CN109996871A - 供靶向癌症的新型抗原标志的car疗法用的通用平台 - Google Patents

供靶向癌症的新型抗原标志的car疗法用的通用平台 Download PDF

Info

Publication number
CN109996871A
CN109996871A CN201780059982.3A CN201780059982A CN109996871A CN 109996871 A CN109996871 A CN 109996871A CN 201780059982 A CN201780059982 A CN 201780059982A CN 109996871 A CN109996871 A CN 109996871A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
icar
acar
antigen
tumour
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780059982.3A
Other languages
English (en)
Inventor
G·格罗斯
M·贝曼
W·吉伯森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Impat Biology Co Ltd
Jiaweishen - Galilee Biological Application Co Ltd
Original Assignee
Impat Biology Co Ltd
Jiaweishen - Galilee Biological Application Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Impat Biology Co Ltd, Jiaweishen - Galilee Biological Application Co Ltd filed Critical Impat Biology Co Ltd
Publication of CN109996871A publication Critical patent/CN109996871A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Abstract

提供了一种核酸分子，其包含编码能够防止或减弱效应免疫细胞的非所需活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的核苷酸序列，其中所述iCAR包含：胞外域，其特异性结合到由于杂合性丢失(LOH)而从哺乳动物肿瘤细胞中缺失但至少存在于相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体；和胞内域，其包含至少一种抑制效应免疫细胞的信号转导元件。进一步提供了包含所述核酸分子的载体和已转导的效应免疫细胞和包含施用所述已转导的效应免疫细胞的癌症治疗方法。

