15개 아미노산)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하는 것을 피하기 위해, 예를 들어, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
존재하는 경우, 막관통 도메인은 천연 TCR 막관통 도메인, 이종 막 단백질로부터의 천연 막관통 도메인, 또는 인공 막관통 도메인일 수 있다. 막관통 도메인은 막 앵커 도메인일 수 있다. 제한 없이, 천연 또는 인공 막관통 도메인은 막관통 도메인은 약 20개 아미노산의 소수성 α-나선을 포함할 수 있으며, 종종 막관통 세그먼트의 측면에 양전하를 가진다. 막관통 도메인은 하나의 막관통 세그먼트 또는 하나 초과의 막관통 세그먼트를 가질 수 있다. 막관통 도메인/세그먼트의 예측은 공개적으로 이용 가능한 예측 도구를 사용하여 이루어질 수 있다 (예를 들어 TMHMM, Krogh et al. Journal of Molecular Biology 2001; 305(3):567-580; 또는 TMpred, Hofmann & Stoffel Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1993; 347: 166). 막 앵커 시스템의 비제한적 예는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR) 막관통 도메인, 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커 (신호 서열에 번역 후 첨가됨) 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 TCR 알파 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 알파 막관통 도메인은 VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW (서열 번호 80)의 서열에 대해 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 알파 막관통 도메인은 서열 번호 80을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, TCR 알파 막관통 도메인은 GTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGG (서열 번호 81)의 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 TCR 베타 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 베타 막관통 도메인은 TILYEILLGKATLYAVLVSALVL (서열 번호 82)의 서열에 대해 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 베타 막관통 도메인은 서열 번호 82를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, TCR 베타 막관통 도메인은 ACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTG (서열 번호 83)의 서열에 의해 암호화된다.
본 개시내용의 TCR은 하나 이상의 세포 내 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 막관통 도메인에 자극 신호를 제공할 수 있는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 자극 신호를 제공할 수 있는 제1 세포 내 도메인 및 자극 신호를 제공할 수 있는 제2 세포 내 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 내 도메인은 자극 신호를 제공할 수 있는 제1, 제2 및 제3 세포 내 도메인을 포함한다. 자극 신호를 제공할 수 있는 세포 내 도메인은 CD28 분자 (CD28) 도메인, LCK 원발암유전자, Src 계열 티로신 키나제 (Lck) 도메인, TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 9 (4-1BB) 도메인, TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 18 (GITR) 도메인, CD4 분자 (CD4) 도메인, CD8a 분자 (CD8a) 도메인, FYN 원발암유전자, Src 계열 티로신 키나제 (Fyn) 도메인, T 세포 수용체 관련 단백질 키나제 70의 제타 사슬 (ZAP70) 도메인, T 세포 (LAT) 도메인의 활성화를 위한 링커, 림프구 세포질 단백질 2 (SLP76) 도메인, (TCR) 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 감마 및 CD3 입실론 세포 내 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 적어도 하나의 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포 내 신호전달 도메인은 세포의 기능, 예를 들어 TCR 함유 세포, 예를 들어, TCR- 발현 T-세포의 면역 효과기 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 제1 수용체의 세포 내 도메인은 적어도 하나의 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, CD3 감마, 델타 또는 입실론의 세포 내 도메인은 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포 내 도메인은 동일한 단백질, 예를 들어 T-세포 수용체 (TCR) 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 감마, CD3 입실론 또는 CD3 제타로부터 단리되거나 유래된다.
본 개시내용의 활성화제 수용체에서 사용하기 위한 세포 내 도메인의 예는 TCR 알파, TCR 베타, CD3 제타, 및 4-1BB의 세포질 서열, 및 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 세포 내 신호전달 공동-수용체, 뿐만 아니라 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 재조합 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 1차 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 예시적인 1차 세포 내 신호전달 도메인은 1차 자극, 또는 항원 의존적 자극을 담당하는 단백질로부터 유도된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 CD3 델타 세포 내 도메인, CD3 입실론 세포 내 도메인, CD3 감마 세포 내 도메인, CD3 제타 세포 내 도메인, TCR 알파 세포 내 도메인 또는 TCR 베타 세포 내 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 TCR 알파 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 알파 세포 내 도메인은 Ser-Ser를 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 알파 세포 내 도메인은 TCCAGC의 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 TCR 베타 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 베타 세포 내 도메인은 다음 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성을 갖거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다: MAMVKRKDSR (서열 번호 84). 일부 구현예에서, TCR 베타 세포 내 도메인은 서열 번호 84를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, TCR 베타 세포 내 도메인은 ATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGA (서열 번호 85)의 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 자극 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 1차 세포 내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 델타, CD3 감마 및 CD3 입실론 세포 내 도메인, 및 하나의 추가 자극 세포 내 도메인, 예를 들어 공동 자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 1차 세포 내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 델타, CD3 감마 및 CD3 입실론 세포 내 도메인, 및 2개의 추가 자극 세포 내 도메인을 포함한다.
예시적인 공동 자극 세포 내 신호전달 도메인은 공동 자극 신호, 또는 항원 독립적 자극을 담당하는 단백질로부터 유도된 것들을 포함한다. 공동 자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA, Toll 리간드 수용체, 뿐만 아니라 DAP10, DAP12, CD30, LIGHT, OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) 4-1BB (CD137, TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 9), 및 CD28 분자 (CD28)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 공동 자극 단백질은 다음 단백질 패밀리로 나타낼 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 c 활성화 분자 (SLAM 단백질), 및 활성화 NK 세포 수용체. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능 관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83, CD4와 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 공동 자극 도메인은 이것이 유래된 분자, 또는 이의 기능적 변이체의 전체 세포 내 부분, 또는 전체 천연 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 도메인은 공동 자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동 자극 도메인은 CD28 또는 4-1BB 공동 자극 도메인을 포함한다. CD28 및 4-1BB 완전한 T 세포 활성화에 필요하고 T 세포 효과기 기능을 향상시키는 것으로 알려진 잘 특성화된 공동 자극 분자이다. 예를 들어, CD28 및 4-1BB는 키메라 항원 수용체 (CAR)에 활용되어 CD3 제타 신호전달 도메인만을 함유하는 1세대 CAR에 비해 사이토카인 방출, 세포 용해 기능, 및 지속성을 향상시킨다. 마찬가지로, TCR에 공동 자극 도메인, 예를 들어 CD28 및 4-1BB 도메인을 포함하면 T 세포 효과기 기능을 증가시킬 수 있으며 특히 일반적으로 표면에서 하향 조절되는 공동 자극 리간드가 없는 경우 공동 자극을 허용할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 도메인은 CD28 세포 내 도메인 또는 4-1BB 세포 내 도메인을 포함한다.
억제 수용체
본 개시내용은 암 세포에서 소실된 비-표적 항원, 예를 들어 유전자의 대립형질 변이체에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 수용체를 제공한다. 비-표적 대립형질 변이체는 제한 없이 비-표적 대립형질 변이체 발현에 영향을 미치는 후생유전학적 변화, 비-표적 대립형질 변이체를 암호화하는 유전자에 대한 돌연변이, 비-표적 대립형질 변이체의 발현을 조절하는 세포 신호전달의 파괴, 염색체 소실, 게놈 유전자좌의 부분적 또는 완전한 결실, 핵산 또는 이종염색질의 변형을 통한 유전자 침묵, 또는 다른 메커니즘을 통한 발현 상실과 같은 임의의 메커니즘을 통해 암 세포에서 소실될 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법의 변형에서, 치료된 세포 또는 대상체는 비-유전적 변화로 인해 비-표적 대립형질 변이체의 발현 상실을 나타낼 수 있다. 따라서 본 개시내용은 세포를 죽이고/거나 이형접합성의 소실을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 원인으로부터 비-표적 항원의 발현이 결여된 개체를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
비-표적 항원은 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와 복합체 내의 단백질, 또는 이의 항원 펩티드일 수 있고, 여기서 비-표적 항원은 다형성을 포함한다. 비-표적 항원은 다형성이기 때문에, 암세포에서 이형접합성의 소실을 통해 발생할 수 있는, 비-표적 항원을 암호화하는 유전자의 단일 카피의 소실은 유전자의 다른 다형성 변이체를 유지하는 암 세포를 산출하지만, 비-표적 항원을 소실한다. 예를 들어, HLA 유전자좌에서 HLA-A*02 및 HLA-A*01 대립유전자를 갖는 대상체는 HLA-A*02 대립유전자만 소실되는 암에 걸릴 수 있다. 그러한 대상체에서, 억제제 수용체가 HLA-A*02 (또는 다른 비-표적 항원)에 특이적인 것으로 설계되기 때문에 HLA-A*01 단백질은 존재하지만, 암 세포와 마주치는 면역 세포의 억제 수용체에 의해 인식되지 않는다. 정상 비-악성 세포에서, HLA-A*02 (또는 다른 비-표적 항원)가 존재하고 조작된 면역 세포의 활성화를 억제한다. 이형접합성이 소실된 암세포에서는, HLA-A*02 대립형질 변이체 (또는 다른 비-표적 항원)가 소실된다. 억제 수용체를 발현하도록 조작된 면역 세포는 억제 수용체가 암 세포에 없는 HLA-A*02 (또는 다른 비-표적 항원)에만 반응하기 때문에, 억제 수용체로부터 억제 신호를 받지 않는다. 이 메커니즘에 의해, 면역 세포는 선택적으로 활성화되어, EGFR을 발현하지만 이형 접합성의 소실로 인해 HLA-A*02 (또는 또 다른 비-표적 항원)를 잃은 암세포를 선택적으로 사멸시킨다. HLA-A를 여기서 예로 사용한다. 유사한 다형성 변이가 다른 MHC 유전자 및 다른 비-MHC 유전자 집단에서도 발생한다. 따라서, 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 COLEC12, APCDD1 또는 CXCL16, 또는 HLA-A*02의 다형성 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA 클래스 I 대립유전자 또는 마이너 조직적합성 항원 (MiHA)이다. 일부 구현예에서, HLA 클래스 I 대립유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 HLA-E를 포함한다. 일부 구현예에서, HLA 클래스 I 대립유전자는 HLA-A*02이다. 일부 구현예에서, HLA-A*02 비-표적 항원은 대상체의 건강한 세포에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 비-표적 대립형질 변이체이다. 일부 구현예에서, 비-표적 대상체의 암 세포에서 발현되지 않는다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 대상체의 종양에서 세포의 일부에서 발현되지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체의 암 세포는 비-표적 항원의 발현을 상실했다. 세포에서 비-표적 항원의 발현 상실 또는 발현 부족은 제한 없이, 비-표적 유전자 발현에 영향을 미치는 후생유전학적 변화, 비-표적 항원을 암호화하는 유전자에 대한 돌연변이, 또는 비-표적 유전자의 발현을 조절하는 세포 신호전달의 파괴와 같은 임의의 메커니즘일 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 수용체는 억제 키메라 항원 수용체 (즉 억제 수용체)이다. 일부 구현예에서, 제2 수용체는 억제 수용체이다. 일부 구현예에서, 제2 수용체는 인간화된다.
일부 구현예에서, 제2수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 174 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열.
본 개시내용은 비-표적 항원의 단일 아미노산 변이 대립유전자를 구별할 수 있는 세포외 리간드 결합을 포함하는 억제 수용체인, 제2 수용체를 제공한다. 비-표적 항원의 대립형질 변이체를 구별하는 이러한 능력은 제2 수용체가 리간드 결합 도메인에 의해 인식되는 대립유전자를 발현하는 비-표적 세포의 존재 하에 제2 수용체를 포함하는 면역 세포의 활성화를 억제할 수 있게 한다. 그러나, 면역 세포의 활성화는 대립유전자를 소실한 표적 세포, 예를 들어 이형 접합체의 소실을 통해 유전자의 하나의 대립 유전자를 소실한 암 세포의 존재 하에서 억제되지 않는다.
본 개시내용은 비-표적 항원의 상이한 발현 수준을 구별할 수 있는 세포외 리간드 결합을 포함하는 억제 수용체인 제2 수용체를 제공한다. 이는 제2 수용체가 제2 수용체에 대한 리간드를 발현하는 비-표적 세포의 존재 하에 제2 수용체를 포함하는 면역 세포의 활성화를 억제할 수 있게 하지만, 제2 수용체에 대한 리간드를 낮은 수준으로 발현하거나, 발현하지 않는 암 세포의 존재 하에 면역 세포의 활성화를 허용할 수 있다.
억제제 리간드
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 표적 세포에 의해 발현되지 않고, 비-표적 세포에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 건강한 세포, 즉 암세포가 아닌 세포에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 이형접합성 소실 (LOH)을 통해 비-표적 항원의 발현을 상실한 다수의 암 세포이다. 일부 구현예에서, 비-표적 세포는 표적 및 비-표적 항원 모두를 발현하는 복수의 건강한 세포 (즉, 비-암, 정상, 또는 건강한 세포)이다.
표적 세포에 의해 발현되지 않는 비-표적 세포에 의해 발현되는 임의의 세포 표면 분자는 제2 수용체 세포외 리간드 결합 도메인에 대한 적합한 비-표적 항원일 수 있다. 예를 들어, 세포 부착 분자, 세포-세포 신호전달 분자, 세포외 도메인, 화학주성에 관여하는 분자, 당단백질, G 단백질 결합 수용체, 막관통, 신경전달물질 수용체 또는 전압 개폐 이온 채널은 비-표적 항원으로 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 항원은 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체 내의 암 세포 특이적 항원의 펩티드 항원이다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 이형접합성의 소실로 인해 암 세포에서 소실된다. 이형접합성의 소실로 인해 암 세포에서 소실된 예시적인 비-표적 항원은 COLEC12, APCDD1, CXCL16 및 HLA-A*02를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 COLEC12, APCDD1 및 CXCL166의 다형성 변이체, 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체 내의 이의 펩티드 항원, 또는 HLA-A*02로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체 내의 COLEC12, APCDD1 및 CXCL16의 다형성 잔기를 포함하는 항원 펩티드이다.
HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 임의의 것을 포함하는 비-표적 MHC-1 (MHC) 항원은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-A를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 인간 백혈구 항원 A*02 대립형질 산물 (HLA-A*02)을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 인간 백혈구 항원 A*69를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-B를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-C를 포함한다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-A*02를 포함한다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 C-X-C 모티프 케모카인 리간드 16 (CXCL16) 또는 MHC-I와의 복합체 내 이의 항원 펩티드를 포함한다. 인간 CXCL16 전구체는 NCBI 기록 번호 NP_001094282.1에 기술되어 있으며, 그 내용은 전체적으로 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, CXCL16은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 MSGSQSEVAP SPQSPRSPEM GRDLRPGSRV LLLLLLLLLV YLTQPGNGNE GSVTGSCYCG
61 KRISSDSPPS VQFMNRLRKH LRAYHRCLYY TRFQLLSWSV CGGNKDPWVQ ELMSCLDLKE
121 CGHAYSGIVA HQKHLLPTSP P I SQASEGAS SDIHTPAQML LSTLQSTQRP TLPVGSLSSD
181 KELTRPNETT IHTAGHSLA A GPEAGENQKQ PEKNAGPTAR TSATVPVLCL LAIIFILTAA
241 LSYVLCKRRR GQSPQSSPDL PVHYIPVAPD SNT (서열 번호 86).
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 CXCL16의 다형성을 포함한다. 예를 들어, 비-표적 항원은 CXCL16의 다형성 잔기를 포함하는 CXCL16으로부터 유래된 펩티드를 포함한다. CXCL16의 다형성 잔기는 서열 번호 86의 위치 142 및 200을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 86의 아미노산 142 또는 200을 포함하는 CXCL16의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 86의 아미노산 200에서 A를 포함하는 CXCL16의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 86의 아미노산 200에서 V를 포함하는 CXCL16의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 86의 아미노산 142에서 I를 포함하는 CXCL16의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 86의 아미노산 142에서 T를 포함하는 CXCL16의 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 CXCL16의 다형성을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 86의 아미노산 200에서 A를 포함하는 CXCL16의 펩티드를 포함하고, 제2 수용체는 서열 번호 86의 위치 200에서 V를 갖는 CXCL16 리간드보다 서열 번호 86의 위치 200에서 A를 갖는 CXCL16 리간드에 대해 더 높은 친화도를 갖는 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 86의 아미노산 200에서 V를 포함하는 CXCL16의 펩티드를 포함하고, 제2 수용체는 서열 번호 86의 위치 200에서 A를 갖는 CXCL16 리간드보다 서열 번호 86의 위치 200에서 V를 갖는 CXCL16 리간드에 대해 더 높은 친화도를 갖는 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 86의 아미노산 142에서 I를 포함하는 CXCL16의 펩티드를 포함하고, 제2 수용체는 서열 번호 86의 위치 142에서 T를 갖는 CXCL16 리간드보다 서열 번호 86의 위치 142에서 I를 갖는 CXCL16 리간드에 대해 더 높은 친화도를 갖는 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 86의 아미노산 142에서 T를 포함하는 CXCL16의 펩티드를 포함하고, 제2 수용체는 서열 번호 86의 위치 142에서 I를 갖는 CXCL16 리간드보다 서열 번호 86의 위치 142에서 T를 갖는 CXCL16 리간드에 대해 더 높은 친화도를 갖는 리간드 결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 콜렉틴 서브패밀리 구성원 12 (COLEC12) 또는 MHC-I와의 복합체 내 이의 항원 펩티드를 포함한다. 인간 COLEC12는 NCBI 기록 번호 NP_569057.2에 기술되어 있고, 그 내용은 전체적으로 참조로 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, COLEC12는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 MKDDFAEEEE VQSFGYKRFG IQEGTQCTKC KNNWALKFSI ILLYILCALL TITVAILGYK
61 VVEKMDNVTG GMETSRQTYD DKLTAVESDL KKLGDQTGKK AISTNSELST FRSDILDLRQ
121 QLREITEKTS KNKDTLEKLQ ASGDALVDRQ SQLKETLENN SFLITTVNKT LQAYNGYVTN
181 LQQDTSVLQG NLQNQMYSHN VVIMNLNNLN LTQVQQRNLI TNLQRSVDDT SQAIQRIKND
241 FQNLQQVFLQ AKKDTDWLKE KVQSLQTLAA NNSALAKANN DTLEDMNSQL NSFTGQMENI
301 TTISQANEQN LKDLQDLHKD AENRTAIKFN QLEERFQLFE TDIVNIISNI SYTAHHLRTL
361 TSNLNEVRTT CTDTLTKHTD DLTSLNNTLA NIRLDSVSLR MQQDLMRSRL DTEVANLSVI
421 MEEMKLVDSK HGQLIKNFTI LQGPPGPRGP RGDRGSQGPP GPTGNKGQKG EKGEPGPPGP
481 AGERGPIGPA GPPGERGGKG SKGSQGPKGS RGSPGKPGPQ GS S GDPGPPG PPGKEGLPGP
541 QGPPGFQGLQ GTVGEPGVPG PRGLPGLPGV PGMPGPKGPP GPPGPSGAVV PLALQNEPTP
601 APEDNGCPPH WKNFTDKCYY FSVEKEIFED AKLFCEDKSS HLVFINTREE QQWIKKQMVG
661 RESHWIGLTD SERENEWKWL DGTSPDYKNW KAGQPDNWGH GHGPGEDCAG LIYAGQWNDF
721 QCEDVNNFIC EKDRETVLSS AL (서열 번호 87).
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 COLEC12의 다형성을 포함한다. 예를 들어, 비-표적 항원은 COLEC12의 다형성 잔기를 포함하는 COLEC12 로부터 유래된 펩티드를 포함한다. COLEC12의 다형성 잔기는 서열 번호 87의 위치 522를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 87의 아미노산 522를 포함하는 COLEC12의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 87의 아미노산 522에서 S를 포함하는 COLEC12의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 87의 아미노산 522에서 P를 포함하는 COLEC12의 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 APC 하향 조절 1 (APCDD1) 또는 MHC-I와의 복합체 내 이의 항원 펩티드를 포함한다. 예시적인 인간 APCDD1은 UniProtKB 기록 번호 Q8J025에 기술되어 있으며, 그 내용은 전체적으로 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, APCDD1은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 MSWPRRLLLR YLFPALLLHG LGEGSALLHP DSRSHPRSLE KSAWRAFKES QCHHMLKHLH
61 NGARITVQMP PTIEGHWVST GCEVRSGPEF ITRSYRFYHN NTFKAYQFYY GSNRCTNPTY
121 TLIIRGKIRL RQASWIIRGG TEADYQLHN V QVICHTEAVA EKLGQQVNRT CPGFLADGGP
181 WVQDVAYDLW REENGCECTK AVNFAMHELQ LIRVEKQYLH HNLDHLVEEL FLGDIHTDAT
241 QRMFYRPSSY QPPLQNAKNH DHACIACRII YRSDEHHPPI LPPKADLTIG LHGEWVSQRC
301 EVRPEVLFLT RHFIFHDNNN TWEGHYYHYS DPVCKHPTFS IYARGRYSRG VLSSRVMGGT
361 EFVFKVNHMK VTPMDAATAS LLNVFNGNEC GAEGSWQVGI QQDVTHTNGC VALGIKLPHT
421 EYEIFKMEQD ARGRYLLFNG QRPSDGSSPD RPEKRATSYQ MPLVQCASSS PRAEDLAEDS
481 GSSLYGRAPG RHTWSLLLAA LACLVPLLHW NIRR (서열 번호 88).
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 APCDD1의 다형성을 포함한다. APCDD1의 예시적인 다형성은 rs3748415를 포함하고, 이는 서열 번호 88의 위치 150에서 V, I 또는 L일 수 있다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 88의 아미노산 150을 포함하는 APCDD1의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 88의 아미노산 150에서 V를 포함하는 APCDD1의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 88의 아미노산 150에서 I를 포함하는 APCDD1의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 88의 아미노산 150에서 L을 포함하는 APCDD1의 펩티드를 포함한다.
추가의 예시적인 인간 APCDD1은 UniProtKB 기록 번호 V9GY82에 기술되어 있으며, 그 내용은 전체적으로 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, APCDD1은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 XDVAYDLWRE ENGCECTKAV NFAMHELQLI RVEKQYLHHN LDHLVEELFL GDIHTDATQR
61 MFYRPSSYQP PLQNAKCAAE SSGSFQILPQ DSSEKEQNGL SHWCLSRPGH QKDWALCAHA
121 GPATAGCPSC LWPPAETGRK AGRTSSKTVH ACPGEAGTSS FELF Y FPNCW SIETKLKISL
181 NAKLSFKPRA SAPLETGHRV KIETLSQLVF LSFIQLCCEV QSPLANK (서열 번호 134).
APCDD1의 예시적인 다형성은 rs1786683을 포함하고, 이는 서열 번호 133의 위치 165에서 Y 또는 S일 수 있다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 134의 아미노산 165를 포함하는 APCDD1의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 134의 아미노산 165에서 Y를 포함하는 APCDD1의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 134의 아미노산 165에서 S를 포함하는 APCDD1의 펩티드를 포함한다.
추가의 예시적인 인간 APCDD1은 UniProt 기록 번호 J3QSE3에 기술되어 있으며, 그 내용은 전체적으로 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, APCDD1은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
1 PEDVLPALQL PAPSAECQVE MGFHHVG Q DG LQLPTSSDPP ALASQSAGIT GVSHRPPGRH
61 LSNDLRTTTM PASPVGSSIG QTSTTLPSCP QRQT (서열 번호 135).
APCDD1의 예시적인 다형성은 rs9952598을 포함하고, 이는 서열 번호 135의 위치 28에서 Q 또는 R일 수 있다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 135의 아미노산 28을 포함하는 APCDD1의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 135의 아미노산 28에서 Q를 포함하는 APCDD1의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 서열 번호 135의 아미노산 28에서 R을 포함하는 APCDD1의 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, APCDD1은 서열 번호 88 또는 134-135 중 어느 하나에 대한 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. APCDD1의 다형성 잔기는 서열 번호 88 또는 134-135에서 볼드체로 표시되고 밑줄이 그어져 있다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-A*02를 포함한다. HLA-A*02에 결합하고 인식하는 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 다양한 단일 가변 도메인이 구현예에서 사용하기에 적합하다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-B*07을 포함한다. HLA-B*07에 결합하고 인식하는 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 다양한 단일 가변 도메인이 구현예에서 사용하기에 적합하다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-A*11을 포함한다. HLA-A*11에 결합하고 인식하는 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 다양한 단일 가변 도메인이 구현예에서 사용하기에 적합하다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-A*01을 포함한다. HLA-A*01에 결합하고 인식하는 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 다양한 단일 가변 도메인이 구현예에서 사용하기에 적합하다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-A*03을 포함한다. HLA-A*03에 결합하고 인식하는 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 다양한 단일 가변 도메인이 구현예에서 사용하기에 적합하다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-C*07을 포함한다. HLA-C*07에 결합하고 인식하는 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 다양한 단일 가변 도메인이 구현예에서 사용하기에 적합하다.
이러한 scFv는 하기 표 4에 제시된 펩티드-독립적 방식으로 예를 들어 제한 없이, 비-표적 항원 (예를 들어 HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*11, HLA-B*07, 또는 HLA-C*07)에 결합하는 다음 마우스 및 인간화 scFv 항체를 포함한다 (표시된 경우, 상보성 결정 영역은 밑줄로 표시됨):
표 4. scFv 결합 도메인
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
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Figure pct00011
Figure pct00012
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Figure pct00019
비-표적 리간드 결합 도메인에 대한 예시적인 중쇄 및 경쇄 CDR (각각, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 또는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)은 하기 표 5에 나타낸다.
표 5. 항원 결합 도메인에 해당하는 CDR
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Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
일부 구현예에서, HLA-A*02를 포함하는 비-표적 항원, 및 제2 수용체의 리간드 결합 도메인은 HLA-A*02 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 HLA-A*02를 포함하는 pMHC 복합체의 펩티드와 독립적으로 HLA-A*02에 결합한다. 일부 구현예에서, HLA-A*02 리간드 결합 도메인은 scFv 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*02 리간드 결합 도메인은 서열 번호 89-100 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*02 리간드 결합 도메인은 서열 번호 89-100 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, HLA-A*02 scFv는 서열 번호 101-112 중 어느 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 101-112 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 101-112 중 어느 하나와 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인의 중쇄는 서열 번호 101-112 중 어느 하나의 중쇄 CDR을 포함하고, 여기서 항원 결합 도메인의 경쇄는 서열 번호 101-112 중 어느 하나의 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*02 항원 결합 도메인은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄는 서열 번호 104-106 및 110-112로부터 선택된 CDR을 포함하고 경쇄는 서열 번호 101-103 및 107-109로부터 선택된 CDR을 포함한다. 임의의 리간드 결합 도메인의 추가 구현예에서, 각각의 CDR 서열은 1, 2, 3개 이상의 치환, 삽입 또는 결실을 가질 수 있다. CDR 서열은 치환, 결실 또는 삽입을 허용할 수 있다. 서열 정렬 도구, 일상적인 실험 및 공지된 검정을 사용하여, 당업자는 과도한 실험 없이 CDR 서열에서 1, 2, 3개 이상의 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 변이체 서열을 생성하고 시험할 수 있다.
