KR20220053587A - 이형접합성 소실에 반응성인 세포 표면 수용체 - Google Patents

이형접합성 소실에 반응성인 세포 표면 수용체 Download PDF

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KR20220053587A
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receptor
cell
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칼 알렉산더 캄
아그네스 햄버거
한 슈
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에이투 바이오쎄라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 이형접합성 소실에 의해 확인된 표적 세포에 전체적으로 설계되고 질환 또는 장애, 예를 들어 암을 치료하기 위해 사용되는 리간드 결합 도메인을 각각 갖는 2개의 조작된 수용체의 시스템에 관한 것이다. 본 개시내용은 2개의 조작된 수용체를 발현하는 면역 세포, 이를 제조하는 방법, 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 벡터를 제공한다.

Description

이형접합성 소실에 반응성인 세포 표면 수용체
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 8월 9일에 출원된 미국 가출원 제62/885,093호 및 2020년 4월 6일에 출원된 미국 가출원 제63/005,670호의 우선권의 이익을 주장하고, 이들의 각각의 내용은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
서열 목록의 참고에 의한 포함
본 출원은 전자 형식으로 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 크기가 404 킬로바이트이고 2020년 8월 5일에 생성된 명칭이 A2BI-00903WO_SeqList.txt인 파일로서 제공된다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 그 전체가 참고로 포함된다.
세포 치료는 다양한 질환, 특히 암의 치료에 강력한 도구이다. 종래의 입양 세포 치료에서, 면역 세포는 수용체와 표적 세포에 의해 발현된 리간드의 상호작용을 통해 세포 표적에 면역 세포의 활성을 지시하는 특이적 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor) 또는 T 세포 수용체(TCR: T Cell Receptor)를 발현하도록 조작된다. 적합한 표적 분자의 확인은 도전으로 남아 있다. 세포 치료에 의해 질환, 특히 암의 치료에서 유용한 조성물 및 방법에 대한 수요가 당해 분야에 있다.
본 개시내용은 일반적으로 이형접합성 소실을 나타내는 종양 세포에 조작된 면역 세포, 예를 들어 입양 세포 치료에 사용된 면역 세포를 표적화하도록 사용될 수 있는 이들 면역 세포에서 발현된 2개-수용체 시스템에 관한 것이다. 이 2개 수용체 시스템에서, 제1 수용체는 면역 세포를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하도록 작용하지만, 제2 수용체는 제1 수용체에 의한 활성화를 억제하도록 작용한다. 예를 들어, 억제 리간드를 암호화하는 유전자좌의 이형접합성 소실을 통한 제1 수용체 및 제2 수용체에 대한 리간드의 차등 발현은 제2 억제 리간드가 아니라 제1 활성인자 리간드를 발현하는 표적 세포에 의한 면역 세포의 활성화를 매개한다.
본 개시내용은 (a) 제1 조작된 수용체이되, 제1 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 제1 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제1 조작된 수용체; 및 (b) 제2 조작된 수용체이되, 제2 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 제2 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제2 조작된 수용체를 포함하는 면역 세포를 제공하고, 제1 리간드에 대한 제1 리간드 결합 도메인의 결합은 수용체에 의해 면역 세포를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하고, 제2 리간드에 대한 제2 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의한 면역 세포의 활성화를 억제한다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제2 리간드는 제2 리간드를 암호화하는 유전자의 이형접합성 소실로 인해 표적 세포에서 발현되지 않는다. 일부 실시형태에서, 제2 리간드는 HLA 클래스 I 대립유전자 또는 부 조직접합 항원(MiHA: minor histocompatibility antigen)이다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제2 리간드는 MiHA이다. 일부 실시형태에서, MiHA는 표 8 및 표 9에서의 MiHA의 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, MiHA는 HA-1이다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제2 리간드는 HLA 클래스 I 대립유전자이다. 일부 실시형태에서, HLA 클래스 I 대립유전자는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C를 포함한다. 일부 실시형태에서, HLA 클래스 I 대립유전자는 HLA-A*02 대립유전자이다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제2 리간드는 Y 염색체 소실로 인해 표적 세포에서 발현되지 않는다. 일부 실시형태에서, 제2 리간드는 Y 염색체 유전자에 의해 암호화된다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제1 리간드 및 제2 리간드는 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 표적 세포에 의해 발현된다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 표적 세포 및 비표적 세포에 의해 발현된다. 일부 실시형태에서, 제2 리간드는 표적 세포에 의해 발현되지 않고, 복수의 비표적 세포에 의해 발현된다. 일부 실시형태에서, 복수의 비표적 세포는 제1 리간드 및 제2 리간드 둘 다를 발현한다.
일부 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포이고, 비표적 세포는 비암성 세포이다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 세포 부착 분자, 세포-세포 신호전달 분자, 세포외 도메인, 화학주성에 관여된 분자, 당단백질, G 단백질 커플링된 수용체, 막관통 단백질, 신경전달인자를 위한 수용체 및 전압 게이팅된 이온 채널로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 표 5에서의 항원의 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 트랜스페린 수용체(TFRC: transferrin receptor), 표피 성장 인자 수용체(EGFR: epidermal growth factor receptor), CEA 세포 부착 분자 5(CEA: CEA cell adhesion molecule 5), CD19 분자(CD19: CD19 molecule), erb-b2 수용체 티로신 키나제 2(HER2: erb-b2 receptor tyrosine kinase 2) 및 메소텔린(MSLN: mesothelin), 또는 이의 펩타이드 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 pan-HLA 리간드이다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제2 리간드는 HLA 클래스 I 대립유전자, 부 조직접합 항원(MiHA) 및 Y 염색체 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제2 리간드의 발현은 이형접합성 소실로부터 표적 세포에서 소실된다. 일부 실시형태에서, MiHA는 HA-1이다. 일부 실시형태에서, HLA 클래스 I 대립유전자는 HLA-A*02 대립유전자이다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제1 조작된 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 실시형태에서, 제2 조작된 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인은 단일 사슬 Fv 항체 단편(ScFv), β 사슬 가변 도메인(Vβ), TCR α 사슬 가변 도메인 및 TCR β 사슬 가변 도메인, 또는 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 리간드 결합 도메인은 ScFv, Vβ 도메인, TCR α 사슬 가변 도메인 및 TCR β 사슬 가변 도메인, 또는 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 EGFR 또는 이의 펩타이드 항원이다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118 또는 서열 번호 391의 서열, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 131 내지 서열 번호 166으로부터 선택된 CDR을 포함한다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 MSLN 또는 이의 펩타이드 항원이다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90 또는 서열 번호 92의 서열, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 CEA 또는 이의 펩타이드 항원이다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 282, 서열 번호 284 또는 서열 번호 286, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 294 내지 서열 번호 302로부터 선택된 CDR을 포함한다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 CD19 또는 이의 펩타이드 항원이고, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 275 또는 서열 번호 277, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 pan-HLA 리간드이다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175 또는 서열 번호 177의 서열, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제2 리간드는 HA-1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 199를 포함하는 TCR 알파 가변 도메인, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 200을 포함하는 TCR 베타 가변 도메인, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 199를 포함하는 TCR 알파 가변 도메인 및 서열 번호 200을 포함하는 TCR 베타 가변 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제2 리간드는 HLA-A*02 대립유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 53 내지 64 중 어느 하나, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 41 내지 서열 번호 52로부터 선택된 CDR을 포함한다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제2 조작된 수용체는 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM: immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)를 포함한다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제2 조작된 수용체는 LILRB1 세포내 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1 세포내 도메인은 서열 번호 76과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조작된 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 85와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조작된 수용체는 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1 힌지 도메인은 서열 번호 84, 서열 번호 77 또는 서열 번호 78과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조작된 수용체는 LILRB1 세포내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인, 또는 이들의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1 세포내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인은 서열 번호 80 또는 서열 번호 80과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조작된 수용체는 서열 번호 80을 포함하는 제1 폴리펩타이드 또는 TCR 알파 가변 도메인에 융합된 이것과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 80을 포함하는 제2 폴리펩타이드 또는 TCR 베타 가변 도메인에 융합된 이것과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 제1 수용체 및 제2 수용체는 약 1:10 내지 10:1의 제1 수용체 대 제2 수용체의 비로 면역 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 제1 수용체 및 제2 수용체는 약 1:3 내지 3:1의 제1 수용체 대 제2 수용체의 비로 면역 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 제1 수용체 및 제2 수용체는 약 1:1의 비로 면역 세포의 표면에서 발현된다.
본 개시내용의 면역 세포의 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포 및 자연 살해(NK: Natural Killer) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 비자연이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 단리된다.
본 개시내용은 약제로서 사용하기 위한 본 개시내용의 2개의 수용체 시스템을 발현하는 면역 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제는 암의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 개시내용은 본 개시내용의 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 면역 세포를 포함한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 복수의 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 입양 세포 치료의 특이성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 치료학적 유효량의 본 개시내용의 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 실시형태에서, 암의 세포는 제1 리간드를 발현한다. 일부 실시형태에서, 암의 세포는 이형접합성 소실 또는 Y 염색체 소실로 인해 제2 리간드를 발현하지 않는다.
본 개시내용은 (a) 복수의 면역 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 면역 세포를 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하는 제1 조작된 수용체를 암호화하는 벡터이되, 세포외 영역은 제1 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 리간드 결합 도메인을 포함하는 벡터, 및 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하는 제2 조작된 수용체를 암호화하는 벡터이되, 세포외 영역은 제2 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는 벡터에 의해 형질전환하는 단계를 포함하는 본 개시내용의 면역 세포를 제조하는 방법을 제공하고; 제1 리간드에 대한 제1 리간드 결합 도메인의 결합은 면역 세포를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하고, 제2 리간드에 대한 제2 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 리간드에 의해 면역 세포의 활성화를 억제한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시내용은 HA-1 부 조직접합 항원(MiHA)에 특이적으로 결합을 할 수 있는 세포외 리간드 결합 도메인 및 적어도 하나의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 억제 수용체를 제공한다.
본 개시내용의 억제 수용체의 일부 실시형태에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 VLRDDLLEA(서열 번호 266)의 HA-1(R) 펩타이드에 대한 것보다 VLHDDLLEA(서열 번호 191)의 HA-1(H) 펩타이드에 대한 더 높은 친화성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 억제 수용체는 VLHDDLLEA(서열 번호 191)의 HA-1(H) 펩타이드에 의해 활성화되고, 활성화되지 않거나, 더 적은 정도로 VLRDDLLEA(서열 번호 266)의 HA-1(R) 펩타이드에 의해 활성화된다. 일부 실시형태에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 199를 포함하는 TCR 알파 가변 도메인, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 200을 포함하는 TCR 베타 가변 도메인, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 199를 포함하는 TCR 알파 가변 도메인 및 서열 번호 200을 포함하는 TCR 베타 가변 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 억제 수용체의 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 LILRB1 세포내 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1 세포내 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 76과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 85와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 수용체는 LILRB1 세포내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인, 또는 이들의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1 세포내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인은 서열 번호 80, 또는 서열 번호 80과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 수용체는 서열 번호 80을 포함하는 제1 폴리펩타이드 또는 TCR 알파 가변 도메인에 융합된 이것과 적어도 95% 동일한 서열, 및 서열 번호 80을 포함하는 제2 폴리펩타이드 또는 TCR 베타 가변 도메인에 융합된 이것과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 수용체는 서열 번호 195 또는 이것과 적어도 95%의 동일성에서의 폴리펩타이드 및 서열 번호 197 또는 이것과 적어도 95%의 동일성에서의 폴리펩타이드를 포함한다.
본 개시내용은 (a) 제1 조작된 수용체이되, 제1 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 CD19 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제1 조작된 수용체; 및 (b) 제2 조작된 수용체이되, 제2 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 HLA-A*02 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제2 조작된 수용체를 포함하는 면역 세포를 제공하고, CD19 리간드에 대한 제1 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의해 면역 세포를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하고, HLA-A*02 대립유전자에 대한 제2 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의한 면역 세포의 활성화를 억제한다.
본 개시내용은 (a) 제1 조작된 수용체이되, 제1 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 EGFR 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제1 조작된 수용체; 및 (b) 제2 조작된 수용체이되, 제2 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 HLA-A*02 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제2 조작된 수용체를 포함하는 면역 세포를 제공하고, EGFR 리간드에 대한 제1 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의해 면역 세포를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하고, HLA-A*02 대립유전자에 대한 제2 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의한 면역 세포의 활성화를 억제한다.
본 개시내용은 (a) 제1 조작된 수용체이되, 제1 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 메소텔린(MSLN) 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제1 조작된 수용체; 및 (b) 제2 조작된 수용체이되, 제2 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 HLA-A*02 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제2 조작된 수용체를 포함하는 면역 세포를 제공하고, MSLN 리간드에 대한 제1 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의해 면역 세포를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하고, HLA-A*02 대립유전자에 대한 제2 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의한 면역 세포의 활성화를 억제한다.
본 발명의 특징 및 이점의 더 양호한 이해는 본 발명의 원칙이 사용된 예시적인 실시형태를 기재한 하기 상세한 설명 및 하기의 첨부된 도면을 참조하여 얻어질 것이다:
도 1은 정상 조직을 구성하는 이형접합성 세포의 배경에 대한 종양을 형성하는 반접합성 종양 세포를 예시하는 다이어그램이다. 반접합성 종양 세포는 오직 표적 A를 발현하고, 이형접합성 소실(LOH)로 인해 표적 B를 소실하지만, 정상 세포는 표적 A와 표적 B 둘 다를 발현한다. 표적 B에 의해 차단되고 표적 A에 의해 활성화된 종양 선택적 세포독성 치료제를 생성하기 위해 이 유전적 차이가 이용될 수 있는데, 이로써 종양을 선택적으로 사멸한다.
도 2a는 종양에서 LOH에 기초한 이중 표적화된 치료의 예시적인 구성을 보여주는 다이어그램이다. 이 예에서, 활성인자 및 차단제 신호의 세포 기반 통합이 있다.
도 2b는 다양한 활성인자 및 수용체 형식 및 조합을 보여주는 일련의 다이어그램이다.
도 3a는 TCR 형식의 본 개시내용의 예시적인 이중 수용체 작제물을 보여주는 한 쌍의 다이어그램이다. 이 예에서, 활성인자 및 억제제(차단제) LBD는 각각 TCR의 CD3 감마 아단위에 별개로 융합된다.
도 3b는 CAR 형식의 본 개시내용의 예시적인 이중 수용체 작제물을 보여주는 다이어그램 및 표이다. 억제제 CAR의 예시적인 ITIM 및 억제제 도메인은 표에서 오른쪽에 기재되어 있다.
도 4a는 GTEx 데이터베이스로부터 인간 조직에서의 트랜스페린 수용체(TFRC)의 RNA-Seq 발현 프로파일을 보여주는 선도이다. 트랜스페린 수용체(TFRC)는 표적 A(활성인자)에 대한 후보이다. RNA 수준에서의 TFRC의 발현은 편재하고 비교적 고르다. TRFC는 필수 유전자이다: 기능 소실 동형접합성 돌연변이는 마우스에서 배아 치사이다.
도 4b는 HLA-A 및 HLA-B의 RNA-Seq 발현 프로파일을 보여주는 선도이다.
도 5a 내지 도 5h는 LIR-1 차단제가 모듈식이고 큰 EC50 이동을 매개한다는 것을 보여준다.
도 5a는 차단제 작제물을 평가하기 위한 T2-저카트 실험의 도식을 보여준디.
도 5b는 NY-ESO-1 차단제 펩타이드가 로딩될 때 MAGE-A3 CAR 활성인자(MP1-CAR)의 EC50에 대한 다양한 NY-ESO-1 scFv LBD 차단제 모듈(PD-1, CTLA-4, LIR-1)의 효과를 보여준다. 오차 막대는 ± SD(n=2)를 나타낸다.
도 5c는 상응하는 펩타이드가 로딩될 때 MAGE-A3 CAR 활성인자 (MP1-CAR)의 EC50에 대한 다양한 scFv LBD(ESO, MP1 LBD 1, MP1 LBD 2, HPV E6 LBD 1, HPV E6 LBD 2, HPV E7)를 갖는 LIR-1 차단제 모듈의 효과를 보여준다. 오차 막대는 ± SD(n=2)를 나타낸다.
도 5d는 NY-ESO-1 차단제 펩타이드가 로딩될 때 상이한 MAGE-A3 CAR 활성인자(MP1-CAR 또는 MP2-CAR)의 EC50에 대한 NY-ESO-1 scFv LBD를 갖는 LIR-1 차단제 모듈의 효과를 보여준다. 오차 막대는 ± SD(n=2)를 나타낸다.
도 5e는 NY-ESO-1 차단제 펩타이드가 로딩될 때 상이한 TCR 활성인자(MP1-TCR, MP2-TCR, HPV E6-TCR)의 EC50에 대한 NY-ESO-1 scFv LBD를 갖는 LIR-1 차단제 모듈의 효과를 보여준다. 오차 막대는 ± SD (n=2)를 나타낸다. 3개의 상이한 TCR 활성인자는 ESO scFv, LIR-1 힌지, LIR-1 TM 및 LIR-1 ICD를 갖는 NY-ESO-LIR-1에 의해 차단된다.
도 5f는 MAGE-A3 CAR 및 TCR 활성인자(MP1-CAR, MP1-TCR)의 EC50에 대한 NY-ESO-1 Ftcr LBD를 갖는 LIR-1 차단제 모듈의 효과를 보여준다. 오차 막대는 ± SD (n=2)를 나타낸다. 제3 세대 CAR 활성인자 또는 정기적 TCR 활성인자 둘 다는 TCRa ECD, LIR-1 TM, LIR-1 ICD 및 TCRb ECD, LIR-1 TM 및 LIR-1 ICD를 갖는 NY-ESO-1 Ftcr-LIR-1에 의해 차단될 수 있다.
도 5g는 활성인자(HPV E7) 및 차단제(NY-ESO-1) 항원의 다양한 비를 나타내는 비드와 동시배양된 HPV E7-CAR 또는 HPV E7-CAR 및 A2-LIR-1에 의해 형질주입된 저카트 세포가 트랜스가 아니라 시스에서의 차단을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 5h는 A2-LIR-1 차단제 모듈이 다양한 활성인자 대 차단제 비에서 CD19-CAR 활성인자를 차단한다는 것을 보여준다. E:T 비: 효과기: 표적 비.
도 6a, 도 6c 내지 도 6e는 LIR-1 차단제를 발현하는 1차 T 세포가 pMHC 및 비-pMHC 개념 증명 표적에 의해 종양 세포를 선택적으로 사멸한다는 것을 보여준다.
도 6a는 HPV E7-TCR 활성인자 및 ESO-LIR-1 차단제에 의해 형질도입된 1차 T 세포가 1차 T 세포 사멸 검정에서 EC50을 약 100배 이동시킨다는 것을 보여준다. 오차 막대는 +/- SD(n=2)를 나타낸다.
도 6b는 HLA-A*02-LIR-1이 저카트 세포에서 다양한 활성인자:차단제 DNA 비로 NY-ESO-1 CAR 활성인자를 차단한다는 것을 보여준다.
도 6c는 CD19 CAR 활성인자 및 HLA-A*02 차단제에 의해 형질도입된 1차 T 세포가 시험관내 세포독성 검정에서 "종양" 세포를 "정상" 세포와 구별하고, 3:1의 E:T에서 혼합 표적 세포 검정에서 "종양" 세포의 선택적 사멸을 나타낸다는 것을 보여준다. A2-LIR-1 : HLA-A2*02 LBD를 갖는 LIR-1 기반 수용체
도 6d 내지 도 6e는 CD19 CAR 활성인자 및 HLA-A*02 차단제에 의해 형질도입된 1차 T 세포가 3:1의 E:T에서 시험관내 세포독성 검정에서 3 회차의 항원 노출(AB-A-AB 및 A-AB-A) 후 가역적 봉쇄(도 6d) 및 활성화(도 6e)를 나타낸다는 것을 보여준다. 1차 T 세포 세포독성 검정은 3개의 HLA-A*02-음성 공여자에 의해 재현되었다.
도 7a 내지 도 7e는 변형된 CAR-T 세포(즉, 활성인자 및 차단제 수용체 둘 다를 발현하는 CAR-T 세포)가 이종이식 모델에서 종양을 선택적으로 사멸한다는 것을 보여준다.
도 7a는 CD19 CAR 활성인자 및 HLA-A*02 차단제에 의해 형질도입된 1차 T 세포가 10일에 걸쳐 CD3/28 자극에 의해 약 20배 확장을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 7b는 생체내 연구 설계의 도식을 보여준다: HLA-A*02 NSG 마우스는 "종양 세포"(A2-음성 라지 세포(Raji cell)) 또는 "정상 세포"(A2-양성 라지 세포)가 동시에 투여되고, 라지 이종이식편이 평균 약 70 mm3일 때 1차 T 세포(인간, HLA-A*02-음성 공여자)가 꼬리 정맥으로 주사된다.
도 7c 내지 도 7e는 캘리퍼 측정에 의한 종양 크기의 판독정보(도 7c), 유세포분석법에 의한 인간 혈액 T 세포 수(도 7d) 및 생존율(도 7e)을 보여준다. 오차 막대는 평균의 표준 오치(s.e.m.)이다. UTD: 비형질도입됨.
도 8은 활성화 EC50의 펩타이드-로딩 이동이 통상적으로 약 10x 미만이라는 것을 보여준다. 활성화 MAGE-A3 CAR(MP2 CAR)에 대한 차단제 펩타이드 로딩(NY-ESO-1, MAGE-A3, HPV E6 및 HPV E7의 50 uM 각각)의 효과가 도시되어 있다.
도 9는 LIR-1 차단제 모듈이 리간드 의존적이라는 것을 보여준다. 다양한 농도의 NY-ESO-1 차단제 펩타이드가 로딩될 때 활성화 MAGE-A3 CAR(MP1-CAR)의 EC50에 대한 NY-ESO-1-LIR-1 차단제의 효과가 도시되어 있다.
도 10은 ICD가 없는 또는 돌연변이된 비기능적 ICD를 갖는 차단제가 활성화를 차단하지 않는다는 것을 보여준다. 10 uM의 NY-ESO-1 차단제 펩타이드가 로딩될 때 MAGE-A3 CAR 활성인자(MP2-CAR)의 EC50에 대한 ICD를 함유하지 않는 변형된 LIR-1 차단제 모듈(청색) 또는 NY-ESO-1 scFv LBD를 갖는 돌연변이된 ICD(자주색)의 효과가 도시되어 있다.
도 11은 HLA-A*02+ (A2+) 라지 세포에서 CD19가 저카트 활성화를 활성화하고 A2-LIR-1이 이를 차단한다는 것을 보여준다. CD19 또는 CD19와 A2-LIR-1에 의해 형질주입된 저카트 세포를 다양한 세포 비율에서 WT (A2-) 라지 세포 또는 A2+ 라지 세포와 동시배양하였다.
도 12는 종양 성장에 대한 마우스 혈액에서의 hCD3+ T 세포의 상관관계를 보여주는 4개의 패널이다. A2- 및 A2+ 라지 세포에 의한 T 세포 주사 후 10일 및 17일에 종양 용적과 비교된 hCD3+ T 세포의 그래프가 도시되어 있다.
도 13은 EGFR CAR 활성인자 및 HLA-A*02 LIR-1 차단제를 발현하는 저카트 세포가 EGFR+/HLA-A*02+ HeLa 표적 세포가 아니라 EGFR+/HLA-A*02- HeLa 표적 세포에 의해 활성화된다는 것을 보여준다.
도 14a는 HLA-A*02에 의해 형질도입된 HeLa 세포 및 HCT116 세포에 대한 HLA-A*02의 발현을 보여준다. HeLa 및 HCT1116 세포를 항-HLA-A2 항체 BB7.2로 표지하고, FAC를 분류하였다. 녹색: 비표지된 HeLa; 오렌지색: 비표지된 HCT116; 청색: BB7.2로 표지된 야생형 HCT116; 적색: HLA-A*02에 의해 형질도입되고 BB7.2에 의해 표지된 HeLa 세포.
도 14b는 HeLa 세포 및 HCT116 세포에 대한 EGFR의 발현을 보여준다. HeLa 및 HCT1116 세포를 항-EGFR 항체로 표지하고, FAC를 분류하였다. 녹색: 비표지된 HeLa; 오렌지색: 비표지된 HCT1116; 청색: 항-EGFR로 표지된 야생형 HCT116; 적색: HLA-A*02에 의해 형질도입되고 항-EGFR에 의해 표지된 HeLa 세포.
도 15a는 EGFR CAR을 발현하는 저카트 세포 및 HCT116 표적 세포의 EGFR CAR 활성화를 보여준다.
도 15b는 저카트 세포의 EGFR CAR 활성화가 HLA-A*02 LIR-1 억제 수용체에 의해 차단될 수 있다는 것을 보여준다. 저카트 세포가 EGFR 및 HLA-A*02를 발현하는 HCT116 표적 세포에 의해 제시될 때 저카트 세포에 의한 EGFR CAR 및 HLA-A*02 LIR-1 억제 수용체의 동시발현은 대략 1.8x의 CAR EMAX의 이동으로 이어진다.
도 16a는 활성인자 대 차단제 항원의 최적 비를 결정하기 위한 비드 기반 검정에서의 활성인자 항원의 적정을 보여준다.
도 16b는 활성인자 대 차단제 항원의 최적 비를 결정하기 위한 비드 기반 검정에서의 활성인자 항원의 일정한 양의 존재 하에서의 차단제 (억제) 항원의 적정을 보여준다.
도 17은 NY-ESO-1 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체가 표적 세포로서의 고형 종양 세포주 A375를 사용하여 MP1 MAGE-A3 TCR에 의한 저카트 세포 활성화의 활성화를 억제할 수 있다는 것을 보여주는 다이어그램(왼쪽) 및 선도(오른쪽)이다.
도 18은 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체가 표적 세포로서의 B 세포 백혈병 계통 NALM6을 사용하여 CD19 ScFv CAR에 의한 저카트 세포 활성화의 활성화를 억제할 수 있다는 것을 보여주는 다이어그램(왼쪽) 및 선도(오른쪽)이다.
도 19는 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체가 용량 의존적 방식으로 NY-ESO-1 ScFv CAR 활성인자에 의해 저카트 세포의 활성화를 억제할 수 있다는 것을 보여주는 다이어그램(왼쪽) 및 선도(오른쪽)이다.
도 20은 pan HLA(pan 클래스 I) ScFv CAR이 T2 표적 세포 및 루시퍼라제 검정을 사용하여 저카트 세포에서 분석될 때 조정 가능항 강도로 HAL-A*02 LIR-1 차단제의 발현에 의해 차단된다는 것을 보여준다.
도 21a는 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체가 무세포 비드 기반 검정에서 시스로 저카트 세포의 활성화를 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
도 21b는 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체가 표적 세포로서의 백혈병 세포주 K562를 사용하여 MSLN ScFv CAR에 의해 저카트 세포의 활성화를 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
도 22는 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체가 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체 및 표적 세포로서의 HLA-A*02+ HeLa 및 SiHa 세포를 사용하여 MSLN ScFv CAR에 의해 IFNγ의 배수 유도에 의해 측정된 것처럼 저카트 세포의 활성화를 억제할 수 있다는 것을 보여주는 다이어그램(왼쪽) 및 챠트(오른쪽)이다.
도 23은 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체가 HLA-A*02- SiHa 세포가 아니라 HLA-A*02+ SiHa 세포를 사용하여 MSLN CAR 활성인자에 의한 사멸을 억제한다는 것을 보여준다.
도 24는 비드 기반 검정을 사용한 EGFR ScFv CAR을 발현하는 저카트 세포의 활성화가 활성인자 및 억제제 항원이 트랜스로 비드에 존재할 때가 아니라 활성인자 및 억제제 항원이 시스로 비드에 존재할 때 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체에 의해 차단될 수 있다는 것을 보여준다.
도 25a는 EGFR ScFv CAR에 의한 저카트 세포의 활성화가 HLA-A*02(SiHa WT)를 발현하지 않는 SiHa 세포에 의해서가 아니라 HLA-A*02(SiHa A02)를 발현하는 SiHa 표적 세포를 사용하여 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체에 의해 차단될 수 있다는 것을 보여준다.
도 25b는 EGFR ScFv CAR에 의한 저카트 세포의 활성화가 HLA-A*02(HeLa WT)를 발현하지 않는 HeLa 세포에 의해서가 아니라 HLA-A*02(HeLa A02)를 발현하는 HeLa 표적 세포를 사용하여 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체에 의해 차단될 수 있다는 것을 보여준다.
도 26은 LIR-1 억제 도메인에 융합된 추가 ScFv가 용량 의존적 방식으로 항시적 CAR 활성인자를 억제한다는 것을 보여준다. 저카트-NFAT 루시퍼라제 리포터 세포는 높은 긴장성 신호전달을 나타내는 활성화 CAR 작제물 및 다양한 pMHC를 인식하는 억제 작제물에 의해 형질주입되었다. NFAT-루시퍼라제의 활성화에 대한 효과는 형질주입된 저카트 세포를 다양한 양의 억제 펩타이드가 로딩된 T2 세포와 동시배양하여 측정되었다.
도 27은 MiHA-b 대리자 ScFv 리간드 결합 도메인(KRAS G12V ScFv-차단제)을 포함하는 억제 수용체가 T2 표적 세포를 사용하여 MiHA-a 대리자(KRAS G12D TCR, C-891)를 표적화하는 활성인자 TCR에 의해 저카트 효과기 세포 활성화를 억제한다는 것을 보여주는 다이어그램(왼쪽) 및 선도(오른쪽)이다.
도 28은 LIR-1 힌지, TM 및 ICD에 융합된 MiHA-b 대리자 ScFv 리간드 결합 도메인(KRAS G12D ScFv-차단제)을 포함하는 억제 수용체가 T2 표적 세포를 사용하여 MiHA-a 대리자(KRAS G12V TCR, C-913)를 표적화하는 TCR에 의해 저카트 효과기 세포 활성화를 억제한다는 것을 보여주는 다이어그램(왼쪽) 및 선도(오른쪽)이다.
도 29는 LIR1 TM 및 ICD에 융합된 MiHA-b 대리자 Ftcr 결합 도메인(KRAS G12V Ftcr-차단제)을 포함하는 억제 수용체가 T2 표적 세포를 사용하여 MiHA-a 대리자(KRAS G12D TCR)를 표적화하는 TCR에 의해 저카트 효과기 세포 활성화를 억제한다는 것을 보여주는 다이어그램(왼쪽) 및 선도(오른쪽)이다.
도 30은 LIR-1 TM 및 ICD에 융합된 MiHA-b 대리자 Ftcr 결합 도메인(KRAS G12D Ftcr-차단제)을 포함하는 억제 수용체가 T2 표적 세포를 사용하여 MiHA-a 대리자(KRAS G12V TCR)를 표적화하는 TCR에 의해 저카트 효과기 세포 활성화를 억제한다는 것을 보여주는 다이어그램(왼쪽) 및 선도(오른쪽)이다.
도 31a는 하나의 돌연변이체 KRAS 펩타이드[KRAS G12D] 및 LIR-1 힌지에 결합하는 MiHA-b ScFv 리간드 결합 도메인, 막관통 도메인 및 다른 돌연변이체 KRAS 펩타이드(KRAS G12V)에 결합하는 세포내 도메인(ICD)을 포함하는 억제 수용체를 사용한 MiHA-a TCR에 의한 저카트 세포 활성화의 억제를 보여주는 선도이다. 흑색: C-891 활성인자; 청색: C-891 활성인자, C-1761 억제제; 적색: C-891 활성인자, C-2371 및 C2369 억제제.
도 31b는 MiHA-b Ftcr 리간드 결합 도메인 및 LIR-1 막관통 도메인 및 세포내 도메인(ICD)을 함유하는 억제 수용체를 사용한 MiHA-a TCR에 의한 저카트 세포 활성화의 억제를 보여주는 선도이다. 흑색: C-913 활성인자; 청색: C-913 활성인자, C-1761 억제제; 적색: C-913 활성인자, C2365 및 C2367 억제제.
도 32는 마우스 MiHA-Y TCR이 저카트 효과기 세포를 활성화할 수 있다는 것을 보여주는 선도이다.
도 33a는 HA-1 Ftcr이 HA-1(H) 펩타이드의 존재 하에 NY-ESO-1 TCR을 특이적으로 차단할 수 있다는 것을 보여주는 선도 및 표이다.
도 33b는 비특이적인 대립유전자 변이체 HA-1(R) 펩타이드의 존재 하에 HA-1 Ftcr에 의한 NY-ESO-1 TCR의 차단이 본질적으로 없다는 것을 보여주는 선도 및 표이다.
도 34a는 HA-1 Ftcr이 HA-1(H) 차단제 펩타이드의 존재 하에 KRAS TCR을 특이적으로 차단할 수 있다는 것을 보여주는 선도 및 표이다.
도 34b는 비특이적인 대립유전자 변이체 HA-1(R) 펩타이드의 존재 하에 HA-1 Ftcr에 의한 KRAS TCR의 차단이 본질적으로 없다는 것을 보여주는 선도 및 표이다.
도 35는 유세포분석법에 의해 T2 세포에서 HA-1(R), HA-1(H) 및 NY-ESO-1 펩타이드의 펩타이드 로딩을 비교하는 선도이다.
도 36a는 MAGE-A3 MP1 ScFv CAR 및 NY-ESO-1 ScFv LIR1 차단제를 사용한 활성화 용량 반응을 보여주는 선도 및 표이다.
도 36b는 MAGE-A3 MP1 ScFv CAR 및 NY-ESO-1 ScFv LIR1 차단제를 사용한 억제 용량 반응을 보여주는 선도 및 표이다.
도 36c는 각각의 곡선에 사용된 일정한 활성인자 MAGE 펩타이드 농도로 정규화되고 x축에 작도된 도 36b로부터의 x-값 차단제 NY-ESO-1 펩타이드 농도를 보여주는 선도이다. B: NY-ESO-1 LIR1 차단제, A: MAGE-A3 펩타이드 2 ScFv CAR.
도 37은 HLA-A*02 ScFv LIR1 억제제가 상이한 EGFR ScFv CAR 활성인자와 사용될 때 상이한 정도의 차단이 관찰된다는 것을 보여주는 일련의 선도 및 표이다.
도 38a는 상이한 EGFR ScFv CAR 및 HLA-A*02 ScFv LIR1 억제제를 발현하는 T 세포와 EGFR 활성인자 단독(표적 A), 억제제 표적 단독(표적 B) 또는 활성인자와 억제제 표적(표적 AB)을 발현하는 HeLa 세포의 항온처리 후 T 세포에 의한 EGFR ScFv CAR 활성인자 수용체의 발현을 보여주는 일련의 형광 활성 세포 분류(FACS) 선도이다.