Description

供靶向癌症的新型抗原标志的CAR疗法用的通用平台
技术领域
本发明涉及通过过继性细胞转移的癌症免疫疗法的领域，其采用识别在肿瘤细胞的表面上表达的抗原的活化嵌合抗原受体(activating chimeric antigen receptor，aCAR)、抑制性CAR(inhibitory CAR，iCAR)和保护性CAR(protective CAR，pCAR)，其针对由正常细胞但由于杂合性丢失(LOH)而不由肿瘤表达的相同或其它细胞表面抗原的等位基因变异体。
背景技术
鉴别仅由肿瘤细胞而非健康组织表达的可靶向抗原无疑是当今中的重大难题。T细胞能够清除肿瘤细胞的临床证据来自评价利用T细胞治疗癌症的高度不同的途径的大量研究(Rosenberg和Restifo,2015)。这些采用利用供体淋巴细胞输注的骨髓移植、过继转移肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、通过CAR(Gross和Eshhar,2016a)或T细胞受体(TCR)在预选择的抗原上基因重定向的T细胞治疗、使用免疫检查点抑制剂或活性疫苗接种。其中，使用基因工程化T细胞和活性免疫接种的不同策略需要关于候选抗原的预先存在的信息，其可能发挥持久的临床反应但最少的不良作用。但如S.Rosenberg的近期综述的标题，“合适标靶的发现是癌症基因疗法的重大障碍(Finding suitable targets is the major obstacleto cancer gene therapy)”(Rosenberg,2014)中所述。
使用嵌合抗原受体(或CAR)基因重新引导T细胞(或免疫系统的其它杀伤细胞，例如自然杀伤(NK)细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞)抵抗以MHC独立的方式选择的抗原的概念在20世纪80年代末首先由Gross和Eshhar引入(Gross等人,1989)。其由编码胞外单链抗体可变片段(scFv)的嵌合基因合成产生，所述scFv通过柔性铰链和跨膜阳离子基序与信号传递组分融合，所述信号传递组分包含能够T细胞活化的CD3-ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸类活化基序。目前，CAR在几十次临床试验中进行检查，并且迄今为止在B细胞恶性肿瘤中已展示格外高的功效(Dotti等人,2014；Gill和June,2015；Gross和Eshhar,2016a)。CAR-T细胞疗法的安全性在很大程度上由其区分肿瘤与健康组织的能力确定。在临床和临床前研究中报告的不良自体免疫作用的主要风险和直接原因是由靶抗原的额外肿瘤表达导致的肿瘤外、靶上毒性(在我们的近期综述(Gross和Eshhar,2016b)和(Klebanoff等人2016)中详细讨论。关于这种风险，临床上或临床前用于CAR疗法的共用的非突变的细胞表面抗原通常可根据其组织分布和表达模式分为许多类别：
-严格的肿瘤特异性抗原。也许这一组中唯一已经临床检查过的成员是表皮生长因子受体的变异体III(EGFRvIII)，其经常在胶质母细胞瘤中过表达，并且也存在于非小细胞肺癌和前列腺癌、乳腺癌、头颈癌和卵巢癌中，但不存在于正常组织上。
-在肿瘤上并且在非重要健康组织上表达的表面抗原。这一组中潜在CAR抗原为分化相关分子，其主要限于B细胞谱系。这些(和许多临床试验中的靶抗原)中突出的是CD19，一种全B细胞标记物，在B细胞分化的早期获得并且参与B细胞受体(BCR)的信号转导。膜前列腺抗原构成这一分类中的另一类抗原。
-通常由非恶性肿瘤促进细胞表达的抗原。一种这类抗原为成纤维细胞活化蛋白质(fibroblast activation protein，FAP)，一种细胞表面丝胺酸蛋白酶，其几乎始终如一地由不同原发性和转移性癌症中的肿瘤相关成纤维细胞表达。另一种抗原为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，其在肿瘤血管生成期间高度表达并且通常在许多重要器官中的血管和淋巴内皮细胞上表达。
-与重要健康组织共用的肿瘤相关抗原(TAA)。
大多数当前在临床前和临床研究中评估的其它TAA由肿瘤过表达，但通常也以较低量存在于必需正常组织上。
为解决CAR T细胞疗法中的自身免疫而设计的广泛范围的策略可分为那些在损伤已经明显(反应措施)时寻求消除或抑制转移的T细胞的策略以及旨在首先预防潜在损害的策略(主动措施)(Gross和Eshhar,2016a)。反应途径常常使用自杀基因，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-tk)和iC9，其为一种包含截短的人类胱天蛋白酶9和突变FK506结合蛋白的融合多肽。其它途径利用抗体选择性去除被破坏的工程化细胞，或如近来证实，控制CAR识别部分与胞内信号传导域的偶联的异源二聚化小分子试剂(Wu等人,2015)。虽然一些主动措施被设计成限制CAR T细胞的体内持久性或功能(例如，mRNA电穿孔用于基因递送的用途)，但其它措施直接解决了增加治疗性CAR的抗原选择性的关键难题，从而避免损害非肿瘤组织。其中两个引起了特别的关注，因为其可能会扩大CAR T细胞可以安全靶向的肿瘤抗原的范围：
-组合(或‘分裂’)抗原识别。虽然真正的肿瘤特异性表面抗原是罕见的，但两种不同抗原的组合(不一定分类为由给定肿瘤共表达的肿瘤相关抗原)可以定义新的肿瘤特异性标志。限制CAR T细胞对这类抗原对的活性提供了关键的安全指标，并且因此延伸肿瘤特异性标靶的范围，并且可具有实质的治疗价值。第二代和第三代CAR被设计成在通过束缚CAR胞内域上的两个或更多个信号传递部分使单个抗原接合时为治疗性T细胞提供活化和共同刺激信号。然而，如果活化和共同刺激在两个CAR之间的相同T细胞中分裂，每个CAR对不同的抗原具有特异性，那么完全的反应将需要两个互补信号的配合，这只能在两种抗原存在的情况下实现。这一原理已在若干临床前研究(Kloss等人,2013；Lanitis等人,2013；Wilkie等人,2012；WO 2016/126608)中证实。
毫无疑问，这种方法仍然需要对活化和共同刺激信号的大小进行缜密滴定，以达到最佳平衡，这将只能实现有效的靶上、肿瘤上T细胞反应。在临床配置中是否可以常规达到这种平衡仍然值得怀疑。
最近公布了一种全新的方法，用于限制对仅表达两种抗原独特组合的靶细胞的T细胞反应(Roybal等人,2016a)。其核心元件充当‘基因开关’，其利用包括Notch的若干细胞表面受体的作用模式。在将这类受体与其配体结合后，它经历双重裂解，导致其胞内域解离，其易位到细胞核中，在那里它充当转录因子。这一原理的实施需要将两个基因共同引入效应T细胞中。第一个是组成型表达并且编码这类嵌合可裂解受体，其配备有针对第一抗原的识别部分。在靶细胞表面上与这种抗原的接合将开启编码针对第二抗原的常规CAR的第二基因的表达。仅当靶细胞也共表达这种第二抗原时靶细胞才会被杀灭。
抑制性CAR。当CAR重定向的杀伤细胞的靶抗原与正常组织共用时，存在肿瘤外反应性。如果这种正常组织表达不存在于肿瘤上的另一种表面抗原，那么在基因修饰的细胞中共表达另一种靶向这种非共用抗原的CAR(其具有抑制性信号传递部分)可以通过正常组织阻止T细胞活化。
iCAR不是活化域(例如FcRγ或CD3-ζ)，而是具有由可以拮抗T细胞活化的抑制性受体衍生的信号传递域，例如CTLA-4、PD-1或NK抑制性受体。如果与肿瘤共用候选aCAR抗原的正常组织表达另一种与肿瘤不共用的表面抗原，那么由靶向这种非共用抗原的相同T细胞表达的iCAR可以保护正常组织(图1)。
不同于T细胞，每个T细胞表达由体细胞重排的基因区段编码的独特的双链TCR，NK细胞不表达抗原特异性受体。相反，NK细胞表达一系列生殖系编码的活化和抑制性受体，其分别识别感染和健康细胞的细胞表面的多种活化和抑制性配体。已描述基于NK抑制性受体(例如KIR3DL1)的iCAR的保护能力(US 9,745,368)。KIR3DL1和其它NK抑制性受体通过以快速和全面的方式解体免疫突触起作用。有令人信服的证据表明，单个NK细胞可以挽救表达抑制性和活化配体的抗性细胞，又杀灭它同时接合的易感细胞，其仅表达活化配体(Abeyweera等人,2011；Eriksson等人,1999；Treanor等人,2006；Vyas等人,2001)。这种精细的能力由每个相应的免疫突触形成的信号转导分子的不同空间组织调节，从而影响溶细胞颗粒的胞吐作用(综述参见(Huse等人,2013))。最近，Fedorov等人(Fedorov等人,2013a；WO 2015/142314)出于此目的成功地采用PD-1和CTLA-4的胞内域。不同于NK抑制性受体，这些iCAR的调节作用影响整个细胞。但这些作用是暂时的，允许在随后遇到仅表达aCAR抗原的靶细胞时完全T细胞活化。
iCAR和aCAR靶向的抗原的组织分布指示在不危害临床功效的情况下赋予最大安全性所需的iCAR的最佳作用模式。举例来说，如果受保护的肿瘤和正常组织的解剖部位不相交，那么短暂抑制(CTLA-4样或PD-1样)将可能满足。然而，如果这些部位确实重叠，那么只有突触限制的抑制(即NK作用模式)将阻止治疗性细胞的持续麻痹并且允许其有效的肿瘤破坏活性。使用iCAR降低靶上、肿瘤外反应性的方法遭受严重缺乏在肿瘤细胞中下调但存在于正常组织中的抗原。
下一代测序(Next generation sequencing，NGS)允许确定给定肿瘤活检中的所有蛋白质编码基因(约1％的全基因组)的DNA序列以及癌症‘外显子组’与同一患者的健康组织(通常来自白血细胞)的比较外显子组测序可在活检去除后若干天内并且在相对低成本下完成。并行地，转录组分析(RNA-seq)可以提供关于由相同细胞样品实际表达的基因的互补信息。
越来越清楚的是，每个个别肿瘤的突变概貌是独特的(Lawrence等人,2013；Vogelstein等人,2013)。由于非同义突变，肿瘤细胞可能在其一种或多种患者的HLA产物上向患者的免疫系统呈递一组私有的新肽。实际上，近年来在鉴别肿瘤特异性新表位方面付出了巨大努力，这些新表位可被患者自身的CD8或CD4T细胞库识别，并且充当免疫治疗的标靶(综述参见(Blankenstein等人,2015；Van Buuren等人,2014；Heemskerk等人,2013；Overwijk等人,2013；Schumacher和Schreiber,2015))。然而，累积的发现表明，新抗原类T细胞免疫疗法更有可能在显示更高突变负荷的癌症，例如黑色素瘤和肺癌中有效，但在大多数突变较少的癌症中可能常常无法获益(Savage,2014；Schumacher和Schreiber,2015)。此外，相当大的瘤内异质性(Burrell等人,2013)需要同时共同靶向若干抗原，从而避免出现突变丢失变异体，鉴于有用的免疫原性新肽的稀缺性，这一任务变得越来越苛刻。
总而言之，通过基因重定向的杀伤细胞的过继转移来鉴别癌症免疫疗法的合适标靶的迫切需要仍然在很大程度上尚未得到满足。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种核酸分子，其包含编码抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的核苷酸序列，所述iCAR能够防止或减弱效应免疫细胞的非所需活化，其中iCAR包含：胞外域，其与由于杂合性丢失(LOH)而从哺乳动物肿瘤细胞中缺失但至少存在于相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体特异性结合；和胞内域，其包含至少一种抑制效应免疫细胞的信号转导元件。
在另一个方面，本发明提供一种载体，其包含如本文所定义的本发明的核酸分子和至少一种控制元件，例如启动子，其可操作地连接到核酸分子上。
在另一方面，本发明提供一种制备能够防止或减弱效应免疫细胞的非所需活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的方法，根据如本文所定义的本发明，所述方法包含：(i)从已知变异体的至少一个数据库中检索编码蛋白质的基因的人类基因组变异体的列表；(ii)通过以下来筛选(i)中检索的所述变异体的列表：(a)选择与其相应参考等位基因相比导致由所述对应的基因编码的蛋白质中的氨基酸序列变异的变异体；(b)选择所述氨基酸序列变异在所述编码的蛋白质的胞外域中的基因的变异体，(c)选择至少在一个肿瘤中经历杂合性丢失(LOH)的基因的变异体，并且(d)选择至少在其根据(c)经历LOH的所述至少一个肿瘤的来源的组织中表达的基因的变异体，从而获得在所述蛋白质中的胞外域中具有氨基酸序列变异的变异体列表，所述蛋白质由在所述至少一个肿瘤中由于LOH而丢失并且至少在所述至少一个肿瘤的来源的组织中表达的所述对应的基因编码；(iii)从(ii)中获得的所述列表中定义包含至少一个单个变异体的序列区、亚克隆并且表达包含所述至少一个单个变异体的所述序列区和包含所述相应参考等位基因的序列区，从而获得所述对应的表位肽；(iv)选择iCAR结合域，其特异性结合到由所述克隆的序列区编码的所述表位肽或特异性结合到由(iii)中获得的所述相应参考等位基因编码的所述表位肽；并且(vii)制备如本文所定义的iCAR，其各自包含如(iv)中所定义的iCAR结合域。
在再一方面，本发明提供一种制备安全效应免疫细胞的方法，所述方法包含：(i)用包含编码如本文所定义的iCAR的核苷酸序列的核酸分子转染针对肿瘤相关抗原的TCR工程化效应免疫细胞，或用在本文中定义的载体转导所述细胞；或(ii)用包含编码如本文所定义的iCAR的核苷酸序列的核酸分子和包含编码如本文所定义的aCAR的核苷酸序列的核酸分子转染初始型效应免疫细胞；或用如本文所定义的载体转导效应免疫细胞。
在又一方面中，本发明提供通过如本文所述的本发明方法获得的安全效应免疫细胞。安全效应免疫细胞可为表达外源性T细胞受体(TCR)和iCAR的重定向T细胞，其中外源性TCR是针对抗原的非多态细胞表面表位或多态细胞表面表位的单个等位基因变异体，其中所述表位为肿瘤相关抗原或至少与相关肿瘤和正常组织的细胞共用，并且iCAR如本文所定义；或安全效应免疫细胞为重定向效应免疫细胞，例如表达如本文所定义的iCAR和aCAR的自然杀伤细胞或T细胞。
在另一方面，本发明提供一种选择患有特征为LOH的肿瘤的个体的个性化生物标记物的方法，所述方法包含(i)从所述个体中获得肿瘤活检；(ii)从所述个体中获得正常组织的样品，例如，周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)；和(iii)鉴别多态细胞表面表位的单个等位基因变异体，其由于LOH而不由所述肿瘤的细胞表达，但其由所述正常组织的细胞表达，从而鉴别所述个体的个性化生物标记物。
在另一方面，本发明提供一种治疗患有特征为LOH的肿瘤的患者的癌症的方法，所述方法包含向所述患者施用如本文所定义的效应免疫细胞，其中所述iCAR是针对编码由于杂合性丢失(LOH)而从所述肿瘤的细胞中缺失但至少存在于所述患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体。
在再另一个方面，本发明是针对用于治疗患有特征为LOH的肿瘤的患者的如本文所定义的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR是针对编码由于杂合性丢失(LOH)而从所述肿瘤的细胞中缺失但至少存在于所述患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体。
在又另一个方面，本发明是针对一种治疗患有特征为LOH的肿瘤的患者的癌症的方法，所述方法包含：(i)鉴别或接收鉴别多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的信息，所述等位基因变异体由于LOH而不由肿瘤的细胞表达，但所述等位基因变异体由正常组织的细胞表达，(ii)鉴别或接收鉴别抗原的非多态细胞表面表位或多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的信息，其中所述表位为肿瘤相关抗原或至少与所述癌症患者的相关肿瘤和正常组织的细胞共用；(iii)选择或接受至少一种定义如本文中所定义的iCAR的核酸分子和至少一种包含编码如本文所定义的aCAR的核苷酸序列或至少一种如本文所定义的载体的核酸分子，其中iCAR包含与(i)的细胞表面表位特异性结合的胞外域，并且aCAR包含与(ii)的细胞表面表位特异性结合的胞外域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接受至少一个群体的安全重定向效应免疫细胞；以及(v)向所述癌症患者施用至少一个群体的(iv)的安全重定向免疫效应细胞。
在一类似方面，本发明提供至少一个群体的用于治疗患有特征为LOH的肿瘤的患者的癌症的安全重定向免疫效应细胞，其中所述安全重定向免疫细胞通过以下获得：(i)鉴别或接收鉴别多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的信息，所述等位基因变异体由于LOH而不由肿瘤的细胞表达，但所述等位基因变异体由正常组织的细胞表达，(ii)鉴别或接收鉴别抗原的非多态细胞表面表位或多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的信息，其中所述表位为肿瘤相关抗原或至少与所述癌症患者的相关肿瘤和正常组织的细胞共用；(iii)选择或接受至少一种定义如本文所定义的iCAR的核酸分子和至少一种包含编码如本文所定义的aCAR的核苷酸序列或至少一种如本文所定义的载体的核酸分子，其中iCAR包含与(i)的细胞表面表位特异性结合的胞外域，并且aCAR包含与(ii)的细胞表面表位特异性结合的胞外域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接受至少一个群体的安全重定向效应免疫细胞。
在另一方面，本发明是针对两种或更多种核酸分子的组合，每一种包含编码受控效应免疫细胞活化系统的不同成员的核苷酸序列，所述核酸分子为单个连续核酸分子的部分或形成单个连续核酸分子或包含两种或更多种分开的核酸分子，其中所述受控效应免疫活化系统引导效应免疫细胞杀灭由于杂合性丢失(LOH)而丢失一个或多个染色体或其部分的肿瘤细胞并且饶过相关正常组织的细胞，并且其中(a)所述第一成员包含活化嵌合抗原受体(aCAR)多肽，其包含与抗原的非多态细胞表面表位或与不同多态细胞表面表位的单个等位基因变异体特异性结合的第一胞外域，并且所述非多态或多态细胞表面表位为肿瘤相关抗原或与相关异常和正常哺乳动物组织的细胞共用；并且(b)所述第二成员包含调节性多肽，其包含与多态细胞表面表位的单个等位基因变异体特异性结合的第二胞外域，所述等位基因变异体由于LOH而不由异常哺乳动物组织表达但存在于相关哺乳动物正常组织的所有细胞上。
附图说明
图1展示iCAR的概念(取自(Fedorov等人,2013a)。
图2展示aCAR/pCAR分子设计和作用模式。无论这些是否表达aCAR抗原，在正常细胞上使pCAR与其抗原结合都被驱使导致快速RIP并且将多肽打破成3个分开的片段。
图3A-C展示在来自TCGA数据库的肿瘤类型中编码HLA I类基因座A.HLA-G、B.HLA-A、C.ZNRD1的染色体区中经历LOH的肿瘤样品的百分比。肾脏嗜铬细胞[KICH]、肾上腺皮质癌[ACC]、胰腺癌[PAAD]、肉瘤[SARC]、肾脏肾乳头状细胞癌[KIRP]、食管癌[ESCA]、肺鳞状细胞癌[LUSC]、肾脏肾透明细胞癌[KIRC]、膀胱尿道上皮癌[BLCA]、卵巢浆液性囊腺癌[OV]、胸腺瘤[THYM]、宫颈鳞状细胞癌和子宫颈内腺癌[CESC]、头颈部鳞状细胞癌[HNSC]、乳腺浸润癌[BRCA]]、胃腺癌[STAD]、淋巴肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBC]、多形性胶质母细胞瘤[GBM]、结肠腺癌[COAD]、直肠腺癌[READ]、肺腺癌[LUAD]、睾丸生殖细胞肿瘤[TGCT]、间皮瘤[MESO]、胆管癌[CHOL]、子宫癌肉瘤[UCS]、皮肤黑色素瘤[SKCM]、子宫肌层内膜癌[UCEC]、脑低级别胶质瘤[LGG]、前列腺癌[PRAD]、肝细肝细胞癌[LIHC]、甲状腺癌[THCA]、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤[PCPG]、急性髓性白血病[LAML]、葡萄膜黑色素瘤[UVM]
图4A-B展示在与图1相同的肿瘤类型中编码HLA I类基因座A.HLA-B、B.HLA-C的染色体区中经历LOH的肿瘤样品的百分比。
具体实施方式
参考已由A.G.Knudson(Knudson Jr.,1971),Devilee,Cleton-Jansen和Cornelisse在1971年陈述于其标题为‘自从Knudson’(Devilee等人,2001)：“许多公开案已记录各种肿瘤中的许多不同染色体上的LOH，涉及存在多种TSG。Knudson的两次命中假设预测这些LOH事件是TSG的两个等位基因失活的第二步骤(Many publications havedocumented LOH on many different chromosomes in a wide variety of tumors,implicating the existence of multiple TSGs.Knudson's two-hit hypothesispredicts that these LOH events are the second step in the inactivation ofboth alleles of a TSG)”的文章的开头段落中提出的肿瘤抑制基因(TSG)的革命性的概念。在关于人类癌症遗传不稳定性的开创性回顾(Lengauer等，1998)，Lengauer，Kinzler和沃格尔斯坦写道：“染色体核型研究表明，大多数癌症已经失去或获得染色体和分子生物学研究表明，核型数据实际上低估了这种变化的真实程度。杂合性丢失，即肿瘤中母体或父本等位基因的丢失是普遍存在的，并且通常伴随着相对等位基因的获得。例如，肿瘤可能失去母体染色体8，同时复制父本染色体8，使细胞具有正常的染色体8核型而非异常染色体8‘等位基因型’。结肠癌、乳腺癌、胰腺癌或前列腺癌的‘平均’癌症可能会失去25％的其等位基因，并且肿瘤丢失超过一半的等位基因并不罕见。”这些观察结果已被加强并且延伸到几乎所有人体癌症，包括几乎所有的癌瘤，在许多报告中(综述参见(McGranahan等人,2012))。现在明确地确定，几乎所有个别肿瘤都表现出全染色体、整个染色体臂或不同大小的亚染色体区的多重丢失。新算法正在迅速发展(例如Sathirapongsasuti等人,2011)以基于外显子组序列数据确定任意给定细胞样品中的LOH概况。虽然统计偏差目前可能会质疑某些解释的有效性(Teo等人,2012)，但这类算法可能会改进并且替代大多数其它方法以建立在NGS时代之前出于这一目而被采用的LOH概况。
早期LOH事件可以在相同组织的癌前细胞中检测到，但不能在周围正常细胞中检测到(Barrett等人,1999)。LOH是不可逆的，并且事件只能累积，因此肿瘤异质性反映了整个肿瘤进展中损失的累积。虽然肿瘤亚克隆可以在随后的LOH事件中发展，但是预期由给定患者中的癌前细胞、推定的肿瘤干细胞和所有肿瘤亚克隆共用的最小LOH标志的存在成为规则。源自这种“主干”LOH模式的分支仍然会形成一组有限的部分重叠的标志，这些标志一起覆盖同一患者中的所有肿瘤细胞。
总LOH事件的不可避免的结果是伴随丢失遗留在被删除的染色体材料上的所有其它基因，并且这些基因天然地包括许多编码跨膜蛋白的基因。关于其一致性，已汇编了3,702种不同的人类细胞表面蛋白(‘surfaceome’)的目录(Da Cunha等人,2009)。≈42％的surfaceome基因的表达显示广泛的组织分布，同时≈85个基因是由所检查的所有组织表达，这是管家基因的标志。这些基因是候选基因，其不同的多态变异体可以充当iCAR和本发明的CAR的标靶。
最近，Bausch-Fluck等人(Bausch-Fluck等人,2015)应用他们的化学蛋白质组细胞表面捕获技术来鉴别41种人类细胞类型中的1492个细胞表面糖蛋白的组合。预期大部分surfaceome由任何给定的肿瘤表达，每个表现出独特的概况。发现编码细胞表面蛋白的基因的其编码区中的单核苷酸多态性(SNP)比所有其它基因略微富集(Da Cunha等人,2009)。多态框内插入和删除是罕见的，其进一步促进变异体的数量，并且可能比肽序列改变(非同义)SNP对多肽产物发挥更稳固的结构作用。总而言之，典型的基因组包含10,000到12,000个具有非同义变异体和190-210个框内插入/删除的位点(Abecasis等人,2010；Auton等人,2015)。这些变异体不是均匀分布在整个基因组中作为高度多态基因，例如HLA基因座(https://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html)或某些G蛋白偶联受体(GPCR)基因(Lee等人,2003；Rana等人,2001)形成不同的变异体“热点”。LOH相关热点的另一层源自不同癌症中的某些染色体或染色体臂(例如，小细胞肺癌中的3p和17p(Lindblad-Toh等人,2000)、结直肠癌中的17p和18q(Vogelstein等人,1989)、乳腺癌中的17q和19(Li等人,2014；Wang等人,2004)、黑色素瘤中的9p(Stark和Hayward,2007)、胶质母细胞瘤中的10q(Ohgaki等人,2004)等等)的频繁丢失。
表面蛋白中的显著部分的等位基因变异将影响对应基因产物的胞外部分，可能形成不同的等位基因受限表位，其原则上可被高度特异性mAb识别并且与其它变异体区分开。在文献中有充分记载，可以分离mAb，其区分相同蛋白质的两种变异体，其仅在单个氨基酸上不同(参见例如，识别具有精确特异性的Ras癌基因的点突变产物的mAb的早期实例(Carney等人,1986))。有趣的是，已表明，对蛋白质表位中单个氨基酸互换特异性的两个mAb可以使用与其重链和轻链V基因库结构不同的可变区(Stark和Caton,1991)。最近，Skora等人(Skora等人,2015)报告肽特异性scFv的分离，所述肽特异性scFv可以区分源自突变KRAS和EGFR蛋白的HLA-I结合的新肽与其野生型对应部分，其在两种情况下在一种氨基酸中不同。
总而言之，肿瘤细胞的独特抗原标志出现，这可以允许其与个别患者的整个身体中的所有其它细胞明确区分。其包含由等位基因变异体编码的所有跨膜蛋白，所述等位基因变异体由于LOH而从肿瘤细胞表面缺失，但存在于表达这些基因的来源的癌症组织或其它组织的正常细胞上。当然，受LOH影响的每个基因的特征在于除了真正的管家基因之外的组织分布的独特模式。预计这些基因中的大多数不直接参与肿瘤形成或转化表型的维持，并且在这个意义上，其丢失具有‘乘客’性质。
上述基本原理认为，对于几乎所有肿瘤，LOH不可避免地形成独特的分子描绘，其特征在于缺乏存在于正常细胞上的多种多态表面结构。将个别肿瘤的这种假定的标志转换成可靶向的一组抗原表位需要可行的免疫策略，从而将特定‘缺失’的识别转化为能够触发靶细胞杀灭的活化提示。重要的是，在这一策略的未来临床实施中，结合安全装置以确保严格避免靶上、肿瘤外反应性将是非常有利的。
本发明通过在每对治疗性杀伤细胞中共表达单对基因来解决这一难题。这一对中的一个伙伴编码活化CAR(aCAR)，并且另一个编码保护CAR(pCAR)或抑制性CAR(iCAR)。
应该强调的是，本发明提供一种新的途径，其能够在保持正常细胞安全的同时特异性靶向肿瘤细胞。本文提出的概念提供鉴别iCAR(或pCAR)的新标靶，这些标靶定义为包含多态细胞表面表位的单个等位基因变异体，其由于其所在的染色体区的LOH而从肿瘤细胞中丢失，但在正常组织上保持表达。由于多态变异，可以区分两个等位基因并且仅靶向肿瘤细胞中缺失的等位基因。此外，靶抗原本身可能不一定是肿瘤抑制基因或预测与癌症有关的基因，因为其被选择在LOH丢失的区域中，并且因此可以简单地与这类基因连接。这在概念上不同于迄今在癌症疗法中采用或建议的方法，其靶向肿瘤相关抗原或在肿瘤中下调的抗原而不管多态性如何。
区别是至关重要的，因为作为基因组事件的LOH导致从肿瘤中完全丢失特异性变异体，并且非常罕见地夺回丢失的等位基因。如果LOH事件在肿瘤发展的非常早期发生，那么其确保在源自包括转移性肿瘤的初始癌前组织的所有肿瘤细胞中均匀的标靶标志。另外，LOH几乎存在于所有类型的癌症中，并且因此可以依赖这一概念作为发展与所有这些癌症类型相关的标记物的通用工具。由于LOH事件在某种程度上是随机的，因此本发明还基于在所述患者中发生的特定LOH事件，为每个个别癌症患者提供个性化肿瘤标记物的选择。依赖于执行这一概念的工具，即aCAR和iCAR，是众所周知的，并且可以使用本领域熟知的方法容易地制备，例如在WO 2015/142314和US 9,745,368中所教示的，两者都是通过引用并入，如同在本文中完全公开的一样。
根据一种策略，每个给定对中的两个CAR特异性地识别患者是杂合的相同靶基因的不同等位基因变异体的产物。基本原理如下：aCAR靶向选定细胞表面蛋白的等位基因变异体，其由给定肿瘤细胞表达并且不受LOH影响，而pCAR或iCAR靶向由相同基因的等位基因变异体编码的产物，所述等位基因变异体由于LOH而从这些肿瘤细胞中丢失。在表达所述基因的个别患者的其它正常组织中，两个等位基因都存在并且公认是同样功能化的，即，表达是在所有组织中双等位基因的(与其中可表现出随机单等位基因表达的其它基因(Chess,2012；Savova等人,2016)。在一种情况下，两种CAR靶向位于蛋白质产物上相同位置的两个相关表位，其相差一个或仅几个氨基酸。在另一种情况下，aCAR靶向同一蛋白质上的非多态表位，而pCAR或iCAR是等位基因特异性的。在这种情况下，正常细胞上aCAR表位的密度通常比iCAR或pCAR表位的密度高两倍。
另一种策略是利用pCAR或iCAR靶向管家基因的蛋白质产物。根据定义，由于这些基因在体内的所有细胞上表达，因此其为pCAR或iCAR的安全标靶。也就是说，如果pCAR或iCAR靶向给定患者为杂合的管家基因的膜产物，那么除了由于LOH而丢失这一等位基因的肿瘤细胞外，体内的所有细胞都将受到保护。这一策略允许将aCAR靶基因产物与pCAR或iCAR靶基因产物解偶联。那么事实上，aCAR标靶可以是由肿瘤表达的任何非多态表位。这一策略的一种变化是利用靶向非多态肿瘤相关抗原的已知aCAR，例如临床使用中或在临床试验中的检查下的aCAR，与针对基因的膜产物的iCAR或pCAR组合，对于所述基因给定患者是杂合，并且所述基因至少在肿瘤的来源的组织中，并且优选在表达aCAR靶抗原的其它重要正常组织中表达。
必须注意确保iCAR传输的抑制信号严格并且永久地优于aCAR信号，并且iCAR与aCAR之间不会发生交叉识别。iCAR的优势保证了将阻止在遇到表达两个等位基因的正常细胞时活化杀伤细胞。然而，这种预设制动将在与肿瘤细胞接合时不操作：在不存在其靶抗原的情况下，iCAR不会递送抑制信号，因此释放预期的aCAR介导的细胞活化和随后的肿瘤细胞裂解。