일부 구현예에서, HLA-A*02 항원 결합 도메인은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄는 서열 번호 89-100 중 어느 하나의 중쇄 부분과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 번호 89-100 중 어느 하나의 경쇄 부분과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열 번호 89-100 중 어느 하나의 중쇄 부분과 동일한 서열을 포함하고, 여기서 경쇄는 서열 번호 89-100 중 어느 하나의 경쇄 부분과 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-B*07을 포함하고, 제2 수용체의 리간드 결합 도메인은 HLA-B*07 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 HLA-B*07을 포함하는 pMHC 복합체의 펩티드와 독립적으로 HLA-B*07에 결합한다. 일부 구현예에서, HLA-B*07 리간드 결합 도메인은 scFv 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-B*07 리간드 결합 도메인은 표 4에 표시된 B7 결합 도메인 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-B*07 리간드 결합 도메인은 표 4에 표시된 HLA-B*07 결합 도메인 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-B*07 scFv는 표 5에 표시된 HLA-B*07 상보성 결정 영역 (CDR) 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 표 4에 표시된 HLA-B*07 scFv 서열 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 표 4에 표시된 HLA-B*07 scFv 서열 중 어느 하나와 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-A*11을 포함하고, 제2 수용체의 리간드 결합 도메인은 HLA-A*11 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 HLA-A*11을 포함하는 pMHC 복합체의 펩티드와 독립적으로 HLA-A*11에 결합한다. 일부 구현예에서, HLA-A*11 리간드 결합 도메인은 scFv 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*11 리간드 결합 도메인은 표 4에 표시된 HLA-A*11 결합 도메인 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*11 리간드 결합 도메인은 표 4에 표시된 HLA-A*11 결합 도메인 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*11 scFv는 표 5에 표시된 HLA-A*11 상보성 결정 영역 (CDR) 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 표 4에 표시된 HLA-A*11 scFv 서열 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 표 4에 표시된 HLA-A*11 scFv 서열 중 어느 하나와 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-A*01을 포함하고, 제2 수용체의 리간드 결합 도메인은 HLA-A*01 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 HLA-A*01을 포함하는 pMHC 복합체의 펩티드와 독립적으로 HLA-A*01에 결합한다. 일부 구현예에서, HLA-A*01 리간드 결합 도메인은 scFv 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*01 리간드 결합 도메인은 표 4에 표시된 HLA-A*01 결합 도메인 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*01 리간드 결합 도메인은 표 4에 표시된 HLA-A*01 결합 도메인 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*01 scFv는 표 5에 표시된 HLA-A*01 상보성 결정 영역 (CDR) 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 표 4에 표시된 HLA-A*01 scFv 서열 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 표 4에 표시된 HLA-A*01 scFv 서열 중 어느 하나와 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-A*03을 포함하고, 제2 수용체의 리간드 결합 도메인은 HLA-A*03 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 HLA-A*03을 포함하는 pMHC 복합체의 펩티드와 독립적으로 HLA-A*03에 결합한다. 일부 구현예에서, HLA-A*03 리간드 결합 도메인은 scFv 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*03 리간드 결합 도메인은 표 4에 표시된 HLA-A*03 결합 도메인 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*03 리간드 결합 도메인은 표 4에 표시된 HLA-A*03 결합 도메인 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*03 scFv는 표 5에 표시된 HLA-A*03 상보성 결정 영역 (CDR) 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 표 4에 표시된 HLA-A*03 scFv 서열 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 표 4에 표시된 HLA-A*03 scFv 서열 중 어느 하나와 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-C*07을 포함하고, 제2 수용체의 리간드 결합 도메인 HLA- C*07 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인 HLA- C*07을 포함하는 pMHC 복합체의 펩티드와 독립적으로 HLA- C*07에 결합한다. 일부 구현예에서, HLA- C*07 리간드 결합 도메인은 scFv 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA- C*07 리간드 결합 도메인은 표 4에 표시된 HLA- C*07 결합 도메인 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA- C*07 리간드 결합 도메인은 표 4에 표시된 HLA- C*07 결합 도메인 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA- C*07 scFv는 표 5에 표시된 HLA-C*07 상보성 결정 영역 (CDR) 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 표 4에 표시된 HLA- C*07 scFv 서열 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 표 4에 표시된 HLA-C*07 scFv 서열 중 어느 하나와 동일한 서열을 포함한다.
억제 수용체
본 개시내용은 억제 키메라 항원 수용체 (즉 억제 수용체)인 제2 수용체를 제공한다. 억제 수용체는 MHC-I 복합체에서 비-표적 항원 또는 이의 펩티드 유도체에 결합하고 인식하는 세포외 리간드 결합 도메인을 포함할 수 있다.
예시적인 억제 수용체는 2020년 9월 6일에 출원된 PCT/US2020/045228, 2020년 12월 11일에 출원된 PCT/US2020/064607, 2021년 4월 29일에 출원된 PCT/US2021/029907, 및 2020년 11월 10일에 출원된 PCT/US2020/059856에 기술되어 있고, 각 내용은 본원에 참조로 포함된다.
비-표적 항원은 비-표적 대립형질 변이체일 수 있다. 본원에서 사용된 "비-표적 대립형질 변이체"는 대립유전자 (예를 들어 MHC 클래스 I 유전자의 대립형질 변이체)를 지칭하고, 그의 발현은 이형접합성의 소실, 또는 다른 발현 상실 메커니즘으로 인해 표적 세포 (예를 들어 암 세포)에서 감소되거나 제거되지만, 정상 또는 건강한 세포에서 발현되거나 검출 가능하게 발현된다.
본원에서 사용된 용어 "억제 키메라 항원 수용체" 또는 "억제 수용체"는 면역 세포의 면역 활성을 방해 또는 억제하는 억제 신호를 전달할 수 있는 세포 내 신호전달 도메인에 융합된 항원-결합 도메인을 지칭한다. 억제 수용체는 면역 세포 억제 잠재력을 가지며, 잠재력을 활성화시키는 면역 세포를 갖는 수용체인, CAR과 별개이고 구별된다. 예를 들어, CAR은 세포 내 자극 및/또는 공동 자극 도메인을 포함하기 때문에 활성화 수용체이다. 억제 수용체는 세포 내 억제 도메인을 함유하는 억제 수용체이다.
본원에서 사용된 "억제 신호"는 면역 반응의 억제 (예를 들어, 사이토카인 생성 감소 또는 면역 세포 활성화의 감소)를 유발하는 면역 세포에서의 신호 전달 또는 단백질 발현의 변화를 지칭한다. 면역 세포의 방해 또는 억제는 선택적 및/또는 가역적이거나 비선택적 및/또는 가역적일 수 있다. 억제 수용체는 비-표적 항원 (예를 들어 HLA-A*02)에 반응한다. 예를 들어, 비-표적 항원 (예를 들어 HLA-A*02)이 억제 수용체에 결합하거나 접촉하면, 억제 수용체가 반응하고 억제 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인에 의한 비-표적 항원 결합 시 억제 수용체를 발현하는 면역 세포에서 억제 신호를 활성화한다.
본 개시내용의 억제 수용체는 세포외 리간드 결합 도메인을 포함할 수 있다. 리간드 의존적 방식으로 수용체의 활성을 조절할 수 있는 임의의 유형의 리간드 결합 도메인은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각된다.
일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 항원 결합 도메인이다. 예시적인 항원 결합 도메인은 특히, scFv, SdAb, Vβ-단독 도메인, 및 TCR α 및 β 사슬 가변 도메인으로부터 유래된 TCR 항원 결합 도메인을 포함한다.
임의의 유형의 항원 결합 도메인은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 생각된다.
일부 구현예에서, 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I), 또는 HLA-A*02와의 복합체 내 COLEC12, APCDD1, CXCL16 또는 이의 항원 펩티드의 다형성 변이체에 결합하고 인식한다. 일부 구현예에서, 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 scFv이다.
일부 구현예에서, 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 억제 수용체의 세포외 도메인에 융합된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 억제 수용체는 세포외 힌지 영역을 포함한다. 예시적인 힌지는 IgD 및 CD8 도메인, 예를 들어 IgG1 로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지는 CD8α 또는 CD28로부터 단리되거나 유래된다.
본 개시내용의 억제 수용체는 억제 수용체의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 막 결합 단백질 또는 막관통 단백질에서 유래될 수 있다. 막관통 영역은 T-세포 수용체, CD28, CD3 입실론, CD45,　CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 또는 IgG4와 같은 면역글로불린의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 단리되거나 유래 (즉 이의 적어도 막관통 영역(들)을 포함)할 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우 그것은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 임의로 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이가 막관통 도메인과 억제 수용체의 세포 내 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 특히 적합한 링커를 제공한다.
본 개시내용은 세포 내 도메인을 포함하는 억제 수용체를 제공한다. 본 개시내용의 억제 수용체의 세포 내 도메인은 억제 수용체를 포함하는 면역 세포의 활성화 억제를 담당하고, 그렇지 않으면 제1 수용체에 의한 활성화 신호에 대한 반응으로 활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제 세포 내 도메인은 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다. 일부 구현예에서, ITIM을 포함하는 억제 세포 내 도메인은 CTLA-4 및 PD-1과 같은 면역 관문 억제제로부터 단리되거나 유래될 수 있다. CTLA-4 및 PD-1은 T 세포의 표면에 발현된 면역 억제 수용체이고, T 세포 반응을 약화시키거나 종료시키는 데 중추적인 역할을 한다.
일부 구현예에서, 억제 세포 내 도메인은 인간 종양 괴사 인자 관련 세포자멸사 유도 리간드 (TRAIL) 수용체 및 CD200 수용체 1로부터 단리된다. 일부 구현예에서, TRAIL 수용체는 TR10A, TR10B 또는 TR10D를 포함한다.
일부 구현예에서, 억제 세포 내 도메인은 글리코스핑고지질 마이크로도메인 1 (PAG1)을 갖는 인단백질 막 앵커로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 억제 세포 내 도메인은 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B1 (LILRB1)로부터 단리된다.
일부 구현예에서, 억제 도메인은 인간 단백질, 예를 들어 인간 TRAIL 수용체, CTLA-4, PD-1, PAG1 또는 LILRB1 단백질로부터 단리되거나 유래된다.
일부 구현예에서, 억제 도메인은 세포 내 도메인, 막관통 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제 도메인은 세포 내 도메인, 막관통 도메인, 힌지 영역 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 억제 도메인은 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 테일 2 (KIR3DL2), 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 테일 3 (KIR3DL3), 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B1 (LIR1, LIR-1 및 LILRB1이라고도 함), 프로그램된 세포 사멸 1 (PD-1), Fc 감마 수용체 IIB (FcgRIIB), 킬러 세포 렉틴 유사 수용체 K1 (NKG2D), CTLA-4, 합성 공통 ITIM, ZAP70 SH2 도메인을 함유하는 도메인 (예를 들어, N 및 C 말단 SH2 도메인 중 하나 또는 둘 모두), 또는 ZAP70 KI_K369A (키나제 불활성 ZAP70)로부터 단리되거나 유래된다.
일부 구현예에서, 억제 도메인은 인간 단백질로부터 단리되거나 유래된다.
일부 구현예에서, 제2, 억제 수용체는 억제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2, 억제 수용체는 억제 세포 내 도메인 및/또는 억제 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제 세포 내 도메인은 억제 수용체의 세포 내 도메인에 융합된다. 일부 구현예에서, 억제 세포 내 도메인은 억제 수용체의 막관통 도메인에 융합된다.
일부 구현예에서, 제2, 억제 수용체는 동일한 단백질, 예를 들어 ITIM 함유 단백질로부터 단리되거나 유래되거나 단리되거나 유래된 세포질 도메인, 막관통 도메인, 및 세포외 도메인 또는 이의 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2, 억제 수용체는 세포 내 도메인 및/또는 막관통 도메인, 예를 들어 ITIM 함유 단백질과 같은 동일한 단백질로부터 단리되거나 유래되거나 단리되거나 유래된 힌지 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 수용체는 억제 도메인을 포함하는 TCR (억제 TCR)이다. 일부 구현예에서, 억제 TCR은 억제 세포 내 도메인 및/또는 억제 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제 세포 내 도메인은 TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 감마 또는 CD3 입실론 또는 이의 일부 TCR의 세포 내 도메인에 융합된다. 일부 구현예에서, 억제 세포 내 도메인은 TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 감마 또는 CD3 입실론의 막관통 도메인에 융합된다.
일부 구현예에서, 제2 수용체는 억제 도메인을 포함하는 TCR (억제 TCR)이다. 일부 구현예에서, 억제 도메인은 LILRB1로부터 단리되거나 유래된다.
LILRB1 억제 수용체
본 개시내용은 LILRB1 억제 도메인, 및 임의로, LILRB1 막관통 및/또는 힌지 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 제2, 억제 수용체를 제공한다. 억제 수용체에 LILRB1 막관통 도메인 및/또는 LILRB1 힌지 도메인을 포함하면 다른 막관통 도메인 또는 또 다른 힌지 도메인을 갖는 참조 억제 수용체와 비교하여 억제 수용체에 의해 생성된 억제 신호를 증가시킬 수 있다. LILRB1 억제 도메인을 포함하는 제2, 억제 수용체는 본원에 기재된 바와 같은 CAR 또는 TCR일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 리간드 결합 도메인은 LILRB1-기반 제2, 억제 수용체에 융합될 수 있다.
백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B1로도 알려진, 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 뿐만 아니라 ILT2, LIR1, MIR7, PIRB, CD85J, ILT-2 LIR-1, MIR-7 및 PIR-B는 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 (LIR) 계열의 구성원이다. LILRB1 단백질은 LIR 수용체의 서브패밀리 B 클래스에 속한다. 이들 수용체는 2 내지 4개의 세포외 면역글로불린 도메인, 막관통 도메인, 및 2 내지 4개의 세포질 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. LILRB1 수용체는 면역 세포에서 발현되며, 항원-제시 세포 상의 MHC 클래스 I 분자에 결합하고 면역 반응의 자극을 억제하는 음성 신호를 전달한다. LILRB1은 세포 독성뿐만 아니라 염증 반응을 조절하고, 자가 반응성을 제한하는 역할을 하는 것으로 생각된다. LILRB1의 상이한 이소형을 암호화하는 다수의 전사 변이체가 존재하며, 이들 모두는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본원에 기재된 억제 수용체의 일부 구현예에서, 억제 수용체 LILRB1로부터 단리되거나 유래된 하나 이상의 도메인을 포함한다. LILRB1으로부터 단리되거나 유래된 하나 이상의 도메인을 갖는 수용체의 일부 구현예에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 서열 번호 113의 서열 또는 하위서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 동일한 서열 번호 113의 서열 또는 하위서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 서열 번호 113의 서열 또는 하위서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 동일한 서열 번호 113의 서열 또는 하위서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어진다.
LILRB1으로부터 단리되거나 유래된 하나 이상의 도메인을 갖는 수용체의 일부 구현예에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 다음 서열 또는 하위서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
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1381 cttcagctcg ctggcgcaca gccccaggct gggctctccc aggccaactt caccctgggc
1441 cctgtgagcc gctcctacgg gggccagtac agatgctacg gtgcacacaa cctctcctcc
1501 gagtggtcgg cccccagcga ccccctggac atcctgatcg caggacagtt ctatgacaga
1561 gtctccctct cggtgcagcc gggccccacg gtggcctcag gagagaacgt gaccctgctg
1621 tgtcagtcac agggatggat gcaaactttc cttctgacca aggagggggc agctgatgac
1681 ccatggcgtc taagatcaac gtaccaatct caaaaatacc aggctgaatt ccccatgggt
1741 cctgtgacct cagcccatgc ggggacctac aggtgctacg gctcacagag ctccaaaccc
1801 tacctgctga ctcaccccag tgaccccctg gagctcgtgg tctcaggacc gtctgggggc
1861 cccagctccc cgacaacagg ccccacctcc acatctggcc ctgaggacca gcccctcacc
1921 cccaccgggt cggatcccca gagtggtctg ggaaggcacc tgggggttgt gatcggcatc
1981 ttggtggccg tcatcctact gctcctcctc ctcctcctcc tcttcctcat cctccgacat
2041 cgacgtcagg gcaaacactg gacatcgacc cagagaaagg ctgatttcca acatcctgca
2101 ggggctgtgg ggccagagcc cacagacaga ggcctgcagt ggaggtccag cccagctgcc
2161 gatgcccagg aagaaaacct ctatgctgcc gtgaagcaca cacagcctga ggatggggtg
2221 gagatggaca ctcggagccc acacgatgaa gacccccagg cagtgacgta tgccgaggtg
2281 aaacactcca gacctaggag agaaatggcc tctcctcctt ccccactgtc tggggaattc
2341 ctggacacaa aggacagaca ggcggaagag gacaggcaga tggacactga ggctgctgca
2401 tctgaagccc cccaggatgt gacctacgcc cagctgcaca gcttgaccct cagacgggag
2461 gcaactgagc ctcctccatc ccaggaaggg ccctctccag ctgtgcccag catctacgcc
2521 actctggcca tccactagcc caggggggga cgcagacccc acactccatg gagtctggaa
2581 tgcatgggag ctgccccccc agtggacacc attggacccc acccagcctg gatctacccc
2641 aggagactct gggaactttt aggggtcact caattctgca gtataaataa ctaatgtctc
2701 tacaattttg aaataaagca acagacttct caataatcaa tgaagtagct gagaaaacta
2761 agtcagaaag tgcattaaac tgaatcacaa tgtaaatatt acacatcaag cgatgaaact
2821 ggaaaactac aagccacgaa tgaatgaatt aggaaagaaa aaaagtagga aatgaatgat
2881 cttggctttc ctataagaaa tttagggcag ggcacggtgg ctcacgcctg taattccagc
2941 actttgggag gccgaggcgg gcagatcacg agttcaggag atcgagacca tcttggccaa
3001 catggtgaaa ccctgtctct cctaaaaata caaaaattag ctggatgtgg tggcagtgcc
3061 tgtaatccca gctatttggg aggctgaggc aggagaatcg cttgaaccag ggagtcagag
3121 gtttcagtga gccaagatcg caccactgct ctccagcctg gcgacagagg gagactccat
3181 ctcaaattaa aaaaaaaaaa aaaaaagaaa gaaaaaaaaa aaaaaaaaa(서열 번호 114).
LILRB1의 하나 이상의 도메인을 갖는 수용체의 일부 구현예에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 서열 번호 114의 서열 또는 하위서열과 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
다양한 구현예에서, 폴리펩티드를 포함하는 억제 수용체가 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 다음 중 하나 이상을 포함한다: LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체; LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 LILRB1 세포 내 도메인 또는 적어도 하나, 또는 적어도 2개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함하는 세포 내 도메인, 여기서 각각의 ITIM은 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 독립적으로 선택된다.
본원에서 사용된 "면역수용체 티로신계 억제 모티프" 또는 "ITIM"은 면역계의 많은 억제 수용체의 세포질 꼬리에서 발견되는, S/I/V/LxYxxI/V/L (서열 번호 423) 등의 보존 서열을 갖는 아미노산의 보존된 서열을 지칭한다. ITIM-보유 억제 수용체가 그들의 리간드와 상호작용한 후, ITIM 모티프는 인산화되어, 억제 수용체가 포스포티로신 포스파타제 SHP-1 및 SHP-2, 또는 SHIP로 불리는 이노시톨 포스파타제와 같은 다른 효소를 모집할 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM), 적어도 2개의 ITIM, 적어도 3개의 ITIM, 적어도 4개의 ITIM, 적어도 5개의 ITIM 또는 적어도 6개의 ITIM을 포함하는 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 ITIM을 갖는다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로 이루어진 ITIM 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 ITIM을 포함하는 세포 내 도메인을 포함한다.
추가 특정한 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 2개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함하는 세포 내 도메인을 포함하고, 여기서 각각의 ITIM은 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 ITIM NLYAAV (서열 번호 115) 및 VTYAEV (서열 번호 116) 모두 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 119와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 119와 동일한 서열을 포함하거나 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 ITIM VTYAEV (서열 번호 116) 및 VTYAQL (서열 번호 117) 모두 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 120과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 120과 동일한 서열을 포함하거나 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 ITIM VTYAQL (서열 번호 117) 및 SIYATL (서열 번호 118) 모두 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 121과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 121과 동일한 서열을 포함하거나 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 ITIM NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), 및 VTYAQL (서열 번호 117)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 122와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 122와 동일한 서열을 포함하거나 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 ITIM VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 123과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 123과 동일한 서열을 포함하거나 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 ITIM NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)을 포함한다. 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 124와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 서열 번호 124와 동일한 서열을 포함하거나 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 LILRB1 세포 내 도메인 (서열 번호 129)과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 도메인은 LILRB1 세포 내 도메인 (서열 번호 129)과 동일한 서열을 포함하거나 본질적으로 이루어진다.
본 개시내용의 LILRB1 세포 내 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 4, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 또는 적어도 8개의 ITIM을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, LILRB1 세포 내 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 ITIM을 갖는다.
특정 구현예에서, 세포 내 도메인은 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함하고, 여기서 각각의 ITIM은 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 세포 내 도메인은 적어도 3개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함하고, 여기서 각각의 ITIM은 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 세포 내 도메인은 3개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함하고, 여기서 각각의 ITIM은 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 세포 내 도메인은 4개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함하고, 여기서 각각의 ITIM은 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 세포 내 도메인은 5개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함하고, 여기서 각각의 ITIM은 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 세포 내 도메인은 6개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함하고, 여기서 각각의 ITIM은 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 세포 내 도메인은 적어도 7개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함하고, 여기서 각각의 ITIM은 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 독립적으로 선택된다.
LILRB1 단백질은 D1, D2, D3 및 D4라고 불리는 4개의 면역글로불린 (Ig) 유사 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, LILRB1 힌지 도메인은 LILRB1 D3D4 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, LILRB1 D3D4 도메인은 서열 번호 125와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, LILRB1 D3D4 도메인은 서열 번호 125를 포함하거나 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 포함한다. 구현예에서, LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체는 서열 번호 132, 서열 번호 125, 또는 서열 번호 126과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함한다. 구현예에서, LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체는 서열 번호 132, 서열 번호 125, 또는 서열 번호 126과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, LILRB1 힌지 도메인은 서열 번호 132, 서열 번호 125, 또는 서열 번호 126과 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, LILRB1 힌지 도메인은 본질적으로 서열 번호 132, 서열 번호 125, 또는 서열 번호 126과 동일한 서열로 이루어진다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 13에 대해 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한 또는 적어도 99%인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 133과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, LILRB1 막관통 도메인은 서열 번호 133과 동일한 서열을 포함한다. 구현예에서, LILRB1 막관통 도메인은 본질적으로 서열 번호 133과 동일한 서열로 이루어진다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 힌지, 예를 들어, 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 제2, 억제 수용체, 예를 들어, 항원 결합 도메인 또는 리간드 결합 도메인의 세포외 영역에 부착될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 힌지는 인간 면역글로불린 (Ig) 힌지, 예를 들어, IgG4 힌지, CD8a 힌지 또는 LILRB1 힌지일 수 있다.
일부 구현예에서, 제2, 억제 수용체는 억제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2, 억제 수용체는 억제 세포 내 도메인 및/또는 억제 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제 도메인은 LILR1B로부터 단리되거나 유래된다.
LILRB1 도메인 조합을 포함하는 억제 수용체
일부 구현예에서, 본 개시내용의 LILRB1-기반 억제 수용체는 하나 초과의 LILRB1 도메인 또는 이의 기능적 등가물을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 억제 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 및 세포 내 도메인, 또는 LILRB1 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포 내 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 억제 수용체는 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 및 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열 번호 127과 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열 번호 127과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열 번호 127과 동일한 서열을 포함한다.
추가 구현예에서, 억제 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 LILRB1 세포 내 도메인 및/또는 적어도 하나의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함하는 세포 내 도메인을 포함하고, 여기서 ITIM은 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 LILRB1 세포 내 도메인 및/또는 적어도 2개의 ITIM을 포함하는 세포 내 도메인을 포함하고, 여기서 각각의 ITIM은 NLYAAV (서열 번호 115), VTYAEV (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 억제 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 및 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열 번호 128과 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열 번호 128과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열 번호 128과 동일한 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 억제 수용체는 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체; LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 LILRB1 세포 내 도메인 및/또는 적어도 2개의 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프 (ITIM)를 포함하는 세포 내 도메인을 포함하고, 여기서 각각의 ITIM은 LYAAV (서열 번호 115), VTYAE (서열 번호 116), VTYAQL (서열 번호 117), 및 SIYATL (서열 번호 118)로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 억제 수용체는 서열 번호 130 또는 서열 번호 131과 적어도 95% 동일한, 또는 서열 번호 130 또는 서열 번호 131과 적어도 99% 동일한, 또는 서열 번호 130 또는 서열 번호 131과 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열 번호 127과 적어도 99% 동일한, 또는 서열 번호 127과 적어도 99% 동일한, 또는 서열 번호 127과 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열 번호 128과 적어도 99% 동일한, 또는 서열 번호 128과 적어도 99% 동일한, 또는 서열 번호 128과 동일한 서열을 포함한다.
표 6. 예시적인 LILRB1-기반 억제 수용체에 대한 폴리펩티드 서열
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
폴리뉴클레오티드 및 벡터
본 개시내용은 본 개시내용의 제1 및 제2 수용체의 서열(들)을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 본원에 기재된 shRNA를 추가로 포함한다. 본 개시내용은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 포함하는 면역 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 서열 번호 180, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 서열 번호 181, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 서열 번호 182, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 서열 번호 183, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 서열 번호 184, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 서열 번호 185, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 서열 번호 187, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 서열 번호 189, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 서열 번호 191 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 서열 번호 193, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 수용체의 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 수용체를 암호화하는 서열은 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 제2 수용체를 암호화하는 서열은 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
본 개시내용은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 구현예에서, 제1 수용체는 제1 벡터에 의해 암호화되고 제2 수용체는 제2 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 두 수용체 모두 단일 벡터에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 수용체는 단일 벡터에 의해 암호화된다. 단일 벡터를 사용하여 다수의 폴리펩티드를 암호화하는 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이며, 특히, 상이한 프로모터의 제어 하에 다수의 폴리펩티드를 암호화하거나, 단일 프로모터를 사용하여 다수의 폴리펩티드의 전사, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및/또는 자가 절단 펩티드를 암호화하는 서열의 사용을 제어하는 경우를 포함한다. 예시적인 자가 절단 펩티드는 T2A, P2A, E2A 및 F2A 자가 절단 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, T2A 자가 절단 펩티드 EGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 430)의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, P2A 자가 절단 펩티드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열 번호 431)의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, E2A 자가 절단 펩티드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP (서열 번호 432)의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, F2A 자가 절단 펩티드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (서열 번호 433)의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, T2A 자가 절단 펩티드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 430)의 서열을 포함한다. 전술한 것 중 임의의 것은 또한 N 말단 GSG 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, T2A 자가 절단 펩티드는 또한 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 178)의 서열을 포함할 수 있고, 이는 GGATCCGGAGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACCCTGGCCCC (서열 번호 434)의 서열에 의해 암호화될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 180, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 181, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 182, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 183, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 184, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 185, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 187, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 189, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 191, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 193, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 186, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 188, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 190, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 192, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 194, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 암호화한다.
일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터, 즉 적합한 세포에서 제1 및/또는 제2 수용체의 발현을 위한 것이다.
렌티바이러스와 같은 레트로바이러스에서 유래된 벡터는 이식 유전자의 장기적이고 안정적인 통합과 딸 세포에서의 전파를 허용하기 때문에 장기 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비증식 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 쥣과 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스에서 유래한 벡터에 비해 추가적인 이점이 있다. 그들은 또한 낮은 면역원성이라는 추가적인 이점을 가지고 있다.
수용체를 암호화하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 수용체 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고 작제물을 발현 벡터에 혼입함으로써 달성된다. 벡터는 복제 및 통합 진핵생물에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.
수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 여러 유형의 벡터로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 벡터로 클로닝될 수 있다. 특히 관심있는 벡터에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터가 포함된다.
추가로, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 면역 세포와 같은 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려졌으며, 예를 들어, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 기타 바이러스학 및 분자생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
다수의 바이러스 기반 시스템이 포유류 세포로 유전자 전달을 위해 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 벡터에 삽입되고 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이어서 재조합 바이러스는 분리되어 생체 내 또는 생체 외 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가 프로모터 요소, 예를 들어, 인핸서는 전사 개시 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 시작 부위의 업스트림 30-110 염기쌍 (bp) 영역에 위치하지만, 최근에는 많은 프로모터가 시작 부위의 다운스트림에도 기능적 요소를 포함하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소 사이의 간격은 종종 유연하므로 요소가 반전되거나 서로 상대적으로 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 협력적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화할 수 있는 것으로 보인다.
적합한 프로모터의 한 예는 즉시 초기 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 신장 성장 인자-1α (EF-1α)이다. 그러나, 유인원 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스테인-바 바이러스 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, U6 프로모터, 뿐만 아니라 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터와 같지만, 이에 제한되지 않는 인간 유전자 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 사용될 수 있다. 추가로, 본 개시내용은 구성적 프로모터의 사용에 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터도 본 발명의 일부로 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 그러한 발현이 요구될 때 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나 발현이 원하지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
수용체의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염시키려는 세포 집단으로부터 발현 세포의 식별 및 선택을 용이하게 하기 위해 선별 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 선별 가능한 마커는 별도의 DNA 조각으로 운반될 수 있고 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선별 가능한 마커 및 리포터 유전자 모두는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열과 함께 플랭킹될 수 있다. 유용한 선별 마커는 예를 들어, neo 등과 같은 항생제 내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염되거나 형질도입된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능을 평가하는 데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않으며 그의 발현이 예를 들어 효소 활성과 같은 쉽게 검출할 수 있는 특성에 의해 나타나는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용 세포에 도입된 후 적합한 시간에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). 적합한 발현 시스템은 잘 알려졌고 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 입수될 수 있다. 일반적으로, 가장 높은 수준의 리포터 유전자 발현을 나타내는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 작제물이 프로모터로 식별된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있으며 프로모터-동 전사를 조절하는 능력에 대한 제제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
유전자를 세포에 도입하고 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전법, 리포펙션법, 입자 충격법, 미세주입법, 전기천공법 등을 포함한다 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려졌다. 예를 들어, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 참조. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 한 가지 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물, 예를 들어, 인간 세포에 유전자를 삽입하는 데 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362 참조.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 방법은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질 기반 시스템과 같은 콜로이드 분산 시스템을 포함한다. 예시적인 시험관 내 및 생체 내 전달 비히클로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공 막 소포)이다.