도 38b는 표적 세포에 대한 노출 전 및 활성인자 리간드 단독(표적 A)을 발현하는 표적 세포 또는 활성인자와 차단제 리간드 둘 다(표적 AB)를 발현하는 표적 세포와의 120시간 동시배양 후 활성인자 수용체 발현의 정량화를 보여주는 선도이다.
도 39a는 동일한 세포에 EGFR(표적 A), HLA-A*02(표적 B), EGFR과 HLA-A*02의 조합(표적 AB)을 발현하는 HeLa 세포의 집단, 상이한 세포에 표적 A와 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단, 또는 상이한 세포에 표적 B와 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단과의 동시배양 후 EGFR ScFv CAR(CT-482) 활성인자 및 HLA-A*02 ScFv LIR1 억제제(C1765)를 발현하는 T 세포에 대한 활성인자 수용체의 세포 표면 발현을 보여주는 선도이다.
도 39b는 동일한 세포에 EGFR(표적 A), HLA-A*02(표적 B), EGFR과 HLA-A*02의 조합(표적 AB)을 발현하는 HeLa 세포의 집단, 상이한 세포에 표적 A와 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단, 또는 상이한 세포에 표적 B와 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단과의 동시배양 후 EGFR ScFv CAR(CT-482) 활성인자 및 HLA-A*02 ScFv LIR1 억제제(C1765)를 발현하는 T 세포에 대한 억제제 수용체의 세포 표면 발현을 보여주는 선도이다.
도 40은 T 세포에 의한 활성인자 수용체의 발현 소실이 가역적인지를 결정하기 위한 실험의 다이어그램이다.
도 41a는 활성인자 표면 발현 소실이 가역적이고 T 세포 세포독성에 상응한다는 것을 보여주는 일련의 선도이다. 상부에서: T 세포에 의한 표적 HeLa 세포의 퍼센트 사멸이 도시되어 있다. 하부에서: FACS에 의해 분석된 것과 같은 활성인자 및 억제제 수용체 발현.
도 41b는 활성인자 표면 발현 소실이 가역적이고 T 세포 세포독성에 상응한다는 것을 보여주는 일련의 선도이다. 상부에서: T 세포에 의한 표적 HeLa 세포의 퍼센트 사멸이 도시되어 있다. 하부에서: FACS에 의해 분석된 것과 같은 활성인자 및 억제제 수용체 발현.
본 발명자들은 적합한 마커를 확인하고 세포 치료에 의한 질환, 특히 암의 치료에서 세포 선택도를 달성하는 문제에 대한 해결책을 개발하였다. 본 발명의 일차 목적은 이형접합성 소실에 기초하여 세포를 표적화하는 것이다(도 1). 활성 신호 및 억제 신호가 세포 수준에서 통합된 2개의 수용체 시스템을 사용하여(도 2a, 도 2b, 도 3a 및 도 3b), 비종양 세포가 아니라 종양 세포의 선택적 표적화가 달성된다. 표적 세포에서 부재하거나 소실되지만 정상 세포에 존재하는 표면 단백질의 발현의 차이는 이로써 표적화된 항-종양 세포 치료로 전환된다. 이 차이는 세포 치료에 의해 표적화를 개선하고, 입양 세포 치료에 사용된 효과기 세포의 세포독성 효과로부터 정상 세포를 보호한다.
본원에 개시된 이 접근법은 일부 실시형태에서 활성인자 리간드에 대한 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1의 것 및 억제제 리간드에 대한 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2의 것인 2개의 조작된 수용체를 사용하고, 이는 "AND NOT" Boolean 로직을 사용하여 표적 세포에서 선택적으로 활성화된다(도 2a, 도 2b, 도 3a 및 도 3b). 정상 세포는 활성인자 리간드 및 억제제 리간드 둘 다를 발현하지만, 제1 수용체를 통한 효과기 세포의 활성화는 억제제 리간드에 대한 억제제 LBD를 포함하는 제2 수용체의 결합에 의해 차단되고, 이것은 보호 효과를 발휘하고, 제1의, 활성인자 수용체의 활성을 지배한다. 이와 반대로, 활성인자 리간드를 발현하지만 억제제 리간드를 발현하지 않는 표적 세포에서, 활성인자 LBD에 의한 활성인자 리간드의 결합은 세포를 활성화한다. 본 개시내용의 이중 활성인자/억제제 수용체 전략의 이점은 강력하지만 특이적 종양-표적화된 입양 세포 치료를 생성하는 활성인자 및 억제제 조합을 조정하는 능력을 포함한다. 추가로, 이 접근법은 신체에서 가변 효과기 대 표적 세포 비(E:T 비), 및 입양 세포 치료에 의해 종양 세포를 표적화할 때 보인 잠재적으로 매우 과량의 정상 세포 대 종양 세포(예를 들어, 1013개의 정상 세포 대 109개의 종양 세포)의 도전을 극복할 수 있다. 훨씬 추가로, 본 발명자들은 큰 가능한 환자 조합을 다루는 활성인자 및 억제제를 확인하였고, 이는 이것이 상업적으로 실행 가능한 접근법이 되게 한다.
특이적 세포 유형에 대한 입양 세포 치료의 특이성은 제1 수용체 및 제2 수용체의 상이한 활성, 및 제1 리간드 및 제2 리간드의 차등 발현을 통해 달성될 수 있다. 제1 수용체에 대한 제1 리간드의 결합은 활성화 신호를 제공하지만, 제2 수용체에 대한 제2 리간드의 결합은 제1 리간드의 존재 하에서도 효과기 세포의 활성화를 방지하거나 감소시킨다. 제1 리간드는 예를 들어 입양 세포 치료에 의해 표적화된 세포, 및 입양 세포 치료에 대한 표적 세포가 아닌 건강한 세포(비표적 세포) 둘 다에서 제2 리간드보다 더 광범위하게 발현될 수 있다. 이와 반대로, 제2 리간드는 비표적 세포에서 발현되고, 표적 세포에서 발현되지 않는다. 비표적 세포가 아니고 오직 표적 세포는 제2 리간드가 아니라 제1 리간드를 발현하고, 이로써 이들 세포의 존재 하에 본 개시내용의 이중 수용체를 포함하는 효과기 세포를 활성화한다.
본 개시내용은 2개의 조작된 수용체의 사용을 통해 이형접합성 소실에 기초한 표적화 세포(예를 들어, 종양 세포)로부터의 조성물 및 방법을 제공한다. 1개의 억제제 및 1개의 활성인자인 2개의 조작된 수용체는 상이한 리간드를 인식하는 상이한 리간드 결합 도메인을 각각 포함한다. 제1 리간드 및 제2 리간드의 발현의 차이는 제1의, 활성인자 리간드가 오직 존재할 때 2개의 수용체를 발현하는 효과기 세포를 선택적으로 활성화하도록 사용된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인 및 제2 리간드 결합 도메인은 상이한 수용체 분자; 즉 단일 유전 작제물, 융합 단백질 또는 단백질 복합체의 일부가 아닌 별개의 수용체에 있다. 일부 실시형태에서, 각각 이의 동족 리간드에 결합할 때 수용체 중 하나는 세포를 활성화하고, 다른 수용체는 세포를 억제한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드 결합 도메인을 포함하는 수용체는 신호전달을 지배하여서, 표적 세포가 표적 둘 다를 발현하면, 그 결과는 효과기 세포의 억제이다. 억제 표적이 세포로부터 부재할 때에만, 제1의, 활성인자 리간드가 제1의, 활성인자 리간드 결합 도메인을 포함하는 수용체를 통해 효과기 세포의 활성화를 유도한다.
임의의 광범위하게 발현된 세포 표면 분자, 예를 들어 세포 부착 분자, 세포-세포 신호전달 분자, 세포외 도메인, 화학주성에 관여된 분자, 당단백질, G 단백질 커플링된 수용체, 막관통, 신경전달인자를 위한 수용체 또는 전압 게이팅된 이온 채널, 또는 임의의 이들의 펩타이드 항원은 제1 리간드로서 사용될 수 있다. 추가의 예로서, 제1 리간드는 트랜스페린 수용체(TFRC)일 수 있다. 표적 세포의 표면에서 발현되지 않은 임의의 세포 표면 분자는 제2 리간드로서 사용될 수 있다. 암을 치료하기 위해 조작된 수용체가 입양 세포 치료에서 사용되고 표적 세포가 암 세포인 이들 실시형태에서, 제2 리간드는 암 세포에서 제2 리간드의 이형접합성 소실에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 이형접합성 소실로 이어지는 돌연변이로 인해 암 세포에서 발현이 흔히 소실되는 예시적인 유전자는 HLA 클래스 I 대립유전자, 부 조직접합 항원(MiHA) 및 Y 염색체 유전자를 포함한다.
본 개시내용은 추가로 본원에 기재된 조작된 수용체를 암호화하는 벡터 및 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 개시내용은 추가로 본원에 기재된 조작된 수용체를 포함하는 면역 세포 집단을 제조하는 방법, 및 이를 사용하여 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
정의
본 개시내용을 더 자세히 기술하기 전에, 이는 본원에 사용되는 소정의 용어의 정의를 제공하도록 이의 이해에 도움일 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 특정 실시형태의 실행 또는 교시에서 사용될 수 있지만, 조성물, 방법 및 재료의 바람직한 실시형태가 본원에 기재된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 하기 용어가 하기 정의되어 있다. 추가 정의는 본 개시내용에 걸쳐 기재되어 있다.
관사 "a", "an" 및 "the"는 관사의 문법적 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나 또는 하나 이상)를 지칭하도록 본원에 사용된다. 예에 의해, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 다, 또는 임의의 이들의 조합을 의미하도록 이해되어야 한다.
"및/또는"이라는 용어는 대안의 하나 또는 둘 다를 의미하도록 이해되어야 한다.
본 명세서에 걸쳐, 문맥이 달리 요하지 않는 한, "포함한다", "포함한" 및 "포함하는"의 단어는 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 배타가 아니라 기술된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 포함을 암시한다고 이해될 것이다. "이루어지는"에 의해 "이루어지는"의 구절에 어떤 것이 뒤따르든지 간에 이에 제한 없이 포함하는 것이 의도된다. 이와 같이, "이루어지는"의 구절은 열거된 요소가 필요하거나 의무적이고, 다른 요소가 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. "본질적으로 이루어지는"에 의해 열거된 요소에 대해 본 개시내용에 기재된 활성 또는 작용을 방해하지 않고 이에 기여하는 다른 요소에 제한 없이 그 구절 후에 열거된 임의의 요소를 포함하는 것이 의도된다. 이와 같이, "본질적으로 이루어지는"의 구절은 열거된 요소가 필요하거나 의무적이지만, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 중요하게 영향을 미치는 다른 요소가 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
"일 실시형태", "하나의 실시형태," "특정 실시형태", "관련 실시형태", "소정의 실시형태", "추가 실시형태" 또는 "추가의 실시형태" 또는 이들의 조합에 대해 본 명세서에 걸친 언급은 그 실시형태와 연결되어 기재된 특정한 특징, 구조 또는 특성이 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 이와 같이, 본 명세서에 걸쳐 다양한 위치에서 상기 구절의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태를 지칭하지는 않는다. 더욱이, 하나 이상의 실시형태에서 특정한 특징, 구조 또는 특성은 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 일 실시형태에서 특징의 긍정 인용이 특정 실시형태에서 특징을 배제하기 위한 기준으로서 작용한다고 또한 이해된다.
본원에 사용된 것과 같이, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 기준 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 많이 변하는 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 기준 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 주위의 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%의 범위를 지칭한다.
본원에 사용된 것과 같이, "단리된"이라는 용어는 자연적 상태에서 재료가 보통 수반하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 재료를 의미한다. 특정 실시형태에서, "얻은" 또는 "유래된"이라는 용어는 단리된과 동의어로 사용된다.
"대상체", "환자" 및 "개체"라는 용어는 척추동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간을 지칭하도록 본원에 상호교환 가능하게 사용된다. 생체내 얻거나 시험관내 배양된 생물학적 집합체의 조직, 세포 및 이의 자손이 또한 포함된다. 본원에 사용된 것과 같이 "대상체", "환자" 또는 "개체"는 본원에 고려된 벡터, 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 통증을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체(예를 들어, 환자)는 실험실 동물(예컨대, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니아 피그), 농장 동물 및 가축 동물 또는 애완동물(예컨대, 고양이 또는 개)을 포함한다. 비인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자가 포함된다.
본원에 사용된 것과 같이 "치료" 또는 "치료하는"은 임의의 유리하거나 바람직한 효과를 포함하고, 심지어 최소 증상 개선을 포함할 수 있다. "치료"는 반드시 질환 또는 병태, 또는 이의 연관된 증상의 완전한 소거 또는 치유를 나타내지는 않는다.
본원에 사용된 것과 같이, "예방한다" 및 "예방된", "예방하는" 등과 같은 유사한 단어는 질환의 증상의 가능성을 예방하거나 억제하거나 감소시키기 위한 접근법을 나타낸다. 이것은 또한 질환 또는 병태의 발병 또는 재발을 지연시키는 것 또는 질환의 증상의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 것과 같이, "예방" 및 유사한 단어는 또한 발병 또는 재발 전에 질환의 강도, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "양"이라는 용어는 임상 결과를 포함하는 유리하거나 원하는 예방 효과 또는 치료 효과를 달성하기 위한 바이러스의 "효과적인 양" 또는 "유효량"을 지칭한다.
"예방학적 유효량"은 원하는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 바이러스의 양을 지칭한다. 반드시는 아니지만 통상적으로, 질환의 단계 전에 또는 이의 더 이른 단계에서 예방 용량이 대상체에 사용되므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적다.
바이러스 또는 세포의 "치료학적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중 및 개체에서 원하는 반응을 일으키는 바이러스 또는 세포의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적으로 유리한 효과가 바이러스 또는 세포의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 것이다. "치료학적 유효량"이라는 용어는 대상체(예를 들어, 환자)를 "치료"하기에 효과적인 양을 포함한다.
생리학적 반응, 예를 들어 전기생리학적 활성 또는 세포 활성의 "증가된" 또는 "향상된" 양은 통상적으로 "통게학적으로 유의미한" 양이고, 비치료된 세포에서 활성의 수준의 1.1배, 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배 또는 이것 초과(예를 들어, 500배, 1000배)(1 초과, 예를 들어 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등 및 이들 사이의 모든 정수 및 소수점을 포함)인 증가를 포함할 수 있다.
생리학적 반응, 예를 들어 전기생리학적 활성 또는 세포 활성의 "감소" 또는 "감소된" 양은 통상적으로 "통게학적으로 유의미한" 양이고, 비치료된 세포에서 활성의 수준의 1.1배, 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배 또는 이것 초과(예를 들어, 500배, 1000배)(1 초과, 예를 들어 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등 및 이들 사이의 모든 정수 및 소수점을 포함)인 감소를 포함할 수 있다.
"유지한다" 또는 "보존한다" 또는 "유지" 또는 "무변화" 또는 "실질적인 무변화" 또는 "실질적인 무감소"에 의해 일반적으로 비히클, 또는 대조군 분자/조성물 중 어느 하나에 의해 야기된 반응에 필적하는 생리학적 반응을 지칭한다. 필적하는 반응은 기준 반응과 유의미하게 상이하지 않거나 측정 가능하게 상이하지 않은 것이다.
일반적으로, "서열 동일성" 또는 "서열 상동성"은 각각 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 정확한 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 아미노산-대-아미노산 관련성을 지칭한다. 통상적으로, 서열 동일성을 결정하기 위한 기법은 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 것 및/또는 이로써 암호화된 아미노산 서열을 결정하는 것, 및 이 서열을 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 2개 이상의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 이의 "퍼센트 동일성"을 결정함으로써 비교될 수 있다. 2개의 서열의 퍼센트 동일성은, 핵산 서열 또는 아미노산 서열이든, 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 일치의 수를 더 짧은 서열의 길이에 의해 나누고 100을 곱한 것이다. 예를 들어, National Institutes of Health로부터 입수 가능한 버전 2.2.9를 포함하는 어드밴스드 BLAST 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 퍼센트 동일성이 또한 결정될 수 있다. BLAST 프로그램은 Altschul, 등, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin And Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993); 및 Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)에 기재된 것처럼 Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)의 정렬 방법에 기초한다. 간단히, BLAST 프로그램은 2개의 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 총 수에 의해 나눈 동일한 정렬된 기호(일반적으로 뉴클레오타이드 또는 아미노산)의 수로서 동일성을 정의한다. 프로그램은 비교되는 단백질의 전체 길이에 걸쳐 퍼센트 동일성을 결정하도록 사용될 수 있다. 디폴트 매개변수는 blastp 프로그램에서, 예를 들어 이에 의해 짧은 쿼리 서열과의 검색을 최적화하도록 제공된다. 프로그램은 또한 Wootton and Federhen, Computers and Chemistry 17:149-163 (1993)의 SEG 프로그램에 의해 결정된 것과 같이 쿼리 서열의 분절을 밝히기 위해 SEG 필터의 사용을 허용한다. 원하는 정도의 서열 동일성이 범위는 대략 80% 내지 100% 및 이들 사이의 정수 값이다. 통상적으로, 개시된 서열과 청구된 서열 사이의 퍼센트 동일성은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%이다.
"외인성"이라는 용어는 유기체의 밖으로부터 기원한 핵산, 단백질 또는 펩타이드, 소분자 화합물 및 기타를 포함하는 임의의 분자를 지칭하도록 본원에 사용된다. 이와 반대로, "내인성"이라는 용어는 유기체 안에서 기원한 임의의 분자(즉, 유기체에 의해 자연적으로 생성됨)를 지칭한다.
"MOI"라는 용어는 물질(예를 들어, 바이러스 입자) 대 감염 표적(예를 들어, 세포)의 비인 감염 다중도를 지칭하도록 본원에 사용된다.
본원에 언급된 모든 공보 및 특허는, 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 참조로 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것처럼 본원에 그 전체가 참조로 포함된다. 상충의 경우에, 임의의 정의를 포함하는 본 출원이 규제할 것이다. 그러나, 본원에 인용된 임의의 참고문헌, 논문, 공보, 특허, 특허 공보 및 특허 출원의 언급은 이들이 세계에서 어떠한 나라에서 유효한 선행 기술을 구성하거나 흔한 일반 지식의 일부를 형성한다는 것인 승인, 또는 제시의 임의의 형태로 취해지지 않고 취해지지 않아야 한다.
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값 및 적절할 때 이의 분수(예컨대, 정수의 10/1 및 100/1)를 포함한다고 이해되어야 한다. "약"이라는 용어는, 수 또는 숫자에 바로 선행할 때, 수 또는 숫자 범위의 플러스 또는 마이너스 10%라는 것을 의미한다.
본원에 사용된 것과 같이, "표적 세포"는 입양 세포 치료에 의해 표적화된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 표적 세포는 입양 세포 치료의 이식된 T 세포에 의해 사멸될 수 있는 암 세포일 수 있다. 본 개시내용의 표적 세포는 본원에 기재된 것과 같은 활성인자 리간드를 발현하고, 억제제 리간드를 발현하지 않는다.
활성인자
본 개시내용은 제1 리간드, 활성인자, 및 제1 활성인자 리간드에 결합하는 제1 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 조작된 수용체를 제공한다.
본 개시내용은 세포외 영역을 포함하는 제1 조작된 수용체를 포함하고, 세포외 영역은, 수용체를 발현하는 효과기 세포의 활성화를 촉진하는, 수용체를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하는 제1 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 리간드 결합 도메인을 포함한다. 본 개시내용은 제2 리간드에 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 조작된 수용체를 추가로 제공하고, 제2 리간드 결합 도메인에 의한 제2 리간드의 결합은 제1 리간드에 결합된 제1 수용체의 존재 하에서도 효과기 세포의 활성화를 억제하거나 감소시킨다.
본원에 사용된 것과 같이, "활성인자" 또는 "활성인자 리간드"는 CAR 또는 TCR과 같은 본 개시내용의 조작된 수용체의 제1의, 활성인자 리간드 결합 도메인(LBD)에 결합하여서, 조작된 수용체를 발현하는 T 세포의 활성화를 매개하는 제1 리간드를 지칭한다. 활성인자는 표적 세포, 예를 들어 암 세포에 의해 발현되고, 또한 바로 표적 세포보다 더 광범위하게 발현될 수 있다. 예를 들어, 활성인자는 정상인 비표적 세포의 일부 유형 또는 모든 유형에서 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 리간드는 본원에 개시된 임의의 활성인자 표적으로부터의 펩타이드 리간드이다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 주요 조직적합성(MHC) 클래스 I 복합체(펩타이드 MHC 또는 pMHC), 예를 들어 인간 백혈구 항원 A*02 대립유전자(HLA-A*02)를 포함하는 MHC 복합체와 복합체화된 펩타이드 항원이다.
임의의 인간 백혈구 항원(HLA) HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G를 포함하는 pMHC와 복합체화된 펩타이드 항원을 포함하는 표적 세포-특이적 제1 활성인자 리간드는 본 개시내용의 범위 내에서 고안된다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드는 HLA-A를 포함하는 pMHC를 포함한다. HLA-A 수용체는 중 α 사슬 및 더 작은 β 사슬을 포함하는 이종이합체이다. α 사슬은 HLA-A의 변이체에 의해 암호화되지만, β 사슬(β2-마이크로글로불린)은 비변이체이다. 수천개의 HLA-A 유전자 변이체가 있고, 이들 모두는 본 개시내용의 범위 내에 해당한다. 일부 실시형태에서, MHC-I은 인간 백혈구 항원 A*02 대립유전자(HLA-A*02)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-B를 포함하는 pMHC를 포함한다. HLA-B 유전자의 수백개의 버전(대립유전자)이 공지되어 있고, 이들의 각각은 특정 수(예컨대, HLA-B*27)가 주어진다.
일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-C를 포함하는 pMHC를 포함한다. HLA-C는 HLA 클래스 I 중쇄 파랄로그에 속한다. 이 클래스 I 분자는 중쇄 및 경쇄(베타-2 마이크로글로불린)로 이루어진 이종이합체이다. 백개 초과의 HLA-C 대립유전자가 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-A를 포함하는 pMHC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-B를 포함하는 pMHC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-C를 포함하는 pMHC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-E를 포함하는 pMHC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-F를 포함하는 pMHC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-G를 포함하는 pMHC를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-A를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-B를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-C를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-E를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-F를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-G를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 활성인자 리간드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 결합 도메인은 ScFv 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 결합 도메인은 Vβ 단독 리간드 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 결합 도메인은 T 세포 수용체(TCR)로부터 단리되거나 유래된 항원 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 제1의, 활성인자 리간드 결합 도메인은 TCR α 및 β 사슬 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 및 제2의, 억제제 리간드는 동일하지 않다.
일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드는 표적 세포에 의해 발현되고, 비표적 세포(즉, 입양 세포 치료에 의해 표적화되지 않은 정상 세포)에 의해 발현되지 않는다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포이고, 비표적 세포는 비암성 세포이다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 표적 세포에서 높은 세포 표면 발현을 갖는다. 이 높은 세포 표면 발현은 큰 활성화 신호를 전달하는 능력을 부여한다. 세포 표면 발현을 측정하는 방법은 당업자에게 공지될 것이고, 활성인자 리간드에 대한 적절한 항체를 사용한 면역조직화학, 이어서 현미경검사 또는 형광 활성 세포 분류(FACS: fluorescence activated cell sorting)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 필수 세포 기능을 갖는 유전자에 의해 암호화된다. 필수 세포 기능은 세포가 살게 하는 데 필요한 기능이고, 단백질 및 지질 합성, 세포 분열, 복제, 호흡, 대사, 이온 수송 및 조직에 대한 구조 지지체의 제공을 포함한다. 필수 세포 기능을 갖는 유전자에 의해 암호화된 활성인자 리간드의 선택은 암 세포에서의 이수성으로 인한 활성인자 리간드의 소실을 방지하고, 활성인자 리간드를 암호화하는 유전자가 암의 진화 동안 돌연변이유발을 덜 겪게 한다. 일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 반수체기능부전인 유전자에 의해 암호화되고, 즉 활성인자 리간드를 암호화하는 유전자의 카피의 소실은 세포에 의해 관용되지 않고, 세포사 또는 불리한 돌연변이체 표현형으로 이어진다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 모든 표적 세포에 존재한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포이다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 복수의 표적 세포에 존재한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포이다. 일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9%의 표적 세포에 존재한다. 일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 적어도 95%의 표적 세포에 존재한다. 일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 적어도 99%의 표적 세포에 존재한다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 모든 세포에 존재한다(유비쿼터스 활성인자 리간드). 예를 들어, 제2 억제제 리간드가 또한 표적 세포를 제외한 모든 세포에서 발현되면 활성인자 리간드는 모든 세포에서 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드는 복수의 표적 세포 및 복수의 비표적 세포에 의해 발현된다. 일부 실시형태에서, 복수의 비표적 세포는 제1의, 활성인자 리간드 및 제2의 억제제 리간드 둘 다를 발현한다.
일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 및 제2의, 억제제 리간드는 제1 리간드 대 제2 리간드의 약 1:100 내지 약 100:1의 비로 복수의 비표적 표적 세포에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 및 제2의, 억제제 리간드는 제1 리간드 대 제2 리간드의 약 1:50 대 약 50:1의 비로 복수의 비표적 표적 세포에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 및 제2의, 억제제 리간드는 제1 리간드 대 제2 리간드의 약 1:25 대 약 25:1의 비로 복수의 비표적 표적 세포에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 및 제2의, 억제제 리간드는 제1 리간드 대 제2 리간드의 약 1:10 내지 약 10:1의 비로 복수의 비표적 표적 세포에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 및 제2의, 억제제 리간드는 제1 리간드 대 제2 리간드의 약 1:5 대 약 5:1의 비로 복수의 비표적 표적 세포에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 및 제2의, 억제제 리간드는 제1 리간드 대 제2 리간드의 약 1:3 대 약 3:1의 비로 복수의 비표적 표적 세포에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 및 제2의, 억제제 리간드는 제1 리간드 대 제2 리간드의 약 1:2 대 약 2:1의 비로 복수의 비표적 표적 세포에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 및 제2의, 억제제 리간드는 약 1:1의 비로 복수의 비표적 표적 세포에 존재한다.
제1의, 활성인자 리간드는 제1 리간드 결합 도메인(때때로 본원에서 활성인자 LBD라 칭함)에 의해 인식된다.
예시적인 활성인자 리간드는 세포 부착 분자, 세포-세포 신호전달 분자, 세포외 도메인, 화학주성에 관여된 분자, 당단백질, G 단백질 커플링된 수용체, 막관통 단백질, 신경전달인자에 대한 수용체 및 전압 게이팅된 이온 채널로 이루어진 군으로부터 선택된 리간드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드는 트랜스페린 수용체(TFRC) 또는 이의 펩타이드 항원이다. 인간 트랜스페린 수용체는 NCBI 기록 AAA61153.1호에 기재되어 있고, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, TFRC는
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의 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 종양 특이적 항원(TSA)이다. 일부 실시형태에서, 종양 특이적 항원은 메소텔린(MSLN: mesothelin), CEA 세포 부착 분자 5(CEACAM5 또는 CEA), 표피 성장 인자 수용체(EGFR: epidermal growth factor receptor) 또는 이의 펩타이드 항원이다. 일부 실시형태에서, TSA는 MSLN, CEA, EGFR, 델타 유사 정규 노치 리간드 4(DLL4: delta like canonical Notch ligand 4), 뮤신 16, 세포 표면 연관(CA125로도 공지된 MUC 16), 강글리오사이드 GD2(GD2), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1: receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), erb-b2 수용체 티로신 키나제 2(HER2/NEU) 또는 이의 펩타이드 항원이다. TSA를 표적화하는 예시적인 마우스 및 인간화된 ScFv 항원 결합 도메인은 하기 표 1에 기재되어 있다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 MSLN 또는 이의 펩타이드 항원이고, 활성인자 리간드 결합 도메인은 MSLN 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, MSLN 리간드 결합 도메인은 ScFv 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, MSLN 리간드 결합 도메인은 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90 또는 서열 번호 92의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, MSLN 리간드 결합 도메인은 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90 또는 서열 번호 92와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, MSLN 리간드 결합 도메인은 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91 또는 서열 번호 93을 포함하는 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, MSLN 리간드 결합 도메인은 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91 또는 서열 번호 93의 서열과 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 CEA 또는 이의 펩타이드 항원이고, 활성인자 리간드 결합 도메인은 CEA 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CEA 리간드 결합 도메인은 ScFv 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CEA 리간드 결합 도메인은 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 282, 서열 번호 284 또는 서열 번호 286의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CEA 리간드 결합 도메인은 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 282, 서열 번호 284 또는 서열 번호 286과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CEA 리간드 결합 도메인은 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 283, 서열 번호 285 또는 서열 번호 287을 포함하는 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, CEA 리간드 결합 도메인은 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 283, 서열 번호 285 또는 서열 번호 287의 서열과 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 CEA 또는 이의 펩타이드 항원이고, 활성인자 리간드 결합 도메인은 CEA 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CEA 리간드 결합 도메인은 EFGMN(서열 번호 294)의 CDR-H1, WINTKTGEATYVEEFKG(서열 번호 295)의 CDR-H2, WDFAYYVEAMDY(서열 번호 296) 또는 WDFAHYFQTMDY(서열 번호 297)의 CDR-H3, KASQNVGTNVA(서열 번호 298) 또는 KASAAVGTYVA(서열 번호 299)의 CDR-L1, SASYRYS(서열 번호 300) 또는 SASYRKR(서열 번호 301)의 CDR-L2 및 HQYYTYPLFT(서열 번호 302)의 CDR-L3 또는 이것과 적어도 85% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CEA ScFv는 EFGMN(서열 번호 294)의 CDR-H1, WINTKTGEATYVEEFKG(서열 번호 295)의 CDR-H2, WDFAYYVEAMDY(서열 번호 296) 또는 WDFAHYFQTMDY(서열 번호 297)의 CDR-H3, KASQNVGTNVA(서열 번호 298) 또는 KASAAVGTYVA(서열 번호 299)의 CDR-L1, SASYRYS(서열 번호 300) 또는 SASYRKR(서열 번호 301)의 CDR-L2 및 HQYYTYPLFT(서열 번호 302)의 CDR-L3을 포함한다. 일부 실시형태에서, CEA 결합 도메인은 EFGMN(서열 번호 294)의 CDR-H1, WINTKTGEATYVEEFKG(서열 번호 295)의 CDR-H2, WDFAYYVEAMDY(서열 번호 296)의 CDR-H3, KASQNVGTNVA(서열 번호 298)의 CDR-L1, SASYRYS(서열 번호 300)의 CDR-L2 및 HQYYTYPLFT(서열 번호 302)의 CDR-L3을 포함한다. 일부 실시형태에서, CEA ScFv는 EFGMN(서열 번호 294)의 CDR-H1, WINTKTGEATYVEEFKG(서열 번호 295)의 CDR-H2, WDFAYYVEAMDY(서열 번호 296)의 CDR-H3, KASAAVGTYVA(서열 번호 299)의 CDR-L1, SASYRKR의 CDR-L2 및 HQYYTYPLFT(서열 번호 302)의 CDR-L3을 포함한다. 일부 실시형태에서, CEA 결합 도메인은 EFGMN(서열 번호 294)의 CDR-H1, WINTKTGEATYVEEFKG(서열 번호 295)의 CDR-H2, WDFAHYFQTMDY(서열 번호 297)의 CDR-H3, KASAAVGTYVA(서열 번호 299)의 CDR-L1, SASYRKR의 CDR-L2 및 HQYYTYPLFT(서열 번호 302)의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 CEA 또는 이의 펩타이드 항원이고, 활성인자 수용체는 CEA CAR이다. 일부 실시형태에서, CEA CAR은 서열 번호 288, 서열 번호 290 또는 서열 번호 292와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CEA CAR은 서열 번호 288, 서열 번호 290 또는 서열 번호 292를 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CEA CAR은 서열 번호 289, 서열 번호 291 또는 서열 번호 293을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, CEA CAR은 서열 번호 289, 서열 번호 291 또는 서열 번호 293과 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 EGFR 또는 이의 펩타이드 항원이고, 활성인자 리간드 결합 도메인은 EGFR 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 ScFv 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118 또는 서열 번호 391의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118 또는 서열 번호 391과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117 또는 서열 번호 119를 포함하는 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117 또는 서열 번호 119의 서열과 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 EGFR 또는 이의 펩타이드 항원이고, 활성인자 리간드 결합 도메인은 EGFR 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 결합 도메인은 표 2에 개시된 군으로부터 선택된 VH 및/또는 VL 도메인, 또는 이것과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128 및 서열 번호 130으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128 및 서열 번호 130 또는 이들과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129 및 서열 번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129 및 서열 번호 131 또는 이들과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함한다.
Figure pct00006
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 EGFR 또는 이의 펩타이드 항원이고, 활성인자 리간드 결합 도메인은 EGFR 리간드 결합 도메인이다. 일부 실시형태에서, EGFR 결합 도메인은 표 3에 개시된 CDR의 군으로부터 선택된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 표 3에 개시된 CDR과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 131 내지 서열 번호 166으로부터 선택된 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 132 내지 서열 번호 137로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR 1(CDR H1)을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 138 내지 서열 번호 143으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR 2(CDR H2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 144 내지 서열 번호 149로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR 3(CDR H3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 150 내지 서열 번호 155로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR 1(CDR L1)을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 156 내지 서열 번호 160으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR 2(CDR L2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 161 내지 서열 번호 166으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR 3(CDR L3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, EGFR 리간드 결합 도메인은 서열 번호 132 내지 서열 번호 137로부터 선택된 CDR H1, 서열 번호 138 내지 서열 번호 143으로부터 선택된 CDR H2, 서열 번호 144 내지 서열 번호 149로부터 선택된 CDR H3, 서열 번호 150 내지 서열 번호 155로부터 선택된 CDR L1, 서열 번호 156 내지 서열 번호 160으로부터 선택된 CDR L2 및 서열 번호 156 내지 서열 번호 160으로부터 선택된 CDR L3을 포함한다.
Figure pct00007
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 pan-HLA 리간드이고, 활성인자 결합 도메인은 pan-HLA 결합 도메인, 즉 HLA A, HLA B 및 HLA C 유전자좌의 산물 중에서 공유된 항원 결정인자에 결합하고 이를 인식하는 결합 도메인이다. 당해 분야에 공지되거나 본원에 개시된 다양한 단일 가변 도메인은 실시형태에 사용하기에 적합하다. 이러한 scFv는 예를 들어 제한 없이 하기 마우스 및 인간화된 pan-HLA scFv 항체를 포함한다. 예시적인 pan-HLA 리간드는 HLA 클래스 I 알파3 및 알파2 도메인과 반응하는 구성적 에피토프를 인식하는 W6/32이다.