iCAR技术可能基于免疫检查点。在这方面，证实(Fedorov等人,2013b；WO 2015/142314)PD-1和CTLA-4的调节元件在作为iCAR信号传递组分并入时具有有效的T细胞抑制能力是令人鼓舞的但是这些观察的一般性最近受到质疑(Chicaybam和Bonamino,2014,2015)。此外，尽管由这些检查点蛋白触发的精确分子途径尚未得到完全了解，但其参与通过近端和远端机制抑制T细胞活化，使T细胞对伴随的活化刺激无反应(Nirschl和Drake,2013)。因此，虽然由PD-1和CTLA-4iCAR确保的灭活状态确实是暂时的和可逆的(Fedorov等人,2013b)，但其不会允许同时表达iCAR和aCAR标靶的组织的T细胞活化。相比之下，NK抑制性受体优于活化受体的优势确保健康细胞通过空间而非时间机制免受NK细胞攻击。(Long等人,2013)。有令人信服的证据表明，单个NK细胞可以饶过表达抑制和活化配体的抗性细胞，但杀死其同时接合的易感细胞，其仅表达活化配体。这种精确的能力由在每个对应免疫突触处形成的信号转导分子的不同空间组织调节，所述突触因此影响溶细胞颗粒的胞吐作用(例如，Abeyweera等人,2011；Eriksson等人,1999；Treanor等人,2006；Vyas等人,2001；US 9,745,368)。
如上文所解释，基于iCAR确证的控制的策略取决于iCAR活性优于aCAR活性的优势。在一个方面，本发明引入了一种全新类型的iCAR，在本文中称为pCAR('保护性CAR，参见图1)，其被设计呈以突触选择性方式在CAR T细胞中操作并且保证优于共表达的aCAR的完全优势。其整合两项技术专长：
1.通过将其遗传放置在两个不同的多肽产物上从识别单元和共同刺激元件(例如，CD28、4-1BB)中解偶联aCAR(FcRγ/CD3-ζ)的活化部分。对于aCAR功能必需的这些元件的重新偶联将仅通过添加异源二聚化药物来进行，所述异源二聚化药物可以分别桥接并入到每个多肽上的对应结合位点(图2B)。Wu等人最近报告通过利用异源二聚化药物桥接类似的分裂识别和活化部分来重构全功能CAR(Wu等人,2015)。为此目的，这些作者使用FK506结合蛋白域(FKBP，104个氨基酸)和FKBP-雷帕霉素(rapamycin)结合域的T2089L突变体(FRB，89个氨基酸)，其在雷帕霉素类似物AP21967存在下异源二聚化(流程I)。这种药物具有与雷帕霉素相比低1000倍的免疫抑制活性(Bayle等人,2006；Graef等人,1997；Liberles等人,1997)并且是可商购的(ARGENTTM,Regulated Heterodimerization Kit,ARIAD)。
流程I.AP21967的结构
2.分别将pCAR识别单元和缺失的活化域移植到RIP控制受体的跨膜域的两个表面上，所述受体包含两个膜内裂解位点(图2A)。pCAR与其抗原的结合将首先由去除胞外域的胞外解整合素和金属蛋白酶(ADAM)家族的成员并且随后由释放pCAR的胞内域的胞内γ-分泌酶触发编码的多肽的双重裂解。预计这一事件会破坏截短的aCAR获得其缺失的活化元件的功能性膜锚定构型的能力，从而获得操作模式(图2C)。这一原理最近被用于发展新的基因开关，其被设计成限制CAR T细胞活性以同时识别肿瘤细胞上的两种不同抗原，应用Notch受体(Morsut等人,2016；Roybal等人,2016b)或上皮细胞粘附分子(在发明人的监督下的EpCAM,Pizem,Y.,M.Sc.论文)，两个充分研究的受体通过RIP起作用。在这些研究中，基于RIP的CAR与一种抗原的结合释放基因工程化的胞内域，其易位到细胞核，在那里其开启第二CAR的表达。不同的是，本发明利用这一方法仅用于在保护性抗原存在下解除任何潜在的aCAR活性。
预测上述提出的作用模式发挥局部作用，使得仅相邻的aCAR受到影响，并且不再能够高效地结合其抗原并且形成免疫突触。因此，即使当aCAR与大量非肿瘤细胞的多次相互作用可能发生时，其也只是短暂的和无功能的，因此细胞完全能够进一步相互作用。
由于aCAR的功能完全取决于pCAR的存在，因此pCAR优于其aCAR对应部分的优势是这一系统所固有的。给定T细胞中pCAR的相对不足将使得aCAR由于缺乏活化域而无功能。
至关重要的是，识别域和活化域都定位于质膜(Wu等人,2015)。因此，将活化域与质膜分离的第2次裂解将使这一域无功能并且阻止不需要的细胞活化。
aCAR和pCAR被设计成通过互斥机制起作用。pCAR经历裂解的能力不取决于抑制性信号传递的强度，因此不会发生信号传递结果的完成。只要pCAR被裂解，aCAR就无法起作用，无论其与其对应抗原相互作用的相对亲合力如何，这种情况确保了另一个关键的安全水平。
任何相关技术都可用于工程化识别部分，所述识别部分赋予aCAR和pCAR或iCAR与其标靶特异性结合。举例来说，包含这一iCAR-aCAR文库的识别部分可以源自理想地选自组合展示文库的主要识别部分库，以便：
-总之，所选择的识别部分靶向位于所有22个人类常染色体的两个臂中的每一个上的基因阵列的细胞表面产物。相邻基因之间的距离越短，因此覆盖范围越充分，使用的普遍性就越大。
-对于每个所选基因，分离一组等位基因特异性识别部分，每个部分允许在人群中普遍存在的不同等位基因变异体之间进行严格区分。靶向变异体的数量越多，可以提供给患者的治疗性基因对的数量就越多。
给定的等位基因产物可以在一个患者中成为潜在的pCAR或iCAR标靶，并且在另一个具有相同等位基因的患者中成为有用的aCAR标靶，这取决于每种情况下的特定LOH模式。因此，当鉴别出合适的识别部分基因时，每个基因将被移植到pCAR或iCAR和aCAR基因支架上。因此，期望针对相同基因的等位基因变异体的所有识别部分具有相似范围的结合亲和力。在这样一组给定的识别部分中，可以预先组装pCAR-aCAR或iCAR-aCAR对的所有可能组合，以确保所述基因在整个群体中的潜在等位基因组成的最高覆盖率。
在更常见的情况中，患者对于主要等位基因和次要等位基因是杂合的，其产物由于非同义SNP或较不常见的插入缺失而在编码多肽的单个位置上不同。在不太常见的情况中，患者对于两个次要等位基因是杂合的，这两个等位基因与两个分开的位置中的主要等位基因不同。取决于在个别患者中涉及所述基因的特定LOH事件，给定的变异体表位可以在一个患者中充当iCAR标靶而在另一个患者中充当aCAR标靶。
鉴别变异体特异性mAb(比方说，对由次要等位基因‘a’编码的表位特异性的mAb)是本领域熟知的，并且原则上类似于鉴别针对任何常规抗原决定簇的mAb，并且通常可能最好通过重组抗体scFv文库的高通量筛选，例如利用噬菌体(Barbas等人,2004)、核糖体(Hanes等人,1997)或酵母(Chao等人,2006)显示技术来完成。用于文库筛选的抗原可以是跨越两个等位基因之间变异位置的合成肽(通常长度为15-20个氨基酸或更长)、重组全长多肽，其可以是商业上可获得的或通过本领域中许多公司操作中的一个定制合成的，或甚至在不表达这一等位基因的相同细胞上进行线都减除步骤后，通过基因转染(例如，使编码以模板克隆的全长cDNA的mRNA电穿孔以用于pGEM4Z/A64载体中的体外mRNA转录(Boczkowski等人,2000))以高水平表达所述等位基因变异体的整个细胞。这些方法是众所周知的，并且描述于以下中：例如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》(第四版)Green和Sambrook,冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)；《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》(第二版),Edward A.Greenfield编,2012 CSH实验室出版；Ed Harlow和David Lane的《使用抗体实验室手册(Using Antibodies,A laboratory manual)》,1999 CSH实验室出版。
根据定义，由主要等位基因(‘A’)编码的相应表位(在相同位置)形成独特的抗原决定簇，其与‘a’在单个氨基酸(SNP)的同一性中形成的抗原决定簇或长度(插入缺失)不同。原则上，这一决定簇可以通过由相同或其它抗体显示筛选技术鉴别的不同mAb组识别。两组鉴别的mAb中的每一组中的不同成员区分两个表位的能力，即来自第一组的抗体结合等位基因‘a’而不是‘A’的产物和来自第二组的Ab相互结合‘A’而不是‘a’可以使用常规结合分析(例如ELISA或流式细胞测量术)确定(Skora等人,2015)。或者，一旦鉴别出‘a’结合Ab而不结合‘A’并且确定其蛋白质序列，计算方法可以潜在地用于预测结合‘A’而非‘a’的‘互补’抗体scFv的序列。对于这种计算方法，参见例如(Sela-Culang等人,2015a,b)。
在呈现HLA-I类基因座基因HLA-A、HLA-B和HLA-C作为靶基因的专用实例中，存在许多可用的等位基因特异性单克隆抗体，例如实例3中列出的抗体。
编码这些抗体的可变区的序列可以容易地从相关的融合瘤中克隆，并且用于构建编码scFv的基因，所述基因针对特异性HLA I类等位基因表位变异体，其适于使用广泛可用的工具并入CAR构建体，如例如在以下中所公开：《分子克隆：实验室手册》(第四版)Green和Sambrook,冷泉港实验室出版社；《抗体：实验室手册》(第二版),Edward A.Greenfield编,2012 CSH实验室出版；Ed Harlow和David Lane的《使用抗体实验室手册》,1999 CSH实验室出版。
本发明提供一种数据库，其包含由于LOH而在肿瘤细胞中丢失并且编码细胞表面产物的多态变异体的DNA序列，其中DNA序列处的变异导致所编码蛋白质的胞外域中氨基酸序列的变异。可获自公众美国国立卫生研究院(National Institute of Health)TCGA数据端口(https://gdc.cancer.gov/)，其尤其提供可用于推断多种肿瘤类型中的基因的相对复本数的数据，和https://www.cbioportal.org的TCGA数据的cbio端口(Cerami等人,2012,Gao等人,2013)；外显子组聚集协会(Exome Aggregation协会，ExAC)数据库(exac.broadinstitute.org,Lek等人,2016)，其尤其提供各种群体中的SNP变异体的等位基因频率；基因型组织表达(Genotype-Tissue Expression，GTEX)数据库v6p(dbGaP登录号phs000424.v6.p1)(https://gtexportal.org/home,Consortium GT.Human genomics, 2015)，其包括基因的组织表达数据；和提供蛋白质的结构信息的数据库，例如人类蛋白图谱(Human Protein Atlas)(Uhlen等人,2015)；细胞表面蛋白图谱(Cell Surface ProteinAtlas)(Bausch-Fluck等人,2015)，N-糖基化细胞表面蛋白的基于质谱法的数据库和UniProt数据库(www.uniprot.org/downloads)。
本发明进一步提供一种用于广泛基因组鉴别编码经历LOH的表达的细胞表面蛋白的基因的方法。鉴别的基因必须符合以下准则：1)所述基因编码跨膜蛋白-因此具有在细胞表面上表达的部分以允许iCAR结合；2)所述基因具有至少两个表达的等位基因(在至少一个种族群体中检查过)；3)所述基因的等位基因变异导致氨基酸相对于蛋白质胞外区中的参考序列改变；4)所述基因定位于经历癌症中的LOH的染色体区；5)基因在肿瘤类型的来源的组织中表达，其中发现对应区经历LOH。
原则上，适合于编码iCAR结合的标靶的如上所述的基因可以通过本领域已知的任何方法鉴别，而不仅仅通过数据库挖掘鉴别。举例来说，LOH的概念不是新的，并且特定肿瘤中的特定基因、染色体或基因组/染色体区的LOH信息已经在文献中公开过，并且因此候选基因可以源自可获得的出版物。或者，可以通过与染色体标记物(例如微卫星探针)的全基因组杂交(Medintz等人,2000,《基因组研究(Genome Res)》.2000年8月；10(8):1211-1218)或通过任何其它合适的方法(Ramos和Amorim,2015,J.Bras.Patol.Med.Lab.51(3):198-196)找到这类信息。
类似地，关于等位基因变异体的信息可在各种数据库中公开获得，并且还可通过疑似区域的基因组测序容易地获得个性化病例。此外，关于蛋白质结构和表达模式的信息是可公开获得的并且如上所述易于获得。
因此，由于关于许多基因和SNP的各种准则的信息是可公开获得的，并且用于检索其的技术通常是已知的，所以应用的主要新颖性是使用LOH作为选择iCAR识别的标靶的准则，以及基于在特定患者中丢失的特异性等位基因来个性化治疗的概念。
作为一非限制性实例，根据本发明发现，在不同频率下，HLA-A、HLA-B和HLA-C LOH在许多肿瘤类型中是相对频繁的事件(参见图4)，其中为了本发明的目的，这些基因将成为用作iCAR识别标靶的良好候选者。
在没有pCAR或iCAR标靶的情况下，对任何健康的必需组织中的正常细胞的aCAR标靶的识别将是有害的并且是严格禁止的。在这方面，如本文所提出的，pCAR-aCAR或iCAR-aCAR对的概念构成故障安全启动开关，如下：i)不表达所选基因的细胞(如果aCAR和pCAR或iCAR靶向相同基因的不同产物)将由于缺乏aCAR靶抗原而不被靶向；ii)表达这种相同基因的正常细胞将共表达两个等位基因，并且由于pCAR或iCAR的优势而不会被靶向；iii)如果pCAR或iCAR靶向多态管家基因的产物，那么体内的所有细胞都将受到保护。iv)将仅攻击表达aCAR标靶但不表达pCAR或iCAR标靶的肿瘤细胞。
如上所强调，抑制信号优于活化信号的永久优势是绝对必需的。因此，在没有iCAR安全措施的情况下，确保在任何时间都没有aCAR基因在给定的杀伤细胞中表达是至关重要的。这可以通过将这些iCAR-aCAR基因对串联组装为单链产物或通过合适的双顺反子模式实施，例如，基于内部核糖体进入位点或几种病毒自裂解2A肽之一。正如报告的双顺反子表达的大量数据所示，iCAR基因将始终位于其aCAR伙伴的上游，以保证有利的化学计量。当然，这在使用PCAR-aCAR基因对时不是一个问题。
确保iCAR优势的另一个有吸引力的选择是将aCAR识别部分与其活化/共同刺激部分分离，使得两种实体可仅在异源二聚化小分子存在下组装成一种功能性受体。在抗肿瘤CAR的情况下，最近证实通过精确定时、剂量和位置严格控制这类分裂受体的操作状态的能力(Wu等人,2015)。
另外，预期的优势也可能是在所选iCAR设计中并入胞内部分的iCAR信号传递元件的特定组成所固有的，所述设计应该与所选aCAR平台的信号传递强度“竞争”。这种能力还将受到两个识别部分对其对应标靶表位(其在以上被处理)的相对亲和力和其相互作用的总体亲和力的影响。关于后者，所提出的策略确保了有利的iCAR/aCAR化学计量和其对应标靶表位在正常细胞上的平衡分布。同样，使用pCAR-aCAR基因对时，这不是问题。
为了进一步确保安全性，可以采用目前在CAR和TCR免疫疗法领域中实施的其它常规手段，例如使用自杀基因或使用mRNA电穿孔进行瞬时表达。
虽然LOH经常使细胞只有一个给定基因的等位基因，但它常常伴随着剩余染色体或染色体部分的重复，产生‘拷贝数中性’-LOH(Lo等人,2008；O'Keefe等人,2010；Sathirapongsasuti等人,2011)。在这些情况下，表位丢失变异体的出现需要两个独立的事件，因此不太可能。在基因修饰细胞的不同部分中表达若干pCAR-aCAR或iCAR-aCAR对将防止突变逃逸的出现，即使在“拷贝数丢失”LOH情况下，其中仅保留了标靶等位基因的单个拷贝。然而，由于单拷贝基因可能变得必不可少，因此其功能丢失的可能性要小得多。
在一方面，本发明提供一种核酸分子，其包含编码抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的核苷酸序列，所述iCAR能够防止或减弱效应免疫细胞的非所需活化，其中iCAR包含：胞外域，其与由于杂合性丢失(LOH)而从哺乳动物肿瘤细胞中缺失但至少存在于相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体特异性结合；和胞内域，其包含至少一种抑制效应免疫细胞的信号转导元件。
在某些实施例中，多态细胞表面表位是由肿瘤抑制基因或与肿瘤抑制基因遗传连接的基因编码的抗原的一部分，因为这类基因可能在肿瘤中由于LOH而丢失。另外，多态细胞表面表位可以是由通常位于染色体或染色体臂上的基因编码的抗原的一部分，所述染色体或染色体臂经常在癌细胞中经历LOH，例如但不限于染色体臂3p、6p、9p、10q、17p、17q或18q、或染色体19。可以在如本文所述的相关数据库中容易地鉴别这些表位。
在某些实施例中，多态细胞表面表位是管家基因产物，例如未分类的AP2S1、CD81、GPAA1、LGALS9、MGAT2、MGAT4B、VAMP3；细胞粘附蛋白质CTNNA1 NM_001903、CTNNB1、CTNNBIP1 NM_020248、CTNNBL1 NM_030877、CTNND1 NM_001085458 δ连环蛋白；通道和转运蛋白ABCB10 NM_012089、ABCB7 NM_004299、ABCD3 NM_002857、ABCE1 NM_002939、ABCF1NM_001090、ABCF2 NM_005692、ABCF3 NM_018358、CALM1[1][7]钙蛋白掌握钙离子、类似于MSFD10，也称为TETRAN或四环素转运蛋白样蛋白质[1]的MFSD11 NM_024311、MFSD12 NM_174983、MFSD3 NM_138431、MFSD5 NM_032889、SLC15A4 NM_145648、SLC20A1 NM_005415、SLC25A11[1]粒线体酮戊二酸/苹果酸盐载剂、SLC25A26 NM_173471、SLC25A28 NM_031212、SLC25A3 NM_002635、SLC25A32 NM_030780、SLC25A38 NM_017875、SLC25A39 NM_016016、SLC25A44 NM_014655、SLC25A46 NM_138773、SLC25A5 NM_001152、SLC27A4 NM_005094、SLC30A1 NM_021194、SLC30A5 NM_022902、SLC30A9 NM_006345、SLC35A2 NM_005660、SLC35A4 NM_080670、SLC35B1 NM_005827、SLC35B2 NM_178148、SLC35C2 NM_015945、SLC35E1 NM_024881、SLC35E3 NM_018656、SLC35F5 NM_025181、SLC38A2 NM_018976、SLC39A1 NM_014437、SLC39A3 NM_144564、SLC39A7 NM_006979、SLC41A3 NM_017836、SLC46A3 NM_181785、SLC48A1 NM_017842、类似于ACVRL1 TGF β受体家族Rendu-Osler-Weber症候群的受体ACVR1 NM_001105、ACVR1B NM_004302,CD23[1]FCER2低亲和力IgE受体(凝集素)；和参与RNA拼接的HLA/免疫球蛋白/细胞识别组BAT1(也称为DDX39B)、BSGBasigin免疫球蛋白超家族、胞外金属蛋白酶、MIF巨噬细胞迁移抑制因子、TAPBP[维基百科(Wikipedia)]。
在某些实施例中，管家基因是HLA I型、G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道或受体酪氨酸激酶，优选为HLA-A、HLA-B或HLA-C。
任何相关技术都可用于工程化识别部分，所述识别部分赋予aCAR和pCAR或iCAR与其标靶特异性结合。在某些实施例中，胞外域包含(i)抗体、其衍生物或片段，例如人源化抗体；人类抗体；抗体的功能性片段；单个域抗体，例如纳米抗体；重组抗体；和单链可变片段(ScFv)；(ii)抗体模拟物，例如亲和抗体分子；阿非灵(affilin)；阿非默(affimer)；阿非汀(affitin)；阿尔法体(alphabody)；抗运载蛋白；高亲和性多聚体；达尔平(DARPin)；非咯默(fynomer)；Kunitz域肽；和单抗体；或(iii)适体。优选地，胞外域包含ScFv。
在某些实施例中，哺乳动物组织是人体组织，并且在其它实施例中，相关哺乳动物正常组织是肿瘤从其发展的正常组织。
在某些实施例中，效应免疫细胞是T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。
在某些实施例中，至少一种能够抑制效应免疫细胞的信号转导元件与免疫检查点蛋白的信号转导元件同源，例如选自由以下组成的群组的免疫检查点蛋白：PD1；CTLA4；BTLA；2B4；CD160；CEACAM，例如CEACAM1；KIR，例如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LIR1、LIR2、LIR3、LIR5、LIR8和CD94-NKG2A；LAG3；TIM3；T细胞活化的V-域Ig抑制因子(VISTA)；干扰素基因的刺激因子(STING)；含有免疫受体酪氨酸类抑制性基序(ITIM)的蛋白质、T细胞免疫球蛋白和ITIM域(TIGIT)和腺苷受体(例如A2a)。
在某些实施例中，免疫检查点蛋白是自然杀伤细胞抑制性受体，例如KIR，例如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3；或白细胞Ig样受体，例如LIR1、LIR2、LIR3、LIR5、LIR8；和CD94-NKG2A，一种C型凝集素受体，其与CD94形成异源二聚体并且含有2个ITIM。
在iCAR中制备和使用杀伤细胞受体的方法已描述于US 9,745,368中，所述文献以引用的方式并入本文，如同在本文中完全公开的一样。
在某些实施例中，任何一个上述实施例的胞外域通过柔性铰链和跨膜阳离子基序与所述胞内域融合。
在某些实施例中，iCAR针对或不特异性结合到不包括蝶素受体(例如EPHA7)和密蛋白的抗原的单个等位基因变异体。
在某些实施例中，iCAR针对或特异性结合到由HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变异体编码的表位。
在另一个方面，本发明提供载体，其包含如上述任一实施例中所定义的本发明的核酸分子和至少一种与核酸分子可操作地连接的控制元件，例如启动子。
在某些实施例中，载体进一步包含包括编码aCAR的核苷酸序列的核酸分子，所述核酸分子包含：胞外域，其特异性结合抗原的非多态细胞表面表位或多态细胞表面表位的单个等位基因变异型，其中所述表位为肿瘤相关抗原或至少与相关肿瘤和正常组织的细胞共用；和胞内域，其包含活化和/或共同刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件。
在某些实施例中，由载体中包含的核酸编码的aCAR的胞外域特异性结合到抗原的非多态细胞表面表位，并且iCAR的胞外域特异性结合与所述aCAR的胞外域结合的抗原不同的抗原的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体。
在某些实施例中，由载体中包含的核酸编码的iCAR的胞外域针对或特异性结合到HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变异体。
在某些实施例中，由载体中包含的核酸编码的aCAR的胞外域针对或特异性结合到选自表1中列出的抗原的非多态细胞表面表位，例如CD19。
在某些实施例中，由载体中包含的核酸编码的iCAR的胞外域针对或特异性结合到HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变异体；由载体中包含的核酸编码的aCAR的胞外域针对或特异性结合到选自表1中列出的抗原的非多态细胞表面表位，例如CD19。
在某些实施例中，活化或共同刺激效应的免疫细胞与以下同源：例如CD3ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)；包含带正电氨基酸残基或带正电侧链的活化杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的跨膜域或例如KIR2DS和KIR3DS的活化KIR跨膜域或转接分子，例如DAP12；或例如CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)或CD134(OX40)的共同刺激信号转导元件。
在某些实施例中，载体的核苷酸序列包含编码aCAR的核苷酸序列与编码iCAR的核苷酸序列之间的内部核糖体进入位点(IRES)。通常，编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列可以是任何顺序，但在特定实施例中，编码aCAR的核苷酸序列是编码iCAR的核苷酸序列的下游。
在某些实施例中，载体的核苷酸序列包含编码aCAR的核苷酸序列与编码iCAR的核苷酸序列之间的病毒自裂解2A肽。特别地，病毒自裂解2A肽可以选自由以下组成的群组：来自明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus，TaV)的T2A、来自口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)的F2A、来自马鼻炎A病毒(Equine rhinitis A virus，ERAV)的E2A和来自猪捷申病毒-1(Porcine teschovirus-1，PTV1)的P2A。
在某些实施例中，载体包含编码通过柔性连接子与所述iCAR连接的组成型aCAR的核苷酸序列。
可以通过例如RNA转染或通过并入适于在真核细胞或病毒载体中复制和/或转录的质粒，用本文所述的适当核酸分子转染免疫细胞。在某些实施例中，载体选自逆转录病毒或慢病毒载体。
也可以使用逆转录病毒载体和适当的包装线的组合，其中衣壳蛋白将为功能性的以用于感染人类细胞。已知几种产生双嗜性病毒的细胞系，包括PA12(Miller,等人(1985)《分子与细胞生物化学(Mol.Cell.BioI.)》5:431-437)；PA317(Miller,等人(1986)《分子与细胞生物化学》6:2895-2902)；和CRIP(Danos等人(1988)《国家科学院学报(Proc.Nati.Acad.Sci.)》USA 85:6460-6464)。或者，可以使用非双嗜性颗粒，例如用VSV、RD 114或GAL V包膜假型化的颗粒。细胞可以通过与生产细胞直接共培养进一步转导，例如通过Bregni等人(1992)《血液(Blood)》80:1418-1422的方法，或仅用病毒上清液或用浓载体原料培养转导，例如通过Xu等人(1994)《实验血液学(Exp.Hemat.)》22:223-230；和Hughes等人(1992)《临床研究期刊(J Clin.Invest.)》89:1817的方法。
在另一方面，本发明提供一种制备能够防止或减弱效应免疫细胞的非所需活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的方法，根据如上文所定义的本发明，所述方法包含：(i)从已知变异体的至少一个数据库中检索编码蛋白质的基因的人类基因组变异体的列表；(ii)通过以下来筛选(i)中检索的所述变异体的列表：(a)选择与其相应参考等位基因相比导致由所述对应的基因编码的蛋白质中的氨基酸序列变异的变异体；(b)选择所述氨基酸序列变异在所述编码的蛋白质的胞外域中的基因的变异体，(c)选择至少在一个肿瘤中经历杂合性丢失(LOH)的基因的变异体，并且(d)选择至少在其根据(c)经历LOH的所述至少一个肿瘤的来源的组织中表达的基因的变异体，从而获得在所述蛋白质中的胞外域中具有氨基酸序列变异的变异体列表，所述蛋白质由在所述至少一个肿瘤中由于LOH而丢失并且至少在所述至少一个肿瘤的来源的组织中表达的所述对应的基因编码；(iii)从(ii)中获得的所述列表中定义包含至少一个单个变异体的序列区、亚克隆并且表达包含所述至少一个单个变异体的所述序列区和包含所述相应参考等位基因的序列区，从而获得所述对应的表位肽；(iv)选择iCAR结合域，其特异性结合到由所述克隆的序列区编码的所述表位肽或特异性结合到由(iii)中获得的所述相应参考等位基因编码的所述表位肽；并且(vii)制备如上文所定义的iCAR，其各自包含如(iv)中所定义的iCAR结合域。
在某些实施例中，所选择的基因的候选变异体在某种肿瘤类型中经历至少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的LOH。
在某些实施例中，所选择的每种变异体的次要等位基因频率在至少一个群体中等于或超过1％、2％、3％、4％或5％。
在再一方面，本发明提供一种制备安全效应免疫细胞的方法，所述方法包含：(i)用包含编码如上文所定义的iCAR的核苷酸序列的核酸分子转染针对肿瘤相关抗原的TCR工程化效应免疫细胞，或用根据权利要求9所述的载体转导所述细胞；或(ii)用包含编码如上文所定义的iCAR的核苷酸序列的核酸分子和包含编码如上文所定义的aCAR的核苷酸序列的核酸分子转染初始型效应免疫细胞；或用如上文所定义的载体转导效应免疫细胞。
在又一方面，本发明提供了通过如上所述的本发明方法获得的安全效应免疫细胞。安全效应免疫细胞可为表达外源性T细胞受体(TCR)和iCAR的重定向T细胞，其中外源性TCR是针对抗原的非多态细胞表面表位或多态细胞表面表位的单个等位基因变异体，其中所述表位为肿瘤相关抗原或至少与相关肿瘤和正常组织的细胞共用，并且iCAR如上文所定义；或安全效应免疫细胞为重定向效应免疫细胞，例如表达如本文中所定义的iCAR和aCAR的自然杀伤细胞或T细胞。
在某些实施例中，安全效应免疫细胞在其表面上表达aCAR和iCAR，所述aCAR包含特异性结合到抗原的非多态细胞表面表位的胞外域，所述iCAR包含特异性结合到与所述aCAR的胞外域结合的抗原不同的抗原的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的胞外域。在某些实施例中，iCAR的胞外域特异性结合与所述aCAR的胞外域结合的抗原相同的抗原的不同多态细胞表面表位的单个等位基因变异体；或iCAR的胞外域特异性结合与所述aCAR的胞外域结合的多态细胞表面表位区域相同的多态细胞表面表位区域的不同单个等位基因变异体。
在某些实施例中，在细胞表面上表达的aCAR的胞外域特异性结合到选自表1中列出的抗原的非多态细胞表面表位，例如CD19。
在某些实施例中，在细胞表面上表达的iCAR的胞外域针对或特异性结合到HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变异体。