외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법 또는 본 발명의 억제제에 세포를 노출시키는 방법과 상관없이, 숙주 세포 내 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 분석을 수행할 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어, 서던 및 노던 블로팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 검정; 예를 들어, 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯) 또는 본 개시내용의 범위 내에 속하는 작용제를 확인하기 위한 본원에 기재된 검정에 의해 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 "생화학적" 검정을 포함한다.
면역 세포
본 개시내용은 본원에 기재된 수용체, 벡터 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 다음을 포함한다: (a) 하기로부터 선택된 표적 항원에 특이적인 제1 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 수용체: (i) 암 세포 특이적 항원, 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체 내 이의 펩티드 항원; 또는 (ii) EGFR, 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체 내 이의 펩티드 항원; 및 (b) 그의 발현이 이형접합성의 소실 또는 다른 메커니즘으로 인해 암 세포로부터 소실된 비-표적 항원에 특이적으로 결합하는 제2 세포외 리간드를 포함하는 제2 수용체. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 CXCL16, COLEC12 및 APCDD1, HLA-A*01, HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*11, HLA-B*07, HLA-C*07, 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체 내 이의 항원 펩티드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 비-표적 항원은 HLA-A*02, 또는 이의 대립형질 변이체이다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 CAR 또는 TCR이다. 일부 구현예에서, 제2 수용체는 억제 수용체이다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 shRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, shRNA는 B2M의 발현을 감소시키거나 제거한다. 일부 구현예에서, shRNA는 HLA-A*02의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 MHC 클래스 I 유전자 또는 B2M 유전자에 대한 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 유전자는 HLA-A*02, 또는 이의 대립형질 변이체이다. 일부 구현예에서, 변형은 MHC 클래스 I 유전자 또는 B2M 유전자의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 본원에 기재된 제1 수용체를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 본원에 기재된 제2 수용체를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 본원에 기재된 shRNA를 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 본원에 기재된 제1 수용체 및 본원에 제2 수용체를 암호화하는 기재된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템은 본원에 기재된 제1 수용체, 본원에 기재된 제2 수용체, 및 본원에 기재된 shRNA를 암호화하는 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역 세포"는 선천적 또는 후천적 (획득) 면역 시스템에 관여하는 세포를 지칭한다. 예시적인 선천성 면역 세포는 호중구, 단핵구 및 대식세포와 같은 식세포, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구 호산구 및 호염기구와 같은 다핵성 백혈구 및 단핵구, 대식세포 및 비만 세포와 같은 단핵 세포를 포함한다. 후천 면역의 역할을 하는 면역세포는 T-세포 및 B-세포와 같은 림프구를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 수용체는 서열 번호 177, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 174 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 서열 번호 177, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 서열 번호 175, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 174, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 서열 번호 175, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 서열 번호 176, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체는 서열 번호 176, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 제2 수용체는 서열 번호 174, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 T2A 자가 절단 펩티드를 추가로 포함하고, 여기서 T2A 자가 절단 펩티드는 서열 번호 178, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 간섭 RNA를 추가로 포함하고, 여기서 간섭 RNA는 서열 번호 179, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "T-세포"는 흉선에서 발생하는 골수 전구체로부터 유래하는 유형의 림프구를 지칭한다. 흉선으로 이동할 때 발생하는 여러 개별 유형의 T-세포는 헬퍼 CD4+ T-세포, 세포독성 CD8+ T 세포, 기억 T 세포, 조절 CD4+ T-세포, NK T 세포, γδ T 세포, 점막 -관련 불변 T (MAIT) 세포, 및 줄기 기억 T-세포를 포함한다. 상이한 유형의 T-세포는 그들의 마커 발현에 기초하여 통상의 기술자에 의해 구별될 수 있다. T-세포 유형을 구별하는 방법은 통상의 기술자에게 쉽게 자명할 것이다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포 및 자연 살해 (NK) 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD8-이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD8+이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD4+이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD4-이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD8-/CD4+ 이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD8+ CD4- T 세포이다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 감마 델타 (γδ) T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 불변 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 불변 자연 살해 T 세포 (iNKT 세포)이다.
일부 구현예에서, 제1 수용체 및 제2 수용체는 함께 표적 세포의 존재 하에 면역 세포를 특이적으로 활성화시킨다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 비천연 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 단리된다.
T 세포와 같은, 면역 세포의 집단을 본 개시내용의 벡터로 형질전환시키는 방법은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다. 예를 들어, CD3+ T 세포는 제조업체의 지침에 따라 CD3+ T 세포 음성 분리 키트 (Miltenyi)를 사용하여 PBMC로부터 분리할 수 있다. T 세포는 CD3/28 다이나비드 (1:1 세포 대 비드 비율) 및 300 단위/mL의 IL-2 (Miltenyi)의 존재 하에 5% 인간 A/B 혈청 및 1% Pen/strep이 보충된 X-Vivo 15 배지에서 1 x 10^6 세포/mL의 밀도로 배양될 수 있다. 2일 후, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 T 세포를 형질도입할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 5의 감염 다중도 (MOI)에서 형질도입된다. 그런 다음 세포는 IL-2 또는 IL-7/15/21의 조합과 같은 다른 사이토카인에서 농축 전 추가 5일 동안 배양될 수 있다. B 세포와 같은 면역 세포의 다른 집단, 또는 다른 T 세포의 다른 집단을 분리하고 배양하는 방법은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다. 이 방법은 잠재적인 접근 방식을 설명하지만 이러한 방법론이 빠르게 진화하고 있다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포의 우수한 바이러스 형질도입은 성장 5일 후에 달성되어 >99% CD3+ 고도로 형질도입된 세포 집단을 생성할 수 있다.
TCR, CAR, 억제 수용체, 수용체 또는 이를 암호화하는 벡터를 포함하는 T 세포 집단을 활성화 및 배양하는 방법은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다.
TCR을 발현하기 위한 T 세포의 유전적 변형 전이든 후이든, T 세포는 일반적으로 예를 들어, 미국 특허 번호 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041, 10040846; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0121005에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 확장될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 T 세포는 시험관 내에서 확장되고 활성화된다. 일반적으로, 본 개시내용의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상의 공동 자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 시험관 내에서 확장된다. 특히, T 세포 집단은 예를 들어 항-CD3 항체와의 접촉에 의해 본원에 기술된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포의 표면의 보조 분자의 공동 자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적합한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉할 수 있다. CD4+　T 세포 또는 CD8+　T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 사용할 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 당업계에 일반적으로 알려진 다른 방법을 사용할 수 있는 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)을 포함한다 (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
일부 구현예에서, T 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공동 자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각 신호를 제공하는 작용제는 용액에 있거나 표면에 결합될 수 있다. 표면에 커플링될 때, 작용제는 동일한 표면 (즉, "시스" 형태) 또는 분리된 표면 (즉, "트랜스" 형태)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 작용제는 표면에 결합되고 다른 작용제는 용액에 커플링될 수 있다. 일부 구현예에서, 공동 자극 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합되고 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나 표면에 결합된다. 특정 구현예에서, 두 제제 모두 용액 상태일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 작용제는 가용성 형태일 수 있고, 이어서 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 작용제에 결합할 항체 또는 다른 결합제와 같은 표면에 가교 결합될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, 본 개시내용에서 T 세포를 활성화 및 확장하는데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 대한 미국 특허 출원 공개 번호 20040101519 및 20060034810 참조.
일부 구현예에서, 2개의 작용제는 동일한 비드, 즉, "시스," 또는 별도의 비드, 즉, "트랜스" 상의 비드에 고정화된다. 예로서, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고 공동 자극 신호는 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고; 두 작용제는 동일한 분자량으로 동일한 비드에 공동 고정화된다. 한 구현예에서, CD4+　T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 1:1 비율의 각 항체가 사용된다. 일부 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율은 100:1 내지 1:100 범위이고 그 사이의 모든 정수 값이다. 본 개시내용의 한 양태에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되며, 즉 CD3:CD28의 비율은 1 미만이다. 본 개시내용의 특정 구현예에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비율은 2:1보다 크다.
1:500 내지 500:1의 입자 대 세포 비율 및 그 사이의 임의의 정수 값을 사용하여 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극할 수 있다. 당업자가 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비율은 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 몇 개의 세포에만 결합할 수 있는 반면 큰 비드는 많은 세포에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서 세포 대 입자의 비율은 1:100 내지 100:1 범위이고 그 사이의 임의의 정수 값이고 추가 구현예에서 비율은 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하고, T 세포를 자극하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 1:1 세포 대 비드의 비율이 사용된다. 당업자는 다양한 다른 비율이 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 비율은 입자 크기와 세포 크기 및 유형에 따라 달라질 것이다.
본 개시내용의 추가 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포는 제제-코팅된 비드와 결합되고, 비드 및 세포는 후속적으로 분리된 다음 세포가 배양된다. 대안적인 구현예에서, 배양 전에 제제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. 추가 구현예에서, 비드 및 세포는 자기력과 같은 힘의 적용에 의해 먼저 농축되어 세포 표면 마커의 결찰이 증가되어 세포 자극을 유도한다.
예로서, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28가 부착된 상자성 비드가 T 세포와 접촉하도록 함으로써 결찰될 수 있다. 한 구현예에서 세포 (예를 들어, CD4+ T 세포) 및 비드 (예를 들어, 1:1 비율의 DYNABEADS CD3/CD28 T 상자성 비드)는 완충액에서 결합된다. 다시, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 인식할 수 있다. 특정 구현예에서 세포와 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, 약 20억 세포/ml의 농도가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 1억 초과 세포/ml가 사용된다. 추가 구현예에서, 1천, 1천5백, 2천, 2천5백, 3천, 3천5백, 4천, 4천5백, 또는 5천만 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 7천5백, 8천, 8천5백, 9천, 9천5백, 또는 1억 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가 구현예에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 1x106 세포/mL의 밀도로 배양되는 세포가 사용된다.
일부 구현예에서, 혼합물은 수 시간 (약 3시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 시간당 정수 값 동안 배양될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 비드 및 T 세포는 2-3일 동안 함께 배양된다. T 세포 배양에 적합한 조건은 혈청 (예를 들어, 태아 소 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 당업자에게 공지된 세포 성장을 위한 임의의 기타 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존력을 위해 필수적인 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지 (예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15, (Lonza))를 포함한다. 세포 성장을 위한 기타 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올과 같은 환원제를 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 배지는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, 옵티마이저를 포함할 수 있고, 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민이 추가되거나, 무혈청이거나 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정의된 일련의 호르몬, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인으로 보충된다. 일부 구현예에서, 배지는 5% 인간 A/B 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 (pen/strep) 및 300 단위/ml의 IL-2 (Miltenyi)이 보충된 X-VIVO-15 배지를 포함한다.
T 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도 (예를 들어, 37℃) 및 대기 (예를 들어, 공기 +5% CO2) 하에서 유지된다.
일부 구현예에서, TCR, CAR 및 본 개시내용의 억제 수용체를 포함하는 T 세포는 자가 세포이다. 확장 및 유전적 변형 전에, T 세포의 공급원은 대상체로부터 수득된다. T 세포와 같은 면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 본 개시내용의 특정 구현예에서, 당업계에서 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 개시내용의 특정 구현예에서, T 세포는 Ficoll™ 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 얻어진다. 성분채집 산물은 일반적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 포함한다. 일부 구현예에서, 성분채집법에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 넣기 위해 세척될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척된다. 대안적인 구현예에서, 세척 용액은 칼슘이 부족하고 마그네슘이 부족할 수 있거나 전부는 아니지만 많은 2가 양이온이 부족할 수 있다. 당업자는 세척 단계가 제조업체의 지침에 따라 반자동 "유동식" 원심분리기 (예를 들어, Cobe 2991 cell processor, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하여 당업자에게 알려진 방법에 의해 달성될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 세척 후, 세포는 예를 들어, Ca2+-프리, Mg2+-프리 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충액이 있거나 없는 다른 식염수와 같은 다양한 생체 적합성 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포와 같은 면역 세포는 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심 분리에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 분리된다. T 세포, B 세포, 또는 CD4+ T 세포와 같은 면역 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 분리될 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 시간 동안, 항-CD4 -접합 비드와 함께 배양함으로써 분리된다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단과 같은 면역 세포 집단의 농축은 음성 선택 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론 항체 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역 부착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택으로 CD4+ 세포를 강화하기 위해, 단일 클론 항체 칵테일은 일반적으로 CD 14, CD20, CD 11b, CD 16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다.
양성 또는 음성 선택에 의한 원하는 면역 세포 집단의 분리를 위해, 세포 및 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도는 다양할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 2-10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 동안 회전기에서 배양될 수 있다.
자극을 위한 T 세포, 또는 T 세포와 같은 면역 세포가 분리되는 PBMC도 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거함으로써 더욱 균일한 산물을 제공한다. 혈장과 혈소판을 제거하는 세척 단계 후 세포를 동결 용액에 현탁할 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 당업계에 알려졌고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 또는 예를 들어, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함하고, 이어서 세포는 분당 1°의 속도로 -80℃로 동결되고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상태로 저장된다. -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않은 동결뿐만 아니라 제어된 동결의 다른 방법을 사용할 수 있다.
본 개시내용은 본원에 기재된 활성화제 및/또는 억제 수용체를 발현하는 면역 세포를 제공하고, 여기서 면역 세포는 주요 조직적합성 (MHC) 클래스 I 복합체의 감소된 발현 및/또는 기능을 갖는다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 자가 세포이다. 예를 들어, 면역 세포는 치료 요법의 일부로서 세포를 수용할 동일한 대상체로부터 분리되거나 유래된다. MHC 클래스 I 항원에 특이적인 억제 수용체로 MHC 클래스 I의 감소된 발현 및/또는 기능을 갖도록 자가 면역 세포를 변형시키는 것이 유리할 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, MHC 클래스 I의 감소된 발현 및/또는 기능을 갖도록 하는 자가 면역 세포의 변형은 시스 또는 트랜스로 면역 세포에 의해 발현되는 MHC 클래스 I에 의한 억제 수용체의 결합을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 모두 동종이계이다. 동종이계 면역 세포는 면역 세포가 투여될 대상체 이외의 공여자로부터 유래될 수 있다. 동종이계 면역 세포는 다양한 유전형의 대상체에서 사용하기 위해 동종이계 세포를 준비하고 보관할 가능성 때문에 세포 요법에서 일반적으로 "규격품(off the shelf)" 또는 "보편적"이라고 한다.
MHC 클래스 I 복합체의 발현 및/또는 기능을 감소시키는 임의의 적합한 방법은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주되며, 특히 MHC 클래스 I 성분을 암호화하는 하나 이상의 RNA를 녹다운시키는 간섭 RNA의 발현, 또는 MHC 클래스 I 성분을 암호화하는 유전자의 변형을 포함한다.
주요 조직적합성 복합체 (MHC)는 적응 면역 체계에 필요한 일련의 폴리펩티드를 암호화하는 척추동물 게놈 상 유전자좌이다. 이들 중에는 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C 및 이의 대립유전자를 포함하는 MHC 클래스 I 폴리펩티드가 있다. MHC 클래스 I 대립유전자는 매우 다형성이 있으며 모든 유핵 세포에서 발현된다. HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C 및 이의 대립유전자에 의해 암호화되는 MHC 클래스 I 폴리펩티드는 β마이크로글로불린 (B2M)과 이종이량체를 형성하고 세포 표면에서 항원과 복합체로 존재한다. 본원에서 언급된 바와 같이, MHC 클래스 I 유전자 또는 폴리펩티드는 MHC 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 상응하는 유전자에서 발견되는 임의의 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 면역 세포는 MHC 클래스 I 폴리펩티드, 예를 들어 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C 및 이의 대립유전자를 포함하는 억제제 리간드에 의해 불활성화된다. HLA-A 대립유전자는 예를 들어 제한 없이, HLA-A*02, HLA-A*02:01, HLA-A*02:01:01, HLA-A*02:01:01:01이고/거나, HLA-A*02 단백질과 동일하거나 유사한 단백질을 암호화하는 임의의 유전자일 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 자가분비 신호전달/ 결합을 방지하기 위해, 면역 세포에서 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C 및 이의 대립유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현을 제거하거나 감소시키는 것이 바람직하다.
MHC 클래스 I 폴리펩티드 발현이 감소된 면역 세포
일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역 세포는 내인성 MHC 클래스 I 폴리펩티드의 대립유전자를 암호화하는 내인성 유전자의 발현 또는 기능을 불활성화시키거나 감소 또는 제거하도록 변형된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 HLA-A, HLA-B, 및/또는 HLA-C이다. HLA-A, HLA-B 및 HLA-C는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌에 의해 암호화된다. 각각의 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C는 많은 변이 대립유전자를 포함하며, 이들 모두는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 HLA-A이다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 HLA-A*02이다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 HLA-A*02:01이다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 HLA-A*02:01:01이다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 HLA-A*02:01:01:01이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 유전적으로 조작된 면역 세포는 B2M 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된다. 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I, 즉 MHC-I 복합체와 관련된 단백질을 암호화한다. MHC-I 복합체는 세포 표면에 항원을 제시하는 데 필요하다. MHC -I 복합체는 B2M이 결실될 때 파괴되고 기능하지 않는다 (Wang D et al. Stem Cells Transl Med. 4:1234-1245 (2015)). 또한, B2M 유전자는 당업계에 알려진 유전자 편집 기술을 사용하여 고효율로 파괴될 수 있다 (Ren et al. Clin. Cancer Res. 23:2255-2266 (2017)). B2M을 줄이거나 제거하면 면역 세포의 표면 상의 기능적 MHC I를 줄이거나, 제거할 수 있다.
본 개시내용은 면역 세포에서 내인성 표적 유전자를 편집하기 위한 유전자 편집 시스템을 제공한다. 본 개시내용은 표적 유전자의 서열에 특이적인 간섭 RNA를 제공한다. CRISPR/Cas 시스템, TALEN 및 징크 핑거(zinc finger)와 같은 유전자 편집 시스템을 사용하여 이중 가닥 절단을 생성할 수 있으며, 이는 상동성 지정 복구 또는 비-상동성 말단 접합 (NHEJ)과 같은 유전자 복구 메커니즘을 통해 돌연변이를 도입하는 데 사용할 수 있다. 절단 끝의 절제 후 NHEJ, 또는 부적절한 끝 접합을 사용하여 결실을 도입할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 MHC-I 복합체의 서브유닛을 암호화하는 유전자를 포함한다.
표적 유전자 서열은 프로모터, 인핸서, 인트론, 엑손, 인트론/엑손 접합부, 전사 산물 (pre-mRNA, mRNA, 및 스플라이스 변이체), 및/또는 3' 및 5' 비번역 영역 (UTR)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 임의의 유전자 요소 또는 유전자 요소의 조합은 본원에 기재된 면역 세포에서 유전자 편집의 목적을 위해 표적화될 수 있다. 표적 유전자에 대한 변형은 표적 유전자 또는 유전자 산물의 발현 또는 기능을 변경하거나 방해하는 표적 유전자를 편집하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, MHC 클래스 I 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 변형시키는 것은 유전자의 전부 또는 일부를 결실시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 변형시키는 것은 유전자에 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 결실, 삽입, 치환 또는 프레임이동 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자를 변형시키는 것은 핵산 유도 엔도뉴클레아제를 사용하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 표적 유전자에 대한 유전자 서열은 당업계에 공지되어 있다. 서열은 NCBI GenBank 또는 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스와 같은 공용 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 서열은 유전자 식별자를 사용하여 찾을 수 있고, 예를 들어, HLA-A 유전자는 NCBI 유전자 ID: 3105를 갖고, HLA-B 유전자는 NCBI 유전자 ID: 3106을 갖고, HLA-C 유전자는 NCBI 유전자 ID: 3107을 갖고, B2M 유전자는 NCBI 유전자 ID: 567 및 NCBI 참조 서열: NC_000015.10을 갖는다. 유전자 서열은 키워드를 사용하여 공개 데이터베이스를 검색하여 찾을 수도 있다. 예를 들어, HLA-A 대립유전자는 키워드, "HLA-A*02", "HLA-A*02:01", "HLA-A*02:01:01" 또는 "HLA-A*02:01:01:01"을 검색하여 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 이들 서열은 당업계에 공지된 다양한 유전자 편집 기술에서 표적화를 위해 사용될 수 있다. 표 7은 본원에 기재된 변형을 위해 표적화된 HLA-A 대립유전자 및 B2M 유전자 서열의 비제한적 예시적 서열을 제공한다.
표 7. 예시적인 표적 유전자 서열
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
당업자는 T가 U를 대체하여 서열을 DNA 서열로 또는 그 반대로 전환할 수 있고, 둘 다 본 개시내용의 표적 유전자 서열로 간주됨을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 표적 유전자는 유도된 엔도뉴클레아제를 사용하여 본원에 기술된 면역 세포에서 편집된다. 예시적인 핵산 유도된 엔도뉴클레아제는 CRISPR/Cas9와 같은 클래스 II를 포함한다.
본원에 사용된 "CRISPR" 또는 "CRISPR 유전자 편집"은 군집된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복 세트 또는 이러한 반복 세트를 포함하는 시스템을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "Cas"는 CRISPR-연관 단백질을 지칭한다. "CRISPR/Cas" 시스템은 표적 유전자를 침묵시키거나 녹아웃시키거나 돌연변이시키는 데 사용될 수 있는 CRISPR 및 Cas에서 파생된 시스템을 지칭한다. 이 시스템은 플라스미드 및 파지와 같은 외래 유전 요소에 대한 저항성을 부여하고 일종의 획득 면역을 제공하는 일종의 원핵 면역 시스템이다. CRISPR/Cas 시스템은 유전자 편집에 사용하기 위해 변형되었다. 이는 하나 이상의 특별히 설계된 가이드 핵산 (gNA), 일반적으로 가이드 RNA (gRNA), 및 gNA와 리보핵단백질 복합체를 형성하는 적절한 Cas 엔도뉴클레아제를 진핵 세포에 도입함으로써 달성된다. gNA는 gNA-엔도뉴클레아제 단백질 복합체를 표적 게놈 위치로 유도하고, 엔도뉴클레아제는 표적 게놈 위치에서 가닥 절단을 도입한다. 이러한 이중 가닥 절단은 비-상동 말단 접합 (결실을 야기함) 또는 상동 수리 (삽입을 생성할 수 있음)와 같은 세포 메커니즘에 의해 수리될 수 있으며, 이에 따라 숙주 세포 게놈에 유전적 변형을 도입한다.
CRISPR/Cas 시스템은 클래스 및 유형별로 분류된다. 클래스 2 시스템은 현재 세 가지 유형 (유형 II, V 및 VI)으로 분류되는 단일 간섭 단백질을 나타낸다. 유전자 편집에 적합한 임의의 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템, 예를 들어 유형 II, 유형 V 또는 유형 VI 시스템은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 생각된다. 예시적인 클래스 2 유형 II CRISPR 시스템은 Cas9, Csn2 및 Cas4를 포함한다. 예시적인 클래스 2, 유형 V CRISPR 시스템은 Cas12, Cas12a (Cpf1), Cas12b (C2c1), Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i 및 Cas12k (C2c5)를 포함한다. 예시적인 클래스 2 유형 VI 시스템은 Cas13, Cas13a (C2c2) Cas13b, Cas13c 및 Cas13d를 포함한다.
CRISPR 유전자좌라고도 하는, CRISPR 서열은 교대 반복과 스페이서로 구성된다. 자연 발생 CRISPR에서, 스페이서는 일반적으로 플라스미드 또는 파지 서열과 같은 박테리아 외래 서열을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 스페이서 서열은 또한 "표적화 서열"로 지칭될 수 있다. 유전 공학을 위한 CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서는 표적 유전자 서열 (gNA)에서 파생된다.
예시적인 클래스 2 유형 II CRISPR 시스템은 이중 나선의 각 가닥에 대해 하나씩 2개의 활성 절단 부위를 갖는 뉴클레아제인 단백질 Cas9에 의존한다. Cas9과 변형된 CRISPR 유전자좌 RNA를 조합하면 유전자 편집 시스템에서 사용할 수 있다. Pennisi (2013) Science 341: 833-836. 일부 구현예에서, 면역 세포를 변형시키는 데 사용되는 Cas 단백질은 Cas9이다.
따라서 CRISPR/Cas 시스템은 염기쌍을 추가 또는 삭제하거나 표적의 발현을 감소시키는 조기 중단을 도입함으로써 본원에 기술된 면역 세포에서 편집을 위해 표적화된 유전자와 같은 표적 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 RNA 간섭처럼 대안적으로 사용되어 가역적인 방식으로 표적 유전자를 차단할 수 있다. 포유류 세포에서, 예를 들어, RNA는 Cas 단백질을 표적 유전자 프로모터로 안내하여 RNA 중합효소를 입체적으로 차단할 수 있다.
Cas 단백질은 임의의 박테리아 또는 고세균 Cas 단백질에서 파생될 수 있다. 임의의 적합한 CRISPR/Cas 시스템은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각된다. 다른 양태에서, Cas 단백질은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a (Cpf1), Cas13, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, CasX, CasY, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 버전 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질, Cpf1 단백질, C2c1 단백질, C2c2 단백질, C2c3 단백질, Cas3, Cas3-HD, Cas 5, Cas7, Cas8, Cas10, 또는 이들의 조합 또는 복합체이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다.
예를 들어, 미국 공개 번호 20140068797, 및 Cong (2013) Science 339: 819-823에 기술된 당업계에 알려진 기술을 사용하여 표적 유전자를 억제하는 인공 CRISPR/Cas 시스템을 생성할 수 있다. 예를 들어, Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576, 미국 특허 번호 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; 및 8,697,359에 기술된 표적 유전자를 억제하는 당업계에 알려진 다른 인공 CRISPR/Cas 시스템을 또한 생성할 수 있다. 특정 Cas 단백질에 적합한 gNA를 설계하는 방법은 당업자에게 공지될 것이다.
본 개시내용은 표적 핵산 게놈 내의 특정 표적 유전자 서열에 대한 관련 폴리펩티드 (예를 들어, 핵산 유도된 엔도뉴클레아제)의 활성을 지시할 수 있는 유전자-표적화 가이드 핵산 (gNA)을 제공한다. 게놈-표적화 핵산은 RNA일 수 있다. 게놈-표적화 RNA는 본원에서 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"로 지칭된다. 가이드 RNA는 적어도 관심 표적 핵산 서열에 혼성화하는 표적화 서열, 및 CRISPR 반복 서열을 포함할 수 있다. 일부 유형 II 시스템에서, gRNA는 또한 본원에서 "스캐폴드" 서열로도 지칭되는, tracrRNA 서열로 불리는 제2 RNA를 포함한다. 유형 II 가이드 RNA (gRNA)에서, CRISPR 반복 서열 및 스캐폴드 서열은 서로 혼성화하여 듀플렉스를 형성한다. 유형 V 가이드 RNA (gRNA)에서, crRNA는 듀플렉스를 형성한다. 두 시스템 모두에서, 듀플렉스는 가이드 RNA와 부위 지정 폴리펩티드가 복합체를 형성하도록 부위 지정 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 유전자-표적화 핵산은 부위 지정 폴리펩티드와의 회합에 의해 복합체에 표적 특이성을 제공할 수 있다. 따라서 유전자-표적화 핵산은 부위 지정 폴리펩티드의 활성을 지시할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 표적화 서열 및 가이드 RNA 스캐폴드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 제공하고, 여기서 표적화 서열은 표적 유전자의 서열에 상보적이다.
예시적인 가이드 RNA는 약 15-20개 염기의 표적화 서열을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 각각의 gRNA는 그의 게놈 표적 서열에 상보적인 표적 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 각각의 표적화 서열, 예를 들어, PAM 부위를 나타내는 3개의 3' 뉴클레오티드를 제외한 표 8에 제시된 DNA 서열의 RNA 버전은 단일 RNA 키메라 또는 crRNA에 넣을 수 있다.
유전자 표적화 핵산은 이중-분자 가이드 RNA일 수 있다. 유전자 표적화 핵산은 단일-분자 가이드 RNA일 수 있다. 유전자 표적화 핵산은 예를 들어, 쌍을 이룬 gRNA, 또는 단일 단계에서 사용되는 다중 gRNA를 포함하는 것과 같이 당업계에 알려진 가이드 RNA의 임의의 알려진 구성일 수 있다. 코딩 서열과 스플라이스 접합부가 있는 게놈 서열에서는 분명하지만, 유전자 발현에 필요한 다른 특징은 특이하고 불분명할 수 있다.
이중-분자 가이드 RNA는 RNA의 두 가닥을 포함할 수 있다. 제1 가닥은 5'에서 3' 방향의 서열, 선택적인 스페이서 연장 서열, 표적화 서열 및 최소 CRISPR 반복 서열을 포함한다. 제2 가닥은 최소 tracrRNA 서열 (최소 CRISPR 반복 서열에 상보적), 3' 서열 및 선택적인 tracrRNA 연장 서열을 포함할 수 있다.