Figure pct00008
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 pan-HLA 리간드이고, 활성인자 리간드 결합 도메인은 pan-HLA 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, pan-HLA 리간드 결합 도메인은 ScFv 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, pan-HLA 리간드 결합 도메인은 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175 또는 서열 번호 177의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, pan-HLA 리간드 결합 도메인은 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175 또는 서열 번호 177과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, pan-HLA 리간드 결합 도메인은 서열 번호 168, 서열 번호 170, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 176 또는 서열 번호 178을 포함하는 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, pan-HLA 리간드 결합 도메인은 서열 번호 168, 서열 번호 170, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 176 또는 서열 번호 178의 서열과 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 CD19 분자(CD19) 또는 이의 펩타이드 항원이고, 활성인자 리간드 결합 도메인은 CD19 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD19 리간드 결합 도메인은 ScFv 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD19 리간드 결합 도메인은 서열 번호 275 또는 서열 번호 277과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD-19 리간드 결합 도메인은 서열 번호 275 또는 서열 번호 277의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD19 리간드 결합 도메인은 서열 번호 276 또는 서열 번호 278을 포함하는 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, CD19 리간드 결합 도메인은 서열 번호 276 또는 서열 번호 278의 서열과 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 활성인자 리간드는 CD19 분자(CD19) 또는 이의 펩타이드 항원이고, 활성인자 수용체는 CAR이다. 일부 실시형태에서, CD19 CAR은 서열 번호 279 또는 서열 번호 281과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD19 CAR은 서열 번호 279 또는 서열 번호 281을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD19 CAR은 서열 번호 280 또는 서열 번호 390의 서열과 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, CD19 CAR은 서열 번호 280 또는 서열 번호 390을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 서열에 의해 암호화된다. 제1 수용체에 대한 제1의, 활성인자 리간드 결합 도메인이 비제한적인 예로서 분야 인정된 T 세포 수용체, 키메라 항원 수용체 및 항체 결합 도메인을 포함하는 당해 분야에 공지된 임의의 원천으로부터 단리되거나 유래될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 제1 리간드 결합 도메인은 표 5에 개시된 임의의 항체로부터 유래되고, 표 5에 기재된 항원으로부터 선택된 제1 리간드에 결합할 수 있다. 따라서, 기재된 2개의 수용체 시스템을 포함하는 면역 세포는 표 5에 기재된 임의의 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 암을 치료하기 위한 적절한 제1의, 활성인자 수용체 리간드 결합 도메인의 선택은 당업자에게 자명할 것이다.
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억제제
본 개시내용은 제2 리간드, 억제제, 및 억제제 리간드에 결합하는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 조작된 수용체를 제공한다.
본 개시내용은 세포외 영역을 포함하는 제2 조작된 수용체를 제공하고, 세포외 영역은 제1 수용체 및 제2 수용체를 발현하는 효과기 세포의 활성화를 억제하는 제2 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하고, 효과기 세포는 제1 조작된 수용체에 대한 제1 리간드의 결합에 의해 활성화된다.
본원에 사용된 것과 같이 "차단제"라고 때때로 칭하는 "억제제" 또는 "억제제 리간드"는 본 개시내용의 조작된 수용체의 제2의, 리간드 결합 도메인(억제제 LBD)에 결합하지만, 조작된 수용체를 발현하는 면역 세포의 활성화를 억제하는 제2 리간드를 지칭한다. 억제제는 표적 세포에 의해 발현되지 않는다. 억제제 리간드는 활성인자 리간드를 발현하는 정상인 비표적 세포를 포함하는 복수의 정상인 비표적 세포에서 또한 발현되어서 입양 세포 치료의 세포독성 효과로부터 이 세포를 보호한다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 억제제 리간드는 다양한 기전을 통해 효과기 세포의 활성화를 차단할 수 있다. 예를 들어, 억제제 LBD에 대한 억제제 리간드의 결합은 억제제의 부재 하에 본원에 기재된 조작된 수용체를 발현하는 면역 세포의 활성화로 어이지는 활성인자 LBD에 대한 활성인자 리간드의 결합 시 발생하는 신호의 전송을 차단할 수 있다.
대안적으로 또는 게다가, 제2 조작된 수용체에 대한 억제제 리간드의 결합은 본원에 기재된 2개의 수용체 시스템을 포함하는 면역 세포의 표면으로부터 제1의, 활성인자 수용체의 세포 표면 발현의 소실을 야기할 수 있다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 정상 세포에 대한 활성인자 및 억제제 리간드의 면역 세포 관여가 억제제 수용체가 면역 세포 표면으로부터 근처의 활성인자 수용체 분자를 제거하게 하도록 야기한다고 생각된다. 이 과정은 면역 세포를 국소로 탈감작시켜서, 이의 활성화 한계치를 가역적으로 상승시킨다. 표적 세포에서 오직 활성인자 리간드를 관여시키는 면역 세포는 제2의, 억제 수용체로부터의 신호에 의해 방해받지 않는 국소 활성화 신호를 야기한다. 이 국소 활성화는 세포독성 과립의 방출이 표적 세포 선택적 세포사로 이어질 때까지 증가한다. 그러나, 표면 수용체 발현 수준의 조절은 차단제 수용체가 제1 활성인자 수용체에 의해 면역 세포의 활성화를 억제하는 유일한 기전이 아닐 수 있다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 비제한적인 예로서 활성인자와 차단제 수용체 신호전달 경로 사이의 혼선을 포함하는 다른 기전이 작동할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 리간드는 표적 세포에 의해 발현되지 않고, 비표적 세포에 의해 발현된다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포이고, 비표적 세포는 비암성 세포이다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드 결합 도메인은 ScFv 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드 결합 도메인은 Vβ 단독 리간드 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드 결합 도메인은 T 세포 수용체(TCR)로부터 단리되거나 유래된 항원 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 제2의, 억제제 리간드 결합 도메인은 TCR α 및 β 사슬 가변 도메인을 포함한다.
억제제 표적
일부 실시형태에서, 억제제 리간드는 조직에 걸친 높은 균질한 표면 발현을 갖는 유전자 또는 이의 펩타이드 항원을 포함한다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 조직에 걸친 높은 균질한 표면 발현은 억제제 리간드가 큰 고른 억제 신호를 전달하게 한다. 대안적으로 또는 게다가, 활성인자 및 억제제 표적의 발현은 상관될 수 있고, 즉 2개는 비표적 세포에서 유사한 수준으로 발현된다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 펩타이드 리간드이다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 주요 조직적합성(MHC) 클래스 I 복합체(펩타이드 MHC 또는 pMHC)와 복합체화된 펩타이드 항원이다. 임의의 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C를 포함하는 pMHC와 복합체화된 펩타이드 항원을 포함하는 억제제 리간드는 본 개시내용의 범위 내로서 고안된다.
일부 실시형태에서, 억제제 리간드는 항원에서 부재하거나 다형성인 유전자에 의해 암호화된다.
표적 세포와 비표적 세포 사이의 억제제 리간드의 차등 발현을 구별하는 방법은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 예를 들어, 비표적 세포 및 표적 세포에서의 억제제 리간드의 존재 또는 부재는 억제제 리간드에 결합하는 항체에 의한 면역조직화학에 의해 분석될 수 있고, 이후에 억제제 리간드의 게놈 유전자좌가 표적 세포 또는 비표적 세포에서 돌연변이를 포함하는지를 결정하기 위해 현미경검사 또는 FACS, 표적 세포 및 비표적 세포의 RNA 발현 프로파일링, 또는 비표적 세포 및 표적 세포의 DNA 시퀀싱이 이어진다.
이형접합성 소실(LOH)로 인해 소실된 대립유전자
1차 종양에서의 동형접합성 결실은 희귀하고 작고, 따라서 표적 B 후보를 생성하지 않을 것이다. 예를 들어, 21개의 인간 암 유형에 걸친 2218개의 1차 종양의 분석에서, 상위 4개의 후보는 사이클린 의존적 키나제 억제제 2A(CDKN2A), RB 전사 동시억제인자 1(RB1), 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN) 및 N3PB2였다. 그러나, CDKN2A(P16)는 모든 암에 걸쳐 불과 5% 동형접합성 결실로 결실되었다. 동형접합성 HLA-A 결실은 암의 0.2% 미만에서 발견되었다(Cheng 등, Nature Comm. 8:1221 (2017)). 이와 반대로, 반접합성 소실로 인한 암 세포에서의 유전자의 단일 카피의 결실은 훨씬 더 흔히 발생한다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 이형접합성 소실로 인해 표적 세포에서 소실된 유전자의 대립유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포를 포함한다. 암 세포는 중복 및 결실을 포함하는 빈번한 게놈 재배열을 겼는다. 이 결실은 암 세포에서의 하나 이상의 유전자의 하나의 카피의 결실로 이어질 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "이형접합성 소실(LOH)"은 암에서 높은 빈도로 발생하는 유전 변화를 지칭하고, 이에 의해 2개의 대립유전자 중 하나가 결실되어서, 단일의 모노-대립유전자(반접합성) 유전자좌를 남긴다.
HLA 클래스 I 대립유전자
일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 HLA 클래스 I 대립유전자를 포함한다. 주요 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I은 면역계의 세포에 항원을 디스플레이하여 면역 반응을 촉발하는 단백질 복합체이다. MHC 클래스 I에 상응하는 인간 백혈구 항원(HLA)은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C이다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 HLA 클래스 I 대립유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 LOH를 통해 표적 세포에서 소실된 HLA 클래스 I의 대립유전자를 포함한다. HLA-A는 HLA-A 유전자좌에 의해 암호화된 주요 조직적합 복합체(MHC)의 인간 백혈구 항원(HLA)의 그룹이다. HLA-A는 인간 MHC 클래스 I 세포 표면 수용체의 3개의 주요 유형 중 하나이다. 수용체는 중 α 사슬 및 더 작은 β 사슬을 포함하는 이종이합체이다. α 사슬은 HLA-A의 변이체에 의해 암호화되지만, β 사슬(β2-마이크로글로불린)은 비변이체이다. 수천개의 HLA-A 변이체가 있고, 이들 모두는 본 개시내용의 범위 내에 해당한다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 HLA-B 대립유전자를 포함한다. HLA-B 유전자는 많은 가능한 변이(대립유전자)를 갖는다. HLA-B 유전자의 백개의 버전(대립유전자)이 공지되어 있고, 이들의 각각은 특정 숫자(예컨대, HLA-B27)가 주어진다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 HLA-C 대립유전자를 포함한다. HLA-C는 HLA 클래스 I 중쇄 파랄로그에 속한다. 이 클래스 I 분자는 중쇄 및 경쇄(베타-2 마이크로글로불린)로 이루어진 이종이합체이다. 100개 초과의 HLA-C 대립유전자가 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, HLA 클래스 I 대립유전자는 넓은 또는 편재한 RNA 발현을 갖는다.
일부 실시형태에서, HLA 클래스 I 대립유전자는 공지된 또는 일반적으로 높은 소수의 대립유전자 빈도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 예를 들어 HLA 클래스 I 대립유전자가 pan-HLA 리간드 결합 도메인에 의해 인식될 때 HLA 클래스 I 대립유전자는 펩타이드-MHC 항원을 요하지 않는다.
일부 실시형태에서, 제2 억제제 리간드는 HLA-A 대립유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, HLA-A 대립유전자는 HLA-A*02를 포함한다. HLA-A*02에 결합하고 이를 인식하는 당해 분야에 공지되거나 본원에 개시된 다양한 단일 가변 도메인은 실시형태에 사용하기에 적합하다. 이러한 scFv는 예를 들어 및 제한 없이 하기 표 6에 도시된 펩타이드 독립적 방식으로 HLA-A*02에 결합하는 하기 마우스 및 인간화된 scFv 항체를 포함한다(상보성 결정 영역 밑줄 표시):
Figure pct00014
Figure pct00015
HLA-A*02 리간드 결합 도메인에 대한 예시적인 중쇄 및 경쇄 CDR(각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 또는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)은 하기 표 7에 기재되어 있다.
Figure pct00016
일부 실시형태에서, scFv는 서열 번호 41 내지 서열 번호 52 중 어느 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 실시형태에서, scFv는 서열 번호 41 내지 서열 번호 52 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, scFv는 서열 번호 41 내지 서열 번호 52 중 어느 하나와 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체의 중쇄는 서열 번호 53 내지 서열 번호 64 중 어느 하나의 중쇄 CDR을 포함하고, 항체의 경쇄는 서열 번호 53 내지 서열 번호 64 중 어느 하나의 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체의 중쇄는 서열 번호 53 내지 서열 번호 64 중 어느 하나의 중쇄 부분과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하고, 항체의 경쇄는 서열 번호 53 내지 서열 번호 64 중 어느 하나의 경쇄 부분과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체의 중쇄는 서열 번호 53 내지 서열 번호 64 중 어느 하나의 중쇄 부분과 동일한 서열을 포함하고, 항체의 경쇄는 서열 번호 53 내지 서열 번호 64 중 어느 하나의 경쇄 부분과 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, ScFv는 서열 번호 53 내지 서열 번호 64 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제 리간드는 HLA-A*02이고, 억제 리간드 결합 도메인은 HLA-A*02 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 리간드 결합 도메인은 HLA-A*02를 포함하는 pMHC 복합체에서 펩타이드와 독립적인 HLA-A*02에 결합한다. 일부 실시형태에서, HLA-A*02 리간드 결합 도메인은 ScFv 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, HLA-A*02 리간드 결합 도메인은 서열 번호 53 내지 서열 번호 64 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, HLA-A*02 리간드 결합 도메인은 서열 번호 53 내지 서열 번호 64 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, HLA-A*02 리간드 결합 도메인은 서열 번호 179 내지 서열 번호 190 중 어느 하나를 포함하는 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, HLA-A*02 리간드 결합 도메인은 서열 번호 179 내지 서열 번호 190 중 어느 하나의 서열과 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화된다.
부 조직접합 항원
일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 부 조직접합 항원(MiHA)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 LOH를 통해 표적 세포에서 소실된 MiHA의 대립유전자를 포함한다.
MiHA는 대립유전자 사이의 비동의 차이를 함유하는 단백질로부터 유래된 펩타이드이고, 흔한 HLA 대립유전자에 의해 디스플레이된다. 비동의 차이는 MiHA를 암호화하는 유전자의 코딩 서열에서 SNP, 결실, 프레임쉬프트 돌연변이 또는 삽입으로부터 생길 수 있다. 예시적인 MiHA는 약 9개 내지 12개의 아미노산 길이일 수 있고, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 단백질에 결합할 수 있다. MiHA를 디스플레이하는 MHC 복합체에 대한 TCR의 결합은 T 세포를 활성화할 수 있다. MiHA의 유전적 특성 및 면역학적 특성은 당업자에게 잘 공지될 것이다. 후보 MiHA는 공지된 HLA 클래스 I 대립유전자에 의해 제시된 공지된 펩타이드이고, 임상에서(예를 들어, 이식편 대 숙주 질환 또는 이식물 거부에서) T 세포 반응을 이끌어내는 것으로 공지되어 있고, 단순한 SNP 유전자형분석에 의해 환자 선택이 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, MiHA는 넓은 또는 편재한 RNA 발현을 갖는다.
일부 실시형태에서, MiHA는 높은 소수 대립유전자 빈도를 갖는다.
일부 실시형태에서, MiHA는 Y 염색체 유전자로부터 유래된 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 억제제 리간드는 표 8 및 표 9에 개시된 MiHA의 군으로부터 선택된 MiHA를 포함한다.
본 발명의 범위 내로서 고려되는 MiHA의 예시적이지만 비제한적인 예는 하기 표 8에 개시되어 있다. 표 8에서의 칼럼은 왼쪽에서 오른쪽으로 MiHA의 명칭, 이것이 유래된 유전자, MiHA를 디스플레이할 수 있는 MHC 클래스 I 변이체 및 펩타이드 변이체의 서열[괄호에 표시된 A/B 변이체)을 나타낸다.
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
본 발명의 범위 내로서 고려되는 MiHA의 예시적이지만 비제한적인 예는 하기 표 9에 개시되어 있다. 표 9에서의 칼럼은 왼쪽에서 오른쪽으로 MiHA의 명칭, 이것이 유래된 유전자, MiHA를 디스플레이할 수 있는 MHC 클래스 I 변이체 및 펩타이드 변이체의 서열[괄호에 표시된 A/B 변이체)을 나타낸다.
Figure pct00022
일부 실시형태에서, MiHA는 HA-1을 포함한다. HA-1은 VL[H/R]DDLLEA(서열 번호 273)의 서열을 갖는 펩타이드 항원이고, Rho GTPase 활성화 단백질 45 (HA-1) 유전자로부터 유래된다.
HA-1 변이체 H 펩타이드(VLHDDLLEA(서열 번호 191))에 선택적으로 결합하는 예시적인 리간드 결합 도메인은 하기 표 10에 기재되어 있다. 서열 번호 193에서의 TCR 알파 및 TCR 베타 서열은 N 말단 GSG 링커를 갖는 서열 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열 번호 192)의 P2A 자가 절단 폴리펩타이드에 의해 분리된다.
Figure pct00023
일부 실시형태에서, 제2의, 억제 리간드는 HA-1(H)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제 리간드 결합은 TCR로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제 리간드 결합 도메인은 TCR 알파 및 TCR 베타 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCR 알파 및 TCR 베타 가변 도메인은 자가 절단 폴리펩타이드 서열에 의해 분리된다. 일부 실시형태에서, 자가 절단 폴리펩타이드 서열에 의해 분리된 TCR 알파 및 TCR 베타 가변 도메인은 서열 번호 193을 포함한다. 일부 실시형태에서, 자가 절단 폴리펩타이드 서열에 의해 분리된 TCR 알파 및 TCR 베타 가변 도메인은 서열 번호 193, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCR 알파 및 TCR 베타 가변 도메인은 서열 번호 194의 서열, 또는 이것과 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, TCR 알파 가변 도메인은 서열 번호 199 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCR 베타 가변 도메인은 서열 번호 200 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
Y 염색체 항원의 소실
일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 Y 염색체 유전자, 즉 Y 염색체에서의 유전자에 의해 암호화된 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 리간드는 Y 염색체 소실(LoY)을 통해 표적 세포에서 소실된 Y 염색체 유전자에 의해 암호화된 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 규명된 MiHA의 약 1/3은 Y 염색체로부터 생긴다. Y 염색체는 200개가 넘는 단백질 코딩 유전자를 함유하고, 이들의 모두는 본 개시내용의 범위 내로서 고안된다.
본원에 사용된 것과 같이, "Y 소실" 또는 "LoY"는 종양에서 높은 빈도로 발생하여서 Y 염색체의 일부 또는 전부의 하나의 카피가 결실되어서 Y 염색체 암호화된 유전자(들)를 소실시키는 유전 변경을 지칭한다.
염색체 소실은 소정의 암에서 생기는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 신장 투명 세포 암에서 Y 염색체의 40% 체세포 소실이 보고되었다(Arseneault 등, Sci. Rep. 7: 44876 (2017)). 유사하게, 남성 유방암 대상체에서 Y 염색체의 클론 소실은 31명 중 5명에서 보고되었다(Wong 등, Oncotarget 6(42):44927-40 (2015)). 남성 환자로부터의 종양에서의 Y 염색체 소실은 두경부암 환자의 "일관된 특징"으로 기재된다(el-Naggar 등, Am J Clin Pathol 105(1):102-8 (1996)). 추가로, Y 염색체 소실은 위암을 갖는 7명의 남성 환자 중 4명에서 X 염색체 이염색체성과 연관된다(Saal 등, Virchows Arch B Cell Pathol (1993)). 이와 같이, Y 염색체 유전자는 다양한 암에서 소실될 수 있고, 암 세포를 표적화하는 본 개시내용의 조작된 수용체를 갖는 억제제 리간드로서 사용될 수 있다.
항원 결합 도메인
본 개시내용은 제1 조작된 수용체를 활성화하여서 제1 조작된 수용체를 발현하는 면역 세포를 활성화하는 제1 리간드 결합 도메인, 및 제1 리간드에 결합된 제1 조작된 수용체의 존재 하에서도 제2 조작된 수용체를 발현하는 면역 세포의 활성화를 억제하는 제2 조작된 수용체를 활성화하는 제2 리간드 결합 도메인을 제공한다.
리간드 의존적 방식으로 수용체의 활성을 조절할 수 있는 리간드 결합 도메인의 임의의 유형은 본 개시내용의 범위 내로서 고안된다. 일부 실시형태에서, 리간드 결합 도메인은 항원 결합 도메인이다. 예시적인 항원 결합 도메인은 특히 ScFv, SdAb, Vβ 단독 도메인, 및 TCR α 및 β 사슬 가변 도메인으로부터 유래된 TCR 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 LBD는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 LBD는 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인의 임의의 유형은 본 개시내용의 범위 내로서 고안된다.
예를 들어, 제1의, 활성인자 LBD 및/또는 제2의, 억제제 LBD는 쥣과 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체로부터 유래된 예를 들어 단일 도메인 항체 단편(sdAb) 또는 중쇄 항체 HCAb, 단일 사슬 항체(scFv)를 포함하는 인접한 폴리펩타이드 사슬의 일부로서 발현될 수 있는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다(Harlow 등, 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; Harlow 등, 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird 등, 1988, Science 242:423-426). 일부 양태에서, 제1의, 활성인자 LBD 및/또는 제2의, 억제제 LBD는 항체 단편을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 추가의 양태에서, 활성인자 LBD는 scFv 또는 sdAb를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 추가의 양태에서, 억제제 LBD는 scFv 또는 sdAb를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "항체"라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 항체는 다중클론 또는 단일클론 기원의 온전한 면역글로불린, 또는 이의 단편일 수 있고, 자연으로부터 또는 재조합 원천으로부터 유래될 수 있다.
"항체 단편" 또는 "항체 결합 도메인"이라는 용어는 항원 결합 도메인을 함유하는 항체 또는 이의 재조합 변이체의 적어도 하나의 부분, 즉 항원 및 이의 한정된 에피토프와 같은 표적에 대한 항체 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하기에 충분한 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 단일-사슬 (sc)Fv("scFv") 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체("sdAb"로 축약됨)(VL 또는 VH 중 어느 하나), 낙타 VHH 도메인, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"scFv"라는 용어는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 짧은 가요성 폴리펩타이드 링커를 통해 인접하여 연결되고, 단일 폴리펩타이드 사슬로서 발현될 수 있고, scFv는 이것이 유래된 온전한 항체의 특이성을 보유한다.
항체와 관련하여 "중쇄 가변 영역" 또는 "VH"(또는 단일 도메인 항체, 예를 들어 나노바디의 경우에는, "VHH")는 프레임워크 영역으로 공지된 플랭킹 스트레치 사이에 끼워진 3개의 CDR을 함유하는 중쇄의 단편을 지칭하고, 이 프레임워크 영역은 CDR보다 일반적으로 더 고도로 보존되고, CDR을 지지하도록 스캐폴드를 형성한다.
달리 기술되지 않는 한, 본원에 사용된 것과 같이 scFv는 어느 한 순서로, 예를 들어 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단 끝과 관련하여 VL 가변 영역 및 VH 가변 영역을 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
"항체 경쇄"라는 용어는 이의 자연 발생 구성에서 항체 분자로 존재하는 폴리펩타이드 사슬의 2개의 유형 중 더 적은 것을 지칭한다. 카파("K") 및 람다("λ") 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
"재조합 항체"라는 용어는 예를 들어 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 지칭한다. 상기 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 명시하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하도록 해석되어야 하고, 당해 분야에서 이용 가능하고 잘 공지된 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 DNA 또는 아미노산 서열이 얻어졌다.
"Vβ 도메인", "Vβ 단독 도메인", "β 사슬 가변 도메인" 또는 "단일 가변 도메인 TCR(svd-TCR)"이라는 용어는 제2 TCR 가변 도메인의 부재 하에 항원에 특이적으로 결합하는 단일 T 세포 수용체(TCR) 베타 가변 도메인으로 본질적으로 이루어진 항원 결합 도메인을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 LBD는 Vβ 단독 도메인을 포함하거나 본질적으로 이것으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제제 LBD는 Vβ 단독 도메인을 포함하거나 본질적으로 이것으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, Vβ 단독 도메인은 추가 아미노산 서열, 추가 단백질 도메인(TCR 가변 도메인과 공유 회합된, 비공유 회합된 또는 공유로 회합되고 비공유로 회합된), TCR 가변 도메인과 다른 유형의 거대분자(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 폴리사카라이드, 지질, 또는 이들의 조합)의 융합 또는 비공유 회합, TCR 가변 도메인과 하나 이상의 소분자, 화합물 또는 리간드의 융합 또는 비공유 회합, 또는 이들의 조합을 포함하는 TCR 가변 도메인 이외의 추가 요소를 포함할 수 있다. 기재된 것과 같은 임의의 추가 요소는 조합될 수 있고, 단 TCR 가변 도메인은 제2 TCR 가변 도메인의 부재 하에 에피토프에 특이적으로 결합하도록 구성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 Vβ 단독 도메인은 Vα 분절이 결여된 사슬과 독립적으로 기능한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 하나 이상의 Vβ 단독 도메인은 항원에 반응하여 T 세포를 활성화할 수 있는 막관통(예를 들어, CD3ζ 및 CD28) 및 세포내 도메인 단백질(예를 들어, CD3ζ, CD28, 및/또는 4-1BB)에 융합된다.
일부 실시형태에서, Vβ 단독 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)을 사용하여 항원을 관여시킨다. 각각의 Vβ 단독 도메인은 3개의 보체 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다.
일부 실시형태에서, 제1 Vβ 단독 도메인은 TCR Vβ 도메인 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
인간에서, α 사슬 및 γ 사슬의 TCR 가변 영역은 각각 V 분절 및 J 분절에 의해 암호화되는 반면, β 사슬 및 δ 사슬의 가변 영역은 각각 추가로 D 분절에 의해 암호화된다. 다수의 가변(V) 유전자 분절, 다양성(D) 유전자 분절 및 연결(J) 유전자 분절(예를 들어, 52개의 Vβ 유전자 분절, 2개의 Dβ 유전자 분절 및 13개의 Jβ 유전자 분절)(Janeway 등 (eds.), 2001, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th Edition, New York, Figure 4.13)이 있고, 이는 V, D 및 J 유전자 분절의 코딩 서열에 인접한 재조합 신호 서열(RSS)을 인식하는 효소 RAG-1 및 RAG-2를 사용하여 상이한 V(D)J 배열에서 재조합될 수 있다. RSS는 12 또는 23 bp의 스페이서에 의해 분리된 보존된 7합체 및 9합체로 이루어진다. RSS은 각각의 V 분절의 3' 측면에서, 각각의 D 분절의 5' 측면과 3' 측면 둘 다에서 그리고 각각의 J 분절의 5'에서 발견된다. 재조합 동안, RAG-1 및 RAG-2는 조인트(코딩 조인트)의 코딩 말단에서의 DNA 헤어핀의 형성 및 RSS 및 이들 사이의 중재 서열(신호 조인트)의 제거를 야기한다. 가변 영역은 코딩 말단 뉴클레오타이드의 가변 수에 의한 결실, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전환효소(TdT)에 의한 뉴클레오타이드의 랜덤 첨가, 및 비대칭적으로 절단된 코딩 헤어핀의 주형 매개 충전으로 인해 생긴 회귀성 뉴클레오타이드에 의해 연접부에서 추가로 다양화된다.
특허 출원 WO 2009/129247호(본원에서 그 전체가 참고로 포함됨)는 시험관내 신생 항체를 생성하기 위해 V(D)J 재조합을 사용하는 HuTarg 시스템이라 칭하는 시험관내 시스템을 개시한다. TCR-특이적 V 요소, D 요소 및 J 요소를 사용함으로써 이 동일한 시스템은 특허 출원 WO 2017/091905호(본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에서처럼 Vβ 단독 도메인의 가변 영역을 생성하도록 사용되었다. 자연 생체내 시스템에서, CDR1 및 CDR2를 암호화하는 핵산 서열은 V(α, β, γ 또는 δ) 유전자 분절 내에 함유되고, CDR3을 암호화하는 서열은, TdT 및 다른 재조합 및 DNA 보수 효소의 작용으로 인해 V-J 및 V-D-J 재조합 연접부에서 뉴클레오타이드의 랜덤 삽입 및 결실을 갖긴 하지만, (Vα 또는 V γ에 대해서는) V 분절 및 J 분절의 일부 또는 V 분절의 일부, 전체 D 분절 및 (Vβ 또는 Vδ에 대해서는) J 분절의 일부로부터 제조된다. 이로부터 발현된 생성된 T 세포 수용체가 하는 것처럼(즉, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4), 재조합된 T- 세포 수용체 유전자는 교대 프레임워크(FR) 및 CDR 서열을 포함한다. 시험관내 V(D)J 재조합(즉, V-J 또는 V-D-J 재조합)을 사용하여, 무작위화된 삽입 및 결실은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3(즉, 바로 CDR3이 아님)에서 또는 이에 인접하게 첨가될 수 있고, 추가 삽입은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 전에 및/또는 후에 재조합 기질에서 플랭킹 서열을 사용하여 첨가될 수 있고, 추가 결실은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에서 또는 이에 인접하게 재조합 기질에서 서열을 결실시킴으로써 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, TCR Vβ 사슬의 부재에서 에피토프에 특이적으로 결합하는 TCR Vα 사슬이 확인되었다. TCR Vα 사슬의 부재 하에 에피토프에 결합하는 예시적인 CDR3 아미노산 서열은 하기 표 11에 열거되어 있다.
Figure pct00024
일부 실시형태에서, Vβ 단독 도메인은 제2 TCR 가변 도메인의 부재 하에 에피토프에 특이적으로 결합하고, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 영역에 의해 한정된 가변 도메인을 플랭킹하는 (임의의 길이 또는 서열의) 선택적인 N 말단 및/또는 C 말단 아미노산 서열로 이루어진다. FR1, FR2, FR3 및 FR4는 자연 Vα, Vβ, Vγ 또는 Vδ 도메인으로부터 얻어지거나, 자연 Vα, Vβ, Vγ 또는 Vδ 유전자 분절에 의해 암호화될 수 있지만, 선택적으로 독립적으로 FR1의 C 말단, FR2의 N 말단, FR2의 C 말단, FR3의 N 말단, FR3의 C 말단 및 FR4의 N 말단 중 하나 이상에서 (예를 들어, 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 5개 초과의 아미노산) 아미노산의 결실 또는 삽입을 포함한다. CDR1, CDR2 및 CDR3은 자연 Vα, Vβ, Vγ 또는 Vδ 도메인으로부터 얻어지거나, 자연 Vα, Vβ, Vγ 또는 Vδ 유전자 분절에 의해 암호화될 수 있지만, CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상은 독립적으로 C 말단, N 말단 또는 CDR 서열 내의 어느 곳에서 삽입(예를 들어, 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 초과의 아미노산) 및/또는 결실(예를 들어, 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 5개 초과의 아미노산)을 함유한다. 일부 실시형태에서, CDR1은 N 말단으로, C 말단으로 또는 내부로 아미노산의 삽입 또는 결실을 함유하고, 자연 CDR 아미노산 잔기의 적어도 50%(또는 선택적으로 60%, 70% 또는 80%)가 보유된다. 일부 실시형태에서, CDR2는 N 말단으로, C 말단으로 또는 내부로 아미노산의 삽입 또는 결실을 함유하고, 자연 CDR 아미노산 잔기의 적어도 50%(또는 선택적으로 60%, 70% 또는 80%)가 보유된다. 일부 실시형태에서, CDR3은 N 말단으로, C 말단으로 또는 내부로 아미노산의 삽입 또는 결실을 함유하고, 자연 CDR 아미노산 잔기의 적어도 50%(또는 선택적으로 60%, 70% 또는 80%)가 보유된다. 삽입 및/또는 결실은 시험관내 V(D)J 재조합 방법의 결과로서 또는 TdT 및 재조합 및 DNA 보수 효소(예를 들어, 아르테미스 뉴클레아제(Artemis nuclease), NDA 의존적 단백질 키나제(DNA-PK: NDA-dependent protein kinase), X선 보수 교차-보완 단백질 4(XRCC4: X-ray repair cross-complementing protein 4), DNA 분해효소 IV, 비상동성 말단 연결 인자 1(NHEJ1: non-homologous end-joining factor 1), PAXX, 및 DNA 중합효소 λ 및 μ 중 하나 이상)의 시험관내 작용으로부터 제조될 수 있다. (치환을 포함하는) 삽입 및/또는 결실은 추가로 시험관내 V(D)J 재조합 기질의 CDR 핵산 서열에 대한 삽입 및/또는 결실로부터 생길 수 있다. Vβ 단독 도메인은 TCR 불변 영역 또는 이의 부분을 추가로 포함할 수 있다. Vβ 단독 도메인은 추가의 단백질 도메인에 융합되고/되거나 이와 복합체화될 수 있다. DNA에서의 이중 가닥 파괴는 상기 재조합 및 DNA 보수 효소의 시험관내 사용 전에 도입될 수 있다. Vβ 단독 도메인은 융합 단백질일 수 있다(또는 이것에 혼입될 수 있다). 본원에 사용된 것과 같이, "융합 단백질"이라는 용어는 이 유전자의 유기체 원천이 동일하거나 상이한지와 무관하게 별개의 유전자로부터의 2개 이상의 코딩 서열의 융합체로 이루어진 적어도 하나의 핵산 코딩 서열에 의해 암호화된 단백질을 의미한다.
일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 LBD는 ScFv 도메인을 포함하고, 제2의, 억제제 LBD는 Vβ 단독 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 LBD는 Vβ 단독 도메인을 포함하고, 제2의, 억제제 LBD는 ScFv 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 LBD 및 제2의, 억제제 LBD 둘 다는 ScFv 도메인이다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 LBD 및 제2의, 억제제 LBD 둘 다는 Vβ 단독 도메인이다.
본 개시내용의 활성인자 및/또는 억제제 수용체와 사용되는 추가 항원 결합 도메인은 하기 표 12에 기재되어 있다. 표 12에서, 작제물의 명칭은 ScFv 억제제 명칭[B]/ScFv 활성인자 명칭[A]으로 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인 또는 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 210, 서열 번호212, 서열 번호 214, 서열 번호216, 서열 번호 218, 서열 번호220, 서열 번호 222 또는 서열 번호224 중 어느 하나의 서열, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
Figure pct00025
Figure pct00026
조작된 수용체
본 개시내용은 본원에 기재된 제1 활성인자 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 조작된 수용체 및 제2 억제제 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 조작된 수용체를 제공한다.
키메라 항원 수용체(CAR)
일부 실시형태에서, 제1 조작된 수용체 또는 제2 조작된 수용체 중 어느 하나는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 실시형태에서, 제1 조작된 수용체 및 제2 조작된 수용체는 키메라 항원 수용체이다. 모든 CAR 구성은 본 개시내용의 범위 내로서 고안된다.
세포외 도메인
일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인 또는 제2 리간드 결합 도메인은 CAR의 세포외 도메인에 융합된다.