在某些实施例中，在细胞表面上表达的iCAR的胞外域针对或特异性结合到HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变异体；并且在细胞表面上表达的aCAR的胞外域针对或特异性结合到选自表1中列出的抗原的非多态细胞表面表位，例如CD19。
在某些实施例中，aCAR和iCAR作为分开的蛋白质存在于细胞表面上。
在某些实施例中，编码iCAR的核苷酸序列的细胞表面上的表达水平大于或等于编码aCAR的核苷酸序列的表达水平。
在又一方面，本发明提供一种为患有特征为LOH的肿瘤的个体选择个性化生物标记物的方法，这一方法包括(i)从个体中获得肿瘤活检；(ii)从个体中获得正常组织的样品，例如PBMC；和(iii)鉴别多态细胞表面表位的单个等位基因变异体，其由于LOH而不由肿瘤的细胞表达，但其由正常组织的细胞表达，从而鉴别个体的个性化生物标记物。
在某些实施例中，生物标记物用于定制个体的治疗，因此这一方法还包括治疗患有特征为LOH的肿瘤的患者的癌症的步骤，所述方法包含向患者施用如上文所定义的效应免疫细胞，其中iCAR是针对(iii)中鉴别的单个等位基因变异体。
在另一方面，本发明提供一种治疗患有特征为LOH的肿瘤的患者的癌症的方法，所述方法包含向所述患者施用如上文所定义的效应免疫细胞，其中所述iCAR是针对编码由于杂合性丢失(LOH)而从所述肿瘤的细胞中缺失但至少存在于所述患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体。
在一类似方面，本发明提供一种减少患有特征为LOH的肿瘤的个体的肿瘤负荷的方法，所述方法包含向所述患者施用如上文所定义的效应免疫细胞，其中所述iCAR是针对编码由于杂合性丢失(LOH)而从所述肿瘤的细胞中缺失但至少存在于所述患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体。
在另一个类似的方面，本发明提供一种提高患有特征为LOH的肿瘤的个体的存活率的方法，所述方法包含向所述患者施用如上文所定义的效应免疫细胞，其中所述iCAR是针对编码由于杂合性丢失(LOH)而从所述肿瘤的细胞中缺失但至少存在于所述患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体。
在又另一方面，本发明是针对如上文所定义的安全效应免疫细胞，其用于治疗患有特征为LOH的肿瘤的患者、减少所述患者的肿瘤负荷或提高所述患者的存活率，其中所述iCAR是针对编码由于杂合性丢失(LOH)而从所述肿瘤的细胞中缺失但至少存在于所述患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体。
在又另一个方面，本发明是针对一种治疗患有特征为LOH的肿瘤的患者的癌症的方法，所述方法包含：(i)鉴别或接收鉴别多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的信息，所述等位基因变异体由于LOH而不由肿瘤的细胞表达，但所述等位基因变异体由正常组织的细胞表达，(ii)鉴别或接收鉴别抗原的非多态细胞表面表位或多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的信息，其中所述表位为肿瘤相关抗原或至少与所述癌症患者的相关肿瘤和正常组织的细胞共用；(iii)选择或接受至少一种定义如上文所定义的iCAR的核酸分子和至少一种包含编码如上文所定义的aCAR的核苷酸序列或至少一种如本文所定义的载体的核酸分子，其中iCAR包含与(i)的细胞表面表位特异性结合的胞外域，并且aCAR包含与(ii)的细胞表面表位特异性结合的胞外域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接受至少一个群体的安全重定向效应免疫细胞；以及(v)向所述癌症患者施用至少一个群体的(iv)的安全重定向免疫效应细胞。
在一类似方面，本发明提供至少一个群体的用于治疗患有特征为LOH的肿瘤的患者的癌症的安全重定向免疫效应细胞，其中所述安全重定向免疫细胞通过以下获得：(i)鉴别或接收鉴别多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的信息，所述等位基因变异体由于LOH而不由肿瘤的细胞表达，但所述等位基因变异体由正常组织的细胞表达，(ii)鉴别或接收鉴别抗原的非多态细胞表面表位或多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的信息，其中所述表位为肿瘤相关抗原或至少与所述癌症患者的相关肿瘤和正常组织的细胞共用；(iii)选择或接受至少一种定义如上文所定义的iCAR的核酸分子和至少一种包含编码如上文所定义的aCAR的核苷酸序列或至少一种如本文所定义的载体的核酸分子，其中iCAR包含与(i)的细胞表面表位特异性结合的胞外域，并且aCAR包含与(ii)的细胞表面表位特异性结合的胞外域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接受至少一个群体的安全重定向效应免疫细胞。
在涉及针对治疗癌症或用于治疗癌症的安全免疫效应细胞的以上实施例中任一项的某些实施例中，(i)iCAR的胞外域特异性结合抗原的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体，所述抗原为与aCAR的胞外域结合的抗原相比不同的抗原；(ii)所述iCAR的胞外域特异性结合与所述aCAR的胞外域结合的抗原相同的抗原的不同多态细胞表面表位的单个等位基因变异体；或(iii)所述iCAR的胞外域特异性结合与所述aCAR的胞外域结合的多态细胞表面表位相同的多态细胞表面表位的不同单个等位基因变异体。
在某些实施例中，与包含向癌症患者施用至少一个群体的表达(iii)的aCAR但缺乏和(iii)的iCAR的免疫效应细胞的治疗相比，所述治疗导致靶上、肿瘤外反应性降低。
在某些实施例中，用于治疗如上文所定义的癌症的安全效应免疫细胞在其表面上表达aCAR和iCAR，所述aCAR包含特异性结合到肿瘤相关抗原或抗原的非多态细胞表面表位的胞外域，所述iCAR包含特异性结合至少在肿瘤或管家蛋白质(例如HLA-A、HLA-B或HLA-C)的来源的组织中表达的抗原的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的胞外域C，所述抗原为与所述aCAR的胞外域结合的抗原相比不同的抗原。
在某些实施例中，施用超过一个群体的免疫效应细胞，并且不同群体表达不同对的aCAR和iCAR，其已与不同基因产物的细胞表面表位特异性结合。
在某些实施例中，用于治疗癌症的方法的安全效应免疫细胞选自T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。在某些实施例中，安全效应免疫细胞是自体或通用(异基因)效应细胞。
在某些实施例中，治疗上文所定义的癌症的方法中的任一项中所用的iCAR是针对存在aCAR的靶抗原的患者的所有组织，其中aCAR的靶抗原为抗原的非多态细胞表面表位或多态细胞表面表位的单个等位基因变异体存在，并且所述表位为肿瘤相关抗原或至少与相关肿瘤和正常组织的细胞共用。
在某些实施例中，癌症选自急性髓性白血病[LAML]、肾上腺皮质癌[ACC]、膀胱尿道上皮癌[BLCA]、脑低级别胶质瘤[LGG]、乳腺浸润癌[BRCA]、宫颈鳞状细胞癌和子宫颈内腺癌[CESC]、胆管癌[CHOL]、结肠腺癌[COAD]、食管癌[ESCA]、多形性胶质母细胞瘤[GBM]、头颈部鳞状细胞癌[HNSC]、肾脏嗜铬细胞[KICH]、肾脏肾透明细胞癌[KIRC]、肾脏肾乳头状细胞癌[KIRP]、肝脏肝细胞肝癌[LIHC]、肺腺癌[LUAD]、肺鳞状细胞癌[LUSC]、淋巴肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBC]、间皮瘤[MESO]、卵巢浆液性囊腺癌[OV]、胰腺癌[PAAD]、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤[PCPG]、前列腺癌[PRAD]、直肠腺癌[READ]、肉瘤[SARC]、皮肤黑色素瘤[SKCM]、胃腺癌[STAD]、睾丸生殖细胞肿瘤[TGCT]、胸腺瘤[THYM]、甲状腺癌[THCA]、子宫癌肉瘤[UCS]、子宫肌层子宫内膜癌[UCEC]、葡萄膜黑色素瘤[UVM]。
在某些实施例中，用于治疗癌症的iCAR，例如上述任何一种癌症类型是针对或特异性结合到HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变异体。
在某些实施例中，用于治疗癌症的aCAR，例如上述任何一种癌症类型是针对或特异性结合到选自表1中列出的抗原的非多态细胞表面表位，例如CD19。
在某些实施例中，用于治疗癌症的iCAR，例如上述任何一种癌症类型是针对或特异性结合到HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变异体；并且用于治疗癌症的aCAR，例如上述任何一种癌症类型是针对或特异性结合到选自表1中列出的抗原的非多态细胞表面表位，例如CD19。
在另一方面，本发明是针对两种或更多种核酸分子的组合，每一种包含编码受控效应免疫细胞活化系统的不同成员的核苷酸序列，所述核酸分子为单个连续核酸分子的部分或形成单个连续核酸分子或包含两种或更多种分开的核酸分子，其中所述受控效应免疫活化系统引导效应免疫细胞杀灭由于杂合性丢失(LOH)而丢失一个或多个染色体或其部分的肿瘤细胞并且饶过相关正常组织的细胞，并且其中(a)所述第一成员包含活化嵌合抗原受体(aCAR)多肽，其包含与抗原的非多态细胞表面表位或与不同多态细胞表面表位的单个等位基因变异体特异性结合的第一胞外域，并且所述非多态或多态细胞表面表位为肿瘤相关抗原或与相关异常和正常哺乳动物组织的细胞共用；并且(b)所述第二成员包含调节性多肽，其包含与多态细胞表面表位的单个等位基因变异体特异性结合的第二胞外域，所述等位基因变异体由于LOH而不由异常哺乳动物组织表达但存在于相关哺乳动物正常组织的所有细胞上。
在某些实施例中，第一成员选自：(a)组成型αCAR，其进一步包含胞内域，所述胞内域包含至少一种活化和/或共同刺激效应免疫细胞的信号转导元件；和(b)条件性aCAR，其进一步包含胞内域，所述胞内域包含异源二聚化小分子和任选的至少一种共同刺激信号转导元件的结合位点的第一成员，但缺乏活化信号转导元件；并且第二种成员是：(c)抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其进一步包含胞内域，所述胞内域包含至少一种抑制效应免疫细胞的信号转导元件；或(d)保护性嵌合抗原受体(pCAR)，其进一步包含胞外调节区，所述胞外调节区包含用于脱落酶的底物；跨膜阳离子基序，其包含用于膜内裂解蛋白酶的底物；和胞内域，所述胞内域包含至少一种活化和/或共同刺激效应免疫细胞的信号转导元件和异源二聚化小分子的结合位点的第二成员。
在某些实施例中，(i)iCAR或pCAR的胞外域特异性结合抗原的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体，所述抗原是与aCAR的胞外域结合的抗原不同的抗原；(ii)所述pCAR或iCAR的胞外域特异性结合所述aCAR的胞外域结合的抗原相同抗原的不同多态细胞表面表位的单个等位基因变异体；或(iii)所述pCAR或iCAR的胞外域特异性结合所述aCAR的胞外域结合的多态细胞表面表位相同的多态细胞表面表位的不同单个等位基因变异体。
在某些实施例中，脱落酶的底物是解整合素和金属蛋白酶(ADAM)或β-分泌酶1(BACE1)的底物。在某些实施例中，底物形成胞外域的一部分并且包含Lin 12/Notch重复序列和ADAM蛋白酶裂解位点。
人们普遍认为，没有一致的序列基序预测ADAM裂解，但是Caescu等人(Caescu等人,2009)在表2中公开了大量ADAM10和/或ADAM17底物序列，其通过引用并入本文中，如同在本文中完全公开的一样，并且其可以在本发明的pCAR中用作ADAM的底物。在某些实施例中，ADAM底物序列是淀粉样前体蛋白、BTC、CD23、胶原蛋白、DII-1、埃博拉(Ebola)糖蛋白、E-钙粘素、EGF、上皮调节蛋白(Epiregulin)、Fas配体、生长激素受体、HB-EGF、II型白细胞介素-1受体、IL-6受体、L-选择素、N-钙粘素、Notch、p55 TNF受体、p75 TNF受体、Pmel17、朊病毒(Prion)蛋白、受体型蛋白酪氨酸磷酸酶Z、TGF-α、TNF或TR(Caescu等人,2009)。
在本发明的pCAR中使用ADAM10裂解序列可能是有利的，因为ADAM 10以相对高的量组成型地存在于例如淋巴细胞上。与ADAM10相反，在未受刺激的细胞上仅检测到相对低的量的TACE/ADAM17。通过刺激迅速诱导T细胞母细胞上的ADAM17表面表达(Ebsen等人,2013)。
Hemming等人(Hemming等人,2009)报告在底物与非底物中没有鉴别出预测BACE1裂解的一致序列基序，但在表1中公开大量具有BAC1裂解序列的BACE1底物，其以引用的方式并入本文中，如同在本文中完全公开的一样，并且其可以充当本发明的pCAR中BACE1的底物。
在某些实施例中，用于膜内裂解蛋白酶的底物是SP2、γ-分泌酶、信号肽酶(signal peptide peptidase，spp)、spp样蛋白酶或扁菱形蛋白酶的底物。
Rawson等人(Rawson,2013)公开了SP2底物具有至少一种2型跨膜螺旋并且包括螺旋去稳定基序，例如SP2底物中的Asp-Pro基序。这一文章在表1中公开了许多具有SP2-裂解序列的SP2底物，其以引用的方式并入本文中，如同在本文中完全公开的一样，并且其可以充当本发明的pCAR中的SP2的底物。
Haapasalo和Kovacs(Haapasalo和Kovacs,2011)教导淀粉样β蛋白前体(AβPP)是早老素(PS)依赖性γ-分泌酶(PS/γ-分泌酶)的底物，并且至少有90种额外蛋白质已经发现通过这种酶复合物经历类似的蛋白水解。γ-分泌酶底物具有一些共同特征：大多数底物蛋白质是I型跨膜蛋白；PS/γ-分泌酶介导的γ样裂解(对应于释放AICD的AβPP中的ε-裂解)发生在跨膜和细胞质域的边界处或附近。ε样裂解位点位于富含赖氨酸和/或精氨酸残基的一段疏水氨基酸序列的侧翼。似乎PS/γ-分泌酶裂解不依赖于裂解位点处或附近的特定氨基酸靶序列，而是可能取决于跨膜域的构象状态。Haapasalo和Kovacs在表1中公开γ-分泌酶底物的列表，其裂解序列以引用的方式并入本文中，如同在本文中完全公开的一样，并且其可以充当本发明的pCAR中的γ-分泌酶的底物。
Voss等人(Voss等人,2013)教导到目前为止还没有描述基于GxGD天冬氨酰蛋白酶(spp)的底物内一级序列元件的共有裂解位点。膜蛋白的跨膜域优先采用α-螺旋确认，其中其肽键很难被蛋白酶接近。为了使跨膜域对膜内蛋白水解敏感，因此推测其α-螺旋含量需要通过螺旋去稳定氨基酸来降低。与这一假设一致，已经显示各种信号肽在其h区内含有螺旋去稳定氨基酸，这严重影响其通过SPP的蛋白水解处理。另外，信号肽的h区内的极性残基可以影响SPP的裂解，例如各种HCV菌株的信号肽内的丝氨酸和半胱氨酸残基对SPP裂解是关键的。这些极性残基是否也仅仅影响信号肽或特别是羟基或巯基的螺旋含量是否需要通过SPP触发裂解尚不完全清楚。类似地，当Bri2跨膜域的α-螺旋含量降低时，SPPL2b对Bri2跨膜域的裂解显著增加。有趣的是，在具有推定的螺旋去稳定效能的四个残基中仅有一个氨基酸残基显著降低了基于磷脂的环境中Bri2跨膜域的α-螺旋含量。这表明α-螺旋跨膜域的去稳定化不仅仅由某些氨基酸残基引起，而是这些氨基酸的相反情况和位置决定了其螺旋去稳定潜力，并且因此决定了跨膜域对SPP/SPPL的膜内蛋白水解的可获得性。Voss等人在表1中进一步公开spp和spp样底物的列表，其裂解序列以引用的方式并入本文中，如同在本文中完全公开的一样，并且其可以充当本发明的pCAR中的spp的底物。
Bergbold等人(Bergbold和Lemberg,2013)教导对于扁菱形蛋白酶，已经表明两种不同的底物识别的模型。在第一个模型中，底物肽骨架的构象灵活性与膜在扁菱形蛋白蛋白活性位点附近的浸入相结合足以提供特异性。对于表征良好的果蝇(Drosophila)基质Spitz，甘氨酸-丙氨酸基序已被证明可充当螺旋断裂，其允许跨膜域展开进入扁菱形蛋白蛋白活性位点。第二个模型表明扁菱形蛋白酶主要识别裂解位点周围的特定序列，并且跨膜螺旋去稳定残基仅是某些底物所需的次要特征。具体序列尚未鉴别。Bergbold等人在表2中公开了扁菱形蛋白酶底物的列表，其裂解序列以引用的方式并入本文中，如同在本文中完全公开的一样，并且其可以充当本发明的pCAR中的扁菱形蛋白酶的底物。
鉴于上述情况，由于在大多数情况下尚未建立用于膜内裂解蛋白酶的共有基序，并且因为用于鉴别膜内裂解蛋白酶底物的分析是本领域熟知的，如上文引用的文献中所述，pCAR可以包含如此鉴别的氨基酸序列，并且可以进一步包含跨膜螺旋去稳定残基。
在某些实施例中，底物形成跨膜阳离子基序的一部分并且与Notch、ErbB4、E-钙粘素、N-钙粘素、蝶素-B2、淀粉样前体蛋白或CD44的跨膜域同源/源自其。
在某些实施例中，包含编码作为分开的蛋白质的所述条件性aCAR的胞外域和胞内域的核苷酸序列，其中每个域独立地与跨膜阳离子基序融合并且包含用于异源二聚化小分子的结合位点的不同成员。
在某些实施例中，异源二聚化小分子的结合位点的第一和第二成员中的每一个源自选自以下的蛋白质：(i)他克莫司(Tacrolimus)(FK506)结合蛋白(FKBP)和FKBP；(ii)FKBP和钙调神经磷酸酶催化亚单元A(CnA)；(iii)FKBP和亲环蛋白；(iv)FKBP和FKBP-雷帕霉素(rapamycin)相关蛋白(FRB)；(v)旋转酶B(GyrB)和GyrB；(vi)二氢叶酸还原酶(DHFR)和DHFR；(ⅶ)DmrB同源二聚化域(DmrB)和DmrB；(viii)PYL蛋白(也称为脱落酸受体和RCAR)和ABI；和(ix)GAI阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)蛋白(也称为Gibberellic Acid)不敏感和DELLA蛋白GAI；GAI)和GID1阿拉伯芥受体GID1；GID1)。
定义
如本文所用的术语“核酸分子”是指DNA或RNA分子。
如本文所用的术语“基因组变异体”是指与相同基因组位置处的参考序列或共同序列相比，测序样品中基因组水平的至少一个核苷酸的变化。
如本文中关于变异体使用的术语“相应参考等位基因”是指与变异体在相同基因组位置的参考序列或共同序列或核苷酸。
如本文所用，参看蛋白质，术语“胞外域”是指蛋白质的区域，其位于细胞膜外。
本文所用的术语“杂合性丢失”或“LOH”是指在体细胞中两条染色体的一个拷贝中染色体材料(例如完整染色体或其部分)的丢失。
如本文中关于变异体或参考等位基因所使用的术语“序列区”是指从变异体的位置上游开始和下游结束的序列，其可以被翻译成可以被抗体识别的“表位肽”。
在特异性结合到多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的胞外域(例如scFv)的情况下，如本文所用的术语“特异性结合”涉及scFv相对结合到等位基因变异体，并且其未能结合至到相同多态细胞表面表位的相应的不同等位基因变异体上。由于这取决于亲合力(T细胞上的CAR拷贝数、靶细胞(或待保护的细胞)表面上的抗原分子数)和所用特异性CAR的亲和力，因此功能定义将是特异性scFv将在ELISA中提供针对其特异性多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的显著信号，或者用显示scFv的CAR转染的细胞将在FACS分析中用多态细胞表面表位的单个等位基因变异体清楚地标记，而使用相同多态细胞表面表位的相应不同等位基因变异体的相同分析不会给出任何可检测信号。
如本文所用的术语“治疗”是指获得所需生理作用的手段。就部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的症状而言，所述效果可以是治疗性的。所述术语指的是抑制疾病，即阻止其发展；或改善疾病，即使疾病消退。
如本文所用，术语“个体(subject/individual)”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何需要诊断、预后或治疗的个体，特别是哺乳动物个体，例如，人类。
可以使用一种或多种生理学上可接受的载剂或赋形剂以常规方式配制根据本发明使用的医药组合物。在与组合物的其它成分相容并且对其接受者无害的意义上，载剂必须是“可接受的”。
载剂、施用模式、剂型等的以下范例列为已知的可能性，根据所述可能性可以选择载剂、施用模式、剂型等以用于本发明。然而，本领域普通技术人员将理解，应首先测试所选择的任何给定配制物和施用模式以确定其达到所需结果。
施用模式包括但不限于非经肠，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、粘膜(例如、经口、鼻内、经颊、经阴道、经直肠、眼内)、鞘内、局部和皮内途径。施用可以是全身性的或局部的。在某些实施例中，医药组合物适于经口施用。
术语“载剂”是指与活性剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。医药组合物中的载剂可包含：粘合剂，例如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮(polyvidone)或聚维酮(povidone))、黄蓍胶、明胶、淀粉、乳糖或单水合乳糖；崩解剂，例如海藻酸、玉米淀粉和其类似物；润滑剂或表面活性剂，例如硬脂酸镁或十二烷基硫酸钠；和助流剂，例如胶体二氧化硅。
对于经口施用，医药制剂可以是液体形式，例如溶液、糖浆或悬浮液，或者可以药品提供，用于在使用前用水或其它合适的媒剂重建。这些液体制剂可以通过常规方式用医药学上可接受的添加剂制备，所述添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒剂(例如杏仁油、油性酯或分级植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。医药组合物可以呈例如通过常规方式用医药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊形式，所述赋形剂例如粘合剂(例如，预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)制；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域熟知的方法涂布。
经口施用的制剂可以适当调配，以控制活性化合物的释放。
对于经颊施用，组合物可以呈以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
组合物可以配制用于通过注射，例如通过快速注射或连续输注进行非经肠施用。用于注射的配制物可以单位剂型存在，例如在具有添加的防腐剂的安瓿或多剂量容器中。所述组合物可以呈例如油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以呈粉末形式，其用于在使用前用合适的媒剂(例如无菌无热原质水)构建。
组合物还可以配制成经直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质，例如可可脂或其它甘油酯。
对于通过吸入施用，根据本发明使用的组合物可使用合适的推进剂方便地以加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾形式递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量量的阀来测定。可以配制用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒，其含有化合物和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
如本文所用的术语“外周血单核细胞(PBMC)”是指具有圆形细胞核的任何血细胞，例如淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。从血液中分离PBMC的方法对于本领域技术人员来说是显而易知的。非限制性实例是使用聚蔗糖(ficoll)从全血中提取这些细胞，聚蔗糖是一种分离血液层的亲水性多糖，其中单核细胞和淋巴细胞在血浆层下或通过白细胞去除法形成血沉棕黄层，用红细胞和白细胞贫乏的血浆返回到供体制备白细胞浓缩物。
为了清楚起见，并且决不限制本教导的范围，除非另外指示，否则表示数量、百分比或比例的所有数字以及本文所述的其它数值应当被解释为在所有情况下前面都有术语“约”。因此，本说明书中列举的数值参数是近似值，其可以根据所需结果而变化。举例来说，可以根据报告的有效数字的数量并且通过应用普通的舍入技术来解释每个数值参数。
如本文所用的术语“约”是指还包括高于或低于指示值的10％或更低的值。
实例
实例1.全基因组鉴别编码表达细胞表面蛋白并且经历杂合性丢失(LOH)的多态基因
为了鉴别可充当iCAR标靶的基因，采用以下要求：
1.所述基因编码跨膜蛋白-因此具有在细胞表面上表达的部分以允许iCAR结合。
2.所述基因至少有两个表达的等位基因(在至少一个种族群体中检查过)
3.发现所述基因的等位基因变异导致蛋白质的胞外区中相对于参考序列的氨基酸改变。
4.所述基因定位于染色体区，其经历癌症中的LOH。
5.所述基因在肿瘤类型的来源的组织中表达，其中发现相应区域经历LOH。
等位基因鉴别：
Exome Aggregation Consortium数据库(ExAC,at exac.broadinstitute.org)用作分析的输入。ExAC数据库是来自各种群体水平测序研究的外显子的汇集，共计60,706个外显子组(Lek等人,2016)。ExAC含有关于每个变异体的信息，包括参考等位基因的计数与变异等位基因的计数的数量(等位基因频率-染色体总数中变异等位基因的计数的数量)。等位基因频率信息延伸到数据库内的亚群，如表2中详述，阈值是至少一个群体中5％或更高的等位基因频率。
表2.ExAC数据库内的亚群。
群体血统 群体缩写 个体数量
非洲人 AFR 5,203
拉丁美洲人 AMR 5,789
东亚人 EAS 4,327
芬兰人 FIN 3,307
非芬兰欧洲人 NFE 33,370
南亚人 SAS 8,256
其他人 OTH 454
根据上面列出的要求，以下筛选应用于从ExAC数据库中检索的变异体：
1)变异体必须影响编码蛋白质的氨基酸组成，ii)变异体在出现于ExAC数据库中的至少一个群体中的次要等位基因频率必须等于或大于0.05(5％)。对于次要等位基因的等位基因分数大于0.5(50％)的情况，校正分析。如果观察到位点超过三个等位基因，那么使用最普遍的取代。
2)变异体(在这种情况下为如果变异被分类为以下任何变异体类别，那么单核苷酸多态性(SNP))注释为对蛋白质组成有影响：‘错义_变异体’、‘框内_删除’、‘起始_丢失’、‘终止_获得’、‘框内_插入’、‘终止_保留_变异体’、‘移码_变异体’、‘终止_丢失’、‘编码_序列_变异体’、‘蛋白质_改变_变异体’。
分析从9,362,319个SNP变异体开始，其中29,904个变异体通过上述两个筛选。这些变异体落入10,322个基因中，其次要等位基因频率等于或大于5％，并且其对蛋白质氨基酸序列具有影响。匹配这两个筛选的所有等位基因都包括在分析中。
表达基因的鉴别：
基因型-组织表达(GTEX)数据库V6P(dbGaP登录号phs000424.v6.p1)用于鉴别在各种组织类型中表达的基因(https://gtexportal.org/home,Consortium GT.人类基因组学(Human genomics),2015)。GTEX数据库由来自不同健康组织类型的8,555个人样品的RNA测序组成。
还包括对应于TCGA数据库中存在分析的每种肿瘤类型的来源的组织中每个基因的平均表达水平。为了获得这些数据，我们创建了肿瘤类型与相应正常组织的映射。举例来说，来自TCGA数据库的胰腺癌数据将用来自GTEX的胰腺组织注释。在一些情况下，由于缺乏肿瘤类型的清楚的来源的组织，因此映射是近似的。举例来说，胶质母细胞瘤表达数据由来自在GTEX中注释为大脑的所有组织映射。
在特定组织中过表达的基因可能是良好的aCAR标靶。相反，在所有组织中均匀表达的基因可能是更好的iCAR标靶。
如果基因满足以下准则，那么将基因定义为“普遍地表达”：(i)跨组织的平均表达大于10RPKM(每百万映射读数的每转录物的千基质的读数)。(ii)表达最少的组织的RPKM大于1。(iii)与平均RPKM相比，跨组织的中间RPKM的标准差的比率小于1。在先前步骤中检索到的10,322个基因中，只有1,092个基因被注释为普遍地表达。
细胞表面蛋白的注释：
对于是CAR-T介导的治疗的良好标靶的蛋白质，其一部分需要在细胞表面上表达。我们使用了几个数据库来帮助鉴别细胞表面蛋白。第一数据库是人蛋白图谱，其为一种来源于用于分析32个不同的组织的24,028种抗体的分析(Uhlen等人,2015)。第二数据库是细胞表面蛋白图谱，其为一种N-糖基化细胞表面蛋白的基于质谱法的数据库(Bausch-Fluck等人,2015)。第三数据库是使用高通量免疫荧光法和自动图像分析以鉴别蛋白质的亚细胞定位，包括细胞表面表达最近发表的分析(Thul等人,2017)。每个SNP都注释有蛋白质出现的数据库的数量。据说在所有三个数据库中由基因编码的蛋白质在细胞表面以“高置信度”表达，两个数据库为“中等置信度”，并且一个数据库为“低置信度”。如表3所示，10,322个基因中的3,359个具有如上所述的膜表达的任何迹象。
表3.基于膜表达的迹象的基因分布
#基因的数据库 分类 基因数量
0 不是膜 6963
1 低置信度 2904
2 中等置信度 408
3 高置信度 47
尽管根据以上数据库对SNP进行了注释，但是仅基于如下所述的UniProt注释来选择候选者。
等位基因对蛋白质功能的影响：
对于仅有效识别已丢失膜蛋白的一个等位基因的癌细胞的iCAR，蛋白质的结构应根据编码的等位基因而充分不同。SIFT(从耐受性中分选不耐受(Sorting IntolerantFrom Tolerant))算法试图预测蛋白质变异体是否会对蛋白质结构并且因此对功能有影响(Ng和Henikoff,2003)。得分可以在0(有害)到1(良性)的范围内。对于可获得得分的每个SNP，包括SIFT得分(sift5.2.2版)。
落在蛋白质的胞外部分的等位基因的分类：