유형 II 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)는 5'에서 3' 방향으로, 선택적인 스페이서 연장 서열, 표적화 서열, 최소 CRISPR 반복 서열, 단일-분자 가이드 링커, 최소 tracrRNA 서열, 3' 서열 및 선택적인 tracrRNA 연장 서열을 포함할 수 있다. 선택적 tracrRNA 연장은 가이드 RNA에 대한 추가 기능성 (예를 들어, 안정성)을 제공하는 요소를 포함할 수 있다. 단일-분자 가이드 링커는 최소 CRISPR 반복과 최소 tracrRNA 서열을 연결하여 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 선택적 tracrRNA 연장은 하나 이상의 헤어핀을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA 또는 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)는 표적화 서열 및 스캐폴드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 서열은 Cas9 gRNA 서열이다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 서열은 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT　(서열 번호 435)과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%,　또는 적어도 99% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화된다.　일부 구현예에서, 스캐폴드　서열은 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT　(서열 번호 435)를 포함하는 DNA　서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 CRISPR/Cas 시스템이 Cas9 시스템인 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 20개 뉴클레오티드 표적화 서열을 포함할 수 있다. sgRNA 서열의 5' 말단에 20개 미만의 뉴클레오티드 표적화 서열을 포함할 수 있다. sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 20개 초과의 뉴클레오티드 표적화 서열을 포함할 수 있다. sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 17-30개 뉴클레오티드를 갖는 가변 길이 표적화 서열을 포함할 수 있다.
적합한 스캐폴드 서열, 및 스캐폴드 표적화 서열의 배열은 엔도뉴클레아제의 선택에 따라 달라지며 당업자에게 공지될 것이다.
유형 II 시스템, 예를 들어 Cas9의 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)는 5'에서 3' 방향으로 최소 CRISPR 반복 서열 및 표적화 서열을 포함할 수 있다.
예시로서, CRISPR/Cas9 또는 CRISPR/Cpf1 시스템에서 사용되는 가이드 RNA, 또는 다른 더 작은 RNA는 하기 예시되고 당업계에 기재된 바와 같이 화학적 수단에 의해 쉽게 합성될 수 있다. 화학적 합성 절차가 지속적으로 확장되는 동안, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, PAGE와 같은 젤의 사용을 피함)와 같은 절차에 의한 그러한 RNA의 정제는 폴리뉴클레오티드 길이가 100개 정도의 뉴클레오티드 이상으로 상당히 증가함에 따라 더욱 어려워지는 경향이 있다. 더 긴 길이의 RNA를 생성하는 데 사용되는 한 가지 접근 방식은 함께 결찰되는 두 개 이상의 분자를 생성하는 것이다. Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 것과 같은 훨씬 더 긴 RNA는 효소적으로 더 쉽게 생성된다. 다양한 유형의 RNA 변형은 RNA의 화학적 합성 및/또는 효소적 생성 동안 또는 후에 도입될 수 있으며, 예를 들어, 당업계에 기술된 바와 같이 안정성을 강화하고, 선천적 면역 반응의 가능성 또는 정도를 감소시키고/하거나 다른 속성을 강화하는 변형을 들 수 있다.
gRNA의 표적화 서열은 관심 표적 핵산의 서열에 혼성화한다. 게놈-표적화 핵산의 표적화 서열은 혼성화 (즉, 염기쌍 형성)를 통해 서열-특이적 방식으로 표적 핵산과 상호작용할 수 있다. 표적화 서열의 뉴클레오티드 서열은 관심 표적 핵산의 서열에 따라 다를 수 있다.
본원에 기재된 Cas9 시스템에서, 표적화 서열은 시스템에서 사용되는 Cas9 효소의 PAM의 역 상보체의 5'에 위치하는 표적 핵산에 혼성화하도록 설계될 수 있다. 표적화 서열은 표적 서열과 완벽하게 일치하거나 불일치할 수 있다. 각각의 CRISPR/Cas 시스템 단백질은 표적 DNA에서 인식하는 특정 방향과 위치에 특정 PAM 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9은 표적 핵산에서 서열 5'을 포함하는 PAM을 인식하며, 여기서 R은 A 또는 G를 포함하고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이고 N은 표적화 서열에 의해 표적화된 표적 핵산 서열의 바로 3'이다. 적절한 PAM 서열의 선택은 당업자에게 명백할 것이다.
표적 서열은 gRNA의 표적화 서열에 상보적이며, 혼성화한다. 표적 핵산 서열은 20개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 핵산은 20개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 핵산은 20개 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 핵산은 적어도 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 CRISPR/Cas 시스템이 Cas9 시스템인 구현예에서, 표적 핵산 서열은 PAM 서열의 역 상보체의 첫 번째 뉴클레오티드의 5' 바로 옆에 있는 20개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 표적 핵산 서열은 PAM 가닥 또는 표적 가닥으로 종종 지칭되며, 상보적 핵산 서열은 종종 비-PAM 가닥 또는 비-표적 가닥으로 지칭된다. 당업자는 표적화 서열이 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 혼성화하는 것을 인식할 것이다, 예를 들어, US20190185849A1 참조.
일부 예에서, 표적화 서열과 표적 핵산 사이의 퍼센트 상보성은 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%이다. 일부 예에서, 표적화 서열과 표적 핵산 사이의 퍼센트 상보성은 최대 약 30%, 최대 약 40%, 최대 약 50%, 최대 약 60%, 최대 약 65%, 최대 약 70%, 최대 약 75%, 최대 약 80%, 최대 약 85%, 최대 약 90%, 최대 약 95%, 최대 약 97%, 최대 약 98%, 최대 약 99%, 또는 100%이다. 일부 예에서, 표적화 서열과 표적 핵산 사이의 퍼센트 상보성은 표적 핵산의 상보성 가닥의 표적 서열의 6개의 인접한 5' 대부분 뉴클레오티드에 걸쳐 100%이다. 표적화 서열과 표적 핵산 사이 퍼센트 상보성은 약 20개의 연속 뉴클레오티드에 걸쳐 적어도 60%일 수 있다. 표적화 서열 및 표적 핵산의 길이는 1 내지 6개의 뉴클레오티드만큼 다를 수 있으며, 이는 벌지 또는 벌지들로 생각할 수 있다.
표적화 서열은 당업자에게 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 설계되거나 선택될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 예측된 용융 온도, 2차 구조 형성, 예측된 어닐링 온도, 서열 동일성, 게놈 맥락, 염색질 접근성, % GC, 게놈 발생 빈도 (예를 들어, 불일치, 삽입 또는 결실의 결과로 하나 이상의 지점에서 동일하거나 유사하지만 다양한 서열의), 메틸화 상태, SNP의 존재 등과 같은 변수를 사용할 수 있다. 사용 가능한 컴퓨터 프로그램은 NCBI 유전자 ID, 공식 유전자 기호, Ensembl 유전자 ID, 게놈 좌표, 또는 DNA 서열을 입력으로 사용할 수 있으며, 입력으로 지정된 적절한 게놈 영역을 표적으로 하는 sgRNA를 포함하는 출력 파일을 생성할 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 또한 표적 유전자에 대한 sgRNA의 온- 및 오프-타겟 결합을 나타내는 통계 및 스코어의 요약을 제공할 수 있다 (Doench et al. Nat Biotechnol. 34:184-191 (2016)). 본 개시내용은 표적화 서열을 포함하는 가이드 RNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 가이드 RNA 스캐폴드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M 또는 이의 대립유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적 유전자의 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 HLA-A 유전자이다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 HLA-B 유전자이다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 HLA-C 유전자이다. 일부 구현예에서 표적 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 표 7에 개시된 서열과 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일성을 공유하거나 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, gNA는 내인성 HLA-A 유전자좌의 서열을 특이적으로 표적화한다. 일부 구현예에서, HLA-A 유전자좌의 서열을 특이적으로 표적화하는 gNA는 표 8에 개시된 서열로부터 선택된 서열과 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A 유전자좌의 서열을 특이적으로 표적화하는 gNA는 표 8에 개시된 서열로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, gNA는 HLA-A*02 대립유전자의 서열을 특이적으로 표적화한다. 예를 들어, gRNA는 모든 HLA-A*02 대립유전자에 의해 공유되지만, HLA-A*02 및 HLA-A*03 대립유전자에 의해 공유되지 않는 서열을 특이적으로 표적화하고, 혼성화한다. 일부 구현예에서, gNA는 HLA-A*02:01 대립유전자의 서열을 특이적으로 표적화한다. 일부 구현예에서, gNA는 HLA-A*02:01:01 대립유전자의 서열을 특이적으로 표적화한다. 일부 구현예에서, gNA는 HLA-A*02:01:01:01 대립유전자의 서열을 특이적으로 표적화한다. 일부 구현예에서, gNA는 HLA-A*02:01:01:01 대립유전자의 서열을 특이적으로 표적화한다.
일부 구현예에서, gNA는 HLA-A*02의 코딩 DNA 서열을 특이적으로 표적화한다.
일부 구현예에서, gNA는 1000 초과 HLA-A*02 대립유전자에 의해 공유되는 코딩 DNA 서열을 특이적으로 표적화한다. 일부 구현예에서, 1000개 초과 HLA-A*02 대립유전자에서 코딩 DNA 서열을 특이적으로 표적화하는 gNA는 서열 번호 400-465로부터 선택된 서열과 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일성을 공유하거나 동일한 서열을 포함한다.
표 8. HLA-A 및 HLA-A 대립유전자를 표적으로 하는 예시적인 서열
Figure pct00039
Figure pct00040
표 8에 개시된 서열은 PAM 서열을 포함하는 상응하는 게놈 서열을 포함한다. 당업자는 gRNA의 표적화 서열이 gRNA에 상응하는 PAM 부위를 나타내는, 표 8의 서열의 3개의 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하지 않는다는 것을 이해할 것이다.
본 개시내용은 B2M 유전자에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 gNA를 제공한다. 일부 구현예에서, gNA는 B2M 유전자의 코딩 서열 (CDS) 서열을 특이적으로 표적화한다. 일부 구현예에서, gNA는 B2M 유전자 프로모터 서열을 표적화하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서 gNA는 표적화 서열 및 gNA 스캐폴드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 표 9에 제시된 서열, 또는 이에 대해 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 서열은 B2M 유전자의 서열에 대해 상보적이다. 일부 구현예에서, B2M 유전자는 표 7에 제시된 B2M 서열과 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
표 9. B2M을 표적화하는 예시적인 서열
Figure pct00041
Figure pct00042
일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역 세포는 TALEN 유전자 편집을 사용하여 편집된다.
"TALEN" 또는 "TALEN 유전자 편집"은 표적 유전자를 편집하는 데 사용되는 인공 뉴클레아제인, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합하여 인공적으로 생성된다. 크산토모나스 박테리아에서 파생된 전사 활성화제-유사 효과기 (TALE)는 TCR 서브유닛, MHC 클래스 I 복합체 구성성분, 또는 CD52와 같은 표적 유전자의 일부를 포함하여, 원하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 TALE을 DNA 절단 도메인과 조합함으로써, 표적 유전자 서열을 포함하는 임의의 원하는 DNA 서열에 특이적인 제한 효소를 생산할 수 있다. 그런 다음 이들은 세포에 도입되어 게놈 편집에 사용될 수 있다.
TALEN을 생산하기 위해, TALE 단백질은 야생형 또는 돌연변이 Fold 엔도뉴클레아제인, 뉴클레아제 (N)에 융합된다. FokI에 대한 여러 돌연변이가 TALEN에서 사용하기 위해 만들어졌고; 예를 들어, 이들은 절단 특이성 또는 활성을 개선한다.
FokI 도메인은 적절한 방향과 간격을 가진 표적 게놈의 부위에 대해 고유한 DNA 결합 도메인이 있는 두 개의 작제물을 필요로 하는 이량체로 기능한다. TALE DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수 모두 높은 수준의 활성을 달성하기 위한 중요한 매개변수인 것으로 보인다.
표적 유전자의 서열에 특이적인 TALEN은 모듈 구성 요소를 사용하는 다양한 계획을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 구성할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 유전자는 ZFN 유전자 편집을 사용하여 본원에 기재된 면역 세포에서 편집된다.
"ZFN" 또는 "징크 핑거 뉴클레아제" 또는 "ZFN 유전자 편집"은 표적 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인, 징크 핑거 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN과 마찬가지로, ZFN은 DNA-결합 도메인에 융합된 Fold 뉴클레아제 도메인 (또는 이의 유도체)을 포함한다. ZFN의 경우에, DNA-결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거를 포함한다.
징크 핑거는 하나 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 작은 단백질 구조 모티프이다. 징크 핑거는 예를 들어, Cys2His2를 포함할 수 있고, 대략 3-bp 서열을 인식할 수 있다. 특이성이 알려진 다양한 징크 핑거를 조합하여 약 6, 9, 12, 15 또는 18-bp 서열을 인식하는 멀티핑거 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 파지 디스플레이, 효모 1-하이브리드 시스템, 박테리아 1-하이브리드 및 2-하이브리드 시스템, 포유동물 세포를 포함하는 특정 서열을 인식하는 징크 핑거 (및 이들의 조합)를 생성하기 위해 다양한 선택 및 모듈 조립 기술을 사용할 수 있다.
TALEN과 마찬가지로, ZFN은 DNA를 절단하기 위해 이량체화되어야 한다. 따라서, 비-회문 DNA 부위를 표적으로 삼기 위해서는 한 쌍의 ZFN이 필요하다. 2개의 개별 ZFN은 적절한 간격으로 떨어져 있는 뉴클레아제를 사용하여 DNA의 반대쪽 가닥에 결합해야 한다.
또한 TALEN과 마찬가지로, ZFN은 DNA에 이중-가닥 절단을 생성할 수 있고, 이는 부적절하게 복구될 경우 프레임 이동 돌연변이를 생성하여, 세포의 표적 유전자 또는 유전자 산물의 발현 및 양을 감소시킨다. ZFN은 또한, 상동 재조합과 함께 사용되어 표적 유전자에서 돌연변이를 일으킬 수 있다.
표적 유전자의 서열에 특이적인 ZFN은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구축할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 MCH-I 구성성분의 발현 및 기능은 RNA 간섭을 사용하여 감소된다. "RNAi" 또는 "RNA 간섭"은 이중-가닥 RNA (dsRNA)에 의해 매개되는 서열-특이적 전사 후 유전자 침묵 과정을 지칭한다. siRNA (소 간섭 RNA), miRNA (마이크로 RNA), shRNA (짧은 헤어핀 RNA), ddRNA (DNA-지정 RNA), piRNA (Piwi-상호작용 RNA), 또는 rasiRNA (반복 관련 siRNA) 및 이들의 변형된 형태와 같은 듀플렉스 RNA는 모두 RNA 간섭을 매개할 수 있다. 이러한 dsRNA 분자는 상업적으로 이용 가능하거나 알려진 서열 정보를 기반으로 설계 및 제조될 수 있다. 이들 분자의 안티-센스 가닥은 RNA, DNA, PNA, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자의 발현을 억제하는 DNA 및 RNA로 구성된 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. dsRNA 분자는 또한 본원에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이는 가닥 중 하나 또는 둘 다에 통합될 수 있다.
RNAi 유전자 사일런싱 또는 녹다운에서, 표적 유전자의 일부에 상보적인 제1 (안티-센스) 가닥 및 제1 안티-센스 가닥에 완전히 또는 부분적으로 상보적인 제2 (센스) 가닥을 포함하는 dsRNA는 유기체 내로 도입된다. 유기체에 도입된 후, 표적 유전자 특이적 dsRNA는 상대적으로 작은 단편 (siRNA)으로 처리되고 이후 유기체 전체에 분포될 수 있으며, 표적 유전자의 메신저 RNA를 감소시켜, 표적 유전자의 완전한 또는 부분적인 결실로부터 발생하는 표현형과 매우 유사하게 될 수 있는 표현형을 유도한다.
세포의 특정 dsRNA는 Dicer 효소, 리보뉴클레아제 III 효소의 작용을 받을 수 있다. Dicer는 dsRNA를 dsRNA의 더 짧은 조각, 즉 siRNA로 처리할 수 있다. RNAi는 또한 RNA 유도 침묵 복합체 (RISC)로 알려진 엔도뉴클레아제 복합체를 포함한다. Dicer에 의한 절단 후, siRNA는 RISC 복합체에 들어가고 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥 RNA 표적의 절단을 지시한다. siRNA의 다른 가닥은 패신저 가닥이다. 표적 RNA의 절단은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 영역의 중간에서 일어난다. 따라서 siRNA는 서열-특이적 방식으로 RNA 간섭을 매개함으로써 유전자 발현을 하향 조절하거나 무너뜨릴 수 있다.
RNA 간섭과 관련하여 사용되는 바와 같이, "표적 유전자" 또는 "표적 서열"은 상응하는 RNA가 본원에 기재된 바와 같은 dsRNA 또는 siRNA를 사용하여 RNAi 경로를 통한 분해를 위해 표적화되는 유전자 또는 유전자 서열을 지칭한다. 예시적인 표적 유전자 서열은 표 7에 나타낸다. 예를 들어 siRNA를 사용하여 유전자를 표적화하기 위해, siRNA는 표적 유전자 또는 서열의 적어도 일부에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 안티센스 영역, 및 안티-센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함한다. 일단 세포에 도입되면, siRNA는 표적 서열을 포함하는 RNA를 절단하도록 RISC 복합체를 지시하여 RNA를 분해한다. 본 개시내용은 간섭 RNA를 제공한다. 본 개시내용의 이중 가닥 RNA 분자는 당업계에 공지된 임의의 유형의 RNA 간섭 분자의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 RNA 분자는 소 간섭 RNA (siRNA)이다. 다른 구현예에서, 이중 가닥 RNA 분자는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자이다. 다른 구현예에서, 이중 가닥 RNA 분자는 siRNA를 생성하기 위해 세포에서 처리되는 Dicer 기질이다. 다른 구현예에서 이중 가닥 RNA 분자는 마이크로RNA 전구체 분자의 부분이다.
일부 구현예에서, shRNA는 RISC 활성 siRNA 분자를 생성하기 위해 처리될 수 있는 다이서 기질로서 적합한 길이이다. 예를 들어, Rossi et al., US2005/0244858 참조.
Dicer 기질 이중 가닥 RNA (예를 들어 shRNA)는 활성 siRNA를 생산하기 위해 Dicer에 의해 처리되기에 충분한 길이일 수 있으며 다음 특성 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: (i) Dicer 기질 shRNA는 예를 들어, 안티-센스 가닥에 3' 오버행을 갖는 비대칭, (ii) Dicer 기질 shRNA는 센스 가닥에서 변형된 3' 말단을 가질 수 있어 활성 siRNA에 대한 Dicer 결합 및 dsRNA의 방향을 지시할 수 있다, 예를 들어 하나 이상의 DNA 뉴클레오티드의 통합, 및 (iii) Dicer 기질 ds RNA의 제1 및 제2 가닥은 21-30 bp 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 간섭 RNA는 B2M mRNA의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 간섭 RNA는 B2M mRNA의 RNAi-매개 분해를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, B2M mRNA 서열은 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, B2M mRNA 서열은 비번역 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 간섭 RNA는 HLA-A*02 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 간섭 RNA는 HLA-A*02 mRNA의 RNAi-매개 분해를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, HLA-A*02 mRNA 서열은 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*02 mRNA 서열은 비번역 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 간섭 RNA는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)이다. 일부 구현예에서, shRNA는 5'에서 3' 말단으로 B2M mRNA에 상보적인 서열을 갖는 제1 서열; 및, 5'에서 3' 말단으로 제1 서열에 상보적인 서열을 갖는 제2 서열을 포함하고, 여기서 제1 서열 및 제2 서열은 shRNA를 형성한다.
일부 구현예에서, 제1 서열은 18, 19, 20, 21, 또는 22개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 표 10 및 11에 제시된 서열로부터 선택된 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 25% 이상 60% 미만의 GC 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 표 10 및 11에 제시된 서열로부터 선택된 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 동일한 염기의 4개의 뉴클레오티드 또는 7개의 C 또는 G 뉴클레오티드 염기의 런을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 21개 뉴클레오티드이다.
제1 서열에 상보적인 예시적인 표적 B2M 서열은 표 10에 나타낸다.
일부 경우에, 제1 서열은 표적 핵산 서열에 대해 100% 동일성, 즉 완전 동일성, 상동성, 상보성을 가질 수 있다. 다른 경우에, 제1 서열과 표적 핵산 서열 사이에 하나 이상의 불일치가 있을 수 있다. 예를 들어, 센스 영역과 표적 핵산 서열 사이에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 불일치가 있을 수 있다.
표 10에 제시된 서열은 DNA 서열로 제시된다. 표 10에 제시된 모든 서열에서, 티민 (T)은 우라실 (U)로 대체되어 표적 mRNA 서열의 서열에 도달할 수 있다.
표 10. 제1 서열에 상보적인 예시적인 표적 B2M 서열.
Figure pct00043
Figure pct00044
일부 구현예에서, 간섭 RNA는 HLA-A*02 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 간섭 RNA는 HLA-A*02 mRNA의 RNAi-매개 분해를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, HLA-A*02 mRNA 서열은 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA-A*02 mRNA 서열은 비번역 영역을 포함한다.
B2M shRNA를 암호화하는 예시적인 서열은 GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC (서열 번호 179)의 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. B2M shRNA를 암호화하는 추가 예시적인 서열은 GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC (서열 번호 808)의 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 간섭 RNA는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)이다. 일부 구현예에서, shRNA는 5'에서 3' 말단으로 HLA-A*02 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 제1 서열; 및 5'에서 3' 말단으로 제1 서열에 상보적인 서열을 갖는 제2 서열, 여기서 제1 서열 및 제2 서열은 shRNA를 형성한다.
제1 서열에 상보적인 예시적인 표적 HLA 서열은 표 11에 나타낸다.
표 11. 제1 서열에 상보적인 예시적인 표적 HLA 서열
Figure pct00045
Figure pct00046
일부 구현예에서, 제1 서열 및 제2 서열은 때때로 루프로 지칭되는 링커에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 제1 서열 및 제2 서열 모두 하나의 단일-가닥 RNA 또는 DNA 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 루프는 제1 서열과 제2 서열 사이에 있다. 이들 구현예에서, 제1 서열 및 제2 서열은 혼성화하여 듀플렉스 영역을 형성한다. 제1 서열 및 제2 서열은 링커 서열에 의해 결합되어, "헤어핀" 또는 "스템-루프" 구조를 형성한다. shRNA는 단일 가닥 분자의 반대쪽 끝에 상보적인 첫 번째 서열과 두 번째 서열을 가질 수 있으므로, 분자는 상보적인 서열 부분과 듀플렉스 영역을 형성할 수 있고, 가닥은 링커에 의해 듀플렉스 영역의 한쪽 끝에서 연결된다 (즉 루프 서열). 링커, 또는 루프 서열은 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 링커일 수 있다. 링커는 공유 결합 또는 비공유 상호작용을 통해 제1 서열, 선택적으로 제2 서열과 상호작용할 수 있다.
임의의 적합한 뉴클레오티드 루프 서열은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 생각된다. 본 개시내용의 shRNA는 shRNA의 제1 서열을 shRNA의 제2 서열에 결합시키는 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드, 또는 혼합된 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 링커를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 루프 서열은 2개 이상의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예시적인 루프 서열은 표 12에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, shRNA는 5' 플랭크 서열 및 3' 플랭크 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 플랭크 서열은 제1 서열의 5' 말단에 연결되고, 3' 플랭크 서열은 제2 서열의 3' 말단에 연결된다.
이론에 얽매이지 않고, 마이크로RNA에서 발견되는 것과 유사한 5' 및 3' 서열을 갖는 플랭킹 shRNA 스템 루프 서열은 shRNA 처리의 효율성을 증가시키면서 내인성 마이크로RNA 처리 기계에 의한 처리를 위해 shRNA를 표적으로 할 수 있다고 생각된다. 대안적으로, 또는 추가로, 플랭킹 서열은 중합효소 II 또는 중합효소 III 프로모터와의 shRNA 호환성을 증가시켜, shRNA 발현의 더욱 효과적인 조절을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 플랭크 서열은 표 12에 제시된 서열로부터 선택된다. 예시적인 플랭크 서열은 표 12에 나타낸다.
표 12. 예시적인 플랭크 서열
Figure pct00047
일부 구현예에서, 제1 및 제2 서열은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 상에 존재하고, 여기서 제1 서열 및 제2 서열은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 뉴클레오티드에 의해 분리되고, 여기서 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 뉴클레오티드는 shRNA에서 루프 영역을 형성한다. 일부 구현예에서, 루프 영역은 표 13에 제시된 서열로부터 선택된 서열을 포함한다.
표 13. 예시적인 루프 영역 서열
Figure pct00048
본 개시내용의 shRNA는 화학적 합성에 의해, 시험관 내 전사에 의해, 또는 Dicer 또는 유사한 활성을 갖는 또 다른 적절한 뉴클레아제를 사용한 더 긴 이중 가닥 RNA의 절단에 의해 외인성으로 생성될 수 있다. 통상적인 DNA/RNA 합성기를 사용하여 보호된 리보뉴클레오시드 포스포르아미다이트로부터 생성된, 화학적으로 합성된 siRNA는 Millipore Sigma (Houston, Tex.), Ambion Inc. (Austin, Tex.). Invitrogen (Carlsbad, Calif.), 또는 Dharmacon (Lafayette, Colo.)과 같은 상업적 공급자로부터 얻을 수 있다. siRNA는 예를 들어 용매 또는 수지를 사용한 추출, 침전, 전기영동, 크로마토그래피 또는 이들의 조합에 의해 정제될 수 있다. 대안적으로, siRNA는 시료 처리로 인한 소실을 피하기 위해 정제가 거의 없는 경우에 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 shRNA는 이중 가닥 RNA를 암호화하는 핵산이 클로닝된 발현 벡터를 사용하여, 예를 들어 적합한 프로모터의 제어 하에 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 포함한다
약학 조성물
본 개시내용은 본 개시내용의 제1 및 제2 수용체 및 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 면역 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 완충제; 글루코스, 만노스, 수크로즈 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 및 방부제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 제1 수용체 및 제2 수용체 모두를 발현한다. 일부 구현예에서, 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 면역 세포가 제1 수용체 및 제2 수용체 모두를 발현한다. 일부 구현예에서, 적어도 90%의 면역 세포가 제1 수용체 및 제2 수용체 모두를 발현한다.
암 치료
본 개시내용의 제1 및 제2 수용체를 포함하는 면역 세포를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 다수의 암 세포를 사멸시키거나 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 면역 세포는 동일한 세포에서 두 수용체를 모두 발현한다.
암은 비정상 세포가 통제 없이 분열하여 주변 조직으로 전이되는 질환이다. 일부 구현예에서, 암은 액상 종양 또는 고형 종양을 포함한다. 암은 상피 조직을 포함하여 사실상 신체의 한 기관에서 발생할 수 있다. 다수의 암 세포가 제1 활성제 리간드를 발현하고 제2 억제제 리간드를 발현하지 않는 임의의 암은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 EGFR 양성 암은 폐암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장관 암종, 결장직장암, 두경부암, 식도 및 위 선암종, 난소암, 다형성 교모세포종, 자궁경부 편평 세포 암종, 신장암, 유두상 신장암, 신장 투명 세포 암종, 방광암, 유방암, 담관암, 간암, 전립선암, 육종, 갑상선암, 흉선암, 위암, 또는 자궁암, 및 기타 모든 EGFR 표적 발현 종양을 포함한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 재발성, 불응성 및/또는 전이성인 EGFR 양성 암을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다수의 암 세포는 표적 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 대상체의 다수의 암 세포는 EGFR을 발현한다. EGFR 양성 암은 폐암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장관 암종, 결장직장암, 두경부암, 식도 및 위 선암종, 난소암, 다형성 교모세포종, 자궁경부 편평 세포 암종, 신장암, 유두상 신장암, 신장 투명 세포 암종, 방광암, 유방암, 담관암, 간암, 전립선암, 육종, 갑상선암, 흉선암, 위암, 또는 자궁암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 다수의 암 세포는 COLEC12, APCDD1 또는 CXCL16의 다형성 대립유전자를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 다수의 암 세포는 비-표적 항원을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 다수의 암 세포는 HLA-A*02를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 다수의 암 세포는 HLA-A*02의 대립형질 변이체를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 다수의 암 세포는 HLA-A*01을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 다수의 암 세포는 HLA-A*03을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 다수의 암 세포는 HLA-A*11을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 다수의 암 세포는 HLA-B*07을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 다수의 암 세포는 HLA-C*07을 발현하지 않는다. 예를 들어, 암 세포는 해당 유전자좌에서 이형 접합체의 소실을 통해 COLEC12, APCDD1 또는 CXCL16, 또는 HLA-A*02의 대립 유전자를 소실했다.
본원에 기재된 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여는 대상체에서 종양의 크기를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 종양의 크기는 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여 전 종양의 크기와 비교하여 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 감소한다. 일부 구현예에서, 종양은 제거된다.