힌지 영역
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR은 세포외 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역의 혼입은 CAR-T 세포로부터의 사이토카인 생성에 영향을 미치고, 생체내 CAR-T 세포의 확장을 개선할 수 있다. 예시적인 힌지는 IgD 및 CD8 도메인, 예를 들어 IgG1로부터 단리되거나 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지는 CD8α 또는 CD28로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지는 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열 번호 1)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지는 서열 번호 1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지는 본질적으로 서열 번호 1로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지는 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나,
Figure pct00027
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD8α 힌지는 서열 번호 2에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, CD28 힌지는 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, CTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(서열 번호 3)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, CD28 힌지는 서열 번호 3을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 힌지는 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나,
Figure pct00028
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD28 힌지는 서열 번호 4에 의해 암호화된다.
막관통 도메인
본 개시내용의 CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR에서 도메인 중 하나와 자연적으로 연관된 막관통 도메인이 사용된다. 예를 들어, CD28 공자극 도메인을 포함하는 CAR은 또한 CD28 막관통 도메인을 사용할 수 있다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하도록 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하도록 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
막관통 도메인은 자연 원천 또는 합성 원천 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다. 원천이 자연이면, 도메인은 임의의 막 결합된 단백질 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 막관통 영역은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 또는 면역글로불린, 예컨대 IgG4로부터 단리되거나 유래될 수 있다(즉, 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함함). 대안적으로 막관통 도메인은 합성일 수 있고, 이 경우에 이것은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 함유할 것이다. 일부 실시형태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견될 것이다. 선택적으로, 바람직하게는 2개 내지 10개의 아미노산 길이의 짧은 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커는 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호전달 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블렛은 특히 적합한 링커를 제공한다.
본 개시내용의 CAR의 일부 실시형태에서, CAR은 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(서열 번호 5)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 도메인은 서열 번호 5를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 막관통 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나,
Figure pct00029
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD28 막관통 도메인은 서열 번호 6에 의해 암호화된다.
본 개시내용의 CAR의 일부 실시형태에서, CAR은 IL-2R베타 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R베타 막관통 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI(서열 번호 7)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, IL-2R베타 막관통 도메인은 서열 번호 7을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, IL-2R베타 막관통 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나,
Figure pct00030
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, IL-2R베타 막관통 도메인은 서열 번호 8에 의해 암호화된다.
세포질 도메인
본 발명의 CAR의 세포질 도메인 또는 달리 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 위치한 면역 세포의 정상 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 책임진다. "효과기 기능"이라는 용어는 특수 세포 기능을 지칭한다. 조절 T 세포의 효과기 기능은 예를 들어 효과기 T 세포의 유도 또는 증식의 억제 또는 하항조절을 포함한다. 이와 같이, "세포내 신호전달 도메인"이라는 용어는 효과기 기능 신호를 형질도입하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 보통 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 도메인을 사용는 것이 필요하지 않다. 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분이 사용되는 정도로, 이러한 절두된 부분은 이것이 효과기 기능 신호를 형질도입하는 한 온전한 사슬 대신에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 다수의 세포내 도메인은 본 개시내용의 CAR-T 세포의 원하는 기능을 달성하도록 조합될 수 있다. 세포내 신호전달 도메인이란 용어는 이와 같이 효과기 기능 신호를 형질도입하기에 충분한 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함하도록 의도된다.
본 개시내용의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 관여 후 신호 형질도입을 개시시키도록 협동으로 작용하는 T 세포 수용체(TCR) 및 동시수용체의 세포질 서열뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 CAR의 세포내 도메인은 적어도 하나의 세포질 활성화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 활성화 도메인은 CAR T 세포의 효과기 기능을 활성화하는 데 필요한 T 세포 수용체(TCR) 신호전달이 있다는 것을 보장한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 세포질 활성화는 CD247 분자(CD3ζ) 활성화 도메인, 자극 살해 면역글로불린-유사 수용체(KIR) KIR2DS2 활성화 도메인, 또는 12 kDa의 DNAX-활성화 단백질(DAP12) 활성화 도메인이다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 활성화 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
Figure pct00031
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD3ζ 활성화 도메인은 서열 번호 9를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 활성화 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나,
Figure pct00032
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD3ζ 활성화 도메인은 서열 번호 10에 의해 암호화된다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호가 대개 T 세포의 완전 활성화에 불충분하고 2차 신호 또는 공자극 신호가 또한 필요하다고 공지되어 있다. 이와 같이, T 세포 활성화는 TCR을 통해 항원 의존적 1차 활성화를 개시시키는 것(1차 세포질 신호전달 서열) 및 2차 신호 또는 공자극 신호를 제공하는 항원 독립적 방식으로 작용하는 것(2차 세포질 신호전달 서열)의 세포질 신호전달 서열의 2개의 구별되는 종류에 의해 매개된다고 말해질 수 있다.
1차 세포질 신호전달 서열은 자극 방식 또는 억제 방식 중 어느 하나로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, ITAM은 임의의 2개의 다른 아미노산 (YxxL)(서열 번호 21)에 의해 류신 또는 이소류신으로부터 분리된 티로신을 함유한다.
일부 실시형태에서, 세포질 도메인은 1개, 2개 또는 3개의 ITAM을 함유한다. 일부 실시형태에서, 세포질 도메인은 1개의 ITAM을 함유한다. 일부 실시형태에서, 세포질 도메인은 2개의 ITAM을 함유한다. 일부 실시형태에서, 세포질 도메인은 3개의 ITAM을 함유한다. 일부 실시형태에서, 세포질 도메인은 4개의 ITAM을 함유한다. 일부 실시형태에서, 세포질 도메인은 5개의 ITAM을 함유한다.
일부 실시형태에서, 세포질 도메인은 CD3ζ 활성화 도메인이다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 활성화 도메인은 단일 ITAM을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 활성화 도메인은 2개의 ITAM을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 활성화 도메인은 3개의 ITAM을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 ITAM을 포함하는 CD3ζ 활성화 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR(서열 번호 11)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, CD3ζ 활성화 도메인은 서열 번호 11을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 ITAM을 포함하는 CD3ζ 활성화 도메인은 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR(서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 단일 ITAM을 포함하는 CD3ζ 활성화 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나,
Figure pct00033
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD3ζ 활성화 도메인은 서열 번호 12에 의해 암호화된다.
본 개시내용의 CAR에 사용될 수 있는 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 추가의 예는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 본 발명의 CAR에서의 세포질 신호전달 분자가 CD3ζ로부터 유래된 세포질 신호전달 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
공자극 도메인
일부 실시형태에서, CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인을 홀로 함유하도록 설계되거나 본 개시내용의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ 사슬 부분 및 공자극 도메인을 포함할 수 있다. 공자극 도메인은 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효과적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 이의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 IL-2Rβ, Fc 수용체 감마(FcRγ), Fc 수용체 베타(FcRβ), CD3g 분자 감마(CD3γ), CD3δ, CD3ε, CD5 분자(CD5), CD22 분자(CD22), CD79a 분자(CD79a), CD79b 분자(CD79b), 암배아 항원 관련 세포 부착 분자 3(CD66d), CD27 분자(CD27), CD28 분자(CD28), TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9(4-1BB), TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 4(OX40), TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 8(CD30), CD40 분자(CD40), 예정 세포사1(PD-1), 유도성 T 세포 공자극(ICOS), 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1), CD2 분자(CD2), CD7 분자(CD7), TNF 슈퍼패밀리 구성원 14(LIGHT), 살해 세포 렉틴 유사 수용체 C2(NKG2C) 및 CD276 분자(B7-H3) c-자극 도메인, 또는 이들의 기능적 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 CAR의 세포질 신호전달 부분 내의 세포질 도메인은 랜덤 순서로 또는 규정된 순서로 서로에 연결될 수 있다. 선택적으로, 예를 들어 2개 내지 10개의 아미노산 길이의 짧은 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커는 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블렛은 적합한 링커의 예를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR의 세포내 도메인은 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극 도메인은 CD28로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, CD28 공자극 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
Figure pct00034
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD28 공자극 도메인은 서열 번호 13을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 공자극 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나,
Figure pct00035
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD28 공자극 도메인은 서열 번호 14에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR의 세포내 도메인은 인터류킨-2 수용체 베타-사슬(IL-2R베타 또는 IL-2R-베타) 세포질 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R베타 도메인은 절두된다. 일부 실시형태에서, IL-2R베타 세포질 도메인은 하나 이상의 STAT5-동원 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 IL-2R베타 세포질 도메인 밖의 하나 이상의 STAT5-동원 모티프를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2-R베타 세포내 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
Figure pct00036
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, IL2R-베타 세포내 도메인은 서열 번호 15를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, IL-2R-베타 세포내 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나,
Figure pct00037
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, IL-2R-베타 세포내 도메인은 서열 번호 16에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, IL-2R-베타 세포질 도메인은 하나 이상의 STAT5-동원 모티프를 포함한다. 예시적인 STAT5-동원 모티프는 Passerini 등의 문헌(2008) STAT5-signaling cytokines regulate the expression of FOXP3 in CD4+CD25+ regulatory T cells and CD4+CD25+ effector T cells. International Immunology, Vol. 20, No. 3, pp. 421-431, 및 Kagoya 등의 문헌(2018) A novel chimeric antigen receptor containing a JAK-STAT signaling domain mediates superior antitumor effects. Nature Medicine doi:10.1038/nm.4478에 의해 제공된다.
일부 실시형태에서, STAT5-동원 모티프(들)는 서열 Tyr-Leu-Ser-Leu(서열 번호 17)로 이루어진다.
억제 도메인
일부 실시형태에서, 예를 들어 억제 신호를 제공하는 본 개시내용의 제2 조작된 수용체에서, 억제 신호는 수용체의 세포내 도메인을 통해 전단된다. 일부 실시형태에서, 조작된 수용체는 억제 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조작된 수용체는 억제 세포내 도메인을 포함하는 CAR(억제 CAR)이다.
일부 실시형태에서, 억제 세포내 도메인은 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함한다. 일부 실시형태에서, ITIM을 포함하는 억제 세포내 도메인은 CTLA-4 및 PD-1과 같은 면역 관문 억제제로부터 단리되거나 유래될 수 있다. CTLA-4 및 PD-1은 T 세포의 표면에서 발현된 면역 억제 수용체이고, T 세포 반응을 약화시키거나 종료시키는 데 중추적 역할을 한다.
억제 도메인은 인간 종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL: human tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand) 수용체 및 CD200 수용체 1로부터 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 억제 도메인은 세포내 도메인, 막관통 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 도메인은 세포내 도메인, 막관통 도메인, 힌지 영역 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 도메인은 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함한다. 일부 실시형태에서, ITIM을 포함하는 억제 도메인은 CTLA-4 및 PD-1과 같은 면역 관문 억제제로부터 단리되거나 유래될 수 있다.
억제 도메인은 인간 종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL) 수용체 및 CD200 수용체 1로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제 도메인은 인간 단백질, 예를 들어 인간 TRAIL 수용체, CTLA-4 또는 PD-1 단백질로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, TRAIL 수용체는 TR10A, TR10B 또는 TR10D를 포함한다.
내인성 TRAIL은 혈장 막에 앵커링되고 세포 표면에 제시된 281-아미노산 II형 막관통 단백질로서 발현된다. TRAIL은 자연 살해 세포에 의해 발현되고, 이는 세포-세포 접촉의 확립 후, 표적 세포에서 TRAIL 의존적 아폽토시스를 유도할 수 있다. 생리학적으로, TRAIL 신호전달 시스템은 면역 감시에, T-헬퍼 세포 2에 대한 T-헬퍼 세포 1의 조절뿐만 아니라 "무헬프" CD8+ T 세포 수를 통해 면역계를 형성하기 위해 그리고 자발적인 종양 형성의 억제에 필수적인 것으로 나타났다.
일부 실시형태에서, 억제 도메인은 CD200 수용체로부터 단리되거나 유래된 세포내 도메인을 포함한다. 세포 표면 당단백질 CD200 수용체 1(Uniprot 참조번호: Q8TD46)은 본 발명의 억제 세포내 도메인의 다른 예를 나타낸다. CD200/OX2 세포 표면 당단백질에 대한 이 억제 수용체는 선택된 자극에 반응하여 TNF-알파, 인터페론 및 유도성 산화질소 합성효소(iNOS: inducible nitric oxide synthase)를 포함하는 전염증성 분자의 발현을 억제함으로써 염증을 제한한다.
일부 실시형태에서, 조작된 수용체는 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 2(KIR3DL2), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 3(KIR3DL3), 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B1(LIR1, LIR-1 및 LILRB1이라고도 칭함), 예정 세포사 1(PD-1), Fc 감마 수용체 IIB(FcgRIIB), 살해 세포 렉틴 유사 수용체 K1(NKG2D), 합성 일치 ITIM을 함유하는 CTLA-4, 도메인, ZAP70 SH2 도메인(예를 들어, N 말단 및 C 말단 SH2 도메인의 하나 또는 둘 다) 또는 ZAP70 KI_K369A(키나제 불활성 ZAP70)로부터 단리되거나 유래된 억제 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 억제 도메인은 인간 단백질로부터 단리되거나 유래된다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제 수용체는 동일한 단백질, 예를 들어 ITIM 함유 단백질로부터 단리되거나 유래된 세포질 도메인 및 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제 수용체는 동일한 단백질, 예를 들어 ITIM 함유 단백질로부터 단리되거나 유래된 단리되거나 유래된 세포질 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제 수용체는 세포내 도메인 및/또는 막관통 도메인과 동일한 단백질, 예를 들어 ITIM 함유 단백질로부터 단리되거나 유래된 단리되거나 유래된 힌지 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제 조작된 수용체는 억제 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제 조작된 수용체는 억제 세포내 도메인 및/또는 억제 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조작된 수용체는 억제 도메인을 포함하는 CAR(억제 CAR)이다. 일부 실시형태에서, 억제 세포내 도메인은 CAR의 세포내 도메인에 융합된다. 일부 실시형태에서, 억제 세포내 도메인은 CAR의 막관통 도메인에 융합된다.
T 세포 수용체(TCR)
일부 실시형태에서, 제1 조작된 수용체 또는 제2 조작된 수용체는 T 세포 수용체(TCR)이다. 일부 실시형태에서, 제1 조작된 수용체 및 제2 조작된 수용체는 T 세포 수용체(TCR)이다.
본원에 사용된 것과 같이, 때때로 "TCR 복합체" 또는 "TCR/CD3 복합체"라고도 칭하는 "TCR"은 때때로 아단위라 칭하는 TCR 알파 사슬, TCR 베타 사슬 및 비변이체 CD3 사슬(제타, 감마, 델타 및 엡실론)의 하나 이상을 포함하는 단백질 복합체라 칭한다. TCR 알파 및 베타 사슬은 펩타이드-MHC 복합체에 결합하는 이종이합체로서 작용하도록 디설파이드 연결될 수 있다. TCR 알파/베타 이종이합체가 펩타이드-MHC를 관여시키면, 연관된 비변이체 CD3 아단위에서의 TCR 복합체의 구성적 변화가 유도되는데, 이는 이의 인산화 및 하류 단백질과의 연관으로 이어져서 1차 자극 신호를 전달한다. 예시적인 TCR 복합체에서, TCR 알파 및 TCR 베타 폴리펩타이드는 이종이합체를 형성하고, CD3 엡실론 및 CD3 델타는 이종이합체를 형성하고, CD3 엡실론 및 CD3 감마는 이종이합체를 형성하고, 2개의 CD3 제타는 동종이합체를 형성한다.
세포외 도메인
본 개시내용은 제1 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 조작된 수용체 및 제2 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 조작된 수용체를 제공한다. 제1 조작된 수용체, 제2 조작된 수용체 중 어느 하나, 또는 둘 다는 TCR일 수 있다. 임의의 적합한 리간드 결합 도메인은 본원에 기재된 조작된 TCR의 세포외 도메인, 힌지 도메인 또는 막관통에 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인 및/또는 제2 리간드 결합 도메인은 TCR 아단위의 세포외 도메인에 융합된다. TCR 아단위는 TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 엡실론 또는 CD3 감마일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인 및 제2 리간드 결합 도메인 둘 다는 상이한 TCR 수용체에서 동일한 TCR 아단위에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제1 리간드 결합 도메인 및 제2 리간드 결합 도메인은 상이한 TCR 수용체에서 상이한 TCR 아단위에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 리간드 결합 도메인은 제1 조작된 수용체에서 제1 TCR 아단위에 융합되고, 제2의, 억제제 리간드 결합 도메인은 제2 조작된 수용체에서 제2 TCR 아단위에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제1 TCR 아단위 및 제2 TCR 아단위는 동일한 아단위가 아니다. 일부 실시형태에서, 제1 TCR 아단위 및 제2 TCR 아단위는 동일한 아단위이다. 예를 들어, 제1 리간드 결합 도메인은 TCR 알파에 융합될 수 있고, 제2 리간드 결합 도메인은 TCR 베타에 융합될 수 있다. 추가의 예로서, 제1 리간드 결합은 TCR 베타에 융합되고, 제2 리간드 결합 도메인은 TCR 알파에 융합되도록 사용된다.
일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 LBD는 ScFv 도메인을 포함하고, 제2의, 억제제 LBD는 Vβ 단독 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 LBD는 Vβ 단독 도메인을 포함하고, 제2의, 억제제 LBD는 ScFv 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 LBD 및 제2의, 억제제 LBD 둘 다는 ScFv 도메인이다. 일부 실시형태에서, 제1의, 활성인자 LBD 및 제2의, 억제제 LBD 둘 다는 Vβ 단독 도메인이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 제1 조작된 TCR은 Vβ 단독 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함하다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 하나 이상의 외인성 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 제1 조작된 TCR은 ScFv 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함하다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 하나 이상의 외인성 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 제2 조작된 TCR은 Vβ 단독 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 억제 세포내 도메인을 포함하다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 제2 조작된 TCR은 ScFv 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 억제 세포내 도메인을 포함하다.
TCR 아단위는 TCR 알파, TCR 베타, CD3 제타, CD3 델타, CD3 감마 및 CD3 엡실론을 포함한다. TCR 알파, TCR 베타 사슬, CD3 감마, CD3 델타 또는 CD3 엡실론, 또는 이들의 단편 또는 유도체의 임의의 하나 이상은 본 개시내용의 자극 신호를 제공하여서 TCR 기능 및 활성을 향상시킬 수 있는 하나 이상의 도메인에 융합될 수 있다. TCR 알파, TCR 베타 사슬, CD3 감마, CD3 델타 또는 CD3 엡실론, 또는 이들의 단편 또는 유도체의 임의의 하나 이상은 본 개시내용의 억제 세포내 도메인에 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어 제1 조작된 수용체 또는 제2 조작된 수용체가 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체(TCR) 세포외 도메인 또는 항체로부터 단리되거나 유래된다.
일부 실시형태에서, 제1 조작된 수용체 및 제2 조작된 수용체는 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인 또는 조작된 수용체의 도메인은 세포내 도메인과 동일한 또는 상이한 폴리펩타이드에 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 조작된 수용체 및/또는 제2 조작된 수용체의 항원 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 조작된 수용체 및/또는 제2 조작된 수용체는 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 본 개시내용은 각각 리간드 결합 도메인의 일부(예를 들어, 이종이합체성 LDB의 동족, 예컨대 TCRα/β 기반 LBD 또는 Fab 기반 LBD)를 갖는 2개의 폴리펩타이드를 갖는 수용체를 제공한다. 본 개시내용은 각각 리간드 결합 도메인의 일부(예를 들어, 이종이합체성 LDB의 동족, 예컨대 TCRα/β 기반 LBD 또는 Fab 기반 LBD)를 갖는 2개의 폴리펩타이드를 갖는 수용체를 추가로 제공하고, 리간드 결합 도메인의 하나의 일부는 힌지 또는 막관통 도메인에 융합되지만, 리간드 결합 도메인의 다른 일부는 세포내 도메인을 갖지 않는다. 추가의 변이는 각각의 폴리펩타이드가 힌지 도메인을 갖는 수용체, 그리고 각각의 폴리펩타이드가 힌지 및 막관통 도메인을 갖는 수용체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 부재한다. 다른 실시형태에서, 힌지 도메인은 막 근위 세포외 영역(MPER: membrane proximal extracellular region), 예컨대 LILRB1 D3D4 도메인이다.
일부 실시형태에서, 예를 들어 제1 조작된 수용체 및/또는 제2 조작된 수용체가 적어도 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드는 항체의 제1 사슬을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 상기 항체의 제2 사슬을 포함한다.
일부 실시형태에서, 수용체는 항체의 Fab 단편을 포함한다. 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드는 항체의 중쇄의 항원 결합 단편 및 세포내 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 항체의 경쇄의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드는 항체의 경쇄의 항원 결합 단편 및 세포내 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 항체의 중쇄의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 조작된 수용체 및/또는 제2 조작된 수용체는 T 세포 수용체(TCR)의 세포외 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드는 TCR의 알파 사슬의 항원 결합 단편 및 세포내 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 TCR의 베타 사슬의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드는 TCR의 베타 사슬의 항원 결합 단편 및 세포내 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 TCR의 알파 사슬의 항원 결합 단편을 포함한다.
Vβ 단독 도메인을 포함하는 TCR
본 개시내용의 소정의 실시형태는 TCR 가변 도메인을 포함하는 조작된 TCR에 관한 것이고, TCR 가변 도메인은 제2 TCR 가변 도메인(Vβ 단독 도메인)의 부재 하에 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 조작된 TCR은 추가 아미노산 서열, 추가 단백질 도메인(TCR 가변 도메인과 공유 회합된, 비공유 회합된 또는 공유로 회합되고 비공유로 회합된), TCR 가변 도메인과 다른 유형의 거대분자(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 폴리사카라이드, 지질, 또는 이들의 조합)의 융합 또는 비공유 회합, TCR 가변 도메인과 하나 이상의 소분자, 화합물 또는 리간드의 융합 또는 비공유 회합, 또는 이들의 조합을 포함하는 TCR 가변 도메인 이외의 추가 요소를 포함할 수 있다. 기재된 것과 같은 임의의 추가 요소는 조합될 수 있고, 단 TCR 가변 도메인은 제2 TCR 가변 도메인의 부재 하에 에피토프에 특이적으로 결합하도록 구성될 수 있다.
본원에 기재된 것과 같은 Vβ 단독 도메인을 포함하는 조작된 TCR은 단일 TCR 사슬(예를 들어, α, β, γ 또는 δ 사슬)을 포함할 수 있거나, 이것은 (예를 들어, α, β, γ 또는 δ 사슬의) 단일 TCR 가변 도메인을 포함할 수 있다. 조작된 TCR이 단일 TCR 사슬이면, TCR 사슬은 막관통 도메인, 불변(또는 C 도메인) 및 가변(또는 V 도메인)을 포함하고, 제2 TCR 가변 도메인을 포함하지 않는다. 조작된 TCR은 따라서 TCR α 사슬, TCR β 사슬, TCR γ 사슬 또는 TCR δ 사슬을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 조작된 TCR은 막 결합된 단백질일 수 있다. 조작된 TCR은 대안적으로 막 회합된 단백질일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 조작된 TCR은 6개의 CD3 아단위와 복합체화된 활성화-유능 TCR을 형성하는 Vα 분절이 결여된 대리 α 사슬을 사용한다.
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 조작된 TCR은 Vα 분절이 결여된 대리 α 사슬과 독립적으로 기능한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 하나 이상의 조작된 TCR은 항원에 반응하여 T 세포를 활성화할 수 있는 막관통(예를 들어, CD3ζ 및 CD28) 및 세포내 도메인 단백질(예를 들어, CD3ζ, CD28, 및/또는 4-1BB)에 융합된다.
일부 실시형태에서, 조작된 TCR은 본원에 기재된 Vβ 단독 도메인에 융합된 하나 이상의 단일 TCR 사슬을 포함한다. 예를 들어, 조작된 TCR은 하나 이상의 Vβ 단독 도메인에 융합된 단일 α TCR 사슬, 단일 β TCR 사슬, 단일 γ TCR 사슬 또는 단일 δ TCR 사슬을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 TCR은 상보성 결정 영역(CDR)을 사용하여 항원을 관여시킨다. 각각의 조작된 TCR은 3개의 보체 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다.
제1 및/또는 제2 리간드 결합 Vβ 단독 도메인은 인간 TCR 가변 도메인일 수 있다. 대안적으로, 제1 및/또는 제2 Vβ 단독 도메인은 비인간 TCR 가변 도메인일 수 있다. 제1 및/또는 제2 Vβ 단독 도메인은 포유류 TCR 가변 도메인일 수 있다. 제1 및/또는 제2 Vβ 단독 도메인은 척추동물 TCR 가변 도메인일 수 있다.
실시형태에서, Vβ 단독 도메인은 융합 단백질, 예를 들어 TCR 아단위, 및 선택적으로, 추가 자극 세포내 도메인을 포함하는 융합 단백질로 혼입된다. 융합 단백질은 Vβ 단독 도메인 및 임의의 다른 단백질 도메인 또는 도메인들을 포함할 수 있다.
막관통 도메인
본 개시내용은 제1의, 활성인자 LBD를 포함하는 제1 융합 단백질 및 제2의, 억제제 LBD 및 억제제 세포내 도메인을 포함하는 제2 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질은 막관통 도메인을 포함한다.
본 개시내용은 막관통 도메인, 및 자극 신호 또는 억제 신호를 제공할 수 있는 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 조작된 TCR은 자극 신호를 제공할 수 있는 다수의 세포내 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "막관통 도메인"은 세포의 막에 걸친 단백질의 도메인을 지칭한다. 막관통 도메인은 통상적으로 주로 비극성 아미노산으로 이루어지고, 1회 또는 수회 지질 이중층을 횡단할 수 있다. 막관통 도메인은 보통 내부 수소 결합을 최대화하는 구성인 알파 나선을 포함한다.
임의의 원천으로부터 단리되거나 유래된 막관통 도메인은 본 개시내용의 융합 단백질의 범위 내로서 고안된다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 융합 단백질의 다른 도메인의 하나와 연관되거나, 융합 단백질의 다른 도메인 중 하나와 동일한 단백질로부터 단리되거나 유래된 것이다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인 및 제2 세포내 도메인은 동일한 단백질, 예를 들어 TCR 복합체 아단위, 예컨대 TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 엡실론 또는 CD3 감마 유래이다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인(svd-TCR), 막관통 도메인 및 제2 세포내 도메인은 동일한 단백질, 예를 들어 TCR 복합체 아단위, 예컨대 TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 엡실론 또는 CD3 감마 유래이다. 다른 실시형태에서, 세포외 도메인(하나 이상의 리간드 결합 도메인, 예컨대 Vβ 단독 도메인 및 ScFv 도메인을 포함), 막관통 도메인 및 세포내 도메인(들)은 상이한 단백질 유래이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 조작된 svd-TCR은 CD28 막관통 도메인을 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ 세포내 도메인과 함께 포함한다.
막관통 도메인은 자연 또는 재조합 원천 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다. 원천이 자연이면, 도메인은 임의의 막 결합된 단백질 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 TCR 복합체가 표적에 결합될 때마다 세포내 도메인(들)에 신호전달을 할 수 있다. 본 발명에서 특별히 사용되는 막관통 도메인은 예를 들어 TCR의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD3 델타, CD3 엡실론 또는 CD3 감마, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 막관통 영역(들)을 적어도 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 융합 단백질의 세포외 영역, 예를 들어 TCR 알파 또는 베타 사슬의 항원 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 힌지는 인간 면역글로불린 (Ig) 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지 또는 CD8a 힌지일 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지는 CD8α 또는 CD28로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지는 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열 번호 1)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지는 서열 번호 1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지는 본질적으로 서열 번호 1로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD8α 힌지는 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나,
Figure pct00038
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD8α 힌지는 서열 번호 2에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, CD28 힌지는 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, CTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(서열 번호 3)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, CD28 힌지는 서열 번호 3을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 힌지는 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나,
Figure pct00039
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD28 힌지는 서열 번호 4에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 TCR 알파 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCR 알파 막관통 도메인은 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 96%의 동일성, 적어도 97%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW(서열 번호 26)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, TCR 알파 막관통 도메인은 서열 번호 26을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, TCR 알파 막관통 도메인은
Figure pct00040
의 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 TCR 베타 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCR 베타 막관통 도메인은 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 96%의 동일성, 적어도 97%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, TILYEILLGKATLYAVLVSALVL(서열 번호 28)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, TCR 베타 막관통 도메인은 서열 번호 28을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, TCR 베타 막관통 도메인은
Figure pct00041
의 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 막관통은 CD3 제타 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 제타 막관통 도메인은 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 96%의 동일성, 적어도 97%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, LCYLLDGILFIYGVILTALFL(서열 번호 29)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, CD3 제타 막관통 도메인은 서열 번호 29를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다.
막관통 도메인은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가 아미노산, 예를 들어 막관통이 유래된 단백질의 세포외 영역과 연관된 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 세포외 영역의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 15개 이하의 아미노산) 및/또는 막관통 단백질이 유래된 단백질의 세포내 영역과 연관된 하나 이상의 추가 아미노산(예를 들어, 세포내 영역의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 15개 이하의 아미노산)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 예를 들어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하도록 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하도록 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
막관통 도메인은 존재할 때 자연 TCR 막관통 도메인, 이종성 막 단백질로부터의 자연 막관통 도메인, 또는 인공 막관통 도메인일 수 있다. 막관통 도메인은 막 앵커 도메인일 수 있다. 제한 없이, 자연 또는 인공 막관통 도메인은 대개 막관통 분절을 플랭킹하는 양전하를 갖는 약 20개의 아미노산의 소수성 a-나선을 포함할 수 있다. 막관통 도메인은 1개의 막관통 분절 또는 1개 초과의 막관통 분절을 가질 수 있다. 공공으로 이용 가능한 예측 도구를 사용하여 막관통 도메인/분절의 예측이 이루어질 수 있다(예를 들어, TMHMM, Krogh 등 Journal of Molecular Biology 2001 ; 305(3):567-580; 또는 TMpred, Hofmann & Stoffel Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1993; 347: 166). 막 앵커 시스템의 비제한적인 예는 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR) 막관통 도메인, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커(신호 서열에 번역후 첨가됨) 및 기타를 포함한다.
세포내 도메인
본 개시내용은 세포내 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. "세포내 도메인"은, 그 용어가 본원에 사용되면서, 단백질의 세포내 부분을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 막관통 도메인에 자극 신호를 제공할 수 있는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 자극 신호를 제공할 수 있는 제1 세포내 도메인 및 자극 신호를 제공할 수 있는 제2 세포내 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포내 도메인은 자극 신호를 제공할 수 있는 제1 세포내 도메인, 제2 세포내 도메인 및 제3 세포내 도메인을 포함한다. 자극 신호를 제공할 수 있는 세포내 도메인은 CD28 분자(CD28) 도메인, LCK 프로토-종양유전자, Src 패밀리 티로신 키나제(Lck) 도메인, TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9(4-1BB) 도메인, TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 18(GITR) 도메인, CD4 분자 (CD4) 도메인, CD8a 분자(CD8a) 도메인, FYN 프로토-종양유전자, Src 패밀리 티로신 키나제(Fyn) 도메인, T 세포 수용체 연관된 단백질 키나제 70의 제타 사슬(ZAP70) 도메인, T 세포의 활성화를 위한 링커(LAT) 도메인, 림프구 시토졸 단백질 2(SLP76) 도메인, (TCR) 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 감마 및 CD3 엡실론 세포내 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 세포의 기능, 예를 들어 TCR 함유 세포, 예를 들어 TCR 발현 T 세포의 면역 효과기 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 융합 단백질의 세포내 도메인은 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, CD3 감마, 델타 또는 엡실론의 세포내 도메인은 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인은 동일한 단백질, 예를 들어 T 세포 수용체(TCR) 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 감마 또는 CD3 엡실론으로부터 단리되거나 유래된다.
본 개시내용의 융합 단백질에 사용하기 위한 세포내 도메인의 예는 TCR 알파, TCR 베타, CD3 제타 및 4-1BB, 및 항원 수용체 관여 후 신호 형질도입을 개시시키도록 협동으로 작용하는 세포내 신호전달 동시수용체의 세포질 서열뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 재조합 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 예시적인 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극 또는 항원 의존적 자극을 담당하는 단백질로부터 유래된 것을 포함한다.
세포내 신호전달 도메인은 일반적으로 융합 단백질이 도입된 면역 세포의 정상 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. "효과기 기능"이라는 용어는 특수 세포 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은 예를 들어 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 이와 같이, "세포내 신호전달 도메인"이라는 용어는 효과기 기능 신호를 전달하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다.
일부 경우에 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 세포내 신호전달 도메인을 사용는 것이 필요하지 않다. 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분이 사용되는 정도로, 이러한 절두된 부분은 이것이 효과기 기능 신호를 전달하는 한 온전한 사슬 대신에 사용될 수 있다. 세포내 신호전달 도메인이란 용어는 이와 같이 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함하도록 의도된다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3 델타 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 델타 세포내 도메인은 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 96%의 동일성, 적어도 97%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
Figure pct00042
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD3 델타 세포내 도메인은 서열 번호 30을 포함하거나 이것로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD3 델타 세포내 도메인은
Figure pct00043
의 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3 엡실론 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 엡실론 세포내 도메인은 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 96%의 동일성, 적어도 97%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, KNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRIGGSRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(서열 번호 32)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, CD3 엡실론 세포내 도메인은 서열 번호 32를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD3 엡실론 세포내 도메인은
Figure pct00044
의 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3 감마 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 감마 세포내 도메인은 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 96%의 동일성, 적어도 97%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
Figure pct00045
의 서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD3 감마 세포내 도메인은 서열 번호 33을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD3 감마 세포내 도메인은
Figure pct00046
의 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 제타 세포내 도메인은 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 96%의 동일성, 적어도 97%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 9)의 서열 또는 이의 하위서열과 동일하다.
일부 실시형태에서, CD3 제타 세포내 도메인은 서열 번호 9를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 TCR 알파 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCR 알파 세포내 도메인은 Ser-Ser을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCR 알파 세포내 도메인은 TCCAGC의 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 TCR 베타 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCR 베타 세포내 도메인은 적어도 80%의 동일성, 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, MAMVKRKDSR(서열 번호 35)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, TCR 베타 세포내 도메인은 서열 번호 35를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, TCR 베타 세포내 도메인은
Figure pct00047
의 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 자극 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 CD3 델타, CD3 감마 및 CD3 엡실론 세포내 도메인, 및 1개의 추가 자극 세포내 도메인, 예를 들어 공자극 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 CD3 델타, CD3 감마 및 CD3 엡실론 세포내 도메인, 및 2개의 추가 자극 세포내 도메인을 포함한다.
예시적인 공자극 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호 또는 항원 독립적 자극을 담당하는 단백질로부터 유래된 것을 포함한다.