对于识别等位基因的iCAR，等位基因必须落在蛋白质的胞外部分上。对于每个SNP，提取共同翻译中受影响的氨基酸的位置，并且与从UniProt数据库注释为胞外的域进行比较，所述数据库从www.uniprot.org/downloads下载。由于缺乏对所有蛋白质的域的表征，许多假阴性是可能的。1146个基因中的总共4577个SNP被注释为胞外。
经历LOH的肿瘤比例
良好的iCAR标靶将是在大部分肿瘤中经历杂合性丢失(LOH)的SNP。区段拷贝数文件从TCGA数据库的cbio端口https://www.cbioportal.org下载(Cerami等人,2012,Gao等人,2013)。如下针对HLA基因更详细地描述，对于每个基因经历LOH的TCGA数据库中的32个肿瘤中的肿瘤的比例进行测定。
实例2.HLA I类蛋白的杂合性丢失
由于其以下已知的特征，HLA I类基因被选为第一组潜在的iCAR标靶：由两个等位基因表达的细胞表面蛋白、广泛的组织分布、高水平的多态性以及肿瘤中记录的LOH作为肿瘤逃逸的机制因此，我们通过测定HLA I类蛋白在各种肿瘤类型中丢失的速率开始分析。我们分析了这些拷贝数概况，表明在表4中列出的HLA-A、B和C的基因组基因座存在杂合性丢失。
表4.HLA-I基因组基因座
可公开购自TCGA的成千上万的肿瘤样品中的SNP阵列数据可以充当拷贝数计算的来源，并且用于预测可在NIH TCGA数据端口(https://gdc.cancer.gov/)上获得的所有肿瘤类型的HLA LOH频率。
为了确定LOH调用是否对基因组位置的变化具有稳定性，我们测试了位于上游(HLA-G，图3A)和HLA-A下游(ZNRD1，图3C)的基因的LOH模式，并且得出结论：所有基因都表现出与HLA-A相同的LOH模式(图3B)
由于所有HLA I类基因(HLA-A、B、C)在染色体6短臂上的主要组织相容性基因座(MHC)中染色体位置彼此接近，正如预期，发现其均展现肿瘤类型中LOH的相同模式和频率(对于HLA-B和C分别参见图4A和4B)。
基于以上所述，并且如图4所示，我们得出结论，HLA I类区域LOH是许多肿瘤中的常见事件，然而LOH的百分比在各肿瘤类型之间变化。因此，HLA基因是iCAR标靶的良好候选者。
实例3.LOH的免疫细胞化学校验和等位基因特异性抗体的特异性。
选择在不同肿瘤中鉴别的几对保存和丢失的等位基因变异体，并且其多肽产物将用于产生变异体特异性mAb。通过双染色和流式细胞测量术实验或免疫组织化学分析候选mAb的辨别力，如下：
IHC方案
等位基因特异性抗HLA抗体：
抗体 制造商
抗人类HLA-A2 APC(BB7.2) eBiosciences
抗人类HLA-A2 PE-cy7(BB7.2) eBiosciences
抗人类HLA-A3 FITC(GAP A3) eBiosciences
抗人类HLA-A3 PE(GAP A3) eBiosciences
小鼠抗人类HLA-B7-PE(BB7.1) Millipore
HLA-A2抗体(BB7.2) Novus
HLA B7抗体(BB7.1) Novus
小鼠抗人类HLA-B27-FITC(HLA.ABC.m3) Millipore
冷冻组织样品-
冷冻组织通常固定在基于福尔马林的溶液中，并且包埋进OCT(最佳裂解温度化合物)中，使得样品冷冻切片。OCT中的组织在-80℃下冷冻保存。冷冻块在切片之前从-80℃去除，在低温恒温室中平衡，并且切成薄切片(通常5-15μm厚)。切片安装在组织学载玻片上。载玻片可在-20℃到-80℃下储存。在IHC染色之前，将载玻片在室温(RT)下解冻10-20min。
石蜡包埋的组织-
将组织包埋在甲醛固定溶液中。在加入石蜡之前，在RT下特定时间和持续时间通过逐渐浸入增加浓度的乙醇(70％、90％、100％)和二甲苯中来使组织脱水。然后，将组织包埋在石蜡中。
将石蜡包埋的组织在薄片切片机中裂解成5-15μm厚的切片，在56℃的水浴中浮置，并且安装在组织学载玻片上。幻灯片可以在RT下保存。
在IHC染色之前，石蜡包埋的切片需要再水合步骤-
再水合-通过浸入二甲苯(2×10min)中再水合切片，然后降低乙醇浓度-100％×2，每次10min
95％乙醇-5min
70％乙醇-5min
50％乙醇-5min
用dH2O冲洗
免疫荧光法检测：
1.将载玻片在洗涤缓冲液(PBSX1)中再水合10min。排空洗涤缓冲液
2.进行抗原检索-如果需要的话(热诱导抗原检索或酶检索)
3.对于胞内抗原，进行渗透-在RT下将载玻片在PBSX1中的0.1％triton X-100中培育10min。
4.阻断-在RT下将组织在阻断缓冲液中阻断30min。阻断缓冲液取决于检测方法，通常是PBSX1中的5％动物血清，或PBSX1中的1％BSA
5.初级抗体-根据抗体制造商的说明，在培育缓冲液(即PBS中的1％BSA、1％驴血清，也可使用其它培育缓冲液)中稀释初级抗体。在4℃下培育稀释的初级抗体中的组织过夜。初级抗体可以是如上详述的单克隆抗HLA-A、抗HLA-B或抗HLA-C等位基因特异性抗体。
如果使用缀合的初级抗体，那么避光，并且继续步骤8
作为阴性对照，仅用培育缓冲液而不用初级抗体培育组织。
此外，进行实验中使用的单克隆抗体的同种型匹配对照。
6.洗涤-在洗涤缓冲液中洗涤载玻片-3×5-15min。
7.二级抗体-根据抗体制造商的说明在培育缓冲液中稀释二级抗体。在RT下将组织在稀释的二级抗体中培育30-60min。避光
8.洗涤-在洗涤缓冲液中洗涤载玻片-3×5-15min。
9.DAPI染色-稀释DAPI培育缓冲液(约300nM-3μM)。向每个切片加入300μl到DAPI溶液。在RT下培育5-10min。
10.洗涤-用×1PBS洗涤一次载玻片
11.使用防褪色安装介质进行安装
12.使载玻片避光
13.使用荧光显微镜观察载玻片
显色检测：
1.将载玻片在洗涤缓冲液(PBSX1)中再水合10min。排空洗涤缓冲液
2.进行抗原检索-如果需要的话-见上文
3.对于HRP试剂，用甲醇中的3.0％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性至少15min
4.通过将这些切片浸入dH2O中5min来进行洗涤
5.对于胞内抗原，进行渗透-在RT下将载玻片在PBSX1中的0.1％triton X-100中培育10min。
6.阻断-在RT下将组织在阻断缓冲液中阻断30min。阻断缓冲液取决于检测方法，通常是PBSX1中的5％动物血清，或PBSX1中的1％BSA
7.初级抗体-根据抗体制造商的说明，在培育缓冲液(即PBS中的1％BSA、1％驴血清，也可使用其它培育缓冲液)中稀释初级抗体。在4℃下培育稀释的初级抗体中的组织过夜。
8.洗涤-在洗涤缓冲液中洗涤载玻片-3×5-15min。
9.二级抗体-在RT下将组织在HRP缀合的二级抗体中培育30-60min。
10.洗涤-在洗涤缓冲液中洗涤载玻片3×5-15min。
11.根据制造商指南添加ABC-HRP试剂。在RT下培育60min。
12.根据制造商指南准备DAB溶液(或其它色原体)，并且应用于组织切片。显色反应使表位位点变棕(通常为几秒-10分钟)。当信号强度适合成像时，继续下一步骤。
13.洗涤-在洗涤缓冲液中洗涤载玻片-3×5-15min。
14.在dH2O中洗涤载玻片-2×5-15min。
15.细胞核染色-加入苏木精(Hematoxylin)溶液。在RT下培育5min。
16.脱水组织切片-
95％乙醇-2×2min。
100％乙醇-2×2min。
二甲苯-2×2min。
17.使用防褪色安装介质进行安装
18.使用明场照明观察载玻片
实例4.CAR-T构建
所述研究的目的是形成一种合成受体，其将抑制CAR-T疗法的靶上、‘肿瘤外’作用。在这种程度上，将建立由活化和抑制性CAR构成的CAR构建体的文库。
第一组构建体将包括针对HLA-I型序列的抑制性CAR(例如，HLA-A2)和针对肿瘤抗原的活化CAR(例如CD19)。下一组构建体将包括针对通过我们的生物信息学分析鉴别的靶抗原的CAR序列。将根据所述准则(例如标靶表达模式、标靶表达水平、抗原性等)对标靶候选物进行优先排序。
对于iCAR构建体，我们将跨膜和胞内域融合到HLA-A2 scFV下游的PD-1(氨基酸145-288)或CTLA4(氨基酸161-223)的第一个注释的胞外域。对于iCAR检测和分选，报告基因(即GFP、DsRED、RFP，mCherry等)将通过IRES序列或2A序列整合到iCAR序列的下游。
从表达上文实例2中列出的任何一种抗体的融合瘤克隆并且构建HLA-A2 scFv。
对于aCAR构建体，CD19 scFV将融合到第2代(CD8或CD28铰链、CD28跨膜、CD28或41BB共同刺激1和CD3ζ)或第3代CAR(CD8或CD28铰链、CD28跨膜、CD28和41BB和CD3ζ)，以用于aCAR检测和分选报告基因(即GFP、DsRed、RFP、mCherry等)将通过IRES序列或2A序列整合到aCAR序列的下游。
将aCAR和iCAR序列克隆到逆转录病毒或慢病毒转移载体中，并且然后使用适当的包装细胞(例如HEK-293T)用于病毒颗粒的产生。
来源于健康供体的Jurkat、Jurkat-NFAT-荧光素酶和活化T细胞将以不同的感染复数(MOI)用aCAR、iCAR或两者转导。基于报告基因表达的FACS选择将用于分选和选择表达不同水平的aCAR、iCAR或两者的细胞群。
靶细胞的制备-
将建立体外重组系统以测试iCAR构建体抑制aCAR对脱靶细胞活性的功能。为此目的，将产生表达aCAR表位、iCAR表位或两者的靶细胞。表达aCAR表位的重组细胞将代表靶上、‘肿瘤上’细胞，而表达aCAR和iCAR表位的细胞将代表靶上、‘肿瘤外’健康细胞。
由于我们的第一个iCAR/aCAR组将分别是HLA-A2、CD19，通过用编码这些基因的表达载体转染细胞系(即海拉(Hela)、海拉-荧光素酶或Raji)，将产生表达HLA-A2、CD19或两者的重组细胞。为了检测重组CD19和HLA A-2表达，将两个基因与蛋白质标签(即HA或Flag或Myc等)融合。
分析-
将在体外和体内测试iCAR的抑制作用。
在体外分析中，我们将集中于测量细胞因子分泌和细胞毒性作用，而在体内，我们将评估对靶上、肿瘤外异种移植物的iCAR抑制和保护。我们将由通过使用报告基因将T细胞分选为iCAR/aCAR双阳性来污染结果而限制缺乏iCAR的T细胞。作为iCAR阻断活性的阴性对照，我们可以使用缺乏scFv域的模拟转染的CAR。
体外分析-
荧光素酶细胞毒性分析-将重组靶细胞(T)工程化以表达萤火虫荧光素酶。将根据Bright-Glo荧光素酶分析(Promega)进行体外荧光素酶分析。将转导的效应(E)T细胞(用iCAR和aCAR或aCAR或模拟CAR转导)与表达HLA-A2、CD19或两者的重组细胞以不同的效应物与标靶比率培育24-48小时。细胞杀伤将用Bright-Glo荧光素酶系统定量。
我们可以通过根据iCAR/aCAR表达水平分选转导的T细胞群体或通过根据其CD19或HLA-A2表达水平选择重组靶细胞的亚群来优化‘肿瘤外’的细胞毒性。
为了测试iCAR转导的T细胞是否可以在体外区分‘肿瘤上’与‘肿瘤外’细胞，我们将测试与以1:1的比率的‘肿瘤上’及‘肿瘤外’细胞的混合物一起培育的转导T细胞的杀伤作用。通过荧光素酶表达将肿瘤上重组细胞与‘肿瘤外’的重组细胞区区分(仅一个细胞群体将工程化为一次表达荧光素酶基因)。将使用Bright-Glo荧光素酶测定法(Promega)在共培育24-48小时后定量杀伤。
胱天蛋白酶3-通过抗体到活化裂解的胱天蛋白酶3检测CTL诱导的细胞凋亡。
CTL杀灭靶细胞的途径之一是通过Fas配体诱导细胞凋亡。CASP3蛋白是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(胱天蛋白酶)家族的成员。胱天蛋白酶的顺序活化在细胞凋亡的执行阶段中起重要作用。将前胱天蛋白酶3裂解成胱天蛋白酶3导致构象变化和催化活性的表达。胱天蛋白酶3的裂解的活化形式可以通过单克隆抗体特异性识别。
将转导的T细胞与预先用CFSE标记的‘肿瘤上’或‘肿瘤外’重组细胞一起培育2-4小时。靶细胞凋亡将通过流式细胞测量术定量。将细胞渗透并且通过内部染色试剂盒(Miltenyi)固定，并且用活化的胱天蛋白酶3的抗体(BD bioscience)染色。
时间流逝微CTL-
靶细胞将用报告基因(例如-cCherry)标记。将转导的T细胞与‘肿瘤上’或‘肿瘤外’细胞一起培育长达5天。时间流逝显微镜将用于观察杀伤。或者，使用活细胞数染色和CountBright珠(Invitrogen)进行流式细胞测量术分析，以测定终点时间的靶细胞数。
为了检查aCAR/iCAR转导的T细胞是否能够在体外辨别标靶，我们将用不同的报告基因蛋白(例如GFP和mCherry)标记每个重组靶细胞(‘肿瘤上’或‘肿瘤外’)。将转导的T细胞(效应细胞)与重组细胞(靶细胞)以1:1的E/T比率共培育。然后我们将通过显微镜成像跟踪细胞去向。
细胞因子释放-
转导的T细胞将与重组靶细胞一起培育，并且细胞因子产生(IL2和/或INFγ)将通过根据BioLegend的ELISA MAXTMDeluxe Set试剂盒测量细胞培养上清液中的细胞因子分泌，或通过流式细胞测量术分析T细胞产生细胞因子的百分比来定量。对于流式细胞测量术分析，我们将使用Golgi stop来阻止细胞因子的分泌。将转导的T细胞与靶细胞培育6和18-24小时后，将T细胞用内部染色试剂盒(Miltenyi)进行电烫和固定，并且用T细胞标记物(CD3和CD8)和细胞因子IL2和INFγ的抗体染色。
CD107a的染色
可以通过溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1)CD107a的表面表达来鉴别T细胞的脱粒。已显示LAMP-1的表面表达与CD8T细胞的细胞毒性相关。这一分子位于溶酶体的腔侧。活化后，CD107a被转移到活化的淋巴细胞的细胞膜表面。CD107a在细胞表面瞬时表达，并且通过内吞途径快速重新内化。因此，通过细胞刺激期间的抗体染色和通过添加莫能菌素(monensin)(以防止内吞的CD107a抗体复合物的酸化和随后的降解)使CD107a检测最大化。
我们将在莫能菌素存在下将转导的T细胞与靶细胞一起培育6-24小时，并且将使用针对T细胞表面标记物(CD3、CD8)的缀合抗体和CD107a的缀合抗体通过流式细胞测量术跟踪CD8 T细胞上的CD107a表达。
体内
NOD/SCID/γc-小鼠将用肿瘤细胞静脉内接种。肿瘤细胞的一种可能性可以是CD19阳性NALM 6(ATCC，人类B-ALL细胞系)细胞，其将被工程化以表达萤火虫荧光素酶。另外，为了建立‘靶上’、‘肿瘤外’细胞，NALM 6也将被工程化以表达iCAR表位(例如HLA-A2)，从而代表健康细胞。将小鼠分成研究组，一组注射NALM 6细胞，同时另一组注射表达iCAR表位的NALM-6。几天后，将小鼠静脉输注用aCAR、aCAR/iCAR和未转导的T细胞或无T细胞的对照组转导的T细胞。处死小鼠并且根据总通量定量肿瘤负荷。
为了测试表达iCAR构建体的T细胞是否可以在同一生物体内区分体内靶细胞和靶外细胞，我们将给小鼠注射1:1的‘肿瘤上’/‘肿瘤外’NALM-6细胞的混合物，然后注射仅表达aCAR或者表达aCAR和iCAR两者的转导的T细胞。在处死小鼠后，将针对两种标记物CD19和iCAR表位，通过流式细胞测量术分析脾脏和骨髓中‘肿瘤上’和‘肿瘤外’细胞的存在。
附录.
表1.
I.在ClinicalTrials.gov注册的试验中评估的CAR靶抗原
II.其它CAR靶抗原
缩写：ADP，二磷酸腺苷；ALL，急性淋巴细胞白血病；AML，急性骨髓性白血病；APRIL，增殖诱导的配体；BAFF，TNF家族的B细胞活化因子；BCMA，B细胞成熟抗原；BCR，B细胞受体；BM，骨髓；CAIX，碳酸酐酶IX；CAR，嵌合抗原受体；CEA，癌胚抗原；CLL，慢性淋巴细胞白血病；CNS，中枢神经系统；CSPG4，硫酸软骨素蛋白聚糖4；DC，树突状细胞；ECM，胞外基质；EGFR，表皮生长因子受体；EGFRvIII，EGFR的变异体III；EphA2，产生促红细胞生成素的肝细胞癌A2；FAP，成纤维细胞活化蛋白；FR-α，叶酸受体-α；GBM，多形性胶质母细胞瘤；GPI，糖磷脂酰肌醇；H&N，头颈部；HL，霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；Ig，免疫球蛋白；L1-CAM，L1细胞粘附分子；MM，多发性骨髓瘤；NB，神经母细胞瘤；NF-κB，核因子-κB；NHL，非霍奇金氏淋巴瘤；NK，自然杀伤细胞；NKG2D-L，NKG2D配体；PBMC，外周血单核细胞；PC，浆细胞；PLL，幼淋巴细胞白血病；PSCA，前列腺干细胞抗原；PSMA，前列腺特异性膜抗原；RCC，肾细胞癌；ROR1，受体酪氨酸激酶样孤儿受体1；TCL，T细胞白血病/淋巴瘤；Th2，T辅助2；TNBC，三阴性乳腺癌；TNFR，肿瘤坏死因子受体；VEGFR-2，血管内皮生长因子-2。
参考文献
Abecasis,G.R.,Altshuler,D.,Auton,A.,Brooks,L.D.,Durbin,R.M.,Gibbs,R.A.,Hurles,M.E.,和McVean,G.A.(2010).《来自群体规模测序的人类基因组变异的映射(A map of human genome variation from population-scale sequencing)》.《自然(Nature)》467,1061-1073。
Abeyweera,T.P.,Merino,E.,和Huse,M.(2011).《抑制性信号传递在自然杀伤细胞中阻断活化受体集群技术并且诱导细胞骨架撤回(Inhibitory signaling blocksactivating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in naturalkiller cells.)》《细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)》192,675-690。
Auton,A.,Abecasis,G.R.,Altshuler,D.M.,Durbin,R.M.,Bentley,D.R.,Chakravarti,A.,Clark,A.G.,Donnelly,P.,Eichler,E.E.,Flicek,P.,等人(2015).《人类基因变异的全球参考(A global reference for human genetic variation.)》《自然》526,68-74。
Barbas,Carlos F.,Dennis R.Burton,Jamie K.Scott,G.J.S.2004.《噬菌体呈现：实验室手册(Phage display:a laboratory manual)》,.冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)。
Bausch-Fluck,D.,Hofmann,A.,Bock,T.,Frei,A.P.,Cerciello,F.,Jacobs,A.,Moest,H.,Omasits,U.,Gundry,R.L.,Yoon,C.,等人(2015).《质谱衍生的细胞表面蛋白图谱(A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.)》《科学公共图书馆综合卷(PLoS One)》10。
Bayle,J.H.,Grimley,J.S.,Stankunas,K.,Gestwicki,J.E.,Wandless,T.J.,和Crabtree,G.R.(2006).《具有不同的结合特异性的雷帕霉素类似物准许正交控制蛋白质活性(Rapamycin analogs with differential binding specificity permit orthogonalcontrol of protein activity.)》《化学生物学(Chem.Biol.)》13,99-107。
Bergbold,N.,和Lemberg,M.K.(2013).《哺乳动物生物学和疾病中扁菱形蛋白家族蛋白质的新兴作用(Emerging role of rhomboid family proteins in mammalianbiology and disease.)》《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》1828,2840-2848。
Blankenstein,T.,Leisegang,M.,Uckert,W.,和Schreiber,H.(2015).《通过T细胞受体基因疗法靶向癌症特异性突变(Targeting cancer-specific mutations by Tcell receptor gene therapy.)》《免疫学当前观点(Curr.Opin.Immunol.)》33,112-119。
Boczkowski,D.,S.K.Nair,J.H.Nam,H.K.Lyerly,和E.Gilboa.2000.《使用用从肿瘤细胞中扩增的信使RNA转染的树突状细胞诱导肿瘤免疫和细胞毒性T淋巴细胞反应(Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses usingdendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells.)》《癌症研究(Cancer Res)》60:1028-34.Barrett,M.T.,Sanchez,C.A.,Prevo,Burrell,R.A.,McGranahan,N.,Bartek,J.,和Swanton,C.(2013).《癌症演变的遗传异质性的原因和后果(The causes and consequences of genetic heterogeneity in cancerevolution.)》《自然》501,338-345。
Van Buuren,M.M.,Calis,J.J.A.,和Schumacher,T.N.M.(2014).《基于癌症外显子组的CD8 T细胞新抗原鉴别的高敏感性(High sensitivity of cancer exome-basedCD8 T cell neo-antigen identification.)》《肿瘤免疫学(Oncoimmunology)》3。
Caescu,C.I.,Jeschke,G.R.,和Turk,B.E.(2009).《通过金属蛋白酶TACE和ADAM10的底物识别的活性位点决定子(Active-site determinants of substraterecognition by the metalloproteinases TACE and ADAM10.)》《生物化学杂志(Biochem.J.)》424,79-88。
Carney,W.P.,Petit,D.,Hamer,P.,Der,C.J.,Finkel,T.,Cooper,G.M.,Lefebvre,M.,Mobtaker,H.,Delellis,R.,和Tischler,A.S.(1986).《对活化RAS蛋白质特异性的单克隆抗体(Monoclonal antibody specific for an activated RAS protein.)》《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》83,7485-7489。
Cerami E,等人.《cbio癌症基因组学端口：查看多维癌症基因组学数据的公开平台(The cbio cancer genomics portal:An open platform for exploringmultidimensional cancer genomics data.)》《癌症发现(Cancer discovery.)》2012；2:401-404。
Chao,G.,W.L.Lau,B.J.Hackel,S.L.Sazinsky,S.M.Lippow,和K.D.Wittrup.2006.《使用酵母表面呈现分离和工程化人抗体(Isolating andengineering human antibodies using yeast surface display.)》《自然实验手册(Nat.Protoc.)》1。
Chess,A.(2012).《普遍无规单等位基因表达的机制和后果(Mechanisms andconsequences of widespread random monoallelic expression.)》《自然评论-遗传学(Nat.Rev.Genet.)》13,421-428。
Chicaybam,L.,和Bonamino,M.H.(2014).《摘要2797：建构和验证活化和抑制性嵌合抗原受体(CAR)系统(Abstract 2797:Construction and validation of anactivating and inhibitory chimeric antigen receptor (CAR)system.)》《癌症研究》74,2797-2797。
Chicaybam,L.,和Bonamino,M.H.(2015).《摘要3156：建构和验证活化和抑制性嵌合抗原受体(CAR)系统(Abstract 3156:Construction and validation of anactivating and inhibitory chimeric antigen receptor (CAR)system.)》《癌症研究》75,3156-3156。
协会GT.人类基因组学.《基因型组织表达(gtex)试点分析：人体内多组织基因调节(The genotype-tissue expression(gtex)pilot analysis:Multitissue generegulation in humans.)》《科学(Science.)》2015；348:648-660。
Da Cunha,J.P.C.,Galante,P.A.F.,De Souza,J.E.,De Souza,R.F.,Carvalho,P.M.,Ohara,D.T.,Moura,R.P.,Oba-Shinja,S.M.,Marie,S.K.N.,Silva Jr.,W.A.,等人(2009).《人类细胞surfaceome的生物资讯建构(Bioinformatics construction of thehuman cell surfaceome.)》《美国国家科学院院刊》106,16752-16757。
Devilee,P.,Cleton-Jansen,A.-M.,和Cornelisse,C.J.(2001).自从Knudson.《遗传学趋势(Trends Genet.)》17,569-573。
Dotti,G.,Gottschalk,S.,Savoldo,B.,和Brenner,M.K.(2014).《使用表达嵌合抗原受体的T细胞的疗法的设计和发展(Design and development of therapies usingchimeric antigen receptor-expressing T cells.)》《免疫学评论(Immunol.Rev.)》257,107-126。
Ebsen,H.,A.,Kabelitz,D.,和Janssen,O.(2013).《人类T淋巴细胞和肿瘤细胞上的ADAM10和ADAM17的不同的表面表达(Differential surface expressionof ADAM10and ADAM17on human T lymphocytes and tumor cells.)》《科学公共图书馆综合卷》8,e76853。
Eriksson,M.,Leitz,G.,E.,Axner,O.,Ryan,J.C.,Nakamura,M.C.,和Sentman,C.L.(1999).《抑制性受体改变自然杀伤细胞与靶细胞的相互作用但同时允许杀灭敏感标靶(Inhibitory receptors alter natural killer cell interactions withtarget cells yet allow simultaneous killing of susceptible targets.)》《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》190,1005-1012。
Fedorov,V.D.,Themeli,M.,和Sadelain,M.(2013a).《基于PD-1和CTLA-4的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)分流脱靶免疫疗法反应(PD-1-and CTLA-4-based inhibitorychimeric antigen receptors(iCARs)divert off-target immunotherapy responses.)》《科学转化医学杂志(Sci.Transl.Med.)》5,215ra172。
Fedorov,V.D.,Themeli,M.,和Sadelain,M.(2013b).《基于PD-1和CTLA-4的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)分流脱靶免疫疗法反应》。在《科学转化医学杂志》中,(隶属：细胞工程化中心(Center for Cell Engineering),纪念斯隆-凯特琳癌症中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)(MSKCC),美国纽约NY 10065(New York,NY 10065,UnitedStates)；隶属：Tri-Institutional MSTP Program(MSKCC,Rockefeller University,Weill-Cornell Medical College),纽约,NY 10065,Un),。
Feenstra,M.,Veltkamp,M.,van Kuik,J.,Wiertsema,S.,Slootweg,P.,van denTweel,J.,de Weger,R.,和Tilanus,M.(1999).《在头颈部鳞状细胞癌中6p和15q处的HLA I类表达和染色体删除(HLA class I expression and chromosomal deletions at 6p and15q in head and neck squamous cell carcinomas.)》《组织抗原(Tissue Antigens)》54,235-245。
Gao J.等人,《使用cBio端口整合分析复杂癌症基因组学和临床概况(Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles usingthe cBio Portal.)》《科学信号(Sci Signal.)》2013 2；6(269)。
Gill,S.,和June,C.H.(2015).《进行病毒：用于血液恶性肿瘤的嵌合抗原受体T细胞疗法(Going viral:chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematologicalmalignancies.)》《免疫学评论》263,68-89。