본원에 기재된 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여는 대상체에서 종양의 성장을 정지시킬 수 있다. 예를 들어, 면역 세포 또는 약학 조성물은 종양 세포를 죽일 수 있어 종양이 성장을 멈추거나 크기가 감소한다. 일부 경우에, 면역 세포 또는 약학 조성물은 추가 종양의 형성을 방지하거나 대상체에서 종양의 총 수를 감소시킬 수 있다.
본원에 기재된 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여는 대상체에서 정상 세포가 아닌 암 세포의 선택적인 사멸을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 사멸된 세포의 약 60%는 암세포이고, 사멸된 세포의 약 65%는 암세포이고, 사멸된 세포의 약 70%는 암세포이고, 사멸된 세포의 약 75%는 암세포이고, 사멸된 세포의 약 80%는 암세포이고, 사멸된 세포의 약 85%는 암세포이고, 사멸된 세포의 약 90%는 암세포이고, 사멸된 세포의 약 95%는 암세포이고, 또는 사멸된 세포의 약 100%는 암세포이다.
본원에 기재된 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여는 대상체의 암 세포의 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 전부의 사멸을 초래할 수 있다.
본원에 기재된 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여는 제1 활성화제 수용체를 포함하지만 제2 억제 수용체는 포함하지 않는 등가의 면역 세포를 투여하는 것보다 대상체에 대해 더 적은 부작용을 초래할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여는 제2 억제 수용체 없이 투여된 EGFR CAR, 또는 EGFR TCR에 비해 용량 제한 독성을 감소시킬 수 있다.
본 개시내용은 다음을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다: (a) COLEC12의 다형성 유전자좌, APCDD1의 다형성 유전자좌 및 CXCL16의 다형성 유전자좌, 또는 HLA-A*02 유전자좌로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다형성 유전자좌에서 대상체의 정상 세포 및 다수의 암 세포의 유전형을 결정하는 단계; (b) 다수의 암 세포에서 EGFR의 발현을 결정하는 단계; 및 (c) 정상 세포가 다형성 유전자좌에 대해 이형접합성이고 다수의 암 세포가 다형성 유전자좌에 대해 반접합성이거나 HLA-A*02를 소실하고, 다수의 암 세포가 EGFR 양성인 경우 다수의 면역 세포를 대상체에 투여하는 단계, 여기서 다수의 면역 세포는 다음을 포함하고: (i) 제1 수용체, 임의로 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR), EGFR에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는, 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체 내 이의 펩티드 항원; 및 (ii) 제2 수용체, 임의로 억제 키메라 항원 수용체 (즉 억제 수용체), COLEC12, APCDD1, 및 CXCL16으로부터 선택된 비-표적 항원에 특이적인 결합을 포함하는 세포외 리간드, 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체 내 이의 항원 펩티드, 또는 HLA-A*02, 여기서 비-표적 항원은 다형성을 포함한다.
SNP의 존재 또는 부재에 대해 대상체로부터 암 세포 및 정상 세포를 유전자형 분석하는 방법은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다. SNP 유전자형 분석 방법은 특히, 이중 프로브 TaqMan 분석, 어레이 기반 혼성화 방법 및 시퀀싱과 같은 PCR 기반 방법을 포함한다.
암 또는 정상 세포에서 표적 항원의 발현을 측정하는 방법은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다. 여기에는 특히 RNA 시퀀싱 및 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)과 같은 RNA 발현을 측정하는 방법뿐만 아니라 면역조직화학 기반 방법과 같은 단백질 발현을 측정하는 방법이 포함된다. 다수의 암 세포에서 이형접합성의 소실을 측정하는 방법은 특히 당업계에 공지된 방법을 사용하여 암 세포로부터 추출된 게놈 DNA의 고처리량 시퀀싱을 포함한다.
대상체로부터의 암 또는 정상 세포에서 표적 항원의 발현을 측정하는 방법은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다. 여기에는 특히 RNA 시퀀싱 및 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)과 같은 RNA 발현을 측정하는 방법뿐만 아니라 면역조직화학 기반 방법과 같은 단백질 발현을 측정하는 방법이 포함된다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 동종 또는 자가이다.
일부 구현예에서, 제2 수용체는 제1 수용체는 발현하지만 제2 수용체는 발현하지 않는 면역 세포와 비교하여 EGFR 양성 암 세포에 대한 면역 세포의 특이성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 제1 수용체는 발현하지만 제2 수용체는 발현하지 않는 면역 세포와 비교하여 감소된 부작용을 갖는다.
암을 치료하면 종양의 크기가 줄어들 수 있다. 종양 크기의 감소는 "종양 퇴행"이라고도 한다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 크기는 치료 전 크기에 비해 5% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 종양 크기는 10% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 20% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 30% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 40% 이상 감소되고; 더욱 바람직하게는, 50% 이상 감소되고; 가장 바람직하게는, 75% 또는 그 이상 감소된다. 종양의 크기는 재현 가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 종양의 크기는 종양의 직경으로 측정할 수 있다.
암을 치료하면 종양 부피가 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후 종양 부피는 치료 전 크기에 비해 5% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 종양 부피는 10% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 20% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 30% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 40% 이상 감소되고; 더욱 바람직하게는, 50% 이상 감소되고; 가장 바람직하게는, 75% 또는 그 이상 감소된다. 종양 부피는 재현 가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다.
암을 치료하면 종양의 수가 감소한다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 수는 치료 전의 수에 비해 5% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 종양 수는 10% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 20% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 30% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 40% 이상 감소되고; 더욱 바람직하게는, 50% 이상 감소되고; 가장 바람직하게는, 75% 이상 감소된다. 종양의 수는 재현 가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 종양의 수는 육안으로 또는 특정 배율로 볼 수 있는 종양을 세어 측정할 수 있다. 바람직하게는, 지정된 배율은 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 또는 50x이다.
암을 치료하면 원발성 종양 부위에서 멀리 떨어진 다른 조직이나 기관의 전이성 병변 수가 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 전이성 병변의 수는 치료 전 수에 비해 5% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 전이성 병변의 수는 10% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 20% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 30% 이상 감소되고; 보다 바람직하게는, 40% 이상 감소되고; 더욱 바람직하게는, 50% 이상 감소되고; 가장 바람직하게는, 75% 이상 감소된다. 전이성 병변의 수는 재현 가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 전이성 병변의 수는 육안으로 또는 특정 배율로 볼 수 있는 전이성 병변을 세어 측정할 수 있다. 바람직하게는, 지정된 배율은 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 또는 50x이다.
암을 치료하면 보인자만 받는 집단과 비교하여 치료 대상 집단의 평균 생존 시간이 증가할 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30일 이상; 보다 바람직하게는, 60일 이상; 보다 바람직하게는, 90일 이상; 가장 바람직하게는, 120일 이상 증가한다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 재현 가능한 모든 수단으로 측정할 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어, 집단에 대해 활성 화합물로 치료를 시작한 후 평균 생존 기간을 계산하여 측정할 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 또한 예를 들어, 집단에 대해 활성 화합물로 치료의 1차 라운드를 완료한 후 평균 생존 기간을 계산함으로써 측정될 수 있다.
암을 치료하면 치료받지 않은 대상 집단과 비교하여 치료 대상 집단의 평균 생존 시간이 증가할 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30일 이상; 보다 바람직하게는, 60일 이상; 보다 바람직하게는, 90일 이상; 가장 바람직하게는, 120일 이상 증가한다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 재현 가능한 모든 수단으로 측정할 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어, 집단에 대해 활성 화합물로 치료를 시작한 후 평균 생존 기간을 계산하여 측정할 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 또한 예를 들어, 집단에 대해 활성 화합물로 치료의 1차 라운드를 완료한 후 평균 생존 기간을 계산함으로써 측정될 수 있다.
암을 치료하면 본 개시내용의 화합물이 아닌 약물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 전구약물, 대사산물, 유사체 또는 이의 유도체로 단일요법을 받는 집단과 비교하여 치료받는 대상 집단의 평균 생존 시간을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30일 이상; 보다 바람직하게는, 60일 이상; 보다 바람직하게는, 90일 이상; 가장 바람직하게는, 120일 이상 증가한다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 재현 가능한 모든 수단으로 측정할 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어, 집단에 대해 활성 화합물로 치료를 시작한 후 평균 생존 기간을 계산하여 측정할 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 또한 예를 들어, 집단에 대해 활성 화합물로 치료의 1차 라운드를 완료한 후 평균 생존 기간을 계산함으로써 측정될 수 있다.
암을 치료하면 보인자만을 수용하는 집단과 비교하여 치료 대상 집단의 사망률 감소를 초래할 수 있다. 암을 치료하면 치료되지 않은 집단과 비교하여 치료 대상 집단의 사망률이 감소할 수 있다. 암을 치료하면 본 개시내용의 화합물이 아닌 약물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 전구약물, 대사산물, 유사체 또는 이의 유도체로 단일요법을 받는 집단과 비교하여 치료 대상 집단의 사망률 감소를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 사망률이 2% 이상; 보다 바람직하게는, 5% 이상; 보다 바람직하게는, 10% 이상; 가장 바람직하게는, 25% 이상 감소한다. 치료 대상 집단의 사망률 감소는 임의의 재현 가능한 수단으로 측정할 수 있다. 집단의 사망률 감소는 예를 들어, 집단에 대해 활성 화합물로 치료를 시작한 후 단위 시간당 평균 질병 관련 사망 수를 계산하여 측정할 수 있다. 집단의 사망률 감소는 또한 예를 들어, 집단에 대해 활성 화합물로 치료의 1차 라운드를 완료한 후 단위 시간당 평균 질병 관련 사망 수를 계산하여 측정할 수 있다.
암을 치료하면 종양 성장 속도가 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 성장 속도가 치료 전의 수에 비해 적어도 5% 감소되고; 보다 바람직하게는, 종양 성장 속도가 적어도 10% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 20% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 30% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 40% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 50% 감소되고; 더욱 바람직하게는, 적어도 50% 감소되고; 가장 바람직하게는, 적어도 75% 감소된다. 종양 성장 속도는 재현 가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 단위 시간당 종양 직경의 변화에 따라 종양 성장 속도를 측정할 수 있다.
암을 치료하면 종양 재성장이 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 재성장은 5% 미만이고; 보다 바람직하게는, 종양 재성장은 10% 미만이고; 보다 바람직하게는, 20% 미만; 보다 바람직하게는, 30% 미만; 보다 바람직하게는, 바람직하게는 40% 미만; 보다 바람직하게는, 50% 미만; 더욱 바람직하게는, 50% 미만; 가장 바람직하게는, 75% 미만이다. 종양 재성장은 임의의 재현 가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 종양 재성장은 예를 들어, 치료 후 선행 종양 수축 후 종양 직경의 증가를 측정함으로써 측정된다. 종양 재성장의 감소는 치료가 중단된 후 종양이 재발하지 않는 것으로 나타난다.
암을 치료하거나 예방하면 세포 증식 속도가 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 세포 증식률은 적어도 5%까지; 보다 바람직하게는, 적어도 10%까지; 보다 바람직하게는, 적어도 20%까지; 보다 바람직하게는, 적어도 30%까지; 보다 바람직하게는, 적어도 40%까지; 보다 바람직하게는, 적어도 50%까지; 더욱 바람직하게는, 적어도 50%까지; 가장 바람직하게는, 적어도 75%까지 감소된다. 세포 증식 속도는 재현 가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 세포 증식 속도는 예를 들어, 단위 시간당 조직 샘플에서 분열하는 세포의 수를 측정함으로써 측정된다.
암을 치료하거나 예방하면 증식하는 세포의 비율이 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 증식하는 세포의 비율은 적어도 5%까지; 보다 바람직하게는, 적어도 10%까지; 보다 바람직하게는, 적어도 20%까지; 보다 바람직하게는, 적어도 30%까지; 보다 바람직하게는, 적어도 40%까지; 보다 바람직하게는, 적어도 50%까지; 더욱 바람직하게는, 적어도 50%까지; 가장 바람직하게는, 적어도 75%까지 감소된다. 증식 세포의 비율은 재현 가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 바람직하게는, 증식 세포의 비율은 예를 들어, 조직 샘플에서 분열하지 않는 세포의 수에 대해 분열하는 세포의 수를 정량화함으로써 측정된다. 증식하는 세포의 비율은 유사분열 지수와 동일할 수 있다.
암을 치료하거나 예방하면 세포 증식 영역 또는 영역의 크기가 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 세포 증식 영역 또는 구역의 크기는 치료 전 크기에 비해 적어도 5% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 10% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 20% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 30% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 40% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 50% 감소되고; 더욱 바람직하게는, 적어도 50% 감소되고; 가장 바람직하게는, 적어도 75% 감소된다. 세포 증식 영역 또는 영역의 크기는 재현 가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 세포 증식 영역 또는 영역의 크기는 세포 증식 영역 또는 영역의 직경 또는 폭으로 측정될 수 있다.
암을 치료하거나 예방하면 비정상적인 모양이나 형태를 가진 세포의 수나 비율이 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 비정상적인 형태를 갖는 세포의 수는 치료 전 크기에 비해 적어도 5% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 10% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 20% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 30% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 40% 감소되고; 보다 바람직하게는, 적어도 50% 감소되고; 더욱 바람직하게는, 적어도 50% 감소되고; 가장 바람직하게는, 적어도 75% 감소된다. 비정상적인 세포 외관 또는 형태는 재현 가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 비정상적인 세포 형태는 현미경, 예를 들어 거꾸로 된 조직 배양 현미경을 사용하여 측정할 수 있다. 비정상적인 세포 형태는 핵 다형성의 형태를 취할 수 있다.
용량 및 투여
본 개시내용의 면역 세포는 국소 또는 전신 치료가 필요한지에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다.
일반적으로, 투여는 비경구적일 수 있다.
입양 세포 요법을 위한 세포 투여 방법은 공지되어 있으며 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법 방법은 예를 들어, Gruenberg et al의 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238 및 Rosenberg의 미국 특허 번호 4,690,915에 기술되어 있다.
본 개시내용의 조성물은 비경구 투여에 적합하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 약학 조성물의 "비경구 투여"는 대상체의 조직을 물리적으로 파괴하는 것을 특징으로 하는 임의의 투여 경로 및 조직의 파괴를 통한 약학 조성물의 투여를 포함하며, 따라서 일반적으로 혈류, 근육 또는 내부 장기로의 직접 투여를 야기한다. 비경구 투여는 조성물의 주사, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직 관통 비-외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약학 조성물의 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 정맥 내, 동맥 내, 척수강 내, 심실 내, 요도 내, 두개 내, 종양 내, 활막 내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물의 비경구 투여는 정맥 내 또는 동맥 내 투여를 포함한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 복수의 면역 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
비경구 투여에 적합한 약학 조성물의 제형은 전형적으로 일반적으로 멸균수 또는 멸균 등장 식염수와 같은 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 면역 세포를 포함한다. 이러한 제형은 일시 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사용 제제는 방부제를 함유하는 앰플 또는 다중 용량 용기와 같은 단위 용량 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제제는 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 제형은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 제형은 또한, 염, 탄수화물 및 완충제와 같은 부형제를 함유할 수 있는 수용액을 포함한다. 예시적인 비경구 투여 형태는 멸균 수용액, 예를 들어 수성 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 용액 중의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 이러한 제형은 필요에 따라 적합하게 완충될 수 있다. 비경구 투여용 제제는 즉시 및/또는 변형 방출되도록 제제화될 수 있다. 변형 방출 제형에는 지연, 지속, 펄스, 제어, 표적 및 프로그램 방출이 포함된다.
일부 구현예에서, 면역 세포를 포함하는 제형화된 조성물은 주사를 통한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 포함하는 제형화된 조성물은 주입을 통한 투여에 적합하다.
편리하게 단위 투여 형태로 제공될 수 있는 본 개시내용의 약학 조성물은 제약 산업에서 잘 알려진 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 약학적 담체(들) 또는 액체 담체와 같은 부형제(들)와 면역 세포를 회합시키는 단계를 포함한다.
수성 현탁액은 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 비롯한 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액에는 안정제가 포함될 수도 있다.
본 개시내용의 조성물은 약학 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 보조 성분을 추가로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 예를 들어 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제와 같은 추가의 상용성 약학적 활성 물질을 함유할 수 있거나, 염료, 방부제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제와 같은 본 개시내용의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화하는데 유용한 추가 물질을 함유할 수 있다. 그러나 그러한 물질이 첨가될 때 본 개시내용의 조성물의 면역 세포의 생물학적 활성을 부당하게 방해하지 않아야 한다.
제제 또는 조성물은 또한 면역 세포로 치료되는 특정 적응증, 질환 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 활성은 서로 불리하게 영향을 미치지 않는다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 적합하게 조합되어 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은 화학요법제와 같은 다른 약학 활성제 또는 약물을 추가로 포함한다.
일부 양태에서 약학 조성물은 조성물의 전달이 치료될 부위의 민감화를 유발하기에 충분한 시간과 이전에 발생하도록 시간 방출, 지연 방출 및 지속 방출 전달 시스템을 사용할 수 있다. 많은 유형의 방출 전달 시스템이 사용 가능하고 알려졌다. 이러한 시스템은 조성물의 반복 투여를 피할 수 있어 대상체와 의사의 편의성을 높일 수 있다.
투여는 치료 과정 전반에 걸쳐 지속적으로 또는 간헐적으로 1회 용량으로 수행될 수 있다. 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다.
일부 구현예에서 약학 조성물은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량과 같이 암을 치료 또는 예방하는데 효과적인 양으로 면역 세포를 함유한다. 일부 구현예에서 치료적 또는 예방적 효능은 치료 대상의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 수일, 수주 또는 수개월에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라 원하는 암 징후 또는 증상 억제가 발생할 때까지 치료를 반복할 수 있다. 그러나 다른 투여 요법이 유용할 수 있고 결정할 수 있다. 원하는 투여량은 조성물의 단일 일시 투여 또는 주입에 의해 또는 조성물의 다중 일시 투여 또는 주입에 의해 전달될 수 있다.
세포 또는 세포 집단은 1회 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 유효량의 세포가 단일 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 유효량의 세포가 일정 기간에 걸쳐 1회 초과 용량으로 투여될 수 있다. 투여 시기는 주치의의 판단 범위 내에 있으며 환자의 임상 상태에 따라 다르다.
세포 또는 세포 집단은 혈액은행, 기증자 또는 환자 자신과 같은 모든 출처에서 얻을 수 있다.
유효량은 치료적 또는 예방적 이점을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 동시 치료의 종류 (있는 경우), 치료 빈도 및 원하는 효과의 특성에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 유효량의 세포 또는 이들 세포를 포함하는 조성물은 비경구적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 투여는 정맥 내 투여일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 종양 내 주사에 의해 직접 수행될 수 있다.
본 개시내용의 목적을 위해, 예를 들어 표적 세포가 용해되는 정도 또는 하나 이상의 사이토카인이 수용체를 발현하는 면역 세포에 의해 분비되는 정도를 비교하는 것을 포함하는 검정은 이러한 면역 세포의 주어진 용량을 대상에게 투여시 포유동물 세트 중에서 각각 상이한 용량의 면역 세포가 제공된 포유동물은 포유동물에게 투여될 시작 용량을 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예를 들어 세포독성 제제 또는 치료제와 같은 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 조합 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서 본 개시내용의 면역 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 일부 상황에서, 면역 세포는 면역 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키거나 그 반대가 되도록 시간상으로 충분히 가까운 또 다른 치료법과 공동 투여된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 하나 이상의 추가 치료제 이후에 투여된다.
구현예에서, 림프구 고갈 화학요법은 입양 면역 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다. 예에서, 림프구 고갈 화학요법은 면역 세포의 투여 전에 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 림프구 고갈 화학요법은 입양 세포 주입 전 1-4일 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4일)에 종료된다. 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 입양 세포의 다중 용량이 투여된다. 구현예에서, 림프구 고갈 화학요법은 본원에 기재된 면역 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다. 림프구 고갈의 예는 비골수 림프구 고갈 화학 요법, 골수 파괴 림프구 고갈 화학 요법, 전신 방사선 조사 등을 포함하지만 이에 국한되지 않을 수 있다. 림프구 고갈제의 예는 항흉선 세포 글로불린, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD8 항체, 항-CD52 항체, 항-CD2 항체, TCRαβ 차단제, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 보르테조밉, 리툭시맙, 항-CD 154 항체, 라파마이신, CD3 면역독소, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 부설판, 멜팔란, 마브테라, 타크로리무스, 알레파셉트, 알렘투주맙, OKT3, OKT4, OKT8, OKT11, 핑골리모드, 항-CD40 항체, 항-BR3 항체, 캄파트-1H, 항-CD25 항체, 칼시뉴린 억제제, 마이코페놀레이트, 및 스테로이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 이는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 추가의 예로서, 림프구 고갈 요법은 알렘투주맙, 시클로포스파미드, 벤두아무스틴, 리툭시맙, 펜토스타틴 및/또는 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 림프구 고갈 요법은 감소된 순환 면역 세포의 원하는 결과가 나올 때까지 하나 이상의 주기로 시행될 수 있다. 일부 구현예에서, 림프구 고갈은 대상체에서 CD52+ 세포를 특이적으로 표적화하고 감소 또는 제거하는 작용제를 투여하는 것을 포함하며, 면역 세포는 CD52 발현을 감소 또는 제거하도록 변형된다.
일부 구현예에서, 면역 자극 요법은 투여 (예를 들어, 주입) 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 면역 자극 요법은 항상성 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 자극 요법은 면역 자극 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 자극 요법은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-9, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 자극 요법은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-9, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 자극 요법은 IL-2, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
자가 세포를 사용하는 양자 세포 치료 방법은 환자 혈액으로부터 면역 세포를 분리하는 것, 본원에 기술된 이중 수용체 시스템을 암호화하는 하나 이상의 벡터로 세포를 형질도입하는 것을 포함하는 분리된 세포에 일련의 변형을 수행하는 것, 및 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 암 또는 혈액학적 악성종양을 앓고 있거나 위험에 처한 대상체로부터 면역 세포를 제공하는 것은 환자의 혈액으로부터 면역 세포를 분리하는 것이 필요하고, 예를 들어, 백혈구 성분채집술에 의해 당업계에 공지된 방법을 통해 달성될 수 있다. 백혈구 성분채집술 동안, 대상체로부터 혈액을 추출하고 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리하고 나머지 혈액은 대상체의 순환계로 복귀시킨다. PBMC는 면역 세포의 샘플로서 동결 또는 동결보존되어 저장되며 예를 들어 본원에 기재된 변형과 같은 추가 처리 단계를 위해 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 대상체를 치료하는 방법은 농축 및/또는 고갈, 활성화, 유전적 변형, 확장, 제형화 및 동결보존을 포함하는 일련의 변형을 포함하는 대상체로부터의 면역 세포에 대한 변형을 포함한다.
본 개시내용은 다운스트림 절차, 예를 들어 본원에 기재된 변형을 위한 대상체 PBMC의 제조를 위해 당업계에 공지된 세척 및 분별 방법일 수 있는 강화 및/또는 고갈 단계를 제공한다. 예를 들어, 제한 없이, 방법은 전체 적혈구 및 혈소판 오염물을 제거하는 장치, 단핵구 고갈 및 림프구 분리를 위한 크기 기반 세포 분획 시스템, 및/또는, 예를 들어 CD4+, CD8+, CD25+, 또는 CD62L+ T 세포와 같은 특정 세포의 농축 또는 고갈을 허용하는 시스템을 포함할 수 있다. 농축 단계 후, 면역 세포의 표적 하위 집단이 추가 처리를 위해 대상 PMBC로부터 분리된다. 당업자는 본원에 제공된 농축 단계가 또한 임의의 새롭게 발견된 방법, 장치, 시약 또는 이들의 조합을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
본 개시내용은 생체 외 확장에 필요한 면역 세포, 예를 들어 T 세포의 활성화를 유도하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법일 수 있는 활성화 단계를 제공한다. 예를 들어, 수지상 세포의 존재 하에 대상 면역 세포를 배양하거나, 인공 항원-제시 세포 (AAPC)의 존재 하에 대상 면역 세포를 배양하거나, 조사된 K562-유래 AAPC의 존재 하에 면역 세포를 배양한다. 대상 면역 세포를 활성화하기 위한 다른 방법은 예를 들어, 분리된 활성화 인자 및 조성물, 예를 들어 활성화 인자로 기능화된 비드, 표면, 또는 입자의 존재 하에 면역 세포를 배양하는 것일 수 있다. 활성화 인자는 예를 들어, 항체, 예를 들어 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 포함할 수 있다. 활성화 인자는 또한 예를 들어, 사이토카인, 예를 들어 인터루킨 (IL)-2 또는 IL-21일 수 있다. 활성화 인자는 예를 들어, CD40, CD40L, CD70, CD80, CD83, CD86, CD137L, ICOSL, GITRL, 및 CD134L과 같은 공동자극 분자일 수 있다. 당업자는 본원에 제공된 활성화 인자가 또한 면역 세포를 활성화할 수 있는 임의의 새롭게 발견된 활성화 인자, 시약, 조성물 또는 이들의 조합을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
본 개시내용은 면역 세포를 변형시키기 위한 유전적 변형 단계를 제공한다. 일부 구현예에서, 유전적 변형은 B2M 또는 HLA-A에 상보적인 본원에 기재된 shRNA를 포함하는 벡터로 면역 세포를 형질도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 변형은 CRISPR/Cas 매개 게놈 공학을 사용하여 B2M 또는 HLA-A에서 돌연변이를 유도하기 위해 면역 세포의 게놈을 변형하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 활성화제 및 억제 수용체를 암호화하는 하나 이상의 벡터로 면역 세포를 형질도입함으로써, 활성화제 및 억제 수용체를 발현하는 면역 세포를 생산하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 유전적으로 변형된 대상 면역 세포에 대해 확장 단계를 제공한다. 유전적으로 변형된 대상체 면역 세포는 투여를 위한 치료 용량의 면역 세포를 생성하기 위해 당업계에 공지된 임의의 면역 세포 확장 시스템에서 확장될 수 있다. 예를 들어, 컨트롤러 펌프와 자동 공급 및 폐기물 제거를 허용하는 프로브를 포함하는 시스템에서 사용하기 위한 생물반응기 백을 면역 세포 확장에 사용할 수 있다. 바닥에 기체 투과성 막이 있는 세포 배양 플라스크는 면역 세포 확장에 사용할 수 있다. 있다. 임상적 사용을 위한 면역 세포의 확장을 가능하게 하는 당해 분야에 공지된 임의의 이러한 시스템은 본원에 제공된 확장 단계에 포함된다. 면역 세포는 확장을 위해 특별히 제조된 배지의 배양 시스템에서 확장된다. 확장은 또한 본원에 기술된 바와 같은 활성화 인자의 존재 하에 개시내용의 면역 세포를 배양함으로써 촉진될 수 있다. 당업자는 본원에 제공된 확장 단계가 또한 임의의 새롭게 발견된 배양 시스템, 배지 또는 면역 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있는 활성화 인자를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
본 개시내용은 확장된 유전적으로 변형된 대상 면역 세포에 대한 제형 및 동결보존 단계를 제공한다. 제공된 제제화 단계는 예를 들어 본원에 기술된 치료 방법의 면역 세포의 준비 및 확장에 사용된 과잉 성분을 씻어내는 것을 포함한다. 당업계에 공지된 면역 세포와 호환되는 임의의 약학적으로 허용되는 제형 배지 또는 세척 완충액을 사용하여 면역 세포를 세척, 희석/농축하고 투여 용량을 준비할 수 있다. 제형 배지는 예를 들어 정맥 내 주입을 위한 결정질 용액과 같이 면역 세포의 투여에 허용될 수 있다.
동결 보존은 선택적으로 면역 세포를 장기간 보관하는 데 사용할 수 있다. 동결 보존은 예를 들어 동결 보존 성분을 함유하는 동결 보존 배지에 세포를 저장하는 것을 포함하는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 동결 보존 성분은 예를 들어 디메틸 설폭사이드 또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 동결보존 배지에 보관된 면역세포는 보관온도를 -80℃ 내지 -196℃로 낮추어 동결보존 가능하다.
일부 구현예에서, 치료 방법은 대상체의 HLA 생식계열 유형을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, HLA 생식계열 유형은 골수에서 결정된다.
일부 구현예에서, 치료 방법은 EGFR의 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR의 발현 수준은 대상체로부터의 종양 조직 샘플에서 결정된다. 일부 구현예에서, EGFR의 발현 수준은 차세대 시퀀싱을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, EGFR의 발현 수준은 RNA 시퀀싱을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, EGFR의 수준은 면역조직화학을 사용하여 결정된다.