"공자극 분자"라는 용어는 공자극 리간드와 특이적으로 결합하여서 비제한적인 예로서 증식과 같은 T 세포에 의한 공자극 반응을 매개하는 T 세포 상에서의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공자극 분자는 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자이다. 공자극 분자 및 이의 리간드는 효과적인 면역 반응에 필요하다. 공자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA, 톨 리간드 수용체(Toll ligand receptor)뿐만 아니라 DAP10, DAP12, CD30, LIGHT, OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18) 4-1BB(CD137, TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9) 및 CD28 분자(CD28)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"공자극 세포내 신호전달 도메인"이라 때때로 칭하는 "공자극 도메인"은 공자극 단백질의 세포내 부분일 수 있다. 공자극 도메인은 공자극 신호를 전달하는 공자극 단백질의 도메인일 수 있다. 공자극 단백질은 TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구용해 활성화 분자(SLAM 단백질) 및 활성화 NK 세포 수용체의 단백질 패밀리에서 표시될 수 있다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83, CD4 및 기타와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 공자극 도메인은 이것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분 또는 전체 자연적 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 자극 도메인은 공자극 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극 도메인은 CD28 또는 4-1BB 공자극 도메인을 포함한다. CD28 및 4-1BB는 전체 T 세포 활성화에 필요하고 T 세포 효과기 기능을 향상시키는 것으로 공지된 잘 규명된 공자극 분자이다. 예를 들어, CD28 및 4-1BB는 오직 CD3 제타 신호전달 도메인을 함유하는 제1 세대 CAR에 비해 사이토카인 방출, 세포용해 기능 및 지속성을 부스팅하기 위해 키메라 항원 수용체(CAR)에 사용되었다. 마찬가지로, 조작된 TCR에서의 공자극 도메인, 예를 들어 CD28 및 4-1BB 도메인의 포함은 T 세포 효과기 기능을 증가시키고 특이적으로 공자극 리간드의 부재 하에 동시자극이 가능하게 할 수 있고, 이는 통상적으로 종양 세포의 표면에서 하향조절된다.
일부 실시형태에서, 자극 도메인은 CD28 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 세포내 도메인은 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 96%의 동일성, 적어도 97%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 적어도 99%의 동일성의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(서열 번호 37)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, CD28 세포내 도메인은 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(서열 번호 37)를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28 세포내 도메인은
Figure pct00048
를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 자극 도메인은 4-1BB 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 도메인은 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 96%의 동일성, 적어도 97%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열 번호 39)의 서열과 동일하다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 도메인은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열 번호 39)을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 세포내 도메인은 AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGGCCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(서열 번호 40)를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
억제 도메인
본 개시내용은 억제 TCR을 생성하기 위해 임의의 TCR 아단위의 막관통 도메인 또는 세포내 도메인에 융합될 수 있는 억제 세포내 도메인을 제공한다.
일부 실시형태에서, 억제 세포내 도메인은 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함한다. 일부 실시형태에서, ITIM을 포함하는 억제 세포내 도메인은 CTLA-4 및 PD-1과 같은 면역 관문 억제제로부터 단리되거나 유래될 수 있다. CTLA-4 및 PD-1은 T 세포의 표면에서 발현된 면역 억제 수용체이고, T 세포 반응을 약화시키거나 종료시키는 데 중추적 역할을 한다.
억제 도메인은 인간 종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL) 수용체 및 CD200 수용체 1로부터 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 억제 도메인은 세포내 도메인, 막관통 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 도메인은 세포내 도메인, 막관통 도메인, 힌지 영역 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 도메인은 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함한다. 일부 실시형태에서, ITIM을 포함하는 억제 도메인은 CTLA-4 및 PD-1과 같은 면역 관문 억제제로부터 단리되거나 유래될 수 있다.
억제 도메인은 인간 종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL) 수용체 및 CD200 수용체 1로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제 도메인은 인간 단백질, 예를 들어 인간 TRAIL 수용체, CTLA-4 또는 PD-1 단백질로부터 단리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, TRAIL 수용체는 TR10A, TR10B 또는 TR10D를 포함한다.
내인성 TRAIL은 혈장 막에 앵커링되고 세포 표면에 제시된 281-아미노산 II형 막관통 단백질로서 발현된다. TRAIL은 자연 살해 세포에 의해 발현되고, 이는 세포-세포 접촉의 확립 후, 표적 세포에서 TRAIL 의존적 아폽토시스를 유도할 수 있다. 생리학적으로, TRAIL 신호전달 시스템은 면역 감시에, T-헬퍼 세포 2에 대한 T-헬퍼 세포 1의 조절뿐만 아니라 "무헬프" CD8+ T 세포 수를 통해 면역계를 형성하기 위해 그리고 자발적인 종양 형성의 억제에 필수적인 것으로 나타났다.
일부 실시형태에서, 억제 도메인은 CD200 수용체로부터 단리되거나 유래된 세포내 도메인을 포함한다. 세포 표면 당단백질 CD200 수용체 1(Uniprot 참조번호: Q8TD46)은 본 발명의 억제 세포내 도메인의 다른 예를 나타낸다. CD200/OX2 세포 표면 당단백질에 대한 이 억제 수용체는 선택된 자극에 반응하여 TNF-알파, 인터페론 및 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)를 포함하는 전염증성 분자의 발현을 억제함으로써 염증을 제한한다.
일부 실시형태에서, 조작된 수용체는 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 2(KIR3DL2), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체, 3개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 3(KIR3DL3), 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B1(LIR1), 예정 세포사 1(PD-1), Fc 감마 수용체 IIB(FcgRIIB), 살해 세포 렉틴 유사 수용체 K1(NKG2D), 합성 일치 ITIM을 함유하는 CTLA-4, 도메인, ZAP70 SH2 도메인(예를 들어, N 말단 및 C 말단 SH2 도메인의 하나 또는 둘 다) 또는 ZAP70 KI_K369A(키나제 불활성 ZAP70)로부터 단리되거나 유래된 억제 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 억제 도메인은 인간 단백질로부터 단리되거나 유래된다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제 수용체는 동일한 단백질, 예를 들어 ITIM 함유 단백질로부터 단리되거나 유래된 세포질 도메인 및 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제 수용체는 동일한 단백질, 예를 들어 ITIM 함유 단백질로부터 단리되거나 유래된 단리되거나 유래된 세포질 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제 수용체는 세포내 도메인 및/또는 막관통 도메인과 동일한 단백질, 예를 들어 ITIM 함유 단백질로부터 단리되거나 유래된 단리되거나 유래된 힌지 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 조작된 수용체는 억제 도메인을 포함하는 TCR(억제 TCR)이다. 일부 실시형태에서, 억제 TCR은 억제 세포내 도메인 및/또는 억제 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 세포내 도메인은 TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 감마 또는 CD3 엡실론의 세포내 도메인 또는 TCR의 이의 일부에 융합된다. 일부 실시형태에서, 억제 세포내 도메인은 TCR 알파, TCR 베타, CD3 델타, CD3 감마 또는 CD3 엡실론의 막관통 도메인에 융합된다.
일부 실시형태에서, 제2 조작된 수용체는 억제 도메인을 포함하는 TCR(억제 TCR)이다. 일부 실시형태에서, 억제 도메인은 LILRB1로부터 단리되거나 유래된다.
LILRB1 억제 수용체
본 개시내용은 LILRB1 억제 도메인, 및 선택적으로, LILRB1 막관통 및/또는 힌지 도메인, 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 제2의, 억제 수용체를 제공한다. 억제 수용체에서의 LILRB1 막관통 도메인 및/또는 LILRB1 힌지 도메인의 포함은 다른 막관통 도메인 또는 다른 힌지 도메인을 갖는 기준 억제 수용체와 비교하여 억제 수용체에 의해 생성된 억제 신호를 증가시킬 수 있다. LILRB1 억제 도메인을 포함하는 제2의, 억제 수용체는 본원에 기재된 것과 같은 CAR 또는 TCR일 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 임의의 적합한 리간드 결합 도메인은 LILRB1 기반 제2의, 억제 수용체에 융합될 수 있다.
백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B1뿐만 아니라 ILT2, LIR1, MIR7, PIRB, CD85J, ILT-2 LIR-1, MIR-7 및 PIR-B로도 공지된 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 하위패밀리 B 구성원 1(LILRB1)은 백혈구 면역글로불린 유사 수용체(LIR) 패밀리의 구성원이다. LILRB1 단백질은 LIR 수용체의 하위패밀리 B 클래스에 속한다. 이들 수용체는 2개 내지 4개의 세포외 면역글로불린 도메인, 막관통 도메인, 및 2개 내지 4개의 세포질 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 함유한다. LILRB1 수용체는 면역 세포에서 발현되고, 여기서 이것은 항원 제시 세포에서 MHC 클래스 I 분자에 결합하고 면역 반응의 자극을 억제하는 음성 신호를 전달한다. LILRB1은 염증 반응뿐만 아니라 세포독성을 조절하고, 제한하는 자가-반응성에서 역할을 하는 것으로 생각된다. LILRB1의 상이한 이소형을 암호화하는 다수의 전사체 변이체가 존재하고, 이들의 모두는 본 개시내용의 범위 내로서 고려된다.
본원에 기재된 억제 수용체의 일부 실시형태에서, 억제 수용체는 LILRB1로부터 단리되거나 유래된 하나 이상의 도메인을 포함한다. LILRB1로부터 단리되거나 유래된 하나 이상의 도메인을 갖는 수용체의 일부 실시형태에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 서열 번호 65의 서열 또는 하위서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%이거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 서열 번호 65의 서열 또는 하위서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 서열 번호 65의 서열 또는 하위서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 동일한 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 서열 번호 65의 서열 또는 하위서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어진다.
LILRB1로부터 단리되거나 유래된 하나 이상의 도메인을 갖는 수용체의 일부 실시형태에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 서열 번호 66의 서열 또는 하위서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%이거나 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
LILRB1의 하나 이상의 도메인을 갖는 수용체의 일부 실시형태에서, LILRB1의 하나 이상의 도메인은 서열 번호 66의 서열 또는 하위서열과 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
다양한 실시형태에서, 폴리펩타이드를 포함하는 억제 수용체가 제공되고, 폴리펩타이드는 하기 중 하나 이상을 포함한다: LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체; LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 LILRB1 세포내 도메인 또는 적어도 1개 또는 적어도 2개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하는 세포내 도메인, 여기서 각각의 ITIM은 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로부터 독립적으로 선택된다.
본원에 사용된 것과 같이 "면역수용체 티로신계 억제 모티프" 또는 "ITIM"은 면역계의 많은 억제 수용체의 세포질 꼬리에서 발견되는 S/I/V/LxYxxI/V/L의 일치 서열을 갖는 아미노산의 보존된 서열(서열 번호 274) 또는 기타를 지칭한다. ITIM 보유 억제 수용체가 이의 리간드와 상호작용한 후, ITIM 모티프는 인산화되어서, 억제 수용체가 다른 효소, 예컨대 포스포티로신 포스파타제 SHP-1 및 SHP-2, 또는 SHIP라 불리는 이노시톨-포스파타제를 동원하게 한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 적어도 1개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM), 적어도 2개의 ITIM, 적어도 3개의 ITIM, 적어도 4개의 ITIM, 적어도 5개의 ITIM 또는 적어도 6개의 ITIM을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 ITIM을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로 이루어진 ITIM의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 ITIM을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
추가의 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 적어도 2개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하는 세포내 도메인을 포함하고, 각각의 ITIM은 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 ITIM NLYAAV(서열 번호 67) 및 VTYAEV(서열 번호 68) 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 71과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 71과 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 ITIM VTYAEV(서열 번호 68) 및 VTYAQL(서열 번호 69) 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 72와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 72와 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 ITIM VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70) 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 73과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 73과 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 ITIM NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV (서열 번호 68) 및 VTYAQL(서열 번호 69)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 74와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 74와 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 ITIM VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 75와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 75와 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 ITIM NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)을 포함한다. 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 76과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 76과 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 LILRB1 세포내 도메인과 적어도 95% 동일한 서열(서열 번호 81)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 LILRB1 세포내 도메인(서열 번호 81)과 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다.
본 개시내용의 LILRB1 세포내 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 4개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개의 ITIM을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, LILRB1 세포내 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 ITIM을 갖는다.
특정 실시형태에서, 세포내 도메인은 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하고, 각각의 ITIM은 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포내 도메인은 적어도 3개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하고, 각각의 ITIM은 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포내 도메인은 3개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하고, 각각의 ITIM은 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포내 도메인은 4개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하고, 각각의 ITIM은 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포내 도메인은 5개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하고, 각각의 ITIM은 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포내 도메인은 6개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하고, 각각의 ITIM은 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포내 도메인은 적어도 7개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하고, 각각의 ITIM은 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로부터 독립적으로 선택된다.
LILRB1 단백질은 D1, D2, D3 및 D4라 칭하는 4개의 면역글로불린(Ig) 유사 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, LILRB1 힌지 도메인은 LILRB1 D3D4 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1 D3D4 도메인은 서열 번호 77과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1 D3D4 도메인은 서열 번호 77을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 포함한다. 실시형태에서, LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체는 서열 번호 84, 서열 번호 77 또는 서열 번호 78과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함한다. 실시형태에서, LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체는 서열 번호 84, 서열 번호 77 또는 서열 번호 78과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, LILRB1 힌지 도메인은 서열 번호 84, 서열 번호 77 또는 서열 번호 78과 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, LILRB1 힌지 도메인은 본질적으로 서열 번호 84, 서열 번호 77 또는 서열 번호 78과 동일한 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 85와 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 85와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, LILRB1 막관통 도메인은 서열 번호 85와 동일한 서열을 포함한다. 실시형태에서, LILRB1 막관통 도메인은 본질적으로 서열 번호 85와 동일한 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 제2의, 억제 수용체의 세포외 영역, 예를 들어 항원 결합 도메인 또는 리간드 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 힌지는 인간 면역글로불린(Ig) 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지, CD8a 힌지 또는 LILRB1 힌지일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2의, 억제 수용체는 억제 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2의, 억제 수용체는 억제 세포내 도메인 및/또는 억제 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 도메인은 LILR1B로부터 단리되거나 유래된다.
LILRB1 도메인의 조합을 포함하는 억제 수용체
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 LILRB1 기반 억제 수용체는 하나 초과의 LILRB1 도메인 또는 이의 기능적 균등물을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 억제 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 및 세포내 도메인, 또는 LILRB1 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 억제 수용체는 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 및 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 79와 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 79와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 79와 동일한 서열을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 억제 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 LILRB1 세포내 도메인 및/또는 적어도 하나의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하는 세포내 도메인을 포함하고, ITIM은 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 LILRB1 세포내 도메인 및/또는 적어도 2개의 ITIM을 포함하는 세포내 도메인을 포함하고, 각각의 ITIM은 NLYAAV(서열 번호 67), VTYAEV(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 70)로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 억제 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 80과 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 또는 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 80과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 80과 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 및 세포외 리간드 결합 도메인에 융합된 서열 번호 80의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 억제 수용체는 TCR 알파 가변 도메인에 융합된 서열 번호 80을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 TCR 베타 가변 도메인에 융합된 서열 번호 80을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 억제 수용체는 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체; LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체; 및 LILRB1 세포내 도메인 및/또는 적어도 2개의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하는 세포내 도메인을 포함하고, 각각의 ITIM은 LYAAV(서열 번호 67), VTYAE(서열 번호 68), VTYAQL(서열 번호 69) 및 SIYATL(서열 번호 11)로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 억제 수용체는 서열 번호 82 또는 서열 번호 83과 적어도 95% 동일한, 또는 서열 번호 82 또는 서열 번호 83과 적어도 99% 동일한, 또는 서열 번호 82 또는 서열 번호 83과 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 79와 적어도 99% 동일한, 또는 서열 번호 79와 적어도 99% 동일한, 또는 서열 번호 79와 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 80과 적어도 99% 동일한, 또는 서열 번호 80과 적어도 99% 동일한, 또는 서열 번호 80과 동일한 서열을 포함한다.
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Figure pct00051
링커
일부 실시형태에서, 조작된 수용체는 조작된 수용체의 2개의 도메인을 연결하는 링커를 포함한다. 본원에는 일부 실시형태에서 본원에 기재된 조작된 수용체의 도메인을 연결하도록 사용될 수 있는 링커가 제공된다.
단백질 도메인, 예를 들어 세포내 도메인 또는 scFv 내의 도메인을 연결하는 것의 맥락에서 사용된 것과 같은 "링커" 및 "가요성 폴리펩타이드 링커"라는 용어는 2개의 도메인을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합으로 사용된 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커를 지칭한다.
임의의 링커가 사용될 수 있고, 많은 융합 단백질 링커 형식이 공지되어 있다. 예를 들어, 링커는 가요성 또는 경질일 수 있다. 경질 및 가요성 링커의 비제한적인 예는 Chen 등 (Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(10):1357-1369)에 제공된다.
본원에 기재된 항원 결합 도메인은 랜덤 순서로 또는 규정된 순서로 서로에 연결될 수 있다.
본원에 기재된 항원 결합 도메인은 N 말단에서 C 말단으로의 임의의 배향으로 서로에 연결될 수 있다.
선택적으로, 예를 들어 2개 내지 40개의 아미노산(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산) 길이의 짧은 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커는 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 링커는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개 또는 30개 초과의 아미노산 잔기의 펩타이드이다. 링커에서 발견된 아미노산의 비제한적인 예는 Gly, Ser, Glu, Gin, Ala, Leu, 이소, Lys, Arg, Pro 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 [(Gly)n1Ser]n2이고, 여기서 n1 및 n2는 임의의 수일 수 있다(예를 들어, n1 및 n2은 독립적으로 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, l0 또는 10 초과일 수 있음). 일부 실시형태에서, n1은 4이다.
일부 실시형태에서, 가요성 폴리펩타이드 링커는 Gly/Ser 링커이고, n회 반복될 수 있는 아미노산 서열(Gly-Gly-Ser), (Gly-Gly-Gly-Ser, 서열 번호 231) 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, 서열 번호 226)을 포함하고, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10. 일부 실시형태에서, 가요성 폴리펩타이드 링커는 GGS, GGGGS(서열 번호 226), GGGGS GGGGS(서열 번호 227), GGGGS GGGGS GGGGS(서열 번호 228), GGGGS GGGGS GGGGS GG(서열 번호 229) 또는 GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS(서열 번호 230)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 링커는 (Gly Gly Ser), (Gly Ser) 또는 (Gly Gly Gly Ser(서열 번호 231))의 다수의 반복부를 포함한다. WO2012/138475(본원에 참고로 포함됨)에 기재된 링커가 본 발명의 범위 내에 또한 포함된다.
일부 실시형태에서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 긴 링커 서열은 4회 반복된 GGGGS(서열 번호 226)를 포함한다. 일부 실시형태에서, GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS(서열 번호 230)는 본 개시내용의 TCR 알파 융합 단백질에서 세포내 도메인을 연결하도록 사용된다.
일부 실시형태에서, 긴 링커 서열은 3회 반복된 GGGGS(서열 번호 226)를 포함한다. 일부 실시형태에서, GGGGS GGGGS GGGGS(서열 번호 228)는 본 개시내용의 TCR 베타 융합 단백질에서 세포내 도메인을 연결하도록 사용된다.
일부 실시형태에서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 짧은 링커 서열은 GGGGS(서열 번호 226)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 글리신-세린 더블렛은 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 도메인은 링커의 사용 없이 펩타이드 결합을 통해 서로 직접 융합된다.
검정
본원에는 본 개시내용의 조작된 수용체의 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 검정이 제공된다.
루시퍼라제 리포터와 같은 수용체 활성의 리포터를 발현하도록 조작된 세포주를 사용하여 조작된 수용체의 활성을 분석할 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 세포주가 사용될 수 있지만, 예시적인 세포주는 저카트 T 세포를 포함한다. 예를 들어, NFAT 프로모터의 제어 하에 루시퍼라제 리포터를 발현하는 저카트 세포는 효과기 세포로서 사용될 수 있다. 이 세포주에 의한 루시퍼라제의 발현은 TCR 매개된 신호전달을 반영한다.
리포터 세포는 본원에 기재된 각각의 다양한 융합 단백질 작제물, 융합 단백질 작제물의 조합 또는 대조군으로 형질주입될 수 있다.
리포터 세포에서의 융합 단백질의 발현은 융합 단백질의 발현을 검출하기 위해 형광으로 표지된 MHC 사합체, 예를 들어 Alexa Fluor 647 표지된 NY-ESO-1-MHC 사합체를 사용함으로써 확인될 수 있다.
조작된 수용체의 활성을 분석하기 위해, 표적 세포는 리포터 및 조작된 수용체를 포함하는 효과기 세포에 대한 노출 전에 항원이 로딩된다. 예를 들어, 표적 세포는 효과기 세포에 대한 노출 전에 적어도 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간 또는 24시간 항원이 로딩될 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 세포가 사용될 수 있지만, 예시적인 표적 세포는 A375 세포를 포함한다. 일부 경우에, 표적 세포는 NY-ESO-1 펩타이드와 같은 항원의 연속 희석된 농도로 로딩될 수 있다. 효과기 세포는 이후 적합한 시간 기간, 예를 들어 6시간 동안 표적 세포와 동시배양될 수 있다. 이후, 루시퍼라제는 동시배양 후 발광 판독에 의해 측정된다. 루시퍼라제 발광은 각각의 조작된 수용체 작제물에 대해 활성화 펩타이드 농도의 비교가 가능하게 하도록 최대 강도 및 최소 강도로 정규화될 수 있다.
본원에는 본 개시내용의 조작된 수용체의 상대 EC50을 결정하는 방법이 제공된다. 본원에 사용된 것과 같이, "EC50"은 반응(또는 결합)이 반만큼 감소되는 억제제 또는 물질의 농도를 지칭한다. 본 개시내용의 조작된 수용체의 EC50은 항원에 대한 조작된 수용체의 결합이 반만큼 감소되는 항원의 농도를 지칭한다. 표지된 펩타이드 또는 표지된 펩타이드-MHC 복합체, 예를 들어 형광단과 접합된 MHC:NY-ESO-1 pMHC 복합체에 의한 염색에 의해 조작된 수용체에 대한 항원 또는 프로브의 결합이 측정될 수 있다. 펩타이드 적정에 의해 리포터 신호의 비선형 회귀 곡선 적합화에 의해 EC50을 얻을 수 있다. 프로브 결합 및 EC50은 융합 단백질, 예를 들어 NY-ESO-1(클론 1G4) 없이 벤치마크 TCR의 수준으로 정규화될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드
본 개시내용은 본원에 기재된 조작된 수용체의 서열(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
일부 실시형태에서, 제1 융합 단백질 및/또는 제2 융합 단백질의 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 융합 단백질을 암호화하는 서열은 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 제2 융합 단백질을 암호화하는 서열은 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
본 개시내용은 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 조작된 수용체의 서열 또는 서열들을 암호화하는 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 제1 융합 단백질 및/또는 제2 융합 단백질의 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 융합 단백질을 암호화하는 서열은 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 제2 융합 단백질을 암호화하는 서열은 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 제1 조작된 수용체는 제1 벡터에 의해 암호화되고, 제2 조작된 수용체는 제2 벡터에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, 조작된 수용체 둘 다는 단일 벡터에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 제1 수용체 및 제2 수용체는 단일 벡터에 의해 암호화된다. 단일 벡터를 사용하여 다수의 폴리펩타이드를 암호화하는 방법은 당업자에게 공지될 것이고, 특히 상이한 프로모터의 제어 하에 다수의 폴리펩타이드를 암호화하는 것, 또는 단일 프로모터가 다수의 폴리펩타이드의 전사를 제어하도록 사용되면, 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site) 및/또는 자가 절단 펩타이드를 암호화하는 서열의 사용을 포함한다. 예시적인 자가절단 펩타이드는 T2A, P2A, E2A 및 F2A 자가절단 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, T2A 자가 절단 펩타이드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열 번호 271)의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, P2A 자가 절단 펩타이드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열 번호 192)의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, E2A 자가 절단 펩타이드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열 번호 272)의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, F2A 자가절단 펩타이드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열 번호 273)의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 적합한 세포에서 발현 벡터, 즉 융합 단백질의 발현을 위한 것이다.
렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 전이유전자의 장기간의 안정한 내재화 및 딸 세포에서의 이의 증식이 가능하게 하므로 장기간 유전자 전달을 달성하기 위한 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비증식 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 쥣과 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스(onco-retroviruse)로부터 유래된 벡터에 비해 상가 이점을 갖는다. 이들은 또한 낮은 면역원성의 상가 이점을 갖는다.
융합 단백질을 암호화하는 자연 핵산 또는 합성 핵산의 발현은 통상적으로 융합 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하는 것, 및 작제물을 발현 벡터로 혼입하는 것에 의해 달성된다. 벡터는 복제 및 내재성 진핵생물에 적합할 수 있다. 통상적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다.
융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 다수의 벡터 유형으로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 비제한적인 예로서 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하는 벡터로 클로닝될 수 있다. 특히 관심 있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다.
추가로, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 면역 세포와 같은 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 Sambrook 등 (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기원, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유한다(예를 들어, WO 01/96584호; WO 01/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호).
다수의 바이러스 기반 시스템은 포유류 세포로의 유전자 전달을 위해 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템에 대한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터로 삽입되고, 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이후, 재조합 바이러스는 생체내 또는 생체외 단리되고 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 통상적으로, 다수의 프로모터가 또한 출발 부위의 하류에 기능적 요소를 함유하는 것으로 최근에 밝혀졌지만, 이들이 출발 부위의 상류에 영역 30개 내지 110개 염기쌍(bp)에 위치한다. 요소들이 서로에 대해 도립되거나 이동할 때 프로모터 기능이 보존되도록 프로모터 요소 사이의 간격은 흔히 융통성이 있다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 떨어져 50 bp로 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 전사를 활성화하도록 협동적으로 또는 독립적으로 작용할 수 있는 것으로 보인다.
적합한 프로모터의 하나의 예는 즉시 초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 이에 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 높은 발현 수준을 유도할 수 있는 강한 항시적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 예는 연장 성장 인자-1α(EF-1α: Elongation Growth Factor-1α)이다. 그러나, 비제한적인 예로서 유인원 바이러스 40(SV40: simian virus 40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV: mouse mammary tumor virus), 인간 면역결핍 바이러스(HIV: human immunodeficiency virus) 긴 말단 반복부(LTR: long terminal repeat) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(Epstein-Barr virus) 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터를 포함하는 다른 항시적 프로모터 서열뿐만 아니라 비제한적인 예로서 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아티닌 키나제 프로모터와 같은 인간 유전자 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 추가로, 본 발명은 항시적 프로모터의 사용으로 제한되지 않아야 한다. 본 발명의 일부로서 유도성 프로모터가 또한 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 이것이 이러한 발현이 원해질 때 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 키거나, 발현이 원해지지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
융합 단백질의 발현을 평가하기 위해, 세포로 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질주입되거나 감염되도록 추구되는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택이 용이하게 하도록 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 선택 가능한 마커는 DNA의 별개의 조각에서 수행되고 동시형질주입 절차에서 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서 발현이 가능하게 하는 적절한 조절 서열에 의해 플랭킹될 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커는 예를 들어 항생제 내성 유전자, 예컨대 네오 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질주입된 또는 형질도입된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수혜자 유기체 또는 조직에 존재하거나 이에 의해 발현되고, 일부 용이하게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소 활성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자이다. DNA가 수혜자 세포로 도입된 후 적합한 시간에 리포터 유전자의 발현이 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로르암페니콜 아세틸 전환효소, 분비된 알칼리 포스파타제를 암호화하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, Ui-Tei 등, 2000 FEBS Letters 479: 79-82). 적합한 발현 시스템은 잘 공지되어 있고, 공지된 기법을 사용하여 제조되거나 상업적으로 얻어질 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 가장 높은 발현 수준을 보여주는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 작제물이 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고 프로모터 유발 전사를 조절하는 능력에 대해 물질을 평가하도록 사용될 수 있다.
유전자를 세포로 도입하고 이를 발현하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당해 분야에서의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적 수단, 화학적 수단 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 포격, 미량주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Sambrook 등 (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)을 참조한다. 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 도입하기 위한 하나의 방법은 인산칼슘 형질주입이다.
숙주 세포로 관심 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 포유류, 예를 들어 인간 세포로 유전자를 삽입하기 위한 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호를 참조한다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구, 비드, 및 수중유 에멀션, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질 기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 베시클)이다.
외인성 핵산을 숙주 세포로 도입하거나 그렇지 않으면 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키기 위해 사용된 방법과 관련하여, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은 본 발명의 범위 내에 해당하는 물질을 확인하기 위해 예를 들어 당업자에게 잘 공지된 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 사우던 블로팅 및 노던 블로팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한 또는 본원에 기재된 검정에 의한 특정 펩타이드의 존재 또는 부재의 검출과 같은 "생화학적" 검정을 포함한다.
면역 세포
본원에는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 융합 단백질 및 조작된 수용체를 포함하는 면역 세포가 제공된다.
본원에 사용된 것과 같이, "면역 세포"라는 용어는 선천성 또는 적응(획득) 면역계에 관여된 세포를 지칭한다. 예시적인 선천성 면역 세포는 식세포 세포, 예컨대 중성구, 단핵구 및 대식세포, 자연 살해(NK) 세포, 다형핵 백혈구, 예컨대 호중구, 호산구 및 호염기구 및 단핵 세포, 예컨대 단핵구, 대식세포 및 비만 세포를 포함한다. 획득 면역에서 역할을 갖는 면역 세포는 T 세포 및 B 세포와 같은 림프구를 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "T 세포"는 흉선에서 발생하는 골수 전구체로부터 기원하는 림프구의 유형을 지칭한다. 헬퍼 CD4+ T 세포, 세포독성 CD8+ T 세포, 기억 T 세포, 조절 CD4+ T 세포 및 줄기 기억 T 세포를 포함하는 흉선으로 이동 시 발생하는 몇몇 구별되는 유형의 T 세포가 있다. 상이한 유형의 T 세포는 이의 마커 발현에 기초하여 당업자에 의해 구별될 수 있다. T 세포 유형 사이를 구별하는 방법은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 제1 수용체 대 제2 수용체의 약 100:1 내지 1:100의 비로 제1 수용체 및 제2 수용체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 제1 수용체 대 제2 수용체의 약 50:1 내지 1:50의 비로 제1 수용체 및 제2 수용체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 제1 수용체 대 제2 수용체의 약 10:1 내지 1:10의 비로 제1 수용체 및 제2 수용체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 제1 수용체 대 제2 수용체의 약 5:1 내지 1:5의 비로 제1 수용체 및 제2 수용체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 제1 수용체 대 제2 수용체의 약 3:1 내지 1:3의 비로 제1 수용체 및 제2 수용체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 제1 수용체 대 제2 수용체의 약 2:1 내지 1:2의 비로 제1 수용체 및 제2 수용체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 약 1:1의 비로 제1 수용체 및 제2 수용체를 발현한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조작된 수용체를 포함하는 조작된 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 효과기 T 세포 또는 조절 T 세포이다.
본 개시내용의 벡터에 의해 T 세포와 같은 면역 세포의 집단을 형질전환하는 방법은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 예를 들어, 제조사의 지시에 따라 CD3+ T 세포 음성 단리 키트(Miltenyi)를 사용하여 PBMC로부터 CD3+ T 세포를 단리할 수 있다. CD3/28 Dynabead(1:1의 세포 대 비드 비) 및 300 단위/mL의 IL-2(Miltenyi)의 존재 하에 5% 인간 A/B 혈청 및 1% Pen/strep가 보충된 X-Vivo 15 배지에서 1 x 10^6개의 세포/mL의 밀도로 T 세포를 배양할 수 있다. 2일 후, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터에 의해 T 세포를 형질도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 5의 다중 감염도(MOI: multiplicity of infection)로 형질도입된다. 이후, 농후화 전 추가 5일 동안 IL-2 또는 다른 사이토카인, 예컨대 IL-7/15/21의 조합에서 세포를 배양할 수 있다. 면역 세포의 다른 집단, 예컨대 B 세포, 또는 다른 T 세포 집단을 단리하고 배양하는 방법은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 이 방법이 가능한 접근법을 개략화하지만, 이 방법론이 신속히 발전한다는 것이 주목되어야 한다. 예를 들어, 99% 초과의 CD3+ 고도로 형질도입된 세포 집단을 생성시키도록 성장 5일 후 말초혈 단핵 세포의 훌륭한 바이러스 형질도입을 달성할 수 있다.
조작된 TCR, CAR, 융합 단백질 또는 본 개시내용의 융합 단백질을 암호화하는 벡터를 포함하는 T 세포의 집단을 활성화하고 배양하는 방법은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다.
조작된 TCR을 발현하기 위한 T 세포의 유전 변형 전이든 또는 후이든, T 세포는 일반적으로 예를 들어 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호, 제10040846호; 및 미국 특허 출원 공보 제2006/0121005호에 기재된 것과 같은 방법을 사용하여 활성화되거나 확장될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T 세포는 시험관내 확장되고 활성화된다. 일반적으로, 본 개시내용의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 물질 및 T 세포의 표면에 공자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 시험관내 확장된다. 특히, T 세포 집단은 예컨대 항-CD3 항체와의 접촉에 의해 본원에 기재된 것처럼 자극될 수 있다. T 세포의 표면에 보조 분자의 공자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기 위한 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉할 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3을 포함하고, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송)은 당해 분야에 흔히 공지된 다른 방법이 사용될 수 있는 것처럼 사용될 수 있다(Berg 등, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen 등, J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland 등, J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
일부 실시형태에서, T 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 물질은 용액 중에 있거나 표면에 커플링될 수 있다. 물질은 표면에 커플링될 때 동일한 표면에(즉, "시스" 형성으로) 커플링되거나 별개의 표면에(즉, "트랜스" 형성으로) 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 물질은 표면 및 용액 중의 다른 물질에 커플링될 수 있다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호를 제공하는 물질은 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 물질은 용액 중에 있거나 표면에 커플링된다. 소정의 실시형태에서, 물질 둘 다는 용액에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 그 물질은 가용성 형태일 수 있고, 이후 표면, 예컨대 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체 또는 그 물질에 결합하는 다른 결합제에 가교결합된다. 이와 관련하여, 본 발멸에서 T 세포를 활성화하고 확장시키는 데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC: artificial antigen presenting cell)에 대해 예를 들어 미국 특허 출원 공보 제20040101519호 및 제20060034810호를 참조한다.
일부 실시형태에서, 2종의 물질은 동일한 비드에, 즉 "시스"로 또는 별개의 비드에, 즉 "트랜스"로 비드에 부동화된다. 예에 의해, 1차 활성화 신호를 제공하는 물질은 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 공자극 신호를 제공하는 물질은 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 물질 둘 다는 동등한 분자 양으로 동일한 비드에 동시부동화된다. 일 실시형태에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 각각의 항체의 1:1 비를 사용한다. 일부 실시형태에서, 비드에 결합된 CD3 : CD28 항체의 비는 100:1 내지 1:100 및 이들 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 본 발명의 일 양태에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되고, 즉 CD3 : CD28의 비는 1보다 작다. 본 발명의 소정의 실시형태에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1 초과이다.