Gordon,W.R.,Zimmerman,B.,He,L.,Miles,L.J.,Huang,J.,Tiyanont,K.,McArthur,D.G.,Aster,J.C.,Perrimon,N.,Loparo,J.J.,等人(2015).《机械别构：蛋白水解活化Notch中的力需要的迹象(Mechanical Allostery:Evidence for a ForceRequirement in the Proteolytic Activation of Notch.)》《发育细胞(Dev.Cell)》33,729-736。
Graef,I.A.,Holsinger,L.J.,Diver,S.,Schreiber,S.L.,和Crabtree,G.R.(1997).《通过非受体酪氨酸激酶ZAP70信号传递之下的接近和取向(Proximity andorientation underlie signaling by the non-receptor tyrosine kinase ZAP70.)》《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》16,5618-5628。
Gross,G.,和Eshhar,Z.(2016a).《T细胞嵌合抗原受体在癌症治疗中的治疗潜能：抵消安全CAR T细胞疗法的肿瘤外毒性(Therapeutic Potential of T-Cell ChimericAntigen Receptors in Cancer Treatment:Counteracting Off-Tumor Toxicities forSafe CAR T-Cell Therapy.)》《药理学和毒理学年鉴(Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.)》2016.56:59-83。
Gross,G.,和Eshhar,Z.(2016b).《T细胞嵌合抗原受体(CAR)在癌症治疗中的治疗性潜能：抵消安全CAR T细胞疗法的肿瘤外毒性(Therapeutic Potential of T CellChimeric Antigen Receptors(CARs)in Cancer Treatment:Counteracting Off-TumorToxicities for Safe CAR T Cell Therapy.)》《药理学和毒理学年鉴》56,59-83。
Gross,G.,Waks,T.,和Eshhar,Z.(1989).《作为具有抗体类型特异性的功能受体的免疫球蛋白T细胞受体嵌合分子(Expression of immunoglobulin-T-cell receptorchimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity.)》《美国国家科学院院刊》86,10024-10028。
Haapasalo,A.,和Kovacs,D.M.(2011).《早老素/γ-分泌酶的许多底物(The manysubstrates of presenilin/γ-secretase.)》《阿尔茨海默病杂志(J.Alzheimers.Dis.)》25,3-28。
Hanes,J.,和A.Plückthun.1997.《通过使用核糖体显示功能蛋白质的体外选择和演变(In vitro selection and evolution of functional proteins by usingribosome display.)》《美国国家科学院院刊》94。
Heemskerk,B.,Kvistborg,P.,和Schumacher,T.N.M.(2013).《癌症反基因组(Thecancer antigenome.)》《欧洲分子生物学杂志》32,194-203。
Hemming,M.L.,Elias,J.E.,Gygi,S.P.,和Selkoe,D.J.(2009).《使用定量蛋白质组研究鉴别β-分泌酶(BACE1)底物(Identification of beta-secretase(BACE1)substrates using quantitative proteomics.)》《科学公共图书馆综合卷》4,e8477。
Huse,M.,Catherine Milanoski,S.,和Abeyweera,T.P.(2013).《通过拆卸突触建造耐受性：在自然杀伤细胞中抑制性受体信号传递(Building tolerance by dismantlingsynapses:inhibitory receptor signaling in natural killer cells.)》《免疫学评论》251,143-153。
Jiménez,P.,Cantón,J.,Collado,A.,Cabrera,T.,Serrano,A.,Real,L.M.,García,A.,Ruiz-Cabello,F.,和Garrido,F.(1999).《染色体丢失为有助于人类肿瘤中HLA单倍型丢失的最常见机制(Chromosome loss is the most frequent mechanismcontributing to HLA haplotype loss in human tumors.)》《国际癌症杂志(Int.J.Cancer)》83,91-97。
Klebanoff,C.A.,Rosenberg,S.A.,和Restifo,N.P.(2016).《对实体癌的基因工程化T细胞免疫疗法的展望(Prospects for gene-engineered T cell immunotherapyfor solid cancers.)》《自然医学(Nat.Med.)》22,26-36。
Kloss,C.C.,Condomines,M.,Cartellieri,M.,Bachmann,M.,和Sadelain,M.(2013).《具有平衡的信号传递的组合抗原识别促进工程化T细胞的选择性肿瘤根除(Combinatorial antigen recognition with balanced signaling promotes selectivetumor eradication by engineered T cells.)》《自然·生物技术(Nat.Biotechnol.)》31,71-75。
Knudson Jr.,A.G.(1971).《突变和癌症：成视网膜细胞瘤的统计研究(Mutationand cancer:statistical study of retinoblastoma.)》《美国国家科学院院刊》68,820-823。
Lanitis,E.,Poussin,M.,Klattenhoff,A.W.,Song,D.,Sandaltzopoulos,R.,June,C.H.,和Powell Jr,D.J.(2013).《具有解离信号传递域的嵌合抗原受体T细胞呈现具有降低毒性潜能的集中抗肿瘤活性(Chimeric antigen receptor T cells withdissociated signaling domains exhibit focused anti-tumor activity withreduced potential for toxicity.)》《癌症免疫学(Cancer Immunol.Res.)》1,10.1158/2326-6066.CIR-13-0008。
Lawrence,M.S.,Stojanov,P.,Polak,P.,Kryukov,G.V,Cibulskis,K.,Sivachenko,A.,Carter,S.L.,Stewart,C.,Mermel,C.H.,Roberts,S.A.,等人(2013).《癌症中的突变异质性和搜索新的癌症相关基因(Mutational heterogeneity in cancer andthe search for new cancer-associated genes.)》《自然》499,214-218。
Lee,A.,Rana,B.K.,Schiffer,H.H.,Schork,N.J.,Brann,M.R.,Insel,P.A.,和Weiner,D.M.(2003).《G蛋白偶联受体基因家族内的非同义多形现象的分布分析(Distribution analysis of nonsynonymous polymorphisms within the G-protein-coupled receptor gene family.)》《基因组学(Genomics)》81,245-248。
Lek M等人,《60,706个人类中编码蛋白质的基因变异的外显子组聚集C.分析(Exome Aggregation C.Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706humans.)》《自然》2016；536:285-291。
Lengauer,C.,Kinzler,K.W.,和Vogelstein,B.(1998).《人类癌症中的遗传不稳定性(Genetic instabilities in human cancers.)》《自然》396,643-649。
Li,H.,Yang,B.,Xing,K.,Yuan,N.,Wang,B.,Chen,Z.,He,W.,和Zhou,J.(2014).《通过使用外显子组测序的乳腺癌转移与杂合性丢失之间的关系的初步研究(Apreliminary study of the relationship between breast cancer metastasis andloss of heterozygosity by using exome sequencing.)》《科学报告(Sci.Rep.)》4。
Liberles,S.D.,Diver,S.T.,Austin,D.J.,和Schreiber,S.L.(1997).《使用通过哺乳动物三混杂筛检鉴别的无毒配体的诱导型基因表达和蛋白质移位(Inducible geneexpression and protein translocation using nontoxic ligands identified by amammalian three-hybrid screen.)》《美国国家科学院院刊》94,7825-7830。
Lindblad-Toh,K.,Tanenbaum,D.M.,Daly,M.J.,Winchester,E.,Lui,W.-O.,Villapakkam,A.,Stanton,S.E.,Larsson,C.,Hudson,T.J.,Johnson,B.E.,等人(2000).《使用单核苷酸多形现象阵列的小细胞肺癌的杂合性丢失分析(Loss-of-heterozygosityanalysis of small-cell lung carcinomas using single-nucleotide polymorphismarrays.)》《自然·生物技术》18,1001-1005。
Lo,K.C.,Bailey,D.,Burkhardt,T.,Gardina,P.,Turpaz,Y.,和Cowell,J.K.(2008).《使用100K SNP映射阵列全面分析胶质母细胞瘤中的杂合性丢失事件并且与由BAC阵列比较基因组杂交定义的拷贝数异常进行比较(Comprehensive analysis of loss ofheterozygosity events in glioblastoma using the 100K SNP mapping arrays andcomparison with copy number abnormalities defined by BAC array comparativegenomic hybridization.)》《基因染色体(Genes Chromosom.)》《癌症》47,221-237。
Long,E.O.,Sik Kim,H.,Liu,D.,Peterson,M.E.,和Rajagopalan,S.(2013).《控制自然杀伤细胞反应：整合活化和抑制的信号(Controlling natural killer cellresponses:Integration of signals for activation and inhibition.)》《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》31,227-258。
Maleno,I.,López-Nevot,M.A.,Cabrera,T.,Salinero,J.,和Garrido,F.(2002).《多种机制产生喉癌中HLA I类改变的表型：HLA单倍型丢失的高频率与染色体区6p21中的杂合性丢失相关(Multiple mechanisms generate HLA class I altered phenotypes inlaryngeal carcinomas:high frequency of HLA haplotype loss associated withloss of heterozygosity in chromosome region 6p21.)》《癌症免疫与免疫疗法(CancerImmunol.Immunother.)》51,389-396。
Maleno,I.,Cabrera,C.M.,Cabrera,T.,Paco,L.,López-Nevot,M.A.,Collado,A.,Ferrón,A.,和Garrido,F.(2004).《结肠直肠癌中的HLA I类改变的表型的分布：HLA单倍型丢失的高频率与染色体区6p21中的杂合性丢失相关(Distribution of HLA class Ialtered phenotypes in colorectal carcinomas:high frequency of HLA haplotypeloss associated with loss of heterozygosity in chromosome region 6p21.)》《免疫遗传学(Immunogenetics)》56,244-253。
Maleno,I.,Romero,J.M.,Cabrera,T.,Paco,L.,Aptsiauri,N.,Cozar,J.M.,Tallada,M.,López-Nevot,M.A.,和Garrido,F.(2006).《6p21.3区域中的LOH和膀胱癌中的HLA I类改变的表型(LOH at 6p21.3 region and HLA class I altered phenotypes inbladder carcinomas.)》《免疫遗传学》58,503-510。
Maleno,I.,Aptsiauri,N.,Cabrera,T.,Gallego,A.,Paschen,A.,López-Nevot,M.A.,和Garrido,F.(2011).《原发性人类肿瘤中的染色体15的β2-微球蛋白区域中常见的杂合性丢失(Frequent loss of heterozygosity in theβ2-microglobulin region ofchromosome 15 in primary human tumors.》《免疫遗传学》63,65-71。
McGranahan,N.,Burrell,R.A.,Endesfelder,D.,Novelli,M.R.,和Swanton,C.(2012).《癌症染色体不稳定性：治疗性和诊断性难题(Cancer chromosomal instability:Therapeutic and diagnostic challenges.)》《欧洲分子生物学学会报导(EMBO Rep.)》13,528-538。
Morsut,L.,Roybal,K.T.,Xiong,X.,Gordley,R.M.,Coyle,S.M.,Thomson,M.,和Lim,W.A.(2016).《使用合成Notch受体的工程化定制的细胞传感和反应特性(EngineeringCustomized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic NotchReceptors.)》《细胞》164,780-791。
Ng PC,Henikoff S.Sift:《预测影响蛋白质功能的氨基酸变化(Predictingamino acid changes that affect protein function.)》《核酸研究(Nucleic acidsresearch.)》2003；31:3812-3814。
Nirschl,C.J.,和Drake,C.G.(2013).《分子途径：共表达免疫检查点分子：癌症免疫疗法的信号传递途径和影响(Molecular pathways:Coexpression of immunecheckpoint molecules:Signaling pathways and implications for cancerimmunotherapy.)》《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》19,4917-4924。
O'Keefe,C.,McDevitt,M.A.,和Maciejewski,J.P.(2010).《拷贝中性的杂合性丢失：骨髓恶性肿瘤中的新颖染色体病灶(Copy neutral loss of heterozygosity:A novelchromosomal lesion in myeloid malignancies.)》《血液》115,2731-2739。
Ohgaki,H.,Dessen,P.,Jourde,B.,Horstmann,S.,Nishikawa,T.,Di Patre,P.-L.,Burkhard,C.,Schüler,D.,Probst-Hensch,N.M.,Maiorka,P.C.,等人(2004).《胶质母细胞瘤的遗传途径：基于群体的研究(Genetic pathways to glioblastoma:apopulation-based study.)》《癌症研究》64,6892-6899。
Overwijk,W.W.,Wang,E.,Marincola,F.M.,Rammensee,H.G.,和Restifo,N.P.(2013).《挖掘突变组：基于肿瘤的突变分析开发高度个性化免疫疗法(Mining themutanome:developing highly personalized Immunotherapies based on mutationalanalysis of tumors.)》《免疫疗法杂志(J.Immunother.)》《癌症》1,11。
Rana,B.K.,Shiina,T.,和Insel,P.A.(2001).《G蛋白偶联受体的基因变异和多形现象：功能和治疗影响(Genetic variations and polymorphisms of G protein-coupledreceptors:functional and therapeutic implications.)》《药理学和毒理学年鉴》41,593-624。
Rawson,R.B.(2013).《位点-2蛋白酶(The site-2protease.Biochim.)》《生物化学与生物物理学报》1828,2801-2807。
Rosenberg,S.A.(2014).《发现合适的标靶为癌症基因疗法的主要障碍(Findingsuitable targets is the major obstacle to cancer gene therapy.)》《癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)》21,45-47。
Rosenberg,S.A.,和Restifo,N.P.(2015).《过继性细胞转移作为人类癌症的个性化免疫疗法(Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for humancancer.)》《科学》348,62-68。
Roybal,K.T.,Rupp,L.J.,Morsut,L.,Walker,W.J.,McNally,K.A.,Park,J.S.,和Lim,W.A.(2016a).《通过具有组合抗原感测电路的T细胞的精确肿瘤识别(PrecisionTumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen-Sensing Circuits.)》《细胞》。
Roybal,K.T.,Rupp,L.J.,Morsut,L.,Walker,W.J.,McNally,K.A.,Park,J.S.,和Lim,W.A.(2016b).《通过具有组合抗原感测电路的T细胞的精确肿瘤识别》《细胞》164,770-779。
Sathirapongsasuti,J.F.,Lee,H.,Horst,B.A.J.,Brunner,G.,Cochran,A.J.,Binder,S.,Quackenbush,J.,和Nelson,S.F.(2011).《基于外显子组测序的拷贝数变异和杂合性丢失检测：ExomeCNV(Exome sequencing-based copy-number variation and lossof heterozygosity detection:ExomeCNV.)》《生物资讯(Bioinformatics)》27,2648-2654。
Savage,P.A.(2014).《揭示肿瘤抗原性(Tumor antigenicity revealed.)》《免疫学趋势(Trends Immunol.)》35,47-48。
Savova,V.,Chun,S.,Sohail,M.,McCole,R.B.,Witwicki,R.,Gai,L.,Lenz,T.L.,Wu,C.-T.,Sunyaev,S.R.,和Gimelbrant,A.A.(2016).《具有单等位基因表达的基因不成比例地有助于人体内的遗传多样性(Genes with monoallelic expression contributedisproportionately to genetic diversity in humans.)》《自然·遗传学》48,231-237。
Schumacher,T.N.,和Schreiber,R.D.(2015).《癌症免疫疗法中的新抗原(Neoantigens in cancer immunotherapy.)》《科学》(80-.).348,69-74。
Sela-Culang,I.,Y.Ofran,和B.Peters.2015a.《抗体特异性表位预测-出现新范例(Antibody specific epitope prediction-Emergence of a new paradigm.)》《病毒学当前观点(Curr.Opin.Virol.)》11。
Sela-Culang,I.,S.Ashkenazi,B.Peters,和Y.Ofran.2015b.PEASE:《预测利用抗体序列的B细胞表位(Predicting B-cell epitopes utilizing antibody sequence.)》《生物资讯》31。
Skora,A.D.,Douglass,J.,Hwang,M.S.,Tam,A.J.,Blosser,R.L.,Gabelli,S.B.,Cao,J.,Diaz,L.A.,Papadopoulos,N.,Kinzler,K.W.,等人(2015).《产生对由体细胞突变基因编码的HLA受限表位有特异性的MANAbody(Generation of MANAbodies specific toHLA-restricted epitopes encoded by somatically mutated genes.)》《美国国家科学院院刊》112,9967-9972。
Stark,M.,和Hayward,N.(2007).《使用高密度单核苷酸多形现象阵列的黑色素瘤中的全基因组杂合性丢失和拷贝数分析(Genome-wide loss of heterozygosity andcopy number analysis in melanoma using high-density single-nucleotidepolymorphism arrays.)》《癌症研究》67,2632-2642。
Stark,S.E.,和Caton,A.J.(1991).《对蛋白质表位中单个氨基酸互换特异性的抗体在结构上使用独特的可变区(Antibodies that are specific for a single aminoacid interchange in a protein epitope use structurally distinct variableregions.)》《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》174,613-624。
Teo,S.M.,Pawitan,Y.,Ku,C.S.,Chia,K.S.,和Salim,A.(2012).《与用下一代测序检测拷贝数变异体的相关的统计难题(Statistical challenges associated withdetecting copy number variations with next-generation sequencing.)》《生物资讯》28,2711-2718。
Thul PJ,等人《人类蛋白质组的亚细胞映射(A subcellular map of the humanproteome.)》《科学》2017；356。
Treanor,B.,Lanigan,P.M.P.,Kumar,S.,Dunsby,C.,Munro,I.,Auksorius,E.,Culley,F.J.,Purbhoo,M.A.,Phillips,D.,Neil,M.A.A.,等人(2006).《在自然杀伤细胞免疫突触下的抑制性杀伤免疫球蛋白样受体信号传递的微丛集(Microclusters ofinhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killercell immunological synapses.)》《细胞生物学杂志》174,153-161。
Uhlen M,等人《人类蛋白质组的基于组织的映射(Tissue-based map of thehuman proteome.)》《科学》2015；347:1260419。
Vogelstein,B.,Fearon,E.R.,Kern,S.E.,Hamilton,S.R.,Preisinger,A.C.,Nakamura,Y.,和White,R.(1989).《结肠直肠癌的等位基因(Allelotype of colorectalcarcinomas.)》《科学》(80-.).244,207-211。
Vogelstein,B.,Papadopoulos,N.,Velculescu,V.E.,Zhou,S.,Diaz Jr.,L.A.,和Kinzler,K.W.(2013).《癌症基因组景观(Cancer genome landscapes.)》《科学》(80-.).340,1546-1558。
Voss,M.,B.,和Fluhrer,R.(2013).《信号肽酶(SPP)和SPP样蛋白酶的机制、特异性和生理(Mechanism,specificity,and physiology of signal peptidepeptidase(SPP)and SPP-like proteases.)》《生物化学与生物物理学报》1828,2828-2839。
Vyas,Y.M.,Mehta,K.M.,Morgan,M.,Maniar,H.,Butros,L.,Jung,S.,Burkhardt,J.K.,和Dupont,B.(2001).《在MHC I类调节非溶细胞和溶细胞相互作用期间NK细胞免疫突触中的信号转导分子的空间组织(Spatial organization of signal transductionmolecules in the NK cell immune synapses during MHC class I-regulatednoncytolytic and cytolytic interactions.)》《免疫学杂志》167,4358-4367。
Wang,Z.C.,Lin,M.,Wei,L.-J.,Li,C.,Miron,A.,Lodeiro,G.,Harris,L.,Ramaswamy,S.,Tanenbaum,D.M.,Meyerson,M.,等人(2004).《杂合性丢失和其与子类浸润性乳腺癌的表达谱的相关性(Loss of heterozygosity and its correlation withexpression profiles in subclasses of invasive breast cancers.)》《癌症研究》64,64-71。
Wilkie,S.,Van Schalkwyk,M.C.I.,Hobbs,S.,Davies,D.M.,Van,D.S.,Pereira,A.C.P.,Burbridge,S.E.,Box,C.,Eccles,S.A.,和Maher,J.(2012).《使用被工程化的嵌合抗原受体在乳腺癌中双靶向ErbB2和MUC1以提供互补信号传递(Dual targeting ofErbB2and MUC1in breast cancer using chimeric antigen receptors engineered toprovide complementary signaling.)》《临床免疫学杂志(J.Clin.Immunol.)》32,1059-1070。
Wu,C.-Y.,Roybal,K.T.,Puchner,E.M.,Onuffer,J.,和Lim,W.A.(2015).《通过小分子闸控嵌合受体远程控制治疗性T细胞(Remote control of therapeutic T cellsthrough a small molecule-gated chimeric receptor.)》《科学》(80-.).350,aab4077。
Yeung,J.T.,Hamilton,R.L.,Ohnishi,K.,Ikeura,M.,Potter,D.M.,Nikiforova,M.N.,Ferrone,S.,Jakacki,R.I.,Pollack,I.F.,和Okada,H.(2013).《在6p21处的HLA I类区域中的LOH与新近诊断出的成人胶质母细胞瘤的较短存活率相关(LOH in the HLAclass I region at 6p21 is associated with shorter survival in newly diagnosedadult glioblastoma.)》《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》19,1816-1826。