일부 구현예에서, 치료 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 HLA-A*02 억제 수용체를 포함하는 치료 유효량의 면역 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 HLA 생식계열 HLA-A*02 이형접합성이고 HLA-A*02가 소실된 암 세포를 갖는 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 HLA-A*01 억제 수용체를 포함하는 치료 유효량의 면역 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 HLA 생식계열 HLA-A*01 이형접합성이고 HLA-A*01이 소실된 암 세포를 갖는 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 HLA-A*03을 포함하는 치료 유효량의 면역 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 HLA 생식계열 HLA-A*03 이형접합성이고 HLA-A*03이 소실된 암 세포를 갖는 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 HLA-A*07 억제 수용체를 포함하는 치료 유효량의 면역 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 HLA 생식계열 HLA-A*07 이형접합성이고 HLA-A*07이 소실된 암 세포를 갖는 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 HLA-C*07 억제 수용체를 포함하는 치료 유효량의 면역 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 HLA 생식계열 HLA-C*07 이형접합성이고 HLA-C*07이 소실된 암 세포를 갖는 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 HLA-B*07 억제 수용체를 포함하는 치료 유효량의 면역 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 HLA 생식계열 HLA-B*07 이형접합성이고 HLA-B*07이 소실된 암 세포를 갖는 것으로 결정된다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용은 EGFR을 발현하고 HLA-A*02 발현을 상실한 악성종양을 갖는 이형접합 HLA-A*02 환자의 치료; 및/또는 EGFR을 발현하고 HLA-A*02 발현을 상실한 재발성 절제 불가능 또는 전이성 고형 종양을 갖는 이형접합 HLA-A*02 성인 환자의 치료 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역 세포의 치료 유효 용량이 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 면역 세포는 정맥 내 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 면역 세포는 복강 내 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х106 세포, 약 1Х106 세포, 약 2Х106 세포, 약 3Х106 세포, 4Х106 세포, 약 5Х106 세포, 약 6Х106 세포, 약 7Х106 세포, 약 8Х106 세포, 약 9Х106 세포, 약 1Х107, 약 2Х107, 약 3Х107, 약 4Х107, 약 5Х107, 약 6Х107, 약 7Х107, 약 8Х107, 약 9Х107, 약 1Х108 세포, 약 2Х108 세포, 약 3Х108 세포, 약 4Х108 세포, 약 5Х108 세포, 약 6Х108 세포, 약 7Х108 세포, 약 8Х108 세포, 약 9Х108 세포, 약 1Х109 세포, 약 2Х109 세포, 약 3Х109 세포, 약 3Х109 세포, 약 4Х109 세포, 약 5Х109 세포, 약 5Х109 세포, 약 6Х109 세포, 약 7Х109 세포, 약 8Х109 세포, 약 9Х109 세포, 약 1Х1010 세포, 약 2Х1010 세포, 약 3Х1010 세포, 약 4Х1010 세포, 약 5Х1010 세포, 약 6Х1010 세포, 약 7Х1010 세포, 약 8Х1010 세포, 또는 약 9Х1010 세포를 포함한다.
일부 구현예에서 치료 유효 용량은 약 0.5Х106 세포 내지 약 9Х1010 세포, 약 1Х106 세포 내지 약 5Х1010 세포, 약 2Х106 세포 내지 약 5Х109 세포, 약 3Х106 세포 내지 약 5Х109 세포, 약 4Х106 세포 내지 약 3Х109 세포, 약 5Х106 세포 내지 약 2Х109 세포, 약 6Х106 세포 내지 약 1Х109 세포, 0.5Х106 세포 내지 약 6Х109 세포, 약 1Х106 세포 내지 약 5Х109 세포, 약 2Х106 세포 내지 약 5Х109 세포, 약 3Х106 세포 내지 약 4Х109 세포, 약 4Х106 세포 내지 약 3Х109 세포, 약 5Х106 세포 내지 약 2Х109 세포, 약 6Х106 세포 내지 약 1Х109 세포, 0.5Х106 세포 내지 약 6Х108 세포, 약 1Х106 세포 내지 약 5Х108 세포, 약 2Х106 세포 내지 약 5Х108 세포, 약 3Х106 세포 내지 약 4Х108 세포, 약 4Х106 세포 내지 약 3Х108 세포, 약 5Х106 세포 내지 약 2Х108 세포, 약 6Х106 세포 내지 약 1Х108 세포, 약 7Х106 세포 내지 약 9Х108 세포, 약 8Х106 세포 내지 약 8Х108 세포, 약 9Х106 세포 내지 약 7Х108 세포, 약 1Х107 세포 내지 약 6Х108 세포, 약 2Х107 세포 내지 약 5Х108 세포, 약 7Х106 세포 내지 약 9Х107 세포, 약 8Х106 세포 내지 약 8Х107 세포, 약 9Х106 세포 내지 약 7Х107 세포, 약 1Х107 세포 내지 약 6Х107 세포, 또는 약 2Х107 세포 내지 약 5Х107 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х105 세포 내지 약 9Х1010 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х106 세포 내지 약 1Х1010 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х106 세포 내지 약 5Х109 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х106 세포 내지 약 1Х109 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х106 세포 내지 약 6Х108 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х106 세포 내지 약 9Х1010 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х107 세포 내지 약 1Х1010 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х107 세포 내지 약 5Х109 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х107 세포 내지 약 1Х109 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х107 세포 내지 약 6Х108 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х108 세포 내지 약 9Х1010 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х108 세포 내지 약 1Х1010 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х108 세포 내지 약 5Х109 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효 용량은 약 0.5Х108 세포 내지 약 1Х109 세포를 포함한다. 치료 용량에서 언급되는 용어 "약"은 예를 들어, ± 0.5Х106 세포, ± 0.5Х107 세포, 또는 ± 0.5Х108 세포일 수 있다.
키트 및 제조 물품
본 개시내용은 본원에 기재된 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터, 및 본원에 기재된 수용체를 포함하는 면역 세포를 포함하는 키트 및 제조 물품을 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 바이알, 주사기 및 사용 설명서와 같은 물품을 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 본 개시내용의 하나 이상의 수용체를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 제1 및 제2 수용체를 포함하는 다수의 면역 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 면역 세포는 다수의 T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 사용 설명서를 추가로 포함한다.
열거된 구현예
구현예 1. 다음을 포함하는 면역 세포:
a.) 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 수용체; 및
b.) EGFR+ 암에서 이형접합성의 소실로 인해 소실된 비-표적 항원에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 수용체,
여기서 제1 수용체는 EGFR에 반응하는 활성화제 수용체이고; 여기서 제2 수용체는 비-표적 항원에 반응하는 억제 수용체이다.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 MHC 단백질의 대립형질 변이체에 특이적으로 결합하는 면역 세포.
구현예 3. 구현예 1에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C 단백질의 대립형질 변이체에 특이적으로 결합하는 면역 세포.
구현예 4. 구현예 1에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 HLA-A*02에 특이적으로 결합하는 면역 세포.
구현예 5. 구현예 1에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*11, HLA-C*07, 또는 HLA-B*07에 특이적으로 결합하는 면역 세포.
구현예 6. 구현예 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이 표 5에 개시된 바와 같은 상보성 결정 영역 (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3; 또는 표 5의 CDR에 비해 최대 1, 2 또는 3개의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 CDR 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 7. 구현예 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이 서열 번호 101-106의 또는 서열 번호 106-112의 상보성 결정 영역 (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3; 또는 표 5의 CDR에 비해 최대 1, 2 또는 3개의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 CDR 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 8. 구현예 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이 표 4에 개시된 폴리펩티드 서열로부터 선택된 폴리펩티드 서열; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 9. 구현예 4에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이 서열 번호 89-100 중 어느 하나; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR)인 면역 세포.
구현예 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이 표 3에 제시된 서열 그룹으로부터 선택된 가변 중쇄 (VH) 부분 세트를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (HC-CDR); 및/또는 표 3에 제시된 서열 그룹의 가변 경쇄 (VL) 부분 세트를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (LC-CDR); 또는 각각의 CDR에서 최대 1, 2, 3, 4개의 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 CDR 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이 표 2에 제시된 VH 서열로부터 선택된 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH) 부분; 및/또는 표 2에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 부분; 또는 이에 대해 적어도 70%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이 표 1에 제시된 서열의 그룹으로부터 선택된 서열; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이 서열 번호 9-18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 scFv 서열; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체는 LILRB1 세포 내 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 면역 세포.
구현예 16. 구현예 15에 있어서, 상기 LILRB1 세포 내 도메인이 서열 번호 129에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한, 또는 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체가 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 면역 세포.
구현예 18. 구현예 17에 있어서, 상기 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체가 서열 번호 133과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체가 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 면역 세포.
구현예 20. 구현예 19에 있어서, 상기 LILRB1 힌지 도메인이 서열 번호 132, 서열 번호 125, 서열 번호 126에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체가 LILRB1 세포 내 도메인, LILRB1 막관통 도메인, LILRB1 힌지 도메인, 이들 중 임의의 것의 기능적 변이체, 또는 이들의 조합을 포함하는 면역 세포.
구현예 22. 구현예 21에 있어서, 상기 LILRB1 세포 내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인이 서열 번호 128 또는 서열 번호 128과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 EGFR+ 암세포가 폐암 세포, 소세포 폐암 세포, 비-소세포 폐암 세포, 췌관 암종 세포, 대장암 세포, 두경부암 세포, 식도암 및 위선암 세포, 난소암 세포, 다형성 교모세포종 세포, 자궁경부 편평 세포 암종 세포, 신장암 세포, 유두상 신장암 세포, 신장 투명 세포 암종 세포, 방광암 세포, 유방암 세포, 담관암 세포, 간암 세포, 전립선암 세포, 육종 세포, 갑상선암 세포, 흉선암 세포, 위암 세포, 또는 자궁암 세포인 면역 세포.
구현예 24. 구현예 23에 있어서, 상기 EGFR+ 암 세포는 폐암 세포인 면역 세포.
구현예 25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 EGFR+ 암 세포는 HLA-A*02를 발현하지 않는 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포; 또는 HLA-A*02를 발현하지 않는 HLA-A*02+ 개체로부터 유래된 암 세포인 면역 세포.
구현예 26. 구현예 25에 있어서, 상기 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포는 HLA-A의 이형접합성 소실에 의해 EGFR+/HLA-A*02+ 세포로부터 유도되어 HLA-A*02의 소실을 초래하는 면역 세포.
구현예 27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 수용체 및 제2 수용체가 함께 이형접합성을 소실한 EGFR/HLA-A*02- 암 세포의 존재 하에 면역 세포를 특이적으로 활성화시키는 면역 세포.
구현예 28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 수용체 및 제2 수용체가 함께 이형접합성 소실에 의해 HLA-A*02가 소실되지 않은 EGFR+ 세포의 존재 하에 면역 세포를 특이적으로 활성화시키지 않는 면역 세포.
구현예 29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, 대식세포, NK 세포, iNKT 세포, 또는 감마 델타 T 세포인 면역 세포.
구현예 30. 구현예 29에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ CD4- T 세포인 면역 세포.
구현예 31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 유전자의 발현 및/또는 기능이 감소되거나 제거된 면역 세포.
구현예 32. 구현예 30에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 유전자는 베타-2-마이크로글로불린 (B2M)인 면역 세포.
구현예 33. 구현예 32에 있어서, 간섭 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 간섭 RNA는 B2M mRNA의 서열 (서열 번호 172)에 상보적인 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 34. 구현예 33에 있어서, 상기 간섭 RNA가 B2M mRNA의 RNAi-매개 분해를 유도할 수 있는 면역 세포.
구현예 35. 구현예 33에 있어서, 상기 간섭 RNA는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)인 면역 세포.
구현예 36. 구현예 35에 있어서, 상기 shRNA는 다음을 포함하고:
a.) 5' 말단에서 3' 말단으로 B2M mRNA의 서열에 상보적인 서열을 갖는 제1 서열; 및
b.) 5' 말단에서 3' 말단으로 제1 서열에 상보적인 서열을 갖는, 제2 서열,
여기서 제1 서열 및 제2 서열은 shRNA를 형성하는 면역 세포.
구현예 37. 구현예 32에 있어서, B2M을 암호화하는 서열 (서열 번호 170)에 대한 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 B2M의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 제거하는 면역 세포.
구현예 38. 구현예 37에 있어서, 상기 하나 이상의 변형은 B2M을 암호화하는 내인성 유전자의 하나 이상의 불활성화 돌연변이를 포함하는 면역 세포.
구현예 39. 구현예 38에 있어서, 상기 하나 이상의 불활성화 돌연변이는 결실, 삽입, 치환, 또는 프레임이동 돌연변이를 포함하는 면역 세포.
구현예 40. 구현예 38 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 불활성화 돌연변이가 B2M을 암호화하는 내인성 유전자의 서열 (서열 번호 170)을 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 핵산 (gNA)과의 복합체에서 핵산 유도 엔도뉴클레아제로 도입되는 면역 세포.
구현예 41. 구현예 31에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 유전자는 HLA-A*02인 면역 세포.
구현예 42. 구현예 41에 있어서, 간섭 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, HLA-A*02 mRNA의 서열 (서열 번호 171)에 상보적인 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 43. 구현예 42에 있어서, 상기 간섭 RNA는 HLA-A*02 mRNA의 RNA 간섭 (RNAi)-매개 분해를 유도할 수 있는 면역 세포.
구현예 44. 구현예 43에 있어서, 상기 간섭 RNA는 다음을 포함하는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)이고:
a.) 5' 말단에서 3' 말단으로 HLA-A*02 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 갖는 제1 서열; 및
b.) 5' 말단에서 3' 말단으로 제1 서열에 상보적인 서열을 갖는 제2 서열,
여기서 제1 서열 및 제2 서열은 shRNA를 형성하는 면역 세포.
구현예 45. 구현예 41에 있어서, HLA-A*02를 암호화하는 내인성 유전자의 서열 (서열 번호 169)에 대한 하나 이상의 변형을 포함하고, 여기서 하나 이상의 변형은 HLA-A*02의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 제거하는 면역 세포.
구현예 46. 구현예 45에 있어서, 상기 하나 이상의 변형은 HLA-A*02를 암호화하는 내인성 유전자의 하나 이상의 불활성화 돌연변이를 포함하는 면역 세포.
구현예 47. 구현예 45 또는 구현예 46에 있어서, 상기 하나 이상의 불활성화 돌연변이는 HLA-A*02를 암호화하는 내인성 유전자의 서열을 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 핵산 (gNA)을 갖는 복합체에서 핵산 유도 엔도뉴클레아제로 도입되는 면역 세포.
구현예 48. 구현예 1에 있어서:
a.) 제1 수용체는 서열 번호 177, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
b.) 제2 수용체는 서열 번호 174 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 49. 구현예 1에 있어서:
a.) 제1 수용체는 서열 번호 177, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
b.) 제2 수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 50. 구현예 1에 있어서:
a.) 제1 수용체는 서열 번호 175, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
b.) 제2 수용체는 서열 번호 174, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 51. 구현예 1에 있어서:
a.) 제1 수용체는 서열 번호 175, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
b.) 제2 수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 52. 구현예 1에 있어서:
a.) 제1 수용체는 서열 번호 176, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
b.) 제2 수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 53. 구현예 1에 있어서:
a.) 제1 수용체는 서열 번호 176, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
b.) 제2 수용체는 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 54. 구현예 48 내지 53 중 어느 하나에 있어서, T2A 자가 절단 펩티드를 추가로 포함하고, 상기 T2A 자가 절단 펩티드는 서열 번호 178, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 55. 구현예 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 간섭 RNA를 추가로 포함하고, 상기 간섭 RNA는 서열 번호 179, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 56. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포가 자가 세포인 면역 세포.
구현예 57. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포가 동종이계인 면역 세포.
구현예 58. 구현예 1 내지 57중 어느 하나의 면역 세포의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물.
구현예 59. 구현예 58에 있어서, 상기 면역 세포는 제1 수용체 및 제2 수용체를 모두 발현하는 약학 조성물.
구현예 60. 구현예 59에 있어서, 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 면역 세포는 제1 수용체 및 제2 수용체를 모두 발현하는 약학 조성물.
구현예 61. 구현예 59에 있어서, 적어도 90%의 면역 세포는 제1 수용체 및 제2 수용체를 모두 발현하는 약학 조성물.
구현예 62. 구현예 58 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
구현예 63. 구현예 58 내지 62 중 어느 하나에 있어서, EGFR+ 암 치료에 약제로 사용하기 위한 약학 조성물.
구현예 64. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템으로서, 다음을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하고:
a.) 내피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 수용체; 및
b.) 이형접합성의 소실로 인해 EGFR+ 암 세포에서 소실된 비-표적 항원에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 수용체,
여기서 제1 수용체는 EGFR+ 암 세포 상의 EGFR에 반응하는 활성화제 수용체이고; 여기서 제2 수용체는 비-표적 항원에 반응하는 억제 수용체인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템.
구현예 65. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템으로서, 구현예 1 내지 57 중 어느 하나의 면역 세포를 생성하는데 사용하기 위한 제1 수용체 및 제2 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템.
구현예 66. 구현예 64 또는 65의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
구현예 67. MHC 클래스 I 유전자좌에서 이형접합성을 소실한 EGFR+ 암 세포를 사멸시키는 방법으로서, 유효량의 구현예 1-57 중 어느 하나의 면역 세포 또는 구현예 58-62 중 어느 하나의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 68. 구현예 67에 있어서, 상기 EGFR+ 암 세포는 폐암 세포, 소세포 폐암 세포, 비-소세포 폐암 세포, 췌관 암종 세포, 결장직장암 세포, 두경부암 세포, 식도 및 위 선암종 세포, 난소암 세포, 다형성 교모세포종 세포, 자궁경부 편평 세포 암종 세포, 신장암 세포, 유두상 신장암 세포, 신장 투명 세포 암종 세포, 방광암 세포, 유방암 세포, 담관암 세포, 간암 세포, 전립선암 세포, 육종 세포, 갑상선암 세포, 흉선암 세포, 위암 세포, 또는 자궁암 세포인 방법.
구현예 69. 구현예 67에 있어서, 상기 EGFR+ 암 세포는 폐암 세포인 방법.
구현예 70. 구현예 67에 있어서, 상기 EGFR+ 암 세포는 HLA-A*02를 발현하지 않는 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포; 또는 HLA-A*02를 발현하지 않는 HLA-A*02+ 개체로부터 유래된 암 세포인 방법.
구현예 71. 구현예 70에 있어서, 상기 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포는 HLA-A*02의 소실을 야기하는 HLA-A에서 이형접합성의 소실에 의해 EGFR+/HLA-A*02+ 세포로부터 유래되는 방법.
구현예 72. 비-표적 항원을 암호화하는 유전자좌에서 이형접합성이 소실된 EGFR+ 종양이 있는 대상체에서 EGFR+ 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 구현예 1-57 중 어느 하나의 면역 세포 또는 구현예 58-62 중 어느 하나의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 73. 구현예 72에 있어서, 상기 대상체는 EGFR을 발현하고 HLA-A*02 발현을 상실한 악성종양을 갖는 이형접합 HLA-A*02 환자인 방법.
구현예 74. 구현예 72에 있어서, 상기 대상체는 EGFR을 발현하고 HLA-A*02 발현을 상실한 재발성 절제 불가능 또는 전이성 고형 종양을 갖는 이형접합 HLA-A*02 환자인 방법.
구현예 75. 다음 단계를 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법:
a.) 대상체의 비악성 세포 및 암세포에서 비-표적 항원의 유전자형 또는 발현 수준을 결정하는 단계;
b.) 대상체의 암 세포에서 EGFR의 발현 수준을 결정하는 단계; 및
c.) 비-악성 세포가 비-표적 항원을 발현하고 암 세포는 비-표적 항원을 발현하지 않고, 암 세포가 EGFR 양성인 경우 대상체에게 유효량의 구현예 1-57 중 어느 하나의 면역 세포 또는 구현예 58-62 중 어느 하나의 약학 조성물을 투여하는 단계.
구현예 76. 구현예 67 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 구현예 1-57 중 어느 하나의 면역 세포 또는 구현예 58-62 중 어느 하나의 약학 조성물의 투여가 대상체에서 종양의 크기를 감소시키는 방법.
구현예 77. 구현예 76에 있어서, 상기 종양이 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 감소되는 방법.
구현예 78. 구현예 76에 있어서, 상기 종양이 제거되는 것인 방법.
구현예 79. 구현예 67 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여가 대상체에서 종양의 성장을 정지시키는 방법.
구현예 80. 구현예 67 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 구현예 1-57 중 어느 하나의 면역 세포 또는 구현예 58-62 중 어느 하나의 약학 조성물의 투여가 대상체에서 종양의 수를 감소시키는 방법.
구현예 81. 구현예 67 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여가 대상체에서 정상 세포가 아닌 암 세포의 선택적인 사멸을 초래하는 방법.
구현예 82. 구현예 81에 있어서, 상기 사멸된 세포의 적어도 약 60%가 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 65%가 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 70%가 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 75%가 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 80%가 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 85%가 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 90%가 암세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 95%가 암세포이고, 또는 사멸된 세포의 약 100%가 암세포인 방법.
구현예 83. 구현예 81에 있어서, 상기 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여가 대상체의 암세포의 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 모두의 사멸을 초래하는 방법.
구현예 84. 구현예 67 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여가 제1 활성화제 수용체를 포함하지만 제2 억제 수용체는 포함하지 않는 달리 동등한 면역 세포의 투여보다 대상체에 대한 부작용이 더 적은 방법.
구현예 85. 다수의 면역 세포를 제조하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
a.) 다수의 면역 세포를 제공하는 단계, 및
b.) 다수의 면역 세포를 구현예 64 또는 구현예 65의 폴리뉴클레오티드 시스템, 또는 구현예 66의 벡터로 형질전환하는 단계.
구현예 86. 구현예 1-57 중 어느 하나의 면역 세포 또는 구현예 58-62 중 어느 하나의 약학 조성물을 포함하는 키트.
구현예 87. 구현예 86에 있어서, 사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
구현예 88. 세포에서 이형접합성의 소실에 반응하는 면역 세포로서, 다음을 포함하는 면역 세포:
a. 다음으로부터 선택된 표적 항원에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 수용체, 임의로 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR):
i. 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체 내 암 세포 특이적 항원, 또는 이의 펩티드 항원; 또는
ii. 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)과의 복합체 내 이의 펩티드 항원; 및
b. 이형접합성의 소실로 인해 암 세포에서 소실된 비표적 항원에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 수용체, 임의로 억제 수용체.
구현예 89. 구현예 88에 있어서, 상기 비-표적 항원은 다형성을 포함하는 방법.
구현예 90. 구현예 89에 있어서, 상기 비-표적 항원은 서열 번호 87과 적어도 95% 동일성을 공유하는 COLEC12 항원을 포함하고 다형성은 서열 번호 87의 위치 522에서 S 또는 P를 포함하는 면역 세포.
구현예 91. 구현예 89에 있어서, 상기 비-표적 항원은 서열 번호 88, 서열 번호 134 또는 서열 번호 135과 적어도 95% 동일성을 공유하는 APCDD1 항원을 포함하고, 다형성은 다음으로 구성된 그룹에서 선택되는 면역 세포:
a. 서열 번호 88의 위치 150에서 A V, I 또는 L;
b. 서열 번호 134의 위치 165에서 Y 또는 S; 및
c. 서열 번호 135의 위치 28에서 A Q 또는 R.
구현예 92. 구현예 89에 있어서, 상기 비-표적 항원은 서열 번호 86과 적어도 95% 동일성을 공유하는 CXCL16 항원을 포함하고 다형성은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역 세포:
a. 서열 번호 86의 위치 142에서 I 또는 T; 및
b. 서열 번호 86의 위치 200에서 A 또는 V.
구현예 93. 구현예 88 또는 89에 있어서, 상기 비-표적 항원은 HLA-A*02를 포함하는 면역 세포.
구현예 94. 구현예 88 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항원이 암 세포에 의해 발현되는 면역 세포.
구현예 95. 구현예 88 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 비-표적 항원이 암 세포에 의해 발현되지 않는 면역 세포.
구현예 96. 구현예 88 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 상기 비-표적 항원이 비-표적 세포에 의해 발현되는 면역 세포.
구현예 97. 구현예 88 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 상기 비-표적 세포가 표적 항원 및 비-표적 항원 모두를 발현하는 면역 세포.
구현예 98. 구현예 88 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항원은 암 세포 특이적 항원인 면역 세포.
구현예 99. 구현예 88 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항원은 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)과의 복합체 내의 암 세포 특이적 항원의 펩티드 항원인 면역 세포.
구현예 100. 구현예 88 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 상기 암 세포는 폐암 세포, 교모세포종 세포, 유방암 세포, 두경부암 세포 또는 결장직장암 세포인 면역 세포.
구현예 101. 구현예 88 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 상기 암 세포가 EGFR을 발현하는 면역 세포.
구현예 102. 구현예 88 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 수용체 및 제2 수용체가 함께 암 세포의 존재 하에 면역 세포를 특이적으로 활성화시키는 면역 세포.
구현예 103. 구현예 102에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, 대식세포, NK 세포, iNKT 세포, 또는 감마 델타 T 세포인 면역 세포.
구현예 104. 구현예 103에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ CD4- T 세포인 면역 세포.
구현예 105. 구현예 88 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 상기 EGFR 서열을 서열 번호 1-8 중 어느 하나와 적어도 95% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 106. 구현예 88 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 수용체는 T 세포 수용체 (TCR)인 면역 세포.
구현예 107. 구현예 88 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 면역 세포.
구현예 108. 구현예 106 또는 107에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 단쇄 Fv 항체 단편 (scFv), β 사슬 가변 도메인 (Vβ), 또는 TCR α 사슬 가변 도메인 및 TCR β 사슬 가변 도메인을 포함하는 면역 세포.
구현예 109. 구현예 106 또는 107에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 scFv를 포함하는 면역 세포.
구현예 110. 구현예 109에 있어서, 상기 scFv는 서열 번호 9-18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 111. 구현예 109에 있어서, 상기 scFv는 서열 번호 9-18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 본질적으로 이루어지는 면역 세포.
구현예 112. 구현예 106 또는 107에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 VH 및 VL 도메인을 포함하는 면역 세포.
구현예 113. 구현예 112에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열 번호 19-24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 표 2에 개시된 VH 서열, 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 114. 구현예 112에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열 번호 19-24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 표 2에 개시된 VH 서열을 포함하거나 본질적으로 이루어지는 면역 세포.
구현예 115. 구현예 112 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 상기 VL 서열 번호 25-30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 표 2에 개시된 VH 서열, 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 116. 구현예 112 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 상기 VL 도메인은 서열 번호 25-30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 표 2에 개시된 VL 서열을 포함하거나 본질적으로 이루어지는 세포.
구현예 117. 구현예 105 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 31-65로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 표 3에 개시된 CDR 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 118. 구현예 88 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 단쇄 Fv 항체 단편 (scFv), β 사슬 가변 도메인 (Vβ), 또는 TCR α 사슬 가변 도메인 및 TCR β 사슬 가변 도메인을 포함하는 면역 세포.
구현예 119. 구현예 88 또는 93 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 scFv를 포함하는 면역 세포.
구현예 120. 구현예 119에 있어서, 상기 scFv는 서열 번호 89-100 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 121. 구현예 119에 있어서, 상기 scFv는 서열 번호 89-100 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 본질적으로 이루어지는 세포.
구현예 122. 구현예 88 또는 93 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 101-112 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 CDR을 포함하는 면역 세포.
구현예 123. 구현예 88 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체는 LILRB1 세포 내 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 면역 세포.
구현예 124. 구현예 123에 있어서, 상기 LILRB1 세포 내 도메인은 서열 번호 124와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 125. 구현예 88 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 면역 세포.
구현예 126. 구현예 125에 있어서, 상기 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 133과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 127. 구현예 88 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체는 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 포함하는 면역 세포.
구현예 128. 구현예 127에 있어서, 상기 LILRB1 힌지 도메인은 서열 번호 132, 서열 번호 125 또는 서열 번호 126과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 129. 구현예 88 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 수용체는 LILRB1 세포 내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 면역 세포.
구현예 130. 구현예 129에 있어서, 상기 LILRB1 세포 내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인은 서열 번호 128 또는 서열 번호 128과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
구현예 131. 구현예 88 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, 대식세포, NK 세포, iNKT 세포, 또는 감마 델타 T 세포인 면역 세포.
구현예 132. 구현예 131에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ CD4- T 세포인 면역 세포.
구현예 133. 치료적 유효량의 구현예 88-132 중 어느 하나의 면역 세포를 포함하는 약학 조성물.
구현예 134. 구현예 133에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
구현예 135. 암 치료에 약제로 사용하기 위한 구현예 133 또는 134의 약학 조성물.
구현예 136. 다음을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 시스템:
a. 다음으로부터 선택된 표적 항원에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 수용체, 임의로 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR):
i. 암 세포 특이적 항원, 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체 내 이의 펩티드 항원; 또는
ii. 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 또는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC-I)와의 복합체 내 이의 펩티드 항원; 및
b. 이형접합성의 소실로 인해 암 세포에서 소실된 비-표적 항원에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 수용체, 임의로 억제 수용체.