1:500 대 500:1 및 이들 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 세포의 비는 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하기 위해 사용될 수 있다. 당업자가 용이하게 이해할 수 있는 것처럼, 입자 대 세포의 비는 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 오직 약간의 세포에 결합할 수 있지만, 더 큰 비드가 많이 결합할 수 있었다. 소정의 실시형태에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 및 이들 사이의 임의의 정수 값의 범위이고, 추가의 실시형태에서 그 비는 1:9 내지 9:1을 포함하고, 이들 사이의 임의의 정수 값은 또한 T 세포를 자극하도록 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 1:1의 세포 대 비드의 비가 사용된다. 당업자는 다양한 다른 비가 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특히, 비는 입자 크기 및 세포 크기 및 유형에 따라 변할 것이다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, T 세포와 같은 세포는 물질 코팅된 비드와 조합되고, 비드 및 세포는 후속하여 분리되고, 이후 세포가 배양된다. 대안적인 실시형태에서, 배양 전에, 물질 코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. 추가의 실시형태에서, 비드 및 세포는 처음에 자기 힘과 같은 힘의 적용에 의해 농축되어서, 세포 표면 마커의 결찰을 증가시키고, 이로써 세포 자극을 유도한다.
예에 의해, 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성 비드가 T 세포를 접촉시키게 하여서 세포 표면 단백질이 결찰될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포(예를 들어, CD4+ T 세포) 및 비드(예를 들어, 1:1의 비의 DYNABEAD CD3/CD28 T 상자성 비드)는 완충액 중에 조합된다. 다시, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하도록 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의미하게 감소시키는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 약 20억개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 다른 실시형태에서, 10000만개의 세포/ml 초과가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 1000만개, 1500만개, 2000만개, 2500만개, 3000만개, 3500만개, 4000만개, 4500만개 또는 5000만개의 세포/ml의 세포의 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 750억, 800억, 850억, 900억, 950억 또는 1000억개의 세포/ml의 세포의 농도가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 12500만개 또는 15000만개의 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 1x106개의 세포/mL의 밀도로 배양된 세포가 사용된다.
일부 실시형태에서, 혼합물은 몇 시간(약 3시간) 내지 약 14일 또는 이들 사이의 임의의 시간당 정수 값 동안 배양될 수 있다. 다른 실시형태에서, 비드 및 T 세포는 2일 내지 3일 동안 함께 배양된다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α, 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는 증식 및 생존능력에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지(Minimal Essential Media) 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 15(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 배지는, 무혈청인 또는 혈청(또는 혈장) 또는 한정된 호르몬 세트의 적절한 양, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 사이토카인(들)의 양이 보충된, 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민이 첨가된, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는 5% 인간 A/B 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep) 및 300 단위/ml의 IL-2(Miltenyi)가 보충된 X-VIVO-15 배지를 포함한다.
T 세포는 성장을 지지하는 데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기와 5% CO2) 하에 유지된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조작된 TCR을 포함하는 T 세포는 자가유래이다. 확장 및 게놈 변형 전에, 대상체로부터 T 세포의 원천을 얻는다. 말초혈 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양을 포함하는 많은 원천으로부터 T 세포와 같은 면역 세포를 얻을 수 있다. 본 발명의 소정의 실시형태에서, 당해 분야에서 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 소정의 실시형태에서, Ficoll™ 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기법을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 단위로부터 T 세포를 얻을 수 있다.
일부 실시형태에서, 성분채집술에 의해 개체의 순환 혈액으로부터의 세포를 얻는다. 성분채집술 생성물은 통상적으로 T 세포, 단핵구, 괴립구, B 세포, 다른 제핵된 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 일부 실시형태에서, 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속 가공 단계를 위한 적절한 완충액 또는 배지에 두도록 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한다. 대안적인 실시형태에서, 세척 용액은 칼슘이 결여되고, 마그네슘이 결여되거나, 모두는 아니지만 많은 2가 양이온이 결여될 수 있다. 당업자가 용이하게 이해하는 것처럼, 세척 단계는 제조사의 지시에 따라 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 반자동 "통과 흐름" 원심분리(예를 들어, Cobe 2991 세포 가공자, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하여 달성될 수 있다. 세척 후, 세포는 예를 들어 완충액과 함께 또는 이것 없이 Ca2+ 비함유, Mg2+ 비함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 다른 식염수 용액과 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거되고, 세포는 배양 배지에 바로 재현탁될 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포와 같은 면역 세포는 적혈구의 용해 및 단핵구의 고갈에 의해, 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 향류 원심 세정에 의해 말초혈 림프구로부터 단리된다. T 세포, B 세포, 또는 CD4+ T 세포와 같은 면역 세포의 특정 하위집단은 양성 선택 기법 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 시간 기간 동안 항-CD4 접합된 비드와의 항온처리에 의해 단리된다.
음성 선택에 의한 면역 세포 집단, 예컨대 T 세포 집단의 농후화는 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 지향된 항체의 조합에 의해 달성될 수 있다. 하나의 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 지향된 단일클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포분석법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농후화하기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD 11b, CD 16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다.
양성 선택 또는 음성 선택에 의한 원하는 면역 세포 집단의 단리를 위해, 세포 및 표면(예를 들어, 입자, 예컨대 비드)의 농도가 변할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하도록 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의미하게 감소시키는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다.
일부 실시형태에서, 2℃ 내지 10℃에서 또는 실온에서 변하는 속도로 변하는 시간 길이 동안 회전자에서 세포를 항온처리할 수 있다.
자극을 위한 T 세포 또는 T 세포와 같은 면역 세포가 단리된 PBMC는 또한 세척 단계 후 동결될 수 있다. 이론에 의해 구속되지 않고자 바라면서, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구를 제거하고 어느 정도로 단핵구를 제거함으로써 더 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에서 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 당해 분야에 공지되어 있고 이 문맥에서 유용할 것이지만, 하나의 방법은 20%의 DMSO 및 8%의 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10%의 덱스트란 40 및 5%의 덱스트로스, 20%의 인간 혈청 알부민 및 7.5%의 DMSO, 또는 31.25%의 Plasmalyte-A, 31.25%의 덱스트로스 5%, 0.45%의 NaCl, 10%의 덱스트란 40 및 5%의 덱스트로스, 20%의 인간 혈청 알부민 및 7.5%의 DMSO를 함유하는 배양 배지 또는 예를 들어 Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 수반하고, 이후 세포는 분당 1°의 속도로 -80℃로 동결되고, 액체 질소 저장 탱크의 기상에서 저장된다. 제어 동결의 다른 방법뿐만 아니라 즉시 -20℃에서 또는 액체 질소에서 비제어 동결을 사용할 수 있다.
약제학적 조성물
본 개시내용은 본 개시내용의 조작된 수용체를 포함하는 면역 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
이러한 조성물은 완충액, 예컨대 천연 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 및 보존제를 포함할 수 있다.
질환을 치료하는 방법
본원에는 본 개시내용의 조작된 수용체를 포함하는 면역 세포를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 면역 세포는 동일한 세포에서 조작된 수용체 둘 다를 발현한다.
일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 암을 갖는다. 암은 제어 없이 비정상 세포가 분열하고 근처의 조직에 분산하는 질환이다. 일부 실시형태에서, 암은 액체 종양 또는 고형 종양을 포함한다. 예시적인 액체 종양은 백혈병 및 림프종을 포함한다. 액체 종양인 추가의 암은 예를 들어 혈액, 골수 및 림프절에서 발생하는 것일 수 있고, 예를 들어 백혈병, 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프종, 호지킨 림프종, 흑색종 및 다발성 골수종을 포함할 수 있다. 백혈병은 예를 들어 급성 림프아구성 백혈병(ALL: acute lymphoblastic leukemia), 급성 골수성 백혈병(AML: acute myeloid leukemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수성 백혈병(CML: chronic myelogenous leukemia) 및 모발 세포 백혈병을 포함한다. 예시적인 고형 종양은 육종 및 암종을 포함한다. 암은 사살상 혈액, 골수, 폐, 유방, 결장, 골, 중추 신경계, 췌장, 전립선 및 난소를 포함하는 신체에서의 장기에서 생길 수 있다. 고형 종양인 추가의 암은 예를 들어 전립선암, 고환암, 유방암, 뇌암, 췌장암, 결장암, 갑상선암, 위암, 폐암, 난소암, 카포시 육종, 피부암, 편평 세포 피부암, 신장암, 두경부암, 갑상선암, 코, 입, 목의 촉촉한 점막 내벽에 형성하는 편평 암종, 방광암, 골육종, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 간암 및 신장암을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료되는 병태는 흑색종 세포, 전립선암 세포, 고환암 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 췌장암 세포, 결장암 세포, 갑상선암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 난소암 세포, 카포시 육종 세포, 피부암 세포, 신장암 세포, 두경부암 세포, 목암 세포, 편평 암종 세포, 방광암 세포, 골육종 세포, 자궁경부암 세포, 자궁내막암 세포, 식도암 세포, 간암 세포 또는 신장암 세포의 전이이다.
복수의 암 세포가 제1의, 활성인자 리간드를 발현하고 제2의, 억제제 리간드를 발현하지 않는 임의의 암은 본 개시내용의 범위 내로서 고안된다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 CEA 양성 암은 결장직장암, 췌장암, 식도암, 위암, 폐 선암, 두경부암, 미만성 대형 B 세포 암 또는 급성 골수성 백혈병 암을 포함한다.
암을 치료하는 것은 종양의 크기를 감소시킬 수 있다. 종양의 크기의 감소는 "종양 회귀"라고도 칭해질 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 크기는 치료 전의 이의 크기에 비해 5% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 종양 크기는 10% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 20% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 30% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 40% 이상만큼 감소하고; 훨씬 더 바람직하게는, 50% 이상만큼 감소하고; 가장 바람직하게는, 75% 이상 초과만큼 감소한다. 종양의 크기는 임의의 재현가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 종양의 크기는 종양의 직경으로서 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 종양 용적을 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 용적은 치료 전의 이의 용적에 비해 5% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 종양 용적은 10% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 20% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 30% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 40% 이상만큼 감소하고; 훨씬 더 바람직하게는, 50% 이상만큼 감소하고; 가장 바람직하게는, 75% 이상 초과만큼 감소한다. 종양 용적은 임의의 재현가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 종양의 수를 감소시킨다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 수는 치료 전의 수에 비해 5% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 종양 수는 10% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 20% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 30% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 40% 이상만큼 감소하고; 훨씬 더 바람직하게는, 50% 이상만큼 감소하고; 가장 바람직하게는, 75% 초과만큼 감소한다. 종양의 수는 임의의 재현가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 종양의 수는 나안에 가시적인 종양을 계수함으로써 또는 규정된 배율에서 측정될 수 있다. 바람직하게는, 규정된 배열은 2x, 3x, 4x, 5x, 10x 또는 50x이다.
암을 치료하는 것은 1차 종양 부위로부터 먼 다른 조직 또는 장기에서의 전이성 병변의 수를 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 전이성 병변의 수는 치료 전의 수에 비해 5% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 전이성 병변의 수는 10% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 20% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 30% 이상만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 40% 이상만큼 감소하고; 훨씬 더 바람직하게는, 50% 이상만큼 감소하고; 가장 바람직하게는, 75% 초과만큼 감소한다. 전이성 병변의 수는 임의의 재현가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 전이성 병변의 수는 나안에 가시적인 전이성 병변을 계수함으로써 또는 규정된 배율에서 측정될 수 있다. 바람직하게는, 규정된 배열은 2x, 3x, 4x, 5x, 10x 또는 50x이다.
암을 치료하는 것은 담체 단독을 받는 집단과 비교하여 치료된 대상체의 집단의 평균 생존 시간을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30일 초과만큼 증가하고; 더 바람직하게는, 60일 초과만큼; 더 바람직하게는, 90일 초과만큼; 가장 바람직하게는, 120일 초과만큼 증가한다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 임의의 재현가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어 활성 화합물에 의한 치료의 개시 후 집단에 대해 생존기간의 평균 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 또한 예를 들어 활성 화합물에 의한 1회차의 치료의 완료 후 집단에 대해 생존기간의 평균 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 비치료된 대상체의 집단과 비교하여 치료된 대상체의 집단의 평균 생존 시간을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30일 초과만큼 증가하고; 더 바람직하게는, 60일 초과만큼; 더 바람직하게는, 90일 초과만큼; 가장 바람직하게는, 120일 초과만큼 증가한다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 임의의 재현가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어 활성 화합물에 의한 치료의 개시 후 집단에 대해 생존기간의 평균 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 또한 예를 들어 활성 화합물에 의한 1회차의 치료의 완료 후 집단에 대해 생존기간의 평균 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 본 발명의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 프로드럭, 대사물질, 유사체 또는 유도체가 아닌 약물에 의한 단일치료를 받는 집단과 비교하여 치료된 대상체의 집단의 평균 생존 시간을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30일 초과만큼 증가하고; 더 바람직하게는, 60일 초과만큼; 더 바람직하게는, 90일 초과만큼; 가장 바람직하게는, 120일 초과만큼 증가한다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 임의의 재현가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어 활성 화합물에 의한 치료의 개시 후 집단에 대해 생존기간의 평균 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 또한 예를 들어 활성 화합물에 의한 1회차의 치료의 완료 후 집단에 대해 생존기간의 평균 길이를 계산함으로써 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 담체 단독을 받는 집단과 비교하여 치료된 대상체의 집단의 사망률을 감소시킬 수 있다. 암을 치료하는 것은 비치료된 집단과 비교하여 치료된 대상체의 집단의 사망률을 감소시킬 수 있다. 암을 치료하는 것은 본 발명의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 프로드럭, 대사물질, 유사체 또는 유도체가 아닌 약물에 의한 단일치료를 받는 집단과 비교하여 치료된 대상체의 집단의 사망률을 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 사망률은 2% 초과만큼; 더 바람직하게는, 5% 초과만큼; 더 바람직하게는, 10% 초과만큼; 가장 바람직하게는, 25% 초과만큼 감소한다. 치료된 대상체의 집단의 사망률의 감소는 임의의 재현가능한 수단에 의해 측정될 수 있다. 집단의 사망률의 감소는 예를 들어 활성 화합물에 의한 치료의 개시 후 집단에 대해 단위 시간당 질환 관련 사망의 평균 수를 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 사망률의 감소는 또한 예를 들어 활성 화합물에 의한 1회차의 치료의 완료 후 집단에 대해 단위 시간당 질환 관련 사망의 평균 수를 계산함으로써 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 종양 성장 속도를 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 성장 속도는 치료 전의 수에 비해 적어도 5%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 종양 성장 속도는 적어도 10%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 20%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 30%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 40%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소하고; 훨씬 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소하고; 가장 바람직하게는, 적어도 75%만큼 감소한다. 종양 성장 속도는 임의의 재현가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 종양 성장 속도는 단위 시간당 종양 직경의 변화에 따라 측정될 수 있다.
암을 치료하는 것은 종양 재성장을 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 재성장은 5% 미만이고; 더 바람직하게는, 종양 재성장은 10% 미만이고; 더 바람직하게는, 20% 미만; 더 바람직하게는, 30% 미만; 더 바람직하게는, 40% 미만; 더 바람직하게는, 50% 미만; 훨씬 더 바람직하게는, 50% 미만; 및 가장 바람직하게는, 75% 미만이다. 종양 재성장은 임의의 재현가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 종양 재성장은 예를 들어 치료 뒤에 이어지는 과거의 종양 수축 후에 종양의 직경의 증가를 측정함으로써 측정된다. 종양 재성장의 감소는 치료가 중단된 후 재발생하는 종양의 실패에 의해 표시된다.
세포 증식성 장애를 치료하거나 예방하는 것은 세포 증식의 속도를 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 세포 증식의 속도는 적어도 5%; 더 바람직하게는, 적어도 10%; 더 바람직하게는, 적어도 20%; 더 바람직하게는, 적어도 30%; 더 바람직하게는, 적어도 40%; 더 바람직하게는, 적어도 50%; 훨씬 더 바람직하게는, 적어도 50%; 가장 바람직하게는, 적어도 75%만큼 감소한다. 세포 증식의 속도는 임의의 재현가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 세포 증식의 속도는 예를 들어 단위 시간당 조직 샘플에서의 분열 세포의 수를 측정하여 측정된다.
세포 증식성 장애를 치료하거나 예방하는 것은 증식 세포의 비율을 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 증식 세포의 비율은 적어도 5%; 더 바람직하게는, 적어도 10%; 더 바람직하게는, 적어도 20%; 더 바람직하게는, 적어도 30%; 더 바람직하게는, 적어도 40%; 더 바람직하게는, 적어도 50%; 훨씬 더 바람직하게는, 적어도 50%; 가장 바람직하게는, 적어도 75%만큼 감소한다. 증식 세포의 비율은 임의의 재현가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 증식 세포의 비율은 예를 들어 조직 샘플에서의 비분열 세포의 수에 대해 분열 세포의 수를 정량화함으로써 측정된다. 증식 세포의 비율은 유사분열 지수와 동등할 수 있다.
세포 증식성 장애를 치료하거나 예방하는 것은 세포 증식의 부위 또는 구역의 크기를 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 세포 증식의 부위 또는 구역의 크기는 치료 전의 이의 크기에 비해 적어도 5%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 10%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 20%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 30%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 40%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소하고; 훨씬 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소하고; 가장 바람직하게는, 적어도 75%만큼 감소한다. 세포 증식의 부위 또는 구역의 크기는 임의의 재현가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 세포 증식의 부위 또는 구역의 크기는 세포 증식의 부위 또는 구역의 직경 또는 폭으로서 측정될 수 있다.
세포 증식성 장애를 치료하거나 예방하는 것은 비정상 외관 또는 형태를 갖는 세포의 수 또는 비율을 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 비정상 형태를 갖는 세포의 수는 치료 전의 이의 크기에 비해 적어도 5%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 10%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 20%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 30%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 40%만큼 감소하고; 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소하고; 훨씬 더 바람직하게는, 적어도 50%만큼 감소하고; 가장 바람직하게는, 적어도 75%만큼 감소한다. 비정상 세포 외관 또는 형태는 임의의 재현가능한 측정 수단에 의해 측정될 수 있다. 비정상 세포 형태는 예를 들어 도립 조직 배양 현미경을 사용하여 현미경검사에 의해 측정될 수 있다. 비정상 세포 형태는 핵 다형태성의 형태를 취할 수 있다.
키트 및 제조 물품
본 개시내용은 본원에 기재된 조작된 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 벡터, 및 본원에 기재된 조작된 수용체를 포함하는 면역 세포를 포함하는 키트 및 제조 물품을 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 물품, 예컨대 바이알, 주사기 및 사용 설명서를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 본 개시내용의 하나 이상의 조작된 수용체를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 것과 같은 조작된 수용체를 포함하는 복수의 면역 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 면역 세포는 복수의 T 세포를 포함한다.
실시예
실시예 1: 활성인자 표적 리간드의 선택
본 발명자들은 활성인자 리간드에 대한 GTex 유전자 발현 데이터베이스(gtexportal.org/home/)를 살펴보았다. 활성인자 리간드는 하기 특징을 가져야 한다: 처음에, 하나의 유형의 활성인자 리간드는 큰 활성화 신호를 전달하는 가능성을 부여하는 높은 표면 발현을 가져야 한다. 대안적으로, MiHA와 같은 활성인자는 세포 표면에서 낮은 밀도를 가질 수 있다. 둘째로, 활성인자 리간드는 필수 세포 기능을 가져야 하고, 이는 활성인자 리간드의 대립유전자가 종양 세포에서의 이수성으로 인해 소실되는 방지하고, 이들이 종양의 전개 동안 돌연변이유발을 덜 겪게 한다. 마지막으로, 활성인자 리간드는 모든 종양 세포에 존재해야 한다. 억제제 리간드가 또한 표적 세포를 제외한 모든 세포에서 발현되면 활성인자 리간드는 모든 세포에서 발현될 수 있다. 활성인자는 또한 암 세포에서 발현되어야 한다. 활성인자는 억제제와 조합되어 사용될 때 예를 들어 모든 세포에서 널리 발현될 수 있다.
도 4a는 트랜스페린 수용체(TFRC)인 예시적인 활성인자 리간드의 RNA 발현 프로파일을 보여준다. 도 4a에서 볼 수 있는 것처럼, RNA 수준에서의 TFRC의 발현은 편재하고 비교적 고르다. 추가로, TFRC는 필수 유전자이다: 기능 동형접합성 TFRC 돌연변이의 소실은 마우스에서 배아 치사이다.
도 4b는 후보 차단제, HLA-A 및 후보 활성인자, HLA-B의 발현 프로파일을 보여준다. 도 4b에서 볼 수 있는 것처럼, 후보 활성인자 및 차단제 HLA 클래스 I 발현은 함께 추적하여 활성인자와 차단제 쌍의 최적화의 도전을 쉽게 한다.
실시예 2: 암 세포에서 소실된 억제제 표적 리간드의 선택
이형접합성 소실
억제제 리간드의 하나의 가능한 풀은 이형접합성 소실로 인해 종양 세포에서 소실된 리간드이다. 26개의 조직학적 유형에 걸친 3131개의 종양 샘플의 분석에서, Beroukhim 등은 통상적인 종양에서, 게놈의 25%가 아암 수 단일 카피 수 변경(중복 및 결실)에 의해 영향을 받고, 게놈의 10%가 2% 오버랩으로 병소 단일 카피 수 변경에 의해 영향을 받는다는 것을 발견하였다. (Beroukhim et al, Nature 463:899-905 (2010)). 추가로, 많은 LOH 영역은 종양 유형들 사이에 중첩하고, 영역의 불과 22%는 하나의 종양 유형에 고유하다. 예를 들어, Beroukhim 등은 증폭 피크의 80% 및 결실 피크의 78%가 17개의 가장 대표적인 종양 유형에 흔하다는 것을 발견하였다. 이와 같이, 억제제 LBD에 의해 선택적으로 결합될 수 있는 LOH로 소실된 대립유전자는 표적 세포에 의해 발현되지 않은 잠재적인 억제제 표적이다.
본 발명자들은 이형접합성 소실을 통해 암에서 소실된 잠재적인 억제제 리간드에 대해 Cancer Genome Atlas Program (https://portals.broadinstitute.org/tcga/home)을 조사하였다. 데이터세트인 all_cancers dataset(모든_암)는 33개의 암 유형으로부터의 10,844개의 암으로 이루어졌다. 하나의 유형의 억제제 리간드는 하기 특징을 가져야 한다: 처음에, 억제제 리간드는 조직에 걸쳐 높은 균질한 표면 발현을 가져야 한다. 이는 큰 공평한 억제 신호를 전달하는 능력을 부여한다. 억제제 리간드는 많은 종양에서 부재하거나 다형성이어야 한다. 추가로, 항체 균주 또는 유전 분석과 같은 종래의 방법을 통해 종양 세포에서 억제제 리간드의 소실을 구별하는 것이 쉬워야 한다. MiHA와 같은 다른 유형의 억제제 리간드는 낮은 표면 발현을 가질 수 있다.
억제제 리간드의 하나의 풀은 암 세포에서 LOH를 통해 소실된 주요 조직적합 복합체(MHC) 대립유전자이다. 억제제 리간드로서의 이 대립유전자의 사용은 펩타이드 MHC 표적(pMHC)을 요하지 않고, 예를 들어 pan HLA-A*02 대립유전자가 사용될 수 있다.
Y 염색체의 소실
성인 남성 발현된 Y 염색체 유전자는 Y 염색체의 소실을 통한 잠재적인 억제제 리간드이다. Y 염색체에서 적어도 60개의 단백질 코딩 유전자가 있다. 몇몇 Y 염색체 유전자는 성인 남성에서 광범위하게 발현되고, Y 염색체 소실로 인해 암에서 소실될 수 있다. 몇몇 다른 광범위하게 발현된 세포질 단백질은 pMHC 억제제 후보(예를 들어, TMSB4Y, EIF1AY)이다. NLGN4Y는 광범위하게 남성에서 그리고 또한 후보에서 발현된 I형 내재성 막 단백질이다.
실시예 3: 쌍을 지은 A 수용체 및 B 수용체를 갖는 표면 항원이 결여된 세포의 표적화
본 발명자들은 이형접합성 소실에 대한 표적화 시스템이 시험관내 및 마우스 암 모델에서 작동한다는 것을 보여준다.
정상 세포와 종양 세포 사이의 구별은 2개의 기능에 따라 달라진다: (i) 종양에서 또한 보유된 정상 세포의 표면 상의 에피토프를 인식하는 활성인자("A") 수용체; 및 (ii) 종양 세포로부터 소실된 대립유전자 생성물에서의 제2 표면 에피토프를 인식하는 차단제("B") 수용체. 이 실시예에서, 본 발명자들은 A 및 B 둘 다에 대해 펩타이드-MHC(pMHC) 표적을 사용하였다(도 5a 참조):
Figure pct00052
A 수용체로서의 HLA-A*02-MAGE-A3(FLWGPRALV) pMHC에 대한 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체; 및
Figure pct00053
B 수용체로서의 HLA-A*02-NY-ESO-1(SLLMWITQC/V)에 결합하는 scFv를 포함하고, PD-1 세포내 도메인(ICD), CTLA-4 세포내 도메인(ICD) 또는 LILRB1(LIR1) 세포내 도메인(ICD)을 포함하는 키메라 항원 수용체.
PD-1 ICD 또는 CTLA-4-ICD를 갖는 각각의 차단제(B) 수용체는 자극으로서 T2 세포에 로딩된 펩타이드의 적정에 의해 측정된 것처럼 10x 미만의 저카트 세포에서의 활성화의 EC50의 이동을 매개하였다(도 5b). 놀랍게도, NY-ESO-1 LBD 및 LIR-1의 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 힌지 도메인(LILRB1) 수용체를 포함하는 B 수용체는 5,000x 초과의 EC50 이동을 매개하였다(또한 도 5b). SLLMWITQC/V 이외의 비관련된 대조군 HLA-A*02-결합 펩타이드의 적정은 통상적으로 10x 미만의 총 이동에 대한 기여인 이용 가능한 HLA 분자에 대해 T2 세포에 대한 로딩된 펩타이드의 경쟁에 의해 야기된 이동의 추정치를 제공하였다(도 8). 본원에 보고된 EC50 이동 값에 대해, 본 발명자들은 통상적으로 활성인자 단독 작제물의 EC50을 비교한다.
4개의 상이한 pMHC 표적에 대해, 총 6개의 상이한 scFv는 10 내지 1,000x의 범위의 EC50으로 LIR-1 매개된 급격한 이동에 일을 하였다(도 5c). EC50 이동의 정도(즉, 차단 강도)는 표준 CAR에 융합될 때 scFv의 EC50과 상관되었다(데이터 비도시). LIR-1 B 신호전달은 다수의 A 표적 및 scFv로부터의 A 신호전달을 차단하였다(도 5d, 도 26). 봉쇄는 리간드 의존적이었다(도 9). LBD를 갖지만, ICD가 결여되거나 ICD의 중요한 요소에서 돌연변이를 함유하는 대조군 B 수용체는 A 수용체 신호에 의해 활성화를 차단하지 않는다. (도 10). A 수용체 및 B 수용체를 갖는 조작된 T 세포는 다수의 표적 항원 및 항원 결합 도메인(즉, LBD 서열)에 걸쳐 작용한다.
LIR-1 ICD는 또한 3개의 상이한 pMHC 표적에 의해 T 세포 수용체(TCR) 세포외 도메인에 융합될 때 작용한다(방법 참조). MAGE-A3으로부터 2개 및 HPV로부터의 1개인 3개의 상이한 pMHC 표적에 대한 TCR을 분석하였다. 모든 경우에, LIR-1 기반 B 수용체는 활성화 EC50을 1,000 내지 10,000x의 범위로 다량 이동시켰다. NY-ESO-1 TCR 가변 도메인 LBD "ESO(Ftcr)"가 이것에 융합된 LIR-1 기반 B 수용체는 또한 CAR 또는 TCR에 의한 활성화를 차단할 수 있었다. 이는 하기 수용체 쌍을 포함하였다.
1. MAGE-A3FLWGPRALV 펩타이드:MHC 복합체에 결합하는 TCR LBD를 포함하는 활성인자(A) TCR("MP1-TCR")은 scFv NY-ESO-1 scFv LBD("ESO") 및 LIR-1 ICD를 포함하는 B 수용체에 의해 차단되었고, 이는 활성화 EC50을 다량 이동시켰다(도 5e);
2. MAGE-A3 MPKVAELVHFL 펩타이드:MHC 복합체에 결합하는 제2 TCR LBD를 포함하는 A TCR("MP2-TCR")은 scFv NY-ESO-1 scFv LBD("ESO") 및 LIR-1 ICD를 포함하는 B 수용체에 의해 차단되었고, 이는 활성화 EC50을 다량 이동시켰다(도 5e);
3. HPVTIHDIILECV 펩타이드:MHC 복합체에 결합하는 TCR LBD를 포함하는 A TCR("HPV E6-TCR")은 scFv NY-ESO-1 scFv LBD("ESO") 및 LIR-1 ICD를 포함하는 B 수용체에 의해 차단되었고, 이는 활성화 EC50을 다량 이동시켰다(도 5e);
4. MAGE-A3FLWGPRALV 펩타이드:MHC 복합체에 결합하는 TCR LBD를 포함하는 A TCR("MP1-TCR")은 NY-ESO-1 TCR LBD("ESO(Ftcr)") 및 LIR-1 ICD를 포함하는 B 수용체에 의해 차단되었다, 이 차단제는 활성화 EC50을 다량 이동시켰다(도 5f);
5. MAGE-A3 FLWGPRALV 펩타이드:MHC 복합체에 결합하는 scFv LBD를 포함하는 A CAR("MP1-CAR")은 TCR NY-ESO-1 TCR 가변 도메인 LBD("ESO(Ftcr)") 및 LIR-1 ICD를 포함하는 B 수용체에 의해 차단되었다. 이 차단제는 활성화 EC50을 다량 이동시켰다(도 5f).
시스 효과의 확인
조작된 효과기 세포는 오직 A+인 잠재적인 표적 세포를 구별해야 하고, 즉 이중 A+ 및 B+인 것으로부터 활성인자를 오직 디스플레이해야 한다. 의도된 것처럼 본 발명자들의 수용체 시스템 작업을 단언하기 위해, 대략 세포 크기(d 약 2.8 μm)의 표적 로딩된 비드가 A 수용체 및 B 수용체를 갖는 조작된 효과기 세포(저카트 세포)에 의해 시험되었다(도 5g). A+ 비드가 총 비드의 불과 20%를 포함할 때에도 효과기 세포는 확실히 A+ 비드와 B+ 비드의 혼합물에 의해 활성화되었다. 이는 효과기 세포가 (B+ 비드에 의해 표시된) 정상 세포를 포함하는 혼합 집단에서 (A+ 비드에 의해 표시된) 이형접합성 소실을 갖는 표적을 인식할 수 있다는 것을 확인시켜준다.
표적 농도 독립성의 확인
환자에서, 표적 밀도는 A 표적 및 B 표적의 발현 수준에 따라 변할 것이다. 본 발명자들은 상기 시스템이 A 표적 밀도가 변할 때(데이터 비기재) 및 B 표적 밀도가 변할 때(도 5h)인 둘 다에 고밀도 표적 및 저밀도 표적 둘 다로 작동한다는 것을 확인하였다. 도 5h에서, 펩타이드 독립적 방식으로 B 세포 마커 CD19 또는 HLA-A*02에 결합된 scFv가 시험되었다. 이 비-pMHC 표적은 100,000개의 에피토프/세포의 범위로 연장될 수 있는 표면 항원을 나타낸다. 이 경우에, A 대 B 모듈 발현의 비는 일시적 형질주입 검정에서 상이한 DNA 농도를 사용하여 변했다. 10x 초과의 Emax 이동이 관찰되었다. 이 실험은 pMHC 표적에 관찰된 이중 수용체 시스템의 특성이 고밀도 표적에 대해 일반적으로 동일하다는 것을 보여주었다.
1차 T 세포에서의 B 수용체 기능
세포 생존능력에 대한 판독정보로서 루시퍼라제에 의해 표적 펩타이드의 적정이 로딩된 레닐라 루시퍼라제(Biosettia)를 발현하는 MCF7 종양 세포는 표적 세포로서 사용되었다. 1차 T 세포는 A 수용체로서의 HPV TCR("HPV E7 TCR") 및 LIR-1 힌지, 막관통 도메인 및 ICD에 융합된 항-NY-ESO-1 scFv을 포함하는 B 수용체("ESO-LIR-1")에 의해 형질도입되거나, 형질도입되지 않는다("비형질도입됨"). 형질도입된 T 세포는 B 수용체 LBD에 결합하는 HLA-A*02 사합체에 커플링된 비드를 사용하여 물리적 선택을 통해 농후화된다. 표적 농도를 변화시키기 위해, 표적 세포는 다양한 양의 HPV 펩타이드가 로딩되었다. 1차 T 세포는 용량 의존적 방식으로 활성화되었다. B 수용체의 발현은 EC50 곡선을 약 100x만큼 이동시켰다(도 6a). 저카트 세포에서 (다양한 활성인자 : 차단제 DNA 비를 형질주입하여 달성된) A 수용체 대 B 수용체의 다양한 비에서 항-HLA-A*02 LBD 및 LIR-1 힌지, 막관통 도메인 및 ICD를 포함하는 B 수용체와 쌍을 이룬 항-NY-ESO-1 CAR A 수용체에 대해 유사한 결과를 얻었다(도 6b). 이 결과는 T 세포에서 HLA-A*02 차단제와 쌍을 이룬 CD19 CAR 활성인자에 의해 확인되었다(도 6c). 이와 같이, 활성인자 및 차단제 수용체 쌍의 기본 기능은 이의 복합함, 이질성 및 공여자-대-공여자 가변성에도 불구하고 1차 T 세포에서 재현되었다.
실시예 4: 쌍을 이룬 A 및 B 수용체에 의한 이형접합성 소실의 표적화
HLA 유전자좌는 오직 HLA-A*02 대립유전자를 갖는 집단의 하위집단으로 다형이다. 로딩된 펩타이드에 독립적인 HLA*A02 대립유전자의 MHC에 결합하는 리간드 결합 도메인("pan HLA-A*02" LBD)은 종양 세포에서 HLA에 이형접합성이고 HLA-A*02 대립유전자의 LOH를 갖는 대상체에서 종양을 표적화하도록 사용될 수 있다.
HLA-A*02-특이적 scFv는 LIR-1 모듈에 융합되고, 저카트 세포에서 pMHC 의존적 활성인자(ESO-CAR, 도 6b)의 존재 하에 차단제로서 기능하는 것으로 나타났다. 게다가, 항-CD19 scFv를 포함하는 A 수용체 및 HLA-A*02-특이적 scFv 및 LIR-1 LBD를 포함하는 B 수용체 둘 다를 발현하는 1차 T 세포에서, B 수용체는 A 수용체를 원하는 대로 차단하였다(도 6c).