Claims (42)

1.一种核酸分子，其包含编码能够防止或减弱效应免疫细胞的非所需活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的核苷酸序列，其中所述iCAR包含：胞外域，其特异性结合到由于杂合性丢失(LOH)而从哺乳动物肿瘤细胞中缺失但至少存在于相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体；和胞内域，其包含至少一种抑制效应免疫细胞的信号转导元件。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述多态细胞表面表位具有管家基因产物，例如HLA I型、G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道或受体酪氨酸激酶，优选为HLA-A、HLA-B或HLA-C。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述胞外域包含(i)抗体、其衍生物或片段，例如人源化抗体；人类抗体；抗体的功能性片段；单域抗体，例如纳米抗体；重组抗体；和单链可变片段(ScFv)；(ii)抗体模拟物，例如亲和抗体分子；阿非灵(affilin)；阿非默(affimer)；阿非汀(affitin)；阿尔法体(alphabody)；抗运载蛋白；高亲和性多聚体；达尔平(DARPin)；非咯默(fynomer)；Kunitz域肽；和单抗体；或(iii)适体。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述哺乳动物组织为人体组织，并且所述相关哺乳动物正常组织为所述肿瘤从其发展的正常组织。
5.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述效应免疫细胞为T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。
6.根据权利要求1所述的核酸分子，其中能够抑制效应免疫细胞的所述至少一种信号转导元件与免疫检查点蛋白的信号转导元件同源。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其中所述免疫检查点蛋白选自由以下组成的群组：PD1；CTLA4；BTLA；2B4；CD160；CEACAM，例如CEACAM1；KIR，例如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LIR1、LIR2、LIR3、LIR5、LIR8和CD94-NKG2A；LAG3；TIM3；T细胞活化的V-域Ig抑制因子(VISTA)；干扰素基因的刺激因子(STING)；含有免疫受体酪氨酸类抑制性基序(ITIM)的蛋白质、T细胞免疫球蛋白和ITIM域(TIGIT)和腺苷受体(例如A2aR)。
8.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述胞外域通过柔性铰链和跨膜阳离子基序与所述胞内域融合。
9.一种载体，其包含根据权利要求1到8中任一项所述的核酸分子和可操作地连接到所述核酸分子的至少一种控制元件，例如启动子。
10.根据权利要求9所述的载体，其进一步包含包括编码aCAR的核苷酸序列的核酸分子，所述aCAR包含：胞外域，其特异性结合抗原的非多态细胞表面表位或多态细胞表面表位的单个等位基因变异体，其中所述表位为肿瘤相关抗原或至少与相关肿瘤和正常组织的细胞共用；和胞内域，其包含活化和/或共同刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件。
11.根据权利要求10所述的载体，其中所述aCAR的胞外域特异性结合到抗原的非多态细胞表面表位，并且所述iCAR的胞外域特异性结合与所述aCAR的胞外域结合的抗原不同的抗原的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体。
12.根据权利要求10或11所述的载体，其中所述aCAR的胞外域特异性结合到选自表1中所列抗原的非多态细胞表面表位，例如CD19。
13.根据权利要求10所述的载体，其中活化或共同刺激效应免疫细胞的所述至少一种信号转导元件与以下同源：免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)，例如CD3ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)；活化杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DS和KIR3DS，或转接分子，例如DAP12；或共同刺激信号转导元件，例如CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)或CD134(OX40)的共同刺激信号转导元件。
14.根据权利要求10所述的载体，其中所述核苷酸序列包含介于编码所述aCAR的所述核苷酸序列与编码所述iCAR的所述核苷酸序列之间的内部核糖体进入位点(IRES)。
15.根据权利要求14所述的载体，其中对所述aCAR进行编码的所述核苷酸序列位于编码所述iCAR的所述核苷酸序列的下游。
16.根据权利要求10所述的载体，其中所述核苷酸序列包含编码所述aCAR的所述核苷酸序列与编码所述iCAR的所述核苷酸序列之间的病毒自裂解2A肽。
17.根据权利要求16所述的载体，其中所述病毒自裂解2A肽选自由以下组成的群组：来自明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus TaV)的T2A、来自口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)的F2A、来自马鼻炎A病毒(Equine rhinitis A virus，ERAV)的E2A和来自猪捷申病毒-1(Porcine teschovirus-1，PTV1)的P2A。
18.根据权利要求10所述的载体，其包含编码所述组成型aCAR的核苷酸序列，所述组成型aCAR通过柔性连接子连接到所述iCAR。
19.一种制备如权利要求1到8中所定义的能够防止或减弱效应免疫细胞的非所需活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的方法，所述方法包含：
(i)从已知变异体的至少一个数据库中检索编码蛋白质的基因的人类基因组变异体的列表；
(ii)如下过滤(i)中检索的所述变异体列表：
(a)选择与其相应参考等位基因相比导致由所述对应的基因编码的所述蛋白质中的氨基酸序列变异的变异体；
(b)选择其中所述氨基酸序列变异发生于所述编码的蛋白质的胞外域中的基因变异体，
(c)选择至少在一个肿瘤中经历杂合性丢失(LOH)的基因变异体，并且
(d)选择至少在所述至少一个肿瘤的来源组织中表达的基因变异体，所述基因变异体根据(c)在所述至少一个肿瘤中经历LOH，从而获得在所述蛋白质中的胞外域中具有氨基酸序列变异的变异体列表，所述蛋白质由在所述至少一个肿瘤中由于LOH而丢失并且至少在所述至少一个肿瘤的来源组织中表达的所述对应基因编码；
(iii)从(ii)中获得的所述列表中定义包含至少一个单变异体的序列区、亚克隆并且表达包含所述至少一个单变异体的所述序列区和包含所述相应参考等位基因的序列区，从而获得所述对应的表位肽；
(iv)选择iCAR结合域，其特异性结合到由所述克隆的序列区编码的所述表位肽或特异性结合到由(iii)中获得的所述相应参考等位基因编码的所述表位肽；以及
(vii)制备如权利要求1到8中任一项所定义的iCAR，其各自包含如(iv)中所定义的iCAR结合域。
20.根据权利要求19所述的方法，其中每个变异体的次要等位基因频率等于或超过1％、2％、3％、4％或5％。
21.一种制备安全效应免疫细胞的方法，所述方法包含：(i)用包含编码权利要求1到8中任一项中的iCAR的核苷酸序列的核酸分子转染针对肿瘤相关抗原的TCR工程化效应免疫细胞，或用根据权利要求9所述的载体转导所述细胞；或(ii)用包含编码权利要求1到8中任一项中的iCAR的核苷酸序列的核酸分子和包含编码权利要求10到13中任一项所定义的aCAR的核苷酸序列的核酸分子转染初始效应免疫细胞；或用根据权利要求10到18中任一项所述的载体转导效应免疫细胞。
22.一种安全效应免疫细胞，其通过根据权利要求21所述的方法获得。
23.根据权利要求22所述的安全效应免疫细胞，其在其表面上表达aCAR和iCAR，所述aCAR包含特异性结合到抗原的非多态细胞表面表位的胞外域，所述iCAR包含特异性结合与所述aCAR的胞外域结合的抗原不同的抗原的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的胞外域。
24.根据权利要求22或23所述的安全效应免疫细胞，其中所述aCAR的胞外域特异性结合到选自表1中所列抗原的非多态细胞表面表位，例如CD19。
25.根据权利要求22所述的安全效应免疫细胞，其中所述aCAR和所述iCAR以分开的蛋白质存在于所述细胞表面上。
26.根据权利要求22所述的安全效应免疫细胞，其中编码所述iCAR的所述核苷酸序列的表达水平大于或等于编码所述aCAR的所述核苷酸序列的表达水平。
27.一种为患有特征为LOH的肿瘤的个体选择个性化生物标记物的方法，所述方法包含
(i)从所述个体中获得肿瘤活检；
(ii)从所述个体中获得正常组织的样品，例如PBMC；
(iii)鉴别多态细胞表面表位的单个等位基因变异体，其由于LOH而不被所述肿瘤的细胞表达，但被所述正常组织的细胞表达，
从而鉴别所述个体的个性化生物标记物。
28.一种治疗患有特征为LOH的肿瘤的患者的癌症的方法，所述方法包含向所述患者施用根据权利要求22所述的效应免疫细胞，其中所述iCAR是针对编码由于杂合性丢失(LOH)而从所述肿瘤的细胞中缺失但至少存在于所述患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体。
29.根据权利要求22所述的安全效应免疫细胞，其用于治疗患有特征为LOH的肿瘤的患者，其中所述iCAR是针对编码由于杂合性丢失(LOH)而从所述肿瘤的细胞中缺失但至少存在于所述患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体。
30.根据权利要求29所使用的安全效应免疫细胞，其中与包含向所述癌症患者施用表达(iii)的aCAR但缺乏和(iii)的iCAR的免疫效应细胞的至少一个群体的疗法相比，所述治疗使得在靶、肿瘤外反应性降低。
31.根据权利要求29所使用的安全效应免疫细胞，其在其表面上表达aCAR和iCAR，所述aCAR包含特异性结合到抗原的肿瘤相关抗原或非多态细胞表面表位的胞外域，所述iCAR包含特异性结合至少在肿瘤或管家蛋白例如HLA-A的来源组织中表达的抗原的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的胞外域，所述抗原为与所述aCAR的胞外域结合的抗原不同的抗原。
32.根据权利要求28所使用的安全效应免疫细胞，其为自体或通用(异基因)效应细胞。
33.根据权利要求28到32中任一项所使用的安全效应免疫细胞，其选自T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。
34.一种具有两种或更多种核酸分子的组合，每一种包含编码受控效应免疫细胞活化系统的不同成员的核苷酸序列，所述核酸分子形成单个连续核酸分子或包含两种或更多种分开的核酸分子，其中所述受控效应免疫活化系统引导效应免疫细胞杀灭由于杂合性丢失(LOH)而丢失一个或多个染色体或其部分的肿瘤细胞并且饶过相关正常组织的细胞，并且其中
(a)所述第一成员包含活化嵌合抗原受体(aCAR)多肽，其包含特异性结合到抗原的非多态细胞表面表位或特异性结合到不同多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的第一胞外域，并且所述非多态或多态细胞表面表位为肿瘤相关抗原或与相关异常和正常哺乳动物组织的细胞共用；并且
(b)所述第二成员包含调节性多肽，其包含特异性结合到多态细胞表面表位的单个等位基因变异体的第二胞外域，所述等位基因变异体由于LOH而不被异常哺乳动物组织表达但存在于相关哺乳动物正常组织的所有细胞上。
35.根据权利要求34所述的组合，其中所述第一成员选自：
(a)进一步包含胞内域的组成型aCAR，所述胞内域包含至少一个活化和/或共同刺激效应免疫细胞的信号转导元件；和
(b)进一步包含胞内域的条件性aCAR，所述胞内域包含异源二聚化小分子的结合位点的第一成员以及任选的至少一个共同刺激信号转导元件，但缺乏活化信号转导元件；并且所述第二成员为：
(c)抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其进一步包含胞内域，所述胞内域包含至少一个抑制效应免疫细胞的信号转导元件；或
(d)保护性嵌合抗原受体(pCAR)，其进一步包含：胞外调节区，其包含脱落酶(sheddase)的底物；跨膜阳离子基序，其包含用于膜内裂解蛋白酶的底物；和胞内域，所述胞内域包含至少一个活化和/或共同刺激效应免疫细胞的信号转导元件；和异源二聚化小分子的结合位点的第一成员。
36.根据权利要求34或35所述的组合，其中：
(i)所述iCAR或pCAR的胞外域特异性结合抗原的多态细胞表面表位的单个等位基因变异体，所述抗原为与所述aCAR的胞外域结合的抗原不同的抗原，
(ii)所述pCAR或iCAR的胞外域特异性结合与所述aCAR的胞外域结合的抗原相同的抗原的不同多态细胞表面表位的单个等位基因变异体；或
(iii)所述pCAR或iCAR的胞外域特异性结合所述aCAR的胞外域所结合的相同多态细胞表面表位的不同单个等位基因变异体。
37.根据权利要求34所述的组合，其中脱落酶的所述底物为解整合素和金属蛋白酶(ADAM)或β-分泌酶1(BACE1)的底物。
38.根据权利要求37所述的组合，其中所述底物形成所述胞外域的一部分，并且包含Lin12/Notch重复序列和ADAM蛋白酶裂解位点。
39.根据权利要求34所述的组合，其中膜内裂解蛋白酶的所述底物为SP2、γ-分泌酶、信号肽肽酶(signal peptide peptidase，spp)、spp样蛋白酶或扁菱形蛋白酶的底物。
40.根据权利要求39所述的组合，其中所述底物形成所述跨膜阳离子基序的一部分，并且与Notch、ErbB4、E-钙粘素、N-钙粘素、蝶素-B2(ephrin-B2)、淀粉样前体蛋白质或CD44的跨膜域同源/源自其。
41.根据权利要求34所述的组合，其包含编码作为分开的蛋白质的所述条件性aCAR的胞外域和胞内域的核苷酸序列，其中每个域独立地与跨膜阳离子基序融合并且包含异源二聚化小分子的结合位点的不同成员。
42.根据权利要求34所述的组合，其中异源二聚化小分子的所述结合位点的所述第一和第二成员中的每一个由选自以下的蛋白质衍生：
(i)他克莫司(Tacrolimus，FK506)结合蛋白(FKBP)和FKBP；
(ii)FKBP和钙调神经磷酸酶催化亚单元A(calcineurin catalytic subunit A，CnA)；
(iii)FKBP和亲环蛋白；
(iv)FKBP和FKBP雷帕霉素相关蛋白质(FKBP-rapamycin associated protein，FRB)；
(v)旋转酶B(gyrase B，GyrB)和GyrB；
(vi)二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)和DHFR；
(vii)DmrB均二聚域(DmrB)和DmrB；
(viii)PYL蛋白质(也称为脱落酸受体和RCAR)和ABI；
(ix)GAI阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)蛋白质(也称为赤霉酸(GibberellicAcid)不敏感和DELLA蛋白质GAI；GAI)和GID1阿拉伯芥蛋白质(也称为赤霉素受体GID1；GID1)。
CN201780059982.3A 2016-09-28 2017-09-28 供靶向癌症的新型抗原标志的car疗法用的通用平台 Pending CN109996871A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662400737P 2016-09-28 2016-09-28
US62/400,737 2016-09-28
PCT/IL2017/051102 WO2018061012A1 (en) 2016-09-28 2017-09-28 A universal platform for car therapy targeting a novel antigenic signature of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109996871A true CN109996871A (zh) 2019-07-09