구현예 137. 구현예 136에 있어서, 비-표적 항원은 다형성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 시스템.
구현예 138. 구현예 137에 있어서, 상기 비-표적 항원은 서열 번호 87과 적어도 95% 동일성을 공유하는 COLEC12 항원이고 다형성은 서열 번호 87의 위치 522에서 S 또는 P를 포함하는 폴리뉴클레오티드 시스템.
구현예 139. 구현예 137에 있어서, 상기 비-표적 항원은 서열 번호 88, 서열 번호 134 또는 서열 번호 135와 적어도 95% 동일성을 공유하는 APCDD1 항원이고, 다형성은 다음으로 구성된 그룹에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 시스템:
a. 서열 번호 88의 위치 150에서 A V, I 또는 L;
b. 서열 번호 134의 위치 165에서 Y 또는 S; 및
c. 서열 번호 135의 위치 28에서 A Q 또는 R.
구현예 140. 구현예 137에 있어서, 상기 비-표적 항원은 서열 번호 86과 적어도 95% 동일성을 공유하는 CXCL16 항원이고 다형성은 다음으로 구성된 그룹에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 시스템:
a. 서열 번호 86의 위치 142에서 I 또는 T; 및
b. 서열 번호 86의 위치 200에서 A 또는 V.
구현예 141. 구현예 136 또는 137에 있어서, 상기 비-표적 항원이 HLA-A*02인 폴리뉴클레오티드 시스템.
구현예 142. 구현예 136-141 중 어느 하나의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
구현예 143. 대상체에서 다수의 암세포를 죽이고/거나 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에 유효량의 구현예 88-132 중 어느 하나의 면역 세포 또는 구현예 46-48 중 어느 하나의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 144. 구현예 143에 있어서, 다수의 암 세포가 표적 항원을 발현하는 방법.
구현예 145. 구현예 143 또는 144에 있어서, 다수의 암 세포는 비-표적 항원을 발현하지 않는 방법.
구현예 146. 다수의 면역 세포를 만드는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
a. 다수의 면역 세포를 생산하는 단계, 및
b. 다수의 면역 세포를 구현예 136-141 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 시스템, 또는 구현예 142의 벡터로 형질전환하는 단계.
구현예 147. 구현예 88-132 중 어느 하나의 면역 세포 또는 구현예 133-135중 어느 하나의 약학 조성물을 포함하는 키트.
구현예 148. 구현예 147에 있어서, 사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
실시예
다음 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는다. 실시예 전체에서, 용어 "차단제 항원"은 비-표적 항원의 구현예를 기술하기 위해 사용된다.
실시예 1: 이형접합성 소실로 인해 암 세포에서 소실된 차단제 표적의 식별
생물정보학 파이프라인을 사용하여 후보 차단제 표적을 식별했다. 결장직장암에서 높은 이형접합성 소실 (0.5 초과)을 갖는 세포외 도메인에서 공통의 비동의 변이체를 갖는 유전자 세트를 인간 유전자 세트에서 검색하였다. 비동의 변이체를 갖는 유전자는 출판, 인구 빈도, 분자 결과 및 게놈 매핑과 함께 소규모 삽입 및 결실을 포함하는 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스인 dbSNP에서 검색되었다. 공통 변이는 적어도 하나의 주요 모집단에서 0.01 이상의 마이너 대립유전자 빈도 (MAF)를 갖고 NCBI에서 마이너 대립유전자를 갖는 적어도 두 명의 무관한 개인으로 정의되었다. 공통 변이에 대한 기준으로 0.1 이상의 MAF. 17번과 18번 염색체는 결장직장암에서 LOH가 높기 때문에 초점이 맞춰졌다. 위에서 기술한 바와 같이, 세포외 도메인에서 막 단백질, 결장 발현 및 일반적인 비동의 변이체에 대해 유전자를 필터링하였다. 검색 프로세스의 요약은 도 18에 나타낸다.
이 분석에 사용된 추가 데이터베이스는 다음과 같다: EMBL-EBI, SIB 및 PIR에서 호스팅하는 단백질 서열 및 주석 데이터에 대한 리소스로 사용되는, Uniprot (The Universal Protein Resource). GTEx (The Genotype-Tissue Expression)는 조직 특이적 유전자 발현 및 조절을 위한 공공 자원으로 사용되었다. 여기에는 거의 1000명의 개체에 걸쳐 54개의 질환이 없는 조직 부위의 샘플이 포함되어 있다. TCGA (The Cancer Genome Atlas)는 20,000개 이상의 원발성 암에 대한 자원으로 사용되었으며 33개 암 유형에 걸친 정상 샘플과 일치했다. TCGA-COADREAD 데이터 세트는 결장 선암종 및 직장 선암종 데이터 세트이다. CCLE (Cancer cell line Encyclopedia)는 57개의 결장직장암 (CRC) 세포주에 대한 정보를 포함한다.
RNASeqDB는 메모리얼 슬론 케터링 암 센터의 비교 연구를 허용하는 동일한 파이프라인을 사용하여 GTEx 및 TCGA에서 처리된 데이터의 데이터베이스이다. GTEx의 372개 TCGA-COADREAD 샘플 및 339개 정상 결장 샘플을 분석했다.
COLEC12, CXCL16 및 APCDD1은 잠재력 차단제 표적으로 식별되었다. 표 14는 결장직장암에서 이들 유전자에 대한 발현 데이터를 요약한 것이다. UCSC Xena 브라우저 (TCGA의 경우) 및 CCLE 샘플의 발현 데이터.
표 14. 발현
Figure pct00049
표 15는 변이체 및 마이너 대립유전자 빈도를 요약한 것이다.
표 15. 위치, 특성 및 변형
Figure pct00050
표 16. 다양한 암의 LOH 빈도
Figure pct00051
실시예 2: 차단제 리간드 결합 도메인의 식별
후보 차단제 항원에 대한 공개적으로 이용 가능한 항체는 CDR 서열이 알려지지 않은 경우 시퀀싱된다. 후보 차단제 표적에 대한 항체가 없는 경우, 정제된 단백질 (예를 들어, COLEC12, CXCL16 및 실시예에 설명된 다른 표적)로 마우스, 랫트 또는 토끼를 면역화하여 이러한 항체를 생성한다. 면역화된 동물의 혈청은 차단제 표적에 결합하기 위해 mAb를 스크리닝하는 데 사용된다. 차단제 표적에 대한 항체도 huTARG 시스템을 사용하여 생성된다. 그런 다음 원하는 특이성을 가진 항체를 분리하고 시퀀싱하여 CDR 서열을 결정한다.
차단제 표적에 대한 항체의 CDR 서열은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 scFv를 생성하는 데 사용된다. 후보 scFv는 억제 수용체 힌지 또는 막관통 도메인에 융합되어 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 억제 수용체를 생성한다. 후보 scFv는 또한 활성화제 수용체 힌지 또는 막관통 도메인 (예를 들어, CAR)에 융합되어 표적 항원에 결합하는 scFv에 대한 양성 대조군으로서 사용하기 위한 전장 활성화제 수용체를 생성한다. 억제 수용체와 관련하여 작동하는 후보 scFv의 능력은 NFAT-루시퍼라제 리포터 분석을 사용하여 저캇 세포에서 분석된다.
실시예 3: 저캇 및 1차 T 세포 활성화 실험 방법
세포 배양
NFAT 루시퍼라제 리포터를 암호화하는 저캇 세포는 BPS Bioscience로부터 얻었다. 배양에서, 저캇 세포는 10% FBS, 1% Pen/Strep 및 0.4mg/mL G418/제네티신이 보충된 RPMI 배지에서 유지되었다. 이 연구에 사용된 다른 모든 세포주는 ATCC에서 구입했으며 ATCC에서 제안한 대로 유지했다.
저캇 세포 형질감염
저캇 세포는 다음 설정을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 100uL 형식 네온 전기천공 시스템 (Lonza)을 통해 일시적으로 형질감염되었다: 3 펄스, 1500V, 10 msec. 1e6 세포당 1-3ug의 활성화제 CAR 또는 TCR 작제물 및 1-3ug의 차단제 작제물 또는 빈 벡터로 동시형질감염을 수행하고 20% 열 불활성화 FBS 및 0.1% Pen/Strep이 보충된 RPMI 배지에서 회수했다.
저캇-NFAT-루시퍼라제 활성화 연구
저캇 세포를 10% 열 불활성화 FBS 및 0.1% Pen/Strep이 보충된 15uL의 RPMI에서 재현탁하고, 펩티드-로딩된 비드에 첨가하고 6시간 동안 공동 배양하였다. ONE-Step 루시퍼라제 분석 시스템 (BPS Bioscience)을 사용하여 저캇 발광을 평가했다. 검정은 기술적 반복으로 수행되었다.
1차 T 세포 형질도입, 확장 및 농축
동결 PBMC는 37℃ 수조에서 해동하고 1% 인간 혈청을 포함하는 LymphoONE (Takara)에서 1e6 세포/mL로 배양하고 300 IU/ml IL-2가 보충된 1:100의 T 세포 TransAct (Miltenyi)를 사용하여 활성화했다. 24시간 후, 렌티바이러스를 MOI 5에서 PBMC로 첨가하였다. PBMC를 2-3일 더 배양하여 세포가 TransAct 자극 하에 확장되도록 하였다. 확장 후, 활성화제 및 차단제로 형질도입된 1차 T 세포는 제조업체의 지침에 따라 항-PE 마이크로비드 (Miltenyi)를 사용하여 강화되었다. 간략하게, 1차 T 세포를 MACS 완충액 (0.5% BSA + PBS 중 2mM EDTA)에서 실온에서 30분 동안 1:25 희석으로 EGFR-Fc (R&D Systems)와 함께 배양하였다 세포를 MACS 완충액으로 3회 세척하고 MACS 완충액에서 실온에서 30분 동안 2차 항체 (1:1200)에서 배양하였다. 이어서 세포를 항-PE 마이크로비드에서 배양하고 LS 컬럼 (Miltenyi)을 통과시켰다.
1차 T 세포 시험관 내 세포독성 연구
pMHC 표적을 사용한 세포독성 연구를 위해, 농축된 1차 T 세포를 GFP 또는 RFP를 발현하는 HeLa 또는 HCT116 표적 세포와 함께 배양했다. "종양" 세포의 경우, WT HeLa 또는 HLA-A*02 녹아웃 HCT116이 사용되었고 "정상" 세포의 경우, HLA-A*02 형질도입된 HeLa 또는 WT HCT116이 사용되었다. 공동 배양은 IncuCyte 라이브 셀 이미저를 사용하여 이미지화되었고 표적 세포 형광 영역은 살아있는 표적 세포를 정량화하는 데 사용되었다.
실시예 4: HLA-A*02 억제 수용체는 저캇 세포의 EGFR-매개 활성화를 차단한다
EGFR 항원 결합 도메인 (예를 들어 CT479, CT486, 또는 CT489)을 갖는 활성화제 CAR을 발현하는 저캇 세포의 활성화를 차단하는 HLA-A-A*02 항원 결합 도메인 및 LIR-1 ICD (C1765 또는 C2162)를 갖는 억제 수용체의 능력은 이전에 설명한 대로 NFAT-루시퍼라제 리포터 시스템을 사용하여 분석하였다. EGFR+ 및 HLA-A*02-인, 정상 HeLa 종양 세포를 표적 세포로 사용하였다. EGFR+/ HLA-A*02- HeLa 세포는 또한 HLA-A*02+를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입되고 EGFR+ /HLA-A*02+ HeLa 세포를 생성하여 활성화제 및 차단제 항원을 모두 발현하는 표적 세포로 사용했다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, EGFR CAR (CT479)를 발현하는 저캇 세포에서 HLA-A*02 LIR-1 차단제 (C1765)의 발현은 차단제를 발현하지 않는 저캇 세포의 CAR Emax와 비교하여 >5배만큼 CAR EMAX를 이동시킨다.
더욱이, 표적 세포에서 더 낮은 HLA-A2 발현 수준으로 더 낮은 차단이 관찰되었다. 정상 HCT116 세포는 EGFR+ 및 HLA-A*02+이다. EGFR 및 HLA-A*02의 수준은 항-EGFR 항체 및 항-HLA-A*02 항체 (BB7.2)를 사용하여 HLA-A*02 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 HCT116 세포 및 HeLa 세포에서 분석되고 FAC 정렬이 이어진다. 도 2a & 2b에 나타낸 바와 같이, HCT116 세포는 형질도입된 HeLa 세포보다 더 낮은 수준의 차단제 HLA-A*02 항원을 갖는다. EGFR CAR 및 HLA-A*02 LIR-1 차단제를 발현하는 저캇 세포가 EGFR 및 HLA-A*02 항원을 발현하는 HCT116 표적 세포와 함께 제시될 때, HLA-A*02 LIR-1 차단제의 존재는 EGFR CAR의 EMAX를 1.8배 이동시켰다(도 3b). 대조적으로, 더 높은 수준의 HLA-A*02 항원을 발현하는, 형질도입된 HeLa 세포는 >5배의 EGFR CAR EMAX 이동을 매개할 수 있었다 (도 1b, 도 17b, 및 도 3d). 대조군으로서, EGFR 녹아웃 HCT116 세포에 의한 최소 활성화가 있었다 (도 3a).
EGFR CAR 및 HLA-A*02 LIR-1 차단제를 사용하여 50% 차단을 달성하는 데 필요한 차단제 대 활성화제의 비율을 도 4a 및 도 4b에 나타낸, 비드 기반 시스템을 사용하여 검정하였다.
활성화제 항원의 EC50을 결정하기 위해, 활성화제 비드를 상이한 농도의 활성제 항원으로 코팅하여 EC50을 결정하였다. 각 농도별로 무관한 단백질을 첨가하여 총 단백질 농도가 동일하게 되도록 하였으며, EGFR CAR을 발현하는 저캇 효과기 세포에 일정한 양의 비드를 첨가하였다 (도 4a).
차단제 항원 IC50을 결정하기 위해, 비드를 EC50 농도 (도 4a에 결정됨)에서 활성화제 항원으로 코팅하고, 상이한 농도의 차단제 항원으로 코팅하였다. 총 단백질 농도가 동일하게 유지되도록 각 농도에서 무관한 단백질을 첨가하고, EGFR CAR 또는 EGFR CAR 및 HLA-A*02 LIR-1 차단제를 발현하는 저캇 효과기 세포에 일정한 양의 비드를 첨가했다 (도 4b).
실시예 5: 특정 수용체 쌍의 특성화
EGFR scFv CAR 활성화제 (도 5 및 7-9에 나타낸 바와 같은, CT-479, CT-482, CT-486, CT-487, CT-488, 또는 CT-489), 또는 EGFR scFv CAR 활성화제 및 HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 억제제 (C1765 또는 C2162)로 형질감염된 T 세포를 HeLa 표적 세포와 공동 배양하였다. EGFR을 발현하지만 HLA-A*02를 발현하지 않는 정상 HeLa 세포주는 HLA-A*02 억제 수용체 표적을 발현하도록 형질도입되었다. 세포를 1:1 비율의 효과기 대 표적 (E:T)으로 공동 배양하였다. 도 5의 우측 아래에, 효과기 세포 수용체 발현이 먼저 표시되고, HeLa 세포 발현은 괄호 안에 표시된다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 동일한 HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 억제제를 상이한 EGFR 활성화제 수용체와 함께 사용했을 때 상이한 정도의 차단이 관찰되었다.
EGFR (표적 A) 또는 EGFR 및 HLA-A*02 (표적 AB)를 발현하는 HCT.116 세포와 공동 배양된 T 세포의 EGFR scFv CAR 활성화를 차단하는 HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 억제제 (C1765)의 능력을 또한 검정하였다 (도 10). HeLa 세포에서와 같이, 동일한 HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 억제제가 상이한 EGFR 활성화제 수용체와 함께 사용될 때 상이한 차단 정도가 관찰된다.
저캇 세포가 HeLa 표적 세포와 공동 배양되었을 때 저캇 세포의 EGFR scFv CAR 활성화를 차단하는 HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 억제제 (C1765)의 능력을 또한 검정하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. 1차 T 세포의 결과와 유사하게, 동일한 HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 억제제가 상이한 EGFR 활성화제 수용체와 함께 사용되었을 때 상이한 차단 정도가 관찰되었다.
활성화 리간드만을 발현하는 표적 세포 또는 활성화제 리간드 및 차단 리간드를 모두를 발현하는 표적 세포의 존재 하에 활성화제 또는 특정 활성화제/차단제 쌍을 발현하는 면역 세포에서 면역 세포 활성화를 측정하였다 (도 6a). 선택성 비율 (SR)을 CAR 활성화제 및 차단제의 시험된 쌍에 대해 계산하였다. SR은 활성화 리간드만을 발현하는 표적 세포의 존재 하에 활성화제/차단제 쌍을 발현하는 면역 세포의 활성화 대 활성화제 리간드 및 차단 리간드 모두를 발현하는 표적 세포의 존재 하에 활성화제/차단제 쌍을 발현하는 면역 세포의 활성화의 비율을 계산하여 결정된다. 선택된 EGFR 표적화 CAR 활성화제는 인간화 차단제 (C2162) 또는 마우스 차단제 (C1765)와 한 쌍으로 발현되었다. 인간화 차단제와 페어링된 EGFR 표적화 CAR 활성화제 중에서, CT489에 대한 선택성 비율은 24.2에 도달했고; CT486에 대한 선택성 비율은 17에 도달했고; CT487에 대한 선택성 비율은 5.0에 도달했고; CT487에 대한 선택성 비율은 5.0에 도달했다. 마우스 차단제와 페어링된 EGFR 표적화 CAR 활성화제 중에서, CT489에 대한 선택성 비율은 21.6이었고; CT486에 대한 선택성 비율은 15.7이었고; CT487에 대한 선택성 비율은 18.4이었고; CT487에 대한 선택성 비율은 21.2였다 (도 6a). EGFR 표적화 활성화제 및 억제 수용체 쌍 각각에 대해 최대 특이적 사멸을 또한 결정하였다. 모든 페어링에 대해, 특이적 사멸은 약 60%를 초과했으며, 이는 차단제의 선택이 EGFR 표적화 활성화제 수용체에 의한 T 세포 활성화에 유의한 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 그러나 특정 활성화제 및 특정 차단제 쌍의 페어링은 선택성 비율에 영향을 미쳤으며, 이는 특정 활성화제/억제 수용체 쌍을 촉진하여 오프-타겟 사멸을 예측할 수 없음을 나타낸다.
활성화제 및 차단제 민감도는 CAR 활성화제 단독 또는 CAR 활성화제 및 인간화 차단제 또는 마우스 차단제를 발현하는 면역 세포에서 결정되었다 (도 6b). 활성화제 민감도를 결정하기 위해 면역 세포를 EGFR 음성 표적 세포의 존재 하에 배양하였다. 배양 전, 표적 세포를 EGFR mRNA 로 적정하여, EGFR 발현 수준을 증가시켰다 (도 6b, 왼쪽 패널). 차단제 민감도를 결정하기 위해 면역 세포를 EGFR을 발현하는 HLA-A*02 음성 표적 세포 (세포당 약 53,000개 EGFR 분자)의 존재 하에 배양하였다. 배양 전, 표적 세포를 HLA-A*02 mRNA로 적정하여, HLA-A*02 발현 수준을 증가시켰다 (도 6b, 오른쪽 패널). EC50 값을 상이한 CAR 활성화제와 조합된 각각의 CAR 활성화제 및 차단제에 대해 계산하였다 (표 5.1). 결과는 특정 활성화제 수용체가 억제 수용체 민감도에 영향을 미친다는 것을 추가로 확인한다.
표 5.1
Figure pct00052
실시예 6: 억제 수용체는 T 세포에서 활성화제 수용체의 표면 수준을 가역적으로 감소시킨다
2명의 HLA-A*02 음성 공여자로부터의 1차 T 세포를 EGFR scFv CAR 활성화제 (CT-479, CT-482, CT-486, CT-487 또는 CT-488) 및 HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 억제제 (C1765)로 형질도입하였다. 형질도입된 세포는 차단제 및 활성화제 수용체에 대한 FACS 분류, 또는 차단제 및 활성화제 수용체에 대한 이중 컬럼 정제에 의해 강화되었다. 형질도입된 T 세포를 HeLa 표적 세포와 공동 배양하였다. 정상 HeLa 세포주는 EGFR을 발현하지만 HLA-A*02는 발현하지 않지만, HLA-A*02 억제 수용체 표적을 발현하도록 형질도입되었다. 세포는 효과기 대 표적 (E:T)의 1:1 비율로 공동 배양되었다. EGFR CAR 활성화제의 표면 발현을 활성화제 및 억제 수용체에 결합하는 표지된 펩티드, 및 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 120시간 후에 검정하였다. 활성화제 및 차단제 리간드 모두를 발현하는 HeLa 세포와의 공동 배양 후 활성화제 표면 수준의 변화는 표적 세포를 사멸시키는 T 세포의 능력에 상응하였다 (도 5 및 도 11a 비교).
CT-482 EGFR scFv CAR 활성화제 및 HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 억제제 (C1765) 조합을 발현하는 T 세포는 EGFR (표적 A), HLA-A*02 (표적 B), 동일한 세포에서 EGFR 및 HLA-A*02의 조합 (표적 AB), 상이한 세포에서 표적 A 및 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단, 또는 상이한 세포에서 표적 B 및 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단을 발현하는 HeLa 세포와 공동 배양되었다 (도 12a-12b). T 세포는 1:1 효과기 세포 대 표적 세포의 비율로 HeLa 표적 세포와 배양되었다. T 세포가 HeLa 세포의 표적 A 플러스 표적 AB 집단과 공동 배양되었을 때, 활성화제의 수준이 감소한 후, 회복되었다 (도 12a). 더욱이, 활성화제 및 차단제 항원은 효과기 T 세포에서 활성화제 표면 발현 상실을 유발하기 위해 동일한 세포에 함께 존재해야 한다. 활성화제와 대조적으로, 차단제 발현은 크게 변하지 않았다 (도 12b).
도 13은 T 세포에 의한 세포독성, 차단 활성, 및 활성화제 수용체의 발현의 상실이 가역적인지 결정하기 위한 실험에 대한 개략도를 보여준다. EGFR scFv CAR 활성화제 수용체 (CT-487) 및 HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 (C1765) 억제 수용체를 발현하는 T 세포는 활성화제 및 억제 수용체 표적 (AB) 둘 모두를 발현하는 HeLa 표적 세포와 공동 배양하였다. 3일 공동 배양 후, HeLa 세포를 항-EGFR 컬럼을 사용하여 제거하고, T 세포는 활성화제 및 억제 수용체에 대해 염색하거나, EGFR 활성화제 표적만을 발현하는 HeLa 세포와 추가 3일 동안 공동 배양했다. 추가 3일 공동 배양 후, HeLa 세포를 항-EGFR 컬럼을 사용하여 HeLa 세포를 다시 제거하고, T 세포는 활성화제 및 억제 수용체에 대해 염색하거나, 염색 전 EGFR 활성화제 표적만, 또는 활성화제 및 차단제 표적 (AB) 둘 모두 발현하는 HeLa 세포와 추가 3일 동안 공동 배양했다. T 세포를 표지된 EGFR 및 A2 프로브를 사용하여 활성화제 및 억제 수용체 (염색됨)의 존재에 대해 분석하고, 수용체 발현의 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 정량화했다. 실험 결과는 도 14a-14b에 나타낸다. 도 14a-14b에 나타낸 바와 같이, T 세포의 활성화제 및 억제제 표적 모두를 발현하는 HeLa 세포와의 공동 배양은 EGFR 활성화제 염색을 감소시킨다 (도 14a-14b, 왼쪽 패널). 2라운드에서 활성화제를 발현하는 HeLa 세포와 공동 배양될 때 (표적 A 단독), EGFR 활성화제의 발현이 증가한다. 따라서, 활성화제 표면 소실은 가역적이며 T 세포 세포독성을 추적한다.
도 15a-15b는 활성화제 수용체 발현의 상실이 빠르게 가역적임을 보여주는 추가 실험의 결과를 보여준다. 활성화제 CAR 세포 표면 발현은 이들 T 세포가 활성화제 및 억제제 리간드 모두를 발현하는 모델 "정상" 세포와 공동 배양될 때 활성화제 및 억제 수용체 모두를 발현하는 T 세포에서 감소된다. 그러나 T 세포가 활성화제 리간드만 발현하는 모델 "암" 세포와의 공동 배양으로 전환되었을 때, T 세포는 활성화제 CAR의 세포 표면 발현을 신속하게 (몇 시간 내에) 복원할 수 있었다. 활성화제 및 억제제 리간드 모두를 발현하는 모델 "정상" 세포의 부재는 또한 종양 세포의 존재에 관계없이 유사한 시간 프레임 내에서, 활성화제 CAR의 세포 표면 발현을 회복시킬 수 있다.
실시예 7: HLA-A*02 LIR-1 기반 억제 수용체는 EGFR CAR 활성화제에 의한 활성화를 차단할 수 있다
EGFR CAR 활성화제 및 pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체 (LIR-1 힌지, 막관통 및 ICD를 포함)를 발현하는 저캇 효과기 세포의 활성화를 실시예 3에 기술된 NFAT 루시퍼라제 검정을 사용하여 검정하였다.
저캇 세포를 활성화제 및 억제 수용체 DNA로 형질감염시키고, 활성화를 무세포 비드 기반 검정에서 검정하였다 (도 16). 비드에는 활성화제 항원, 차단제 항원, 또는 활성화제 및 억제제 항원이 로드되었으며, 비드 내 저캇 세포의 비율은 다양했다. 무세포 비드 기반 검정에서, HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체는 세포가 시스로 HLA-A*02 차단제 및 EGFR 활성화제를 운반하는 비드와 접촉했을 때 저캇 세포의 활성화를 차단할 수 있었지만, 트랜스 (상이한 비드 상에서)로 HLA-A*02 차단제 및 EGFR 활성화제를 운반하는 경우에는 그렇지 않는다. 비드 상의 HLA-A*02 차단제의 존재는 EGFR CAR의 EMAX를 9X 이상으로 이동시킬 수 있었다 (도 16).
EGFR CAR 활성화제 및 HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체를 발현하는 저캇 세포의 활성화를 또한 표적 세포로서 HeLa 및 SiHa 세포를 사용하여 검정하였다. 정상 HeLa 및 SiHa 세포주는 EGFR을 발현하지만 HLA-A*02 (SiHa WT 및 HeLa WT)는 발현하지 않지만, HLA-A*02 억제 수용체 표적 (SiHa A02 및 HeLa A02)을 발현하도록 형질도입되었다. 도 17a 및 도 17b에서 볼 수 있는 바와 같이, HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체는 EGFR EMAX를 SiHa 표적 세포를 사용하여 4X 이상 (도 17a) 및 HeLa 표적 세포를 사용하여 5X 이상 이동시킬 수 있었다 (도 17b).
실시예 8: EGFR CAR 활성화제 및 억제 수용체 발현 T 세포의 생체 내 효능
활성화제 수용체 (EGFR CAR) 및 억제 수용체 (차단제) 쌍을 발현하는 면역 세포에 대한 효능 및 종양 대 정상 세포 선택성은 생체 내 환경에서 확립된다 (도 19). "정상" 세포를 대표하는 인간 EGFR+/HLA-A*02+ HeLa 세포 및 "종양" 세포로서 동질유전자 EGFR+/HLA-A*02(-) 녹아웃 HeLa 세포를 사용하는 NSG (NOD.Cg- PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)에서 마우스 이종이식 모델. 생체 내 치료 창은 정상 대 종양 세포에 대한 활성화제/억제 수용체 쌍의 효과를 비교함으로써 확립된다. 이러한 데이터는 온-타겟, 오프-종양 치료 창에 대한 생체 내 지원을 제공한다 활성화제/억제 수용체 쌍에 대한 최적 용량이 설정되고 민감도 및 선택성에 대해 최적화된다.
생체 내 모델은 오른쪽 측면 "정상" 세포 및 왼쪽 측면 "종양" 세포의 피하 이종이식을 포함한다. 활성화제 수용체, 활성화제/억제 수용체 쌍을 발현하는 면역 세포, 또는 형질도입되지 않은 대조군 세포를 일정 범위의 시점에서 동물에게 투여한다.
임상 관찰 및 체중에 대한 영향을 통해 동물의 전반적인 건강 상태를 모니터링한다. 종양 이종이식은 캘리퍼 및 이미징에 의해 크기에 대해 평가된다. 각 시점에서, 인간 T 세포는 유동 세포측정법에 의해 열거되고 CD3, CD4, CD8, 활성화제 수용체 발현, 및 억제 수용체 발현을 포함하는 표면 마커에 대해 평가된다. IFNγ 및 인터루킨-2 (IL-2)를 포함하는 혈청 사이토카인 수준이 결정된다. 사후 분석에서, 주사 부위와 종양을 포함한 프로토콜 지정 조직은 ACVP 이사회 인증 병리학자에 의해 종양 침윤 T-세포 및 활성화제 수용체 항원 (예를 들어 EGFR) 및 차단제 항원 발현 (예를 들어 HLA-A*02)에 대한 조직학에 의해 평가된다.