CD19+이고 HLA-A*02에 음성인 라지 표적 세포는 LOH를 통해 소실된 HLA-A*02를 갖는 종양 세포를 모델링하도록 사용될 수 있다. HLA-A*02를 안정하게 발현하는 동일한 세포주는 정상 세포의 모델로서 사용될 수 있다. 라지 표적 세포가 오직 CD19를 발현하면 라지 세포주는 CD19 CAR 및 HLA-A*02 LIR-1 차단제를 발현하는 저카트 효과기 세포를 활성화하였다. 라지 표적 세포가 HLA-A*02를 발현하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 형질주입될 때, 저카트 효과기 세포의 활성화가 차단되었다(도 11).
상기 기재된 것처럼, A 수용체 결합 CD19 및 B 수용체 결합 HLA-A*02는 1차 T 세포뿐만 아니라 저카트 세포에서 작동하였다. 조작된 T 세포는 HLA-A*02 발현의 부재 하에 CD19 발현 라지 세포를 사멸하였다(도 6c, 상부 패널). CD19 및 HLA-A*02 둘 다를 발현한 라지 세포는 오직 활성화 모듈을 발현하는 T 세포에 의해 사멸되었지만, 활성인자 및 차단제 모듈 둘 다를 발현하는 T 세포에 의해 동시배양될 때 감마-인터페론(IFNg) 분비(데이터 비도시) 및 세포독성 둘 다로부터 차단되었다(도 6c, 중간 패널). 활성인자 및 차단제 모듈을 보유하는 1차 T 세포는 혼합된 배양에서 CD19+/HLA-A*02+ "정상" 세포(도 6c, 오른쪽 패널)로부터 CD19+ "종양"(도 6c, 하부 패널)을 구별하였다.
활성인자 및 차단제 기전에 기초한 T 세포 치료제는 가역적으로 작용할 수 있어야 하고, 즉 봉쇄의 상태로부터 활성화로 그리고 다시 봉쇄로 사이클링할 수 있어야 한다. 효과기 세포를 CD19+ 또는 D19+/HLA-A2*02+ 중 어느 하나인 여러 회차의 라지 세포와 동시배양하였고, 이들은 회차들 사이의 배양으로부터 제거되었다. 원하는 것처럼, 표적 세포 노출의 차단-사멸-차단 프로그램(도 6d) 및 사멸-차단-사멸 프로그램(도 6e) 둘 다에 대해 정상 세포에 노출된 효과기 세포는 라지 표적 세포에 노출될 때 활성화되지 않았다. 효과기 T 세포는 이들이 노출된 표적 세포에 따라 차단의 상태로부터 세포독성으로 그리고 다시 사이클링할 수 있었다.
실시예 5: 쌍을 지은 A 및 B 수용체에 의한 이형접합성 소실의 생체내 표적화
본 발명자들은 생체내 실험에 대해 준비하기 위해 1차 T 세포에서 조작된 CD19/HLA-A*02 활성인자/차단제 쌍이 표준 CD3/CD28 자극을 사용하여 많은 수로 시험관내 확장이 가능하게 되었다는 것을 보여주었다(도 7a). 이와 같이, 세포 산물은 치료제로서 환자에서 사용하기 위한 충분한 분량으로 제조될 수 있다.
면역손상된 (NGS-HLA-A2.1) 마우스의 옆구리로 라지 표적 세포를 주사함으로써 CD19+/HLA-A*02+ 또는 CD19+/ HLA-A*02- 종양 세포 마우스 이종이식편이 생성되었다(도 7b). 라지 세포를 2e6개 또는 1e7개의 T 세포인 2의 용량에서 주사하고, 시간에 걸쳐 종양 성장 및 이식된 T 세포의 지속성을 분석하였다. 오직 CD19+/HLA-A*02- 종양 세포는 전달된 T 세포 수에 의해 추적된 마우스 및 종양 대조군에서 사멸되어서 숙주 마우스의 생존을 촉진한다(도 7c 내지 도 7e 및 도 12). 정상 세포를 모델링하도록 설계된 정상 CD19+/HLA-A*02+ 세포는 치료에 의해 영향을 받지 않는다.
요약
본 발명자들은 LOH로부터 유래된 암 표적의 광범위한 새로운 종류의 이점을 취할 수 있는 합성 신호 통합 시스템을 개발하였다. 상기 시스템은 부당한 실험 없이 LOH를 갖는 환자에 대한 세포 치료의 요건을 충족한다. 상기 시스템은 저카트 세포, 1차 T 세포 및 생체내에서 튼튼히 작동한다. 이 시스템은 또한 (i) 모듈식 및 가요성이고, 상이한 표적 밀도로 CAR 및 TCR 양상에 걸쳐 작동하고; (ii) 차단제 및 활성인자 표적에 의해 침묵화될 때 소수의 세포가 오직 활성인자를 발현할 때가 아니라 시스에서 하나의 표면에 존재하고; (iii) 신체에 걸쳐 종양 세포를 사냥할 필요성과 일치하여 가역적으로 상태를 스위칭한다.
실시예 6: 실시예 3 내지 실시예 5를 위한 방법
세포 배양
BPS Bioscience로부터 NFAT 루시퍼라제 리포터를 암호화하는 저카트 세포를 얻었다. ATCC로부터 이 연구에서 사용된 모든 다른 세포주를 얻었다. 배양에서, 저카트 세포를 10% FBS, 1% Pen/Strep 및 0.4mg/mL G418/제네티신이 보충된 RPMI 배지에서 유지켰다. ATCC에 의해 제시된 것처럼 T2, MCF7 및 라지 세포를 유지시켰다. 5의 MOI에서 라지 세포를 HLA-A*02 렌티바이러스(커스텀 렌티바이러스, Alstem)로 형질도입함으로써 "정상" 라지 세포를 제조하였다. FACSMelody Cell Sorter(BD)를 사용하여 HLA-A*02-양성 라지 세포를 분류하였다.
플라스미드 작제
힌지, 막관통 영역, 및/또는 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 하위패밀리 B 구성원 1, LILRB1(LIR-1), 예정 세포사 단백질 1, PDCD1(PD-1) 또는 세포독성 T 림프구 단백질 4, CTLA4(CTLA-4)의 세포내 도메인을 포함하는 수용체의 도메인에 NY-ESO-1 scFv LBD를 융합함으로써 NY-ESO-1-반응성 억제 작제물이 생성되었다. 유전자 분절은 Golden Gate 클로닝을 사용하여 조합되고, 렌티바이러스 발현 플라스미드에 함유된 인간 EF1α 프로모터의 하류에 삽입되었다.
저카트 세포 형질주입
3 펄스, 1500 V, 10 msec의 설정을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 100 uL 형식 Neon 전기천공 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 통해 저카트 세포를 일시적으로 형질주입하였다. 동시형질주입을 1e6개의 세포당 1 내지 3 ug의 활성인자 CAR 또는 TCR 작제물 및 1 내지 3 ug의 scFv 또는 Ftcr 차단제 작제물 또는 빈 벡터로 수행하고, 20% 열 불활성화된 FBS 및 0.1% Pen/Strep가 보충된 RPMI 배지에서 회수하였다.
저카트-NFAT-루시퍼라제 활성화 연구
Genscript에 의해 펩타이드, MAGE-A3(MP1; FLWGPRALV), MAGE-A3(MP2; MPKVAELVHFL), HPV E6(TIHDIILECV), HPV E7(YMLDLQPET) 및 변형된 NY-ESO-1 ESO(ESO; SLLMWITQV)를 합성하였다. 활성화 펩타이드는 50 uM에서 시작하여 연속 희석되었다. 차단제 펩타이드인 NY-ESO-1은 (달리 표시되지 않는 한) 50 uM으로 희석되었고, 이것은 활성화 펩타이드 연속 희석액에 첨가되고 후속하여 1% BSA 및 0.1 % Pen/Strep가 보충된 15 uL의 RPMI 중에 1e4 T2 세포에 로딩되고, Corning® 384웰 Low Flange White Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates에서 항온처리되었다. 다음날, 1e4 저카트 세포를 10% 열 불활화된 FBS 및 0.1% Pen/Strep가 보충된 15 uL의 RPMI에 재현탁시키고, 펩타이드 로딩된 T2 세포에 첨가하고, 6시간 동안 동시배양하였다. 저카트 발광을 평가하도록 ONE-Step Luciferase Assay System(BPS Bioscience)이 사용되었다. 기술적 중복으로 검정이 수행되었다.
1차 T 세포 형질도입, 확장 및 농후화
동결된 PBMC를 37℃ 수욕에서 해동하고, 1% 인간 혈청을 갖는 LymphoONE(Takara)에서 1e6개의 세포/mL로 배양하고, IL-15(10ng/mL) 및 IL-21(10ng/mL)이 보충된 1:100의 T 세포 TransAct(Miltenyi)를 사용하여 활성화하였다. 24시간 후, 렌티바이러스를 5의 MOI에서 PBMC에 첨가하였다. 세포가 TransAct 자극 하에 확장하게 하도록 PBMC를 추가 2일 내지 3일 동안 배양하였다. 확장 후, 제조사의 지시에 따라 항-PE 마이크로비드(Miltenyi)를 사용하여 활성인자 및 차단제 형질도입된 1차 T 세포는 농후화되었다. 간단히, 1차 T 세포를 MACS 완충액(PBS 중의 0.5% BSA + 2 mM EDTA)에서 4℃에서 30분 동안 1:100 희석으로 CD19-Fc(R&D Systems)와 항온처리하였다. 세포를 MACS 완충액 중에 3회 세척하고, MACS 완충액 중에 4℃에서 30분 동안 2차 항체(1:200) 중에 항온처리하였다. 이후, 세포를 항-PE 마이크로비드에서 항온처리하고, LS 칼럼(Miltenyi)을 통해 통과시켰다.
1차 T 세포 시험관내 세포독성 연구
pMHC 표적에 의한 세포독성 연구를 위해, 농후화된 1차 T 세포를 48시간 동안 3:1의 효과기:표적 비로 상기 기재된 것처럼 표적 펩타이드의 적정으로 로딩된 레닐라 루시퍼라제(Biosettia)를 발현하는 2e3개의 MCF7 세포와 항온처리하였다. Renilla Luciferase Reporter Assay System(Promega)을 사용하여 살아 있는 루시퍼라제 발현 MCF7 세포를 정량화하였다. 비-pMHC 표적에 의한 세포독성 연구를 위해, 농후화된 1차 T 세포를 6일 이하 동안 3:1의 효과기:표적 비로 2e3개의 WT 라지 세포("종양" 세포) 또는 HLA-A*02 형질도입된 라지 세포("정상" 세포)와 항온처리하였다. GFP 및 레닐라 루시퍼라제(Biosettia)를 안정하게 발현하는 WT "종양" 라지 세포 또는 HLA-A*02 "정상 " 라지 세포는 안정하게 발현하는 RFP이고, 반딧불이 루시퍼라제(Biosettia)는 IncuCyte 생 세포 영상화기를 사용하여 비표지된 1차 T 세포와 함께 영상화하였다. IncuCyte 영상화 소프트웨어를 사용하여 시간에 걸쳐 생 라지 세포의 형광 강도를 정량화하였다. 가역성 연구를 위해, 농후화된 1차 T 세포를 3일 동안 "정상" 또는 "종양" 라지 세포와 유사하게 동시배양하고 영상화하였다. 3일 후, T 세포를 CD19 음성 선택을 사용하여 남은 라지 세포로부터 분리하고, 기재된 것처럼 새로운 "정상" 또는 "종양" 라지 세포로 재시딩하였다. 별개의 웰에서, Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)을 사용하여 생 루시퍼라제 발현 라지 세포를 정량화하였다.
마우스 이종이식 연구
동결된 PBMC를 37℃ 수욕에서 해동하고, 활성화 전에 무혈청 TexMACS 배지(Miltenyi)에서 밤새 휴지시켰다. IL-15(20ng/mL) 및 IL-21(20ng/mL)이 보충된 T 세포 TransAct (Miltenyi) 및 TexMACS 배지를 사용하여 PBMC를 1.5e6개의 세포/mL에서 활성화하였다. 24시간 후, 렌티바이러스를 5의 MOI에서 PBMC에 첨가하였다. 세포가 TransAct 자극 하에 확장하게 하도록 PBMC를 추가 8일 내지 9일 동안 배양하였다. 확장 후, 생체내 주사 전에 스트렙타비딘-PE-HLA-A*02-pMHC에 대해 항-PE 마이크로비드(Miltenyi)를 사용하여 T 세포는 A2-LIR-1(LIR-1 힌지, TM 및 ICD에 융합된 pMHC HLA-A*02 ScFv)에서 농후화되었다.
The Jackson Labs로부터 5주령 내지 6주령 암컷 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Dvs/SzJ (NSG-HLA-A2/HHD) 마우스를 구입하였다. 동물을 연구의 개시 전 적어도 3일 동안 수용 환경에 순응시켰다. 동물을 오른쪽 옆구리에서 피하로 100 uL의 부피로 2e6개의 WT 라지 세포 또는 HLA-A*02 형질도입된 라지 세포로 주사하였다. 종양이 70 mm3의 평균에 도달할 때(V = L x W x W/2), 동물을 5개의 그룹으로 무작위화하고(n=7), 2e6개(데이터 비기재) 또는 1e7개의 T 세포를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. T 세포 주사 후, 종양 측정을 매주 3회 수행하고, 유동 분석 후 10일 및 17일에 혈액을 수집하였다. RBC 용해 후, 세포를 항-hCD3 항체, 항-hCD4 항체, 항-hCD8 항체, 항-msCD45 항체(Biolegend)에 의해 염색하였다.
실시예 7:
이전에 기재된 것처럼 NFAT-루시퍼라제 리포터 시스템을 사용하여 EGFR 항원 결합 도메인(CT479)과 함께 활성인자 CAR을 발현하는 저카트 세포의 활성화를 차단하는 HLA-A-A*02 항원 결합 도메인 및 LIR-1 ICD(C1765)를 갖는 차단제 수용체의 능력을 분석하였다. EGFR+ 및 HLA-A*02-인 야생형 HeLa 종양 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 활성인자 및 차단제 항원 둘 다를 발현하는 표적 세포로서 사용하기 위해 EGFR+ /HLA-A*02+ HeLa 세포를 생성하기 위해 HLA-A*02+를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 EGFR+/ HLA-A*02- HeLa 세포를 또한 형질도입하였다.
도 13에 도시된 것처럼, EGFR CAR을 발현하는 저카트 세포에서의 HLA-A*02 LIR-1 차단제의 발현은 차단제를 발현하지 않는 저카트 세포의 CAR Emax와 비교하여 5배 초과만큼 CAR EMAX를 이동시킨다.
게다가, 표적 세포에서 더 낮은 HLA-A2 발현 수준에 의해 더 낮은 차단이 관찰되었다. 야생형 HCT116 세포는 EGFR+ 및 HLA-A*02이다. EGFR 및 HLA-A*02의 수준은 항-EGFR 항체 및 항-HLA-A*02 항체(BB7.2)를 사용하여 HLA-A*02 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 형질도입된 HCT116 세포 및 HeLa 세포에서 분석된 후 FACs 분류가 되었다. 도 14a 및 도 14b에 도시된 것처럼, HCT116 세포는 형질도입된 HeLa 세포보다 차단제 HLA-A*02 항원의 더 낮은 수준을 갖는다. EGFR CAR 및 HLA-A*02 LIR-1 차단제를 발현하는 저카트 세포가 EGFR 및 HLA-A*02 항원을 발현하는 HCT116 표적 세포에 의해 제시될 때, HLA-A*02 LIR-1 차단제의 존재는 EGFR CAR의 EMAX를 1.8배 이동시켰다(도 15b). 이와 반대로, 더 높은 수준의 HLA-A*02 항원을 발현한 형질도입된 HeLa 세포는 5배 초과의 EGFR CAR EMAX 이동을 매개할 수 있었다(도 13). 대조군으로서, EGFR 넉아웃 HCT116 세포에 의한 최소 활성화가 있었다(도 15a).
EGFR CAR 및 HLA-A*02 LIR-1 차단제를 사용하여 50% 차단을 달성하는 데 필요한 차단제 대 활성인자의 비는 비드 기반 시스템을 사용하여 분석되었고, 이는 도 16a 및 도 16b에 도시되어 있다.
활성인자 항원의 EC50을 결정하기 위해, 활성인자 비드를 상이한 농도에서 활성인자 항원으로 코팅하였다. 비관련 단백질은 총 단백질 농도가 동일하도록 각각의 농도로 첨가되었고, 일정한 양의 비드는 EGFR CAR을 발현하는 저카트 효과기 세포에 첨가되었다(도 16a).
차단제 항원 IC50을 결정하기 위해, 비드를 (도 16a에서 결정된) EC50 농도에서 활성인자 항원으로 코팅하고, 상이한 농도에서 차단제 항원으로 코팅하였다. 비관련 단백질은 총 단백질 농도가 동일하게 있도록 각각의 농도에서 첨가되었고, 일정한 양의 비드는 EGFR CAR 또는 EGFR CAR 및 HLA-A*02 LIR-1 차단제를 발현하는 저카트 효과기 세포에 첨가되었다(도 16b).
실시예 8: LIR-1 기반 차단제는 고형 종양 세포주를 사용하여 TCR 신호전달을 억제할 수 있다
상이한 농도의 활성인자 및 차단제 펩타이드가 로딩된 A375 표적 세포를 사용하여 MAGE-A3 활성인자 TCR 및 NY-ESO-1 scFv LIR-1 기반 억제 수용체(LIR-1 힌지, TM 및 ICD를 포함)를 발현하는 저카트 효과기 세포를 분석하였다. 저카트 세포 활성화는 NFAT 루시퍼라제 검정을 사용하여 분석되었다(실시예 6 참조). 도 17에 도시된 것처럼, 50 μM NY-ESO-1 펩타이드에 의한 A375 세포의 로딩은 활성인자 TCR EMAX를 10배 초과로 이동시켰다. A375 세포 대 T2 표적 세포에서 펩타이드 로딩 효율의 약 100x 차이가 추정되었다. 펩타이드 로딩은 명확한 치료학적 지수에 원인일 수 있다.
실시예 9: HLA-A*02 LIR-1 기반 차단제는 B 세포 백혈병 세포주를 사용하여 CAR 신호전달을 억제할 수 있다
NALM6 표적 세포를 사용하여 pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체(LIR 힌지, TIM 및 ICD를 포함)의 동시발현이 있거나 없는 비-pMHC, 고밀도 CD19 특이적 활성인자(CD19 scFv CAR 활성인자)를 발현하는 저카트 효과기 세포를 분석하였다. 저카트 세포 활성화는 NFAT 루시퍼라제 검정(실시예 6 참조)을 사용하여 분석되었고, 효과기 대 표적 세포(E:T) 비가 변했다.
도 18에 도시된 것처럼, 저카트 세포에 의한 차단제의 발현은 CAR의 EMAX를 5배 초과만큼 이동시킬 수 있었다.
실시예 10: HLA-A*02 LIR-1 기반 차단제는 용량 의존적 방식으로 CAR 신호전달을 억제할 수 있다
변하는 양의 펩타이드가 로딩된 T2 표적 세포를 사용하여 NY-ESO-1 scFv CAR 및 pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체를 발현하는 저카트 효과기 세포를 분석하였다(주목, 이 경우에 활성인자 및 차단제 ScFv 둘 다에 의해 동일한 펩타이드가 인식된다). 저카트 세포 활성화는 NFAT 루시퍼라제 검정을 사용하여 분석되었다(실시예 6 참조). 저카트 세포에 의해 발현된 수용체의 비를 변화시키도록 활성인자 대 차단제 DNA의 다양한 비, 즉 1:1, 1:2 및 1:3의 활성인자 대 차단제에 의해 저카트 세포를 형질주입하였다.
도 19에서 볼 수 있는 것처럼, 1:1의 비로 활성인자 및 차단제 수용체 DNA에 의해 형질주입된 저카트 세포에 의해서도, MHC HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체(차단제)는 활성인자 CAR에 의해 저카트 세포의 활성화를 억제할 수 있었다. 게다가, 억제 수용체가 활성화를 차단하는 정도는 저카트 세포 형질주입에서 사용된 활성인자 수용체 DNA와 비교하여 억제 수용체 DNA의 증가된 양에 의해 증가하였다.
실시예 11: HLA-A*02 LIR-1 기반 차단제는 조정 가능한 강도로 보편적 (pan HLA 클래스 I) 활성인자를 억제할 수 있다
HLA-A*02 양성 T2 세포를 사용하여 pan HLA 항체 W6/32에 기초한 3개의 상이한 scFv 결합 도메인을 갖는 pan HLA scFv CAR, 및 pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체를 발현하는 저카트 효과기 세포의 활성화를 분석하였다. 도 20으로부터 볼 수 있는 것처럼, 각각의 활성인자 scFv는 HLA-A*02-음성 저카트 세포에서 상이한 기능적 신호를 지지하였다. 저카트 세포가 1:2의 E:T 비에서 HLA-A*02-양성 T2 표적 세포와 접촉될 때 pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체는 모든 3개의 pan HLA scFv CAR로부터 기능적 신호를 차단할 수 있었다. 게다가, pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 기반 억제 수용체는 25배까지 활성인자를 억제할 수 있었다.
실시예 12: HLA-A*02 LIR-1 기반 억제 수용체는 MSLN CAR 활성인자에 의해 활성화를 차단할 수 있다
실시예 6에 기재된 것과 같은 NFAT 루시퍼라제 검정을 사용하여 MSLN CAR 활성인자 및 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체를 발현하는 저카트 효과기 세포의 활성화를 분석하였다.
저카트 세포를 1:4의 비의 활성인자:차단제 DNA에 의해 형질주입하고, 무세포 비드 기반 검정에서 활성화를 분석하였다(도 21a). 비드를 활성인자 항원, 또는 활성인자 및 차단제 항원으로 로딩하고, 비드 대 저카트 세포의 비가 변했다. 무세포 비드 기반 검정에서, pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체는 세포가 시스로 pMHC HLA-A*02 차단제 및 MSLN 활성인자를 보유하는 비드와 접촉할 때 저카트 세포의 활성화를 차단할 수 있었다. 비드에서의 pMHC HLA-A*02 차단제의 존재는 12X 이상만큼 MSLN CAR의 EMAX를 이동시킬 수 있었다(도 21a).
만성 골수성 백혈병 세포주 K562를 사용하여 활성화에 대해 1:4 DNA 비의 동일한 활성인자 및 차단제에 의해 형질주입된 활성화 저카트 세포를 분석하였다. K562는 MLSN인 활성인자 항원을 발현한다. 활성인자 및 차단제 항원(MSLN+ HLA-A*02+) 둘 다를 발현하도록 HLA-A*02에 의해 형질도입된 K562 세포 및 차단제 항원이 아니라 활성인자를 발현한 비형질도입된 K562 (MSLN+ HLA-A*02-)에 대한 저카트 효과기 세포의 반응을 분석하였다. 도 21b로부터 볼 수 있는 것처럼, K562 세포에 의한 HLA-A*02+의 발현은 MSLN CAR EMAX를 5X 초과만큼 이동시킬 수 있었다.
실시예 6에서 라지에 기재된 것처럼 효과기 1차 T 세포 및 SiHa 또는 HeLa 표적 세포를 사용하여 MSNL ScFv CAR을 통해 활성화를 차단하는 pMHC HLA-A*02 억제 수용체의 능력을 또한 분석하였다. SiHa 및 HeLa 세포는 MSLN을 내인성으로 발현하고, HLA-A*02 억제 수용체 표적을 발현하도록 형질도입되었다. IFNγ의 배수 유도를 살펴보아 1차 효과기 T 세포의 활성화를 분석하였다. 도 22에 도시된 것처럼, pMHC HLA-A*02 LIR-1 억제 수용체는 1차 T 세포가 HLA-A*02를 발현하는 SiHa 또는 HeLa 표적 세포에 의해 제시될 때 1차 T 세포의 활성화를 차단할 수 있었다(각각 10X 및 5X 억제를 초과).
T 세포가 HLA-A*02가 아니라 MSLN을 발현한 SiHa 세포에 의해 제시될 때, pMHC HLA-A*02 억제 수용체는 또한 MSLN ScFv CAR 및 pMHC HLA-A*02 LIR-1 억제 수용체 둘 다를 발현하는 T 세포에 의한 사멸을 억제할 수 있었다(도 23).
실시예 13: HLA-A*02 LIR-1 기반 억제 수용체는 EGFR CAR 활성인자에 의해 활성화를 차단할 수 있다
실시예 6에 기재된 것과 같은 NFAT 루시퍼라제 검정을 사용하여 EGFR CAR 활성인자 및 pMHC HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체(LIR-1 힌지, 막관통 및 ICD를 포함)를 발현하는 저카트 효과기 세포의 활성화를 분석하였다.
저카트 세포를 활성인자 및 차단제 수용체 DNA에 의해 형질주입하고, 무세포 비드 기반 검정에서 활성화를 분석하였다(도 24). 비드는 활성인자 항원, 차단제 항원, 또는 활성인자 및 억제제 항원이 로딩되고, 비드 대 저카트 세포의 비가 변했다. 무세포 비드 기반 검정에서, HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체는 HLA-A*02 차단제 및 EGFR 활성인자가 (상이한 비드에서) 트랜스일 때가 아니라 세포가 시스로 HLA-A*02 차단제 및 EGFR 활성인자를 보유하는 비드와 접촉할 때 저카트 세포의 활성화를 차단할 수 있었다. 비드에서의 HLA-A*02 차단제의 존재는 9X 이상만큼 EGFR CAR의 EMAX를 이동시킬 수 있었다(도 24).
표적 세포로서 HeLa 및 SiHa 세포를 사용하여 EGFR CAR 활성인자 및 HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체를 발현하는 저카트 세포의 활성화를 또한 분석하였다. 야생형 HeLa 및 SiHa 세포주는 HLA-A*02(SiHa WT 및 HeLa WT)가 아니라 EGFR을 발현하지만, HLA-A*02 억제 수용체 표적(SiHa A02 및 HeLa A02)을 발현하도록 형질도입되었다. 도 25a 내지 도 25b로부터 볼 수 있는 것처럼, HLA-A*02 ScFv LIR-1 기반 억제 수용체는 SiHa 표적 세포를 사용하여 4X 초과(도 25a) 및 HeLa 표적 세포를 사용하여 5X 초과(도 25b)만큼 EGFR EMAX를 이동시킬 수 있었다.
실시예 14: 활성인자 및 차단제 쌍은 KRAS 대립유전자 사이를 구별할 수 있다
MiHA는 대립유전자 사이의 비동의 차이를 함유하는 단백질로부터 유래된 펩타이드이다. MiHA에 대한 모델로서 KRAS를 사용하여, 활성인자 및 차단제 쌍은 KRAS G12V 및 KRAS G12D 돌연변이에 특이적인 항원 결합 도메인을 사용하여 상이한 KRAS 변이체를 구별하고 이에 반응할 수 있었다.
실시예 6에 기재된 저카트-NFAT-루시퍼라제 활성화 연구 및 T2 표적 세포를 사용하여, 활성인자 KRAS CAR 또는 TCR에 의해 매개된 활성화를 억제하는 KRAS ScFv 또는 Ftcr 억제 LIR-1 기반 수용체의 능력이 분석되었다.
도 27은 KRAS G12V ScFV 차단제가 KRAS G12D TCR(C-891)에 의해 저카트 세포의 활성화를 억제하고 KRAS G12D EMax를 14X만큼 이동시킬 수 있다는 것을 보여준다. 도 28은 KRAS G12D ScFv 차단제 및 KRAS G12V TCR 활성인자(C-913)인 상호적 쌍에 의한 유사한 결과를 보여주고, 여기서 억제제는 KRAS G12V EMax를 8X만큼 이동시킬 수 있었다.
도 29는 KRAS G12V Ftcr 차단제가 KRAS G12D TCR을 억제할 수 있었다는 것을 보여준다. 억제제는 50X 초과만큼 KRAS G12D EMax를 이동시킬 수 있었다. 이 경우에, LIR-1 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 갖는 작제물은 억제 TCR의 알파 및 베타 사슬 둘 다(알파 및 베타에서 LIR-1), 오직 TCR 알파 사슬(오직 알파에서 LIR-1), 오직 TCR 베타 사슬(오직 베타에서 LIR-1)에 포함되었고, LIR-1 ICD가 없는 버전은 대조군으로서 포함되었다(LIR-1 무). 상호적 실험에서, KRAS G12D Ftcr 차단제는 KRAS G12V 활성인자 TCR를 억제할 수 있어서, KRAS G12V EMax를 500X 초과만큼 이동시켰다.
마지막으로, 비관련 ScFv 도메인을 갖는 억제 수용체와의 쌍이 활성인자 EMAX에 대한 적은 효과를 가지면서 이 효과는 특이적 리간드 결합 도메인에 의존적이었다(도 31a 내지 도 31b).
표 14는 KRAS ScFv 및 Ftcr 서열을 열거한다. 모든 ScFv는 LIR-1 힌지, TM 및 ICD에 융합되었다. 모든 Ftcr은 LIR-1 TM 및 ICD에 융합되었다.
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
실시예 15: MiHA-Y를 인식하는 TCR의 규명
Jb2.3 및 P2A 마우스 TCR로부터의 TCR 알파 및 베타 세포외 도메인을 활성인자 TCR 작제물로 클로닝하였다. 자연적 마우스 또는 인간 불변 영역을 사용하였다. mH-Y H-2Db 펩타이드 KCSRNRQYL(서열 번호 256)이 로딩된 EL5 세포는 MiHA-Y TCR이 형질주입된 저카트 세포의 활성화를 분석하도록 표적 세포로서 사용되었다(도 32). 도 32로부터 볼 수 있는 것처럼, C-003121은 튼튼한 저카트 세포 활성화를 지지한다.
Figure pct00057
실시예 16: 부 조직접합 항원 HA-1 억제 수용체
HLA-A*02 및 A*11 클래스 I 대립유전자를 보유하는 T2 세포를 50 uM A*02-특이적 HA-1 차단제 펩타이드의 부재 또는 존재 하에 A*02-특이적 NY-ESO-1 펩타이드의 적정으로 로딩하였다. 상기 기재된 것처럼 NY-ESO-1 TCR 또는 NY-ESO-1 TCR 및 HA-1 Ftcr을 발현하는 저카트 효과기 세포의 활성화를 분석하였다(실시예 6 참조). 도 33a는 차단제 펩타이드의 부재 하에 NY-ESO-1 TCR의 민감성이 HA-1 Ftcr의 존재에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다. HA-1(H) 차단제 펩타이드의 존재 하에, NY-ESO-1 및 HA-1(H) 펩타이드는 동일한 HLA-A*02 대립유전자에 대해 경쟁하여 약 30x의 EC50 오른쪽 이동을 야기한다(실선 정사각형 대 파선 정사각형). 그렇지만, 약 10x의 활성의 추가 오른쪽 이동이 HA-1 Ftcr 차단제의 존재 하에 관찰된다(파선 정사각형 대 파선 원). 게다가, Emax는 1.5x 하향 이동하였다(고체 원대 파선 원). 도 33b는 비특이적인 대립유전자 변이체 HA-1(R) 차단제 펩타이드의 존재 하에, 본질적으로 차단이 관찰되지 않는다는 것을 보여주고, 이는 차단이 단일 아미노산에 특이적이라는 것을 제시한다. 일반적으로, NY-ESO-1이 HA-1(R)보다 더 효과적으로 HLA-A*02로 로딩하므로(도 35 참조), HA-1(R) 차단제 펩타이드의 존재 하에 관찰된 3-5x 오른쪽 이동이 또한 있다(실선에서 파선).
펩타이드 서열은 하기와 같았다:
NY-ESO-1 = SLLMWITQV (서열 번호 265),
HA-1(H) = VLHDDLLEA (서열 번호 191),
HA-1(R) = VLRDDLLEA (서열 번호 266).
HA-1 Ftcr은 또한 HA-1(H) 펩타이드의 존재 하에 KRAS TCR을 특이적으로 차단할 수 있다. HLA-A*02 및 A*11 클래스 I 대립유전자를 보유하는 T2 세포를 50 uM A*02-특이적 HA-1 차단제 펩타이드의 부재 또는 존재 하에 A*11-특이적 KRAS 펩타이드의 적정으로 로딩하였다. 상기 기재된 것처럼 NY-ESO-1 TCR 또는 NY-ESO-1 TCR 및 HA-1 Ftcr을 발현하는 저카트 효과기 세포의 활성화를 분석하였다(실시예 6 참조). 도 34a는 차단제 펩타이드의 부재 하에 KRAS TCR의 민감성이 HA-1 Ftcr의 존재에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다. HA-1(H) 차단제 펩타이드의 존재 하에, HA-1 Ftcr은 활성에서 KRAS TCR을 약 5x만큼 차단한다(고체 원 대 파선 원). 게다가, Emax는 2.7x 하향 이동하였다(고체 원대 파선 원). 도 34b는 비특이적인 대립유전자 변이체 HA-1(R) 차단제 펩타이드의 존재 하에 본질적으로 차단이 관찰되지 않는다는 것을 보여주고, 이는 차단이 단일 아미노산에 특이적이라는 것을 제시한다. 일반적으로, KRAS 및 HA-1(H) 또는 HA-1(R)이 동일한 대립유전자로 로딩하지 않으므로, 차단제 펩타이드의 존재 하에 관찰된 유의미한 오른쪽 이동이 없다(실선 대 파선).
펩타이드 로딩된 HLA-A*02 클래스 I 대립유전자 생성물을 특이적으로 인식하는 BB7.2 염색을 사용하여 T2 세포에 의한 NY-ESO, HA-1(H) 및 HA-1(R) 펩타이드의 로딩이 비교되고, 유세포분석법을 사용하여 정량화되었다. 도 35는 HLA-A*02-특이적 NY-ESO-1 및 HA-1(H) 펩타이드의 로딩이 T2 세포에서 매우 유사하다는 것을 보여준다. 대립유전자 변이체인 HA-1(R)은 HA-1(H) 및 NY-ESO-1 펩타이드보다 약간 덜 효율적으로 로딩한다.
HA-1(H) Ftcr 서열은 표 10에 기재되어 있고, NY-ESO-1 및 KRAS TCR은 하기 표 17에 기재되어 있다.