Family

ID=61762577

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780059982.3A Pending CN109996871A (zh) 2016-09-28 2017-09-28 供靶向癌症的新型抗原标志的car疗法用的通用平台

Country Status (11)

Country Link
US (3) US20190248869A1 (zh)
EP (2) EP4282978A3 (zh)
JP (2) JP2019530456A (zh)
KR (1) KR20190052697A (zh)
CN (1) CN109996871A (zh)
AU (1) AU2017333446A1 (zh)
BR (1) BR112019006006A2 (zh)
CA (1) CA3038475A1 (zh)
IL (1) IL265608A (zh)
MX (1) MX2019003462A (zh)
WO (1) WO2018061012A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111465693A (zh) * 2017-09-28 2020-07-28 依姆派特生物有限公司 用于制备抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的通用平台
WO2022179562A1 (en) * 2021-02-24 2022-09-01 Hangzhou Qihan Biotechnology Co., Ltd. Chimeric antigen receptors in immune cells

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11072644B2 (en) * 2014-11-12 2021-07-27 Allogene Therapeutics, Inc. Inhibitory chimeric antigen receptors
TWI796329B (zh) 2017-04-07 2023-03-21 美商默沙東有限責任公司 抗－ilt4抗體及抗原結合片段
KR20210088559A (ko) * 2018-09-28 2021-07-14 임팩트-바이오 리미티드. 암 요법에 사용하기 위한 활성화 항원 수용체 (aCAR)/저해성 키메라 항원 수용체 (iCAR) 쌍의 식별 방법
EP3870600A1 (en) * 2018-10-24 2021-09-01 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
WO2020152197A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG A combination of compositions for elimination and enhanced engraftment of hematopoietic stem cells in the bone marrow of a subject
US20220186232A1 (en) * 2019-03-26 2022-06-16 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd. Genetically reprogrammed tregs expressing cars
SG11202111130SA (en) 2019-04-30 2021-11-29 Senti Biosciences Inc Chimeric receptors and methods of use thereof
US20220389075A1 (en) 2019-11-12 2022-12-08 A2 Biotherapeutics, Inc. Engineered t cell receptors and uses thereof
US20230029341A1 (en) 2019-12-11 2023-01-26 A2 Biotherapeutics, Inc. Nucleic acid encoding lilrb1-based chimeric antigen receptor
CN112079934B (zh) * 2019-12-17 2021-01-29 合源生物科技(天津)有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途
CN115066249A (zh) 2020-02-04 2022-09-16 美天施生物科技有限两合公司 表达用于感测可溶性抗原的适体嵌合抗原受体的免疫细胞
EP4107175A4 (en) * 2020-02-20 2024-03-20 Senti Biosciences, Inc. ARCHITECTURES OF INHIBITORY CHIMERIC RECEPTORS
EP3915578A1 (en) 2020-05-28 2021-12-01 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Chimeric antigen receptor with a spacer comprising c2-set ig-like domains
WO2021252635A1 (en) * 2020-06-11 2021-12-16 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating cancers
JP2023538115A (ja) 2020-08-20 2023-09-06 エー２ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｅａｃａｍ陽性がんを治療するための組成物及び方法
JP2023538116A (ja) 2020-08-20 2023-09-06 エー２ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ陽性がんを治療するための組成物及び方法
IL300500A (en) 2020-08-20 2023-04-01 A2 Biotherapeutics Inc Preparations and methods for the treatment of mesothelin positive cancer
EP4240404A1 (en) 2020-11-09 2023-09-13 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Methods and compositions for eliminating engineered immune cells
WO2022203226A1 (ko) * 2021-03-22 2022-09-29 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
US20240245722A1 (en) * 2021-05-25 2024-07-25 Vaxcell-Bio Monobody-based chimeric antigen receptor and immune cell including same
EP4413031A1 (en) 2021-10-06 2024-08-14 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method for targeted gene insertion into immune cells
WO2024024551A1 (ja) * 2022-07-26 2024-02-01 国立大学法人京都大学 シェディング構造を有する人工受容体
WO2024078995A1 (en) 2022-10-15 2024-04-18 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Transduction of gammadelta t cells with pseudotyped retroviral vectors

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105246504A (zh) * 2013-03-15 2016-01-13 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于免疫疗法的组合物和方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9090515B2 (en) 2013-03-03 2015-07-28 Thomas Taverne Method for concrete crack repair
US9745368B2 (en) 2013-03-15 2017-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
EP3263595A1 (en) * 2016-06-30 2018-01-03 Medizinische Hochschule Hannover Fusion protein for use in the treatment of hvg disease

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105246504A (zh) * 2013-03-15 2016-01-13 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于免疫疗法的组合物和方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VICTOR D. FEDOROV: ""PD-1–and CTLA-4–Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors (iCARs) Divert Off-Target Immunotherapy Responses"", 《SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111465693A (zh) * 2017-09-28 2020-07-28 依姆派特生物有限公司 用于制备抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的通用平台
WO2022179562A1 (en) * 2021-02-24 2022-09-01 Hangzhou Qihan Biotechnology Co., Ltd. Chimeric antigen receptors in immune cells

Also Published As

Publication number Publication date
BR112019006006A2 (pt) 2019-06-25
CA3038475A1 (en) 2018-04-05
US20220380434A1 (en) 2022-12-01
EP4282978A2 (en) 2023-11-29
AU2017333446A1 (en) 2019-04-18
EP4282978A3 (en) 2023-12-06
IL265608A (en) 2019-05-30
EP3519564B1 (en) 2023-11-15
MX2019003462A (es) 2019-08-16
US20210230251A1 (en) 2021-07-29
US20190248869A1 (en) 2019-08-15
JP2019530456A (ja) 2019-10-24
EP3519564A4 (en) 2020-04-29
EP3519564A1 (en) 2019-08-07
KR20190052697A (ko) 2019-05-16
WO2018061012A1 (en) 2018-04-05
JP2023010717A (ja) 2023-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109996871A (zh) 供靶向癌症的新型抗原标志的car疗法用的通用平台
US20210244759A1 (en) Universal platform for car therapy targeting a novel antigenic signature of cancer
EP3126380B1 (en) Chimeric antigen receptor (car) signalling system
CN105848673B (zh) 细胞
JP6378172B2 (ja) マウス抗ｎｙ−ｅｓｏ−１ｔ細胞受容体
US20200316120A1 (en) METHODS FOR IDENTIFYING ACTIVATING ANTIGEN RECEPTOR (aCAR)/INHIBITORY CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (iCAR) PAIRS FOR USE IN CANCER THERAPIES
CN106068276B (zh) 具有针对T细胞受体beta恒定区的抗原结合域的嵌合抗原受体(CAR)
JP6076963B2 (ja) 抗上皮成長因子受容体変異体ｉｉｉキメラ抗原受容体及び癌の治療のためのその使用
WO2017219937A1 (zh) 一种高效稳定表达抑制性抗体的car-t细胞及其用途
US20240075066A1 (en) Cell
JP2013538555A (ja) Ｍｈｃクラスｉｉとグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｇａｄ）自己抗原性ペプチドとの天然型複合体に対するｔ細胞受容体様特異性を有する単離された高親和性実体
JP2013535963A (ja) Ｍｈｃクラスｉｉと糖尿病関連自己抗原性ペプチドとの天然型複合体に対するｔ細胞受容体様特異性を有する単離された高親和性実体
JP2019535292A (ja) シグナル伝達改変タンパク質
AU2021219233A1 (en) Immune cells overexpressing cell signaling regulatory factor introduced from outside and use thereof
EP3735425A1 (en) Chimeric antigen receptor specific for bdca2 antigen
US20220135688A1 (en) Fusion protein for use in the treatment of hvg disease
Guzman Evaluation of the Functional Performance of KLK2 Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Designs
Fried et al. Recombinant dimeric MHC antigens protect cardiac allografts from rejection and visualize alloreactive T cells
CN117756944A (zh) 对叶酸受体1具有特异性的嵌合抗原受体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: G.Gross

Inventor after: M.Berman

Inventor after: W.Gibson

Inventor after: D. Da Harry

Inventor before: G.Gross

Inventor before: M.Berman

Inventor before: W.Gibson

CB03 Change of inventor or designer information
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40011286

Country of ref document: HK