실시예 9: B7 및 HLA-A*11은 억제 수용체 리간드이다
HLA-A*011 억제 수용체는 scFv #4 (표)를 힌지, TM 및 LIR-1로부터 유래된 ICD에 융합하여 만들었다. 유전자 세그먼트는 골든 게이트 클로닝을 사용하여 결합되었고 렌티바이러스 발현 플라스미드에 포함된 인간 EF1알파 프로모터의 다운스트림에 삽입되었다.
저캇 NFAT-루시퍼라제 효과기 세포는 CAR 활성화제, 또는 CAR 활성화제 및 scFv #4 HLA-A*11 억제 (차단제) 수용체로 상기 기술된 바와 같이 형질전환되었다. HLA-A*011 억제 수용체의 서열은 하기 표 9.1에 나타내고, 활성화제 리간드 및 HLA-A*011:01을 발현하는 HeLa 세포와 공동 배양했다. NFAT-루시퍼라제 검정은 T2 표적 세포 대신에 HeLa를 사용하여 수행되었다.
결과를 도 20a 및 도 20b에 나타낸다. 도 20a에 나타낸 바와 같이, LIR-1의 힌지, TM 및 ICD 도메인에 융합될 때, scFv #4는 활성화제 리간드 및 HLA-A*011을 모두 발현하는 표적 세포와 공동 배양된 저캇 효과기 세포의 활성화를 억제할 수 있다.
표 9.1. HLA-A*011 억제 수용체 서열.
Figure pct00053
저캇 NFAT 루시퍼라제 (JNL) 세포 활성화는 mRNA로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하여 mRNA 적정 분석에서 측정되었다. HeLa 세포는 HLA-B*07:02를 암호화하는 연속적으로 희석된 mRNA로 형질감염시켰다. JNL 세포는 EGFR 활성화 CAR 및 HLA-B*07 차단제 (원) 또는 음성 대조군 벡터 (삼각형)로 일시적으로 형질감염시켰다. 기능적 반응은 6시간 공동 배양 후 평가되었다. 도 21에 나타낸 결과는 HLA-B*07 차단제가 적정된 HLA-B*07:02의 존재 하에 EGFR 표적화 CAR의 활성화를 차단하지만 차단제의 부재 하에서는 차단하지 않음을 입증한다.
실시예 10: 1차 T 세포에서 EGFR 활성화제 및 HLA-A*02 억제 수용체 발현의 특성화
EGFR 활성화제를 염색하기 위해, 1차 T 세포를 FACS 완충액 (PBS 중 1% BSA)에서 실온에서 30분 동안 1:25 희석으로 EGFR-Fc (R&D Systems)와 함께 배양했다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 FACS 완충액에서 실온에서 30분 동안 항-Fc (1:100)에서 배양했다. HLA-A*02 억제 수용체를 염색하기 위해, T 세포를 FACS 완충액에서 실온에서 30분 동안 HLA-A*02 사량체 프로브와 배양했다. 수용체 발현은 염색 후 유동 세포측정법으로 분석하였다.
1차 T 세포는 EGFR 표적화 활성화제 수용체 및 인간 또는 마우스 HLA-A*02 표적화 억제 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입되었다. 여러 특정 쌍의 EGFR 표적화 활성화제 및 HLA-A*02 표적화 억제 수용체를 시험했다. 형질도입은 활성화제 수용체 및 억제 수용체를 모두 암호화하는 단일 벡터 또는 2개의 벡터, 활성화제 수용체를 암호화하는 하나 및 억제 수용체를 암호화하는 하나로 수행했다. 활성화제 및 억제제 수용체 모두를 발현하는 세포의 백분율을 결정하기 위해 농축이 있거나 없는 세포를 분석하였다 (도 22).
2개의 벡터, 활성화제 수용체를 암호화하는 하나 및 억제 수용체를 암호화하는 하나로 형질도입된 1차 T 세포에서, 두 수용체를 모두 발현하는 형질도입된 T 세포 집단에서 세포의 백분율은 농축 전에 약 22.5% (도 22a, 왼쪽 패널)였다. 농축 후, 두 수용체를 모두 발현하는 형질도입된 T 세포 집단의 세포 백분율은 약 91.6%로 증가했다.
활성화제 수용체 및 억제 수용체를 모두 암호화하는 단일 벡터로 형질도입된 1차 T 세포에서, 수용체를 모두 발현하는 형질도입된 T 세포 집단에서 세포의 백분율은 농축 전에 약 6.29% 내지 13.2% 범위였다. 농축 후, 두 수용체를 모두 발현하는 세포의 비율은 22.6% 내지 82.8% 범위였다. 두 수용체를 모두 발현하는 세포의 백분율은 특정 활성화제 및 억제 수용체 쌍에 따라 다르다.
실시예 11: 활성화제 및 억제 수용체를 발현하는 1차 T 세포에서 면역 세포 활성화 선택성의 특성화
선택적 세포독성 연구를 위해, 농축된 1차 T 세포를 GFP 또는 RFP를 발현하는 HeLa 또는 HCT116 표적 세포와 함께 배양했다. "종양" 세포의 경우, WT HeLa 또는 HLA-A*02 녹아웃 HCT116이 사용되었고 "정상" 세포의 경우, HLA-A*02 형질도입된 HeLa 또는 WT HCT116이 사용되었다. 공배양물은 IncuCyte 라이브 세포 이미저를 사용하여 이미지화되었고 표적 세포 형광 영역은 살아있는 표적 세포를 정량화하는 데 사용되었다 (도 23a). 혼합 표적 배양에서 선택적 세포독성을 측정하기 위해, "종양" WT HeLa 세포를 발현하는 RFP 및 HLA-A*02로 형질도입된 "정상" HeLa 세포를 발현하는 GFP를 1:1 비율로 혼합했다. 농축된 1차 T 세포를 혼합 표적 배양물에 첨가하고 IncuCyte 라이브 세포 이미저를 사용하여 이미지화하고 표적 세포 영역을 사용하여 살아있는 표적 세포를 정량화하였다 (도 23b).
도 23a는 EGFR 활성화제 수용체 및 HLA-A*02 scFv LIR1 억제제 수용체를 발현하는 면역 세포에 의한 HeLa 표적 세포 또는 HCT116 표적 세포의 특이적 사멸 백분율을 나타내는 일련의 플롯이다. 표적 세포는 EGFR 항원 (A), HLA-A*02 비-표적 항원 (B), 또는 둘 다 (AB)를 발현한다. 활성화제/억제제 수용체 쌍을 발현하는 면역 세포를 1:1 비율로 표적 세포와 함께 배양하였다.
도 23b는 암 세포 및 정상 세포의 혼합 배양에서 EGFR 활성화제 수용체 및 HLA-A*02 scFv LIR1 억제제 수용체를 발현하는 면역 세포에 의한 표적 세포의 특이적이고 선택적인 사멸을 나타내는 플롯 및 일련의 이미지이다. UTD = 활성화제 또는 억제제 수용체가 없는 면역 세포; CAR = 활성화제 수용체만 발현하는 면역 세포; Tmod = 활성화제 및 억제제 수용체 모두를 발현하는 면역 세포.
실시예 12: 활성화제 및 억제 수용체를 발현하는 저캇 세포에서 면역 세포 활성화 선택성의 특성화
도 24는 EGFR 활성화제 수용체 (CAR) 또는 EGFR 활성화제 수용체 및 HLA-A*02 억제제 수용체를 발현하는 저캇 세포 (효과기)에서 면역 세포 활성화를 나타내는 차트이다 (Tmod). 저캇 세포는 EGFR 발현 없이 HLA-A*02를 발현하거나 EGFR 발현과 함께 HLA-A*02를 발현하는 표적 세포주의 패널과 함께 배양되었다. EGFR 음성 세포주는 CRISPR/Cas9를 사용하여 EGFR을 녹아웃하여 생성되었다. Tmod 저캇 효과기 세포는 EGFR 음성 세포와 함께 배양했을 때 오프-타겟 활성화를 나타내지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> A2 BIOTHERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING EGFR POSITIVE CANCERS <130> A2BI-021/02WO 331656-2067 <150> US 63/230,632 <151> 2021-08-06 <150> US 63/105,639 <151> 2020-10-26 <150> US 63/068,249 <151> 2020-08-20 <160> 919 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu 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ugacuuacug aagaauggag agagaauuga aaaaguggag 240 cauucagacu ugucuuucag caaggacugg ucuuucuauc ucuuguacua cacugaauuc 300 acccccacug aaaaagauga guaugccugc cgugugaacc augugacuuu gucacagccc 360 aagauaguua agugggaucg agacauguaa gcagcaucau ggagguuuga agaugccgca 420 uuuggauugg augaauucca aauucugcuu gcuugcuuuu uaauauugau augcuuauac 480 acuuacacuu uaugcacaaa auguaggguu auaauaaugu uaacauggac augaucuucu 540 uuauaauucu acuuugagug cugucuccau guuugaugua ucugagcagg uugcuccaca 600 gguagcucua ggagggcugg caacuuagag guggggagca gagaauucuc uuauccaaca 660 ucaacaucuu ggucagauuu gaacucuuca aucucuugca cucaaagcuu guuaagauag 720 uuaagcgugc auaaguuaac uuccaauuua cauacucugc uuagaauuug ggggaaaauu 780 uagaaauaua auugacagga uuauuggaaa uuuguuauaa ugaaugaaac auuuugucau 840 auaagauuca uauuuacuuc uuauacauuu gauaaaguaa ggcaugguug ugguuaaucu 900 gguuuauuuu uguuccacaa guuaaauaaa ucauaaaacu uga 943 <210> 173 <211> 522 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C1765 (anti-HLA-A*02 chimeric antigen receptor) Prot <400> 173 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<210> 451 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 451 ggatggagcc gcgggcgccg tgg 23 <210> 452 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 452 ggcgccgtgg atagagcagg agg 23 <210> 453 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 453 gcgccgtgga tagagcagga ggg 23 <210> 454 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 454 cggctactac aaccagagcg agg 23 <210> 455 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 455 ctggttgtag tagccgcgca ggg 23 <210> 456 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 456 tactacaacc agagcgaggc cgg 23 <210> 457 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 457 ctacctggag ggcacgtgcg 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ccagtacgcc tacgacggca agg 23 <210> 472 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 472 ggatgtgaag aaatacctca tgg 23 <210> 473 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 473 atttcttcac atccgtgtcc cgg 23 <210> 474 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 474 aggcgtactg gtggtacccg cgg 23 <210> 475 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 475 cgtactggtg gtacccgcgg agg 23 <210> 476 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 476 gaggatgtat ggctgcgacg tgg 23 <210> 477 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 477 ggatgtatgg ctgcgacgtg ggg 23 <210> 478 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence 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Sequence <400> 485 cgtagcccac tgcgatgaag cgg 23 <210> 486 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 486 cttcatcgca gtgggctacg tgg 23 <210> 487 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 487 ggagccccgc ttcatcgcag tgg 23 <210> 488 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 488 cggggagaca cggaaagtga agg 23 <210> 489 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 489 agtattggga cggggagaca cgg 23 <210> 490 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 490 agggtccgga gtattgggac ggg 23 <210> 491 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 491 gagggtccgg agtattggga cgg 23 <210> 492 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 492 ggaccctcct gctctatcca cgg 23 <210> 493 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 493 gtggatagag caggagggtc cgg 23 <210> 494 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 494 agactcaccg agtggacctg ggg 23 <210> 495 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 495 cactcggtga gtctgtgagt ggg 23 <210> 496 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 496 cagactcacc gagtggacct ggg 23 <210> 497 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 497 ccactcacag actcaccgag tgg 23 <210> 498 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 498 ccactcggtg agtctgtgag tgg 23 <210> 499 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 499 tcggactggc gcttcctccg cgg 23 <210> 500 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 500 gcagccatac atcctctgga cgg 23 <210> 501 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 501 tctcaactgc tccgccacat ggg 23 <210> 502 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 502 accctcatgc tgcacatggc agg 23 <210> 503 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 503 acctgccatg tgcagcatga ggg 23 <210> 504 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 504 cacctgccat gtgcagcatg agg 23 <210> 505 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 505 ggaggaccag acccaggaca cgg 23 <210> 506 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 506 ggatggggag gaccagaccc agg 23 <210> 507 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 507 gacctggcag cgggatgggg agg 23 <210> 508 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 508 agatcacact gacctggcag cgg 23 <210> 509 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 509 gatcacactg acctggcagc ggg 23 <210> 510 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 510 aggtcagtgt gatctccgca ggg 23 <210> 511 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 511 aagcccctca ccctgagatg ggg 23 <210> 512 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 512 ctgcggagat cacactgacc tgg 23 <210> 513 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 513 cagcaatgat gcccacgatg ggg 23 <210> 514 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 514 ccagcaatga tgcccacgat ggg 23 <210> 515 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 515 gccagcaatg atgcccacga tgg 23 <210> 516 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 516 ggatggaacc ttccagaagt ggg 23 <210> 517 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 517 gggatggaac cttccagaag tgg 23 <210> 518 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 518 atgcccacga tggggatggt ggg 23 <210> 519 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 519 cagcccacca tccccatcgt ggg 23 <210> 520 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 520 ccagcccacc atccccatcg tgg 23 <210> 521 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 521 gatgcccacg atggggatgg tgg 23 <210> 522 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 522 cagggcccag cacctcaggg tgg 23 <210> 523 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 523 aatgatgccc acgatgggga tgg 23 <210> 524 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 524 ggccctgacc cagacctggg cgg 23 <210> 525 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 525 gacccaggac acggagctcg tgg 23 <210> 526 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 526 acacggagct cgtggagacc agg 23 <210> 527 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 527 cgtggagacc aggcctgcag ggg 23 <210> 528 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 528 tcgtggagac caggcctgca ggg 23 <210> 529 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 529 agctgtgatc actggagctg tgg 23 <210> 530 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 530 aaaaggaggg agctactctc agg 23 <210> 531 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 531 atgtggagga ggaagagctc agg 23 <210> 532 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 532 gtgtctctca cagcttgtaa agg 23 <210> 533 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide Nucleic Acid Targeting Sequence <400> 533 gagagacaca tcagagccct ggg 23 <210> 534 <211> 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Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895 Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser 900 905 910 Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr 930 935 940 Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975 Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro 980 985 990 Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe 1010 1015 1020 Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu 1025 1030 1035 Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn 1040 1045 1050 Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg 1055 1060 1065 Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp 1070 1075 1080 Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro 1085 1090 1095 Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln 1100 1105 1110 Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro 1115 1120 1125 His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln 1130 1135 1140 Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala 1145 1150 1155 Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln 1160 1165 1170 Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys 1175 1180 1185 Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln 1190 1195 1200 Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210 <210> 919 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 919 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Arg Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895 Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser 900 905 910 Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr 930 935 940 Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975 Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro 980 985 990 Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe 1010 1015 1020 Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu 1025 1030 1035 Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn 1040 1045 1050 Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg 1055 1060 1065 Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp 1070 1075 1080 Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro 1085 1090 1095 Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln 1100 1105 1110 Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro 1115 1120 1125 His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln 1130 1135 1140 Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala 1145 1150 1155 Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln 1160 1165 1170 Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys 1175 1180 1185 Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln 1190 1195 1200 Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210

Claims (87)

  1. 하기를 포함하는 면역 세포로서:
    a. 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 수용체; 및
    b. 이형접합성의 소실로 인해 EGFR+ 암에서 소실된 비-표적 항원에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 수용체,
    여기서 제1 수용체는 EGFR에 반응하는 활성화제 수용체이고; 여기서 제2 수용체는 비-표적 항원에 반응하는 억제 수용체인 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 MHC 단백질의 대립형질 변이체에 특이적으로 결합하는 면역 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C 단백질의 대립형질 변이체에 특이적으로 결합하는 면역 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 HLA-A*02에 특이적으로 결합하는 면역 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*11, HLA-C*07, 또는 HLA-B*07에 특이적으로 결합하는 면역 세포.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 표 5에 개시된 상보성 결정 영역 (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3; 또는 표 5의 CDR에 비해 최대 1, 2 또는 3개의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 CDR 서열을 포함하는 면역 세포.
  7. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 101-106 또는 서열 번호 106-112의 상보성 결정 영역 (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3; 또는 표 5의 CDR에 비해 최대 1, 2 또는 3개의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 CDR 서열을 포함하는 면역 세포.
  8. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 표 4에 개시된 폴리펩티드 서열로부터 선택된 폴리펩티드 서열; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
  9. 제4항에 있어서, 상기 제2 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 89-100 중 어느 하나; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 면역 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이 표 3에 제시된 서열 그룹으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 (HC-CDR) 세트를 포함하는 가변 중쇄 (VH) 부분; 및/또는 표 3에 제시된 서열 그룹의 경쇄 상보성 결정 영역 (LC-CDR) 세트를 포함하는 가변 경쇄 (VL) 부분; 또는 각각의 CDR에서 최대 1, 2, 3, 4개의 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 CDR 서열을 포함하는 면역 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 표 2에 제시된 VH 서열로부터 선택된 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH) 부분; 및/또는 표 2에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 부분; 또는 이에 대해 적어도 70%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 표 1에 제시된 서열 그룹으로부터 선택된 서열; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 9-18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 scFv 서열; 또는 이에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 면역 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 수용체가 LILRB1 세포 내 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 면역 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 LILRB1 세포 내 도메인은 서열 번호 129와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한, 또는 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 수용체가 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 면역 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 133과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 수용체가 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 면역 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 LILRB1 힌지 도메인은 서열 번호 132, 서열 번호 125, 서열 번호 126과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 수용체는 LILRB1 세포 내 도메인, LILRB1 막관통 도메인, LILRB1 힌지 도메인, 이들 중 임의의 것의 기능적 변이체, 또는 이들의 조합을 포함하는 면역 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 LILRB1 세포 내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인은 서열 번호 128 또는 서열 번호 128과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 면역 세포.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGFR+ 암 세포는 폐암 세포, 소세포 폐암 세포, 비소세포 폐암 세포, 췌관 암종 세포, 대장암세포, 두경부암 세포, 식도 및 위 선암종 세포, 난소암 세포, 다형성 교모세포종 세포, 자궁경부 편평 세포 암종 세포, 신장암 세포, 유두상 신장암 세포, 신장 투명 세포 암종 세포, 방광암 세포, 유방암 세포, 담관암 세포, 간암 세포, 전립선암 세포, 육종 세포, 갑상선암 세포, 흉선암 세포, 위암 세포 또는 자궁암 세포인 면역 세포.
  24. 제23항에 있어서, 상기 EGFR+ 암 세포는 폐암 세포인 면역 세포.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGFR+ 암 세포는 HLA-A*02를 발현하지 않는 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포; 또는 HLA-A*02를 발현하지 않는 HLA-A*02+ 개체로부터 유래된 암 세포인 면역 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포는 HLA-A*02의 소실을 야기하는 HLA-A에서의 이형접합성의 소실로 인해 EGFR+/HLA-A*02+ 세포로부터 유래되는 면역 세포.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 수용체 및 제2 수용체가 함께 이형접합성을 소실한 EGFR/HLA-A*02- 암 세포의 존재 하에서 면역세포를 특이적으로 활성화시키는 것인 면역세포.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 수용체 및 제2 수용체가 함께 이형접합성 소실에 의해 HLA-A*02를 소실하지 않은 EGFR+ 세포의 존재 하에 면역 세포를 특이적으로 활성화시키지 않는 것인 면역 세포.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, 대식세포, NK 세포, iNKT 세포, 또는 감마 델타 T 세포인 면역 세포.
  30. 제29항에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ CD4- T 세포인 면역 세포.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 유전자의 발현 및/또는 기능이 감소되거나 제거된 것인 면역 세포.
  32. 제30항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 유전자가 베타-2-마이크로글로불린 (B2M)인 면역 세포.
  33. 제32항에 있어서, 간섭 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 간섭 RNA는 B2M mRNA의 서열 (서열 번호 172)에 상보적인 서열을 포함하는 면역 세포.
  34. 제33항에 있어서, 상기 간섭 RNA는 B2M mRNA의 RNAi-매개 분해를 유도할 수 있는 면역 세포.
  35. 제33항에 있어서, 상기 간섭 RNA는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)인 면역 세포.
  36. 제35항에 있어서, 상기 shRNA는 다음을 포함하고:
    a. 5' 말단에서 3' 말단으로 B2M mRNA의 서열에 상보적인 서열을 갖는 제1 서열; 및
    b. 5' 말단에서 3' 말단으로 제1 서열에 상보적인 서열을 갖는 제2 서열,
    여기서 제1 서열 및 제2 서열은 shRNA를 형성하는 면역 세포.
  37. 제32항에 있어서, B2M을 암호화하는 서열 (서열 번호 170)에 대해 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 B2M의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 제거하는 것인 면역 세포.
  38. 제37항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형이 B2M을 암호화하는 내인성 유전자의 하나 이상의 불활성화 돌연변이를 포함하는 면역 세포.
  39. 제38항에 있어서, 상기 하나 이상의 불활성화 돌연변이가 결실, 삽입, 치환, 또는 프레임이동 돌연변이를 포함하는 면역 세포.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 하나 이상의 불활성화 돌연변이가 B2M을 암호화하는 내인성 유전자의 서열 (서열 번호 170)을 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 핵산 (gNA)과의 복합체 내 핵산 유도 엔도뉴클레아제와 함께 도입되는 것인 면역 세포.
  41. 제31항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 유전자가 HLA-A*02인 면역 세포.
  42. 제41항에 있어서, HLA-A*02 mRNA의 서열 (서열 번호 171)에 상보적인 서열을 포함하는 간섭 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 면역 세포.
  43. 제42항에 있어서, 상기 간섭 RNA가 HLA-A*02 mRNA의 RNA 간섭 (RNAi)-매개 분해를 유도할 수 있는 면역 세포.
  44. 제43항에 있어서, 상기 간섭 RNA는 다음을 포함하는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)이고:
    a. 5' 말단에서 3' 말단으로 HLA-A*02 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 갖는 제1 서열; 및
    b. 5' 말단에서 3' 말단으로 제1 서열에 상보적인 서열을 갖는 제2 서열,
    여기서 제1 서열 및 제2 서열은 shRNA를 형성하는 면역 세포.
  45. 제41항에 있어서, HLA-A*02를 암호화하는 내인성 유전자의 서열 (서열 번호 169)에 대해 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 HLA-A*02의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 제거하는 것인 면역 세포.
  46. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형이 HLA-A*02를 암호화하는 내인성 유전자의 하나 이상의 불활성화 돌연변이를 포함하는 면역 세포.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 하나 이상의 불활성화 돌연변이가 HLA-A*02를 암호화하는 내인성 유전자의 서열을 특이적으로 표적화하는 적어도 하나의 가이드 핵산 (gNA)과의 복합체 내 핵산 유도 엔도뉴클레아제와 함께 도입되는 면역 세포.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서:
    a. 제1 수용체가 서열 번호 177, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
    b. 제2 수용체가 서열 번호 174 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
  49. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서:
    a. 제1 수용체가 서열 번호 177, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
    b. 제2 수용체가 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
  50. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서:
    a. 제1 수용체가 서열 번호 175, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
    b. 제2 수용체가 서열 번호 174, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
  51. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서:
    a. 제1 수용체가 서열 번호 175, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
    b. 제2 수용체가 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
  52. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서:
    a. 제1 수용체가 서열 번호 176, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
    b. 제2 수용체가 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
  53. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서:
    a. 제1 수용체가 서열 번호 176, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하고; 그리고
    b. 제2 수용체가 서열 번호 173, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, T2A 자가 절단 펩티드를 추가로 포함하고, 상기 T2A 자가 절단 펩티드는 서열 번호 178, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA를 추가로 포함하고, 상기 간섭 RNA는 서열 번호 179, 또는 이에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 면역 세포.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 자가 세포인 면역 세포.
  57. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 동종이계인 면역 세포.
  58. 치료적 유효량의 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 면역 세포를 포함하는 약학 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 면역 세포가 제1 수용체 및 제2 수용체 모두를 발현하는 약학 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 면역 세포가 제1 수용체 및 제2 수용체 모두를 발현하는 약학 조성물.
  61. 제59항에 있어서, 적어도 90%의 면역 세포가 제1 수용체 및 제2 수용체 모두를 발현하는 약학 조성물.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR+ 암 치료에 약제로서 사용하기 위한 약학 조성물.
  64. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템으로서, 다음을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하고:
    a. 내피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 수용체; 및
    b. 이형접합성의 소실로 인해 EGFR+ 암 세포에서 소실된 비-표적 항원에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 수용체,
    여기서 제1 수용체는 EGFR+ 암 세포 상의 EGFR에 반응하는 활성화제 수용체이고; 제2 수용체는 비-표적 항원에 반응하는 억제 수용체인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템.
  65. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 면역 세포를 생성하는 데 사용하기 위한 제1 수용체 및 제2 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시스템.
  66. 제64항 또는 제65항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  67. MHC 클래스 I 유전자좌에서 이형접합성이 소실된 EGFR+ 암 세포를 사멸시키는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 EGFR+ 암 세포는 폐암 세포, 소세포 폐암 세포, 비소세포 폐암 세포, 췌관 암종 세포, 대장암세포, 두경부암 세포, 식도 및 위 선암종 세포, 난소암 세포, 다형성 교모세포종 세포, 자궁경부 편평 세포 암종 세포, 신장암 세포, 유두상 신장암 세포, 신장 투명 세포 암종 세포, 방광암 세포, 유방암 세포, 담관암 세포, 간암 세포, 전립선암 세포, 육종 세포, 갑상선암 세포, 흉선암 세포, 위암 세포 또는 자궁암 세포인 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 EGFR+ 암 세포는 폐암 세포인 방법.
  70. 제67항에 있어서, 상기 EGFR+ 암 세포는 HLA-A*02를 발현하지 않는 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포; 또는 HLA-A*02를 발현하지 않는 HLA-A*02+ 개체로부터 유래된 암 세포인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 EGFR+/HLA-A*02- 암 세포는 HLA-A*02의 소실을 야기하는 HLA-A에서의 이형접합성의 소실로 인해 EGFR+/HLA-A*02+ 세포로부터 유래되는 것인 방법.
  72. 비-표적 항원을 암호화하는 유전자좌에서 이형접합성의 소실을 갖는 EGFR+ 종양을 갖는 대상체에서 EGFR+ 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에 유효량의 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 대상체가 EGFR을 발현하고 HLA-A*02 발현을 상실한 악성종양을 갖는 이형접합 HLA-A*02 환자인 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 대상체가 EGFR을 발현하고 HLA-A*02 발현을 상실한 재발성 절제 불가능 또는 전이성 고형 종양을 갖는 이형접합 HLA-A*02 환자인 방법.
  75. 다음을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법:
    a. 대상체의 비-악성 세포 및 암세포에서 비-표적 항원의 유전자형 또는 발현 수준을 결정하는 단계;
    b. 대상체의 암 세포에서 EGFR의 발현 수준을 결정하는 단계; 및
    c. 비-악성 세포가 비-표적 항원을 발현하고 암세포가 비-표적 항원을 발현하지 않고, 암 세포가 EGFR 양성인 경우 유효량의 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계.
  76. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항의 약학 조성물의 투여가 대상체에서 종양의 크기를 감소시키는 것인 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 종양이 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 감소되는 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 종양이 제거되는 방법.
  79. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여가 대상체에서 종양의 성장을 정지시키는 방법.
  80. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항의 약학 조성물의 투여가 대상체에서 종양의 수를 감소시키는 것인 방법.
  81. 제67항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여가 대상체에서 정상 세포가 아닌 암 세포의 선택적인 사멸을 초래하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 사멸된 세포의 적어도 약 60%가 암 세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 65%가 암 세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 70%가 암 세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 75%가 암 세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 80%가 암 세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 85%가 암 세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 90%가 암 세포이고, 사멸된 세포의 적어도 약 95%가 암 세포이고, 또는 사멸된 세포의 약 100%가 암 세포인 방법.
  83. 제81항에 있어서, 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여가 대상체의 암 세포의 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 전부의 사멸을 초래하는 방법.
  84. 제67항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포 또는 약학 조성물의 투여가 제1 활성화제 수용체를 포함하지만 제2 억제 수용체를 포함하지 않는 다른 동등한 면역 세포의 투여보다 대상체에 대한 부작용이 더 적은 방법.
  85. 다수의 면역 세포를 제조하는 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
    a. 다수의 면역 세포를 제공하는 단계, 및
    b. 다수의 면역 세포를 제64항 또는 제65항의 폴리뉴클레오티드 시스템, 또는 제66항의 벡터로 형질전환시키는 단계.
  86. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 포함하는 키트.
  87. 제86항에 있어서, 사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
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