Figure pct00058
실시예 17: 활성인자 및 억제제 펩타이드의 비
활성인자 및 차단제 펩타이드 로딩된 T2 세포에 의한 동시배양의 6시간 후 단독으로 또는 NY-ESO-1 ScFv LIR1 차단제와 조합되어 활성인자 MAGE-A3 CAR에 의해 형질도입된 저카트 세포의 NFAT-루시퍼라제 신호를 측정하였다. 도 36a는 적정된 양의 활성인자 MAGE-A3 펩타이드 및 고정된 농도의 차단제 NY-ESO-1 펩타이드가 로딩된 T2 세포와 동시배양된 저카트 세포의 반응을 보여준다. 도 36b는 적정된 양의 차단제 NY-ESO-1 펩타이드 및 Emax 농도(약 0.1 μM)보다 높은 고정된 농도의 활성인자 MAGE-A3 펩타이드가 로딩된 T2 세포에 대한 저카트의 반응을 보여준다. 도 36c는 각각의 곡선에 사용된 일정한 활성인자 MAGE 펩타이드 농도로 정규화되고 x축에 작도된 도 36b로부터의 x-값 차단제 NY-ESO-1 펩타이드 농도를 보여준다. 각각의 곡선에 대해 50% 차단(IC50)에 필요한 차단제 펩타이드 대 활성인자 펩타이드의 비가 표시된다. 필요한 B:A 펩타이드 비는 1 미만이어서, 활성인자 pMHC 항원을 차단하기 위해 표적 세포에서 활성인자 CAR 및 차단제의 이 쌍에 대해 유사한(또는 더 적은) 차단제 pMHC 항원이 필요하다는 것을 나타낸다. 활성화 pMHC CAR에서 반응을 생성하는 것과 유사한 pMHC 항원 밀도에서 차단이 가능하다.
실시예 18: 특이적 수용체 쌍의 최적화
EGFR ScFv CAR 활성인자(도 37에 표시된 것처럼 CT-479, CT-482, CT-486, CT-487 또는 CT-488), 또는 EGFR ScFv CAR 활성인자 중 어느 하나 및 HLA-A*02 PA2.1 ScFv LIR1 억제제(C1765)에 의해 형질주입된 T 세포를 HeLa 표적 세포와 동시배양하였다. 야생형 HeLa 세포주는 HLA-A*02가 아니라 EGFR을 발현하지만, HLA-A*02 억제 수용체 표적을 발현하도록 형질도입되었다. 세포를 효과기 대 표적(E:T)의 1:1 비로 동시배양하였다. 도 37의 하부 오른쪽에서, 효과기 세포 수용체 발현이 처음에 표시되지만, HeLa 세포 발현은 괄호 안에 있다. 도 37로부터 볼 수 있는 것처럼, 동일한 HLA-A*02 PA2.1 ScFv LIR1 억제제가 상이한 EGFR 활성인자 수용체와 사용될 때 상이한 정도의 차단이 관찰된다.
실시예 19: 억제 수용체는 T 세포에서 활성인자 수용체의 표면 수준을 가역적으로 감소시킨다
EGFR ScFv CAR 활성인자(CT-479, CT-482, CT-486, CT-487 또는 CT-488) 및 HLA-A*02 PA2.1 ScFv LIR1 억제제(C1765)에 의해 2개의 HLA-A*02 음성 공여자로부터의 1차 T 세포를 형질도입하였다. 형질도입된 세포는 차단제 및 활성인자 수용체에 대한 FACS 분류, 또는 차단제 및 활성인자 수용체에 대한 이중 칼럼 정제에 의해 농후화된다. 형질도입된 T 세포를 HeLa 표적 세포와 동시배양하였다. 야생형 HeLa 세포주는 HLA-A*02가 아니라 EGFR을 발현하지만, HLA-A*02 억제 수용체 표적을 발현하도록 형질도입되었다. 세포를 효과기 대 표적(E:T)의 1:1 비로 동시배양하였다. 활성인자 및 차단제 수용체를 결합시킨 표지된 펩타이드, 및 형광 활성 세포 분류를 사용하여 120시간 후 EGFR CAR 활성인자의 표면 발현을 분석하였다. 활성인자 및 차단제 리간드 둘 다를 발현하는 HeLa 세포에 의한 동시배양 후 활성인자 표면 수준의 변화는 표적 세포를 사멸하는 T 세포의 능력에 상응하였다(도 37 및 도 38을 비교).
CT-482 EGFR ScFv CAR 활성인자 및 HLA-A*02 PA2.1 ScFv LIR1 억제제(C1765) 조합을 발현하는 T 세포를 EGFR(표적 A), HLA-A*02(표적 B), 동일한 세포에서 EGFR 및 HLA-A*02의 조합(표적 AB), 상이한 세포에서 표적 A 및 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단, 또는 상이한 세포에서 표적 B 및 표적 AB를 발현하는 HeLa 세포의 혼합 집단을 발현하는 HeLa 세포와 동시배양하였다(도 39a 내지 도 39b). T 세포를 1:1의 효과기 세포 대 표적 세포의 비로 HeLa 표적 세포와 배양하였다. T 세포를 HeLa 세포의 표적 A와 표적 AB 집단과 동시배양할 때, 활성인자의 수준은 감소되고, 이후 회수되었다(도 39a). 게다가, 활성인자 및 차단제 항원은 효과기 T 세포에서 활성인자 표면 발현 소실을 촉발하도록 동일한 세포에 함께 존재해야 한다. 활성인자와 반대로, 차단제 발현은 크게 변하지 않았다(도 39b).
도 40은 T 세포에 의한 활성인자 수용체의 발현 소실이 가역적인지를 결정하기 위한 실험에 대한 도식을 보여준다. EGFR ScFv CAR 활성인자 수용체(CT-487) 및 HLA-A*02 PA2.1 ScFv LIR1(C1765) 억제제 수용체를 발현하는 T 세포를 활성인자 및 차단제 수용체 표적(AB) 둘 다를 발현하는 HeLa 표적 세포와 동시배양하였다. 3일 동시배양 후, HeLa 세포를 항-EGFR 칼럼을 사용하여 제거하고, T 세포를 활성인자 및 억제제 수용체에 대해 염색하거나, 추가 3일 동안 오직 EGFR 활성인자 표적을 발현하는 HeLa 세포와 동시배양하였다. 추가 3일 동시배양 후, HeLa 세포를 항-EGFR 칼럼을 사용하여 다시 제거하고, T 세포를 활성인자 및 억제제 수용체에 대해 염색하거나, 염색 전에 오직 EGFR 활성인자 표적 또는 활성인자 및 차단제 표적(AB) 둘 다를 발현하는 HeLa 세포와 추가 3일 동안 동시배양하였다. T 세포를 표지된 EGFR 및 A2 프로브를 사용하여 활성인자 및 억제제 수용체(염색된)의 존재에 대해 분석하고, 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 수용체 발현의 수준을 정량화하였다. 실험의 결과는 도 41a 내지 도 41b에 도시되어 있다. 도 41a 내지 도 41b에 도시된 것처럼, T 세포와 활성인자 및 억제제 표적 둘 다를 발현하는 HeLa 세포와의 동시배양은 EGFR 활성인자 염색을 감소시킨다(도 41a 내지 도 41b, 왼쪽 패널). T 세포가 2회차에서 활성인자(오직 표적 A)를 발현하는 HeLa 세포와 동시배양될 때, EGFR 활성인자의 발현은 증가한다. 이와 같이, 활성인자 표면 소실은 가역적이고, T 세포 세포독성에 의해 추적한다.
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domain <400> 22 ggacaggatg gagttcgcca gtcgagagct tcagacaagc agactctgtt gcccaatgac 60 cagctctacc agcccctcaa ggatcgagaa gatgaccagt acagccacct tcaaggaaac 120 cagttgagga ggaatggcgg aagcaggagc aagcggagca gactgctgca cagcgactac 180 atgaacatga ccccccggag gcctggcccc acccggaagc actaccagcc ctacgcccct 240 cccagggatt tcgccgccta ccggagctag 270 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UTY peptide <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X is R or G <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is E or A <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is V or P <400> 23 Xaa Glu Ser Glu Glu Xaa Ser Xaa Ser Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RPSY peptide <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is V or L <400> 24 Thr Ile Arg Tyr Pro Asp Pro Xaa Ile 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UTY peptide <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is H or R <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is D or N <400> 25 Leu Pro His Asn Xaa Thr Xaa Leu 1 5 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tccagggcag ggtcaccatg accagggaca cttccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgacgac acggccatgt attactgtgc gagaaccgca 300 agttgtggtg gtgactgcta ctaccttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtg 360 tcctcaggcg gaggtggaag cggaggggga ggatctggcg gcggaggaag cggaggcgac 420 atccagatga cccagtctcc tcccaccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 480 acttgccggg ccagtgagaa tgttaatatc tggttggcct ggtatcagca gaaaccaggg 540 aaagccccta agctcctgat ctataagtca tccagtttag caagtggggt cccatcaagg 600 ttcagtggca gtggatctgg ggcagaattc actctcacca tcagcagcct gcagcctgat 660 gattttgcaa cttattactg ccaacagtat caaagttacc ccctcacttt cggcggaggg 720 accaaggtgg aaatcaaa 738 <210> 90 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSLN binding domain <400> 90 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser 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atttatgagg 1200 ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1260 ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag 1320 ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1380 gacaagcgta gaggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1440 gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1500 atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg actcagtaca 1560 gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctag 1614 <210> 292 <211> 536 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA CAR <400> 292 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu 20 25 30 Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 Tyr Thr Phe Thr Glu Phe Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 50 55 60 Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala 65 70 75 80 Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys Gly Arg 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Artificial Sequence <220> <223> LB-CCL4-1T peptide <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is T or S <400> 328 Cys Ala Asp Pro Ser Glu Xaa Trp Val 1 5 <210> 329 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-NCAPD3-1Q peptide <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is Q or R <400> 329 Trp Leu Xaa Gly Val Val Pro Val Val 1 5 <210> 330 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-NDC80-1P peptide <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is P or A <400> 330 His Leu Glu Glu Gln Ile Xaa Lys Val 1 5 <210> 331 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-TTK-1D peptide <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is D or E <400> 331 Arg Leu His Xaa Gly Arg Val Phe Val 1 5 <210> 332 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WDR27-1L peptide <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is L or P <400> 332 Ser Xaa Asp Asp His Val Val Ala Val 1 5 <210> 333 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIIP peptide <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is K or E <400> 333 Ser Glu Glu Ser Ala Val Pro Xaa Arg Ser Trp 1 5 10 <210> 334 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIIP peptide <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is K or E <400> 334 Glu Glu Ser Ala Val Pro Xaa Arg Ser Trp 1 5 10 <210> 335 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-DHX33-1C peptide <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is C or R <400> 335 Tyr Leu Tyr Glu Gly Gly Ile Ser Xaa 1 5 <210> 336 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PANE1 peptide <400> 336 Arg Val Trp Asp Leu Pro Gly Val Leu Lys 1 5 10 <210> 337 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP110 peptide <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is R or G <400> 337 Ser Leu Pro Xaa Gly Thr Ser Thr Pro Lys 1 5 10 <210> 338 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC-1C/Y <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is Y or C <400> 338 Asp Tyr Leu Gln Xaa Val Leu Gln Ile 1 5 <210> 339 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2RX7 peptide <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is H or R <400> 339 Trp Phe His His Cys Xaa Pro Lys Tyr 1 5 <210> 340 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC-4 peptide <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is R or G <400> 340 Ala Thr Leu Pro Leu Leu Cys Ala Xaa 1 5 <210> 341 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC-5 <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> X is R or G <400> 341 Trp Ala Thr Leu Pro Leu Leu Cys Ala Xaa 1 5 10 <210> 342 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AKAP13 peptide <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is M or T <400> 342 Ala Pro Ala Gly Val Arg Glu Val Xaa 1 5 <210> 343 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-APOBEC3B-1K peptide <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X is K or E <400> 343 Xaa Pro Gln Tyr His Ala Glu Met Cys Phe 1 5 10 <210> 344 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> APOBEC3H peptide <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is K or E <400> 344 Lys Pro Gln Gln Xaa Gly Leu Arg Leu 1 5 <210> 345 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-ARHGDIB-1R peptide <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is R or P <400> 345 Pro Arg Ala Cys Trp Xaa Glu Ala 1 5 <210> 346 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-BCAT2-1R peptide <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is R or T <400> 346 Gln Pro Xaa Arg Ala Leu Leu Phe Val Ile 1 5 10 <210> 347 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BFAR peptide <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> X is M or R <400> 347 Ala Pro Asn Thr Gly Arg Ala Asn Gln Gln Xaa 1 5 10 <210> 348 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C14orf169 peptide <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is A or V <400> 348 Arg Pro Arg Xaa Pro Thr Glu Glu Leu Ala Leu 1 5 10 <210> 349 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-C16ORF-1R peptide <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X is R or W <400> 349 Xaa Pro Cys Pro Ser Val Gly Leu Ser Phe Leu 1 5 10 <210> 350 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C18orf21 peptide <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is A or T <400> 350 Asn Pro Ala Thr Pro Xaa Ser Lys Leu 1 5 <210> 351 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-EBI3-1I peptide <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is I or V <400> 351 Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Tyr Xaa Gln Val 1 5 10 <210> 352 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> POP1 peptide <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is N or K <400> 352 Leu Pro Gln Lys Lys Ser Xaa Ala Leu 1 5 <210> 353 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SCRIB peptide <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is L or P <400> 353 Leu Pro Gln Gln Pro Pro Xaa Ser Leu 1 5 <210> 354 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MTRR peptide <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is S or L <400> 354 Ser Pro Ala Ser Xaa Arg Thr Asp Leu 1 5 <210> 355 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LLGL2 <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is R or H <400> 355 Ser Pro Ser Leu Xaa Ile Leu Ala Ile 1 5 <210> 356 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-ECGF-1H peptide <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is H or R <400> 356 Arg Pro Xaa Ala Ile Arg Arg Pro Leu Ala Leu 1 5 10 <210> 357 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-ERAP1-1R peptide <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is R or P <400> 357 His Pro Xaa Gln Glu Gln Ile Ala Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 358 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-ERAP1-1R peptide <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is R or P <400> 358 His Pro Xaa Gln Glu Gln Ile Ala Leu 1 5 <210> 359 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-FUCA2-1V peptide <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is V or M <400> 359 Arg Leu Arg Gln Xaa Gly Ser Trp Leu 1 5 <210> 360 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-GEMIN4-1V peptide <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is V or E <400> 360 Phe Pro Ala Leu Arg Phe Val Glu Xaa 1 5 <210> 361 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HDGF peptide <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> X is L or P <400> 361 Leu Pro Met Glu Val Glu Lys Asn Ser Thr Xaa 1 5 10 <210> 362 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-PDCD11-1F peptide <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is F or L <400> 362 Gly Pro Asp Ser Ser Lys Thr Xaa Leu Cys Leu 1 5 10 <210> 363 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-PFAS-1P peptide <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is P or S <400> 363 Ala Xaa Gly His Thr Arg Arg Lys Leu 1 5 <210> 364 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-TEP1-1S peptide <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is S or P <400> 364 Ala Pro Asp Gly Ala Lys Val Ala Xaa Leu 1 5 10 <210> 365 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-TMEM8A-1I peptide <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is I or V <400> 365 Arg Pro Arg Ser Val Thr Xaa Gln Pro Leu Leu 1 5 10 <210> 366 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-USP15-1I peptide <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is I or T <400> 366 Met Pro Ser His Leu Arg Asn Xaa Leu Leu 1 5 10 <210> 367 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LRH-1 peptide <400> 367 Thr Pro Asn Gln Arg Gln Asn Val Cys 1 5 <210> 368 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-MOB3A-1C peptide <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X is C or S <400> 368 Xaa Pro Arg Pro Gly Thr Trp Thr Cys 1 5 <210> 369 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-ZDHHC6-1Y peptide <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is Y or H <400> 369 Arg Pro Arg Xaa Trp Ile Leu Leu Val Lys Ile 1 5 10 <210> 370 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAPHIR peptide <400> 370 Ile Pro Arg Asp Ser Trp Trp Val Glu Leu 1 5 10 <210> 371 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HEATR1 peptide <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is E or G <400> 371 Ile Ser Lys Glu Arg Ala Xaa Ala Leu 1 5 <210> 372 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-GSTP1-1V peptide <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is V or I <400> 372 Asp Leu Arg Cys Lys Tyr Xaa Ser Leu 1 5 <210> 373 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-1/B60 peptide <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is H or R <400> 373 Lys Glu Cys Val Leu Xaa Asp Asp Leu 1 5 <210> 374 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-SON-1R peptide <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is R or C <400> 374 Ser Glu Thr Lys Gln Xaa Thr Val Leu 1 5 <210> 375 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-SWAP70-1Q peptide <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is Q or E <400> 375 Met Glu Gln Leu Glu Xaa Leu Glu Leu 1 5 <210> 376 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-TRIP10-1EPC peptide <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is E or G <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is P or S <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is C or G <400> 376 Gly Xaa Xaa Gln Asp Leu Xaa Thr Leu 1 5 <210> 377 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-NUP133-1R peptide <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is R or Q <400> 377 Ser Glu Asp Leu Ile Leu Cys Xaa Leu 1 5 <210> 378 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LB-ZNFX1-1Q peptide <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is Q or H <400> 378 Asn Glu Ile Glu Asp Val Trp Xaa Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 379 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC1A5 peptide <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is A or P <400> 379 Ala Glu Xaa Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ala Leu 1 5 10 <210> 380 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC-2 peptide <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is D or G <400> 380 Lys Glu Phe Glu Asp Xaa Ile Ile Asn Trp 1 5 10 <210> 381 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC-6 peptide <400> 381 Met Glu Ile Phe Ile Glu Val Phe Ser His Phe 1 5 10 <210> 382 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HB-1H/Y peptide <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is H or Y <400> 382 Glu Glu Lys Arg Gly Ser Leu Xaa Val Trp 1 5 10 <210> 383 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DPH1 peptide <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is V or L <400> 383 Ser Xaa Leu Pro Glu Val Asp Val Trp 1 5 <210> 384 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UGT2B17/A02 peptide <400> 384 Cys Val Ala Thr Met Ile Phe Met Ile 1 5 <210> 385 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UGT2B17/A29 <400> 385 Ala Glu Leu Leu Asn Ile Pro Phe Leu Tyr 1 5 10 <210> 386 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UGT2B17/B44 peptide <400> 386 Ala Glu Leu Leu Asn Ile Pro Phe Leu Tyr 1 5 10 <210> 387 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DFFRY peptide <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is C or S <400> 387 Ile Val Asp Xaa Leu Thr Glu Met Tyr 1 5 <210> 388 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMCY peptide <400> 388 Phe Ile Asp Ser Tyr Ile Cys Gln Val 1 5 <210> 389 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TMSB4Y peptide <400> 389 Glu Val Leu Leu Arg Pro Gly Leu His Phe Arg 1 5 10 <210> 390 <211> 1533 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 CAR <400> 390 gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggagatcac aggcggaggt ggaagcggag ggggaggatc tggcggcgga 360 ggaagcggag gcgaggtgaa actgcaggag tcaggacctg gcctggtggc gccctcacag 420 agcctgtccg tcacatgcac tgtctcaggg gtctcattac ccgactatgg tgtaagctgg 480 attcgccagc ctccacgaaa gggtctggag tggctgggag taatatgggg tagtgaaacc 540 acatactata attcagctct caaatccaga ctgaccatca tcaaggacaa ctccaagagc 600 caagttttct taaaaatgaa cagtctgcaa actgatgaca cagccattta ctactgtgcc 660 aaacattatt actacggtgg tagctatgct atggactact ggggccaagg aacctcagtc 720 accgtgtcct caaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 780 tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 840 acgagggggc tggacttcgc ctgtgatttc tgggtgctgg tcgttgtggg cggcgtgctg 900 gcctgctaca gcctgctggt gacagtggcc ttcatcatct tttgggtgag gagcaagcgg 960 agcagactgc tgcacagcga ctacatgaac atgacccccc ggaggcctgg ccccacccgg 1020 aagcactacc agccctacgc ccctcccagg gatttcgccg cctaccggag caaacggggc 1080 agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga ggccagtaca aactactcaa 1140 gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1200 gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1260 aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagcg tagaggccgg 1320 gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1380 ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1440 aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggactcagta cagccaccaa ggacacctac 1500 gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1533 <210> 391 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR ScFv <400> 391 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Val Ser Ile Phe Gly Val Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg 180 185 190 Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Ala Glu Ile Lys 245

Claims (102)

  1. 면역 세포로서,
    a. 제1 조작된 수용체이되, 제1 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 상기 세포외 영역은 제1 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제1 조작된 수용체; 및
    b. 제2 조작된 수용체이되, 제2 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 제2 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제2 조작된 수용체를 포함하고,
    상기 제1 리간드에 대한 제1 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의해 면역 세포를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하고,
    상기 제2 리간드에 대한 제2 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의한 면역 세포의 활성화를 억제하는, 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 리간드는 제2 리간드를 암호화하는 유전자의 이형접합성 소실로 인해 표적 세포에서 발현되지 않는, 면역 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2 리간드는 HLA 클래스 I 대립유전자 또는 부 조직접합 항원(MiHA: minor histocompatibility antigen)인, 면역 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 리간드는 Y 염색체 소실로 인해 표적 세포에서 발현되지 않는, 면역 세포.
  5. 제3항에 있어서, 상기 MiHA는 표 8 및 표 9에서의 MiHA의 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
  6. 제3항에 있어서, 상기 MiHA는 HA-1인, 면역 세포.
  7. 제3항에 있어서, 상기 HLA 클래스 I 대립유전자는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C를 포함하는, 면역 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 HLA 클래스 I 대립유전자는 HLA-A*02 대립유전자인, 면역 세포.
  9. 제4항에 있어서, 상기 제2 리간드는 Y 염색체 유전자에 의해 암호화되는, 면역 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 제2 리간드는 동일하지 않는, 면역 세포.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드는 표적 세포에 의해 발현되는, 면역 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드는 표적 세포 및 복수의 비표적 세포에 의해 발현되는, 면역 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 복수의 비표적 세포는 제1 리간드 및 제2 리간드 둘 다를 발현하는, 면역 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 리간드는 표적 세포에 의해 발현되지 않고, 복수의 비표적 세포에 의해 발현되는, 면역 세포.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포는 암 세포이고, 상기 비표적 세포는 비암성 세포인, 면역 세포.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드는 세포 부착 분자, 세포-세포 신호전달 분자, 세포외 도메인, 화학주성에 관여된 분자, 당단백질, G 단백질 커플링된 수용체, 막관통 단백질, 신경전달인자를 위한 수용체 및 전압 게이팅된 이온 채널, 또는 이의 펩타이드 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드는 암 항원인, 면역 세포.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드는 표 5에서의 항원의 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제1 리간드 결합 도메인은 표 5에서의 항체의 항원 결합 도메인으로부터 단리되거나 유래되는, 면역 세포.
  20. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드는 트랜스페린 수용체(TFRC: transferrin receptor), 표피 성장 인자 수용체(EGFR: epidermal growth factor receptor), CEA 세포 부착 분자 5(CEA), CD19 분자(CD19: CD19 molecule), erb-b2 수용체 티로신 키나제 2(HER2) 및 메소텔린(MSLN), 또는 이의 펩타이드 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
  21. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드는 pan-HLA 리간드인, 면역 세포.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드는 HLA-G의 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F를 포함하는, 면역 세포.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조작된 수용체는 T 세포 수용체(TCR: T cell receptor) 또는 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor)인, 면역 세포.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조작된 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 면역 세포.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드 결합 도메인은 단일 사슬 Fv 항체 단편(ScFv: single chain Fv antibody fragment) 또는 β 사슬 가변 도메인(Vβ: β chain variable domain)을 포함하는, 면역 세포.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드 결합 도메인은 TCR α 사슬 가변 도메인 및 TCR β 사슬 가변 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드 결합 도메인은 가변 중쇄(VH: variable heavy chain) 도메인 및 가변 경쇄(VL: variable light chain) 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  28. 제25항에 있어서, 상기 제1 리간드는 EGFR 또는 이의 펩타이드 항원이고, 상기 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118 또는 서열 번호 391의 서열, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  29. 제25항에 있어서, 상기 제1 리간드는 MSLN 또는 이의 펩타이드 항원이고, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90 또는 서열 번호 92의 서열, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  30. 제25항에 있어서, 상기 제1 리간드는 CEA 또는 이의 펩타이드 항원이고, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 282, 서열 번호 284 또는 서열 번호 286, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  31. 제25항에 있어서, 상기 제1 리간드는 CD19 또는 이의 펩타이드 항원이고, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 275 또는 서열 번호 277, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  32. 제25항에 있어서, 상기 제1 리간드는 pan-HLA 리간드를 포함하고, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175 또는 서열 번호 177의 서열, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  33. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드는 EGFR 또는 이의 펩타이드 항원을 포함하고, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 131 내지 서열 번호 166으로부터 선택된 CDR을 포함하는, 면역 세포.
  34. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드는 CEA 리간드 또는 이의 펩타이드 항원을 포함하고, 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 294 내지 서열 번호 302로부터 선택된 CDR을 포함하는, 면역 세포.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 리간드 결합 도메인은 ScFv 또는 Vβ 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 리간드 결합 도메인은 TCR α 사슬 가변 도메인 및 TCR β 사슬 가변 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  37. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드 결합 도메인은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  38. 제36항에 있어서, 상기 제2 리간드는 HA-1을 포함하고, 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 199를 포함하는 TCR 알파 가변 도메인, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 200을 포함하는 TCR 베타 가변 도메인, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  39. 제35항에 있어서, 상기 제2 리간드는 HLA-A*02 대립유전자를 포함하고, 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 53 내지 64 중 어느 하나, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  40. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 리간드는 HLA-A*02 대립유전자를 포함하고, 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 41 내지 서열 번호 52로부터 선택된 CDR을 포함하는, 면역 세포.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조작된 수용체는 적어도 하나의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM: immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)를 포함하는, 면역 세포.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조작된 수용체는 LILRB1 세포내 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 면역 세포.
  43. 제42항에 있어서, 상기 LILRB1 세포내 도메인은 서열 번호 76과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 면역 세포.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조작된 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 면역 세포.
  45. 제44항에 있어서, 상기 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 85와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 면역 세포.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조작된 수용체는 LILRB1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 포함하는, 면역 세포.
  47. 제46항에 있어서, 상기 LILRB1 힌지 도메인은 서열 번호 84, 서열 번호 77 또는 서열 번호 78과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 면역 세포.
  48. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조작된 수용체는 LILRB1 세포내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인, 또는 이들의 기능적 변이체를 포함하는, 면역 세포.
  49. 제48항에 있어서, 상기 LILRB1 세포내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인은 서열 번호 80 또는 서열 번호 80과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 면역 세포.
  50. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조작된 수용체는 서열 번호 80을 포함하는 제1 폴리펩타이드 또는 TCR 알파 가변 도메인에 융합된 이것과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 80을 포함하는 제2 폴리펩타이드 또는 TCR 베타 가변 도메인에 융합된 이것과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 수용체 및 제2 수용체는 약 1:10 내지 10:1의 제1 수용체 대 제2 수용체의 비로 면역 세포의 표면에서 발현되는, 면역 세포.
  52. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 수용체 및 제2 수용체는 약 1:3 내지 3:1의 제1 수용체 대 제2 수용체의 비로 면역 세포의 표면에서 발현되는, 면역 세포.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, B 세포 및 자연 살해(NK) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 비자연인, 면역 세포.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 단리된, 면역 세포.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, 면역 세포.
  57. 제56항에 있어서, 상기 약제는 대상체에서의 암의 치료를 위한 것인, 면역 세포.
  58. 약제학적 조성물로서,
    제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 복수의 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 치료학적 유효량의 면역 세포를 포함하는, 약제학적 조성물.
  61. 대상체에서 입양 세포 치료의 특이성을 증가시키는 방법으로서,
    제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 복수의 면역 세포 또는 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  62. 입양 세포 치료에 의해 암을 치료하는 방법으로서,
    제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 복수의 면역 세포 또는 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 암의 세포는 제1 리간드를 발현하는, 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 암의 세포는 이형접합성 소실 또는 Y 염색체 소실로 인해 제2 리간드를 발현하지 않는, 방법.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 비표적 세포는 제1 리간드 및 제2 리간드 둘 다를 발현하는, 방법.
  66. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 면역 세포를 제조하는 방법으로서,
    a. 복수의 면역 세포를 제공하는 단계; 및
    b. 상기 면역 세포를 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하는 제1 조작된 수용체를 암호화하는 벡터이되, 세포외 영역은 제1 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 리간드 결합 도메인을 포함하는 벡터 및 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하는 제2 조작된 수용체를 암호화하는 벡터이되, 세포외 영역은 제2 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는 벡터에 의해 형질전환하는 단계를 포함하고;
    상기 제1 리간드에 대한 제1 리간드 결합 도메인의 결합은 면역 세포를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하고,
    상기 제2 리간드에 대한 제2 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 리간드에 의한 면역 세포의 활성화를 억제하는, 방법.
  67. 키트로서,
    제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
  68. 제67항에 있어서, 사용 설명서를 추가로 포함하는, 키트.
  69. 억제 수용체로서,
    HA-1 부 조직접합 항원(MiHA)에 특이적으로 결합을 할 수 있는 세포외 리간드 결합 도메인 및 적어도 하나의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 억제 수용체.
  70. 제69항에 있어서, 상기 세포외 리간드 결합 도메인은 VLRDDLLEA(서열 번호 266)의 HA-1(R) 펩타이드에 대한 것보다 VLHDDLLEA(서열 번호 191)의 HA-1(H) 펩타이드에 대한 더 높은 친화성을 갖는, 억제 수용체.
  71. 제69항에 있어서, 상기 억제 수용체는 VLHDDLLEA(서열 번호 191)의 HA-1(H) 펩타이드에 의해 활성화되고, VLRDDLLEA(서열 번호 266)의 HA-1(R) 펩타이드에 의해 활성화되지 않거나 더 적은 정도로 활성화되는, 억제 수용체.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 199를 포함하는 TCR 알파 가변 도메인, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 200을 포함하는 TCR 베타 가변 도메인, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 억제 수용체.
  73. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 199를 포함하는 TCR 알파 가변 도메인 및 서열 번호 200을 포함하는 TCR 베타 가변 도메인을 포함하는, 억제 수용체.
  74. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 도메인은 LILRB1 세포내 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 억제 수용체.
  75. 제74항에 있어서, 상기 LILRB1 세포내 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 76과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 억제 수용체.
  76. 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제 수용체는 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 억제 수용체.
  77. 제76항에 있어서, 상기 LILRB1 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 85와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 억제 수용체.
  78. 제69항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제 수용체는 LILRB1 세포내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인, 또는 이들의 기능적 변이체를 포함하는, 억제 수용체.
  79. 제78항에 있어서, 상기 LILRB1 세포내 도메인 및 LILRB1 막관통 도메인은 서열 번호 80 또는 서열 번호 80과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 억제 수용체.
  80. 제79항에 있어서, 상기 억제 수용체는 서열 번호 80을 포함하는 제1 폴리펩타이드 또는 TCR 알파 가변 도메인에 융합된 이것과 적어도 95% 동일한 서열, 및 서열 번호 80을 포함하는 제2 폴리펩타이드 또는 TCR 베타 가변 도메인에 융합된 이것과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 억제 수용체.
  81. 제69항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 195 또는 이것과 적어도 95%의 동일성의 폴리펩타이드 및 서열 번호 197 또는 이것과 적어도 95%의 동일성의 폴리펩타이드를 포함하는, 억제 수용체.
  82. 면역 세포로서,
    a. 제1 조작된 수용체이되, 제1 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 CD19 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제1 조작된 수용체; 및
    b. 제2 조작된 수용체이되, 제2 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 HLA-A*02 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제2 조작된 수용체를 포함하고,
    상기 CD19 리간드에 대한 제1 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의해 면역 세포를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하고,
    상기 HLA-A*02 대립유전자에 대한 제2 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의한 면역 세포의 활성화를 억제하는, 면역 세포.
  83. 제82항에 있어서, 상기 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 53 내지 64 중 어느 하나, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  84. 제82항에 있어서, 상기 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 41 내지 서열 번호 52로부터 선택된 CDR을 포함하는, 면역 세포.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 275 또는 서열 번호 277, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조작된 수용체는 LILRB1로부터 단리되거나 유래된 세포내 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  87. 면역 세포로서,
    a. 제1 조작된 수용체이되, 제1 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 EGFR 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제1 조작된 수용체; 및
    b. 제2 조작된 수용체이되, 제2 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 HLA-A*02 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제2 조작된 수용체를 포함하고,
    상기 EGFR 리간드에 대한 제1 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의해 면역 세포를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하고,
    상기 HLA-A*02 대립유전자에 대한 제2 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의한 면역 세포의 활성화를 억제하는, 면역 세포.
  88. 제87항에 있어서, 상기 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118 또는 서열 번호 391의 서열, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  89. 제87항에 있어서, 상기 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 131 내지 서열 번호 166으로부터 선택된 CDR을 포함하는, 면역 세포.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 53 내지 64 중 어느 하나, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  91. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 41 내지 서열 번호 52로부터 선택된 CDR을 포함하는, 면역 세포.
  92. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조작된 수용체는 LILRB1로부터 단리되거나 유래된 세포내 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  93. 면역 세포로서,
    a. 제1 조작된 수용체이되, 제1 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 메소텔린(MSLN) 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제1 조작된 수용체; 및
    b. 제2 조작된 수용체이되, 제2 조작된 수용체는 막관통 영역 및 세포외 영역을 포함하고, 세포외 영역은 HLA-A*02 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 리간드 결합 도메인을 포함하는, 제2 조작된 수용체를 포함하고,
    상기 MSLN 리간드에 대한 제1 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의해 면역 세포를 활성화하거나 이의 활성화를 촉진하고,
    상기 HLA-A*02 대립유전자에 대한 제2 리간드 결합 도메인의 결합은 제1 수용체에 의한 면역 세포의 활성화를 억제하는, 면역 세포.
  94. 제93항에 있어서, 상기 제1 리간드 결합 도메인은 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90 또는 서열 번호 92의 서열, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 상기 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 53 내지 64 중 어느 하나, 또는 이것과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 면역 세포.
  96. 제93항 또는 제94항에 있어서, 상기 제2 리간드 결합 도메인은 서열 번호 41 내지 서열 번호 52로부터 선택된 CDR을 포함하는, 면역 세포.
  97. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조작된 수용체는 LILRB1로부터 단리되거나 유래된 세포내 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  98. 약제학적 조성물로서,
    제82항 내지 제97항 중 어느 한 항의 복수의 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  99. 입양 세포 치료에 의해 암을 치료하는 방법으로서,
    제82항 내지 제97항 중 어느 한 항의 복수의 면역 세포 또는 제98항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 암의 세포는 제1 리간드를 발현하는, 방법.
  101. 제99항 또는 제100항에 있어서, 상기 암의 세포는 이형접합성 소실 또는 Y 염색체 소실로 인해 제2 리간드를 발현하지 않는, 방법.
  102. 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 비표적 세포는 제1 리간드 및 제2 리간드 둘 다를 발현하는, 방법.
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